UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA

FACULTAD DE CIENCIAS MARINAS

“VITAMINA B12 EN CULTIVOS CONTINUOS DE BACTERIAS MARINAS A DIFERENTES TASAS DE CRECIMIENTO

ESPECÍFICO”

TESIS QUE

PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS

PRESENTA

JOSUÉ RODOLFO VILLEGAS MENDOZA

Ensenada, B.C. Noviembre de 2010

“VITAMINA B12 EN CULTIVOS CONTINUOS DE BACTERIAS MARINAS A DIFERENTES TASAS DE CRECIMIENTO ESPECÍFICO”

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS

PRESENTA

JOSUÉ RODOLFO VILLEGAS MENDOZA

R E S U M E N

Para entender el papel de la vitamina B12 en el potencial fisiológico de

procariotas heterotróficos marinos, en los ciclos biogeoquímicos y en la red

trófica, es necesario conocer las diferentes respuestas del metabolismo

procariota del carbono (producción, respiración, consumo de carbono y

eficiencia de crecimiento) a diferentes condiciones de limitación de sustrato

orgánico e inorgánico. Con este propósito se establecieron una serie de

experimentos en quimiostatos con agua de mar como medio de cultivo

suplementada con 20 µM ó 100 µM de glucosa, 30 µM NH4Cl, 5 µM KH3PO4,

0.4 µM FeCl3 para todos los cultivos y solo para algunos de los cultivos se

agregó 18, 20 y 50 pM de vitamina B12. El medio de cultivo fué inoculado con

poblaciones naturales de procariotas marinos provenientes de la Bahía

Todos Santos en Ensenada. A una sola temperatura (18oC) el metabolismo

microbiano puede ser modelado como una función de la tasa de crecimiento

específico aplicando el modelo de Pirt. Es decir que la eficiencia de

crecimiento aumenta asintóticamente con el incremento en la tasa específica

de crecimiento. La adición de vitamina B12 en cultivos no modifica la

respuesta de la respiración o eficiencia de crecimiento indicando que es

posible que exista producción suficiente de vitamina B12 en los cultivos o que

el consorcio bacteriano en cultivo no utiliza vitamina B12.

DEDICATORIA A mis padres: Rodolfo y Graciela, por su guía y ejemplo maravillosos.

AGRADECIMIENTOS Al Dr. Ramón Cajal Medrano, por su ejemplo, dedicación, disposición, y apoyo. A mis sinodales, Dr. Helmut Maske, por su apoyo, sugerencias, y comentarios; Dra. Roxana Rico, por sus sugerencias y comentarios. Dr. Sergio Sañudo por sus sugerencias, comentarios y apoyo en el procesamiento de las muestras de vitamina. A las Instituciones involucradas:

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (CONACYT).

Universidad Autónoma de Baja California (UABC), Facultad de Ciencias Marinas.

Centro de Investigaciones Cientificas y Educacion Superior de Ensenada (CICESE), laboratorio de “Ecologia de Plancton Marino”.

A la familia.

2

Contenido

1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………..4

2. OBJETIVOS………………………………………………………………………..15 2.1 Objetivo General 2.2 Objetivos Particulares

3. HIPÓTESIS……………………………………………………………………….16 3.1 Preguntas Generales

4. METODOLOGÍA…………………………………………………………………..17 4.1 Medio de cultivo………………………………………………………………17 4.2 Inóculo………………………………………………………………………...18 4.3 Sistema de cultivo (quimiostato)…………………………………………...18 4.4 Experimentos en quimiostato……………………………………………….20 4.5 Abundancia de bacterias por conteo directo ……………………………..21 4.6 Determinación de POC y PON……………………………………………..22 4.7 Determinación de CO2 total…………………………………………………22 4.8 Determinación de oxígeno disuelto ………………………………………..23 4.9 Procesamiento de Datos…………………………………………………….24 4.10 Cálculo de eficiencia del crecimiento teórica…………………………….24 4.11 Hibridación fluorescente in situ……………………………………………25

5. RESULTADOS…………………………………………………………………....26 5.1 Abundancia celular…………………………………………………………...26 5.2 Producción de CO2, Reducción de O2 y cociente respiratorio…………..28 5.3 Biomasa……………………………………………………………………….37 5.4 Producción POC y PON……………………………………………………..40 5.5 Demanda bacteriana de carbono…………………………………………...43 5.6 Razón carbón: nitrógeno…………………………………………………….46 5.7 Contenido de carbono y volumen celular…………………………………..47 5.8 Eficiencia del crecimiento……………………………………………………49 5.9 Modelo de Pirt…………………………………………………………………51 5.10 Hibridación fluorescente in situ…………………………………………….53

6. DISCUSIÓN………………………………………………………………………..54

7. CONCLUSIONES…………………………………………………………………64

8. LITERATURA ...……..……………………………………………………………65

9. ANEXO……………………………………………………………………………..76 9.1 BGEs a partir de combinaciones de datos de POC y CO2......................76 9.2 BGE contra el consumo de carbono………………………………………..77 9.3 Carbono por célula reportado en la literatura ……………………………..78 9.4 Razón Carbono: Nitrógeno reportadas en la literatura…………………...79 9.5 Nitrógeno por célula contra tasa de dilución………………………………80 9.6 Volumen celular vs fg de carbono por célula………………………………82 9.7 fg de carbono por µm3 vs tasa de dilución…………………………………83

3

9.8 Compendio de resultados de abundancia celular y RQ………………….84 9.9 Compendio de resultados de respiración CO2........................................85 9.10 Compendio de resultados de respiración O2.........................................86 9.11 Compendio de resultados de carbón: nitrógeno…………………………87 9.12 Compendio de resultados de eficiencia del crecimiento………………..88

4

1. Introducción.

La vitamina B12.

El término vitamina B12 se utiliza ampliamente para describir compuestos

dentro del grupo de la cobalamina. Las formas naturales son

adenosilcobalamina, metilcobalamina e hidroxicobalamina. Cianocobalamina es

la forma más estable de cobalamina. (Hodgkin et al., 1955). (Fig.1).

Fig.1. Estructura de la vitamina B12

La vitamina B12 contiene el metal cobalto en el centro de su estructura La

estructura de cianocobalamina fue deducida por Dorothy Hodgkin (Hodgkin et

al., 1955) por medio de cristalografía de rayos X y reveló ser una molécula de

enorme complejidad, que además de consistir de un complejo hexacoordinado

de cobalto contiene un anillo contraído de porfirina, (las porfirinas existen en la

5

naturaleza como parte de tres grupos de compuestos: clorofila, hemo, y la

vitamina B12, y cada uno está formado de un tetrapirrol, la estructura es muy

similar y se diferencian porque cada una está unida a un metal diferente, la

clorofila contiene magnesio, el grupo hemo hierro y la cianocobalamina

cobalto). En la cianocobalamina una de las posiciones axiales se completa con

un grupo cianuro (CN-). Una cadena lateral del anillo de corrina compuesta por

una amida, un grupo fosfato, una ribosa y un nucleótido completa la

coordinación a través del resto 5,6-dimetilbenzimidazol en su extremo.

La biosíntesis de cobalamina tiene dos rutas alternativas que principalmente

difieren entre sí en el momento en el cual es insertado el cobalto en su

estructura y en las primeras etapas que dirigen la contracción del macro ciclo

de corrina y escisión del carbono extruido y su unión al grupo metilo. (Fig.2).

La vitamina B12 es biológicamente producida como una molécula

organometálica, su biosíntesis es intrincada, complicada y se encuentra

confinada a ciertos miembros del mundo de los procariotas (bacterias y

arqueas) (Warren et al., 2002). Solo alrededor de una tercera parte de los 250

taxones de arqueas y bacterias marinas secuenciadas hasta el año 2000

poseen los genes codificantes para las treinta enzimas que se conoce

participan en las reacciones de síntesis de cobalamina (Raux et al., 2000),

Actualmente se mantiene la hipótesis de que solo una minoría de las bacterias

saludables exudan o pierden cobalamina liberándola al mar (Provasoli 1963,

Berland et al., 1976).

6

Fig.2 Comparación de los genes requeridos en la ruta anaeróbica y aeróbica de la biosíntesis de vitamina B12 (Warren et al., 2002).

metilación en C1

hidroxilación C20 y formación

de γ lactona

metilación en C2 y C7

metilación en el C20

metilación en C11

contracción de anillo/

formación de δ lactona

metilación en el C17

cbiL

“Vía Anaeróbica

(inserción del cobalto temprana)”

Uroporfirinogeno III

Precorrina-2

Precorrina-cobalto 2

ácido cobirinico

Ado-cobalamina

cbiH

cblG?

-

Precorrina-cobalto 5

Precorrina-cobalto 6B

Precorrina-cobalto 3

Precorrina-cobalto 4

Precorrina-cobalto 6A

Precorrina-cobalto 8x

Cob(II) diamina a,c-ironoica

Cob(I) diamina a,c-ironoica

ado-Cob(I) diamina a,c-ironoica

ácido ado-cobirico

ado-cobinamida fosfato)

ado-GDP-cobinamida

cysGA

cobA

cysGB

cibK

cbiX

cbiF

cbiJ

cbiD?

cbiE

cbiT

cbiC

cbiA

?

cobA/

btuR

cobU

A

cobD y

cbiB

cbiP

cobT y

cobC

cobS

Inserción de cobalto

escisión de acetaldehído

Reducción C18-C19

metilación en C5 y

descarboxilación C15

rearreglo del metil C11 a C12

reducción de cobalto

a, c amidación

Precorrina-4

Precorrina-5

Precorrina-6A

cobJ

Precorrina-6B

Precorrina-8x

ácido hidrogenobirinico

Precorrina-3A

Precorrina-3B

cobG

cobI

“Vía Aeróbica”

(inserción de cobalto tardía)

Uroporfirinogeno III

cobA

precorrina-2

cobH

cobK

cobF

cobM

cobB

cobN

cob S y

cobT

?

cobO

cobP

cobU

cobV

cobD, cobC y

proteína α

Ado-cobalamina

Cob(II) diamina a,c-ironoica

ácido hidrogenobirinico a,c-diamina

Cob(I) diamina a,c-ironoica

ado-Cob(I) diamina a,c-ironoica

ácido ado-cobirico

ado-cobinamida

ado-GDP-cobinamida

contracción de anillo

cobL

cobL

escisión de ácido acético

inserción de cobalto

adenilación

amidación b,d,e,g

unión de aminopropanol en C17

fosforilación y

adición GMP

Síntesis de α-ribazol 5 fosfato y

desfosforilación

unión α-ribazol

7

La vitamina B12 es requerida para la síntesis de enzimas vitales. Por ejemplo se

necesita en reacciones de transmetilación, síntesis de metionina, y en la

replicación del DNA (Warren et al., 2002; Rodionov et al., 2003). La vitamina

B12 tiene la capacidad de catalizar reacciones de reducción (ejemplo:

metilmalonil CoA mutasa y ribonucleótido reductasas tipo II) o reacciones de

transferencia de grupos metilo, tales como aquellos que se encuentran en el

metabolismo metanogénico en bacterias (síntesis de metionina dependiente de

cobalamina) (Raux et al., 2000; Martens et al., 2002).

Las reacciones enzimáticas dependientes de adenosilcobalamina y

metilcobalamina pueden ser clasificadas en tres grupos generales (Stroinsky y

Schneider, 1987):

1. Rearreglos intramoleculares que involucran la transferencia de un átomo

de hidrógeno de un carbono hacia un carbono adyacente y su

reemplazamiento por otro grupo adyacente.

2. Reducción de ribonucleótido trifosfato en 22-deoxiribonucleotido

trifosfato.

3. Transferencias intermoleculares de grupos metilo.

Es interesante que humanos, animales y protistas necesiten obtener la vitamina

B12 de su ambiente, o bien alimentarse con dietas que la contengan, porque

son incapaces de sintetizarla por sí mismos, ya que necesitan B12 para fabricar

sus proteínas esenciales. En humanos la vitamina B12 es requerida en

cantidades traza (aproximadamente 1 μg/día) donde se encarga de asistir la

acción de dos enzimas, la metionina sintasa y la metilmalonil-CoA mutasa

8

(Warren et al., 2002). Se cree que las plantas y hongos ni la sintetizan ni la

usan ya que poseen rutas bioquímicas alternativas que no requieren esta

vitamina (Duda et al., 1967). A diferencia de la mitad de todas las especies

estudiadas de fitoplancton eucariótico que carecen de la vía biosintética de

vitamina B12 y deben depender de la vitamina exógena disuelta. (Croft et al.,

2005, 2006).

Se ha encontrado que en hielo marino aparentemente coexisten tanto bacterias

productoras como consumidoras de vitamina B12 (Kottmeier et al., 1987). Se ha

demostrado que microorganismos con un tamaño de entre 0.2 y 1.0 asimilan

cobalamina probablemente en proporción a su productividad y biomasa (Taylor

y Sullivan 2008).

Fue en microorganismos donde inicialmente se encontraron las ribonucleótido

reductasas dependientes de adenosilcobalamina (Blakely y Barker 1964;

Blakely 1965; Reichard 1993; Frey 2001). Las ribonucleótido reductasas tienen

un papel importante en el metabolismo celular de algunos microorganismos,

estas generan deoxirribonucleotidos (dNTPs) a partir de ribonucleótidos, que

son requeridos para la síntesis de DNA (Jordan y Reichard 1998).

Dentro de las reacciones en las cuales participa cobalamina en bacterias

encontramos el proceso de formación de acetato en bacterias acetogénicas vía

la cascada de Wood/Ljungdahl, donde acetil-CoA sintetizado a partir de dos

moléculas de CO2 es dependiente de metil corrinoide (Wood et al., 1986;

9

Ragsdale 1991; Stupperich 1993). Las cuales median la transferencia del grupo

metil del metiltetrahidrofolato a la monóxido de carbono deshidrogenasa

(CODH), una enzima capaz de unir CO por su sitio activo níquel. El grupo metil

es transferido a CODH por medio de una proteína metil-corrinoide/hierro-

azufre.

En casi todas las bacterias entéricas, con la excepción de Escherichia coli, la

coenzima B12 es esencial para la fermentación anaeróbica de 1,2 propanadiol,

etanolamina y glicerol. Estas reacciones redox son mediadas por enzimas diol-

deshidratasas, etanolamina amonio-liasas y glicerol deshidratasa dependientes

de adenosilcobalamina, (Abeles y Lee 1961; Bradbeer 1965; Scarlett y Turner

1976; Toraya et al., 1979; Forage y Foster 1982; Lawrence y Roth 1995).

Las arqueas metanógenas son microorganismos procariontes que viven en

medios estrictamente anaerobios y que obtienen energía mediante la

producción de gas natural, el metano (CH4), requieren metil-corrinoides para la

transferencia de grupos metilo de los sustratos metanogénicos, como el

metanol (Keltjens y Vogels 1993), metilaminas (Burke y Krzycki 1995) y acetato

(Ferry 1992), a un grupo tiol de coenzima M (Ferry 1993; Stupperich 1993).

Estos grupos metilo pueden ser transferidos de metil-tetra-hidrometanopterina

(un análogo estructural natural y funcional de metiltetrahidrofolato) vía

metilcobalamina a un grupo tiol de coenzima M (Poirot et al., 1987; Weiss y

Thauer 1993).

10

La vitamina B12 en el océano.

La presencia e importancia de compuestos orgánicos reguladores del

crecimiento del plancton en el océano se conoce desde hace tiempo (ver

Williams, 1975) y desde entonces el grupo de compuestos de este tipo que han

sido estudiados con mayor detalle es el del grupo de la vitamina B (biotina,

tiamina y vitamina B12). Con las técnicas disponibles en aquella época se

observó que la concentración superficial de vitamina B12 y oceánica es menor

que en la costa y en aguas profundas (Williams, 1975). Este hecho ha sido

confirmado recientemente con técnicas más modernas (Sañudo-Wilhelmy et

al., 2006). Una característica sobresaliente reportada para este compuesto es

que presenta un máximo a profundidades intermedias (200 a 500 m)

presumiblemente porque pierde su actividad cuando se expone a la luz solar

(Carlucci et al., 1969), pero pocos detalles son conocidos acerca de su

producción y consumo. Se supone que la vitamina B12 en los ecosistemas

marinos proviene de la biosíntesis de bacterias, sin embargo las explicaciones

acerca de las rutas a través de las cuales la cobalamina se encuentra disuelta

están sujetas a mucha especulación (Karl 2002; Croft et al., 2005, 2006, Droop

2007). Con la finalidad de explicar la liberación de la mayoría de B12 presente

en el océano se debe considerar a los procesos de mortalidad y senescencia

(lisis viral, depredación, y muerte celular programada). Adicionalmente se debe

considerar la incorporación de vitaminas al océano producto de la advección al

mar por parte de los ríos y arroyos (Swift 1980). Muchas especies de

microalgas deben obtener B12 directamente o indirectamente de otros

miembros de la comunidad a través de una variedad de procesos (Rodionov et

11

al., 2003). Hay evidencias genéticas y experimentales que demuestran que

algunos taxones de procariotas poseen rutas para recuperar o asimilar B12

extracelular así como sus precursores (Burkholder y Lewis 1968; Woodson y

Escalante-Semerena 2004). Se supone que las 2/3 partes restantes de los

procariotas adquieren cobalamina extracelular o tienen rutas independientes de

B12 (Rodionov et al., 2003).

La vitamina B12 como compuesto regulador del crecimiento en el océano.

La disponibilidad de B12 disuelta puede alterar la producción y afectar la

estructura de la comunidad planctónica del océano. Basándose en mediciones

directas de cobalamina se tiene evidencia que en los ambientes costeros,

donde la mayoría de la producción primaria del mundo ocurre, la vitamina B12

influencia la dinámica de la comunidad de fitoplancton. Mientras que la

estructura de la comunidad está parcialmente manejada por macronutrientes y

luz, hay resultados que sugieren que la vitamina B12 puede incrementar la

biomasa de fitoplancton y potenciar la inducción de cambios en su estructura

(procariotas contra eucariotas o pequeñas contra grandes eucariotas) (Sañudo-

Wilhelmy et al., 2006). La ausencia o presencia de B12 en el océano puede

determinar dónde, cuánto, y qué tipo de fitoplancton (protistas fotosintéticos

comúnmente llamados algas microscópicas) florece en el mar (Croft et al.,

2005, 2006). Se cree que el crecimiento de grandes taxones de fitoplancton

puede ser estimulado por adiciones de vitamina B12, incluso en aguas

relativamente ricas en nutrientes (Sañudo-Wihelmy et al., 2006; Gobler et al.,

2007). Se sabe que una alta proporción de diatomeas (59 %) y dinoflagelados

(89%) en cultivo son auxótrofos a B12 y requieren vitaminas extracelulares para

12

crecer (Croft et al., 2005, 2006). Se sabe también que en el golfo de Maine y en

el mar de Sargasso las concentraciones de B12 varían estacionalmente, con un

máximo en invierno seguidas de una disminución durante el florecimiento de

primavera (“spring bloom”) (Menzel y Spaeth 1962; Swift 1981). Sin embargo la

cantidad de vitamina B12 requerida por parte de los taxones de fitoplancton en

el océano es hasta ahora incierta (Carlucci y Bowes, 1972; Croft et al., 2006;

Droop, 2007).

La producción de vitamina B12 y su utilización por procariotas marinos.

Aunque se conoce que en general el fitoplancton en el océano, requiere de la

presencia de la vitamina B12 para su crecimiento y que entre los productores de

la vitamina se encuentran los procariotas, no se conocen detalles de la

identidad y fisiología de las bacterias capaces de producirla y mucho menos su

impacto en el ecosistema marino y el ciclo del carbono. Por ejemplo, se sabe

que la bacteria marina más abundante y conspicua (25% del bacterioplancton)

en el océano (Pelagibacter ubique) y de la cual se especula (Giovannoni y

Rappé, 2000) que debe tener un papel muy importante en el océano, no tiene

capacidad de producción de vitamina B6, B12, Biotina y Tiamina (Giovannoni et

al., 2005). Este hecho sugiere que este importante grupo de bacterias no

requiere el uso de vitamina B12 o sufre algún tipo de limitación por vitamina B12

y por lo tanto no se conoce el efecto global en un grupo mayoritario de

bacterias marinas y el impacto final de estas interacciones en el enlace

microbiano (microbial loop).

Las pocas mediciones de vitamina B12 en el agua mar de regiones oceánicas

han revelado concentraciones dentro del rango subpicomolar, y

13

concentraciones mayores en regiones costeras. (Menzel y Spaeth 1962;

Okbamichael y Sañudo-Wilhelmy 2004; Sañudo-Wilhelmy et al., 2006).

Se sugiere que el crecimiento de muchos taxones de algas puede estar

limitado por la disponibilidad de B12 en el océano pero no se sabe qué fracción

del bacterioplancton pudiera también sufrir limitación por este cofactor de

crecimiento. Se han reportado condiciones limitantes por parte de la vitamina

B12 y una estimulación preferencial de taxones de fitoplancton en el mar de

Ross (Bertrand et al., 2007). Contrariamente a lo anterior también es posible

que la vitamina B12 no tenga un papel tan relevante como el que se le adjudica

y que el requerimiento celular de vitamina sea tan bajo que resulte de muy

poca influencia para el crecimiento del plancton. Este punto de vista contrario

se basa en estudios realizados en laboratorio en donde la cobalamina disuelta

rara vez disminuye, de manera que la vitamina B12 no sería un compuesto

limitante del crecimiento en el océano (Droop, 2007).

El efecto que potencialmente pueda tener la vitamina B12 en el metabolismo

del carbono del bacterioplancton marino no ha sido estudiado y como una

primera aproximación pretendemos establecer cultivos de consorcios de

bacterioplancton marino usando cultivos continuos. Los cultivos continuos en

quimiostato funcionan con una tasa de dilución (tasa de bombeo dividido por

volumen del cultivo) menor a la requerida para mantener la velocidad de

crecimiento celular máxima. Esto permite el crecimiento continuo de cultivos

con densidades de población limitadas por recursos ya que se limita la

presencia de nutrientes en el cultivo. Al mismo tiempo se mantiene el

14

crecimiento exponencial. A diferencia de los cultivos en batch (cultivos

discontinuos) o los cultivos continuos en turbidostato (donde la velocidad de

crecimiento se mantiene a la velocidad máxima) en los cultivos continuos en

quimiostato (velocidad de crecimiento proporcional a la tasa de dilución) se

pueden estudiar aspectos ecológicos y fisiológicos bajo condiciones limitadas

de sustrato (s) que es la condición necesaria para estudiar el caso en particular

de la producción de la vitamina B12 por parte de comunidades de bacterias

marinas. Los parámetros que se deben considerar en un cultivo en quimiostato

son: D (tasa de dilución, tiempo-1) que es igual al flujo de medio (ml/h) sobre el

volumen de la cámara de cultivo.

Las diferentes tasas de dilución (o tasas de crecimiento) en cultivo de

poblaciones naturales de bacterias heterotróficas producen un amplio rango de

selecciones genotípicas y fenotípicas y simplifica el estudio del metabolismo del

bacterioplancton marino bajo condiciones controladas de temperatura, con

limitación o sin limitación por recursos. Aunque este trabajo es aún de carácter

exploratorio, pretendemos relacionar los consorcios bacterianos

(seleccionados con las diferentes tasas de dilución), con su capacidad de

producción de vitaminas y con el efecto potencial en la eficiencia del

crecimiento del consorcio bacteriano en cultivo. Con esta investigación

iniciamos un proyecto a largo plazo para generar información que permita

entender el papel de las vitaminas en el potencial fisiológico (tasas de

crecimiento específico, eficiencia del crecimiento, respiración, etc.) de

comunidades de bacterias marinas en el océano.

15

2. Objetivo

2.1 Objetivo General

Determinar la importancia de la vitamina B12 en el crecimiento y fisiología de

cultivos de poblaciones de bacterias marinas naturales en quimiostato a

diferentes tasas de crecimiento.

2.2 Objetivos Particulares

1.- Obtener diferentes tasas de crecimiento de bacterioplancton marino en

estado estacionario en un quimiostato.

2.- Determinar la actividad metabólica (respiración, producción de CO2 y

reducción de oxígeno) producción de biomasa (POC y densidad celular) y

eficiencia del crecimiento de cultivos marinos en quimiostato.

3.- Determinar la proporción de taxones característicos de las comunidades de

bacterioplancton en cultivos marinos durante el estado estacionario en

quimiostato.

16

3. Hipótesis

3.1 Preguntas generales.

1. ¿Se produce vitamina B12 en cultivos continuos de comunidades de

bacterioplancton organotrófico marino?

2. ¿Existe alguna relación entre la fisiología del bacterioplancton (tasas de

crecimiento específico, respiración, eficiencia del crecimiento etc.) y la

concentración de vitamina B12 en los cultivos?

3. ¿Se puede asociar la presencia de vitamina B12 con diferentes grupos

taxonómicos?

4. ¿Cómo responden los cultivos a la adición de vitamina B12?

5. ¿Se puede encontrar algún patrón en la presencia de vitamina B12 en

cultivos con la fisiología y ecología del bacterioplancton?

17

4. Metodología

4.1 Medio de cultivo

Los medios de cultivo se prepararon utilizando agua de mar natural, la cual se

colectó de la Bahía de Ensenada, en garrafones de plástico de 20 L. Con el

propósito de eliminar posibles fuentes de carbono presentes, el agua de mar

fue tratada con ozono por 24 horas, después se agregó carbono activado se

agitó por 24 horas y se filtró por un filtro GF/F. Para los quimiostatos que

mantuvieron una tasa de dilución menor a 3.6 día-1 los medios de cultivo se

prepararon con el agua de mar tratada adicionando glucosa 20µM, NH4Cl 30

µM, KH3PO4 5µM y FeCl3 0.4µM. Para quimiostatos con tasas de dilución

mayores a 3.6 día-1 las concentraciones de nutrientes utilizadas fueron glucosa

100 µM, NH4Cl 182 µM, KH3PO4 43 µM, y FeCl3 2 µM. Los medios de cultivo

fueron almacenados en botellas de 20L de policarbonato y se acidificaron con

un burbujeo de CO2 por 4 minutos. Posteriormente los medios de cultivo se

esterilizaron a 121oC (15 pka) por una hora. Finalmente el medio fue oxigenado

con un burbujeo de aire filtrado (0.2µm de poro) durante 24 horas.

18

4.2 Inóculo

Los inóculos utilizados fueron muestras de agua de mar de la Bahía de Ensenada

filtrada por filtros de policarbonato de 0.6 m. Los cuales fueron colectados durante el

inicio de marea alta en la zona costera rocosa de la Facultad de Ciencias Marinas.

Las muestras eran transportadas inmediatamente al laboratorio e inoculadas al

sistema de cultivo dentro de los 25 minutos posteriores a la colecta.

4.3 Sistema de cultivo (quimiostato)

El sistema de cultivo consistió de un garrafón de policarbonato el cual contuvo

el medio de cultivo, tapado con un tapón de silicón con una salida de medio de

cultivo asistida por una bomba. La esterilidad del medio de cultivo se

comprobó con el paso de este hacia medio líquido ZoBell. La cámara de cultivo

consistió de una botella de teflón protegida de la luz con una conexión para

entrada de medio de cultivo, una conexión para la salida de efluente (el

efluente se recuperó en un embase plástico), una conexión para la toma de las

muestras, y conexión para la salida de aire. La cámara de cultivo se encontró

en agitación continua (agitador magnético con recubrimiento de vidrio), y su

temperatura permaneció constante por medio de un baño de agua que fluyó

por un termocirculador. Toda la tubería fue de teflón o de silicón. El medio y

cultivo solo estuvieron en contacto con vidrio, teflón o silicón. Fig. 3.

19

Fig. 3. Componentes del sistema de cultivo quimiostato

1.- Medio de cultivo.

2.-Cultivo

3.- Bomba para succión del efluente

4.- Reservorio para efluente.

5.- Baño de agua

6.- Matraz Erlenmeyer con medio ZoBell.

7.- Filtro para aire.

8.- Filtro de 0.2 µm.

9.-Salida de aire del medio.

10.- Salida de aire del cultivo.

11.- Salida de medio.

12.-Toma de muestra

13.-Bulbo para goteo de medio

14.- Entrada de medio al cultivo

15.- Salida de cultivo

16.- Agitador del medio

17.- Agitador del cultivo

20

4.4 Experimentos en Quimiostatos

Se realizaron un total de ocho experimentos en quimiostato. En tres de ellos

(0.37 día -1, 0.62 día -1, y 0.8 día -1) se adicionó vitamina B12 (18pM, 20 pM y 50

pM) al medio de cultivo. La solución stock de vitamina B12 se preparó en

condiciones de esterilidad con una concentración de 0.1 g/L, y se almacenó en

congelación en ampoyetas de vidrio de 5ml. La solución de vitamina fue

adicionada al medio de cultivo oxigenado con una jeringa conectada a un filtro

de 0.2 µm con el objetivo de asegurar la máxima dilución de la vitamina B12.

En los quimiostatos a las tasas de dilución de 3.69 día-1 y 7.5 día-1 se buscó

asegurar una menor pérdida de la vitamina B12 en el efluente así como

observar algún efecto inmediato de la B12 en alguna de las variables a

determinar. Por estas razones se adicionó la vitamina B12 filtrada (0.2 µm) en

pulsos directamente al cultivo en fase de crecimiento estacionario (3.69 día-1 3

pulsos 100 pM de B12 y 7.5 día-1 4 pulsos 100 pM de B12).

21

4.5 Abundancia de bacterias por conteo directo con el colorante

fluorescente DAPI

Para determinar abundancia bacteriana se colectaron ~ 20 ml de muestra

directamente en un vial de centelleo con formol amortiguado a una

concentración final de 2%. Se utilizo un filtro GF/F como soporte del filtro negro

de policarbonato de 0.2m. La preparación se ajustó hasta obtener un número

de células entre 20-40 células por campo (0.5 ml a 0.1 ml, según la densidad

del cultivo). Se adicionó el colorante DAPI (4’,6-diamino-2-fenilindol a una

concentración de 10μg ml-1) y fué incubada por 10 minutos, en oscuridad. Una

vez filtrada la muestra se retiró el filtro y se montó. El montaje de las

preparaciones fué realizado con una solución 50% glicerol y 50% PBS con p-

fenilenediamina al 0.01%. Para observar al microscopio se agregó sobre el

portaobjetos aceite de inmersión de baja fluorescencia. Se seleccionaron de

12 a 16 campos al azar y un total > 300 células bacterianas fueron contadas.

Los conteos se realizaron con un microscopio de epifluorescencia con espejo

dicroico de 395 nm, filtro para longitud de onda de excitación 360 nm y filtro

para longitud de onda de emisión de 461 nm, con el objetivo de 100x. El cálculo

de la densidad celular se hizo de acuerdo a la relación siguiente:

Células ml-1 = (PCM)*F/V

PCM= promedio de células por campo en la muestra

F= cociente del área de la superficie del filtro y área de la cuadricula de conteo.

V= volumen filtrado de la muestra.

22

4.6 Determinación de POC y PON

Las muestras para determinar carbono orgánico particulado (POC) y nitrógeno

orgánico particulado (PON) se obtuvieron por duplicado filtrando cultivo (~400

ml) y medio (~800 ml) con filtros de fibra de vidrio (GF/F) calcinados (dos

horas a una temperatura de 450oC). Los filtros se almacenaron congelados en

viales de centelleo a una temperatura de -40oC hasta el momento de su

liofilización. La determinación del contenido de carbono y nitrógeno se realizó

en un analizador de carbono, hidrógeno y nitrógeno (CHN) en el laboratorio de

Marine Science en la Universidad de California en Santa Barbara.

4.7 Determinación de CO2 Total

El CO2 fue medido por un método diferencial de titulación usando una bomba

de inyección (Kloehn 50300) y un pH metro (Orion 701A). La titulación se

realizó automáticamente mediante una PC que controló la bomba de inyección

y almacenó los datos digitales de pH. La cámara de titulación (30.733ml) era

enjuagada más de tres veces con agua, una vez con agua destilada y las

demás veces con agua de la misma muestra, después era llenada y mantenida

a una temperatura constante (25°C) durante toda la titulación. Durante la

titulación se obtuvieron dos picos de inflexión obtenidos de la primera derivada

de la curva de titulación, y el cálculo de CO2 total se realizó con la siguiente

ecuación.

CO2T (M) = (V2-V1) * N (HCL) / Volumen de la muestra * 1000.

23

Donde:

V1= volumen HCl (primer punto de inflexión).

La precisión obtenida con nuestra titulación diferencial de CO2 se encontró en

el rango de 0.15 a 0.4% o 3 a 8 μmol CO2 kg–1.

4.8 Determinación de oxígeno disuelto por espectrofotometría

El oxígeno disuelto se determinó mediante el método Winkler (Roland et al., 1999).

Esta técnica detecta el complejo triyoduro formado finalmente por los reactivos del

método Winkler, a 430 nm.

Se generó una curva de calibración mediante el uso de agua destilada saturada con

aire a diferentes temperaturas (10, 15, 20,25 y 30 oC.). De esta manera se obtuvo una

relación entre la concentración de oxígeno disuelto y la absorbancia. La concentración

de oxígeno disuelto fue titulada con el polinomio de Weiss (1970) para determinar

solubilidad en el agua de mar con lo cual se obtuvo valores de oxígeno disuelto

teórico. El agua destilada saturada (en el intervalo de temperaturas indicado), se tituló

con tiosulfato y se registró absorbancia en el espectrofotómetro, simultáneamente a

430 y 750 nm. Se prepararon blancos de reactivos agregando los reactivos Winkler en

sentido contrario y tomando una lectura en espectrofotómetro a 430 nm.

La ecuación resultante para calcular oxígeno disuelto con valores de

absorbancia fue:

DO (mg L-1) = 0.00738 x CA- 0.562)

Donde CA = (Abs430 MUESTRA - Abs430 REACTIVOS – Abs750 MUESTRA) x 1000.

24

4.9 Procesamiento de datos

La respiración se calculó a partir de la concentración de CO2 y POC en el

medio de cultivo y el cultivo. Por diferencia se obtuvo el incremento de ∆CO2 y

∆POC. La tasa de respiración específica se calculó de acuerdo a la expresión.

r = POC

DCO

*2 [d-1]

Donde r es la respiración específica y D es la tasa de dilución

La eficiencia del crecimiento se calculó a partir del incremento en la biomasa en

forma de POC y el CO2 respirado.

2COPOC

POC

4.10 Cálculo de eficiencia del crecimiento teórica

La eficiencia del crecimiento está definida como la producción de biomasa

bacteriana relativa a la cantidad total de material utilizado para crecer.

Definida matemáticamente como BGE=BP/BCD donde BP es la producción

bacteriana y BCD es la demanda de carbono bacteriana.

Para calcular la eficiencia del crecimiento teórica (Y) se utilizó el modelo de

Pirt. En donde la eficiencia del crecimiento (Y) es función de la tasa de

crecimiento específico (µ) según se expresa en la siguiente ecuación:

25

Y=µ (µ-1+a-1)-1

En donde µ= crecimiento específico, Ɛ =Eficiencia de conversión de sustrato a

energía (o biomasa), a= metabolismo de mantenimiento.

4.11 Hibridación fluorescente in situ (FISH)

FISH consiste en la detección de secuencias de ADN (sondas) previamente

marcadas con fluorescencia sobre cromosomas o núcleos celulares fijados

sobre un portaobjetos, usando para ello un microscopio de fluorescencia.

Este procedimiento fue realizado de acuerdo con la metodología descripta por

Pinkel et al., (1990) con modificaciones.

Las preparaciones fueron incubadas en una cámara húmeda a 46°C. La

desnaturalización cromosómica fue realizada en formamida al 99%. La

abundancia bacteriana fue detectada con DAPI (10µg/ml), el montaje de las

preparaciones fue realizado con una solución 50% glicerol y 50% PBS con p-

fenilenediamina al 0.01%. Los conteos se realizaron con un microscopio de

epifluorescencia con, espejo dicroico de 395 nm, con filtro para longitud de

onda de excitación 360 nm y filtro para longitud de onda de emisión de 461 nm.

La observación de las células en las cuales se incorporan las secuencias

marcadas con fluorescencia características a cada taxón de bacterias (alfa,

beta, gama, arqueas, SAR11, y eubacterias) se realizó con un filtro dicroico de

562 nm, con un filtro de excitación de 532±20, y con un filtro de emisión de

593±20, con objetivo de 100x.

26

5. Resultados

5.1 Abundancia celular

La abundancia celular máxima en estado estacionario obtenida fue de 1.41x107

células por mililitro correspondiente al quimiostato con tasa de dilución de

3.69 día-1. El cultivo con la abundancia celular más baja (4.07x106 cél ml-1)

correspondió al quimiostato con tasa de dilución de 0.2 día-1. (Figura 4a).

Cuando se comparó la abundancia celular de cultivos a los que se agregó

vitamina B12 contra los que no se agregó vitamina (Figura 4b) pero con tasas

de dilución similares se pudo observar que no hubo diferencias significativas

entre los dos tratamientos (con vitamina y sin vitamina) y la relación general del

número de células en función de la tasa de dilución se mantiene.

4a

27

Figuras 4.- a) Abundancia celular contra la tasa de dilución. b) Abundancia celular promedio contra la tasa de dilución. Las barras de desviación estándar destacan la diferencia entre cultivos del mismo experimento (n=2, desviaciones estándar multiplicadas por un factor de corrección de 1.25) en los cuales la variante fue el agregar la vitamina B12 al medio de cultivo de uno de los duplicados. En color amarillo se destacan los experimentos en los cuales se le agrego vitamina B12 al medio de cultivo.

4b

28

5.2 Producción de CO2, Reducción de O2, y cociente respiratorio.

Con respecto a la producción de CO2 total (diferencia en la concentración de

CO2 entre el medio de cultivo y el cultivo) los valores más altos fueron 275 µM

L-1 y 270.36 µM L-1, con tasas de producción de CO2 de 1014.75 µM L-1 d-1 y

997.63 µM L-1 d-1 respectivamente para las tasas de dilución de 3.69 día-1.

Los valores de producción de CO2 total registrados más bajos 18.66 µM L-1 y

33.02 µM L-1 con tasas de producción de CO2 de 13.06 µM L-1 d-1 y 13.54 µM L-

1 d-1 correspondieron a los quimiostatos con las tasas de producción de 0.7 día-1

y 0.41 día-1, respectivamente. (Figura 5a).

Los valores de producción de CO2 total, aumentaron linealmente (18.66 µM L-1

a 275 µM L-1) conforme aumentaba la tasa de dilución, sin embargo a partir de

la tasa de dilución de 3.69 día-1 hasta 7.5 día-1 la producción de CO2 no siguió

aumentando sino se mantuvo constante (Figura 5a).

A diferencia de la tasa de producción de CO2 total la producción de CO2 por

día mostró un aumento lineal positivo durante toda la curva de producción de

CO2. (Figura 5b).

Cuando se comparó la producción de CO2 de los cultivos a los cuales se les

agrego vitamina B12 se vió que su comportamiento no parece diferir de aquellos

a los cuales no les agregó vitamina. (Figuras 5a y 5b).

La producción de CO2 por célula más altas obtenidas (3.33 x10-8 µM cél-1 y

2.64 x10-8 µM cél-1) fueron para los cultivos con las tasas de cultivo de 1 día-1 y

0.2 día-1 respectivamente. La adición de vitamina no genero ningún

29

comportamiento característico en la tasa de producción de CO2 por célula.

(Figura 5c).

5 a

5a.1

30

5b

5b.1

31

5c

5c.1

32

Figuras 5.- a) Diferencia en la concentración de Co2 entre el cultivo y el medio de cultivo a

diferentes tasas de dilución. b) Tasa de producción promedio de Co2 contra la tasa de dilución.

c) Producción de CO2 por célula contra la tasa de dilución. En color amarillo se destacan los

experimentos a los cuales se le agregó vitamina B12 al medio de cultivo. Las barras de

desviación estándar destacan la diferencia entro cultivos del mismo experimento (n=2 hasta la

tasa de dilución de 1.22 día-1, n=3 para las tasas de 3.69 día-1 y 7.5 día-1 desviaciones estándar

multiplicadas por un factor de corrección de 1.25 y 1.125 respectivamente) 5a.1 solo se

muestran bajas tasas de dilución. 5b.1 solo se muestran bajas tasas de dilución. 5c.1 solo se

muestran bajas tasas de dilución.

La reducción de O2 (diferencia en la concentración de oxígeno entre el medio

de cultivo y el cultivo) durante la fase de crecimiento estacionario, fue positivo y

aumentó de manera lineal (figura 6a) y al igual que la producción de CO2 total a

partir de la tasa de crecimiento de 3.69 día-1 dejo de aumentar y se mantuvo

con poca variación aun a las tasas de crecimiento más altas como 7.5 día-1. La

tasa de reducción de oxígeno por día más alta (1028.61 µM L-1 d-1)

correspondió a la tasa de crecimiento de 7.5 día-1 a la cual se le agregó

vitamina B12. Al igual que el aumento lineal de la reducción de O2 por día

durante la fase de crecimiento estacionario, la tasa de reducción de O2 por

célula tuvo el mayor registro (1.29x10-8 µM cel-1) en la tasa de dilución de 7.5

día-1. (Figuras 6b y 6c, respectivamente).

El cociente respiratorio vario de 1.15 a 2.89 y no se detectó ningún efecto

cuando se agregó vitamina B12 (Figura 6d).

33

6a

6a.1

34

6b

6b.1

35

6c

6c.1

36

Figuras 6.- a) Diferencia promedio en la concentración de O2 entre el cultivo y el medio de

cultivo a diferentes tasas de dilución (n=3 desviaciones estándar multiplicadas por un factor de

corrección de 1.125). b) Tasa de reducción promedio de O2 por día contra la tasa de dilución

(n=3 desviaciones estándar multiplicadas un factor de corrección de 1.125). c) Reducción

promedio de O2 por célula contra la tasa de dilución (n=3, desviaciones estándar multiplicadas

por un factor de corrección de 1.125). d) Cociente respiratorio contra la tasa de dilución. En

color amarillo se destacan los experimentos en los cuales se agregó vitamina B12 al medio de

cultivo. 6a.1 solo se muestran bajas tasas de dilución. 6b.1 solo se muestran bajas tasas de

dilución. 6c.1 solo se muestran bajas tasas de dilución.

6d

37

5.3 Biomasa

La biomasa calculada con la diferencia entre el contenido de POC en el medio

y el cultivo, tuvo un aumento lineal positivo, consecuentemente donde la

concentración más alta (386.80 µM) correspondió a la tasa de dilución (7.5

día-1). La biomasa más baja (21.96 µM) correspondió a la tasa de dilución (0.7

día-1). (Figura 7a).

La biomasa PON tuvo un aumento lineal positivo, consecuentemente 84.69 µM

fue la concentración más alta y correspondió a la tasa de dilución de 7.5 día-1.

La biomasa PON más baja 6.17 µM correspondió a la tasa de dilución de 1.1

día-1. (Figura 7b).

Ni en la biomasa POC ni la biomasa PON se puede observar un

comportamiento que destaque el papel de la adición de vitamina B12 en los

medios de cultivo para ninguno de los experimentos. (Figura 7a y Figura 7b).

38

7a

7a.1

39

Figuras 7.- a) Biomasa promedio POC contra la tasa de dilución (n=3, desviaciones estándar

multiplicadas por un factor de corrección de 1.125). b) Biomasa promedio PON contra la tasa

de dilución (n=3, desviaciones estándar multiplicadas por un factor de corrección de 1.125). En

color amarillo se destacan los experimentos en los cuales se agregó vitamina B12 al medio de

cultivo. 7a.1 solo se muestran bajas tasas de dilución. 7b.1 solo se muestran bajas tasas de

dilución.

7b

7b.1

40

5.4 Producción de carbón orgánico particulado y nitrógeno orgánico

particulado.

La producción de POC por día tuvo un incremento lineal. La producción POC

más alta (2901.03 µM día-1) correspondió a la tasa de dilución de 7.5 día-1. La

producción de POC por día más baja (7.66 µM día-1) correspondió a la tasa de

dilución de 0.2 día-1. (Figura 8a).

La producción de PON por día tuvo un incremento lineal. La producción PON

más alta (635.18 µM día-1) correspondió a la tasa de dilución de 7.5 día-1. La

producción de PON por día más baja (1.62 µM día-1) correspondió a la tasa de

dilución de 0.2 día-1. (Figura 8b).

Ni en la producción POC día-1 ni en la producción de PON día-1 se puede

observar un comportamiento que destaque el papel de la adición de vitamina

B12 en los medios de cultivo para ninguno de los experimentos.

8a

41

8a.1

8b

42

Figuras 8.- a) Tasa de producción de POC día-1 contra la tasa de dilución (n=3, desviaciones

estándar multiplicadas por un factor de corrección de 1.125). b) Tasa de producción de PON

día-1 contra la tasa de dilución (n=3, desviaciones estándar multiplicadas por un factor de

corrección de 1.125). En color amarillo se destacan los experimentos en los cuales se agregó

vitamina B12 al medio de cultivo. 8a.1 solo se muestran bajas tasas de dilución. 8b.1 solo se

muestran bajas tasas de dilución.

8b.1

43

5.5 Consumo Bacteriano de Carbono

El consumo de carbono bacteriano se define como la suma de la biomasa total

más la producción total de CO2. El consumo de carbono en general aumentó

de manera lineal en función de la tasa de dilución donde la adición de vitamina

B12 no destacó en relación a los cultivos sin vitamina. Sin embargo dentro de

las tasas de dilución de 0.2 día-1 y 1.22 día-1 el consumo de carbono no

aumento pero se mantuvo constante en función de la tasa de dilución, los

experimentos adicionados con vitamina B12 exhibieron el mismo

comportamiento. (Figura 9a).

La tasa de consumo de carbono por día al igual que el consumo bacteriano de

carbono total tuvo un aumento lineal positivo en donde las adiciones de

vitamina B12 tampoco se vieron reflejadas en la determinación de este

parámetro. (Figura 9b).

9a

44

9b

9a.1

45

Figuras 9.- a) Demanda de carbono total contra la tasa de dilución. Las líneas sólidas representan la concentración de sustrato orgánico agregado en forma de glucosa. 9a.1 solo se muestran bajas tasas de dilución. 9b.1 solo se muestran bajas tasas de dilución. b) Tasa de demanda de carbono por día contra la tasa de dilución. En color amarillo se destacan los experimentos en los cuales se agregó vitamina B12 al medio de cultivo.

9b.1

46

5.6 Razón Carbón: Nitrógeno (C: N)

La razón C: N no cambio significativamente en función de la tasa de

crecimiento y no se observó ningún efecto con la adición de la vitamina B12 a

los medios de cultivo en ninguno de los experimentos. (Figura 10).

Figura 10.- a) Razón C/N promedio contra la tasa de dilución (n=3, desviaciones estándar

multiplicadas por un factor de corrección de 1.125).

10

47

5.7 Contenido de carbono y volumen celular

El contenido de carbono aumento linealmente en función de la tasa de

crecimiento. Se observó este mismo comportamiento en aquellos cultivos a los

cuales se les agregó la vitamina B12.

El volumen celular aumento linealmente en función de la tasa de crecimiento.

En donde la incorporación de vitamina B12 a los cultivos no mostro ningún

efecto.

11a

48

Figuras 11. a) Contenido de carbono contra la tasa de dilución (n=3, desviaciones estándar

multiplicadas por un factor de corrección de 1.125). b) Volumen celular contra la tasa de

dilución (n=3, desviaciones estándar multiplicadas por un factor de corrección de 1.125). Los

círculos amarillos representan los cultivos a los cuales se les agregó vitamina B12. Los círculos

vacíos representan a los cultivos sin vitamina.

11b

49

5.8 Eficiencia del crecimiento

La eficiencia del crecimiento se incrementó rápidamente de 0.26 a 0.42 a partir

de las tasas de dilución de 0.22 día-1 hasta 0.93 día-1. A partir de la tasa de

dilución de 0.93 día-1 (0.1 día-1 a 1 día-1 tasas de crecimiento relevantes para el

océano, Kirchman 2008) el incremento se redujo asintóticamente. (Figura

11a). La adición de vitamina B12 no muestra tener un efecto significativo en la

eficiencia del crecimiento en función de la tasa de dilución.

La eficiencia del crecimiento no mostró ningún comportamiento en función de la

razón carbono: nitrógeno, sin embargo la dispersión de los datos fue

generalmente mayor en los valores más altos de la relación C: N. Tampoco en

este caso la adición de vitamina B12 reflejó tener algún efecto. (Figura 11b).

12a

50

Figuras 12.- a) Eficiencia del crecimiento contra la tasa de dilución. b) Eficiencia del crecimiento promedio contra la razón carbono/nitrógeno. (n=3, desviaciones estándar multiplicadas por un factor de corrección de 1.125). En color amarillo se destacan los experimentos en los cuales se agregó vitamina B12 al medio de cultivo.

12b

51

5.9 Modelo de Pirt.

La eficiencia del crecimiento mostró el comportamiento esperado en función de

la tasa de crecimiento específico (o tasa de dilución) de acuerdo al modelo de

Pirt (Figura 12). Las variables resultantes utilizadas para el cálculo del modelo

de Pirt fueron Ɛ=0.66 y a=1.72, R2=0. 5372

Al aplicar el modelo de Pirt a los datos de eficiencia obtenidos junto a los

obtenidos con experimentos en quimiostatos de Cajal y Maske, 2005 y datos

de Jiménez Mercado 2007, se encontró que nuestros datos se integran bien.

(Figura 13). Las variables resultantes utilizadas para el cálculo del modelo de

Pirt fueron Ɛ=0.57 y a=0.59, R2=0.5169

13

52

Figura 13.- Eficiencia del crecimiento experimental y eficiencia del crecimiento esperada (modelo de Pirt) contra la tasa de dilución. Los círculos representan la eficiencia del crecimiento experimental, en color amarillo se destacan los experimentos en los cuales se agregó vitamina B12 al medio de cultivo. La Línea punteada representa al modelo de Pirt el cual fue calculado bajo los siguientes parámetros Ɛ=0.66 y a=1.72. La estimación de la propagación del error para las diferentes eficiencias del crecimiento calculadas varió de 0.05 a 0.5 en donde las desviaciones estándar fueron multiplicadas por un factor de corrección de 1.25, 1.125, 1.0822, y 1.0625 de acuerdo a el valor de n el cual vario de 2 a 4 dependiendo de las diferentes variables involucradas para el cálculo de eficiencia).

Figura 14.- Eficiencia del crecimiento experimental y eficiencia del crecimiento esperada (modelo de Pirt) contra la tasa de dilución. Círculos blancos y amarillos (adición de vitamina) son los datos obtenidos en este trabajo. Los cuadrados son datos de Jiménez-Mercado (no publicado). Los triángulos son datos de Cajal y Maske (2005). La Línea punteada representa al modelo de Pirt el cual fue calculado bajo los siguientes parámetros Ɛ=0.57 y a=0.59.

14

53

5.10 Hibridación fluorescente in situ (FISH)

Los porcentajes de la hibridación fluorescente in situ en función de las células

marcadas con DAPI sugieren que nuestros cultivos mantienen cierta diversidad

taxonómica bacteriana. Todas las sondas específicas probadas (alfa, beta,

gama, arqueas, SAR11, y eubacterias) hibridaron con células de nuestros

cultivos los cuales se encontraban en la fase de crecimiento estacionaria.

Figura 15.- Porcentaje de grupos bacterianos representados en el estado estacionario en quimiostato a una tasa de dilución de 0.2 día-1 en el estado estacionario.

15

54

6. Discusión

Los valores estimados para la razón carbono: nitrógeno se encuentran dentro

del rango reportado (tabla 2). La variabilidad de la razón C/N fue mucho menor

durante el crecimiento máximo sugiriendo una población menos diversa. La

razón C: N se comportó de acuerdo a lo reportado por Cajal y Maske en el

2005 en donde se encontró que la razón carbono nitrógeno no cambió en

función de la tasa de crecimiento ni en función de la eficiencia del crecimiento.

Lo cual apoya el argumento de que en el océano la calidad de la biomasa

transferida a los niveles tróficos superiores no difiere en función de las

diferentes tasas de crecimiento y representa una transferencia de material

orgánico enriquecido en nitrógeno (Cajal y Maske, 2005).

Se estima que en la mayoría de los sistemas acuáticos de los océanos

oligotróficos los tiempos de generación de las comunidades de bacterias

pueden ser tan largos como un día e incluso a veces hasta de semanas

(Kirchman, 2008). Las tasas de dilución utilizadas en nuestros experimentos

(de 0.2 d-1 a 7.5 d-1) representan una amplia gama de tiempos de generación

posibles en el océano (de 3.5 d-1 a 0.1 d-1).

En la naturaleza el límite superior del tamaño de la población no solo se

encuentra establecido por la disponibilidad de los recursos, sino también por la

mortalidad por medio de los depredadores o la enfermedad. (Carpenter et al.,

1985; McQueen et al., 1986; Ducklow y Carlson, 1992). En nuestros cultivos en

estado estacionario la tasa de mortalidad es constante y no existen

depredadores porque el inóculo del cultivo es filtrado (0.6 µm) y la observación

55

directa de las muestras con microscopio de epifluerescencia no reveló su

presencia. Evidencia previa con este tipo de cultivos muestra que el efecto de

fagos sobre la biomasa es despreciable (Cajal y Maske, 2005; Jiménez-

Mercado et al., 2007). Los resultados de abundancia celular mostraron un

patrón en función de la tasa de dilución. Se apreció un aumento asintótico en la

abundancia en función a la tasa de dilución. Esto se explica por el hecho de

que a mayores tasas de dilución la limitación por el sustrato disminuye pero se

seleccionan las bacterias con los menores tiempos de duplicación. También se

debe considerar que aunque los inóculos fueron colectados en condiciones

muy similares (intermareal en la zona costera rocosa de la Facultad de

Ciencias Marinas) es posible que tengamos poblaciones distintas debido al

tiempo transcurrido (semanas a meses) entre las diferentes colectas de los

inóculos (Fuhrman y Hagström, 2008).

Tanto la producción de CO2 como la reducción de O2 aumentaron linealmente

en función de la tasa de dilución. Esto se debe a que a mayores tasas de

dilución las bacterias disponían de una mayor cantidad de substrato orgánico

para oxidar. Como el aceptor final de los electrones provenientes del sustrato

es el oxígeno los cultivos aumentaron su reducción. El aumento en la

producción de CO2 (definido por la eficiencia del crecimiento) se debe a que la

mayoría del carbono tomado por las bacterias es respirado en forma de CO2.

El CO2 respirado representa la mayor fracción del sustrato incorporado a la

célula para el mantenimiento celular y biosíntesis (Pirt 1975; Kirchman 2000).

56

Si consideramos que el substrato orgánico utilizado es glucosa y que para

oxidar un mol de glucosa son necesarias seis moles de oxigeno produciéndose

a su vez seis moles de bióxido de carbono, entonces la razón molar entre el

CO2 producido y el O2 reducido (RQ) esperada en nuestros experimentos debe

estar alrededor de 1 porque el substrato orgánico utilizado fue glucosa (del

Giorgio y Williams 2005). Sin embargo el cociente respiratorio varió de 1.15 a

2.89. Estos valores de RQ más altos que los esperados nos sugieren que las

bacterias pudieron haber utilizado una fracción de carbono orgánico disuelto

(DOC) presente en el medio que no fue eliminado durante el tratamiento con

ozono. Alternativamente puede resultar que la inexactitud en la determinación

de CO2 y O2 disuelto pudo alterar el RQ. Por otra parte se ha reportado una

alta difusión de oxígeno y CO2 a través de membranas de teflón (Pierce, 1959),

efecto que pudo haber ocurrido en nuestros experimentos debido a que fue el

material del cual estaban hechas las botellas de nuestros cultivos. De haber

ocurrido una difusión de gas a nuestros cultivos se explicarían los altos valores

del RQ obtenidos porque el efecto de la difusión del CO2 es relativamente

menor que el del oxígeno por su concentración más baja en el aire (0.03%).

Ahora bien, nuestro cálculo de la concentración de oxígeno se realizó con la

ecuación (DO = 0.00738 x CA- 0.562) obtenida en nuestro laboratorio con

nuestras condiciones experimentales (Jiménez-Mercado et al., 2007) y no con

la que obtuvieron Roland et al., (1999) (DO = 0.0081 x CA- 0.41). La diferencia

en las ecuaciones obtenidas es mínima pero en general se obtienen valores

mayores en la concentración de oxígeno (12.5 por ciento), sin embargo esta

corrección no explica por completo los altos valores obtenidos de RQ. La

diferencia principal entre la ecuación usada para el cálculo de la concentración

57

de oxígeno y la de Roland et al., (1999) se debe a que en la calibración de

nuestra técnica espectrofotométrica de oxígeno, usamos agua destilada en

lugar del agua de mar que usan Roland et al., (1999). Si consideramos un valor

de RQ igual a 1 como lo sugiere la estequiometria de oxidación de la glucosa,

podemos calcular de nuestros datos de oxígeno que la eficiencia del

crecimiento máxima aumentaría a 0.76 lo cual corresponde a datos generados

con 14C-glucosa (Maske, datos no publicados).

La biomasa estimada a partir de datos de POC y PON tuvo un incremento con

la tasa de dilución. Ambos, el contenido de carbono y el contenido de nitrógeno

por célula aumentaron en función de la tasa de dilución de 15.7 a 365 fg y de

2.59 a 80.1 fg. respectivamente, estas estimaciones se encuentran dentro de lo

reportado en la literatura (ver tabla comparativa 1 en el Anexo). La variación en

el contenido de carbono y el volumen celular (figuras 11a y 11b) en función de

la tasa de dilución refleja el grado de limitación de sustrato que había en

nuestros cultivos ya que se ha reportado que cuando hay limitación de

nutrientes orgánicos, se presentan células de menor volumen pero cuando no

hay limitación de nutrientes orgánicos el tamaño de las células aumenta

(Morita, 1993; Fukuda et al., 1998; Vrede et al., 2002). Este efecto se corroboró

al graficar el contenido de carbono por volumen celular (fg C µm-3) en función

de la tasa de dilución (gráfica 6 del anexo) en donde los valores más bajos se

observaron en condiciones de limitación de sustrato y los valores más altos se

observaron en condiciones sin limitación, cabe destacar que el rango de

valores encontrados de fg C µm-3 correspondieron con los reportados por

58

Vrede et al., en 2002 de acuerdo con las distintas condiciones de limitación de

sustrato.

En nuestros experimentos la eficiencia del crecimiento bacteriano (BGE) varió

de 0.14 a 0.59. Valores similares de BGE ya se han reportado (Apple et al.,

2006). En los océanos oligotróficos la BGE sugerida promedio es de 0.15

(Ducklow, 1999), valor que produce qué los modelos de flujo de carbono

muestren grandes zonas del océano como zonas de heterotrofía neta (Gocke

et al., 2002). Sin embargo el rango de valores en la literatura es amplio 0.03 a

0.85 (Cole y Pace 1995), y en general los valores más altos ocurren en

ambientes eutróficos. La discrepancia entre los distintos valores de eficiencia

del crecimiento reportadas se puede atribuir a que la BGE depende de

múltiples factores externos y fisiológicos, tales como el funciones de

mantenimiento celular, procesos regulatorios (Neijssel et al., 1996), la

composición taxonómica (del Giorgio y Cole 2000), la concentración y

composición del sustrato (Pomeroy y Wiebe, 2001), y por la temperatura

(Pomeroy y Wiebe, 2001; Rivkin y Legendre, 2001, Apple et al., 2006, Jiménez

Mercado et al., 2007) entre otros. La BGE se incrementó asintóticamente en

función de la tasa de crecimiento considerando todos los experimentos

realizados bajo condiciones de limitación (0.1 d-1 a 1.1 d-1) y sin limitación de

sustrato (3.39 d-1 y 7.5 d-1). Esta distribución general de los datos sugiere un

ajuste mejor de los datos al modelo cuando se consideran ambas condiciones

(limitación y sin limitación) en la concentración de recursos. Sin embargo,

cuando se consideran las tasas de crecimiento relevantes en el océano (<1 d-1)

observamos una mayor variabilidad y un cambio fuerte en la eficiencia del

crecimiento con el incremento en las tasas de crecimiento específico. Al

59

graficar el coeficiente de variación de la eficiencia del crecimiento calculado con

las 36 combinaciones posibles (ver gráfica 1 del anexo) de las tres réplicas de

POC y las de CO2 (de 2 a 3) contra la tasa de dilución se observa una

disminución lineal del coeficiente de variación del 64% al 3% (Figura 16).

Figura 16.- Coeficiente de variación vs tasa de dilución.

Esta disminución es más evidente cuando se consideran los datos sin

limitación de sustrato de nuestros cultivos (3.69 y 7.5 d-1) y concuerda con

experimentos similares de Jiménez-Mercado et al., (2007). Es probable que la

disminución de la variabilidad del coeficiente de variación con el incremento en

la tasa de crecimiento específico indique un efecto de selección taxonómica de

bacterias mejor adaptadas a las altas tasas de dilución y suministro de sustrato

sin limitación.

La magnitud de los valores de eficiencia del crecimiento de este trabajo se

encuentra dentro de lo reportado en la literatura (Apple et al., 2006; Grossart y

16

60

Ploug, 2000; del Giorgio y Cole, 1998; Roland y Cole, 1999) en donde también

se ha descrito el aumento de la BGE en función de la tasa de crecimiento

(Cajal y Maske, 1999; Cajal y Maske, 2005). (Ver figura 14). Al calcular los

valores de los parámetros para el modelo de Pirt, (Ɛ, eficiencia de conversión

de sustrato teórica máxima, y a, metabolismo de mantenimiento), incorporando

los datos de Cajal y Maske del 2005 y a los de Jiménez Mercado (no

publicados) a nuestros datos, observamos que los valores de Ɛ, y a son muy

similares a los reportados por Cajal y Maske en 1999 (a=0.58, Ɛ=0.51), sin

embargo cuando los parámetros son calculados solo para nuestros datos se

obtienen valores mayores (a=1.72, Ɛ=0.66) esto se pudo deber a que en

nuestros experimentos una menor respiración especifica permitió valores

mayores de eficiencia máxima teórica ya que hay una menor pérdida de

carbono en forma de CO2.

Por otro lado un aspecto importante a destacar de este trabajo es que el

consumo de carbono no rebasó el contenido de carbono per se de los medios

es decir que no excede la concentración de carbono agregado en forma de

glucosa (120 y 600 µM) (ver figura 9a), lo cual contrasta con experimentos

similares (Cajal y Maske, 2005; Jiménez Mercado et al., 2007) sugiriendo que

el tratamiento adoptado para eliminar el DOC natural presente en el medio de

cultivo resultó ser más efectivo. Al graficar la BGE en función del consumo de

carbono (ver gráfica 2 del anexo) en condiciones de limitación de sustrato se

observó una disminución de la eficiencia del crecimiento y un aumento en el

consumo de carbono. Sin embargo en condiciones sin limitación de sustrato

ocurrió lo contrario; es decir aumentó la eficiencia. Puede ser que cuando no

61

hay limitación de sustrato las bacterias terminan siendo más eficientes para

asimilar sustrato al tener un metabolismo más balanceado (Russell y Cook,

1995). Esta relación positiva de la eficiencia en condiciones sin limitación de

sustrato está de acuerdo a lo reportado por Jiménez-Mercado et al., (2007)

pero en general es opuesto a lo reportado por Apple y del Giorgio (2007) con

experimentos en el campo. Estos autores encuentran una relación negativa

entre la BGE y el consumo de carbono (BCC) y argumentan que el efecto de la

temperatura enmascara la relación positiva esperada por ellos. Sin embargo,

en nuestros experimentos la temperatura es constante y es posible que la

relación entre BGE y BCC negativa en condiciones de limitación sea

ocasionada por el decremento de la tasa de respiración específica con el

aumento en la tasa de dilución. Otro aspecto a considerar es el efecto de la

diversidad o selección taxonómica en la relación BGE y la BCC, ya que Eiler et

al., (2003) reportan que en condiciones de limitación de sustrato pueden

subsistir especies con eficiencias del crecimiento intrínsecamente bajas.

En este momento no tenemos información sobre la variación taxonómica en

nuestros experimentos que pueden ser inducidos por la variación en las tasas

de dilución impuestas, el sustrato seleccionado y la temperatura de cultivo. Sin

embargo nuestros datos preliminares obtenidos con la técnica de FISH

(Hibridación Fluorescente in situ), muestran que nuestros cultivos nunca fueron

cultivos monoespecíficos y que si ocurre selección, esta siempre es de distintos

consorcios bacterianos que se manifiestan desde el momento del inóculo del

medio hasta el final. Por ejemplo en nuestros cultivos en fase estacionaria se

encontraron representados algunos de los más importantes grupos de

bacterias marinas, tales como las α-proteobacterias, β- proteobacterias, γ-

62

proteobacterias y SAR11 (Rappé et al., 2002) y nunca fueron evacuadas del

sistema. No podemos evaluar cuantitativamente la presencia de estos grupos

de manera exacta por limitaciones técnicas de nuestra cámara y microscopio.

La diversidad taxonómica influye directamente en la mayoría de las variables

estudiadas en este trabajo. Es muy posible que parte de la variabilidad que

existe entre los resultados de la eficiencia del crecimiento de los diferentes

experimentos, a diferentes tasas de dilución, se deba en una buena medida a

la variabilidad de los taxones presentes en nuestros cultivos, ya que se ha

observado que el cambio en la estructura de la comunidad bacteriana se

encuentra linealmente correlacionado con la eficiencia del crecimiento (del

Giorgio y Cole, 2000; Eiler et al., 2003;). Otro aspecto importante es que la

diversidad taxonómica está íntimamente relacionada a la síntesis de vitamina

B12 ya que según datos genómicos y en cultivo indican que muchos procariotas

(fotótrofos y heterótrofos) pueden ser organismos productores importantes de

B12 en los océanos (Palenik et al., 2003; Rocap et al., 2003; Bonnet et al.,

2010).

La adición de la vitamina B12 a los cultivos no mostró ejercer algún efecto en

ninguna de las variables cuantificadas. Cabe recalcar que los medios de

cultivos no contenían vitamina B12 por que la hubiese tenido degradada

durante el envejecimiento, ozonificación y esterilización a la cual fué expuesta

el agua del medio de cultivo. El hecho que la adición de vitamina B12 no

mostrara ningún efecto se puede explicar con dos argumentos alternativos. El

primero es que la vitamina B12 pudo no haber sido requerida, sin embargo este

argumento se encuentra poco factible debido a la importancia de este cofactor

63

en múltiples reacciones del metabolismo (Raux et al., 2000; Martens et al.,

2002). La otra explicación posible es que la vitamina B12 pudo haber sido

producida en nuestros cultivos. Ya se ha reportado que la producción de

vitamina B12 por parte de las bacterias heterotróficas se encuentra entre 0.1 y

1.7 x 10-22 picomoles de B12 por célula (Azam et al., 1983; Croft et al., 2005).

64

7. Conclusiones

Los datos experimentales de este trabajo muestran que se produjeron dos

distintas condiciones fisiológicas, una de limitación y otra sin limitación de

sustrato. Bajo estas condiciones, la mayoría de las variables determinadas

(respiración, biomasa, eficiencia del crecimiento, etc.) se encontraron dentro

del intervalo de valores reportados en la literatura sugiriendo que en el océano

incluso en condiciones sin limitación de sustrato la eficiencia del crecimiento

máxima es alrededor de (< 57 %).

Debido al comportamiento de las distintas variables cuantificadas tenemos

elementos para pensar que nuestros cultivos mantuvieron cierta diversidad

taxonómica, la cual pareció disminuir al incrementarse la velocidad de

crecimiento (tasa de dilución).

En ninguno de los experimentos encontramos algún patrón debido a la

presencia de vitamina B12 en nuestros cultivos de bacterioplancton. No se

encontró ninguna relación fisiológica (respiración, eficiencia del crecimiento,

etc.) asociada a la adición de vitamina B12 a los medios de cultivo o

directamente a los cultivos en fase estacionaria. Sugerimos una posible

producción de la vitamina B12 por parte de la comunidad bacteriana presente.

Sin embargo son necesarios análisis futuros en donde se cuantifique la

concentración de vitamina B12, así como también son necesarios análisis

genéticos que nos permitan asociar la presencia de la vitamina B12 con grupos

taxonómicos específicos.

65

8. Literatura

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Wood H, Ragsdale S, Pezacka E (1986) The acetyl-CoA pathway of autotrophic

growth. FEMS Microbiol Rev 39:345-362

Woodson JD, Escalante-Semerena JC (2004) CbiZ, an amidohydrolase

enzyme required for salvaging the coenzyme B12 precursor cobinamide

in archaea. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America 101:3591-3596

76

9. Anexo

9.1 BGEs a partir de combinaciones de datos de POC y CO2

Gráfica 1.- Eficiencias del crecimiento obtenidas a partir de las combinaciones de datos de CO2

y POC contra la tasa de dilución. Los puntos negros representan la media de las 36 de eficiencias calculadas a partir de todas las combinaciones posibles del total de datos de POC y

CO2 para cada tasa de dilución. La línea sólida representa la estimación del modelo de Pirt para las 36 eficiencias del crecimiento.

1

77

9.2 BGE contra el consumo de carbono

Gráfica 2.- Eficiencia del crecimiento vs consumo de carbono. Los círculos amarillos representan los cultivos a los cuales se les agregó vitamina B12. Los círculos vacíos representan

a los cultivos sin vitamina. (n=3, desviaciones estándar multiplicadas por un factor de corrección).

2

78

Contenido de Carbono Condiciones Fuente

fg C por célula

0.8 a 1967 In situ Barragán et al. (2009)

5.28 a 1046 cultivos continuos 10 a 26 °C Jiménez-Mercado etal.(2007)

1.4 a 240 In situ La Ferla et al (2004)

149 a 8 Batch Vrede et al. (2002)

39 a 3 Batch Vrede et al. (2002)

6.3 a 12.4 In situ aguas oceánicas Fakuda (1998)

12.3 a 30.2 In situ aguas costeras Fakuda (1998)

26.24 Batch Dupuy et. Al. (1997)

15 a 42 In situ Tuomi et al. (1995)

200 a 260 In situ Kroer,N (1994)

20 Batch Lee & Fuhrman (1987)

26 a 84 Batch Bjornsen (1986)

106 a 214 Batch Bratbak (1985)

15 a 365 cultivos continuos 18 °C Este trabajo

9.3 Carbono por célula reportado en la literatura

Tabla 1.- Comparación de datos de literatura de valores de contenido de carbono celular bacteriano

79

Razón C:N Condiciones Fuente

6.46 a 10.57 cultivos continuos 15 a 28 °C Simonds et al. (2010)

2.59 a 24.45 cultivos continuos 10 a 26 °C Jiménez-Mercado et al.(2007)

3.6 a 12 Batch Vrede et al. (2002)

3.2 a 11.2 Batch agua dulce Nagata & T. Watanabe (1990)

3.6 a 7.5 Batch Goldman et al. (1987)

3.3 a 4.9 Batch Bratbak (1985)

5.2 a 8.3 In situ oceáno Billen (1984)

6.8 a 5.9 In situ costa Billen (1984)

2.88 a 4.92 cultivos continuos 18 °C Este trabajo

9.4 Razón Carbono: Nitrógeno reportadas en la literatura

Tabla 2.- Comparación de datos de reportados en la literatura de la razón carbono: nitrógeno celular bacteriano

80

9.5 Nitrógeno por célula contra tasa de dilución

Gráfica 3.- Contenido de nitrógeno vs bajas tasas de dilución. Los círculos amarillos representan los cultivos a los cuales se les agregó vitamina B12. Los

círculos vacíos representan a los cultivos sin vitamina. (n=3, desviaciones estándar multiplicadas por un factor de corrección de 1.125).

3

81

Gráfica 4.- Contenido de nitrógeno vs bajas tasas de dilución. Los círculos amarillos representan los cultivos a los cuales se les agregó vitamina B12. Los

círculos vacíos representan a los cultivos sin vitamina. (n=3, desviaciones estándar multiplicadas por un factor de corrección de 1.125).

4

82

9.6 Volumen celular vs fg de carbono por célula

Gráfica 5.- Volumen celular vs fg de carbono por célula. Los círculos amarillos representan los cultivos a los cuales se les agregó vitamina B12. Los círculos

vacíos representan a los cultivos sin vitamina. (n=3, desviaciones estándar multiplicadas por un factor de corrección de 1.125).

5

83

9.7 fg de carbono por µm3 vs tasa de dilución

Gráfica 6.- fg de carbono por µm-3 vs tasa de dilución. Los círculos amarillos representan los cultivos a los cuales se les agregó vitamina B12. Los círculos

vacíos representan a los cultivos sin vitamina. (n=3, desviaciones estándar multiplicadas por un factor de corrección de 1.125).

6

84

Abundancia Tasa Producción Consumo Cociente Abundancia Error G

Experimento celular crecimiento CO2 Total O2 Respiratorio celular Abundancia celular

cel ml-1 día-1 µM µM por experimento por experimento por día

CA1Q2 4.1E+06 0.20 107.7 3.5

CA2Q2

CA3Q2

CA1Q3 4.1E+06 1.10 80.4 40.1 2.0 0.6

CA2Q3

CB1Q3 4.1E+06 1.00 53.6 46.7 1.1 0.7

CB2Q3

CA1Q5 7.5E+06 0.62 77.5 6.3E+06 2.1E+06 1.1

CA2Q5

CA3Q5

CB1Q5 5.1E+06 0.70 18.7 1.0

CB2Q5

CB3Q5

CA1Q6 6.8E+06 0.37 77.5 26.8 2.9 6.3E+06 8.6E+05 1.9

CA2Q6

CA3Q6

CB1Q6 5.8E+06 0.41 33.0 20.1 1.6 1.7

CB2Q6

CB3Q6

CB1Q7 4.5E+06 1.22 57.4 27.4 2.1 0.6

CB2Q7

CB3Q7

CA1Q8 1.4E+07 0.80 80.4 29.0 2.8 1.2E+07 3.4E+06 0.9

CA2Q8

CA3Q8

CB1Q8 1.0E+07 0.93 57.4 47.0 1.2 0.7

CB2Q8

CB3Q8

CA1T1 1.4E+07 3.69 275.0 129.2 2.1 1.4E+07 9.6E+04 0.2

CA2T1

CA3T1

CB1T1 1.4E+07 3.69 270.4 119.8 2.3 0.2

CB2T1

CB3T1

CA1T2 1.1E+07 7.50 260.6 137.1 1.9 1.0E+07 6.6E+05 0.1

CA2T2

CA3T2

CB1T2 9.8E+06 7.50 241.5 125.2 1.9 0.1

CB2T2

CB3T2

9.8 Compendio de resultados de abundancia celular y RQ

85

Abundancia Tasa Producción Producción Error Tasa Producción Tasa Producción Error Producción Producción Producción Error

Experimento celular crecimiento CO2 Total CO2 Total prom. Producción CO2 total CO2 total prom. Tasa Producción CO2 total de CO2 por cél de CO2 por cél Producción

cel ml-1 día-1 µM µM CO2 Total µM d-1 µM d-1 CO2 total µM ml-1 µM CO2 cel-1 promedio de CO2 por cél

CA1Q2 4.07E+06 0.2 129.2 107.7 38.1 25.8 21.5 7.6 0.13 3.2E-08 2.65E-08 9.36E-09

CA2Q2 4.07E+06 0.2 86.1 17.2 0.09 2.1E-08

CA1Q3 4.14E+06 1.1 85.3 80.4 8.6 93.8 88.4 9.5 0.09 2.1E-08 1.94E-08 2.09E-09

CA2Q3 4.14E+06 1.1 75.5 83.1 0.08 1.8E-08

CB1Q3 4.05E+06 1 47.4 53.6 10.9 47.4 53.6 10.9 0.05 1.2E-08 1.32E-08 2.69E-09

CB2Q3 4.05E+06 1 59.7 59.7 0.06 1.5E-08

CA1Q5 7.51E+06 0.62 20.1 77.5 101.5 12.5 48.1 62.9 0.02 2.7E-09 1.03E-08 1.35E-08

CA2Q5 7.51E+06 0.62 135.0 83.7 0.13 1.8E-08

CB1Q5 5.11E+06 0.7 14.4 18.7 7.6 10.1 13.1 5.3 0.01 2.8E-09 3.66E-09 1.49E-09

CB2Q5 5.11E+06 0.7 23.0 16.1 0.02 4.5E-09

CA1Q6 6.75E+06 0.37 34.5 77.5 76.1 12.8 28.7 28.2 0.03 5.1E-09 1.15E-08 1.13E-08

CA2Q6 6.75E+06 0.37 120.6 44.6 0.12 1.8E-08

CB1Q6 5.78E+06 0.41 34.5 33.0 2.5 14.1 13.5 1.0 0.03 6.0E-09 5.71E-09 4.40E-10

CB2Q6 5.78E+06 0.41 31.6 12.9 0.03 5.5E-09

CB1Q7 4.45E+06 1.22 48.8 57.4 15.2 59.6 70.1 18.6 0.05 1.1E-08 1.29E-08 3.42E-09

CB2Q7 4.45E+06 1.22 66.0 80.6 0.07 1.5E-08

CA1Q8 1.40E+07 0.8 51.7 80.4 50.8 41.3 64.3 40.6 0.05 3.7E-09 5.73E-09 3.62E-09

CA2Q8 1.40E+07 0.8 109.1 87.3 0.11 7.8E-09

CB1Q8 1.02E+07 0.93 40.2 57.4 30.5 37.4 53.4 28.3 0.04 3.9E-09 5.63E-09 2.99E-09

CB2Q8 1.02E+07 0.93 74.7 69.4 0.07 7.3E-09

CA2T1 1.40E+07 3.69 267.9 275.0 12.6 988.6 1014.8 46.3 0.27 1.9E-08 1.96E-08 8.94E-10

CA3T1 1.40E+07 3.69 282.1 1040.9 0.28 2.0E-08

CB1T1 1.41E+07 3.69 280.1 270.4 6.0 1033.6 997.6 22.2 0.28 2.0E-08 1.91E-08 4.25E-10

CB2T1 1.41E+07 3.69 272.1 1004.0 0.27 1.9E-08

CB3T1 1.41E+07 3.69 267.7 987.8 0.27 1.9E-08

CB4T1 1.41E+07 3.69 266.5 983.4 0.27 1.9E-08

CB5T1 1.41E+07 3.69 265.4 979.3 0.27 1.9E-08

CA1T2 1.06E+07 7.5 257.3 260.6 6.1 1929.8 1954.3 45.6 0.26 2.4E-08 2.46E-08 5.75E-10

CA2T2 1.06E+07 7.5 266.8 2001.0 0.27 2.5E-08

CA3T2 1.06E+07 7.5 257.6 1932.0 0.26 2.4E-08

CB1T2 9.82E+06 7.5 243.4 241.5 11.9 1825.5 1811.4 88.9 0.24 2.5E-08 2.46E-08 1.21E-09

CB2T2 9.82E+06 7.5 224.3 1682.3 0.22 2.3E-08

CB3T2 9.82E+06 7.5 237.8 1783.5 0.24 2.4E-08

CB4T2 9.82E+06 7.5 250.0 1875.0 0.25 2.5E-08

CB5T2 9.82E+06 7.5 252.1 1890.8 0.25 2.6E-08

9.9 Compendio de resultados de respiración (CO2)

86

Abundancia Tasa Consumo Consumo Error Tasa consumo Tasa consumo Error Consumo Consumo Consumo Error

Experimento celular crecimiento O2 Total O2 Total prom. consumo O2 total O2 total prom. Tasa consumo O2 total de O2 por cél de O2 por cél consumo

cel ml-1 día-1 µM µM O2 Total µM d-1 µM d-1 O2 total µM ml-1 µM CO2 cel-1 promedio de O2 por cél

CA1Q3 4.14E+06 1.1 40.0 40.1 0.8 44.0 44.1 0.8 0.04 9.7E-09 9.7E-09 1.8E-10

CA2Q3 4.14E+06 1.1 40.8 44.8 0.04 9.9E-09

CA3Q3 4.14E+06 1.1 39.4 43.4 0.04 9.5E-09

CB1Q3 4.05E+06 1.0 48.3 46.7 1.7 48.3 46.7 1.7 0.05 1.2E-08 1.2E-08 4.2E-10

CB2Q3 4.05E+06 1.0 45.2 45.2 0.05 1.1E-08

CB3Q3 4.05E+06 1.0 46.7 46.7 0.05 1.2E-08

CA1Q6 6.75E+06 0.4 31.1 26.8 7.6 11.5 9.9 2.8 0.03 4.6E-09 4.0E-09 1.1E-09

CA2Q6 6.75E+06 0.4 30.3 11.2 0.03 4.5E-09

CA3Q6 6.75E+06 0.4 19.0 7.0 0.02 2.8E-09

CB1Q6 5.78E+06 0.4 22.4 20.1 2.6 9.2 8.2 1.1 0.02 3.9E-09 3.5E-09 4.5E-10

CB2Q6 5.78E+06 0.4 20.2 8.3 0.02 3.5E-09

CB3Q6 5.78E+06 0.4 17.7 7.3 0.02 3.1E-09

CB1Q7 4.45E+06 1.2 33.4 27.4 5.9 40.8 33.4 7.2 0.03 7.5E-09 6.1E-09 1.3E-09

CB2Q7 4.45E+06 1.2 24.0 29.3 0.02 5.4E-09

CB3Q7 4.45E+06 1.2 24.6 30.0 0.02 5.5E-09

CA1Q8 1.40E+07 0.8 28.2 29.0 0.9 22.5 23.2 0.7 0.03 2.0E-09 2.1E-09 6.4E-11

CA2Q8 1.40E+07 0.8 29.3 23.4 0.03 2.1E-09

CA3Q8 1.40E+07 0.8 29.7 23.8 0.03 2.1E-09

CB1Q8 1.02E+07 0.9 44.7 47.0 3.5 41.6 43.7 3.2 0.04 4.4E-09 4.6E-09 3.4E-10

CB2Q8 1.02E+07 0.9 45.8 42.6 0.05 4.5E-09

CB3Q8 1.02E+07 0.9 50.5 47.0 0.05 5.0E-09

T5AT1 1.40E+07 3.7 144.2 129.2 11.4 532.0 476.6 41.9 0.14 1.0E-08 9.2E-09 8.1E-10

T6AT1 1.40E+07 3.7 126.1 465.3 0.13 9.0E-09

T7AT1 1.40E+07 3.7 119.8 441.9 0.12 8.5E-09

TFAT1 1.40E+07 3.7 126.6 467.2 0.13 9.0E-09

T5BT1 1.41E+07 3.7 132.7 119.8 10.2 489.7 441.9 37.8 0.13 9.4E-09 8.5E-09 7.2E-10

T6BT1 1.41E+07 3.7 118.7 438.2 0.12 8.4E-09

T7BT1 1.41E+07 3.7 117.6 433.9 0.12 8.3E-09

TFBT1 1.41E+07 3.7 110.0 406.0 0.11 7.8E-09

T3AT2 1.06E+07 7.5 136.3 137.1 4.4 1022.0 1028.6 33.2 0.14 1.3E-08 1.3E-08 4.2E-10

T4AT2 1.06E+07 7.5 139.7 1047.6 0.14 1.3E-08

T5AT2 1.06E+07 7.5 140.9 1056.7 0.14 1.3E-08

TFAT2 1.06E+07 7.5 131.8 988.2 0.13 1.2E-08

T3BT2 9.82E+06 7.5 115.9 125.2 14.2 869.1 938.7 106.9 0.12 1.2E-08 1.3E-08 1.5E-09

T4BT2 9.82E+06 7.5 115.8 868.2 0.12 1.2E-08

T5BT2 9.82E+06 7.5 125.3 939.6 0.13 1.3E-08

TFBT2 9.82E+06 7.5 143.7 1077.9 0.14 1.5E-08

9.10 Compendio de reducción de O2

87

Tasa de Biomasa Biomasa Error Tasa Tasa prom. Error Biomasa Biomasa Error Tasa Tasa prom. Error Producción Demanda Tasa de Demanda sustrato Vitamina

Experimento crecimiento POC prom. POC Biomasa prom. POC POC Tasa prom. PON prom. PON prom. PON PON Tasa prom. CO2 Total prom. total carbono de carbono B12

día-1 µM µM Delta POC µM d-1 µM/L d-1 POC µM µM PON µM d-1 µM/L d-1 PON µM µM µM día-1 µM agregada

CA1Q2 0.2 15.1 22.3 15.1 3.0 4.5 3.0 3.6 5.8 4.1 0.7 1.2 0.8 107.7 130.0 26.0 120.0

CA2Q2 0.2 14.0 2.8 3.8 0.8

CA3Q2 0.2 37.8 7.6 9.9 2.0

CA1Q3 1.1 16.5 13.3 5.7 18.1 14.6 6.2 3.1 2.7 0.7 3.4 2.9 0.8 80.4 93.7 103.1 120.0

CA2Q3 1.1 10.1 11.1 2.3 2.5

CB1Q3 1.0 23.4 17.4 10.6 23.4 17.4 10.6 5.8 4.4 2.5 5.8 4.4 2.5 53.6 70.9 70.9 120.0

CB2Q3 1.0 11.3 11.3 3.0 3.0

CA1Q5 0.6 20.7 18.1 8.7 12.8 11.3 5.4 6.8 4.9 1.9 4.2 3.0 1.2 77.5 95.7 59.3 120.0 18pM

CA2Q5 0.6 9.4 5.8 3.9 2.4 18pM

CA3Q5 0.6 24.3 15.1 3.9 2.4 18pM

CB1Q5 0.7 14.2 15.7 2.1 9.9 11.0 1.4 5.1 5.4 0.4 3.6 3.8 0.2 18.7 34.4 24.1 120.0

CB2Q5 0.7 15.3 10.7 5.4 3.8

CB3Q5 0.7 17.7 12.4 5.8 4.0

CA1Q6 0.4 27.0 29.6 2.9 10.0 11.0 1.1 7.6 7.2 0.7 2.8 2.7 0.3 77.5 107.1 39.6 120.0 20pM

CA2Q6 0.4 32.2 11.9 7.6 2.8 20pM

CA3Q6 0.4 29.6 10.9 6.4 2.4 20pM

CB1Q6 0.4 24.6 26.5 3.5 10.1 10.8 1.4 7.0 7.1 1.0 2.9 2.9 0.4 33.0 59.5 24.4 120.0

CB2Q6 0.4 24.7 10.1 6.3 2.6

CB3Q6 0.4 30.0 12.3 8.1 3.3

CB1Q7 1.2 16.0 17.9 1.8 19.6 21.9 2.2 4.3 4.8 0.8 5.3 5.8 1.0 57.4 75.4 91.9 120.0

CB2Q7 1.2 18.8 23.0 5.6 6.8

CB3Q7 1.2 18.9 23.0 4.4 5.3

CA1Q8 0.8 19.9 21.4 2.9 15.9 17.1 2.3 5.5 5.7 0.3 4.4 4.6 0.3 80.4 101.8 81.5 120.0 50pM

CA2Q8 0.8 20.0 16.0 5.6 4.5 50pM

CA3Q8 0.8 24.4 19.5 6.1 4.8 50pM

CB1Q8 0.9 16.7 18.0 3.2 15.6 16.7 3.0 3.5 3.9 0.6 3.2 3.6 0.5 57.4 75.4 70.1 120.0

CB2Q8 0.9 21.3 19.8 4.2 3.9

CB3Q8 0.9 15.9 14.8

CA1T1 3.7 203.6 218.2 14.2 751.5 805.1 52.4 45.5 48.9 3.5 167.9 180.5 12.9 275.0 493.2 1819.9 600.0 4

CA2T1 3.7 224.8 829.3 49.7 183.3 pulsos

CA3T1 3.7 226.2 834.6 51.6 190.5 100 pM

CB1T1 3.7 184.4 181.7 10.2 680.5 670.5 37.6 41.9 41.9 2.7 154.5 154.7 10.0 270.4 452.1 1668.2 600.0

CB2T1 3.7 171.6 633.3 39.6 145.9

CB3T1 3.7 189.1 697.8 44.4 163.8

CA1T2 7.5 223.3 367.0 148.7 1675.0 2752.5 1114.9 46.7 81.9 38.5 350.5 613.9 288.6 260.6 627.6 4706.7 600.0 3

CA2T2 7.5 394.3 2957.6 83.8 628.3 pulsos

CA3T2 7.5 483.3 3625.0 115.1 863.0 100pM

CB1T2 7.5 182.2 348.7 186.2 1366.9 2615.3 1396.7 40.8 76.6 39.3 306.1 574.2 295.0 241.5 590.2 4426.7 600.0

CB2T2 7.5 513.3 2629.3 110.7 830.2

CB3T2 7.5 350.6 3849.7 78.2 586.3

9.11 Compendio de resultados de Carbono/Nitrógeno

88

Tasa Producción Producción Error Consumo Biomasa Biomasa Error Biomasa Razón Razón Error Eficiencia Error C/N C/N promedio C/N Demanda

Experimento crecimiento CO2 Total CO2 prom. Producción O2 POC prom. POC Biomasa PON C/N C/N C/N Crecimiento Y por por célula de carbono

día-1 µM µM CO2 Total µM µM µM prom. POC µM prom. prom Y célula célula desestandar µM

CA1Q2 0.2 129.2 107.7 38.1 15.1 22.3 15.1 3.6 4.2 3.9 0.3 0.2 0.05 1.0E-06 9.6E-07 6.3E-08 129.99

CA2Q2 0.2 86.1 14.0 3.8 3.7 9.2E-07

CA3Q2 0.2 37.8 9.9 3.8 9.4E-07

CA1Q3 1.1 85.3 80.4 8.6 40.1 16.5 13.3 5.7 3.1 5.4 4.9 0.8 0.1 0.06 1.3E-06 1.2E-06 1.9E-07 93.69

CA2Q3 1.1 75.5 10.1 2.3 4.5 1.1E-06

CB1Q3 1 47.4 53.6 10.9 46.7 23.4 17.4 10.6 5.8 4.0 3.9 0.2 0.2 0.12 1.0E-06 9.7E-07 4.1E-07 70.91

CB2Q3 1 59.7 11.3 3.0 3.8 9.4E-07

CA1Q5 0.62 20.1 77.5 101.5 20.7 18.1 8.7 6.8 3.0 3.9 2.3 0.2 0.02 4.1E-07 5.2E-07 3.1E-07 95.67

CA2Q5 0.62 135.0 9.4 3.9 2.4 3.2E-07

CA3Q5 0.62 24.3 3.9 6.3 8.4E-07

CB1Q5 0.7 14.4 18.7 7.6 14.2 15.7 2.1 5.1 2.7 2.9 0.2 0.5 0.10 5.4E-07 5.6E-07 3.7E-08 34.38

CB2Q5 0.7 23.0 15.3 5.4 2.8 5.5E-07

CB3Q5 0.7 17.7 5.8 3.1 6.0E-07

CA1Q6 0.37 34.5 77.5 76.1 26.8 27.0 29.6 2.9 7.6 3.6 4.1 0.6 0.3 0.01 5.3E-07 6.1E-07 8.6E-08 107.15

CA2Q6 0.37 120.6 32.2 7.6 4.3 6.3E-07

CA3Q6 0.37 29.6 6.4 4.6 6.8E-07

CB1Q6 0.41 34.5 33.0 2.5 20.1 24.6 26.5 3.5 7.0 3.5 3.7 0.2 0.4 0.26 6.1E-07 6.4E-07 3.8E-08 59.47

CB2Q6 0.41 31.6 24.7 6.3 3.9 6.7E-07

CB3Q6 0.41 30.0 8.1 3.7 6.5E-07

CB1Q7 1.22 48.8 57.4 15.2 27.4 16.0 17.9 1.8 4.3 3.7 3.8 0.5 0.2 0.03 8.3E-07 8.6E-07 1.2E-07 75.35

CB2Q7 1.22 66.0 18.8 5.6 3.4 7.6E-07

CB3Q7 1.22 18.9 4.4 4.3 9.7E-07

CA1Q8 0.8 51.7 80.4 50.8 96.4 19.9 21.4 2.9 5.5 3.6 3.7 0.3 0.2 0.01 2.6E-07 2.7E-07 2.1E-08 101.82

CA2Q8 0.8 109.1 20.0 5.6 3.5 2.5E-07

CA3Q8 0.8 24.4 6.1 4.0 2.9E-07

CB1Q8 0.93 40.2 57.4 30.5 30.7 16.7 18.0 3.2 3.5 4.8 4.9 0.2 0.2 0.02 4.7E-07 4.8E-07 2.0E-08 75.40

CB2Q8 0.93 74.7 21.3 4.2 5.0 5.0E-07

CB3Q8 0.93 15.9

CA1T1 3.69 267.9 275.0 12.6 129.2 203.6 218.2 14.2 45.5 4.5 4.5 0.1 0.4 0.23 3.2E-07 3.2E-07 5.8E-09 493.19

CA2T1 3.69 282.1 224.8 49.7 4.5 3.2E-07

CA3T1 3.69 226.2 51.6 4.4 3.1E-07

CB1T1 3.69 280.1 276.1 6.0 119.8 184.4 181.7 10.2 41.9 4.4 4.3 0.1 0.4 0.25 3.1E-07 3.1E-07 5.7E-09 452.08

CB2T1 3.69 272.1 171.6 39.6 4.3 3.1E-07

CB3T1 3.69 267.7 189.1 44.4 4.3 3.0E-07

CA1T2 7.5 265.4 261.4 6.1 135.4 223.3 438.8 148.7 46.7 4.8 4.6 0.4 0.6 0.60 4.5E-07 4.3E-07 3.4E-08 627.57

CA2T2 7.5 257.3 394.3 83.8 4.7 4.5E-07

CA3T2 7.5 266.8 483.3 115.1 4.2 4.0E-07

CB1T2 7.5 257.6 250.5 11.9 131.3 182.2 266.4 186.2 40.8 4.5 4.5 0.1 0.5 0.48 4.5E-07 4.6E-07 1.1E-08 590.22

CB2T2 7.5 243.4 350.6 110.7 4.6 4.7E-07

CB3T2 7.5 224.3 513.3 78.2 4.5 4.6E-07

9.12 Compendio de Resultados de Eficiencia del crecimiento