UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO FACULTAD DE...
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO FACULTAD DE QUÍMICA “ELABORACIÓN DE QUESO TIPO PORO CON CULTIVOS INICIADORES OBTENIDOS DURANTE LA PRODUCCIÓN ARTESANAL DEL ALIMENTO” TESIS INDIVIDUAL QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO EN ALIMENTOS PRESENTA ALEJANDRA CASTILLO CARBAJAL DIRIGIDA POR Dra. MONTSERRAT HERNÁNDEZ ITURRIAGA SANTIAGO DE QUERÉTARO, QUERÉTARO, 2014.
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO
FACULTAD DE QUÍMICA
“ELABORACIÓN DE QUESO TIPO PORO CON CULTIVOS
INICIADORES OBTENIDOS DURANTE LA PRODUCCIÓN
ARTESANAL DEL ALIMENTO”
TESIS INDIVIDUAL
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO QUÍMICO EN ALIMENTOS
PRESENTA
ALEJANDRA CASTILLO CARBAJAL
DIRIGIDA POR
Dra. MONTSERRAT HERNÁNDEZ ITURRIAGA
SANTIAGO DE QUERÉTARO, QUERÉTARO, 2014.
i
ÍNDICE GENERAL
Contenido Página
ÍNDICE GENERAL i!
ÍNDICE DE CUADROS v!
ÍNDICE DE FIGURAS vii!
RESUMEN
1! ANTECEDENTES 1!
1.1! Leche 1!
1.1.1! Importancia socioeconómica 1!
1.1.2! Generalidades 4!
1.1.3! Características microbiológicas de la leche cruda. 6!
1.2! Queso 8!
1.2.1! Etapas de la fabricación del queso 9!
1.2.2! Aspectos tecnológicos del procesamiento 10!
1.2.3! Microbiología de los quesos 15!
1.2.4! Quesos artesanales 18!
1.2.4.1! Queso de Poro de Balancán 20!
1.3! Cultivo iniciador 24!
1.3.1! Bacterias ácido lácticas no iniciadoras 28!
1.4! Caracterización de la flora microbiana en alimentos 28!
1.4.1! Técnicas dependientes de cultivo 29!
1.4.2! Técnicas independientes del cultivo 30!
1.4.2.1! Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA) 32!
2! OBJETIVOS 34!
2.1! General 34!
ii
2.2! Específicos 34!
3! MATERIALES Y MÉTODOS 35!
3.1! Materiales y equipo 35!
3.1.1! Caracterización de quesos de poro 35!
3.1.2! Elaboración del queso 35!
3.1.3! Análisis microbiológicos 36!
3.1.4! Análisis sensorial 36!
3.1.5! Análisis moleculares 36!
3.2! Reactivos 37!
3.2.1! Elaboración de queso 37!
3.2.2! Medios de cultivos 37!
3.2.3! Análisis moleculares 37!
3.2.3.1! Extracción de ADN 37!
3.2.3.2! Electroforesis 38!
3.2.3.3! Amplificación por PCR 38!
3.3! Metodología 38!
3.3.1! Caracterización microbiológica de quesos de Poro de
Balancán, Tabasco. 38!
3.3.1.1! Análisis microbiológicos 38!
3.3.1.1.1! Bacterias mesófilas aerobias (BMA) 39!
3.3.1.1.2! Bacterias ácido lácticas (BAL) 39!
Se hizo el recuento por el método de extensión en superficie en
agar MRS. Las placas se incubaron a 30º C por 48 h. 39!
3.3.1.1.3! Hongos y levaduras 39!
3.3.1.1.4! Coliformes totales, fecales y E. coli 40!
3.3.1.1.5! Salmonella spp. 40!
3.3.1.1.6! Staphylococcus aureus 40!
iii
3.3.1.1.7! Listeria monocytogenes 40!
3.3.2! Elaboración del queso tipo poro. 41!
3.3.2.1! Prueba preliminar 41!
3.3.2.1.1! Preparación del queso 42!
3.3.2.1.2! Análisis microbiológico 43!
3.3.2.1.3! Prueba sensorial 43!
3.3.2.2! Prueba definitiva 43!
3.3.2.2.1! Estabilización del inóculo para la elaboración del
Lote 2 de queso tipo Poro. 43!
3.3.2.2.2! Preparación del queso tipo Poro 44!
3.3.2.2.3! Análisis microbiológico 44!
3.3.2.2.4! Análisis sensorial 45!
3.3.2.2.5! Análisis molecular de las muestras lácteas 47!
3.3.2.2.5.1! Extracción de ADN 47!
3.3.2.2.5.2! Análisis de integridad de ADN extraído 49!
3.3.2.2.5.3! Pureza del ADN 49!
3.3.2.2.5.4! PCR-RISA 49!
3.3.3! Análisis estadístico 51!
4! RESULTADOS Y DISCUSIÓN 52!
4.1! Caracterización microbiológica de quesos de Poro elaborados
en Balancán, Tabasco. 52!
4.2! Elaboración del queso tipo poro con leche pasteurizada y
adición de inoculo controlado. 56!
4.2.1! Prueba preliminar 56!
4.2.2! Prueba definitiva 65!
4.2.2.1! Estabilización del inóculo 65!
4.2.2.2! Análisis sensorial 68!
iv
4.2.2.3! Análisis molecular de las muestras lácteas 69!
4.2.2.3.1! Pureza del ADN 70!
4.2.2.3.2! RISA 71!
5! CONCLUSIONES 74!
6! REFERENCIAS 76!
7! ANEXOS 82!
v
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1. Composición típica de la leche cruda de vaca (Inda, 2000). 5!
2. Clasificación de quesos conforme la norma A6 del Codex
Alimentarius según consistencia, contenido de grasa y
características de maduración (% HSMG-humedad del queso
desgrasado, GES-grasa en el extracto seco) (FAO, 2000). 9!
3. Microorganismos patógenos humanos asociados con la leche y los
productos lácteos (Marth y Steele, 2001). 17!
4. Diagrama de elaboración de queso de Poro. 23!
5. Principales especies de lactobacilos asociados a productos lácteos
agrupados según el tipo de fermentación (Martin- Platero, 2008). 27!
6. Técnicas moleculares más frecuentes. 31!
7. Origen del inóculo empleado para la producción de quesos tipo
poro elaborados con leche pasteurizada. 41!
8. Formato de selección de panelistas para análisis sensorial 45!
9. Formato de encuesta para prueba dúo-trío. 46!
10. Descripción de muestras analizadas mediante la técnica RISA. 47!
11. Comparación de medias 61!
12. Análisis de varianza del contenido de BAL en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada, inoculado con tres tipos de
cultivos y almacenado 49 días a temperatura ambiente. 62!
13. Análisis de varianza del contenido de BMA en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada, inoculado con tres tipos de
cultivos y almacenado 49 días a temperatura ambiente. 63!
14. Análisis de varianza del contenido de levaduras en queso tipo
Poro elaborado con leche pasteurizada, inoculado con tres tipos
de cultivos y almacenado 49 días a temperatura ambiente. 64!
15. Contenido de microorganismos indicadores en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada empleando el inóculo A. 68!
16. Pureza del ADN extraído de muestras lácteas. 71!
vi
Cuadro Página
A1. Número mínimo de respuestas correctas necesarias para
concluir que existe diferencia significativa, basado en un ensayo
dúo-trío. 84!
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
1. Producción Nacional de Leche Fluida 2003-2011 (SAGARPA, 2012). 1!
2. Participación en la producción de leche por estado (SAGARPA, 2012) 2!
3. Transformación y distribución de la leche (SIAP/SAGARPA, 2012). 3!
4. Queso de Poro de Balancán. 21!
5. Organización estructural de genes de ARN ribosomal en bacterias
(Sachse, 2003). 33!
6. Contenido de microorganismos indicadores de cuatro queserías del
queso de Poro en dos periodos del año. 54!
7. Análisis de pH y de Aw el queso de Poro en dos periodos del año. 55!
8. Contenido de microorganismos indicadores en quesos elaborados
con leche pasteurizada e inoculados con tres tipos de inoculo
(prueba preliminar). 59!
9. Efecto del tipo de empaque en el contenido de BAL en queso tipo
Poro elaborado con leche pasteurizada. P= queso empacado con
parafina; V= queso empacado al vacío. 62!
10. Efecto del tipo de empaque en el contenido de BMA en queso tipo
Poro elaborado con leche pasteurizada. P= queso empacado con
parafina; V= queso empacado al vacío. 63!
11. Efecto del inóculo en el contenido de BAL en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada. 64!
12. Efecto del tipo de empaque y del inoculo en el contenido de
levaduras en queso tipo Poro elaborado con leche pasteurizada.
P= queso empacado con parafina; V= queso empacado al vacío;
A, B C= tipos de inóculos 65!
13. Acidez del suero durante 20 trasferencias sucesivas
(ºD: Grados Dornic) 66!
14. pH del suero durante 20 transferencias sucesivas 67!
15. Gel de integridad de ADN extraído de muestras lácteas de queso
tipo Poro. M: marcador de peso molecular; 1: !. 70!
viii
Figura Página
16. Bandas de muestras lácteas obtenidas del proceso de
producción del queso tipo poro elaborado con leche pasteurizada 72!
17. Bandas secuenciadas de muestras lácteas obtenidas del proceso
de producción del Queso de Poro del productor El Bejucal en
temporada de lluvias 73!
.
RESUMEN
El queso de Poro es un queso artesanal de corta maduración que se produce en el Estado de Tabasco y generalmente se elabora a partir de leche cruda y mediante la incorporación de suero fermentado de un lote previo como cultivo iniciador. La actividad metabólica de la microbiota autóctona presente en la leche cruda o suero genera los aromas y sabores característicos del queso. Sin embargo, el uso de leche no pasteurizada y la ausencia de un cultivo iniciador estandarizado genera variabilidad en la calidad, y puede representar un riesgo para la salud de los consumidores. En este trabajo se caracterizo microbiológicamente el queso de Poro elaborado en Balancán, Tabasco, elaborado por dos épocas en el año ( lluvias y secas) a lo largo de la maduración del queso. Se elaboraron dos lotes de queso tipo Poro, con el fin de adicionar un cultivo iniciador estable (pH, acidez); se observó si había diferencia en la flora del cultivo a lo largo del tiempo mediante técnicas moleculares; para ello se extrajo ADN del queso elaborado con leche pasteurizada y se realizó la amplificación por PCR de la región espaciadora intergénica ribosomal 16S-23S del operón ADNr con los primers ITSF e ITSReub. Se hizo un análisis microbiológico (se cuantifico bacterias mesófilas aerobias, coliformes totales, bacterias ácido lácticas, hongos y levaduras) para observar el comportamiento de microorganismos indicadores a lo largo del tiempo de maduración del queso además de la diferencia entre el empacado con parafina (tradicional) y al vacío. Los cuales se muestra que el desarrollo de microorganismos no se altera con el empaque, además que los valores de los microorganismos indicadores se comportan de manera similar a los del queso de origen. Se realizó un análisis sensorial por la prueba dúo-trío (p<0.05), el cual se observó que existía una diferencia perceptible en el queso elaborado con leche pasteurizada y el de origen.
1
1 ANTECEDENTES
1.1 Leche
1.1.1 Importancia socioeconómica
En México la producción de leche de bovino es muy heterogénea desde el punto
de vista tecnológico, agroecológico y socioeconómico, incluyendo la gran
variedad de climas regionales y características de tradiciones y costumbres de
las poblaciones.
Según cifras del Servicio de Información Estadística Agroalimentaria y Pesquera
(SIAP) de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentación (SAGARPA), durante el período 2003-2011 la producción nacional
de leche de bovino ha tenido una tasa media de crecimiento de 1.3 % (Figura 1).
Figura 1. Producción Nacional de Leche Fluida 2003-2011 (SAGARPA, 2012).
En México la producción lechera se desarrolló en todo su territorio, pero durante
el periodo de 2005 a 2010 se concentró en cuatro Estados (Jalisco, Coahuila,
Durango y Chihuahua), los que contribuyeron conjuntamente con el 45 % de la
2
producción nacional en este período. Cabe señalar, que los estados de Coahuila
y Durango se encuentran ubicados en la región Lagunera, que es la más
importante cuenca lechera del país, y que ocupa el primer lugar en producción a
nivel nacional (Figura 2).
Figura 2. Participación en la producción de leche por estado (SAGARPA, 2012)
En México los productos lácteos como son los quesos y los yogurts, así como
las leches industrializadas (pasteurizada, ultra pasteurizada y en polvo), ocupan
los primeros lugares de comercialización en las zonas urbanas, ya que estas
poseen vías de comunicación. La transformación y distribución de la leche se
lleva a cabo tal como se muestra en la Figura 3.
3
Figura 3. Transformación y distribución de la leche (SIAP/SAGARPA, 2012).
4
Entre 2005 y 2011, la producción industrial de leche y derivados lácteos registró
un comportamiento favorable en la mayoría de los productos, con base en
información del INEGI, destacan la producción de yogurt y quesos, con una tasa
de crecimiento promedio de 7.3 y 5.7 por ciento.
La mayor producción de derivados se encuentra asociada entre otros factores,
al comportamiento de la demanda de estos productos, apoyada en la estabilidad
de la economía en general y en modificaciones en las preferencias de algunos
segmentos de la población, lo que ha influido en un aumento del consumo de
productos lácteos de mayor valor, en comparación con el consumo de las leches
líquidas.
1.1.2 Generalidades
La leche se define como la secreción mamaria normal de animales lecheros,
obtenida mediante uno o más ordeños sin ningún tipo de adición o extracción,
destinada al consumo en forma de leche líquida o la elaboración ulterior
(CODEX STAN 206-1999). La propiedad fundamental de la leche es la de ser
una mezcla compleja, tanto física como químicamente, de sustancias definidas:
agua, lactosa, lípidos, proteínas (caseínas, proteínas de suero), sales y
micronutrientes.
Desde el punto de vista físico, coexiste en varios estados: emulsión, suspensión
y solución (Alais, 2000). La composición de la leche varía considerablemente
con la raza de la vaca, el estado de lactancia, alimento, época del año y muchos
otros factores. Aun así, algunas de las relaciones entre los componentes son
muy estables y pueden ser utilizados para indicar si ha ocurrido alguna
adulteración en la composición de la leche (Cuadro 1) (Inda, 2000).
5
Cuadro 1. Composición típica de la leche cruda de vaca (Inda, 2000).
Proteínas 3.10%
Caseínas 2.40%
Proteínas de suero 0.70%
Grasas 3.40%
Lactosa 4.70%
Minerales 0.90%
Sólidos totales 12.10%
Gracias a su amplio contenido de nutrientes es considerada como un alimento
completo y equilibrado, tiene una gran capacidad para ser procesada y generar
una gran variedad de productos lácteos; esto da lugar a que las personas
puedan consumirlos según sus diferentes hábitos y necesidades nutricionales.
La leche al ser un alimento con un alto contenido en nutrientes y agua, y por
tener la capacidad para sustentar la actividad microbiana, es fácilmente
alterable. Los principales agentes de alteración son los microorganismos que se
encuentran presentes en la leche, aun obtenida mediante una ordeña higiénica.
Entre estos la microflora acidógena es la más activa (Villegas, 2011).
Debido a las excelentes propiedades nutricionales de la leche y al aumento en
su producción a nivel mundial, se propició la innovación de productos lácteos
(crema, mantequilla, yogurt, quesos). Uno de los productos más importantes a
nivel mundial debido a la variedad de subproductos y a su elevada
comercialización son los quesos. En la actualidad existen por lo menos 2000
variedades de queso en el mundo, muchos de los cuales tienen producción
limitada.
La calidad de la leche es el factor de mayor importancia en la fabricación de
queso, ya que es la materia prima principal para su producción. Por lo tanto se
6
debe garantizar el cuidado en los procedimientos de manejo de esta a través de
las fases de elaboración de queso (Chandan y Kilara, 2011).
El potencial de la leche para ser empleada en la fabricación de queso está
determinado principalmente por tres factores:
• El contenido de proteínas coagulables (caseínas)
• El contenido de materia grasa
• La calidad sanitaria y microbiológica
El principal factor es el contenido de caseínas, estas mediante la acción del
cuajo y la acidez, retienen prácticamente toda la humedad del queso. El
contenido de materia grasa también es importante ya que nos aporta
propiedades de conservación y características organolépticas (Inda, 2000). La
calidad sanitaria y microbiológica puede estar afectada por la presencia de
materia fecal, pastizales, suciedad y otros materiales en la piel exterior de la
ubre al tiempo de ordeñar, dando lugar a la contaminación con microorganismos
tanto patógenos como deterioradores. El empleo de leche de mala calidad
microbiológica tiene como consecuencias la degradación parcial de grasas y
proteínas y termina manifestándose en una disminución del rendimiento de
producción de queso (Inda, 2000).
1.1.3 Características microbiológicas de la leche cruda.
La leche contiene una cantidad de microorganismos muy variable, y pueden
tener un origen tanto intramamario como extramamario. Se pueden encontrar
bacterias como coliformes, Pseudomonas, Micrococus, Staphylococcus y
además de esporulados como Clostridium y Bacillus que se encuentran en la
leche debido a contaminación del ambiental o a problemas de higiene de las
ubres o de saneamiento de equipo empleado durante la ordeña (Dunand, 1999).
Los diferentes microorganismos alcanzan la leche por dos vías principales: la
vía mamaria y el medio externo.
7
• Mamaria. Los microorganismos que pueden alcanzar la ubre, igualmente
pueden llegar a contaminar la leche antes o después del ordeño.
• Medio externo. La contaminación de la leche ocurre cuando ha sido
extraída de la glándula mamaria. Los utensilios, tanques de
almacenamiento, transporte e incluso el personal que manipula la leche,
donde se pueden encontrar bacterias, hongos, levaduras (Amiot, 1991).
La diversidad microbiológica en la leche cruda es considerada esencial para la
riqueza sensorial y la variedad de los quesos tradicionales. Algunos son los
responsables de los defectos en los quesos o los constituyentes de riesgos a la
salud de los consumidores (Delbes y col., 2007). Las bacterias ácido lácticas
constituyen el conjunto de microorganismo más importantes presentes en la
leche debido a sus propiedades benéficas. Son las encargadas de la
fermentación de la lactosa. Estas bacterias causantes de la fermentación
pueden ser:
• Homofermentativos: que producen casi exclusivamente ácido láctico y
cantidades mínimas de otras sustancias.
• Heterofermentativos: que producen además de ácido láctico cantidades
apreciables de productos volátiles (Jay, 2000; Axelsson, 2004).
La calidad microbiológica de la leche y productos lácteos está influenciada por la
flora inicial de la leche cruda, las condiciones del procesamiento y la
contaminación post-pasteurización (Pouch e Ito, 2001).
A lo largo del tiempo, se ha observado que la leche puede llegar a las industrias
lácteas con una alta y variada población microbiana, probablemente debido a
una ordeña deficiente, o a falta de control de la temperatura durante el
transporte y almacenamiento. Muchas de estas bacterias producen enzimas que
degradan parcialmente las proteínas y la grasa de la leche dando lugar a
sabores y aromas inaceptables para la producción de derivados de la leche
(Inda, 2000).
8
La aplicación de tratamientos térmicos a la leche principalmente la
pasteurización, tiene como objetivo eliminar los microorganismo patógenos
presentes, y en consecuencia parte de la microflora deterioradora también se
elimina contribuyendo a salvaguardar sabores y nutrientes en el producto.
1.2 Queso
Desde el punto de vista de su composición el queso puede definirse como un
producto fermentado o no, obtenido por coagulación de la leche, en forma de gel
más o menos deshidratado que retiene casi toda la materia grasa, si se trata de
un queso graso, un poco de lactosa en forma de ácido láctico y fracción variable
de sustancias minerales (Veisseyre, 1988). Según la NOM-121-SSA1-1994 son
los productos elaborados con la cuajada de leche estandarizada y pasteurizada
de vaca o de otras especies animales, con o sin adición de crema, obtenida por
la coagulación de la caseína con cuajo, gérmenes lácticos, enzimas apropiadas,
ácidos orgánicos comestibles y con o sin tratamiento ulterior por calentamiento,
drenada, prensada o no, con o sin adición de fermentos de maduración, mohos
especiales, sales fundentes e ingredientes comestibles opcionales, dando lugar
a las diferentes variedades de queso pudiendo por su proceso ser: fresco,
madurado o procesado.
El queso es uno de los derivados más importantes de la leche y aunque su
clasificación resulta un tanto difícil por el incremento en el número de variedades
existentes, la más completa de ellas es la de la FAO (Cuadro 2) que clasifica a
los quesos según la consistencia respecto a la humedad del queso desgrasado,
contenido de grasa y características de maduración. Otro tipo de clasificación es
según la textura, el tipo de microorganismo empleado, y el tiempo de
maduración (Orozco, 2004).
9
Cuadro 2. Clasificación de quesos conforme la norma A6 del Codex Alimentarius
según consistencia, contenido de grasa y características de maduración (%
HSMG-humedad del queso desgrasado, GES-grasa en el extracto seco) (FAO,
2000).
1.2.1 Etapas de la fabricación del queso
En la ciencia de la fabricación de quesos hay que considerar cinco factores
principales: la composición de la leche, la velocidad de acidificación, el
desarrollo de la acidificación, el contenido de humedad y la manipulación de la
cuajada (Lucey, 2003).
La fabricación de un queso comprende tres fases esenciales:
a) Cuajado o coagulación de la leche. La formación del gel de caseína.
b) Desuerado de la cuajada. La deshidratación parcial de este gel por
sinéresis, es decir, por la contracción de las micelas que lo forman.
c) Afinado o maduración de la cuajada. Comprende una serie de cambios de
las propiedades físicas y químicas adquiriendo aspecto, textura y
consistencia, así como su aroma y sabor característicos.
%HSMG
Designación
% GES
Designación
Designación según características de
maduración
< 51 % Extra duro > 60% Extra graso Madurado 49-56 Duro 45-60 Graso Madurado por mohos
54/69 Firme/Semiduro 25-45 Emigrase No madurado Fresco
>67 Blando <10 Desnatado En salmuera
10
1.2.2 Aspectos tecnológicos del procesamiento
Preparación de la leche.: Previamente al comienzo de la fabricación de queso
es necesario tener una leche homogénea, con parámetros óptimos establecidos
para la obtención del queso que se trate de fabricar. De esta manera se
eliminará la variabilidad de calidad en cada proceso. Entre los tratamientos se
tienen:
Filtrado. Es un método físico mediante el cual se eliminan las impurezas visibles
tales como pelos, partículas de excremento, partículas de vegetales y polvo que
pueden haber tenido acceso a la leche, pudiendo hacerlo a través de filtros
fibrosos, tamiz, mallas, paño, etc.
Pasteurización. El principal objetivo de la pasteurización es destruir las bacterias
patógenas que eventualmente se pueden encontrar en la leche.
La pasteurización se aplica también por razones técnicas como la de destruir, al
menos en parte, la flora indeseable de la leche que puede producir defectos en
el queso. De esta manera las fermentaciones ocurren de forma regular y son
más fáciles de controlar y por tanto, se puede obtener un producto de calidad
uniforme. Por otra parte, en la pasteurización se destruyen las sustancias
antibacterianas que contiene la leche cruda, lo que favorece el desarrollo de
algunas cepas de bacterias lácticas que son sensibles a estas sustancias. En
general, todos los estreptococos mesofílicos se desarrollan mejor en una leche
que ha sufrido pasteurización (Flores y López, 1998).
La pasteurización produce importantes modificaciones en la estructura de las
proteínas solubles. Por acción del calor, y de forma proporcional a la intensidad
del tratamiento, las proteínas se desnaturalizan y precipitan junto con las
micelas de caseína quedando retenidas en la cuajada. Como estos
componentes tienen la propiedad de captar y retener fuertemente el agua, su
inclusión en el coágulo dificulta el desuerado y el endurecimiento (Amiot, 1991).
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Se pueden distinguir dos métodos de pasteurización. Baja y alta. La
pasteurización baja se define por un calentamiento a 64-65ºC durante 30
minutos. Es un método lento discontinuo, pero presenta la ventaja de no
modificar las propiedades de la leche. No se coagulan las albúminas, ni las
globulinas y el estado de los glóbulos grasos permanece inalterado. Por otra
parte, aun en la actualidad, la baja calidad bacteriológica de la leche exige un
tratamiento térmico más severo. Este es tanto más conveniente cuanto que
algunos gérmenes termófilos pueden crecer a 63ºC y desarrollarse en la leche
pasteurizada.
Adición de cloruro de calcio. El calcio soluble de la fase acuosa de la leche está
en constante equilibrio con el calcio coloidal ligando a las micelas de caseína.
Para conseguir una buena coagulación, las micelas deben estar saturadas de
calcio. La refrigeración prolongada de la leche a 3-4ºC y especialmente la
pasteurización, provocan el aumento del contenido de calcio coloidal a expensas
del calcio soluble. Para restablecer el equilibrio, normalmente se añade a la
leche cloruro de calcio después del tratamiento térmico. Una parte de este
compuesto pasa a la forma coloidal con las caseínas. La dosis que se añade es
variable, en función de la intensidad del tratamiento térmico que ha recibido la
leche. Es importante que el cloruro de calcio se distribuya homogéneamente en
la masa de leche para lo cual se disuelve previamente en agua. Se debe añadir
unos minutos antes del cuajo. La adición de cloruro de calcio evita las pérdidas
de caseína durante la coagulación y hace que la textura del queso sea más
firme. Si el lactosuero tiene una apariencia lechosa, quiere decir que faltó calcio.
Generalmente el calcio se añade incluso para elaborar quesos a partir de leche
que solo ha sido precalentada porque así se obtienen coágulo con una mejor
consistencia (Amiot, 1991).
Coagulación. Los pasos iniciales en la elaboración de quesos involucra la
coagulación de micelas de caseína por la vía de dos posibles métodos:
proteólisis limitada (usando renina u otros coagulantes), acidificando (con
cultivos iniciadores o adición de ácidos) y calentando; o la combinación de estos
tres métodos (Lucey y col., 2003). Las micelas de caseína se aglomeran para
12
formar un gel compacto aprisionando el liquidó de dispersión que constituye el
suero.
Coagulación láctica o ácida. Es la que se lleva a cabo acidificando la leche por
vía biológica en el seno de la leche mantenida en reposo, siendo el único
método que permita obtener un gel homogéneo. Al reducirse el pH de la leche
provoca la alteración de las micelas de caseína, modificando su dispersabilidad.
Cuando el pH de la leche llega a ser 5.2 a 20ºC, las micelas se han
desestabilizado suficientemente para aglomerarse y formar un gel láctico. Sin
embargo, la desmineralización no es total. Para alcanzar este estado es
necesario acidificar la leche hasta un pH de 4.6 que corresponde al punto
isoeléctrico de la caseína que quedan suspendidos en el lactosuero que
contiene todo el calcio micelar en estado disuelto.
Coagulación enzimática. Es el sistema de coagulación más ampliamente
empleado en quesería. El mecanismo de acción de la enzima es como sigue: la
enzima provoca una proteólisis limitada de la caseína " con lo cual pierde sus
propiedades estabilizantes en presencia de calcio respecto a las caseínas #s1 y
$. Las micelas de caseína, cuya estructura se ha modificado, se agregan en
flóculos y después en fibras que finalmente constituyen una red tridimensional
cuya estructura se elabora progresivamente. La red retiene en su interior
lactosuero y los glóbulos grasos de manera semejante a un líquido que
impregna una esponja. La rigidez del gel está asegurada principalmente por el
fosfato cálcico coloidal que constituye una verdadera armadura. La caseína se
encuentra en forma de un complejo de fosfoparacaseinato de calcio, es decir, en
una forma muy mineralizada (Veissyre, 1988).
Los factores de los que depende la coagulación enzimática son los siguientes:
• La dosis de cuajo. Depende de la fuerza del mismo.
• La temperatura. La velocidad de coagulación es máxima entre 30 y 35ºC.
• El pH de la leche. Cuando el pH es inferior a 7 se observa una
aceleración de la gelificación porque se acerca al pH óptimo de la
13
actuación de la enzima que es 5.5, y porque se reducen las cargas
eléctricas de las micelas de caseína con lo que disminuye su estabilidad.
Corte de la cuajada. Después de que la leche ha coagulado la primera
operación que se realiza es el corte de la cuajada formada. El propósito del
cortado es el de permitir la salida de una gran proporción del suero de la
cuajada. El contenido de agua en la cuajada se reduce rápidamente cuando se
realiza el cortado en cubos pequeños (Webb, 1999).
En el momento del cortado, la cuajada debe tener una firmeza suficiente y
resistencia al corte (que corresponde a la tensión de la cuajada). Las cuajadas
muy blandas se desmenuzan durante el trabajo, formándose el polvo de
cuajada, que hace disminuir el rendimiento. Las cuajadas muy duras son
difíciles de trabajar y se forma una capa seca sobre la superficie de los trozos, y
el desuerado es imperfecto. Es importante hacer el cortado de forma
homogénea, para evitar pérdidas y de esta manera se cuidan los rendimientos
queseros.
Desuerado de la cuajada. La concentración se consigue eliminando una
cantidad mayor o menor de agua y elementos solubles. La pasta que queda está
formada esencialmente por la caseína y la materia grasa adherida a ella
físicamente. El lactosuero que se extrae contiene la mayor parte de la lactosa y
de las sustancias nitrogenadas no coaguladas y una proporción variable de
minerales. Fundamentalmente la menor cantidad de suero queda retenido en la
cuajada lo que determina muchas de las características de las distintas
variedades de queso; dureza, textura, velocidad e intensidad de la maduración,
etc. Por esta razón la operación de desuerado tiene una gran importancia en el
proceso de fabricación y además, controlando esta etapa se regula el extracto
seco total exigido por la legislación para cada tipo de queso (Amiot, 1991).
Moldeado. Después de la eliminación de gran parte del suero, los granos de
leche coagulada se colocan en moldes de diferentes tamaños y formas, que son
14
los que dan apariencia final al queso. Estos moldes pueden ser de madera,
plástico o metal (Madrid, 1990).
Prensado. La operación de prensado en la cuajada y desuerada tiene varios
fines:
• El queso se individualiza en piezas y adquiere su apariencia típica.
• Con el prensado en moldes, el queso adquiere una superficie firme que le
permite conservar su estructura en las operaciones posteriores de salado,
maduración, etcétera.
• Se consigue una eliminación adicional de suero.
El prensado tiene lugar en condiciones distintas de tiempo, temperatura, presión
y pH (según tipo de queso), que son los factores más importante que intervienen
en esta operación (Madrid, 1990).
Salado. El salado es la adición de cloruro de sodio al queso, y se lleva a cabo
principalmente mediante la inmersión directa en baños de salmuera o a través
de la aplicación de sal sódica a la corteza o mezclada con la masa. También se
puede efectuar el salado cuando los granos aún están en el contenedor, pero
ello tiene el inconveniente de que también se incorpora sal al suero, con lo que
se limita su posible aprovechamiento. Muchos son los objetivos del salado en
los quesos, entre ellos se tienen (Madrid, 1990):
• Realzar el sabor del queso
• Regular el desarrollo microbiano, tanto suprimiendo bacterias indeseables
como controlando el crecimiento de los agentes de maduración.
• Mejorar la apariencia y consistencia de los quesos.
• Facilitar la perdida de suero tras el desuerado
Maduración. En algunos quesos denominados quesos frescos, la fabricación se
interrumpe en esta fase. Los demás tipos de quesos sufren una maduración
biológica, destinada a desarrollar su sabor, al mismo tiempo que se modifica su
aspecto, textura y consistencia. Cada tipo de queso se caracteriza por su propio
15
proceso de maduración o afinado. Sin embargo, se dan tres grandes
fenómenos, aunque en diverso grado, en todos los procedimientos de afinado:
• Fermentación de la lactosa a ácido láctico, y producción de pequeñas
cantidades de ácido acético y propiónico, CO2 y diacetilo. • Hidrólisis de la grasa, la cual influye en el aroma y sabor del queso.
• Degradación de las proteínas que afecta al sabor, aspecto y textura de la
pasta (Medina, 1996).
Los agentes de afinado son numerosos y comprenden fundamentalmente: las
enzimas presentes en la leche, el cuajo, que es el origen del coágulo, y las
enzimas segregadas por la flora microbiana que se desarrolla en la cuajada.
Puesto que la maduración del queso depende esencialmente de la actividad
microbiana se sigue que los factores que regulan esta tienen un papel
determinante en el desarrollo del afinado. Entre estos factores tenemos: la
aireación, la humedad, la temperatura, contenido de sal y el pH.
1.2.3 Microbiología de los quesos
El queso es un ecosistema en cambio continuo en cuanto a los factores
externos de conservación-maduración como a los intrínsecos como la
composición y la microbiología. El queso contiene elevados contenidos
microbianos que juegan un papel importante en sus características de calidad
(Inda, 2000).
En el queso se producen reacciones bioquímicas e interacciones microbianas.
La presencia de las bacterias en los quesos depende de la contaminación
microbiana de la leche, la acidificación de la misma previa a la elaboración del
queso, los tratamientos térmicos de la leche, el uso de cultivo iniciador, las
condiciones del proceso, principalmente en cuanto a tiempo, temperaturas y
condiciones higiénicas (Peláez y Requena, 2005).
16
Los microorganismos mayoritarios que aparecen en los quesos se han divido en
dos grandes grupos: cultivos iniciadores y cultivos no iniciadores o
microorganismos secundarios (Beresford y col., 2001). Los cultivos iniciadores
son aquellos microorganismos que intervienen fundamentalmente en la
producción de ácido láctico durante la primera etapa de fabricación, la
coagulación de la leche, pudiendo intervenir de forma secundaria en la
maduración del queso. Estos cultivos iniciadores pueden estar presentes de
forma natural en la leche o ser añadidos intencionadamente.
Los cultivos no iniciadores son microorganismos que no intervienen en la
acidificación, pero desempeñan un papel muy importante durante la maduración
del queso. En estos últimos se incluyen las bacterias acido lácticas (BAL) no
iniciadoras, otras bacterias no pertenecientes al grupo de las BAL, levaduras y
mohos.
Los microorganismos secundarios se añaden a algunas variedades de queso en
los que se busca proporcionar características muy concretas, como por ejemplo
Penicillum roqueforti en quesos tipo roquefort. La presencia de bacterias
potencialmente patógenas provenientes de una mala calidad de leche está bien
documentada (Cuadro 3). Entre los patógenos reportados como los agentes
más comúnmente implicados en enfermedades transmitidas por leche se
incluyen Salmonella spp. Campylobacter spp., Escherichia coli, Mycobacterium
tuberculosis y Listeria monocytogenes (Law y Tamime, 2010).
Como se mencionó previamente, el principal método destinado al control de
patógenos es la pasteurización de la leche, aunque por sí sólo no asegura un
producto libre de patógenos. Son además factores muy importantes el tiempo y
temperatura de cocción del cuajo, así como la tasa de acidificación (Buyser y
col., 2001). Algunos patógenos pueden ser eliminados durante la fase de
cocción (Arocha y col., 1992), mientras que una tasa de acidificación lenta
puede llegar a inducir una respuesta adaptativa al pH ácido y favorecer así su
resistencia al pH ácido estomacal (Vernozy-Rozand y col., 2005).
17
Cuadro 3. Microorganismos patógenos humanos asociados con la leche y los
productos lácteos (Marth y Steele, 2001).
Organismo Enfermedad
Escherichia coli
Gastroenteritis, síndrome urémica
hemolítico
Salmonella Gastroenteritis, fiebre tifoidea
Yersinia enterolitica Gastroenteritis
Aeromonas hydrophila Gastroenteritis
Brucella spp. Brucelosis
Campylobacter jejeuni Gastroenteritis
Pseudomonas aeruginosa Gastroenteritis
Bacillus cereus Gastroenteritis
Bacillus anthracis Ántrax
Clostridium perfringens Gastroenteritis
Clostridium botulinum Botulismo
Staphylococcus aureus Intoxicación emética
Streptococcus agalactiae Dolor de garganta
Streptococcus pyogenes Fiebre escarlatina
Corynebacterium spp. Difteria
Listeria monocytogenes Listeriosis
Mycobacterium bovis Tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis Tuberculosis
Enterovirus Infección entérica
Mohos Micotoxinas
18
1.2.4 Quesos artesanales
Los quesos que actualmente se industrializan en grandes volúmenes en todo el
mundo, se empezaron a elaborar con procedimientos artesanales, que se han
venido mejorando obteniéndose mayor rentabilidad, mayor higiene y procesos
cada vez más automatizados.
Hoy en día los quesos artesanales están recobrando el digno lugar que les
corresponde, impulsándose la identidad nacional, reconociendo el ingenio de
sus artesanos, vinculando sus tradiciones regionales, con su historia y
geografía. Los sabores de los quesos, sus texturas, su forma de presentación,
los cuidados para su conservación y maduración, son propiedades especiales
que distinguen a una región de otra, un país o continente.
Estos quesos artesanales surgen por la necesidad de aprovechar la leche y
ofrecer un producto que sea aceptado por la población consumidora. El producto
comúnmente se enraíza en las zonas de consumo, convirtiéndose en un
producto indispensable en la cocina regional y a veces hasta nacional; la
mayoría de estos productos artesanales se elaboran con leche entera o
semidescremada, con un sabor característico de cada región (Esquivel, 1995).
El queso artesanal, se elabora con una tecnología que dista mucho de
aprovechar los grandes avances tecnológicos que en la actualidad se tienen
(Esquivel, 1995). Sin embargo, es de importancia mencionar que la mayoría de
los quesos producidos artesanalmente no se requieren equipos especiales o
instalaciones con alto grado en tecnología para reducir los riesgos críticos de
contaminación; lo único que se requiere son algunos cuidados, que constituyen
el saneamiento básico para el mejoramiento de la calidad de estos productos. El
carácter artesanal de esos quesos no justifica el incumplimiento de normas de
calidad que aseguren la satisfacción del consumidor en el
mercado, especialmente frente a la competencia tan cerrada que reciben de
parte de los productores de quesos en volumen industrial, tanto locales como de
origen extranjero.
19
La calidad sensorial típica de los quesos tradicionales depende de varios
factores, incluyendo las prácticas de fabricación tradicionales (leche bronca), la
alimentación de los animales lecheros, la diversidad y dinámica de las
comunidades microbianas. La composición microbiana (cualitativa y cuantitativa)
y su actividad durante el madurado juegan un papel muy importante en el
desarrollo de características sensoriales (Pogacic y col., 2010).
Muchos quesos mexicanos genuinos, en la actualidad no tienen patrones muy
claros de elaboración, no están estandarizados, ni puedan usarse como
referencia o prototipo de los quesos de su especie para producirse de manera
independiente (Santos y Villegas, 1997).
Es por lo anterior que los quesos elaborados con leche pasteurizada resultan en
productos más uniformes y de mejor calidad sanitaria. Sin embargo, la
pasteurización afecta negativamente la calidad sensorial, ya que elimina parte
de la microflora autóctona de la leche, que es responsable del sabor típico del
queso (Torres-Llanez, 2005).
Los consumidores aprecian los quesos artesanales por sus singulares
características de sabor y aroma, que es generalmente atribuida a la actividad
metabólica de la microbiota autóctona presente en la leche cruda. La utilización
de cultivos lácticos comerciales ayuda a llevar a cabo el proceso de
acidificación, pero generalmente se asocian con otras propiedades
organolépticas, pues esos microorganismos han sido seleccionados de quesos
de otras regiones. Además, el uso de cultivos lácticos industriales en
substitución de la microbiota autóctona, podría llevar a la perdida de las cepas
autóctonas a largo plazo. Generalmente, la selección de cepas lácticas
autóctonas ha ayudado a obtener productos lácteos con características similares
a los productos elaborados con leche cruda (Ramos-Izquierdo, 2009).
20
1.2.4.1 Queso de Poro de Balancán
El queso “de poro” se elabora en forma artesanal en el municipio de Balancán,
Tabasco, México. El de poro es un queso fresco, o ligeramente maduro, de
pasta blanda y prensada, elaborado con leche entera y cruda de vaca.
El producto final se obtiene después de un corto proceso de maduración de
siete días, después de los cuales puede conservarse sin refrigeración. La
elevada concentración de bacterias lácticas, así como su alta acidez permiten
mantener sin refrigeración el queso de poro.
Se presenta al mercado en piezas pequeñas, prismático-rectangulares. El queso
de poro se comercializa a los pocos días de producido; sin embrago, por
problemas de distribución puede ocurrir que su venta se retarde varias semanas
y durante ese tiempo la pasta del queso continúa un proceso de maduración,
hasta llegar al consumidor (Cervantes y col., 2006).
En cuanto al rendimiento, en este producto se obtienen cifras que oscilan entre
9 y 10 kg de queso por 100 L de leche procesada planas, con un peso que
oscila entre 250 g y 1 kg (Figura 4). Las piezas vienen parafinadas (cubiertas
con parafina transparente) y envueltas en papel celofán amarillo, bajo el cual
luce su etiqueta. La envoltura le imprime una presentación muy atractiva para el
comprador.
La pasta de este queso se encuentra fuertemente desmineralizada debido al
reposo prolongado (varias horas) de la cuajada húmeda en el molde. Durante el
proceso de desmineralización la acidez de la pasta aumenta, constituyéndose
ésta en un factor para su conservación.
21
Figura 4. Queso de Poro de Balancán.
Otra característica notable de la pasta es su friabilidad (se desmorona
fácilmente) cuando ya ha perdido mucha humedad; por ejemplo, si el queso ha
madurado algunas semanas.
El queso de poro es un producto meramente regional que se elabora en la Zona
de Los Ríos en el estado de Tabasco; concretamente en los municipios de
Balancán y Tenosique. En su fabricación se emplea leche de ganado cruzado
cebú-pardo suizo.
Algunos pasos notables en la elaboración de este queso son (Cuadro 4):
• Adición de suero ácido a la leche. A la leche cruda y fresca de fabricación
se le agrega alrededor de 5 % en volumen de suero ácido, de la víspera.
El suero ácido cumple la función de un cultivo láctico, aunque rústico; su
propósito es desarrollar rápidamente acidez en la pasta durante el reposo
y moldeo de la cuajada.
• Reposo de la cuajada. Después del cortado del gel en bloques, se
permite un reposo de 2-4 horas. El propósito de esta operación es
propiciar la multiplicación de microorganismos acidificantes nativos en la
leche, y consecuentemente, el desarrollo de acidez en la masa. Los
bloques quedan sumergidos en el suero.
22
• Moldeado. Se efectúa disponiendo la cuajada en moldes de madera,
prismático- rectangulares. Ahí la cuajada se auto-prensa. Por auto-
compresión la pasta exuda suero gradualmente el cual escapa por los
orificios laterales del molde y por la apertura inferior del mismo.
• Reposo de la cuajada en moldes. Tras el moldeado se efectúan cuatro
vires o inversiones de los moldes, en un lapso de 2-4 horas; el propósito
es continuar acidificando (y desmineralizando) la pasta y lograr una
buena consistencia en las piezas, antes del prensado.
• Después del último “vire”, la cuajada permanece dentro de los moldes
durante un tiempo prolongado, entre 15 y 20 horas.
• Prensado. Este se lleva a cabo empleando prensas rústicas de madera
resistente. En ellas cada “queso verde” queda sujeto a la pesa de
concreto o metal.
• Maduración parcial de pasta. Se efectúa colocando las piezas de queso
recién desmoldado, en un armario de madera, cerrado. Dentro de este se
mantienen las piezas en pilas durante dos días. Debido a la elevada
temperatura que reina dentro del armario (entre 30 y 40ºC), se produce
una maduración acelerada de la pasta; esto repercute en el fuerte olor-
sabor, característico del queso de Poro.
• Salado. El salado final del queso se realiza frotando cada pieza con sal
fina, en sucesivas aplicaciones, durante 3 días, Después de cada frotado,
las unidades se reintroducen en el armario de maduración.
• Raspado de la costra. Posteriormente al salado se imparte a las piezas
un oreo de 2-4 horas a temperatura ambiente; luego empleando un
cuchillo o una espátula se limpia el “limo” que se ha generado en la
corteza de cada queso por la actividad microbiana de superficie.
• Parafinado. Se lleva a cabo sumergiendo las piezas de queso,
previamente lavadas y oreadas, en un baño de parafina blanca fundida.
El objetivo es formar una barrera contra la deshidratación del producto y
la invasión de mohos.
• Empacado. Las piezas de queso, ya parafinadas, se envuelven en papel
celofán amarillo debajo del cual se coloca una etiqueta de identificación
comercial.
23
Cuadro 4. Diagrama de elaboración de queso de Poro.
24
1.3 Cultivo iniciador
En 1873 Lister aisló un cultivo iniciador puro y confirmó el papel de los
microorganismos en la fabricación de los quesos (Powell y col., 2002), a partir
de 1890 cuando comienza a desarrollarse la tecnología de los cultivos
iniciadores.
Tradicionalmente los cultivos iniciadores que se usaban era la microflora
autóctona que contiene la leche, esta proporcionaba la producción de ácido
láctico y daba las características organolépticas específicas de cada queso, sin
embargo como la microflora es variable, la producción de ácido no era la misma,
dando como resultando quesos con calidades diferentes.
Los iniciadores lácteos son cultivos inofensivos de bacterias activas que crecen
en la leche o en el suero, los cuales imparten ciertas características y calidades
a varios productos lácteos. Los cultivos pueden ser de una o varias especies de
microorganismo. Consisten en bacterias ácido lácticas, propionibacterias,
bacterias superficiales maduradoras, levaduras y mohos. Los cultivos iniciadores
son ahora liofilizados con componentes de la leche y nutrientes y son
distribuidos comercialmente (Kosikowski, 1977).
Los fermentos lácticos dan lugar a:
a) Acidificación de la leche, con la consiguiente disminución del pH.
b) Segregación de enzimas proteolíticas que ayudan a la
descomposición de las proteínas durante la posterior maduración.
c) Segregación de enzimas lipolíticas que ayuda a la descomposición de
las grasa, lo que facilita la maduración del queso.
d) Aparición de sustancias aromáticas típicas de los quesos (Madrid,
1999).
Los cultivos iniciadores también pueden tener un papel importante durante la
maduración, debido fundamentalmente a la producción de compuestos
aromáticos a partir de la lactosa, el citrato y las proteínas y péptidos de la leche,
25
además de contribuir a cambios en la textura, como consecuencia de la
degradación de proteínas y grasas.
El grupo más importante empleado en los cultivos iniciadores son las BAL.
Consiste en un grupo filogenéticamente diverso de géneros de bacterias Gram
positivas de morfología cocoidea o bacilar, catalasa negativa, no esporulantes y
anaerobios-aero tolerantes, que originan ácido láctico como producto final de la
fermentación de azúcares (Makarova y Koonin, 2007).
El grupo de las BAL está constituido por los siguientes géneros:
1. Bacterias en forma de coco: Streptococcus, Lactococcus,
Vagococcus, Enterococcus, Pediococcus, Aerococcus,
Tetragenococcus, Leuconostoc y Atopobium.
2. Bacterias en forma de bacilo: Lactobacillus y Carnobacterium.
3. Otros géneros afines: Bifidobacterium, Micrococcus, Brevibacterium y
Propionibacterium.
De estos géneros de BAL los más utilizados en la industria láctea como cultivos
iniciadores pertenecen los géneros: Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus y
Leuconostoc. Un quinto género, Enterococcus, es encontrado ocasionalmente
en cultivos iniciadores de mezclas.
Lactococcus. Células en forma de coco dispuestas en cadenas de longitud
variable. Poseen un metabolismo homofermentativo, produciendo ácido L-láctico
a partir de la lactosa. Su temperatura de crecimiento es de 30ºC. Las especies
de lactococos comúnmente encontradas en la leche son: Lactococcus lactis
subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris y Lc. raffinolactis (Mundt, 1986). Los
Lactococcus completan la acción del cuajo, liberando péptidos de pequeño
tamaño y aminoácidos libres, los cuales son el origen de compuestos que
intervienen directamente en el sabor de los quesos o constituyen precursores de
los aromas.
26
Leuconostoc. Células con forma esférica o lenticular dispuestas en pares y
cadenas y se encuentran comúnmente en cultivos mesófilos. Fermentan los
azúcares de forma heterofermentativa, produciendo cantidades equimolares de
lactato, etanol y CO2. Las especies de Leuconostoc que más comúnmente se
encuentran asociadas a la leche, y por tanto, al queso, son: Leuconostoc
mesenteroides subsp. mesenteroides, Ln. mesenteroides subsp. dextranicum,
Ln. desenteroides subsp. cremoris, Ln. paramesenteroides y Ln. lactis. Al ser
bacterias heterofermentativas, producen etanol, ácido acético y diacetilo,
contribuyendo de forma importante a la formación del aroma.
Streptococcus. Bacterias lácticas mesófilas homofermentativas, tolerante, capaz
de crecer a 52ºC y fermentan solo un número de carbohidratos. Las dos únicas
especies mesófilas de gran importancia en quesería son Streptococcus lactis y
Streptococcus cremoris.
Lactobacillus. Células en forma de bacilo que pueden ser largos, o cortos y
normalmente aparecen en forma de cadenas. Este género se divide en tres: 1)
homofermentativo, que fermentan exclusivamente las hexosas a ácido láctico; 2)
heterofermentativos facultativos, producen solo ácido láctico, etanol y ácido
fórmico cuando la glucosa es limitada; y 3) heterofermentativos obligados,
fermentan hexosas a ácido láctico, ácido acético (o etanol) y dióxido de carbono.
Pueden causar sabores indeseables y formación de gas en madurado de
quesos (Cuadro 5) (Vernozy-Rozand y col., 2005).
Los cultivos iniciadores usados en productos lácteos se dividen en mesófilos y
termófilos, basados en su temperatura óptima de crecimiento. Los cultivos
mesofílicos crecen a temperaturas de 10-40 ºC con temperatura óptima de
alrededor 30ºC. Los cultivos termófilos tienen temperatura óptima de crecimiento
alrededor de los 40 y 50ºC. Cada uno de estos grupos se puede subdividir a su
vez en cultivos de cepas definidas y cultivos mixtos.
27
Cuadro 5. Principales especies de lactobacilos asociados a productos lácteos
agrupados según el tipo de fermentación (Martin- Platero, 2008).
Homofermentativos Heterofermentativos
Facultativos Obligados
Lb. Acidophilus Lb.casei Lb.bifermentans
Lb. Helveticus Lb. Coryneformis Lb. Brevis
Lb. Delbreckii subsp.Delbreckli Lb.curvatus Lb. Buchneri
Lb. Delbreckii subsp. Lactis Lb.paracasei Lb.fermentum
Lb. Delbreckii subsp.Bulgaricus Lb.plantarum Lb. Kefiri
Cultivos de cepas definidas: son cultivos puros cuyas características fisiológicas
son conocidas y están identificadas. Estas cepas son aisladas de cultivos
mixtos, o de productos fermentados por las bacterias lácticas de flora nativa.
Este tipo de cultivo puede tener iniciadores de cepa única o de múltiples cepas,
la cual son elegida(s) con características específicas como resistencia a fagos o
perfil óptimo proteolítico.
Cultivos mixtos: contienen diferentes cepas definidas de diferentes especies.
Aunque este tipo de cultivos contienen diferentes cepas, se conoce que
finalmente una cepa será predominante a expensas de las otras (Salminen y
Wright, 1993; Chandan y Kilara, 2011).
El cultivo iniciador es uno de los principales factores que determinan la calidad y
propiedades del producto final, se agrega dependiendo del tipo de queso que se
va a elaborar. Si el queso es de pasta blanda se usan cultivos de acidificación
rápida, como el compuesto por Lactococcus lactis, subespecie lactis y
Lactococcus lactis subespecie cremoris. Para obtener quesos de pasta dura y
firme, se utilizan cultivos con capacidad proteolítica y lenta producción de ácido.
28
1.3.1 Bacterias ácido lácticas no iniciadoras
La microbiota láctica secundaria NSLAB por sus siglas en inglés (non starter
lactic acid bacteria), son bacterias lácticas que contaminan la leche después de
la pasteurización, o bien que sobreviven al tratamiento térmico aun en baja
proporción o en un estado no cultivable. Estas bacterias se desarrollan
espontáneamente en la etapa de maduración en todos los quesos, provocado
por la autolisis por los organismos iniciadores, liberando sustratos de
crecimiento y enzimas, dando lugar al incremento de NSLAB (Fitzsimons y col.,
1999).
Las NSLAB no contribuyen significativamente a la producción de ácido láctico al
comienzo de la fabricación (coagulación), y además están presentes en bajo
número al inicio de la fermentación, sin embargo suelen ser microorganismos
tolerantes a la sal y al pH ácido, por lo que pueden crecer bien durante la
maduración del queso, las NSLAB suelen encontrarse en concentración de 102-
103 UFC/g tras el prensado, para alcanzar niveles de 107-108 UFC/g tras unos
tres meses de maduración (Fox y col., 1998).
Estas bacterias son fundamentalmente cepas seleccionadas de especies de
lactobacilos mesófilos. La causa de su adición como cultivos adjuntos a los
iniciadores radica en que estas bacterias se han encontrado en elevados
recuentos de queso maduro, es por eso que se cree que deben tener alguna
función.
1.4 Caracterización de la flora microbiana en alimentos
La microbiología de alimentos ha tendido a dividir en partes la investigación de
los microorganismos, enfocándose en el estudio o la detección de únicamente
de ciertos grupos. Recientemente, se ha visto la necesidad de tomar en cuenta
el ecosistema completo, ya que el crecimiento, la sobrevivencia de cualquier
especie, pueden estar determinados por la presencia de otras especies (Díaz y
Wacher, 2003).
29
Aunque las pruebas bioquímicas siguen siendo hoy día muy importantes en la
identificación de los microorganismos, sin embargo tienen serios inconvenientes.
Algunos de ellos se enumeran a continuación:
• Las técnicas fenotípicas no siempre son reproducibles. • Tampoco permiten obtener información sobre la diversidad genética de
los distintos aislados ni por supuesto diversidad genética de la
comunidad de la cual se han aislado. • Sólo se pueden aplicar en aquellos microorganismos cultivables (Giraffa y
Neviani, 2001).
Ya que el uso de métodos convencionales para la identificación de
microorganismos resulta insuficiente, en los últimos años se han desarrollado
numerosos métodos moleculares que permiten conocer a fondo la microbiota
presente en los alimentos. El empleo de uno u otro, suele estar a menudo
condicionado con el nivel de información requerido: detección, identificación,
cuantificación y tipificación. Las tres primeras se pueden llevar a cabo tanto
mediante la utilización de técnicas dependientes o independientes de cultivo,
mientras que el análisis de tipificación sólo puede aplicarse a métodos
dependientes de cultivo (Dahllöf, 2002; Giraffa, 2004).
1.4.1 Técnicas dependientes de cultivo
Las técnicas de identificación de los microorganismos dependientes de cultivo
incluyen tanto las tradicionales técnicas microbiológicas, basadas en caracteres
fenotípicos, como las genotípicas y filogenéticas. Mediante el uso de los
métodos tradicionales, se realizan recuentos de microorganismos y se
determina su diversidad en medios sintéticos con agar, pero en algunos casos
se requiere un período de incubación en medio líquido, para promover el
crecimiento de microorganismos específicos o seleccionarlos, ya que su
aislamiento sería imposible sin este paso. El gran inconveniente de los métodos
microbiológicos clásicos dependientes de cultivo es la imposibilidad de llegar a
tener una visión precisa de la biodiversidad de estos ecosistemas complejos. Al
30
utilizar los métodos de enriquecimiento y crecimiento en medios microbiológicos,
la microbiota originalmente presente en la muestra es sometida a importantes
cambios debido a la capacidad de ciertas especies para dominar el entorno y
superar a los otros componentes microbianos. Por esta razón la población
numéricamente menos importante, o en condiciones de estrés, apenas es
recuperada e identificada. Con los métodos dependientes de cultivo hay un alto
riesgo de errores de identificación de la ecología de los complejos ecosistemas
microbianos (Hugenholtz y col., 1998). Aunque el cultivo tiene como resultado
una visión general de la flora microbiana, solo las cepas que pueden crecer bajo
las condiciones selectivas pueden ser monitoreadas y su caracterización
fenotípica puede no ser confiable, pues ésta depende del medio de cultivo y las
condiciones ambientales usados en el ensayo. Éste enfoque es limitado por su
sensibilidad y no es apropiado para análisis de rutina para subespecies o cepas
(Beresford y col., 2001).
Las técnicas dependientes de cultivo muy a menudo representan una desviación
de la composición real de las comunidades dado que suelen proporcionarse
condiciones que distan de las presentes en el medio del cual fueron extraídas.
En la mayoría de los casos la ausencia de interacciones con otras poblaciones,
implica que solo presenten crecimiento poblaciones con la mayor
representatividad o cuyo nicho ecológico incluye las condiciones representadas
in vitro. Para resolver este tipo de problemas se ha planteado el uso de técnicas
independientes del cultivo para el estudio de comunidades bacterianas
complejas.
1.4.2 Técnicas independientes del cultivo
Las técnicas independientes de cultivo tratan de resolver algunos de los
problemas asociados con la identificación bacteriana, ya que el porcentaje de
recuperación de las bacterias mediante técnicas tradicionales es bajo, debido a
la dificultad de obtener cultivos puros de cierto microorganismo por la
dependencia de las actividades de otros microorganismos o por la falta de
conocimiento de no las condiciones para su cultivo. Es por lo anterior que las
31
técnicas independientes de cultivo tratan de determinar la diversidad microbiana
en los ecosistemas, tanto en el espacio como en el tiempo, sin necesidad de
recurrir al aislamiento (Díaz y Wacher, 2003).
En los últimos años los métodos moleculares basados en la extracción del ADN
han tenido una gran aplicación en el campo de trabajo de la microbiología, ya
proporcionan una herramienta sobresaliente para la detección, identificación y
caracterización de microorganismos encontrados en muestras ambientales,
alimentos y otros ecosistemas complejos (Pogacic y col., 2010). Las limitaciones
de estos procedimientos suelen estar asociados con aspectos técnicos, por
ejemplo en la extracción de ADN/ARN de la muestra, los errores propios de la
amplificación del ADN (Forney y col., 2004).
En el Cuadro 6 se muestran algunas de las técnicas moleculares mas usadas
en la microbiología.
Cuadro 6. Técnicas moleculares más frecuentes.
Identificación
Hibridación
Métodos basados en la PCR (ARDEA-PCR, ITS o RISA, amplificación de genes metabólicos)
Secuenciación del ADN Tipado (Métodos
basados en la RFLP)
Ribotipado
REA-PFGE
Tipado (Métodos basados en la
PCR)
RAPD;Rep-PCR
ITS o RISA AFLP
Acronimos: ARDRA, Amplification Ribosomal DNA Restriction Analysis; ITS, Internal Transcribed Spacer; RISA, rRNA gene Internal Spacer Analysis; RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism; REA-PFGE, Restriction Endonuclease Analysis-Pulses Fiel Gel Electrophoresis; RAPD, Randomly Amplified Polymorphic DNA; Rep-PCR, Repetitive Extragenic Palindromic PCR; AFLP, Adaptor Fragment Length Polymorphism.
32
1.4.2.1 Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA)
El uso de métodos moleculares para describir y controlar la diversidad
microbiana ha mejorado considerablemente el conocimiento de la estructura de
la población en las comunidades microbianas naturales. Entre todas las técnicas
moleculares disponibles para estudiar las comunidades bacterianas, el análisis
del espaciador intergénico ribosomal (Ribosomal Intergenic Spacer Análisis,
RISA por sus siglas en ingles) ha demostrado ser un método fiable, y
relativamente barato.
RISA es un método que proporciona estimaciones de la diversidad microbiana y
la composición de la comunidad sin el sesgo que impone los enfoques basados
en el cultivo o la labor de la construcción de librerías de clones del gen de la
subunidad de ARNr. El método implica la amplificación por PCR a partir de todo
el ADN de la comunidad bacteriana del espacio intergénico (ITS: internal
transcribed spacer) dentro del operón que codifica para el ARN ribosomal
(rARN). En particular, el fragmento analizado corresponde a aquel espacio entre
los genes que codifican para la subunidad pequeña (16S) y grande (23S) del
mismo (Fisher and Triplett 1999). Este espacio intergénico 16S-23S se
caracteriza por ser heterogéneo tanto en su secuencia como en la longitud del
mismo. Esta heterogeneidad se debe, principalmente, a la presencia (en
bacterias Gram negativas ) o ausencia (en bacterias Gram positivas) de
secuencias que codifican para ARN de transferencia (tARN) en esta región
intergénica (Liao, 2000). Estos dos tipos de variación (i.e. secuencia y longitud)
hacen a este espacio intergénico una región muy útil para la tipificación de
cepas y separación entre especies bacterianas cercanas entre sí en aquellos
casos donde la secuencia del gen ribosomal 16S rARN no permite suficiente
resolución (Scheinert y col., 1996). La estructura del operón rARN en bacterias
comprende tres secuencias de genes y dos regiones espaciadoras (Figura 5).
Debido a su tamaño manejable de aproximadamente 1500 pb, el gen 16S del
rARN se ha convertido en la parte del operón mejor caracterizado con más de
33000 secuencias de fuentes bacterianas. Sin embargo, la detección y
33
diferenciación basada en rADN 16S, puede ser obstaculizado por la
heterogeneidad secuencial intraespecies o por homología entre especies
relacionadas. Los genes de la unidad grande ribosomal del ARN, el rADN 23s,
ha sido menos usado debido a su mayor tamaño. El número de secuencias
disponibles en base de datos es muy pequeña, comparada con los datos de 16S
(Sachse, 2003).
Figura 5. Organización estructural de genes de ARN ribosomal en bacterias
(Sachse, 2003).
En los perfiles obtenidos a partir de la técnica RISA (Fisher y Triplett ,1999)
concluyeron que las relaciones entre el número de fragmentos en el perfil y la
diversidad absoluta de la comunidad que el perfil representa debe ser realizada
con cautela. Estos autores señalan que, por un lado la existencia de
solapamiento en la longitud del espacio intergénico entre organismo no
relacionados puede llevar a una subestimación de la diversidad mientras que,
por otro lado, un mismo organismo puede estar aportando más de una señal al
perfil como consecuencia de diferencias en las longitudes de los espacios
intergénicos de las distintas copias del operón, dentro de un mismo genoma.
34
2 OBJETIVOS
2.1 General
Elaborar queso tipo Poro con cultivos iniciadores obtenidos durante el proceso
tradicional de manufactura, que mantenga las características fisicoquímicas y
sensoriales del queso elaborado artesanalmente.
2.2 Específicos
• Caracterizar microbiológicamente quesos Poro colectados en Balancán,
Tabasco.
• Elaborar queso tipo Poro con la adición de cultivos iniciadores
seleccionados.
• Determinar las características fisicoquímicas y microbiológicas del
producto obtenido.
• Evaluar las características sensoriales del queso tipo Poro.
• Conocer la evolución de las poblaciones microbianas presentes en el
queso mediante la técnica molecular RISA.
35
3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales y equipo
3.1.1 Caracterización de quesos de poro
• Hielera
• Refrigerantes
• Balanza
• Quesos de poro (7, 30 y 60 días de maduración)
• Hieleras
• Refrigerantes
• Cuchillo
3.1.2 Elaboración del queso
• Ollas de 80 L
• Tina Quesera
• Prensa vertical
• Mesas de trabajo
• Termómetro
• Cronómetro
• Estufa
• Moldes de 500 g
• Termómetro
• Cronómetro
• Liras verticales y horizontales
• Manta
• Agitadores
36
3.1.3 Análisis microbiológicos
• Balanza analítica, Denver Intruments APX-602
• Potenciómetro, Orión 410
• Vortéx, Genie
• Homogeneizador de alimentos, Interscience
• Incubadoras (22, 30, y 35ºC)
• Cajas Petri
• Tubos con tapón de rosca
• Micropipeta 100-1000 µL
• Puntas 20-200 µL, 200-1000µL
• Bolsas de plástico
• Probeta 100 / 300 mL
• Asas de vidrio en forma “L”
3.1.4 Análisis sensorial
• Cabina de sensorial
• Vasos desechables
• Platos desechables
• Servilletas
3.1.5 Análisis moleculares
• Equipo de electroforesis, Owl Easycast B2, Thermo scientifix
• Fuente de poder para electroforesis, EPS301, GE
• Fotodocumentador, KODAK
• Termociclador, Techne TC512
• Centrifuga, Universal Zentrifuge Z400, Hermle
• Baño termo regulador, Shel Lab
• Tubos eppendorf de 2 mL
• Tubos para PCR 200 µL
37
• Puntas 0.5-10 µL
• Micropipeta
• Vidrio Molido
3.2 Reactivos
3.2.1 Elaboración de queso
• Leche
• Cloruro de calcio
• Cuajo
• Cloro (sanitizante)
3.2.2 Medios de cultivos
La composición de los medios de utilizados, se expresa en gramos por litro de
agua o tampón. Los medios se esterilizarán en autoclave a 121ºC durante 15
minutos, excepto el agar Rojo-Bilis.
• Agar cuenta estándar, BD Bioxon (ACE)
• Agar Lactobacilli MRS BD Difco (MRS) • Agar Rojo Violeta
• Agar papa dextrosa, Bioxon (APD)
• Diluyente de peptona de caseína 0.1%, Bioxon (DP)
3.2.3 Análisis moleculares
3.2.3.1 Extracción de ADN
• Solución citrato de sodio (2%)
• Fenol equilibrado pH 9.0
• Etanol absoluto, Meyer
• Etanol (70%), Meyer
38
3.2.3.2 Electroforesis
• Tampón TBE 1x, Ultrapure™, Invitrogen
• Solución de bromuro de etidio (0.5 µg/ml)
• Agarosa Ultrapure™, Invitrogen
• Marcador de peso molecular de ADN 100 pb, Invitrogen
• Tampón de carga 10x, Invitrogen
3.2.3.3 Amplificación por PCR
• Tampón de PCR 10x, Invitrogen.
• Solución stock dNTP (2.5 µm), Invitrogen.
• Solución stock de primers ITSF 100nmoles (5’-
GTCGTAACAAGGTAGCCGTA-3’) e ITSReub 100 nmoles (5’-
GCCAAGGATCCACC-3’).Integrated DNA Technologies.
• Takara Ex Taq™ hot star versión
• Albumina de suero bovino (BSA), Invitrogen
• Tampón TBE 1x, Ultrapure™, Invitrogen
3.3 Metodología
3.3.1 Caracterización microbiológica de quesos de Poro de Balancán, Tabasco.
Se colectaron muestras de leche, cuajada y queso de cuatro queserías,
ubicadas en Balancán, Tabasco en dos diferentes épocas (seca y lluviosa). Las
muestras se refrigeraron y se transportaron a la Universidad Autónoma de
Querétaro.
3.3.1.1 Análisis microbiológicos
Después de colectar los quesos de las cuatro queserías se procedió a la
determinación de microorganismos patógenos (Salmonella spp., Staphylococcus
aureus y Listeria monocytogenes) y a la cuantificación de microorganismos
39
indicadores (bacterias mesófilas aerobias, bacterias acido lácticas, coliformes
totales, coliformes fecales, Escherichia coli, hongos y levaduras), para poder
caracterizar la flora microbiana presente en los diferentes tiempos de
maduración del queso de Balancán, Tabasco.
Se pesaron 10 g de la muestra en cuestión y se agregaron 90 ml de diluyente de
peptona (0.1 % peptona de caseína), se homogeneizó en stomacher por un
minuto, y se prepararon series de diluciones decimales necesarias para efectuar
los recuentos de manera adecuada. Este procedimiento se hizo para los análisis
de bacterias acido lácticas, bacterias mesófilas aerobias, hongos y levaduras,
coliformes totales, coliformes fecales y E. coli. Para los microorganismos
patógenos (Salmonella spp., Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes)
se pesaron 25 gr de la muestra y se adicionó un caldo especifico para cada
microorganismo.
3.3.1.1.1 Bacterias mesófilas aerobias (BMA)
Se hizo el recuento por el método de vaciado en placa en agar cuenta estándar.
Las placas se incubaron a 35ºC por 24-48 h.
3.3.1.1.2 Bacterias ácido lácticas (BAL)
Se hizo el recuento por el método de extensión en superficie en agar MRS. Las
placas se incubaron a 30º C por 48 h.
3.3.1.1.3 Hongos y levaduras
Se hizo el recuento por el método de vaciado en placa en agar papa-dextrosa.
Las placas se incubarán a 22ºC por 120 h.
40
3.3.1.1.4 Coliformes totales, fecales y E. coli
Para el análisis de coliformes totales, coliformes fecales y E. coli en las
muestras de queso de poro traídas de Balancán, Tabasco, se usó la técnica de
número más probable (NMP). Para la prueba presuntiva se empleó un batería
de 9 tubos con caldo lactosado (3 incubados con 0.1 g, 3 con 0.01 g y 3 con
0.001 g) los cuales se incubaron a 35ºC por 48 h. De cada tubo positivo
(formación de gas adentro del tiempo de incubación) se tomó una alícuota de
(40 µL) y se inocularon por separado dos tubos conteniendo CLBVB y un tubo
con caldo lauril sulfato con MUG. Uno de los tubos con CLBVB se incubó a 35ºC
por 48 h; el tubo restante de CLBVB y el caldo lauril sulfato con MUG se
incubaron a 44.5ºC en un baño de precisión durante 48 h.
3.3.1.1.5 Salmonella spp.
La muestra se pre-enriqueció en caldo lactosado (CL) por 18-24 h a 35ºC, se
tomó una alícuota de 1 mL de este caldo incubado y se inocularon tubos con
caldo de enriquecimiento (Tetrationato y Rappaport) los cuales se incubaron a
43ºC durante 24 h. Posteriormente se llevó a cabo el aislamiento de Salmonella
en agar XLD y agar sulfito bismuto y se incubó a 35ºC por 24 h. Las colonias
sospechosas se confirmaron mediante pruebas bioquímicas y serológicas.
3.3.1.1.6 Staphylococcus aureus
Se realizó el recuento por la técnica de extensión de superficie en agar Baird
Parker, se incubaron las placas a 35ºC de 24 a 48 h. Las colonias sospechosas
se inocularon en agar BHI y se incubaron de 18-24 h para llevar a cabo la
prueba de coagulasa y termonucleasa.
3.3.1.1.7 Listeria monocytogenes
La muestra se pre-enriqueció en caldo LEB (Listeria Enrichment Broth) incubado
48 h a 35ºC, posteriormente se aisló en medio Oxford modificado (MOX) el cual
41
se incubó de 24-48 h a 35ºC, las colonias sospechosas se confirmaron mediante
pruebas bioquímicas.
3.3.2 Elaboración del queso tipo poro. La elaboración del queso tipo poro con leche pasteurizada se realizó en dos
etapas. La primera de ellas a la cual denominaremos Lote 1 (prueba preliminar)
se realizó con el propósito de determinar el mejor inóculo capaz de producir las
características sensoriales esperadas en el queso. La segunda etapa o prueba
definitiva (Lote 2) consistió en elaborar con el inóculo seleccionado en la etapa
1.
3.3.2.1 Prueba preliminar
Se probaron tres tipos de inóculos los cuales se describen en el Cuadro 6.
Adicionalmente se evaluó el tipo de empaque al cual se sometió el queso:
recubrimiento con parafina y empacado al vacío.
Cuadro 7. Origen del inóculo empleado para la producción de quesos tipo poro elaborados con leche pasteurizada.
Cultivo iniciador Origen Año de
recolección Tiempo de
almacenamiento Almacenamiento
A Suero fermentado del
rancho Bejucal, Balancán Tabasco
2011 1 año Congelado (-18 ºC)
B Suero fermentado del
racho Bejucal, Balancán Tabasco
2012 4 días Refrigerado (4ºC)
C
Suero fermentado reposado 24 h del
racho Bejucal, Balancán Tabasco
2012 5 días Refrigerado (4ºC)
42
3.3.2.1.1 Preparación del queso
La elaboración de queso tipo poro, se realizó en la planta pilotó de las
instalaciones de la UNAM campus Tequisquiapan, Querétaro. La leche se
recibió cruda de la ordeña de la mañana, con una acidez de 14 a 17ºD, y se filtró
con una malla (manta de cielo). La leche se colocó en 3 tinas diferentes con 40 l
cada una, se pasteurizó a una temperatura de 65 ºC durante 30 minutos. Se
enfrió mediante la agitación de la leche con una pala de acero inoxidable
(desinfectada) hasta llegar a los 37ºC. Se adicionaron 800 ml de cada inóculo,
(suero A, B o C), cada uno en una tina diferente, además de adicionar 8 g de
cloruro de calcio y 6 ml de cuajo enzimático (renina), con un cuajo enzimático de
potencia 1:10,000. Se aplicó agitación severa por 30 s para disolver y
homogeneizar el cloruro de calcio y el calcio enzimático. Se mantuvo en reposo
la leche con la mezcla de aditivos por 40 minutos a 35ºC. Se realizaron cortes
de 2 x 2 cm con liras de acero inoxidable en cada tina. Se dejó en reposo por 2
h. Se pasó la cuajada (tira de 2 x 2 cm) a moldes perforados grandes,
previamente desinfectados junto con una manta lavada y se hizo un vire
después de dos horas. Se dejó reposar 18 h. Se transfirió la cuajada
(desuerada) a moldes desinfectados y perforados de 500 g, se colocó una
manta limpia y se prensó en una prensadora tipo holandesa por 24 h. Se retiró
el queso de la prensa junto con el molde y la manta. Se saló (1er salado) por
frotación 50 g/ Kg de queso. Se volvió a prensar por 24 h sin la manta. Se retiró
el queso de la prensa y se volvió a salar por frotación (2do salado). Se colocó el
queso en una mesa de acero inoxidable previamente lavada y desinfectada a
temperatura ambiente, y se dejó reposar durante 24 h. Se retiró la corteza del
queso, quitando la superficie dura formada. Nuevamente se saló con 50g /Kg del
queso (3er salado). Se dejó reposar nuevamente en la mesa de acero inoxidable
a temperatura ambiente por 48 h. Se lavó manualmente el queso con agua
potable, quitando el exceso de sal y dando forma al queso, eliminando toda
irregularidad (agujeros, granos de sal). Se dejó orear 2 h para eliminar el agua
contenida por el lavado. Para el empaque del queso, se usaron dos métodos:
cubierta de parafina y empacado al vacío. Para la cubierta de parafina, esta se
fundió a 45ºC y con la ayuda de unas pinzas y una cuchara se bañó el queso
43
con la parafina fundida e inmediatamente se solidificó; se repitió este paso por 3
veces, obteniendo tres capas de parafina. El empacado al vació se realizó en
una empacadora con bolsas de polipropileno, aplicando una presión de 0.8 bar.
Se identificaron por medio de una etiqueta el inóculo correspondiente a cada
queso. Los quesos se conservaron a temperatura ambiente.
3.3.2.1.2 Análisis microbiológico
Para las muestras del Lote 1 se hizo el recuento de microorganismos
indicadores (bacterias mesofilicas aerobias, coliformes totales, bacterias acido
lácticas, hongos y levaduras) cada 7 días para observar el comportamiento de
la flora microbiana a diferentes tiempos de maduración del queso. Los métodos
empleados se describieron previamente en el apartado 3.3.1.1.
3.3.2.1.3 Prueba sensorial
Se realizó una pequeña prueba sensorial entre los trabajadores de la plata pilotó
de la UNAM para seleccionar cual inóculo producía las características
sensoriales más similares del queso de poro de Balancán, Tabasco. El inóculo
seleccionado fue el A (suero fermentado del rancho Bejucal colectado en el
2011).
3.3.2.2 Prueba definitiva
3.3.2.2.1 Estabilización del inóculo para la elaboración del Lote 2 de queso tipo Poro.
Habiendo seleccionado el suero que proporcionó las mejores características
sensoriales al queso Poro elaborado con leche pasteurizada, se procedió a
evaluar la estabilidad del inóculo. Se inocularon 50 ml del suero seleccionado en
500 ml de leche ultrapasteurizada (Alpura ®), se homogeneizó y se incubó a 35
ºC durante 24 h; al término de la incubación se observó una mínima separación
44
de fases (suero y cuajada). El suero se separó de la cuajada, obteniendo 200 ml
de él, se colocó en tubos falcón de 50 ml y se congeló a – 18ºC por 24 h.
Después del tiempo transcurrido se descongeló el suero y se inoculó
nuevamente en leche ultrapasteurizada y se continuó con el proceso descrito
previamente cuatro veces más, a partir del quinto pase se fueron aumentando
100 ml de leche y 10 ml de suero por cada pase que se realizaba, hasta llegar al
décimo pase con 1000 ml de leche ultrapasteurizada y 100 ml de suero,
obteniendo de esta manera 500 ml de suero. Al término de cada ciclo de
fermentación se midió el pH y la acidez titulable, y se guardó una pequeña
porción para llevar a cabo posteriormente los análisis moleculares (perfil RISA).
El procedimiento se repitió 20 veces hasta observar que el pH y acidez era
constante.
3.3.2.2.2 Preparación del queso tipo Poro
Siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.3.2.1.1 se elaboró queso
tipo Poro. En esta ocasión se utilizaron 80 L de leche y se empleó el inoculo A.
Este segundo lote de producción de queso (Lote 2) se elaboró en la planta pilotó
de la Facultad de Química, Universidad Autónoma de Querétaro, las cuales
contaba con las mismas herramientas que en el campus de la UNAM en
Tequisquiapan. Este queso solamente se empacó con parafina.
3.3.2.2.3 Análisis microbiológico
Al término de la elaboración del queso se realizó la cuantificación de
microorganismos indicadores (BMA, BAL, coliformes totales, hongos y
levaduras) para conocer la calidad microbiológica del producto terminado
(métodos descritos en el apartado 3.3.1.1)
45
3.3.2.2.4 Análisis sensorial
Se llevó a cabo el análisis sensorial a los quesos tipo poro elaborados en el Lote
2 empleando una prueba discriminativa por el método dúo-trío (ISO
10399:2004). El desarrollo del análisis sensorial se dividió en dos partes:
• La selección de los panelistas
• Aplicación de las encuestas
Selección de panelistas. En la selección de los panelistas se realizó una pre-
encuesta el mismo día de la prueba, la cual nos proporcionó información
relevante para descartar o aceptar la encuesta de nuestro panelista ya que era
necesario incluir a personas con el siguiente perfil: sexo indiferente
(femenino/masculino), mayor de 23 años, preferencia por el consumo de quesos
madurados. Se aplicó una encuesta corta (Cuadro 8).
Cuadro 8. Formato de selección de panelistas para análisis sensorial.
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO Facultad de Química
Sexo: ________ Edad:_________ Ocupación:__________________ Subraya la respuesta a las siguientes preguntas: 1.-¿ Consume queso?
a) Si b) No
2.- ¿Con que frecuencia consume queso?
a) Diario b) Una vez por semana c) 2 a 3 veces por semana
3.- ¿Qué tipo de queso consume?
a) Fresco b) Madurado c) Otro :_____________
46
Aplicación de las encuestas. Las muestras de queso fueron presentadas en un
vaso de plástico transparente de 50 mL identificados por números de tres
dígitos, conteniendo cada uno una rebanada de queso (2 x 2 cm). Se prepararon
80 muestras de queso de referencia y 40 muestras del queso de prueba. El
orden de colocación de las muestras en cada trío fue balanceado y la posición
del trío en la bandeja de servicio fue hecha al azar. Las pruebas se realizaron en
cubículos individuales del laboratorio de evaluación sensorial del INIFAP,
campus Ajuchitlán, Qro.
Las muestras se dispusieron en los cubículos, con servilletas blancas
desechables, agua purificada, dos galletas para quitar el sabor del queso entre
muestra y la hoja que contenía el siguiente formato. Se procedió a la evaluación
sensorial empleando el formato del Cuadro 9. La muestra codificada como
referencia es igual a la codificada como 941 era el queso de poro obtenido de
Balancán, Tabasco; la muestra 792 fue la diferente, la del queso procesado en
Querétaro.
Cuadro 9. Formato de encuesta para prueba dúo-trío.
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO Facultad de Química
Juez nº: _________ Nombre ______________________________________ Instrucciones A continuación se presentan 3 muestras de quesos. La muestra marcada con una R es de referencia y las otras dos son codificadas. Una de las muestras codificadas es igual a la referencia “R”. Marque con una “X” en el cuadro correspondiente de la muestra aquella que se igual en sabor a la de referencia. Prueba las muestras de quesos de izquierda a derecha
Muestras codificadas REF 941 792
Comentarios:_______________________________________________________
__________________________________________________________________
47
3.3.2.2.5 Análisis molecular de las muestras lácteas
Se realizaron análisis moleculares a las muestras colectadas durante la
estabilización del inoculo (apartado 3.3.2.2.1) y durante la elaboración de los
quesos (apartado 3.3.2.2.2 ) (Cuadro 10), a las cuales se les realizó extracción
de ADN, pureza de ADN, integridad, y PCR-RISA.
Cuadro 10. Descripción de muestras analizadas mediante la técnica RISA.
Muestra Descripción
1 Leche pasteurizada con adición de suero.
2 Suero estable, extraído de los pases realizados; el cual se agregó para la elaboración del queso.
3 Suero obtenido del corte de la cuajada, en el procesamiento del queso.
4 Suero obtenido del reposo del suero en el procesamiento del queso.
5 Suero estable del pase 5.
6 Suero estable del pase 10.
7 Suero estable del pase 15.
8 Suero estable del pase 20.
9 Cuajada desuerada, obtenida del procesamiento del queso.
10 Producto terminado.
3.3.2.2.5.1 Extracción de ADN
Se extrajo ADN mediante un kit comercial, QIAamp® DNA stool. Se extrajo ADN
de muestras de leche, suero y queso tipo Poro elaborado con leche
pasteurizada.
48
Para realizar la extracción de ADN a partir de las muestras lácteas, se tomaron
9 ml de leche y suero, los cuales se colocaron en tubos falcón estériles de 15
ml. Se tomaron 5 g de queso, se adicionaron 45 ml de citrato de sodio al 2%, y
se homogeneizó en stomacher durante 5 minutos; de esta suspensión se tomó
una alícuota de 9 ml y se transfirió a un tubo falcón estéril de 15 ml. De igual
forma a 5 g de cuajada se le adicionaron 5 ml de citrato de sodio (2%) y se
homogeneizó en vortéx durante 2 min y se colocaron 9 ml de esta suspensión
en un tubo falcón de 15 ml. Los tubos falcón conteniendo las suspensiones de
queso y cuajada se sometieron a lavados sucesivos para eliminar la matriz
alimentaria y concentrar las células. Cada muestra se centrifugó a 4500 rpm por
15 min, el sobrenadante se desechó y fue lavado con 10 ml solución de citrato
de sodio (2 %). Se repitió el proceso de lavado 3 veces o hasta no contener más
matriz alimentaria. El paquete celular se resuspendió en 2 ml de buffer TE. Se
colocaron 0.4 ml de cada muestra en un tubo eppendorf para la extracción de
ADN empleando el Kit QIAamp® DNA stool. Para ello se siguieron las
instrucciones dadas por el proveedor. A cada tubo eppendorf conteniendo cada
una de las muestras se le añadieron 1.2 ml de buffer ASL. Se homogeneizó en
vórtex por 60 s y se sometió a un tratamiento de sonicación a 80 V por 60 s. Se
incubó por 5 min a 95°C, se homogeneizó en vórtex por 30 s y centrifugó a
17319 g por 1 min. Se transfirió 1.2 ml del sobrenadante a un tubo nuevo y este
se incubó 1 min a temperatura ambiente y se centrifugó (17319 g/ 3 min). Se
pipeteó el mayor volumen posible del sobrenadante y se volvió a centrifugar a
17319 g por 3 min. En un tubo nuevo, se añadieron 15 !l de proteinasa K, y se
colocaron 200 %l de sobrenadante y 200 %l de buffer AL. Se mezcló en vórtex
por 5 s e incubó a 70°C por 10 min. Se añadió 200 %l de etanol absoluto y
homogeneizó nuevamente. Se pipeteó el lisado en una columna QIAamp® y se
centrifugó 1 min por 17319 g. La columna se cambió a un tubo nuevo y se
añadieron 500 !l de buffer AW1, se centrifugó 1 min por 17319 g; la columna se
transfirió a un tubo nuevo y se añadieron 500 %l de buffer AW2, se centrifugó 3
min por 17319 g y se cambió a tubo nuevo. Se centrifugó de nuevo 3 min por
17319 g. Se colocó la columna en tubo nuevo con tapa, añadiendo 200 %l de
buffer AE, se incubó 1 min a temperatura ambiente y se centrifugó 1 min a
17319g. El líquido centrifugado se empleó en análisis posteriores.
49
3.3.2.2.5.2 Análisis de integridad de ADN extraído
La integridad del ADN se verificó por electroforesis utilizando un gel de agarosa
1%, 95 V por 120 min, en tampón 1x TBE. El gel se tiñó con bromuro de etidio
(0.5 %g/ml) por 30 min y se capturó la imagen con el sistema fotográfico DNR
Bioimaging, Jerusalem, Israel.
3.3.2.2.5.3 Pureza del ADN
Se midió la pureza del ADN total extraído mediante la medición de la
absorbancia de la muestras a 260 nm y 280 nm, siendo el coeficiente de
absorbancias 260/280 el que indica la pureza de la solución.
Un cociente de 1.8 indica que la solución es ADN puro, valores inferiores
indican una contaminación por proteínas o polifenoles mientras que si la relación
es de 2.0 se trata de ARN puro.
La medida de la pureza del ADN se obtuvo mediante la siguiente ecuación:
A260nm
Pureza = A280nm
Se usó buffer TE, buffer AE o agua libre de nucleasas como blanco para la
calibración del espectrofotómetro a un longitud de onda de 260 (máxima
absorbancia del ADN) y 280 nm (máxima absorbancia de proteínas),
dependiendo del buffer en el que se encuentran las muestras.
3.3.2.2.5.4 PCR-RISA
Se realizó RISA mediante la amplificación de las secuencias presentes entre las
regiones genéticas 16S y la 23S de la población microbiana de las muestras de
leche, suero fermentado (inóculo), cuajada y queso madurado.
50
La amplificación se llevó a cabo con 1 µL de extracto de ADN de cepa control
en una reacción conteniendo 1 µL de buffer 10X, 2.5 µL de BSA (0.1 MG/l), 0.8
µLde desoxinucleótidos trifosfato 2.5 mM, 0.15 de Taq polimerasa (0.75U) y el
volumen necesario de cada uno de los primers ITSF .25 µM (5’-
GTCGTAACAAGGTAGCCGTA.3’) e ITSReub .25 µM (5’-
GCCAAGGCATCCACC-3’) para llegar a la concentración que se requiera según
el diseño experimental hasta un volumen final de 10 µL. El PCR se llevó a cabo
en un Termociclador (Techne TC-512, Essex, Inglaterra) bajo las siguientes
condiciones:
1) Desnaturalización inicial 94°C por 3 min,
2) Ciclos de amplificación dónde el número de ciclos dependerá del
diseño:
-Desnaturalización a 94°C por 60 s,
-Hibridación de iniciadores dónde la temperatura de
alineamiento dependerá del diseño del experimento, por 50 s,
-Extensión a 72°C por 90 s,
3) Extensión final a 72°C por 3 min.
Se verificó por electroforesis horizontal utilizando un gel de agarosa al 2 %, 100
V por 90 min, en tampón TBE 1X. El gel se tiñó con bromuro de etidio (0.5
µg/ml) por 30 min y se capturó la imagen con sistema fotográfico. Se analizó la
intensidad de las bandas y se compararon las bandas predominantes con un
proyecto paralelo a este.
51
3.3.3 Análisis estadístico
Los resultados microbiológicos obtenidos en la elaboración del queso, en la
prueba preliminar se analizaron estadísticamente con un análisis de varianza
multifactorial (ANOVA) comparando las medias con la prueba de Tukey, con un
nivel de significancia del 5%. Se utilizó el programa estadístico JMP. Las
medidas cuantitativas fueron transformadas logarítmicamente para los análisis.
Para el análisis sensorial los resultados se obtuvieron en valores de tablas
basadas en la distribución binomial.
52
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Caracterización microbiológica de quesos de Poro elaborados en
Balancán, Tabasco.
En América latina, hay regiones donde los productos lácteos fermentados son
aún elaborados tradicionalmente. En mercados especializados de todo el
mundo, estos productos fermentados son muy apreciados y se considera su
valor por sus características de sabor que normalmente no están presentes en
los quesos producidos comercialmente (Pereira y col., 1995).
La diversidad microbiana procedente del medio ambiente por la exposición
durante la fabricación y maduración de los quesos y la natural diversidad
microbiota inicial presente en la leche cruda, desempeñan un papel importante
en procesos de fermentación y son trascendentales en el desarrollo final de los
productos lácteos (Garabal, 2007).
Durante la época seca (mayo a agosto) y de lluvia (agosto-octubre) se
colectaron muestras de queso de poro en cuatro queserías (Bejucal, 4
Hermanos, Usumacinta y El Tigre) ubicadas en Balancán, Tabasco. Quesos del
mismo lote se almacenaron en el sitio de producción y se analizaron después de
30 y 60 días.
El contenido de bacterias mesófilas aerobias , bacterias ácido lácticas , hongos
y levaduras en las muestras de queso se muestra en la Figura 9.
Independientemente del productor las poblaciones de BMA, en la temporada
seca fueron de aproximadamente 6.5 Log UFC/g y en temporada de lluvia el
contenido fue ligeramente menor (5.5 Log UFC/g). En México no existe una
norma que indique el límite máximo permitido para BMA en este tipo de
alimentos.
53
El comportamiento de BAL en los quesos de Poro, en general fue heterogéneo y
no se pudo apreciar una tendencia clara (rango 4.5 a 7.2 Log UFC/g). Las BAL
son generalmente reconocidas como GRAS, por su siglas en inglés (Generally
Recognized As Safe) y tienen un papel importante en la preservación y
fermentación de alimentos por inhibir la flora competitiva la cual incluye
patógenos (Cintas y col., 2001).
En la mayoría de los productos lácteos la concentración de BAL debe ser como
mínimo Log 6.30 UFC/g (NMX-F444-1983) y en los quesos analizados se
encontró durante los siete días concentraciones por arriba de lo que exige la
norma para productos lácteos, lo que convierte a estos quesos en una buena
fuente de BAL.
Los hongos en la temporada seca no mostraron un patrón definido; su contenido
osciló entre 1.0 y 4.78 Log UFC/g; en la temporada de lluvia incrementaron su
número a los 60 días de maduración. El límite máximo para hongos y levaduras
es de 3 Log UFC/g en quesos madurados. Las levaduras se comportaron de
manera similar a los hongos.
En todas las muestras el contenido de coliformes totales, coliformes fecales y E.
coli estuvo por debajo del límite de detección (<3 NMP/g). Así mismo, no se
detectó la presencia de Salmonella spp., L. monocytogenes y S. aureus en
ninguna de las muestras de queso colectadas en las 4 queserías de Balancán,
Tabasco.
54
Figura 6. Contenido de microorganismos indicadores de cuatro queserías del
queso de Poro en dos periodos del año.
Con respecto a los parámetros fisicoquímicos, las muestras de quesos en
temporada seca y lluviosa se caracterizaron por presentar un bajo pH (4.44 y
4.39, respectivamente) y una baja Aw (0.909 y 0.917, respectivamente) (Figura
7). Los valores de pH a los 30 y 60 días maduración del queso se incrementaron
en ambos períodos, siendo más acentuado el cambio en la temporada seca y en
la temporada de lluvias el pH fue más estable conforme al paso del tiempo en la
maduración del queso. Sin embargo, se encuentra por debajo de un pH óptimo
para el desarrollo de microorganismos patógenos.
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Temporada de secas Temporada de lluvias
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55
Este aumento en la acidez puede deberse a la acción de las BAL que utilizan los
nutrientes presentes en el queso como fuente de carbono para producir ácido
orgánicos, como cítrico, acético y láctico (Raimbault, 1998).
Los valores de Aw se mantuvieron en la temporada seca y disminuyeron en
temporada de lluvia.
Figura 7. Análisis de pH y de Aw el queso de Poro en dos periodos del año.
Se realizó un análisis bromatológico a los quesos en el INIFAP, campus
Ajuchitlán en los cuales los quesos en temporada seca y de lluvias se
caracterizaron por un alto porcentaje de grasa (35.74 y 41.19%,
respectivamente), proteína (27.93 y 26.08%, respectivamente) y baja humedad
(26.33 y 31.28%, respectivamente) a los 7 días de maduración, que es el
momento en que los quesos están listos para comercializarse.
La calidad microbiológica del queso es importante ya que está compuesto
principalmente por proteína y grasa, lo que lo convierte en un sustrato nutritivo
para el desarrollo de microorganismos; además, es un alimento que se consume
sin cocimiento posterior, en donde el manejo tiene implicaciones importantes en
la calidad sanitaria (Díaz-Rivero y González, 2001).
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00123/,$
56
4.2 Elaboración del queso tipo poro con leche pasteurizada y adición de
inoculo controlado.
4.2.1 Prueba preliminar
Con el propósito de estudiar si el uso de leche pasteurizada y la adición de un
cultivo iniciador (suero fermentado) afectaba la flora microbiana presente en el
queso y si había diferencias sensoriales en el producto, se elaboró el queso tipo
Poro bajo condiciones estandarizadas.
El queso tipo Poro se preparó en dos ocasiones, la primera ocasión que se
elaboró se realizó para observar y caracterizar la flora microbiana
(microorganismos indicadores) a lo largo de la maduración del queso. La
segunda ocasión que se elaboró el queso, fue con un cultivo estandarizado con
pH, acidez titulable y para realizar el análisis sensorial al queso, y observar la
comparación que existe sensorialmente con el queso producido en Balancán,
Tabasco.
La elaboración del queso se realizó tal como se detalla en la metodología en la
sección 3.3.2.1.1. Como se mencionó en los antecedentes en la elaboración de
un queso una de las etapas importantes que es la adición de un cultivo iniciador,
con bacterias seleccionadas para que sus propiedades organolépticas sean las
mismas en cualquier lote de producción.
Como parte del proceso inicial en la elaboración del queso de Poro se agrega
suero del día anterior, lo que permite agregar a la leche un inóculo con alta
concentración presumiblemente de BAL. Se ha reportado que las BAL son una
opción para inhibir el crecimiento de la flora patógena (Steinkraus 2002). La
producción de ácido láctico por este tipo de microorganismos ha demostrado
poseer efectos de conservación. El uso de cultivos microbianos protectores se
está revelando como una opción de futuro para la conservación de alimentos
crudos o moderadamente procesados. Estudios recientes han evidenciado que
algunos microorganismos compiten por el alimento y el espacio con patógenos,
57
de modo que limitan enormemente su capacidad para alterar los alimentos
(Lunden y col., 2003).
Esta práctica que se realiza en Balancán, Tabasco tiene la desventaja de que al
no tener control sobre los microorganismos que están presentes en el suero las
propiedades o características de los quesos pueden variar entre lotes de
producción.
Para la elaboración del primer queso se realizaron dos lotes con diferente
inóculo. Se recolectó suero de la producción de queso de Poro de la quesería
Bejucal de Balancán, Tabasco y fue transportado a la Ciudad de Querétaro para
ser usado como cultivo iniciador en la producción del queso con leche
pasteurizada (cultivo iniciador A). El cultivo iniciador “A” fue congelado con
glicerol por un año. Para reactivarlo se le adicionó leche y se dejó incubando a
35ºC por 24 h, posteriormente se filtró obteniendo una mayor cantidad de suero,
este se volvió a inocular en otra leche y se dejó incubar en las mismas
condiciones, así continuamente para poder adquirir un volumen mayor de suero
para la elaboración del queso tipo Poro.
El cultivo iniciador “B” fue transportado de Balancán, Tabasco a Querétaro el
mismo día que se obtuvo de la elaboración del queso en su lugar de origen
(llegó 4 días después de su obtención a Querétaro). Aunque se colocaron
refrigerantes para mantener la temperatura del cultivo estable durante el
transporte, no fue posible mantenerla durante todo el tiempo, por lo cual no se
puede asegurar si hubo desarrollo o descenso de la carga microbiana presente
en él.
El cultivo iniciador “C” fue igualmente transportado de Balancán, Tabasco a
Querétaro junto con el cultivo “B”, la diferencia es que este fue el suero
fermentado, el cual se adicionó para la elaboración del queso, de ese día en el
lugar de origen.
58
Tanto en el cultivo “B” y “C” no fue necesario hacer el mismo procedimiento que
para el cultivo “A” ya que este además que no fue congelado, solo refrigerado,
teníamos un volumen mucho mayor que el anterior.
Además de probar tres sueros como cultivos iniciadores, también se introdujo la
variante de la forma de empacar el queso. Tradicionalmente se hace aplicando
tres capas de parafina, etapa que es peligrosa por la temperatura a la cual se
funde para poder manipularla, es por eso que propusimos un nuevo empaque, el
empacado al vacío.
No existe información en la literatura sobre el uso de los diferentes empaques ya
que tradicionalmente cada queso se empaca de manera diferente. Sin embargo,
el empacado del queso se realiza para proteger al queso de los hongos, de los
ácaros y de la pérdida de humedad, se acostumbra a revestir el queso de
sustancias más o menos impermeables como la parafina. En algunas regiones
se parafina el queso a los tres o cuatro días de salido de la prensa, tal es el caso
del queso de poro.
Si el queso es de primera calidad esta parafinación no lo perjudica, pero si el
queso es hecho con leches dudosas la parafinación precoz puede bajar la
calidad del queso por impedir en todo o en parte a respiración (cambios
gaseosos del mismo). En este proyecto se evaluó el empacado al vacío con una
bolsa plástica la cual cumple con las mismas funciones que el empacado con
parafina.
Para conocer el efecto de los dos factores antes mencionados (tipo de suero y
tipo de empaque) sobre la microbiología del queso, se realizó un análisis de
microorganismos indicadores (BMA, BAL y levaduras) cada 7 días. En la figura 8
se observan el contenido de microorganismos indicadores con los diferentes
inóculos y empaques, durante el tiempo de maduración. Se observa que al final
del almacenamiento las BMA tienden a disminuir independientemente del tipo
del empaque.
59
Figura 8. Contenido de microorganismos indicadores en quesos elaborados con
leche pasteurizada e inoculados con tres tipos de inoculo (prueba preliminar).
En el empaque con parafina no existe diferencia con respecto a los diferentes
inóculos empleados ya que al término del análisis en los tres tipos de quesos la
concentración de BMA es de aproximadamente 4 Log UFC/g. En el empaque al
vacío cuando se empleó el inóculo “B” la población de BMA fue de 4 Log UFC/g,
mientras que en los inóculos “A” y “C” esta se redujo hasta 2 Log UFC/g.
Como se mencionó previamente en el análisis de los quesos colectados en las
cuatro rancherías, el desarrollo de BMA alcanza valores de aproximadamente 6
Log UFC/g. Estos resultados son similares a los encontrados por Jiménez
0
2
4
6
8
7 14 21 28 35 42 49
Log
UFC
/g
BMA (Parafina)
0
2
4
6
8
!" #$" %#" %&" '(" $%" $)"
BMA (vacío)
0
2
4
6
8
7 14 21 28 35 42 49
Levaduras (Vacío)
0 2 4 6 8
!" #$" %#" %&" '(" $%" $)"
!"#$%&'(#$
)*+,-./,+0./1"$234,56$
Levaduras (Parafina)
*" +" ,"
0
2
4
6
8
7 14 21 28 35 42 49
!"#$%&'(#$
BAL (Parafina)
0
2
4
6
8
7 14 21 28 35 42 49
BAL (Vacío)
60
(2010), quien reporta valores de 5.40-6.78 Log UFC/g en el contenido de BMA
en queso de Poro elaborado con leche no pasteurizada. Sin embargo, en el
queso de Poro elaborado con leche pasteurizada mostró valores menores a los
encontrados en quesos elaborados con leche no pasteurizada, esto se puede
deber al tratamiento de pasteurización que se le aplica a la leche afecta a los
microorganismos presentes en ella.
El comportamiento de BAL tanto en el queso empacado con parafina y al vacío
fue heterogéneo en sus tres inóculos. En términos generales se observa que las
BAL aumentan su desarrollo independientemente del empaque alcanzando de 5
a 6 Log UFC/g. Por lo general el desarrollo de BAL inhibe el crecimiento de
enterobacterias donde se incluyen coliformes y E.coli principalmente debido a la
producción de ácido láctico (Axelsson, 1998).
El desarrollo de las levaduras en los tres inóculos y los diferentes empaques fue
escaso y homogéneo ya que el desarrollo de levaduras no fue como los
microorganismos anteriores. En el empaque con parafina se observa un
contenido de 4 Log UFC/g en cada uno de los inóculos, mientras que en el
empaque al vacío las cifras finales oscilaron entre 5 y 6 Log UFC/g. Los
recuentos altos de levaduras en los quesos son atribuibles a su tolerancia a
desarrollar a bajo pH, a actividades bajas de agua y en presencia de altas
concentraciones de sal (Ferreira y col., 2003). Se puede explicar también su
aparición en los quesos ya que son capaces de asimilar y fermentar la lactosa y
la galactosa, así como del ácido succínico, cítrico y láctico. Además se
distribuyen ampliamente en los entornos de la producción de lácteos y surgen
como contaminantes naturales en leche cruda, aire, productos lácteos utensilios,
salmuera y agua.
El contenido de coliformes totales estuvo por debajo de límite de detección
(<10 UFC/g). La presencia de coliformes en los quesos al igual que en el caso
de la leche muestran evidencia de descuidos en la higienización del equipo
empleado para su elaboración y en pobres condiciones de manipulación, así
61
mismo el agua también es una fuente potencial de contaminación (Orozco,
1999).
Se realizó un análisis estadístico de comparación de medias de cada
microorganismo por la prueba de Tukey (Cuadro 11) además del análisis de
ANOVA de dos factores con sus interacciones, para determinar el efecto del tipo
de empaque e inóculos sobre el crecimiento de los microorganismos indicadores
(BMA, BAL y levaduras).
En el Cuadro 11 se observa si en algún tratamiento existe diferencia significativa
entre uno u otro respecto a cada microorganismo. Para el caso de BMA, el
inóculo “C” empacado al vacío es el que muestra una diferencia significativa en
comparación con los demás inóculos y empaques. En contenido de BAL no hay
diferencia significativa entre inóculos y empaques. En cambio para el desarrollo
de las levaduras se observa que el inóculo AP, BV, CV son iguales entre sí; es
decir que no hay diferencia estadísticamente significativa entre ellas, en los
inóculos BV, AP, CP tampoco existió diferencia significativa entre ellos, al igual
que en los inóculos AP, CP, AV.
El único que se diferenció de todos fue el BP (AP: inóculo A con parafina, AV:
inóculo A al vacío, BP: inóculo B con parafina, BV: inóculo B al vacío, CP:
inóculo C con parafina, CV: inóculo C al vacío) ((Cuadro 10)).
Cuadro 11. Comparación de medias
Suero Empacado BMA BAL Lev
A Parafina 4.20 a 5.40 a 5.00 a,b,c
Vacío 3.40 a,b 5.70 a 4.85 c
B Parafina 4.05 a 5.25 a 4.20 d
Vacío 4.15 a 5.70 a 5.40 a,b
C Parafina 3.76 a,b 5.18 a 4.87 b,c
Vacío 2.00 b 5.73 a 5.43 a
a,b,c,d Dentro de la misma columna letras diferentes expresan una diferencia significativa. Prueba Tukey P> 0.05.
62
En el Cuadro 12 se puede observar el análisis estadístico (ANOVA) de BAL en
el cual nos muestra que el empaque es el único factor que tiene una diferencia
estadísticamente significativa sobre el desarrollo de BAL. Sin embargo,
microbiológicamente la diferencia entre los dos empaques no es considerada
como importante ya que no existe ni siquiera un logaritmo de diferencia entre
uno y otro tratamiento.
Cuadro 12. Análisis de varianza del contenido de BAL en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada, inoculado con tres tipos de cultivos y
almacenado 49 días a temperatura ambiente.
Factor Grados de libertad
Suma de cuadrados F Ratio Prob > F
Inoculo 2 0.035 0.5085 0.6252 Empaque 1 0.6075 17.6513 0.0057*
Inoculo*Empaque 2 0.02 0.2906 0.7578
Figura 9. Efecto del tipo de empaque en el contenido de BAL en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada. P= queso empacado con parafina; V= queso
empacado al vacío.
En el Cuadro 13 se observa el análisis estadístico del contenido de BMA en los
quesos; se observa que tanto el inóculo como el empaque tienen un efecto
63
significativo sobre el contenido microbiano. Cuando las muestras son
empacadas al vacío las BMA tienen un menor desarrollo en comparación con el
empaque con parafina (Figura 10). En la Figura 11 se observa la diferencia que
existe entre inóculos; cuando se empleó como cultivo iniciador el inóculo C el
desarrollo de BMA fue menor.
Cuadro 13. Análisis de varianza del contenido de BMA en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada, inoculado con tres tipos de cultivos y
almacenado 49 días a temperatura ambiente.
Factor Grados de libertad
Suma de cuadrados F Ratio Prob > F
Inoculo 2 3.24735 6.1579 0.0352* Empaque 1 2.0090083 7.6193 0.0328*
Inoculo*Empaque 2 1.7210167 3.2635 0.1099
Figura 10. Efecto del tipo de empaque en el contenido de BMA en queso tipo
Poro elaborado con leche pasteurizada. P= queso empacado con parafina; V=
queso empacado al vacío.
64
Figura 11. Efecto del inóculo en el contenido de BAL en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada.
En el Cuadro 14 se observa el análisis estadístico del contenido de levaduras en
el queso tipo Poro. El cual el empaque, inóculo y la interacción entre ambos,
tienen un efecto estadísticamente significativo sobre su contenido. Cuando se
empleo el inóculo B y C el contenido de levaduras fue mayor en los quesos
empacados al vacío, mientras independientemente del empaque el que numero
de levaduras no cambio cuando se inoculó C.
Cuadro 14. Análisis de varianza del contenido de levaduras en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada, inoculado con tres tipos de cultivos y
almacenado 49 días a temperatura ambiente.
Factor Grados de libertad
Suma de cuadrados F Ratio Prob > F
Inoculo 2 0.25551667 6.7925 0.0288* Empaque 1 0.86940833 46.2246 0.0005*
Inoculo*Empaque 2 0.91231667 24.253 0.0013*
65
Figura 12. Efecto del tipo de empaque y del inoculo en el contenido de levaduras
en queso tipo Poro elaborado con leche pasteurizada. P= queso empacado con
parafina; V= queso empacado al vacío; A, B C= tipos de inóculos
4.2.2 Prueba definitiva
4.2.2.1 Estabilización del inóculo Muchos cultivos comerciales combinan varias especies o cepas de
microorganismo para buscar la simbiosis entre ellos y conseguir mejores
resultados. Los cultivos iniciadores se presentan de diferentes formas y se
deben seguir las recomendaciones del fabricante para ser activados. Existe el
riesgo que en el proceso de propagación del cultivo, ocurran mutaciones
bacterianas y se pierda la información genética de la producción del metabolito
de interés o que se eliminen algunas bacterias importantes para la creación de
aromas y sabores; es por eso que era importante observar si el cultivo se
mantenía estable, tanto en pH, acidez y pruebas moleculares.
Para comprobar que el inóculo A fuera estable a lo largo del tiempo durante 20
días se hicieron una serie de transferencias tratando de simular el proceso que
llevan a cabo los productores de queso. Brevemente, se utilizó el inoculo
después de un reposo a temperatura ambiente por 24 h y se le añadió a la leche
pasteurizada, y se dejó incubar 24 h para que hubiera una separación del suero
66
y la cuajada. Se separó el suero en pequeños volúmenes y se aumentó la
cantidad de leche con el paso del tiempo para ir recuperando suero hasta tener
un volumen suficiente para preparar otro lote de queso. A lo largo del tiempo de
la recolección del suero, se determinó el pH, la acidez titulable y se guardó una
pequeña porción para análisis moleculares posteriores.
En la Figura 13 se observa el comportamiento de acidez del suero lácteo
fermentado en los diferentes pases. La acidez inicial fue de 22ºD, aumentando a
65 ºD en el quinto pase; a partir del pase numero 14 la acidez del suero se
estabilizó en un rango de 77 a 80ºD.
Figura 13. Acidez del suero durante 20 trasferencias sucesivas
(ºD: Grados Dornic)
En la Figura 14 se observan los cambios en el pH del suero lácteo fermentado
durante las trasferencias sucesivas a leche fresca. Al inicio el pH fue de 6 y
conforme se realizaban las trasferencias disminuyó pasta alcanzar su
estabilización en la transferencia numero 13 (pH= 4.4).
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
ºD
Pases de inóculo
Acidez
67
Figura 14. pH del suero durante 20 transferencias sucesivas.
Los sueros fermentados con valores de pH y acidez constante, se emplearon
como inoculo para producir el segundo lote de queso el cual fue elaborado en la
planta piloto de la Facultad de Quimica, UAQ, con 80 litros de leche y 1.6 L del
suero fermentado (inóculo). De los 80 litros de leche se obtuvieron 8 kilos de
queso de poro, y se aplicó el empacado tradicional con parafina.
Terminado el procesamiento del queso tipo Poro con el inóculo estabilizado, se
procedió a la realización del análisis microbiológico. En este análisis solo se
muestrearon dos puntos al inicio (tiempo 0) y después de 7 días de maduración
que es cuando el queso esta listo para su venta (Cuadro 15). Las poblaciones
de BAL, BMA, OCT, y hongos y levaduras permanecieron prácticamente sin
cambios. Es importante destacar que desde el día 0 no se detectaron coliformes
lo que indica que la leche fue pasteurizada adecuadamente y la manipulación
posterior del queso fue adecuada.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
pH
Pases del inóculo
!"#
68
Cuadro 15. Contenido de microorganismos indicadores en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada empleando el inóculo A.
Días de maduración
BAL BMA OCT HL
"#$!%&'(!$!
0 6.4 5.4 0 5.4
7 5.9 5.6 0 5.6
4.2.2.2 Análisis sensorial
Como etapa previa al análisis sensorial se aplicó una encuesta a 43 personas
para seleccionar a un grupo de panelistas que contara con la mayoría de edad,
consumo de queso, y preferencias del mismo. Se seleccionaron 26 personas,
las cuales cumplieron con el perfil que se necesitaba para la realización del
análisis sensorial. Las personas seleccionadas estaban en un rango de edad de
23-68 años, predominando con un 60 % las edades en un rango de 53-58 años.
Se realizó el análisis sensorial con la prueba dúo-trio en el cual un total de 21
panelistas identificaron correctamente la muestra que es igual a la de referencia.
En el Cuadro 15 se muestran los resultados del análisis sensorial de los quesos
tipo Poro. En la fila correspondiente a n= 26 jueces y la columna
correspondiente a #= 0.05, se encontró que fueron necesarias 18 respuestas
correctas para concluir que existe una diferencia perceptible a #=0,05. Por lo
tanto, 21 respuestas correctas son suficientes para concluir que tanto el queso
elaborado con leche cruda (Balancán, Tabasco) y el queso elaborado con leche
pasteurizada (Querétaro) son productos perceptiblemente diferentes.
69
Los panelistas emitieron comentarios con respecto a los quesos que se les
presentó en el análisis sensorial. Señalan que el queso elaborado con leche
pasteurizada es más seco que el elaborado con leche cruda, y que el queso
elaborado con leche pasteurizada es más salado y presenta mejor sabor al
paladar.
4.2.2.3 Análisis molecular de las muestras lácteas
Los métodos convencionales (aquellos basados en el aislamiento de
microorganismos y su identificación por pruebas bioquímicas) son
insatisfactorios para el estudio de un sistema ecológico dinámico de las
poblaciones microbianas, como es el caso de la microflora del queso. La
aplicación de técnicas moleculares, tales como PCR, son útiles para la
determinación de especies individuales o cepas (Coppola y col, 2008). El uso de
estos métodos tiene la ventaja de proporcionar la identificación y monitorear la
microbiota a nivel especie sin la necesidad del aislamiento de microorganismos
en medios de cultivo. En lugar de ello se extrae directamente el ADN de los
microorganismos presentes en la matriz láctea original para conocer la
diversidad de géneros bacterianos que integran esa comunidad (Coppola y col,
2008).
El método de extracción de ADN empleado en este trabajo fue por medio de un
kit comercial (QIAamp DNA stool). El kit QIAamp DNA stool), se basa en la lisis
química y por medio de un sonicador, produce calor en la pared celular de las
bacterias, se eliminan inhibidores de la PCR con una matriz adsorbente y el
sobrenadante es tratado con proteinasas y purificado en columnas de sílica que
unen específicamente al ADN. En los extractos de ADN se midió su pureza e
integridad, y se llevó a cabo la amplificación intergénica ribosomal.
A pesar de los esfuerzos realizados no se pudo observar ADN obtenido de las
extracciones, lo único que se pudo observar fue la aparición de marcador de
peso molecular (Figura 15). Aunque no se pudo observar ADN extraído de las
70
muestras, se realizó la PCR y se obtuvo amplificación de productos, lo que
indicó la presencia de ADN.
Figura 15. Gel de integridad de ADN extraído de muestras lácteas de queso tipo
Poro. M = 100 bp DNA ladder, 1 = Leche pasteurizada con adición de suero, 2 = Suero estable
(inóculo), 3 = Suero del corte de cuajada , 4 =Suero del reposo de cuajada, 5 = Inóculo
estabilizado (pase 5) , 6 = Inóculo estabilizado (pase 10), 7 = Inóculo estabilizado (pase 15) ,
8=Inóculo estabilizado (pase 20) , 9 = Cuajada desuerada , 10 = Producto terminado (queso).
4.2.2.3.1 Pureza del ADN
La medida de la pureza se realizó midiendo la absorbancia a 280 nm, siendo el
coeficiente de absorbancias 260/280 el que indica la pureza de la solución. Se
obtuvieron valores menores a 1.8 la cual puede indicar que los lavados con
citrato de sodio no son suficientes para eliminar parte de los contaminantes
(proteínas, grasas, sales) provenientes del queso y aquellos liberados después
de la pared celular bacteriana dónde los reactivos del kit no fueron suficientes
para eliminarlos (Cuadro 16).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
71
Cuadro 16. Pureza del ADN extraído de muestras lácteas.
Muestra Pureza (260/280 nm) )! )*+,!-! )*..!,! )*.)!/! )*.+!+! )*.!.! )*,-!0! )*.-!1! )*+2!2! )*+1!)3! )*+-!
4.2.2.3.2 RISA
Las condiciones de la técnica RISA se obtuvieron de un trabajo paralelo a este
(Aldrete, 2013), el cual cumplía con el propósito de obtener el mayor perfil de
bandeo que pudiera indicar mayor diversidad de microorganismos y obtener una
mayor intensidad.
Se realizó RISA mediante la amplificación de las secuencias presentes entre las
regiones genéticas 16S y la 23S del ADN extraído y se verificó por electroforesis
horizontal.
En la Figura 16 se muestra un gel de electroforesis en el cual se aprecian las
bandas obtenidas de la amplificación (RISA) del ADN extraído de las muestras
lácteas descritas en el Cuadro 10 en el apartado 3.3.2.2.5 En la mayoría de las
muestras se observa la presencia de las bandas etiquetadas como 1, 2 y 3; en
algunas muestras también se pudo apreciar la banda 4.
Las bandas que se obtuvieron en las muestras lácteas se compararon con otras
de un trabajo paralelo a este (Aldrete, 2013) las cuales fueron secuenciadas, y
72
después de analizar las secuencias en una base de datos, se proporcionó el
nombre del microorganismo que correspondería.
Figura 16. Bandas de muestras lácteas obtenidas del proceso de producción del
queso tipo poro elaborado con leche pasteurizada. M = 100 bp DNA ladder, 1 = Leche pasteurizada con adición de suero, 2 = Suero estable
(inóculo), 3 = Suero del corte de cuajada , 4 =Suero del reposo de cuajada, 5 = Inóculo
estabilizado (pase 5) , 6 = Inóculo estabilizado (pase 10), 7 = Inóculo estabilizado (pase 15) ,
8=Inóculo estabilizado (pase 20) , 9 = Cuajada desuerada , 10 = Producto terminado (queso).
Teniendo las bandas secuenciadas se compararon las bandas de la Figura 16
con la Figura 17, el marcador de peso molecular fue nuestra guía para poder
realizar la comparación existente entre un gel y otro, además de analizar las
imágenes con el software Gelquant Express (DNR Bioimaging systems,
Jerusalen, Israel), estimando los pesos moleculares de las bandas. las cuales
nos muestran que la banda marcada como “1”corresponde a Lactobacillus
delbrueckii , la banda “2” corresponde a Streptococcus thermophilus , la banda
“3” corresponde a Lactococcus garviae, la banda “4” corresponde nuevamente
a Streptococcus thermophilus y la “5” banda corresponde nuevamente a
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus estas bandas son las que están
presentes en todas las muestras, aunque en la muestra 9 se presentan muy
tenues las bandas “1” y “3” al igual que la banda “4” y “5” en las muestras, sin
embargo es notorio que se encuentran en el gel.
73
La presencia de las bandas características para S. thermophilus y L. delbrueckii
subsp. bulgaricus, en el suero, cuajada y queso madurado, y aunado con la
intensidad de las bandas, que con cierta reserva, se considera una medida de la
proporción relativa en la que se encuentran presentes en las bacterias en las
muestras, se puede suponer que estos dos microorganismos son los que
desarrollan las características sensoriales en el queso. Ambos microorganismos
tienen gran importancia en la industria láctea, funcionando como cultivo iniciador
en la fermentación del yogur y en la producción de quesos Suizos, Franceses e
Italianos tales como Gruyere, Emmental, Grana, Provolone y Gorgonzola
(Giraffa y col., 2008). Sin embargo hay un variación entre pesos moleculares, es
importante realizar otros análisis para afirmar que están presentes los
microorganismos anteriormente mencionados.
Figura 17. Bandas secuenciadas de muestras lácteas obtenidas del proceso de
producción del Queso de Poro del productor El Bejucal en temporada de lluvias. M = 100 bp DNA ladder, L = Leche, S = Suero, C = Cuajada, Q7 = Queso a 7 días de
maduración, Q30 = Quesos a 30 días de maduración, Q60 = Queso a 60 días de maduración.
Bandas: 1 = Enterococcus faecalis, 2 = Corynebacterium resistens, 3 = Lactococcus garviae, 4 =
Comamonas testosteroni, 5 = Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, 6 = Streptococcus
thermophilus, 7 = Lactococcus lactis, 8 = Klebsiella pneumoniae.
74
5 CONCLUSIONES
Los quesos colectados en Balancán, Tabasco cumplen con los limites de la
norma oficial mexicana NOM-121-SSA1-1994 para coliformes y
microorganismos patógenos, pero sobrepasan el límite de hongos y levaduras
en las dos temporadas (seca y lluviosa). La presencia de hongos y levaduras
pone de manifiesto la exposición a fuentes de contaminación de origen
ambiental. Los valores de pH encontrados (4.4) muestran que el queso es ácido
debido a la producción de ácido láctico por las BAL. Esta característica puede
estar relacionada con la ausencia de microorganismos patógenos en el
alimento.
La concentración de las BMA, BAL y levaduras fueron mayores en el queso de
origen (elaborado en Balancán, Tabasco), mientras que los quesos elaborados
con leche pasteurizada y con la adición de un inóculo controlado el contenido de
los grupos indicadores mencionados fue menor. Este hallazgo evidencia los
beneficios de la pasteurización en la disminución de la carga microbiana. El tipo
de empaque (envoltura de parafina y empacado al vacío) aplicado a los quesos
elaborados con leche pasteurizada no influyó en el desarrollo de los
microorganismos indicadores.
Al efectuar el análisis sensorial los consumidores detectaron diferencias
perceptibles entre el queso de origen y el queso elaborado en la UAQ. Sin
embargo, aunque diferentes el queso elaborado en la UAQ no resultó
desagradable al paladar. Esta diferencia en las características sensoriales
puede estar relacionada con el inoculo empleado (cantidades del
microorganismo) y a las diferencias en el proceso de producción. En Tabasco se
emplean utensilios de madera, mientras que en la UAQ todo el material y
equipos eran de acero inoxidable, lo que pudo afectar el tipo de flora microbiana
presente en el alimento.
La población microbiana presente en el suero empleado como inóculo (A) para
la elaboración de queso con leche pasteurizada detectada mediante la técnica
75
RISA, también se observó en los quesos elaborados en Balancán, Tabasco
(queso de origen) y en la UAQ. En los geles se observaron dos bandas que
coinciden con las observadas en un estudio previo y que corresponden a
Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus. Este hecho sugiere que
el inóculo seleccionado contiene los principales microorganismos que participan
en la generación de sabores y olores del queso.
La técnica RISA resultó ser un método rápido, fácil y económico para obtener
información acera de los principales microorganismos que se encuentran a lo
largo del proceso de producción de queso de poro.
Es necesario realizar estudios enfocados al aislamiento, identificación y
caracterización de los microorganismos presentes en el inóculo A que puedan
tener un uso tecnológico en el proceso de elaboración del queso tipo Poro.
76
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84
7 ANEXOS
Cuadro A1. Número mínimo de respuestas correctas necesarias para concluir
que existe diferencia significativa, basado en un ensayo dúo-trío.
0,20 0,10 0,05 0,01 0,001 0,20 0,10 0,05 0,01 0,0016 5 6 6 ---- ---- 26 16 17 18 20 227 6 6 7 7 ---- 27 17 18 19 20 228 6 7 7 8 ---- 28 17 18 19 21 239 7 7 8 9 ---- 29 18 19 20 22 2410 7 8 9 10 10 30 18 20 20 22 2411 8 9 9 10 11 32 19 21 22 24 2612 8 9 10 11 12 36 22 23 24 26 2813 9 10 10 12 13 40 24 25 26 28 3114 10 10 11 12 13 44 26 27 28 31 3315 10 11 12 13 14 48 28 29 31 33 3616 11 12 12 14 15 52 30 32 33 35 3817 11 12 13 14 16 56 32 34 35 38 4018 12 13 14 15 16 60 34 36 37 40 4319 12 13 14 15 17 64 36 38 40 42 4520 13 14 15 16 18 20 38 40 42 45 4821 13 14 15 17 18 21 41 42 44 47 5022 13 14 15 17 19 22 43 45 46 49 5223 15 16 16 18 20 23 45 47 48 51 5524 15 16 17 19 20 24 47 49 51 54 5725 16 17 18 19 21 25 49 51 53 56 59
!n n !
Nota 1: Los valores de la tabla son exactos porque están basados en la distribución bonomial. Para valores de n no incluidos en la tabla, se calculan los valores utilizando la aproximación normal a la bonomial como sigue: minimo de respuestas (x)= número entero más cercano mayor que x=(n/2) + z !n/4 donde z varía con el nivel de significación como sigue 0,84 para "= 0,20; 1,28 para "=0,10; 1,64 para "= 0,05; 2,33 para " =0,01; 3,09 para "= 0,001.
