UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO MAESTRÍA...
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO
MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS
AGROPECUARIAS Y RECURSOS NATURALES
AISLAMIENTO DE CEPAS Y OBTENCIÓN DE
METABOLITOS SECUNDARIOS DEL GÉNERO
ENTOMOPATÓGENO Cordyceps sensu lato DEL ESTADO
DE MÉXICO
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRA EN CIENCIAS
AGROPECUARIAS Y RECURSOS NATURALES
PRESENTA:
BIÓL. LORENA LÓPEZ RODRÍGUEZ
COMITÉ DE TUTORES:
Dra. Cristina Burrola Aguilar. Tutor académico
Dra. Tatiana Ibeth Sanjuan Giraldo. Tutor adjunto
Dr. Moisés Tejocote Pérez. Tutor adjunto
El Cerrillo Piedras Blancas, Estado de México. Diciembre 2017
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
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Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
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Dedicatoria
Este camino no ha sido fácil por razones personales, académicas y espirituales, pero hoy después de la partida de mi padre y de tantos problemas puedo decir
he culminado este ciclo.
A ti mi Dios, que aunque nunca había creído completamente en ti, te conocí y te agradezco el permitirme seguir viva.
Con todo mi amor, dedico este trabajo a mi ángel, a mi gran motor, mi pequeño Ian.
A mi esposo quien ha estado apoyándome todo este camino, a mi mamá que siempre me ha dado lo mejor de ella.
Y obviamente a ti mi gran padre, a ti mi maestro, que aunque ya no estás en cuerpo, en mi corazón siempre vivirá tu amor y tus enseñanzas.
A mis hermanos que siempre han creído en mí, y aunque les encanta molestarme se que me aman y mucho de lo aprendido es gracias ha ellos.
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RESUMEN
Cordyceps sensu lato (s.l.) es un grupo de hongos ascomicetos parásitos de
artrópodos, hongos y gramíneas. La importancia de este grupo es ecológica,
agrícola, comestible, medicinal y por lo tanto económica. En México el estudio de
Cordyceps s.l. es incipiente, y nunca se había tenido la iniciativa de investigar los
metabolitos secundarios que presentan teleomorfos silvestres de este grupo en
México, ni tampoco la optimización de su cultivo in vitro. Para realizar esta
investigación, el primer objetivo fue revisar exhaustivamente literatura para conocer
el estado del conocimiento actual de Cordyceps s.l. en México y a partir de este
direccionar la investigación, el segundo objetivo fue determinar las condiciones
óptimas nutricionales del cultivo in vitro superficial y sumergido de dos cepas, en
condiciones de ausencia y presencia parcial de luz, y cuantificar un metabolito
llamado cordicepina con propiedades anticancerígenas, antibióticas y antivirales.
Para responder la siguiente pregunta ¿Producirán cordicepina cepas silvestres del
Estado de México?, y si esta fuera afirmativa ¿Qué efecto tendrían las fuentes de
nitrógeno y las diferentes condiciones de luz en la producción de biomasa, en la
morfología de las cepas y la velocidad de crecimiento en el cultivo superficial? y
¿Qué efecto tendrían las fuentes de nitrógeno y las diferentes condiciones de luz en
la producción de biomasa, en la morfología macroscópica y microscópica de los
pellets y la producción de cordicepina en cultivo sumergido?. Para resolver estas
preguntas se realizó un experimento multifactorial, donde las variables
dependientes fueron biomasa, velocidad de crecimiento, morfología macro y
microscópica de cepas y pellets, y producción de cordicepina. Las variales
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independientes fueron medios de cultivo y ausencia y presencia de luz. Los análisis
estadísticos fuerón un MANOVA, prueba de Tuckey con un nivel de confianza del
95%. Como resultados del primer objetivo, se registraron 25 especies de Cordyceps
sensu lato para México, distribuidas heterogéneamente en las tres familias que
conforman al grupo, de las cuales solo Tolypocladium capitatum y T.
ophioglossoides tienen un uso comestible tradicional, y Metharhizium anisopliae y
Beauveria bassiana son utilizadas como agentes de control biológico, sin embargo
hay una ausencia de conocimiento con respecto al potencial medicinal,
farmacológico y alimenticio de las especies registradas. De acuerdo al segundo
objetivo, se obtuvierón dos cepas con afinidad molecular con los marcadores
moleculares ITS y LSU a Cordyceps submilitaris. Las cepas mostrarón diferencias
en coloración de acuerdo a las condiciones lumínicas, siendo blanquecinas en
oscuridad y amarillentas en condiciones luminosas, la biomasa y velocidad de
crecimiento fue mayor en medios ricos en nutrientes y la producción de cordicepina
estuvo diectamente relacionada con la fuente de nitrógeno orgánico, por lo tanto las
cepas analizadas presentan potencial medicinal y farmacéutico.
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ABSTRACT
Cordyceps sensu lato (s.l.) is a group of fungi ascomicetes parasitic of arthropods,
fungi and grasses. The importance of this group is ecological, agricultural, edible,
medicinal and therefore economical. In Mexico, the study of Cordyceps s.l. is
incipient, and had never had the initiative to investigate the secondary metabolites
that have wild teleomorphs of this group in Mexico, nor the optimization of their
culture in vitro, so the first objetive of this research was to review literatura to know
current state of knowledge of Cordyceps s.l. in Mexico and from this research
direction. The second objetive was to determine the optimal nutritional conditions of
the in vitro culture of two strains, under conditions of partial presence and presence
of light, and to quantify a metabolite called cordycepin with anticancer, antibiotics
and antivirals properties. To answer the following question, will cordycepin produce
wild strains from the State the Mexico?, and if this were affirmative, what effect would
nitrogen sources and different light conditions have on biomass production, on the
morphology of the strains and the speed of growth in Surface cultivation?, and, What
effect would nitrogen sources and different light conditions have on biomass
production, macroscopic and microscopic morphology of pellets, and production of
cordycepin in submerged culture?. To answer these cuestions a multifactorial
experiment was carried out, where the dependent variables were biomass, speed of
growth, macro and microscopic morphology of strains and pellets, and production of
cordycepin. The independent variials were culture media and absence and presence
of light. Statistical analyzes were a MANOVA, tuckey test with a confidence level of
95%. As results of the first objetive, 25 species of Corduyceps sensu lato were
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recorded for Mexico, distributed in the three families that make up the group, of which
only Tolypocladium capitatum and T. ophioglossoides have a traditional edible use,
and Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana are used as biological control
agents, however there is an absence of knowledge regarding the medicinal,
pharmacological and nutrimental potential of the registered species. According to
the second objetive, two straisn were obtained, with molecular affinity of 95% with
molecular markets ITS and LSU to Cordyceps submilitaris. The strains showed color
differences according to light conditions, being whitish in darkness and yellow in
luminous conditions, the biomass and growth rate was higher in nutrient-rich media
and the production of cordycepin was directly related to nitrogen source, therefore
the analyzed strains present medicinal and pharmaceutical potential.
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AGRADECIMIENTOS
Agradezco el apoyo de cada persona que me compartió sus conocimientos y me
enseñó a ser y hacer mejor esta investigación.
En primera instancia agradezco a usted Dra. Cris, yo la quiero, respeto, admiro y le
agradezco todo su apoyo, porque si usted no hubiera aparecido en mi camino yo no
estaría aquí con estos resultados y de pie.
A usted Dra. Tatiana que me ha enseñado tanto de este grupo tan complejo he
interesante.
A ti Gris, porque desinteresadamente y de la manera más humilde me enseñaste a
mejorar mi redacción.
Al Dr. Roberto Garibay Orijel que me abrió las puertas de su laboratorio y me invito
a asistir al curso de Biología Molecular de Hongos.
A la Química Maria Magdalena Garcia Fabila que me permitió humildemente
trabajar en su laboratorio y cuantificar la tan codiciada cordicepina.
A la M. en C. Celia Elvira Aguirre Acosta del Instituto de Biología de la UNAM, que
me proporciono los ejemplares de MEXU para su revisión.
A mis compañeros de laboratorio que siempre con dudas tratamos de ayudarnos.
Especialmente a ti Yola, por tu gran amistad, y por siempre ayudarme ha corregir y
mejorar mi trabajo de investigación.
A la Secretaria de Investigación y Estudios Avanzados de la UAEM, por el
financiamiento del proyecto de investigación “Los hongos silvestres como estrategia
para el desarrollo sustentable en le Parque Ecológico Ejidal de Cacalomacán,
Estado de México”, clave 3687/2014/CIA, haciendo posible el presente trabajo.
Agradezco a la Red MEXBOL CONACYT proyecto 280896 por la financiación de la
secuenciación de ADN.
A CONACyT por la beca de manutención otorgada durante la maestría.
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CONTENIDO
I. Introducción general
II. Revisión de Literatura
i. Generalidades de Cordyceps sensu lato
ii. Clasificación taxonómica de Cordyceps sensu lato
iii. Ciclo de vida de hongos entomopatógenos
iv. Distribución y diversidad de Cordyceps sensu lato en el mundo
v. Diversidad de Cordyceps sensu lato en México
vi. Diversidad de Cordyceps sensu lato en el Estado de México
vii. Usos medicinales de diferentes especies de Cordyceps sensu lato
viii. Cultivo in vitro de Cordyceps
ix. Cordicepina: metabolito producido por Cordyceps
III. Planteamiento del problema
IV. Justificación
V. Hipótesis
VI. Objetivos
VII. Material y Método
VIII. Resultados
i. Capítulo I: Revisión del estado del conocimiento de Cordyceps sensu lato
en México: primeros reportes, diversidad, estados asexuales utilizados
como control biológico y conocimiento tradicional
ii. Capítulo II: Dos nuevos registros de Cordyceps sensu stricto en el centro
de México con posible potencial medicinal
iii. Capítulo III: Cultivo in vitro y producción de cordicepina de Cordyceps aff.
submilitaris, hongo silvestre del Centro de México
IX. Conclusiones generales
X. Referencias bibliográficas
XI. Anexos
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FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida de hongos entomopatógenos del orden Hypocreales
(Augustyniuk-Kram y Kram, 2012)……………………………………………………...16
Figura 2. Ciclo de vida polimórfico de Cordyceps militaris…………………………..16
Figura 3. Metodología general de esta investigación………………………………..28
Figura 4. Envio del articulo de revisión: Estado del conocimiento de Cordyceps
sensu lato en México, a la Revista Mexicana de Biodiversidad…………………….29
Figura 5: Dibujo de larva-ninfa. A. con ramificaciones que parten de la cabeza y terminan en punta, B. con ramificaciones que terminan en coliflor, C. larva ninfa dividida longitudinalmente a la mitad, D. extremidad anterior del artrópodo que le sirve para cavar la tierra (Tomado de: Rio de la Loza, 1864)……………………….56
Figura 6. Morfología de Cordyceps sp.1. a. estroma emergiendo del hospedero (Lepidóptero), b. corte transversal del estroma, c. parte externa del estroma, d. peritecios en forma de matraz, e. crecimiento hifal apical del peritecio, f. liberación de segmentos de ascas y ascosporas, g. segmentos de ascas y ascosporas………………………………………………………………………………..82
Figura 7. Morfología de Cordyceps sp.6. a. estromas emergiendo del hospedero (Lepidóptero), b. corte transversal del estroma, c. peritecios, d. peritecio con liberación de ascas, e. ascas con ascosporas………………………………………..83
Figura 8: a. Fotografía de la cepa de Cordyceps 1, b. Fotografía de la cepa de Cordyceps 6………………………………………………………………………………84
Figura 9. Caracterización microscópica de cepas. a. hifas a 100x con tinción rojo congo de la cepa 1, b. hifas y esporas a 100x con tinción rojo congo de la cepa 6. Ambas en medio Agar papa dextrosa (PDA) en ausencia de luz…………………..84
Figura 10. Cepa C-1 en los diferentes tratamientos. a, b, c, d y e, en presencia de
luz, a1, b1, c1, d1 y e1 en ausencia de luz. a: en AA, b: PDA, c:EMA, d:PDA+Y y e:SB.
……………………………………………………………………………………………..98
Figura 11. Cepa C-6 en los diferentes tratamientos. a, b, c, d y e, en presencia de
luz, a1, b1, c1, d1 y e1 en ausencia de luz. a: en AA, b: PDA, c:EMA, d:PDA+Y y e:SB.
……………………………………………………………………………………………..98
Figura 12. Conidios y esporas producidos en las cepas. a: cepa jc., b: cepa 6…100
Figura 13. Interacción entre cepa, condiciones lumínicas y medios de cultivo con
respecto a la velocidad de crecimiento……………………………………………….101
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Figura 14: Interacción entre condiciones lumínicas y medios de cultivo con respecto
a la producción de biomasa……………………………………………………………102
Figura 15. Cinética de crecimiento de la cepa C-1. Los tratamientos se observan
del lado derecho: A: agar agar; PDA: agar papa dextrosa; EMA: agar extracto de
malta; PDA+Y: agar papa dextrosa adicionado con levadura………………………104
Figura 16. Cinética de crecimiento de la cepa C-6. Los tratamientos se observan
del lado derecho: A: agar agar; PDA: agar papa dextrosa; EMA: agar extracto de
malta; PDA+Y: agar papa dextrosa adicionado con levadura……………………..104
Figura 17: Curva de calibración de cordicepina de 1-10ppm………………………123
Figura 18: Grafica lineal y línea de tendencia de la curva de calibración de
cordicepina………………………………………………………………………………124
Figura 19: Cromatogramas de las replicas 1, 2 y 3 del tratamiento PD+O+C6….125
Figura 20: Cromatogramas de las replicas 6, 7 y 8 del tratamiento PD+L+C6….125
Figura 21: Cromatogramas de las replicas 11, 12 y 13 del tratamiento
PD+O+C1……………………………………………………………………………….126
Figura 22: Cromatogramas de las replicas 16, 17 y 18 del tratamiento
PD+L+C1……………………………………………………………………………….126
Figura 23: Cromatogramas de las replicas 21, 22 y 23 del tratamiento
EM+L+C1………………………………………………………………………………..127
Figura 24: Cromatogramas de las replicas 26, 27 y 28 del tratamiento
PDY+O+C1……………………………………………………………………………...128
Figura 25: Cromatogramas de las replicas 31, 32 y 33 del tratamiento
PDY+L+C6………………………………………………………………………………128
Figura 26: Cromatogramas de las replicas 36, 37 y 38 del tratamiento
PDY+O+C6……………………………………………………………………………..129
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TABLAS
Tabla 1. Principales metabolitos secundarios extraídos de cepas de diferentes
especies de Cordyceps sensu lato……………………………………………………..19
Tabla 2. Medios de cultivo empleados en el experimento, con clasificación de
acuerdo a Kornerup y Wanscher (1978)………………….……………………………27
Tabla 3: Especies de la Familia Clavicipitaceae registradas en México..…………36
Tabla 4: Especies de la Familia Cordycipitaceae registradas en México................37
Tabla 5: Especies de la Familia Ophiocordycipitaceae registradas en México……44
Tabla 6: Estados asexuales de Cordyceps sensu lato utilizados como control biológico de insectos en México………………………………………………………...55
Tabla 7: Especies de Tolypocladium con uso tradicional en el Centro de México…56
Tabla 8. Porcentaje de identidad con análisis BLAST de las cepas y los estromas con los marcadores, ITS y LSU…………………………………………………………85
Tabla 9. Caracterización fenotípica de la cepa Cordyceps sp.1. y Cordyceps sp.6
en los diferentes tratamientos…………………………………………………………..96
Tabla 10. Velocidad de crecimiento y biomasa seca del cultivo in vitro en medio
sólido…………………….………………………………………………………………100
Tabla 11: Caracterización macroscópica de pellets..……………………………….105
Tabla 12. Caracterización microscópica y de pellets en cultivo sumergido……..106
Tabla 13. Biomasa y cordicepina extracelular producida en medio líquido……… 108
Tabla 14: Curva de calibración de la cordicepina con los diferentes valores de área
y altura de la curva, así como el tiempo de retención………………………………123
Tabla 15: Tiempo de retención, área y altura de las diferentes concentraciones de
cordicepina obtenidas en sistema de HPLC………………………………………….123
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INTRODUCCIÓN GENERAL
Los hongos a través del tiempo se han considerado un recurso natural para la
población humana debido a sus propiedades nutritivas, medicinales y enteógenas,
por lo que en la actualidad su estudio y aprovechamiento tiene gran importancia
(Duvoboy, 1968; Martínez-Carrera et al., 2005; McLain, 2008). Actualmente los
hongos medicinales son una buena alternativa para su uso en la industria
farmacéutica, así como alimentos funcionales, ya que la mayoría de los
componentes bioactivos o también llamados metabolitos secundarios que producen
no tienen efectos negativos en la salud del humano en contraste con los
medicamentos sintéticos (Boa, 2005).
Cordyceps sensu lato es un grupo de ascomicetos entomopatógenos que incluye
los géneros Metarhizium, Cordyceps, Tolypocladium y Ophiocordyceps entre otros
(Sung et al., 2007a). Algunas especies de este género son ampliamente utilizadas
en la medicina Asiática tradicional, ya que presentan metabolitos secundarios con
propiedades medicinales (Ng y Wang, 2005), como cordicepina y manitol (Chun-kit
y Wing-hung, 2012). Ademas de ser una especie medicinal, tiene comestible y
ecológica, esta última se debe a que controlan la densidad poblacional de algunos
artrópodos, por lo que algunas especies pueden ser utilizadas como control
biológico (Augustyniuk-Kram y Kram, 2012).
Su cultivo in vitro tiene gran importancia, ya que los estromas colectados son muy
escasos, el tamaño de estos es muy pequeño y el costo es muy elevado, ya que
1Kg de Cordyceps silvestre colectado en la India, puede tener un costo de 4,770 a
9,500 MXN, lo que equivale a 318 a 633 dólares (Sharma, 2004).
Para México el conocimiento tradicional de Cordyceps es escaso. Guzmán (2008)
menciona que Tolypocladium ophioglossoides y T. capitatum, anteriormente
considerados Cordyceps ophioglossoides y C. capitata, respectivamente, son
utilizados en ceremonias religiosas por los nahuas en Tenango del Valle y San
Pedro Tlanixco, Estado de México, debido a que se les atribuyen propiedades
medicinales y alucinógenas. Sin embargo las condiciones óptimas de cultivo in vitro
de diferentes especies silvestres de Cordyceps, el tipo y concentración de
metabolitos secundarios que presentan es desconocido.
Por lo tanto los objetivos de esta investigación fueron conocer el estado actual del
conocimiento de Cordyceps sensu lato en México (Capítulo 1), identificar a nivel de
especie los estromas colectados (Capítulo 2) y realizar el cultivo in vitro en medio
sólido y líquido de estas especies, así como determinar la producción de cordicepina
en diferentes tratamientos (Capítulo 3) para conocer el potencial medicinal de
especies silvestres de Cordyceps en México.
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REVISIÓN DE LITERATURA
GENERALIDADES DE Cordyceps sensu lato
Cordyceps sensu lato (Cordyceps s.l.) es un género de hongos entomopatógenos
que parasitan insectos en los diferentes estadios del ciclo de vida y también parásita
ha hongos del género Elaphomyces (Mains, 1958; Sung et al., 2007a).
Estos hongos endoparásitos pueden tener rangos específicos de hospederos que
van desde orden pasando por familia, hasta especie (Nikoh y Fakatsu, 2000; Sasaki,
2008; Sanjuan et al., 2014). Tienen la capacidad de atravesar el exoesqueleto de
sus hospederos debido a que pueden hidrolizar la quitina. Las ascosporas o
conidios inician este proceso con la ayuda de prolongaciones de las células fúngicas
llamadas aprensorios y haustorios, luego segregan la maquinaría enzimática para
poder atravesar el exoesqueleto y llegar así a colonizar el interior del hospedero
(Evans et al., 1988).
Las principales especies de Cordyceps s.l. utilizadas como medicinales son
Ophiocordyceps sinensis que parasita larvas de la polilla Hepialus sp. y Cordyceps
militaris, que parásita pupas de Lepidóptera. Estas especies producen diferentes
componentes bioactivos tales como: cordicepina, polisacáridos, ergosterol y manitol
(Tan, 2010), siendo la cordicepina el principal componente bioactivo del hongo
(Chun-kit y Wing-hung, 2012). Los componentes bioactivos producidos por algunas
especies de Cordyceps, como por ejemplo la especie más ampliamente estudiada,
C. militaris, presenta actividades antimalarias, hipoglucémicas, antitumorales,
antidiabéticas e inmunomodulatorias (Chen et al, 1997; Kim et al., 2001; Zhao et al.,
2002; Asaduzzaman et al., 2010).
CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE Cordyceps sensu lato
Este género pertenece al Phylum Ascomycota, debido a que cuando se reproducen
sexualmente forman estructuras especializadas llamadas ascas y ascosporas, a la
Clase Sordariomycetes, al orden Hypocreales y a las familias Cordycipitaceae,
Clavicipitaceae y Ophiocordycipitaceae (Eriksson et al., 2004; Sung et al., 2007a y
2007b). Presenta como características exclusivas la presencia de peritecios, estos
son una cámara con forma de matraz que contiene a las ascas y en la parte apical
presentan un ostiolo por el cual se liberan las ascosporas. Hay cuatro tipos de
peritecios de acuerdo a su posición en el estroma: superficial, medio inmerso,
verticalmente inmerso y oblicuamente inmerso. Otras características de este grupo
son: ascas cilíndricas, con una tapa apical engrosada, ascosporas filiformes que
frecuentemente están separadas pero pueden desarticularse y formar partes de
esporas (Tian et al., 2010).
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La clasificación de las especies anteriormente se basaba en caracteres
morfológicos de acuerdo a Masse (1895), Mains (1957, 1958) y Kobayasi (1941,
1982) la cual considera, el color del estroma de la parte fértil, la forma de los
peritecios y su disposición en el estroma, la forma de ascas y de ascosporas.
Posteriormente debido a las compleja morfología macroscópica y microscópica de
las especies, la taxonomía del género de una familia se ha modificado,
Clavicipitaceae (Kobayasi, 1941, 1982; Mains, 1957, 1958) a tres familias
Clavicipitaceae, Cordycipitaceae y Ophiocordycipitaceae, con los géneros
Metacordyceps, Cordyceps sensu stricto, Ophiocordyceps y Elaphocordyceps
(Sung et al., 2007) de acuerdo a estudios filogenéticos realizados con caracteres
morfológicos y utilizando los marcadores moleculares LSU, SSU, RPB1, RPB2 Tef
y mtATP6. Gracias a ello, se ha planteado que la identificación taxonómica requiere
tanto de caracteres morfológicos y genotípicos, siendo consistentes el color y la
textura del estroma, así como el hospedero que parasitan que se define como el
nicho ecológico (Sung et al., 2007a; 2007b; Sanjuan, 2015). Ahora la clasificación
taxonómica es la siguiente (Sung et al., 2007a; 2007b; Kepler et al., 2014 y Quandt
et al., 2014):
Familia Clavicipitaceae: Incluye el género Metarhizium (anteriormente
Metacordyceps).
Familia Cordycipitaceae: Incluye el género Cordyceps sensu stricto
Familia Ophiocordycipitaceae: Incluye dos géneros, Ophiocordyceps y
Tolypocladium (anteriormente Elaphocordyceps).
Las especies del género Cordyceps presentan anamorfos, tales como: Beauveria
spp., Metarhizium spp. e Isaria spp., anteriormente Paecilomyces, (Sung et al.,
2007a, 2007b), los cuales han sido empleados como controladores biológicos, por
ejemplo Metarhizium ha sido utilizado en Brasil para controlar los “salivazos” que
afectan el cultivo de alfalfa y caña de azúcar (Alves et al., 2008), en África se han
utilizado para controlar los mosquitos vectores de malaria (Scholte et al., 2005), así
como también para el control de las “langostas” (FAO, 2009).
CICLO DE VIDA DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
El ciclo de vida de hongos entomopatógenos es complejo ya que presenta fases
asexuales y sexuales, en el estado asexual se reproduce por medio de blatosporas,
conidios y/o clamidosporas, y en el estado sexual se reproducen con la formación
de ascosporas (Augustyniuk-Kram y Kram, 2012). Este autor menciona que de
forma general los hongos entomopatógenos presentan un ciclo de vida con dos
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fases: Fase parasítica (en la cual el hongo parasita al hospedero) y la fase saprobia
(después de la muerte del hospedero).
Figura 1. Ciclo de vida de hongos entomopatógenos del orden Hypocreales (Tomado de:
Augustyniuk-Kram y Kram, 2012).
Zheng et al. (2011), secuenciaron el genoma y definieron el ciclo de vida de
Cordyceps militaris, ya que es la especie con mayor número de estudios e
importancia hasta la actualidad, por lo que es considerada modelo biológico. C.
militaris presenta un ciclo de vida polimórfico, se reproduce asexual y sexualmente,
en la reproducción asexual forma conidios o blatosporas que dan lugar a un
estroma, y en la reproducción sexual también dan lugar a estromas pero a partir de
la germinación de ascosporas, por lo tanto pueden formar estromas por
heterotalismo bipolar o pueden formar estromas por homotalismo (Zheng et al.,
2011).
Figura 2. Ciclo de vida polimórfico de Cordyceps militaris.
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DISTRIBUCIÓN Y DIVERSIDAD DE Cordyces sensu lato EN EL MUNDO
El género Cordyceps s.l. presenta una distribución cosmopolita e incluye todas las
regiones a excepción de la Antártida, sin embargo la mayor diversidad de especies
se encuentra en las regiones tropical y subtropical, destacando en el sur y sureste
de Asia (Kobayasi 1941, 1982; Samson et al., 1988).
A nivel mundial se han reportado cerca de 450 especies de hongos
entomopatógenos (Kirk et al., 2001), sin embargo se estima que existen 750 (Sung,
1996) y para Norteamérica se han reportado 41 especies (Mains, 1958).
Del género Cordyceps sensu stricto mundialmente se han reportado 236 especies
(Index Fungorum, 2016).
DIVERSIDAD DE Cordyceps sensu lato EN MÉXICO
En México Cordyceps ha sido un ascomiceto poco estudiado a comparación del
continente oriental, su taxonomía solo ha sido estudiada más específicamente por
Pérez-Silva (1977, 1978), Rubio-Bustos et al. (1999) y Guzmán et al. (2001). Los
demás registros se han dado ocasionalmente por estudios de micoflora para ciertas
regiones de México, y hasta la actualidad no se ha vuelto a realizar un estudio
taxonómico dirigido al género Cordyceps, también es importante mencionar que en
todos estos estudios la identificación taxonómica se ha realizado de forma
tradicional utilizando solo caracteres morfológicos y excluyendo la utilización de
marcadores moleculares.
En México se han registrado 25 especies de Cordyceps sensu lato que incluye
estados asexuales y teleomorfos, de los cuales 9 especies pertenecen a
Cordcyceps sensu stricto (Ver Capítulo 1).
DIVERSIDAD DE Cordyceps sensu lato EN EL ESTADO DE MÉXICO
Para el Estado de México se tenia el registro de tres especies: Tolypocladium
capitatum, Tolypocladium ophioglossoides y Cordyceps militaris, anteriormente
considerados C. capitata y C. ophioglossoides (Heim, 1957; Trappe y Guzmán,
1971; Frutis et al., 1985; Guzmán et al., 2001). Sin embargo Pérez-Villamares et al.
(2017) realizaron un estudio en diferentes municipios del sureste del Estado de
México donde identificaron a siete especies, Cordyceps militaris, Ophiocordyceps
entomorrhiza, O. gracilioides, O. gracilis, y la fase conidial de O. stylophora,
Cordyceps takaomontana y C. scarabaeicola, con lo cual se tienen hasta el
momento nueve especies registradas para el Estado de México.
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USOS MEDICINALES DE DIFERENTES ESPECIES DE Cordyceps sensu lato
El género Cordyceps ha sido ampliamente utilizado en el continente Asiático debido
a las propiedades anticancerígenas que presenta, principalmente en Japón, Korea
y China, tal como: Ophiocordyceps sinensis, Cordyceps militaris, C. sphecocephala,
C. oxycephala, C. elongotostromata y C. japonenesis (Nam, et al., 2006).
En México, a pesar de que no se han realizado trabajos etnomicológicos del género
Cordyceps, Guzmán (2008) menciona que los nahuas utilizaban a C. capitata y C.
ophioglossoides, con fines medicinales y alucinógenos, que actualmente
pertenecen al género Tolypocladium.
Cordyceps militaris y Ophiocordyceps sinensis son las especies más ampliamente
estudiadas. En C. militaris se han extraído diferentes metabolitos secundarios con
diversas actividades biológicas tales como: pro-sexual, anti-inflamatoria, anti-
oxidante, anti-cancerígena, anti-proliferativa, anti-metástasica, inmunomodulatoria,
anti-microbiana, anti-viral, anti-fúngica, anti-protista, insecticida, larvicida, anti-
fibrótica, hipoglucémica, hipolipídica, anti-diabética, anti-VIH, anti-malaria,
neuroprotectiva y reno-protectiva (Won y Park, 2005).
CULTIVO in vitro DE Cordyceps
Carilli y Pacioni (1977), fueron los primeros en realizar cultivo in vitro sumergido y
determinar la morfología de C. militaris, realizando estudios de control biológico de
plagas. Observaron el desarrollo de conidios con fialides y esporas llamadas
blatosporas.
Cordyceps militaris es la especie más estudiada, y recientemente el estudio in vitro
de otras especies de Cordyceps ha sido experimentado debido a la presencia de
metabolitos secundarios con propiedades medicinales (Ling et al., 2002; Wongsa
et al., 2005; Nam et al., 2006; Sung et al., 2010; Wang et al., 2012; Chiriví-Salomón
et al., 2017).
El cultivo in vitro se ha obtenido y optimizado en medio de cultivo superficial o sólido
(Masuda et al., 2007) y medio de cultivo sumergido o líquido (Mao et al., 2007), sin
embargo, la concentración de metabolitos secundarios, así como la cantidad de
biomasa producida depende de diversos factores, como las fuentes de carbono,
nitrógeno, potasio, factores de crecimiento, minerales, temperatura, pH, agitación,
luz y también de la cepa utilizada (Hung et al., 2009). Los componentes bioactivos
como cordicepina y exo-polisacáridos producidos por C. militaris, así como la
optimización del cultivo in vitro para obtener mayor concentración de estos
metabolitos han sido ampliamente estudiados (Kim y Yun, 2005; Mao y Zhong,
2006). Los trabajos de optimización del cultivo in vitro también han incluido los
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factores luz (ausencia/presencia) (Shrestha et al., 2006), y la incidencia de
diferentes longitudes de onda en estromas (Dong et al., 2012):
CORDICEPINA: METABOLITO PRODUCIDO POR Cordyceps
La cordicepina (3´-deoxiadenosina) es un nucleósido análogo a la adenosina. Es
producida por diferentes especies de Cordyceps y es extraída debido a las
propiedades anti-virales, anti-fúngicas, anti-bacteriales, anti-leucémicas y anti-
metástasicas en algunas líneas celulares cancerígenas (Chun-kit y Wing-hung
2012). La cordicepina fue extraída por primera vez por Cunningham et al. (1950),
está puede ser sintetizada químicamente, sin embargo su rendimiento es bajo y el
proceso es complicado, alternamente su extracción en estromas colectados es muy
costosa y la obtención de estromas cultivados in vitro es más baja que la obtenida
del micelio (McDonald et al., 1996; Guo et al., 1998). Por lo tanto el micelio se cultiva
en medios sólidos o en medios líquidos para obtener la cordicepina con menor costo
económico (Hung et al., 2009), en la mayoría de los trabajos se utilizan cepas de
origen Asiático ya registradas en ceparios del extranjero.
En diferentes investigaciones se ha determinado que C. militaris es la especie que
produce mayor cantidad de cordicepina, biomasa y exopolisacáridos (EPS) a
comparación de O. sinensis (Kim y Yun, 2005). Al mismo tiempo, se ha registrado
que los medios añadidos con levadura producen una mayor concentración de EPS
y cordicepina (Shih et al., 2006) y estos se encuentran en un 98% en el medio de
cultivo, en contraste del manitol que se encuentra en mayor concentración en el
micelio (Masuda et al., 2006).
Otras especies que también se han cultivado in vitro son: O. sinensis y C.
kyushuensis, a las cuales se les ha extraído cordicepina (Ling et al., 2002), así como
también a C. cicadae (Wang et al., 2012). C. unilateralis presenta naftoquinonas con
actividad antimalaria (Wongsa, et al., 2005). C. sphecocephala y C. cardinalis solo
se han aislado y se ha determinado el medio sólido óptimo para su crecimiento
micelial (Nam et al., 2006; Sung et al., 2010). En C. nidus se ha determinado la
presencia de altas concentraciones de componentes fenólicos con propiedades
anti-microbianas y anti-oxidantes (Chivirí-Solomon et al., 2017). En la Tabla 1 se
muestran los metabolitos producidos por diferentes especies de Cordyceps.
Tabla 1. Principales metabolitos secundarios extraídos de cepas de diferentes especies de
Cordyceps sensu lato
Especie Cordicepina Manitol Componentes fenólicos
Naftoquinonas Referencia
Ophiocordyceps sinensis
* *
Ling et al., 2002
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Cordyceps militaris
* * * Cunningham et al., 1950; Mao et al.,
2005; Masuda et al., 2005
C. cyushuensis *
Ling et al., 2002
C. cicadae *
Wang et al., 2012
C. pruinosa *
Meng et al., 2014
C. cardinalis *
Sung et al., 2010
C. unilateralis
* Wongsa et al., 2005
C. sphecocephala
Nam et al., 2006
C. nidus * *
Chiriví-Salomón et al., 2017
*Indica presencia
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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Cordyceps sensu lato en México es un grupo escasamente estudiado, a pesar de
tener importancia agrícola, comestible y medicinal, su estudio ha sido ampliamente
enfocado a su manejo como control biológico, sin embargo, su uso como comestible
y medicinal solo se ha reportado para dos especies: Tolypocladium capitatum y T.
ophioglossoides. Sin embargo, se desconocía un estado del conocimiento general
y actual de este grupo.
Con respecto al estudio bioquímico, molecular y el cultivo in vitro de teleomorfos de
especies silvestres de Cordyceps de México no ha sido aún investigado y analizado.
En Asia han sido estudiados Cordyceps militaris y Ophiocordyceps sinensis por las
propiedades anti-bacteriales, anti-metástasicas, anti-inmunomodulatorias y anti-
virales que presentan. Se ha demostrado que estas propiedades se deben a un
metabolito secundario llamado cordicepina, que se producen a gran escala con la
utilización del cultivo in vitro de C. militaris.
En México, se desconoce si las especies silvestres producen cordicepina, y en qué
cantidad, lo cual fue el principal problema a resolver en esta investigación.
Con respecto al experimento, se planteó la pregunta: ¿Qué efecto tendrá la luz en
la producción de cordicepina en diferentes medios de cultivo líquidos a nivel de
cepa?
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JUSTIFICACIÓN
Los recursos naturales, como los hongos son una fuente de alimento funcional que
proporciona nutrientes y metabolitos secundarios con actividad benéfica a la salud,
por lo que el estudio molecular, bioquímico y su cultivo in vitro permiten conocer las
especies, sus propiedades y su uso en la industria, respectivamente.
En México Cordyceps sensu lato es un grupo de hongos que ha sido escasamente
estudiado, destacan los estudios enfocados a la agroindustria como controladores
biológicos de plagas que afectan cultivos con importancia comercial como el maíz,
frijol y cítricos. Con respecto al enfoque biológico solo se ha estudiado su diversidad
utilizando la taxonomía clásica, excluyendo la utilización de caracteres moleculares.
En relación a la utilización tradicional de algunas especies, solo se conoce el
consumo de Tolypocladium capitatum y T. ophioglossoides por los nahuas en el
estado de México, sin embargo, no se han realizado estudios de las propiedades
bioquímicas y medicinales de las especies silvestres para México.
Por lo tanto, para México se desconoce el estado del conocimiento actual de
Cordyceps sensu lato, las propiedades medicinales y comestibles, así como
tampoco se conocen las condiciones óptimas del cultivo in vitro de especies
silvestres.
Por lo tanto, estos fueron los tres objetivos de esta investigación, ya que el conocer
el estado del conocimiento de este grupo, permitió describir la diversidad registrada
hasta el momento, el enfoque de los estudios y al mismo tiempo se visualizaron los
tópicos que faltan por investigar con el fin de priorizar investigaciones futuras.
Por último, el determinar los parámetros nutricionales para la óptima producción de
biomasa y cordicepina permitió demostrar el potencial biológico, medicinal,
biotecnológico y farmacológico de estas especies fúngicas silvestres de México, lo
que a su vez sustenta las bases para realizar ciencia aplicada de este grupo de
hongos tan complejo e interesante.
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HIPOTESIS
Las cepas de Cordyceps silvestres de México producirán cordicepina, si pertenecen
al grupo Cordyceps sensu stricto, ya que diversas especies de este grupo, como
Cordyces militaris, especie modelo, comparten la producción de este metabolito.
La producción de cordicepina será mayor en medios de cultivo ricos en nutrientes
en presencia de luz a comparación de medios de cultivo con pocos nutrientes y
ausencia de luz., en contraste con la producción de biomasa que será mayor en
medios ricos en nutrientes y ausencia de luz.
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OBJETIVO GENERAL
Determinar las condiciones óptimas nutricionales del cultivo in vitro a nivel de cepa
y la cantidad de cordicepina, bajo condiciones de luz y oscuridad, entre cepas
silvestres de Cordyceps del Estado de México
OBJETIVOS PARTICULARES
Determinar taxonómica y molecularmente las especies estudiadas
Determinar los parámetros nutricionales que optimizan la velocidad de
crecimiento y producción de biomasa en dos cepas de Cordyceps en cultivo
superficial bajo condiciones de luz y oscuridad
Determinar los parámetros nutricionales que optimizan la producción de
biomasa y cordicepina en cultivo in vitro a nivel de cepa en medio líquido bajo
condiciones de luz y oscuridad
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MATERIALES Y MÉTODO
Para el estado del conocimiento actual de Cordyceps sensu lato en México se
revisaron las primeras publicaciones en el Acervo histórico del Instituto de Biología
de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Se realizó un listado de
las especies de teleomorfos registradas en los diferentes estados del país, mediante
la revisión de las investigaciones publicadas desde el año 1864 al 2017. Se realizó
una visita al herbario MEXU del Instituto de Biología de la UNAM y se revisaron
todos los ejemplares depositados con el nombre de Cordyceps. El uso de estados
anamorfos como control biológico y conocimiento tradicional, se realizó en
buscadores electrónicos como Google, Scientific Electronic Library Online (SciELO),
en las bases de datos Redalyc, Elsevier, Scopus, y SpringerLink. Las palabras clave
utilizadas en las búsquedas fueron: Cordyceps, hongos entomopatógenos, control
biológico, Metarhizium, Beauveria, Isaria, Paecilomyces¸ cultivo de Cordyceps y
Tolypocladium. El nombre científico de las especies se describe de acuerdo al
nombre taxonómico actual, mediante la nomenclatura del Index Fungorum
MATERIAL RECOLECTADO
Los ejemplares fueron colectados en “Desierto del Carmen”, Tenancingo, localizado en la región sureste del Estado de México, ubicado a 18°49´ y 19°03´ latitud norte y 99°30´y 99°39´ de longitud oeste, a una altitud de 2200 a 2700 msnm (INEGI, 2009). Se realizó un muestreo dirigido de agosto a octubre de 2015, los cuales fueron colectados cuidadosamente, se limpiaron con una brocha de cerdasd delgadas y se guardaron en bolsas ziploc. Estos se llevaron al laboratorio de Micología del Centro de Investigación en Recursos Bióticos para su identificación. Los ejemplares serán depositados en el herbario del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México una vez que se identifiquen completamente las especies. Los estromas fueron caracterizados microscópicamente de acuerdo a claves especializadas de Mains (1958) y Kobayasi (1941, 1982). La examinación de los ejemplares se realizó de acuerdo a Sanjuan et al. (2014). Las descripciones del color de los estromas se realizó mediante la clave de color HTML color codes (http://html-color-codes.info) .La identificación del hospedero se realizó a nivel de orden.
EXTRACCIÓN DE DNA, AMPLIFICACIÓN CON PCR, ELECTROFORESIS Y SECUENCIACIÓN
La extracción de DNA se realizó con el kit SIGMA-ALDRICH-REDExtract-N-AmpTM
Plant, con algunas modificaciones. Se amplificaron dos locus: La región transcrita interna (ITS) y la subunidad larga del ribosoma (LSU). La reacción de PCR se realizó con una mastermix de 20 µl (Vilgalys y Sun, 1994). La purificación se realizó con EXOSAP, se preparó una master mix a 1x con EXOSAP y ddH2O. Las muestras se
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
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mandaron a secuenciar con el método de Sanger, al Laboratorio de Secuenciación del Instituto de Biología de la Universidad Autónoma Nacional de México.
EDICIÓN DE SECUENCIAS, ANÁLISIS DE BLAST Y ANÁLISIS FILOGENÉTICO
Las secuencias obtenidas en este estudio fueron editadas en el programa Geneious R.1.5 (Drummond et al., 2009). Se realizó un análisis de BLAST dentro de Geneious R. 1.5 utilizando la plataforma de GenBank para confirmar que las secuencias pertenecían a la familia Cordycipitaceae, así como también para determinar la especie a la que pertenecían los ejemplares. Las secuencias obtenidas serán subidas a la plataforma de GenBank, una vez que se halla terminado el análisis filogenético.
El análisis filogenético se realizará utilizando las secuencias obtenidas en este estudio y las obtenidas por Sanjuan et al. (2015) que se encuentran en Gen Bank, el análisis se llevará a cabo utilizando los marcadores moleculares ITS, LSU, RPB1, RPB2 y TEF. Para el grupo externo se utilizarán especies representativas de Metarhizium y Pochonia. El alineamiento de SSU y LSU se realizará en MUSCLE (Edgar, 2004), el alineamiento para los genes que codifican proteínas RPB1, RPB2 y TEF se realizaran con MAFT (Katoh y Toh, 2010). Finalmente cada alineamiento será refinado manualmente en BioEdit versión 6.0.7 (Hall, 1999). Este análisis no se ha realizado ya que posiblemente se trata de nuevas especies, por lo que requiere un análisis cuidadoso, que realizara Sanjuan, T., investigadora experta en este grupo de hongos.
AISLAMIENTO DE CEPAS
A los estromas colectados, con un bisturí estéril se les cortó un pedazo de estroma de aproximadamente 2-3 mm, este se aisló directamente en placas de Petri en medio estéril de Agar Papa Dextrosa (PDA) y se incubó por 30 días a 25°C de acuerdo al método modificado de Kumar y Sagar (2006). Al término de este periodo se caracterizó la cepa macroscópica de acuerdo a Cruz-Ulloa (1995) y microscópicamente de acuerdo a Mains (1958).
CULTIVO SUPERFICIAL, DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se caracterizaron las cepas 1 y 6 en cinco medios de cultivo, clasificados de
acuerdo a su contenido nutrimental. Agar Agua (AA), Agar Papa Dextrosa (PDA),
Agar Extracto de Malta (EMA), Agar Papa Dextrosa adicionado con Levadura
(PDA+Y) y Sabourad (SB) (tabla 2). La inoculación de los medios sólidos se realizó
tomando una muestra de 0.5cm de diámetro de las cepas en medio PDA, se reaisló
en placas de cultivo previamente esterilizadas y preparadas con los diferentes
medios de cultivo, se incubaron a 25°C en ausencia y presencia parcial de luz (12
hrs luz/12 hrs oscuridad). Diariamente se midió el diámetro de las cepas y se calculó
la velocidad de crecimiento de acuerdo al método modificado de Huerta et al. (2009),
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
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con la siguiente formula: Velocidad de crecimiento=(Df-Di)/(Df-Di), donde, Df es el
diámetro final, Di es el diámetro inicial y Tf-Ti son los días de crecimiento micelial.
Posteriormente, se caracterizaron macroscópicamente las cepas de acuerdo a
Mains (1958), y microscópicamente de acuerdo a Cruz-Ulloa (1995), también se
determinó la densidad del micelio de acuerdo a Kornerup y Wanscher (1978) y
Shrestha et al. (2006), donde (-) indica extremadamente pobre, (+) pobre, (++)
moderado y (+++) abundante. La descripción de la coloración de las cepas se realizó
utilizando la clave de colores Color codes (http://html-color-codes.info, 2016).
Después se midió la producción de biomasa, se realizó un triple lavado de las cepas
con agua destilada calentada a 90-100°C, posteriormente se filtró el micelio en papel
filtro del número 4, este se dejó secar a 60°C por 24hrs de acuerdo a Sung et al.
(2010). Se establecio un diseño experimental multifactorial, por lo que se aplico un
análisis estadístico multifactorial MANOVA utilizando un nivel de confianza de 95%,
posteriormente una prueba de Tukey.
Tabla 2. Medios de cultivo empleados en el experimento, con clasificación de
acuerdo a Kornerup y Wanscher (1978).
Medio de cultivo Clasificación Componentes (gr/L) Marca
Agar agua (AA) Pobre Agar (15.0) Bioxon
Agar papa dextrosa (PDA)
General Almidón de papa (4.0) Dextrosa (20.0) Agar (15.0)
Bioxon
Agar extracto de malta (EMA)
General Maltosa (12.75) Dextrina (2.75) Glicerol (2.35) Peptona (0.78) Agar (15.0)
Difco
Agar papa dextrosa adicionado con levadura (PDA+Y)
Rico Almidón de papa (4.0) Dextrosa (20.0) Agar (15.0) Levadura (2.0)
Difco
Agar dextrosa Sabourad (SB)
Rico Dextrosa (40.0) Peptona de carne (5.0) Peptona de caseína (5.0) Agar (15.0)
Bioxon
CULTIVO LÍQUIDO, EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CORDICEPINA
Las cepas 1 y 6 se caracterizaron en tres medios de cultivo, clasificados de acuerdo
a su contenido nutrimental. Papa dextrosa (PD), Extracto de malta (EM), y Papa
dextrosa adicionado con levadura (PD+Y). Se inocularon frascos bacteriológicos de
500 ml con cinco pellets de 5 mm cada uno, se dejaron en agitación por 60 días a
25°C a 150 rpm, en ausencia y presencia parcial de luz (12 hrs luz/12 hrs oscuridad).
Se determinó la cantidad de biomasa de acuerdo a Shih et al., (2006). Se aplicó un
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
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análisis estadístico multifactorial MANOVA utilizando un nivel de confianza de 95%,
posteriormente una prueba de Tukey.
Después de que se midió la biomasa, se realizó un lavado de los medios líquidos
con agua destilada estéril, posteriormente se filtró el micelio en papel filtro del
número 4, este se dejó secar a 60°C por 24hrs de acuerdo a Sung et al. (2010).
Para la extracción de cordicepina, se centrifugó el cultivo líquido a 6000g/10min,
posteriormente se filtró el sobrenadante en papel filtro Whatman 4. Se midió el pH,
se lavó el micelio con agua destilada y se secó a 60°C por 48hrs, para obtener
biomasa seca. Posteriormente el medio de cultivo filtrado se mezcló con metanol al
15% (1:1), se centrifugó a 6000g/15min y se filtró el sobrenadante en Syringe Filter
estéril de 0.45µm/13mm de diámetro. El filtrado obtenido se analizó en
Cromatografia Liquida de Alta resolución (HPLC, High Performance Liquid
Chromatography) para la cuantificación de la cordicepina. La curva de calibración
de cordicepina (Sigma Aldrich) se realizó utilizando diferentes concentraciones
desde 1-10ppm (Figuras 16-17 y Tablas 16-17). El sistema de HPLC estuvo
conformado por un Automuestreador Waters 717 plus, bombas binarias Waters
1525, detector de absorbancia dual Waters 2487, columna C18 Kromasil® (250
mmx4.6 mm; 5 µm tamaño de partícula), la fase móvil estuvo compuesta por una
mezcla de metanol y KH2PO4 (0.02M) en concentración (15:85), la tasa de flujo fue
de 20 µl/min, se utilizó un detector de UV a 254 nm, con temperatura de 25°C, con
un tiempo de corrida de 40 min. Posteriormente los resultados fueron analizados en
el programa Breeze (Figuras 18-25).
La metodología se resume gráficamente en el siguiente diagrama (figura 3):
Figura 3. Metodología general de esta investigación.
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RESULTADOS
CAPITULO I. Revisión del estado del conocimiento
de Cordyceps sensu lato en México: primeros
reportes, diversidad, estados asexuales utilizados
como control biológico y conocimiento tradicional
Figura 4. Envio del articulo de revisión: Estado del conocimiento de Cordyceps sensu lato en México, a la Revista Mexicana de Biodiversidad.
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RESUMEN
Cordyceps sensu lato es un grupo de hongos ascomicetos que parásita artrópodos,
plantas gramíneas y hongos del género Elaphomyces. A nivel mundial existen
especies con importancia agrícola, comestible, ecológica y medicinal. A pesar de
que México ocupa el cuarto lugar de los 12 países más megadiversos del planeta,
los hongos entomopatógenos han sido escasamente estudiados y se desconoce el
panorama actual de su diversidad y por eso se convierte en el principal objetivo de
esta revisión. En este estudio se realizó una revisión exhaustiva de los estudios
publicados en México, de especies utilizadas para control biológico y uso tradicional
así como una revisión de las bases de datos biológicas disponibles para el país. En
México se han reportado 25 especies, entre las cuales se incluyen teleomorfos y
estados asexuales. La familia Clavicipitaceae está representada por Metarhizium
anisopliae. La familia Cordycipitaceae, está representada por cinco especies del
género Cordyceps y cuatro son estados asexuales tal como Beauveria bassiana e
Isaria fumosorosea, mientras que la familia Ophiocordycipitaceae posee diez
especies del género Ophiocordyceps, dos del género Tolypocladium y tres estados
asexuales del género Hirsutella. Tolypocladium ophioglossoides y T. capitata, son
utilizadas por los Nahuas en ceremonias sagradas en el Estado de México.
PALABRAS CLAVE
Taxonomía, Etnomicología, Hypocreales, listado de especies, insectos plaga,
cordicepina
ABSTRACT
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
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Cordyceps sensu lato (Cordyceps s.l.), is a group of ascomicetes fungi parasites of
arthropods, grass plants and fungi of the genus Elaphomyces. This group presents
at a global level species of agricultural, edible, medicinal and ecological importance.
Although Mexico had the fourth place of the twelve most megadiverse countries of
the planet, whith respect to entomopathogenic fungi, there ins´t currently general
overview of the state ot its knowledge in this conuntry, so this is the main aim of this
review. In this study, a comprehensive review was carried out of the studies
published in Mexico, where diversity, species used for biological control and
traditional use are mentioned. In Mexico, 25 species have been reported, including
teleomorphs and asexual states. The family Clavicipitaceae for Metarhizium
anisopliae. Nine species belong to Cordycipitaceae family, five belong the genus
Cordyceps and four asexual states as Beauveria bassiana e Isaria fumosorosea.
The family Ophiocordycipitaceae has ten species of the genus Ophiocordyceps, two
in the genus Tolypocladium and three asexual states of the genus Hirsutella.
Tolypocladium ophioglossoides y Tolypocladium capitata are use for the Nahuas in
sacred ceremonies in Mexico.
KEY WORDS
Taxonomy, Ethnomycology, Hypocreales, list of species, pest insects, cordycepin
INTRODUCCIÓN
Cordyceps sensu lato (Cordyceps s.l.) es un grupo de ascomicetos parásitos de
artrópodos en sus diferentes estadios de su ciclo de vida, que pueden ser pupa,
larva o estado adulto, también parasitan gramíneas y hongos del género
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
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Elaphomyces (Sung et al., 2007a). Estos hongos endoparásitos pueden tener
rangos específicos de hospederos que van desde orden, familia ó especie (Nikoh y
Fakatsu, 2000; Sasaki, 2008; Sanjuan et al., 2014). Se reproducen sexual y
asexualmente por lo que su ciclo de vida es pleomórfico y polimórfico, en la
reproducción sexual (estado teleomorfo o perfecto) con meiosis producen
ascosporas y en la reproducción asexual (estado asexual o imperfecto) por mitosis
producen blastosporas o conidios (Zheng et al., 2011). Tienen la capacidad de
atravesar el exoesqueleto de sus hospederos debido a que pueden hidrolizar la
quitina. Las ascosporas o conidios inician este proceso con la ayuda de
prolongaciones de las células fúngicas llamadas aprensorios y haustorios, los
cuales segregan enzimas específicas para poder atravesar el exoesqueleto y llegar
así a colonizar el interior del hospedero (Evans et al., 1988). Cordyceps sensu lato
es un grupo parafilético que pertenece al Phylum Ascomycota, a la Clase
Sordariomycetes, al Orden Hypocreales y se encuentra dividido en tres familias, la
Familia Cordycipitaceae, que incluye el género teleomorfo Cordyceps y estados
asexuales como Isaria y Beauveria, la familia Clavicipitaceae incluye teleomorfos
como Claviceps y estados asexuales como Balansia y Moelleriella, la Familia
Ophiocordycipitaceae que incluye a los teleomorfos Ophiocordyceps y
Tolypocladium y estados asexuales como Polycephalomyces, Purpureocillium,
Harposporium (Sung et al., 2007a; Sung et al., 2007b; Kepler et al., 2014 y Quandt
et al., 2014). Los caracteres más consistentes de Cordyceps s.l. son el color y
textura del estroma (Sung et al., 2007a) y el hospedero que parasita que se define
como el nicho ecológico (Sanjuan, 2015). La utilización de marcadores moleculares
también es una herramienta indispensable para determinar especies y relaciones
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
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filogenéticas de este grupo, siendo los diagnósticos, la subunidad pequeña y grande
de DNA ribosomal (SSU, LSU), la primer y segunda más grande subunidad de la
RNA polimerasa II (RPB1, RPB2), el factor de elongación 1-α (Tef) (Sung et al.,
2006a; Quandt et al., 2014). La importancia de Cordyceps s.l. es agrícola,
comestible y medicinal. Estos hongos pueden controlar la densidad poblacional de
algunos insectos, por lo que algunas especies, particularmente el estado asexual
presenta importancia como control biológico. En África se ha utilizado a Metarhizium
para controlar el género Anopheles (“mosquito”), vector de malaria (Scholte et al.,
2005), así como para el control de los acrídidos (“langostas”) (FAO 2009). En
Norteamérica, Beauveria bassiana y Paecilomyces fumosoroseus se han utilizado
para controlar a la mosca blanca Bemisia argentifolii y B. tabaco, consideradas por
la IUCN (International Union for Conservtion of Nature, por sus siglas en inglés)
como especies invasivas que afectan cultivos de alfalfa, brócoli, col, algodón,
tomate, calabaza, cacahuate, sandía entre otros, (Quesada-Moraga et al., 2006;
SEDECO, 2014). Para Latinoamérica, específicamente en Brasil, Metarhizium ha
sido utilizado para controlar a Aeneolamia varia (“salivazos”) que afecta el cultivo de
alfalfa y caña de azúcar (Alves et al., 2008), en Colombia se ha encontrado a
Lecanicillium sabanense parasitando hembras de Pulvinaria caballeroramosae que
a su vez parasitan a Ficus suatensis (Chiriví-Salomón et al., 2015), por mencionar
algunos ejemplos. Cordyceps también es muy apreciado como comestible en el
continente Asiático, ya que Ophiocordyceps sinensis parasita larvas de la polilla
Hepialus sp. presenta una larga historia en la medicina china tradicional, por lo que
es considerado un alimento funcional, a este se le atribuyen propiedades
antioxidantes, antitumorales, inmunoestimulantes, antigripales y afrodisiacas. En el
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
34
Tibet es llamado “hongo caterpilar” ó “gusano de invierno, hierba de verano”,
presenta alto valor cultural y económico. En 2008 estaba valorado comercialmente
en 3,000 a 18,000US un kilogramo. Su distribución geográfica está restringida a
altitudes elevadas en Asia y su sobreexplotación ha provocado la disminución de su
población (Ng y Wang, 2005; Kumar et al., 2010; Winkler, 2010; Shrestha et al.,
2011). Debido a que O. sinensis no se ha podido obtener artificialmente a nivel de
estroma, Cordyceps militaris es utilizado como sustituto de O. sinensis, y es
cultivado a nivel industrial (Shrestha et al., 2010). Ambas especies producen
componentes bioactivos (Tan, 2010). Estos metabolitos secundarios como las
naftoquinonas, exopolisacáridos, ergosterol, carotenos y cordicepina (un análogo
de la adenosina) presentan actividades antimalarias, hipoglucémicas, antidiabéticas
anticancerígenas e inmunomodulatorias (Chen et al., 1997; Kim et al., 2001; Zhao
et al., 2002; Asaduzzaman et al., 2010). También se utilizan para tratar
enfermedades respiratorias, tales como asma, bronquitis y enfermedad pulmonar
obstructiva (COPD) e infecciones virales causadas por influenza A (Kumar et al.,
2010). Para México no se tiene un listado de las especies que se han colectado en
el país, su distribución geográfica o los usos que se han dado a estas especies., por
lo que este trabajo aporta los siguientes aspectos: primeros reportes de hongos
entomopatógenos en México, diversidad, especies utilizadas para control biológico
y su uso tradicional.
MATERIALES Y MÉTODO
La revisión de los primeros reportes de hongos entomopatógenos se hizo en el
Acervo histórico del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
35
México (UNAM). Se elaboró un listado de las especies de teleomorfos registradas
en los diferentes estados del país, mediante la revisión de las investigaciones
publicadas desde el año 1864 al 2017. Se realizó una visita al herbario MEXU del
Instituto de Biología de la UNAM y se revisaron todos los ejemplares depositados
con el nombre de Cordyceps. El uso de estados anamorfos como control biológico
y conocimiento tradicional, se llevó a cabo en buscadores electrónicos como
Google, Scientific Electronic Library Online (SciELO), en las bases de datos
Redalyc, Elsevier, Scopus, y SpringerLink. Las palabras clave utilizadas en las
búsquedas fueron: Cordyceps, hongos entomopatógenos, control biológico,
Metarhizium, Beauveria, Isaria, Paecilomyces¸ cultivo de Cordyceps y
Tolypocladium. El nombre científico de las especies se describe de acuerdo al
nombre taxonómico actual, mediante la nomenclatura del Index Fungurum.
RESULTADOS
Para México, Cordyeps sensu lato está representado por 25 especies, las cuales
incluyen estados teleomórficos y anamórficos. Están distribuidas en las tres familias
que conforman a Cordyceps sensu lato. La Familia Clavicipitaceae solo está
representada por Metharizium anisopliae (Tabla 3), la Familia Cordycipitaceae está
representada por cinco especies del género Cordyceps y cuatro estados asexuales
Tabla 4), y la Familia Ophiocordycipitaceae que presenta dos especies del género
Tolypocladium, diez del género Ophiocordyceps y tres estados asexuales del
género Hirsutella (Tabla 5).
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
36
Tabla 3. Especies de la Familia Clavicipitaceae registradas en México
Especie Hospedero Vegetación Altitud
(m)
Distribución geográfica y
Referencia
Localidad y Clave de
Herbario/Clave de
cepario
Metarhizium
anisopliae
(Sorokin,
1883)
Phyllophaga spp.
Brachistola magna
Melanoplus
differentialis
Agroecosistema:
Café, maíz,
frijol, cítricos
1137-2229 Chihuahua: Orranteño, Santa
Gertrudis, Las Varas (Barajas et al.,
2011).
Morelos: Tetela de Volcán (N
18.89462, WO 98.73398), Tlayca (N
18.70045, WO 98.84995), San
Andrés de la Cal (N 18.95696, WO
99.11691), Buenavista del Monte
(Hernández-Velázquez et al., 2011).
Chiapas (De la Rosa et al., 2000).
Michoacán: Sahuayo, Jiquilpan,
Zamora, Los Reyes, Cojumatlán
(García-Munguía et al., 2015).
Colima, Jalisco, Tamaulipas
(Lezama-Gutiérrez et al., 2001).
Coahuila (Sánchez-Peña et al.,
2010).
Querétaro (Uribe-González y
Santiago-Basilio, 2012).
Orranteño: Ma-001
(X-17)
Santa Gertrudis: Ma-
002 (X-31)
Las Varas: Ma-003
(X-040)
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
37
Tabla 4: Especies de la Familia Cordycipitaceae registradas en México
Especie Hospedero Vegetación Altitud
(m)
Distribución
geográfica y
Referencia
Localidad y Clave de Herbario
Cordyceps militaris
(Fr. Link 1818)
Pupas y larvas
de Lepidóptera
de la Familia
Saturniidae:
Paradirphia
lasiocampina,
Familia
Geometridae,
Noctuidae y
Sphingidae, y
adultos de
Coleóptera
Bosque:
mesófilo de
montaña, Pinus-
Quercus,
tropical
subcaducifolio,
tropical
perennifolio,
Abies, Abies
balsamea, Tsuga
y Picea con
árboles
deciduos.
Selva: baja
caducifolia
Matorral de
Juniperus
260-
3200
Hidalgo: Parque
Nacional el Chico, Las
Ventanas (Pérez-Silva,
1977).
Morelos: Tepoztlán,
camino al cerro del
Tepozteco (Pérez-Silva,
1977; Rubio-Bustos et
al., 1999).
Oaxaca: Huautla de
Jiménez., Sierra Ixtlán,
1 km antes de
Jacaltianguis (Pérez-
Silva, 1977), Sierra de
Ixtlán, Carretera
Oaxaca-Ixtlán, El punto
(Rubio-Bustos et al.,
1999).
Veracruz: Jalapa, Cerro
La Martinica (Pérez-
Silva, 1977), Xalapa,
2.5 km antigua carretera
Xalapa- Coatepec,
alrededores de la casa
asistencial
Parque Nacional el Chico: ENCB
32, Bush, 1966
Cerro del Tepozteco: ENCB 59,
24, Garnica., ENCB 91,26,
Magaña, 1968
Huautla de Jiménez: P. Heim,
1956
Sierra de Ixtlán: MEXU 9841,
Pérez-Silva, 1976
Cerro la Martinica: MEXU 9841,
Pérez-Silva, 1975
Ocosingo: XAL 1957, S. Chacón,
1984
Camino Lacanja-Rio Cedro
Lacanja: XAL 1974, S. Chacón,
1984
Barranca de Huentitán: IBUG
48, 96, 134, 319 L.S. Vázquez,
1986., IBUG 92, I. Álvarez, 1987.,
IBUG 506, L.S. Vázquez, 1987.,
IBUG 709, L.S. Vázquez, 1988
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
38
CONECALLI-DIF.,
Cerca del rio
Coapexpan, 2 KM al
Suroeste de Xalapa.,
Ejido Benito Juárez,
1Km al sureste del
Jardín Botánico
Francisco Javier
Clavijero (Rubio-
Bustos et al., 1999).
Chiapas: (Chacón y
Guzmán, 1984),
Ocosingo, Camino
Lacanja-Rio Cedro
Lacanja (Rubio-Bustos
et al., 1999).
Jalisco: (Mains, 1958;
Rubio-Bustos et al.,
1999), Barranca de
Huentitán., Zapopan,
parque los Colomos.,
Cuautitlán, Reserva de
la Biosfera Sierra de
Manantlán, puerto de
Escobedo., El
Tlacuache., Casimiro
Castillo, Cerro La
Petaca (Rubio-Bustos et
al., 1999; Guzmán et al.,
Zapopan: IBUG s.n., Puga, 1983.,
MEXU 9356, R. Hernández,
1983., IBUG 2064, L. Guzmán-
Dávalos, 1985., IBUG 3, N.
Carrillo, 1987., IBUG 314, 315,
316 y 317, S.Y. Rubio, 1996.
Cuautitlán: IBUG 984, M. L.
Fierros, 1995
El Tlacuache: IBUG 263, S. Y.
Rubio, 1995
Cerro la Petaca: IBUG 2, L.
Vigueras, 1988
Amecameca: ENCB 221, G.
Guzmán, 1955
Tepoztlán: ENCB 91, Magaña,
1968
Carretera Oaxaca-Ixtlán: XAL
s.n., W.S. Miller, 1961
Carretera Matamoros-
Mazatlán: IBUG 1188,
Rodríguez, 1995
Xalapa, 2.5 km: XAL 864, F.
Tapia, 1991
Cerca del rio Coapexpan: XAL
201, V.M. Bandala-Muñoz, 1985
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
39
2001), Tapalpa
(Gándara et al., 2014).
Estado de México: (Frutis et al., 1985;
Rubio-Bustos et al.,
1999), Amecameca,
Popocatépetl, Barranca
del Ameyalco (Rubio-
Bustos et al., 1999),
Ocuilan, La Haciendita.,
Tenancingo, Santo
Desierto., Villa
Guerrero, San Miguel
(Pérez-Villamares et al.,
en prensa).
Sinaloa: Carretera
Matamoros-Mazatlán,
cañada en el tramo
Durango-Mazatlán
(Rubio-Bustos et al.,
1999).
Michoacán: (Díaz-
Barriga et al., 1988;
Rubio-Bustos et al.,
1999).
Nuevo León: (Guzmán
et al., 2001).
Morelos: Cuernavaca,
Jardín Botánico
Ejido Benito Juárez: XAL 1149,
S. Chacón, 1983
Ocuilan: (18°58’44”N-
99°25’01”O): AMCIRB 29, 32,
61-69, 135-139, 211-223, J.C.
Pérez-Villamares, 2013
Tenancingo: 18°55’01”N –
99°33’31”O: AMCIRB 1-14, 41-
49, 52, 69, 73, 75, 101-125, 181-
203 J.C. Pérez-Villamares, 2013
Villa Guerrero: 18°59’38”N –
99°39’59”O: AMCIRB 16-27,
J.C. Pérez-Villamares 2013.,
AMCIRB 53-60, 97,98, 115, 143-
159, 161-166, 168, 224-240, 242-
245, J.C. Pérez-Villamares, 2014
Álamos: CESUES 536
Yécora: CESUES 3099
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
40
UAEM.,
Tlalquiltenango, Cruz
pintada., Miacatlán, 2
KM. al sur de las
pirámides de
Xochicalco (Castro et
al., 2012).
Sonora: Álamos, km 42
de la carretera Navojoa
a Alamos., Yécora, 4.8
km del camino Yécora a
Sahuaripa (Pérez-Silva
et al., 1996).
Cordyceps
polyarthra
(Möller 1901)
Pupas de
Lepidóptera
Bosque: tropical
caducifolio,
tropical con
Quercus
1300-
1650
Guadalajara: Barranca
de Huentitán., Cocula,
Sierra de Quila, El
Mirador (Rubio-Bustos,
1999).
Barranca de Huentitán: IBUG
546 L.S. Vázquez, 1987
Cocula: IBUG 271, O. Vargas,
1989
Cordyceps pruinosa
(Petch 1924)
Hospedero
desconocido
Bosque:
Tropical
Quintana Roo: Zona
Chunyaxche, cerca de
Puerto Carrillo y Puerto
Morelos (Guzmán et
al., 2001).
Zona Chunyaxche: XAL 20626,
Guzmán, 1981
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
41
Cordyceps
scarabaeicola
(Kobayasi y Shimizu
1976)
Adultos de la
Familia
Scarabaeidae:
Cotinus
mutabilis.,
Familia
Melolonthinae:P
hyllophaga sp.
Familia
Dynastinae:
Xyloryctes
thestalus
Bosque:
Quercus-Pinus,
Quercus
Ecotono entre
vegetación
arbustiva de
bosque
Juniperus y zona
agrícola
Estado de México:
Malinalco, carretera
Malinalco-Tenancingo.,
Ocuilan, La Haciendita.,
Tenancingo, Santo
Desierto (Pérez-
Villamares et al., en
prensa).
Malinalco (18°58’19”N-
99°29’40”O): AMCIRB 80, 206,
J.C. Pérez-Villamares, 2014.
Ocuilan: (18°58’44”N-
99°25’01”O): AMCIRB 28, 87, 88
J.C. Pérez-Villamares 2013
Tenancingo: (18°55’01”N-
99°33’31”O): AMCIRB 50, J.C.
Pérez-Villamares, 2013
Cordyceps
takaomontana
(Yakush y Kumaz
1941)
Pupas y larvas
de Lepidóptera
Bosque:
Quercus-Pinus
Vegetación
secundaria
arbustiva de
bosque de
Quercus
Ecotono entre
vegetación
secundaria
arbustiva de
bosque de
Juniperus y zona
agrícola
Estado de México:
Malinalco, carretera
Malinalco-Tenancingo.,
Ocuilan, La Haciendita.,
Tenancingo, Santo
Desierto del Carmen.,
Tenango del Valle, San
Pedro Tlanixco., Villa
Guerrero, San Miguel
(Pérez-Villamares et al.,
en prensa).
Malinalco:18°58’19”N-
99°29’40”O: AMCIRB 76-79, 81-
85, 126, 133, 134, J.C. Pérez-
Villamares 2014
Ocuilan:18°58’44”N-
99°25’01”O: AMCIRB 86, 89,
210, 220, J.C. Pérez-Villamares
2014
Tenancingo: AMCIRB 71, 72, 74,
J.C. Pérez-Villamares, 2014
Tenango del Valle (19°03’45”N-
99°39’07”O): AMCIRB 177-180,
100, J.C. Pérez-Villamares, 2014.,
AMCIRB 100, J.C. Pérez-
Villamares, 2013
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
42
Villa Guerrero (18°59’38”N-
99°39’59”O): AMCIRB 160, 167,
241, J.C. Pérez-Villamares, 2014
Paecilomyces
tenuipes (Peck 1901)
Pupa no
identificada
Bosque:
mesófilo de
montaña
Veracruz: Xalapa,
Parque ecológico “El
Haya” (López y García,
2002).
Beauveria bassiana
(Bals.-Criv) Vuill
1912
Coleóptera:
Phyllophaga
spp.,
Galleria
mellonella,
Hypothenemus
hampei.,
Orthoptera:
Brachystola
magna.,
Lepidóptera
Agroecosistema:
Café, maíz, frijol
1600 Morelos: Tetelilla
(18°66´01´´N-
98°79´21´´WO,
Buenavista del Monte
(Hernández-Velázquez
et al., 2011).
Chihuahua: General
Trías, Orranteño,
Delicias, Las Varas,
Alvareñas (Barajas et
al., 2011).
Chiapas (De la Rosa et
al. 2000).
Michoacán: Sahuayo,
Jiquilpina, Zamora, Los
Reyes, Cojumatlán
(García-Munguía et al.,
2015).
Coahuila (Sánchez-
Peña et al., 2010).
Tetelilla: Aislamientos
resguardadas en la Colección de
Hongos entomopatógenos del
Centro Nacional de Referencia de
Control Biológico SAGARPA-
SENASICA-DGSV
General Trías: Bb-001 (X-003)
Orranteño: Bb-002 (X-023)
Delicias: Bb-003 (X-024)
Las Varas: Bb-004 (X-036)
Alvareñas: Bb-005 (X-042)
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
43
Isaria fumosorosea
(Wize 1904)
Adultos de
Orthóptera de la
Familia
Tetigonidae,
Agroecosistema:
cítricos
Veracruz: Cerro de la
Martinica, sur de
Banderilla (Pérez-Silva,
1978).
Cerro de la Martinica: MEXU
12210, Hernández y Garrido, 1977
Isaria farinosa
(Holmsk 1832)
Pupas de
Lepidópteros
Morelos: (Guzmán et
al., 2001), Autopista
México-Cuernavaca.,
Autopista México-
Cuernavaca, Curva La
Pera, Autopista de
Cuautla 5km al oeste de
Tepoztlán (Pérez-Silva,
1977).
Oaxaca: (Guzmán et
al., 2001), Zacatepec
(Pérez-Silva, 1977).
Sin localidad (Pérez-
Silva, 1979).
Autopista México-Cuernavaca:
MEXU 3391, Miuda, 1961
Autopista México-Cuernavaca,
Curva La Pera: ENCB 88, 21,
Gimate, 1969
Autopista de Cuautla 5Km al
oeste de Tepoztlán: ENCB 6058,
Guzmán, 1967
Zacatepec: P 5850, Heim, 1959
Torrubiella spp.
(Boud. 1885)
Sobre hojas con
Sporothrix
guttuliformis
Agroecosistema:
café
150-
1700
Veracruz (Carrión y
Rico-Gray, 2002).
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
44
Tabla 5: Especies de la Familia Ophiocordycipitaceae registradas en México
Especie Hospedero Vegetación Altitud
(m)
Distribución geográfica y
Referencia
Localidad y Clave de
Herbario
Tolypocladium
capitatum (Holmsk)
(Quandt, Kepler y
Spatafora, 2014)
Ascomicetos:
Elaphomyces
granulatus y
E. variegatus
Bosque:
Pinus y
Pinus-
Quercus
1800-
3500
Durango: (Quintos et al., 1984;
Rubio-Bustos et al., 1999), Región
del Salto, Municipio de pueblo
Nuevo, Las Bayas, (Raymundo et al.,
2005).
Estado de México: Tenango del
Valle, San Pedro Tlanixco (Heim y
Wason, 1958; Guzmán, 1958, 1977;
Pérez-Silva, 1977; Guzmán et al.,
2001; Guzmán, 2008). San Cayetano,
Rio Frio, Suroeste del Nevado de
Toluca, Zoquiapan (Pérez-Silva,
1977).
Hidalgo: (Heim 1958; García-
Romero et al., 1970; Rubio-Bustos et
al., 1999), Sierra del Chico (Pérez-
Silva, 1977).
Jalisco: San Andrés Ixtlán (Pérez-
Silva et al., 1977), Tapalpa (Gándara
et al., 2014).
Puebla: (Martínez et al., 1983;
Rubio-Bustos et al., 1999).
Tenango del Valle: MEXU 3929, Herrera y
Sánchez, 1957., MEXU
3153, T. Herrera, 1956.,
MEXU 3929, Herrera et
al., 1996., MEXU 11523,
T. Herrera, 1956., P. Heim,
1956., ENCB 832,
Guzmán, 1957., ENCB
5094, Guzmán, 1963.
San Cayetano: ENCB
5094, Guzmán, 1963.
Rio Frio: ENCB 87, 28,
Montaud, 1967
SO del Nevado de Toluca: ENCB 103, Muñoz, 1967
Zoquiapan, Llano
grande: ENCB 5,
Hernández, 1972., ENCB
13-Z, Padilla, 1974
Sierra del Chico: ENCB
98, Varela, 1975
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
45
Morelos: Lagunas de Zempoala, San
José Tlacotenco, Faldas de Tepozteco
(Pérez-Silva, 1977).
Michoacán: (Díaz-Barriga et al.,
1988; Rubio-Bustos et al., 1999).
Tamaulipas: (Heredia, 1989; Rubio-
Bustos et al., 1999).
Oaxaca: Huautla de Jiménez,
Juquilla, Carretera Oaxaca-Tuxtepec
(Pérez-Silva et al., 1977).
Veracruz: (Guzmán y Villareal,
1984; Heredia, 1989; Rubio-Bustos et
al., 1999).
San Luis Potosí: (Rubio-Bustos et
al., 1999), Puerto a Hurta (Pérez-
Silva, 1977).
Sonora: Yécora, km 258 de la
carretera Hermosillo a Yécora (Pérez-
Silva et al., 1996).
San Andrés: ENCB
11926, Guzmán, 1974
Lagunas de Zempoala: ENCB 8376, Guzmán,
1970.
San Juan Tlacotenco: MEXU 9635, Pérez-Silva,
1974.
Faldas de Tepozteco: MEXU 11569, Martínez,
1976
Huautla de Jiménez: P.
5540, Heim, 1959.
Juquilla: P. 92, Heim,
1956
Carretera Oaxaca-
Tuxtepec: MEXU 10583,
Pérez-Silva, 1976
Puerto a Huerta: ENCB
s.n, Medellín, 1968
Yécora: CESUES 3068
Tolypocladium
ophioglossoides (J.F. Gmel.)
(Quandt, Kepler y
Spatafora, 2014)
Ascomicetos:
Elaphomyces
granulatus y E.
reticulatus
Bosque:
Pinus y
Quercus
Durango: Región del Salto, Arroyo
Santo Domingo (Pérez-Silva, 1977).
Estado de México: (Trappe y
Guzmán, 1971; Guzmán et al., 2001),
Tenango del Valle (Heim y Wason,
Región del Salto, Arroyo
Santo Domingo: ENCB
1628, Guzmán, 1961
Tenango del Valle: ENCB
1628, Guzmán, 1958.,
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
46
1958; Pérez-Silva, 1977). Zona este
del Nevado de Toluca “Barranca del
Diablo”, Cerca de San Pedro Tlanixco
(Pérez-Silva, 1977).
Hidalgo: Sierra el Chico “Las
ventanas” (Pérez-Silva, 1977).
Michoacán: (Díaz-Barriga et al.,
1988).
Oaxaca: Huautla de Jiménez, Cerro
Clarín (Pérez-Silva, 1977).
Sonora: Álamos, Rancho Las
Uvalamas (Pérez-Silva et al., 1996).
San Luis Potosí: (Guzmán, 1958;
Guzmán et al., 2001).
MEXU 11685, Herrera y
Sánchez, 1956
Nevado de Toluca
“Barranca del Diablo”:
ENCB 1736, Guzmán,
1958
Cerca de San Pedro
Tlanixco: ENCB 1642,
Guzmán, 1958
Sierra el Chico “Las
ventanas”: ENCB 120,
Varela, 1975
Huautla de Jiménez: P.
92-bis, Heim, 1958
Álamos: CESUES 1796a
Ophiocordyceps
melolonthae
(Tul y Tul) (Sung,
Sung, Hywel-
Jones y Spatafora,
2007)
Larvas y
adultos de
Coleóptera de
la Familia
Melolonthidae:
Enema
endymion,
Strategus
aloeus y
Phyllophaga
sp.
Bosque:
Pinus-
Quercus,
húmedo
subtropical
(Calophyllu
m, Tapirira,
Laplacea,
Terminalia,
Mosquitoxyl
um,
Vochysia,
150-
1925
Chiapas: (Chacón y
Guzmán, 1983), Tuxtla
Gutiérrez (Pérez-Silva,
1977), Tenejapa, Villa Las
Rosas (Guzmán et al., 2001).
San Pedro Chenalho
(16°55´04.2´´lat. N,
92°30´57.6´´ long. O;
16°55´22.2´´ lat. N,
92°38´02.5 long. O),
Tenejapa (16°55´20.2´´ lat
Tuxtla Gutiérrez: MEXU 11524,
Palacios, 1959., P Heim, 1959
Tenejapa: Colección entomológica
del IE, Robles, 1999
Villa Las Rosas: Colección
entomológica del IE y en ECOSUR
en San Cristóbal de las Casas,
Alcazar, 1999
Cuautitlán: IBUG 292, Rubio, 1995
Oaxaca: XAL Wolf, 1998: 2559-1,
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
47
Enterolobiu
m, Quercus,
Podocarpus
y Pinus
chiapensis)
Selva alta
perennifolia
Agroecosist
ema: cafetal
N, 92°29´05.3´´ long. O)
(Robles et al., 2006).
Jalisco: (Chacón y Guzmán,
1983; Guzmán et al., 2001),
“Cuautitlán, Reserva de la
Biosfera Sierra Manantlán,
predio las Joyas, cuatro
caminos” (Rubio-Bustos et
al., 1999).
Oaxaca: Al oeste de la
Sierra Madre del Sur, al este
del Itsmo de Tehuantepec,
31 Km al noreste de Lázaro
Cárdenas y Escuilapa, a los
alrededores de Santa María
Chimalapa, al oeste de Cerro
Azul (Guzmán et al., 2001).
Veracruz: Catemaco, ejido
López Mateos (Guzmán et
al., 2001).
Morelos: Cuernavaca,
Jardín Botánico UAEM
(Castro-Bustos et al., 2012).
2559-3, 2559-4, 2559-5, 2559-6,
2559-10, 2559-11 2559-12, 2559-14,
2559-1., ECOSUR: 2559-8, 2559-9,
2559-13., K: 2559-2., NY: 2559-7
Catemaco: XAL 4001, Chacón,
1987.
San Pedro Chenalho: ECOSUR L.
Robles, 1999: 201, 202, 245, 424,
426.
Ophiocordyceps
dipterigena (Berk
y Broome) (Sung,
Sung, Hywel-
Díptero:
Eucalliphora y
Phaenicia
sericata
Bosque:
húmedo
subtropical
Veracruz: Xalapa, Parque
Ecológico “El Haya”
(López-García, 2009).,
Jardín Botánico del Instituto
de Ecología Xalapa
Jardín Botánico del Instituto de
Ecología Xalapa: XAL 15 Ramírez-
Guillén, 1997., XAL 456, Jarvio,
2000
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
48
Jones y Spatafora,
2007)
(Guzmán et al., 2001; Medel,
2013).
Ophiocordyceps
entomorrhiza
(Dicks) (Sung,
Sung, Hywel-
Jones y Spatafora,
2007)
Larvas de
Lepidóptera de
la Familia
Noctuidae
Bosque:
mesófilo de
montaña
Agroecosist
ema: cafetal
1460 Veracruz: (Chacón y
Guzmán, 1983, 1995;
Chacón et al., 1995; Rubio-
Bustos et al., 1999), Xalapa,
Jardín Botánico Francisco
Javier Clavijero, Parque
Ecológico “El Haya”
(López y García, 2002),
Xalapa km.2.5 antigua
carretera Xalapa-Coatepec,
alrededores de la casa
Asistencial CONECALLI-
DIF., Jardín Botánico
Francisco Javier Clavijero.,
Xico, Barranca del Techolo
(Rubio- Bustos et al., 1999).
Xalapa a 1.5 a Pacho
(Pérez-Silva, 1978; Medel,
2013).
Estado de México: Villa
Guerrero, San Miguel
(Pérez-Villamares et al., en
prensa).
Xalapa Km. 2.5 antigua carretera
Xalapa-Coatepec: XAL 326, Tapia,
1990
Jardín Botánico Francisco Javier
Clavijero: XAL 112, 171, 172, 184,
187, 207, 214, 215, 225, 244, D.
Brown, 1981., XAL 4215, S.
Chacón, 1989., XAL 461, R. Medel,
1981., XAL 770,734, 751, D.
Brown, 1982.
Xico, Barranca del Techolo: XAL
2768, s. Chacón, 1984., XAL 13400,
F. Ventura 1976.
Xalapa a 1 ½ a Pacho: MEXU
12209, 12211 M.A. Flores 1977.
Villa Guerrero (18°59’38”N-
99°39’59”O): AMCIRB 91-96, 99,
169-176, J.C. Pérez-Villamares,
2014
Ophiocordyceps
humbertii
(C.P. Robin)
(Sung, Sung,
Oaxaca (Ulloa y Benavides,
1991; Rubio-Bustos et al.,
1999).
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
49
Hywel-Jones y
Spatafora, 2007)
Ophiocordyceps
gracilis (Grev.)
(Sung, Sung,
Hywel-Jones y
Spatafora, 2007)
Larvas de
Lepidóptera de
la Familia
Noctuidae
Bosque:
tropical
caducifolio,
mesófilo de
montaña
Vegetación
inducida
Ecotono
entre
vegetación
secundaria
de bosque
Juniperus y
una zona
agrícola
1300-
1640
Jalisco: Barranca de
Huentitán, Zapopan, Las
Agujas, Nextipac, Centro
Universitario de Ciencias
Biológicas y Agropecuarias,
Universidad de Guadalajara
(Rodríguez et al., 1993;
Rubio-Bustos et al., 1999;
Medel et al., 1999; Medel,
2013).
Veracruz: Xico, Cofre de
Perote, Los Gallos (Chacón
y Guzmán, 1983, 1995;
Chacón et al., 1995;
Guzmán et al., 2001),
Banderilla, Cerro la
Martinica., Xalapa, Rio
Coapexpan (Rubio-Bustos
et al., 1999).
Estado de México:
Malinalco, carretera
Malinalco- Tenancingo
(Pérez-Villamares et al., en
prensa).
Barranca de Huentitán: IBUG 127,
L.S. Vázquez, 1986.
Zapopan: IBUG 45, I. Álvarez,
1987., IBUG 4857, L. Guzmán-
Dávalos, 1989., IBUG 14, Torres, s.f.
Xico: XAL 661, Bandala
Banderilla: XAL 1357 Bandala
Malinalco: AMCIRB 34, 35, J.C.
Pérez-Villamares, 2013., AMCIRB
128-132, J.C. Pérez-Villamares, 2014
Ophiocordyceps
gracilioides
(Kobayasi) (Sung,
Larvas de
Coleóptero
Selva baja
caducifolia
1104-
1200 Estado de México:
Malinalco, carretera
Malinalco-Tenancingo
Malinalco (18°58’19”N-
99°29’40”O): AMCIRB 36-40, 127,
J.C. Pérez-Villamares, 2014
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
50
Sung, Hywel-
Jones y Spatafora
2007)
Ecotono
entre
vegetación
secundaria
arbustiva de
bosque de
Juniperus y
zona
agrícola
(Pérez-Villamares et al., en
prensa).
Morelos: Miacatlán, 2 km
al sur de las pirámides de
Xochicalco., Coatlán del
Rio, Michapa (Castro-
Bustos et al., 2012).
Ophiocordyceps
sphecocephala
(Klotzsch ex
Berk) (Sung,
Sung, Hywel-
Jones y Spatafora,
2007)
Adulto de
Himenóptera
del género
Polistes
Bosque de
Quercus,
tropical
caducifolio
Selva:
tropical
perturbada,
baja
caducifolia
1000 Jalisco: (Chacón y Guzmán,
1983; Rodríguez et al.,
1993; Guzmán et al., 2001),
Carretera Guadalajara-La
Piedad, Barranca del Río
Santiago (Pérez-Silva,
1977), Pihuamo entre el
Vallecito y Las Encinas
(Rubio-Bustos et al., 1999).
Oaxaca: (Ulloa y
Benavides, 1991).
Morelos: Tlalquiltenango,
Cruz pintada., Miacatlán, 2
km al sur de las pirámides
de Xochicalco (Castro-
Bustos et al., 2012).
Carretera Guadalajara-La Piedad: ENCB 12352, Guzmán, 1975
Pihuamo: IBUG 7021, L. Guzmán-
Dávalos, 1997.
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
51
Ophiocordyceps
stylophora (Berk
y Broome) (Sung,
Sung, Hywel-
Jones y Spatafora,
2007)
Adulto de
Himenóptera:
Polistes
instabilis
Larvas de
Coleóptera
Bosque:
Quercus-
Pinus
El ejemplar
no
concuerda
porque C.
stylophora
parasita
Coleópteros
, y el tamaño
de los
estromas
difiere, por
lo que tal
vez es una
nueva
especie
(Rubio-
Bustos
1999)
10 Jalisco: Sin localidad
(Herrera y Ulloa, 1998),
Chamela (Pérez-Silva,
1978; Rubio-Bustos et al.,
1999).
Estado de México: Tenancingo, Santo Desierto
El Carmen (Pérez-
Villamares et al., en prensa)
La Huerta, Estación Biológica
Chamela: MEXU 12212, Pérez-
Jiménez 1977
Tenancingo (18°55’01”N-
99°33’31”O): AMCIRB 12, 15, 51,
J.C. Pérez-Villamares, 2013
Ophiocordyceps
sobolifera
(Hill y Watson)
(Sung, Sung,
Hywel-Jones y
Spatafora, 2007)
Ninfas de
Homóptera de
la Familia
Cicadidae
Bosque:
Xerófilo
con
Quercus
Guanajuato: (Guzmán et
al., 2001).
Coahuila: Faldas del Cerro
del Mercado, cerca de
Monclova (Rubio-Bustos et
al., 1999).
Faldas del Cerro del Mercado: ENCB 1279, R. Valenzuela, 1981
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
52
Sonora (Méndez-Mayboca
et al., 2007).
Sin Localidad: (Mains,
1951, 1955, 1958; Pérez-
Silva, 1979; Petch (1933-
1934; Urbina, 1881).
Ophiocordyceps
octospora (M.
Blackw. Y Gilb)
(Sung, Sung,
Hywel-Jones y
Spatafora, 2007)
Jalisco (Blackwell y
Gilbertson, 1984; Guzmán
et al., 2001).
Hirsutella
stylophora
(Mains 1952)
Adultos del
orden
Himenóptera
Jalisco: Chamela (Pérez-
Silva, 1978).
Chamela: MEXU 12212, Pérez-
Jiménez, 1977
Hirsutella
thompsonii (F.E.
Fisher 1950)
Tetranychus
urticae, Aceria
guerreronis,
Phyllocoptruta
oleivora,
Brevipálpidos
phoenicics
Cultivo de
cítricos
Sin Localidad (Mier et al.,
1989, 1992; Sampedro y
Rosas, 1989; Guzmán et al.,
2001).
Colima: Llanura costera de
Tecomán (Boca de Apiza,
Tecomán, El Real, El
Paraíso), Llanura costera de
Cuyutlán (Playa de Oro,
Cuyutlán) y Valle del río
Armería (Los Amiales)
Colima: Clave en el cepario:
HtM130, 131, 135, 137,138, 150,
152, 155,160, 164.
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del Género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Lorena López Rodríguez
53
(Rosas-Acevedo y
Sampedro-Rosas, 2006).
Hirsutella
citriformis
(Speare 1920)
Hemíptera:
Diaphorina
citri
Tabasco, Yucatán,
Quintana Roo, Campeche,
Chiapas, Veracruz,
Colima
(Pérez-González et al.,
2015).
Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Por. Lorena López Rodríguez
54
Familia Clavicipitaceae. Es la menos representada, solo con Metarhizium anisopliae, se
ha registrado de siete estados con diferentes tipos de climas, de cultivos de café, maíz,
cítricos y frijol.
Familia Cordycipitaceae. Presenta cinco reportes de teleomorfos, siendo Cordyceps
militaris la especie con mayor número de reportes y mayor distribución geográfica.
Familia Ophiocordcycipitaceae. Es la más diversa y colectada ya que Tolypocladium
capitatum ha sido registrada de 12 estados del país, siguiendo T. ophioglossoides. El
género Ophiocordyceps está representado en siete estados, siendo Veracruz, Oaxaca y
Jalisco donde se registran más de tres especies, los cuales presentan una compleja
geografía ya que son atravesados por distintos sistemas montañosos y presentan climas
tropicales y templados.
Investigaciones de Ciencia Aplicada con entomopatógenos: Se ha estudiado el
porcentaje de infección in vitro e in situ de cuatro estados asexuales de aislados
obtenidos en diferentes estados de México, de cultivos de maíz, frijol, café y cítricos
(Tabla 6). También se ha utilizado para controlar insectos que transmiten enfermedades
por lo tanto presentan potencial para ser utilizados como control biológico de insectos
plaga de cultivos con importancia alimenticia-económica y de insectos transmisores de
enfermedades.
.
55
Tabla 6: Estados asexuales de Cordyceps sensu lato utilizados como control biológico de insectos en México
Controlador
biológico
Hospedero Cultivo
afectado/enfermedad
controlada
Referencia
Metarhizium
anisopliae
Diaphorina citri
Brachystola
magna
Phyllophaga
spp.
Spodoptera
frugiperda
Aedes aegypti
Citrus sp. (lima persica)
Phaseolus vulgaris (frijol)
Zea mays (maíz)
Zea mays (maíz)
Dengue
Lezama-Gutiérrez et
al. (2012)
Barajas et al. (2011)
Hernández-Velázquez
et al. (2011)
Lezama et al. (2005)
García-Munguía et al.
(2015)
Beauveria
bassiana
Phyllophaga spp
Brachystola
magna
Aedes aegypti
Zea mays (maíz)
Phaseolus vulgaris (frijol)
Dengue
Hernández-Velázquez
et al. (2011)
Barajas et al. (2011)
García-Munguía et al.
(2015)
Isaria
fumosorosea
Diaphorina citri Citrus sp. (lima persica) Lezama-Gutiérrez et al.
(2012)
Hirsutella spp. Diaphorina citri Citrus spp. Pérez-González et al.
(2015)
Uso tradicional. El uso tradicional de especies de Cordyceps sensu lato solo se ha
reportado para dos especies, Tolypocladium capitata y T. ophioglossoides en el Centro
de México (Tabla 7).
.
56
Tabla 7: Especies de Tolypocladium con uso tradicional en el Centro de México.
Especie Nombre
común
Uso Lugar Observaciones Referencias
Tolypocladium
capitata
T.
ophioglossoides
Hombrecitos Efectos
curativos
(mezclados
con
Psilocybe)
Alucinógeno
Sagrado
Tenango del
Valle y San
Pedro
Tlanixco,
Estado de
México
Es utilizado por los
nahuas en ceremonias
sagradas cuando
también consumen a
Psilocybe muliercula
o P. sanctorum y
Elaphomyces
granulatus conocido
como gran mundo.
Heim y Wason
(1958),
Guzmán (1958,
1977)
Pérez-Silva
(1977)
Guzmán (2008)
DISCUSIONES
El primer mexicano interesado en conocer lo que en su tiempo nombraban “animal-
planta” fue Rio de la Loza (1864), quien fue un médico cirujano farmacéutico. En ese
tiempo se creía que en la naturaleza habitaba un animal herbívoro que cavaba la tierra y
al lado o dentro de él germinaba una semilla que posteriormente implantaba en este sus
radículas lo cual causaba su muerte. A partir de esta premisa Rio de la Loza identificó al
“animal” (hospedero) y cuantificó cenizas de la “planta” que emergía de este (estroma),
con lo que concluyó que el animal era un insecto hemíptero de la Familia Cicadidae
(Cicada communis) y la planta era una excrecencia de naturaleza animal (figura 5).
Figura 5: Dibujo de larva-ninfa. A. con ramificaciones que parten de la cabeza y terminan en punta, B. con
ramificaciones que terminan en coliflor, C. larva ninfa dividida longitudinalmente a la mitad, D. extremidad
anterior del artrópodo que le sirve para cavar la tierra (Tomado de: Rio de la Loza, 1864).
.
57
Posteriormente Urbina (1881) y Sánchez (1886) fueron los primeros en determinar a
estos “animal-planta raro” en hongos entomopatógenos de insectos.
Urbina (1881) determinó que la excrecencia presente en la parte anterior de larvas de
cicada (hemíptero) era un hongo llamado Sphaeria sobolifera (actualmente
Ophiocordyceps sobolifera). Posteriormente, Sánchez (1886) discutió acerca de los
“tlalomites”, nombre designado a una larva de insecto parasitado por hongos del género
Cordyceps que consumían los indios aztecas. La especie descrita por Sánchez (1886)
fue posteriormente identificada por Pérez-Silva (1979) como Cordyceps cosmopsaltria.
Los primeros reportes de hongos micopatógenos de Cordyceps s.l. los dió Mains (1957,
1958) quién describió a Tolypocladium capitatum como Cordyceps canadiensis en
Hidalgo y a Ophiocordyceps sobolifera como C. sobolifera en Jalisco. Al mismo tiempo,
Heim y Wasson (1958) registraron a T. capitatum como C. capitata y a T. ophioglossoides
como C. ophioglossoides para el Estado de México.
Por otra parte los estudios pioneros de diversidad de Cordyceps en México los realizaron
principalmente Pérez-Silva (1977), Pérez-Silva et al. (1978, 1996), Rubio-Bustos (2000)
y Guzmán et al. (2001), los demás registros se han dado por investigaciones de
diversidad general de ascomicetos.
Hasta ahora todos los estudios de diversidad han utilizado caracteres morfológicos, sin
integrar caracteres ecológicos y moleculares, así como tampoco se han realizado
estudios sobre las relaciones evolutivas de estos organismos. Por su parte Almaraz-
Sánchez et al. (2012) han utilizado marcadores moleculares ITS, excluyendo los
marcadores LSU, SSU, RPB1, RPB2 y TEF, los cuales de acuerdo a Sung et al. (2006),
.
58
Quandt et al. (2015) y Sanjuan et al. (2014) son los caracteres moleculares diagnósticos
de hongos entomopatógenos.
Con respecto a la diversidad, México se encuentra ubicado entre la zona neártica y
neotropical lo que implica una topografía, orografía y climas diferentes, lo que está
directamente relacionado con la diversidad que presenta y por lo tanto la zona
biogeográfica neotropical es considerada una zona “hot spot”(Sanjuan et al., 2015), por
lo que México ocupa el cuarto lugar como país megadiverso (Pérez-Silva, 1977), por lo
tanto las 24 especies registradas del complejo Cordyceps sensu lato podrían aumentar,
si se realizaran estudios dirigidos específicamente a conocer la diversidad y relaciones
filogenéticas de este grupo.
La Familia Clavicipitaceae está representada por Metarhizium anisopliae. Ésta es
frecuentemente aislada de suelos, un amplio rango de insectos y es encontrada en
regiones tropicales y templadas, por lo que es considerada una especie generalista
(Bischoff et al., 2009). Las especies de este género son usadas como control biológico y
agentes para manejo y prevención de infestaciones principalmente de la Familia
Acridoidea. Otros estudios también han demostrado que reduce en un 75% la intensidad
de infección de malaria (Scholte et al., 2005). En México la utilización de estados
asexuales de Metarhizium sp. y Beauveria sp. prevalecen como control biológico en
cultivos de maíz y frijol que forman parte de la canasta básica para la población mexicana
(Barajas et al., 2011; Hernández-Velázquez et al., 2011), por lo que su estudio se ha
basado en su importancia agrícola y por lo tanto económica.
La Familia Cordycipitaceae, está representada principalmente por el género Cordyceps
y algunos anamorfos. Cordyceps es considerado el género más diverso en número de
.
59
especies y de hospederos (Sung et al., 2007a).Cordyceps militaris, ha sido registrada en
doce estados del país y puede ser considerada como especie cosmopolita (Rubio-Bustos
et al., 1999), Mains (1958) y Pérez-Silva (1977) la cito con amplia distribución en
Norteamérica, Europa y Asia. Guzmán (1977) la cito por primera vez para el Estado de
México. Cordyceps militaris se ha registrado en pupas y larvas de la Familia Noctuidae,
Shingidae y Geometridae en México en diferentes tipos de bosques desde templados
hasta tropicales y en vegetación inducida (Rubio-Bustos et al., 1999), lo cual indica que
su distribución no está determinada en primera instancia por la vegetación o clima, si no
por el hospedero, aunque la mayoría de las veces se ha registrado en climas húmedos
tropicales (Shrestha et al., 2016). Su importancia es comestible, medicinal y económica
ya que en Korea, Japón y Asia es consumida debido a las propiedades medicinales que
se le atribuyen y por la producción de metabolitos secundarios como la cordicepina con
actividad anticancerígena, antibiótica y antifúngica (Ng y Wang, 2005; Shrestha et al.,
2016).
La Familia Ophiocordycipitaceae está representada con el mayor número de especies de
Cordyceps s.l. en México, con registros en 12 estados del país, siendo Ophiocordyceps
el género con diez especies registradas, es considerado el género más diverso de
Hypocreales (Sung et al., 2007a). A nivel mundial la Familia Ophiocordycipitaceae
comprende cerca de 160 especies, estas infectan un amplio número de insectos,
parasitan a once ordenes: Coleóptera, Blattaria, Dermáptera, Díptera, Hymenotera,
Hemíptera, Isóptera, Lepidóptera, Mantodea, Orthoptera y Odonata (Evans et al., 2011;
Araújo y Hughes, 2014). Ophiocordyceps melolonthae se ha encontrado en diferentes
tipos de vegetación como, selva perennifolia, bosque de pino-encino, bosques húmedos
.
60
subtropicales y agroecosistemas como cafetales, siempre se encuentra parasitando
larvas y adultos de coleópteros de la Familia Melolonthidae (Perez-Silva, 1977; Rubio-
Bustos et al., 1999), por lo que su distribución también está relacionada con el hospedero.
Ophiocordyceps dipterigena, se ha registrado solo para el estado de Veracruz en bosque
húmedo subtropical sobre dípteros (Guzmán et al, 2001; Medel, 2013) esta especie
presenta importancia biotecnológica ya que produce un exobiopolímero que induce la
producción de interleucinas IL-8 por fibroblastos, lo cual es útil en la aplicación como
material de curación, también debido a sus propiedades de alta viscosidad y humectante
se puede utilizar como sustituto del ácido hialurónico en la industria farmacéutica
(Kocharin et al., 2010). Ophiocordyceps entomorrhiza, solo ha sido reportada para
Veracruz y para el Estado de México, es una especie similar a Ophiocordyceps gracilis
por lo que puede ser confundida (Guzmán et al., 2001). Pérez-Villamares et al. (en
prensa), menciona que O. gracilis parasita larvas de Lepidóptera y O. entomorrhiza solo
se ha encontrado parasitando larvas de Coleóptera, por lo que probablemente está
restringida a este orden. Ophiocordyceps gracilioides solo se ha reportado en larvas de
Coleópteros en dos estados del país (Kobayasi, 1941; Li et al., 2002; Castro et al., 2012;
Pérez-Villamares et al., en prensa), es una especie muy rara de encontrar y especialista
de Coleópteros. En México, se ha registrado ha Ophiocordyceps sphecocephala como
parasito de Polistes, en Japón, China, Korea y Nepal se ha encontrado sobre avispas del
género Aphrophora spp. (Shrestha, 2011). Ophiocordyceps stylophora, se ha descrito
sobre larvas de Coleóptero (Pérez-Villamares et al., en prensa) y sobre Hymenópteros,
en México se ha descrito el teleomorfo y la fase asexual como Hirsutella stylophora
.
61
(Pérez-Silva, 1978). Ophiocordyceps sobolifera se ha descrito sobre ninfas de cicada, y
su anamorfo se ha descrito como Beauveria sobolifera (Liu et al., 2001).
Tolypocladium parasita hongos hipógeos del género Elaphomyces y ninfas de la familia
Cicadidae. Se tiene la hipótesis de que al ser el mismo hábitat subterráneo en raíces y
cerca de árboles de Cicadas y Elaphomyces, Tolypocladium realizó un salto de
hospedero (Nikoh y Fukatsu, 2000). Tolypocladium capitatum y T. ophioglossoides son
las especies con mayor número de registros en diferentes lugares de México, siendo
ampliamente recolectado con Elaphomyces spp. en bosques de pino-encino, ya que es
el hábitat de su hospedero. En el Estado de México se ha obtenido con Elaphomyces
spp. y Psilocybe muliercula, lo que está directamente relacionado a su uso tradicional por
el grupo indígena nahua del Estado de México, donde dichas especies presentan un
nombre común y son consumidos en rituales (Guzmán, 2008). T. capitatum y T.
ophioglossoides fueron citadas por Heim y Wason (1958) por primera vez para México
y posteriormente se siguieron registrando con el nombre común de “hombrecitos”
(Guzman, 2008). T. ophioglossoides se ha reportado con amplia distribución para el
hemisferio norte: E.U.A., Rusia y Japón (Mains, 1957; Pérez-Silva, 1977), y por lo tanto
también para México. Es importante mencionar que los nahuas les atribuyen
propiedades medicinales a ambas especies (Heim y Wason, 1958). Por otra parte T.
ophioglossoides produce ophiocordin, con propiedades antibióticas y antifúngicas
(Kneifel et al., 1997) y ophiosetin con propiedades antibióticas (Putri et al., 2010). Sin
embargo, en México se desconoce el aprovechamiento tradicional y tradicional-comercial
de Cordyceps sensu stricto y del género Ophiocordyceps.
.
62
El uso de Tolypocladium ha sido escasamente reportado y el lapso de tiempo entre los
reportes deja un vacío de información que indica la importancia de investigar el
conocimiento tradicional de Cordyceps s.l. en más lugares del país, en asentamientos
nahuas y también de otros grupos indígenas, así como analizar las propiedades
bioquímicas y medicinales de las diferentes especies que forman parte de este grupo tan
complejo e interesante. A pesar de que en el continente oriental se ha estudiado
ampliamente la taxonomía, cultivo in vitro y bioquímica de ascomicetos
entomopatógenos, en México el estudio en general de Cordyceps sensu lato es escaso.
Es importante mencionar que los hongos entomopatógenos generalistas presentan una
diversidad de hospederos y pueden ser encontrados en un amplio rango geográfico como
Metarhizium, o especies especialistas, como por ejemplo Cordyceps unilateralis que
parasita adultos de Hymenoptera: Formicidae del género Camponotus rufipes, C. balzani,
C. melanoticusand, C. novogranadensis (Evans et al., 2011). En México no se ha
registrado a Cordyceps unilateralis, especie pleomórfica (Sanjuan et al., 2001). Aunque
Evans y Samson, (1984) propusieron que la asociación Camponotus-C. unilateralis es la
dominante entre hongos y hormigas en el trópico, la diversidad y abundancia de las
hormigas está determinado por la temperatura y la altitud, siendo escasas en bosques de
coníferas o bosques tropicales densos que se encuentran por arriba de los 2500msnm,
en contraste, son diversas y abundantes en los bosques subtropicales de baja altitud y
en los desiertos cálidos de todo el mundo (Brown, 1973; Fernández, 2001), aunado a que
probablemente el sistema montañoso en México tiene un papel como barrera geográfica
que no ha permitido la distribución de C. unilateralis de América del sur hacia México.
.
63
Por último consideramos sería importante iniciar un estudio de diversidad utilizando
caracteres morfológicos, moleculares y ecológicos, para determinar las relaciones
ecológicas y evolutivas de las especies. Así como también determinar los mecanismos
de infección, investigar su uso tradicional, analizar los componentes con actividad
medicinal que presentan, y determinar las condiciones óptimas de su cultivo in vitro a
nivel de cepa y estroma, ya que son tópicos parcialmente o totalmente desconocidos para
especies silvestres de México.
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Tesis de Maestría. Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato en México. Por. Lorena López Rodríguez
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CAPITULO II. Nuevos registros de Cordyceps en el Centro de México con posible potencial medicinal
RESUMEN
Cordyceps sensu stricto es un grupo de hongos entomopatógenos que pertenecen a la Familia Cordycipitaceae. En México, son escasos los estudios enfocados a este grupo y solo se tiene el registro de cinco teleomorfos y cuatro estados asexuales. En esta investigación se registran por primera vez para México dos especies de Cordyceps, de acuerdo a análisis genéticos, Cordyceps sp. 1. y Cordyceps sp. 6. El análisis genético para Cordyceps sp. 1 presentó afinidad en la región LSU del 99.1% a Cordyceps submilitaris y Cordyceps ningxiaensis y en la región ITS 96.3% de afinidad con Cordyceps submilitaris. Cordyceps sp. 6 presentó afinidad en la región LSU del 99.1% a Cordyceps submilitaris y Cordyceps ningxiaensis, y con ITS un 98.8% de afinidad con Cordyceps submilitaris. Estas son las primeras secuencias obtenidas de ITS y LSU de dos teleomorfos de Cordyceps para México. Además se obtuvo el estado anamorfo por aislamiento vegetativo, las cepas aisladas producen conidiosporas y presentan características similares a Cordyceps militaris, lo que indica su potencial para cultivo in vitro. A pesar de ello, se desconoce su potencial medicinal y de control biológico en insectos plaga. Se presenta información de las primeras cepas obtenidas de teleomorfos de Cordyceps en México.
ABSTRACT
Cordyceps sensu stricto (Cordyceps s.s.) is a complex group of ascomicetes fungi parasites of arthropods. In Mexico are little the studies these group and only there are the report of five teleomorphs and four asexual states of Cordyceps sensu stricto. In this research, are registered for first time for Mexico, two species of entomopathogenic fungus, Cordyceps sp. 1 and Cordceps sp. 6. In genetic analyzes, Cordyceps sp. 1 showed affinity in the LSU región of 99.1% to Cordyceps submilitaris and Cordyceps ningxiaensis, and in the ITS region showed 96.3% affinity to Cordyceps submilitaris. Cordyceps sp. 6 showed affinity in the LSU region of 99.1% to Cordyceps submilitaris and Cordyceps ningxiaensis and with ITS region a 98.8% affinity to Cordyceps submilitaris. These are the first sequences obtained from ITS and LSU of two teleomorphs of Cordyceps in Mexico. In addition, the anamorph state was obtained by vegetative isolation. The strains obtained produced spores and presented characteristics similar to Cordyceps militaris, which indicates potential for its in vitro culture. However its medicinal potential and biological control of insects pests is unknown. It is also important to mention that these are the first strains obtained from Cordyceps teleomorphs in Mexico.
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
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PALABRAS CLAVE
hongos entomopatógenos, Hypocreales, Cordyceps militaris, Cordyceps submilitaris, aislamiento vegetativo
KEY WORDS
Entomopathogenic fungi, Hypocreales, Cordyceps militaris, Cordyceps submilitaris,
vegetative isolation
INTRODUCCIÓN
Cordyceps sensu lato es un grupo de ascomicetos entomopatógenos que parasita a artrópodos en sus diferentes estadíos del ciclo de vida y también parásita otros hongos del género Elaphomyces (Mains, 1958; Sung et al., 2007a; 2007b). Este grupo parafilético presenta teleomorfos con importancia comestible y medicinal como Ophiocordyceps sinensis y Cordyceps militaris, y estados asexuales con importancia biológica, ya que se utilizan como controladores biológicos. Por ejemplo, Metarhizium se usa en Brasil para controlar Aeneolamia spp. que afecta el cultivo de alfalfa y caña de azúcar (Alves et al., 2008), en África se utiliza para controlar los mosquitos del género Anopheles, vectores de malaria (Scholte et al., 2005), así como también para el control de diferentes especies de la familia Acrididae (FAO, 2009).
A nivel mundial se han reportado cerca de 450 especies de hongos entomopatógenos (Kirk et al., 2001), sin embargo se estima que existen 750 especies (Sung, 1996).
La clasificación taxonómica de Cordyceps s.l. se ha modificado a través del tiempo, ya que en un principio se utilizaban caracteres morfológicos (Masse, 1895; Mains, 1957, 1958; Kobayasi, 1941, 1982). Sin embargo debido a su complejo polimorfismo intra-específico, actualmente se utilizan caracteres moleculares mediante los marcadores moleculares, ITS, LSU, SSU, RPB1, RPB2 y TEF1 (Sanjuan et al., 2015). Ademas, se utilizan caracteres morfológicos diagnósticos, como el color y la textura del estroma, así como el nicho ecológico, en este caso el hospedero (Sung et al., 2007a, 2007b; Sanjuan, 2015).
Actualmente la clasificación taxonómica es la siguiente (Sung et al., 2007a; 2007b; Kepler et al., 2014 y Quandt et al., 2014): Familia Clavicipitaceae: incluye el género Metarhizium (anteriormente Metacordyceps), Familia Cordycipitaceae: incluye a Cordyceps sensu stricto y la Familia Ophiocordycipitaceae: incluye a Ophiocordyceps y Tolypocladium (anteriormente Elaphocordyceps).
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En México, la identificación de entomopatógenos pertenecientes a Cordyceps sensu lato y Cordyceps sensu stricto se ha realizado mediante el uso de caracteres morfológicos. Hasta el momento se han descrito 25 especies que incluyen teleomorfos y estados asexuales para México (ver capítulo 1).
En el presente estudio se realizó la identificación molecular de dos especies de Cordyceps presentes en el centro de México, se identificó el estado teleomorfo y se obtuvo el estado anamorfo mediante aislamiento vegetativo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material recolectado
Los ejemplares fueron colectados en el “Desierto del Carmen”, Tenancingo, localizado en la región sureste del Estado de México, ubicado a 18°49´ y 19°03´ latitud norte y 99°30´y 99°39´ de longitud oeste, a una altitud de 2200 a 2700 msnm (INEGI, 2009). Se realizó un muestreo dirigido, ya que es la zona donde Pérez-Villamares (2015) reportó la mayor diversidad de Cordyceps sensu lato para el sur del Estado de México. El muestreo se realizó de agosto a octubre de 2015, dando un total de siete ejemplares, los cuales fueron colectados cuidadosamente, se limpió la tierra de los hospederos con un cepillo de cerdas delgadas y se colocó el estroma con el hospedero en bolsas de plástico ziplocMR, solo se colectaron los ejemplares en los cuales el estroma emergía del hospedero. Estos se llevaron al laboratorio de Micología del Centro de Investigación en Recursos Bióticos para su identificación, donde fueron secados con sílica gel. Los ejemplares serán depositados en el herbario del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México, cuando se culmine la identificación con un análisis filogenético y el artículo este por enviarse. La colecta de los ejemplares se realizó de acuerdo a Sanjuan (2015). Las descripciones del color de los estromas se llevó a cabo mediante la clave de color HTML color codes (http://html-color-codes.info).Los estromas fueron caracterizados microscópicamente de acuerdo a claves especializadas Mains (1958) y Kobayasi (1941, 1982) y con apoyo de artículos especializados, tal como: Carilli y Pacioni (1977), Pérez-Silva, (1977), Rubio-Bustos et al. (2000), Guzmán et al. (2001), Shrestha et al. (2005), Tian et al. (2010), Wen-Jing et al. (2012), Zi-Hong et al. (2013), Sanjuan et al. (2014); con fotografías tomadas en un Microscopio óptico modelo Motic Digital Microscope DMB3-223, NTSC Systemy.La identificación del hospedero se realizó a nivel de Orden.
Extracción de DNA, amplificación con PCR, electroforesis y secuenciación
La extracción de DNA se realizó con el kit SIGMA-ALDRICH-REDExtract-N-AmpTM
Plant, con algunas modificaciones. Se tomó de 1-2 mm de tejido seco del contexto de los ejemplares. Para las cepas se tomó un trozo del micelio más externo y cada muestra se colocó en un tubo de 2 ml. Se añadieron 100 µl de solución de extracción, se tapó el tubo y se colocó en el vortex por 5-10 segundos. Posteriormente se incubaron a 95°C por 10 min, después se añadieron 100 µl de
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dilución, se mezcló y se dejó por 30 min a temperatura ambiente; por último, las muestras se guardaron a 2°C.
Se amplificaron dos locus: La región transcrita interna (ITS) y la subunidad larga del ribosoma (LSU). La reacción de PCR se realizó con una mastermix de 20 µl: se añadieron 10 µl de RuviTaq, 0.2 µl de cada primer: ITS1f/ITS4 (10mM) (White et al., 1990), LROR/LR5 (10mM) (Vilgalys y Sun, 1994), 2 µl del extracto de DNA en concentración 1:1 para ITS y 1:10 para LSU. Se añadió ddH2O hasta completar los 20 µl. La reacción en cadena de la polimerasa se realizó en el termociclador BIO RAD DNA Engine®. Los ciclos de PCR fueron los siguientes: para la amplificación de ITS, 35 ciclos: 94°C por 2 min y 94°C por 1 min para la desnaturalización de DNA, 51°C por 1 min para la alineación, y 72°C por 1 min y 72°C por 8 min para la extensión, y 4°C por 15 min para detener la reacción. Para la amplificación de LSU, 35 ciclos: 94°C por 3 min y 94°C por 1 min, para la desnaturalización de DNA, 54°C por 1 min para la alineación, y 72°C por 2 min y 72°C por 7 min para la extensión, por último se detuvo la reacción a 4°C por 15 min.
El gel para electroforesis se preparó con 50 ml de buffer TBE, 1 gr de agarosa (Molecular Biology Grade) Vivantis, y 1 µl de REDGEL (0.1x) Biotium ©. Se mezcló el buffer TBE con la agarosa por 30 seg, se disolvió hasta que no se observaron grumos, se dejó enfriar por 10 min y se añadió el REDGEL, este se disolvió en el matraz por 3 minutos, posteriormente se vacio el gel en una placa de vidrio, y se dejó enfriar. Este se corrió en una cámara de electroforesis a 90 vol por 50 min. Posteriormente el gel se reveló en una cámara de UV Kodak-Eastman ©.
La purificación se realizó con EXOSAP. Se preparó una master mix a 1x con EXOSAP y ddH2O. En un tubo de PCR (2 ml) se colocaron 2 µl de la master mix y se añadieron 3.5 µl de producto de PCR, se tapó el tubo y se colocó en el termociclador Programable Thermal Controler, MS Research, Inc. a 37°C por 45 min, 80°C por 15 min y 4°C por 10min.
Las muestras se mandaron a secuenciar con el método de Sanger, al Laboratorio de Secuenciación del Instituto de Biología de la Universidad Autónoma Nacional de México.
Edición de secuencias, análisis de BLAST y análisis filogenético
Las secuencias obtenidas en este estudio fueron editadas en el programa Geneious R.1.5 (Drummond et al., 2009). Se realizó un análisis de BLAST dentro de Geneious R. 1.5 utilizando la plataforma de GenBank para confirmar que las secuencias pertenecían a la Familia Cordycipitaceae, para determinar la especie a la que pertenecían los ejemplares. Las secuencias obtenidas serán subidas a la plataforma de GenBank cuando se hallá finalizada la identificación y este por enviarse este capitulo como artículo.
El análisis filogenético se realizará utilizando las secuencias obtenidas en este estudio y las obtenidas por Sanjuan et al. (2015) que se encuentran en Gen Bank.
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El análisis se realizará utilizando los marcadores moleculares ITS, LSU, RPB1, RPB2 y TEF. Para el grupo externo se utilizarán especies representativas de Metarhizium y Pochonia. El alineamiento de SSU y LSU se realizara en MUSCLE (Edgar, 2004), el alineamiento para los genes que codifican proteínas RPB1, RPB2 y TEF se realizaran con MAFT (Katoh y Toh, 2010). Finalmente cada alineamiento será refinado manualmente en BioEdit versión 6.0.7 (Hall, 1999). Este análisis no ha sido concluido ya que se realizará con la base de datos de Sanjuan (2015), con secuencias que provengan de especimenes voucher y por lo tanto no halla error en el análisis y la interpretación del resultado.
Aislamiento de cepas
Los estromas colectados se llevaron al Laboratorio de Micología del Centro de Investigación en Recursos Bióticos de la UAEM. Se realizó el aislamiento vegetativo. Para esto, los estromas se lavaron con agua destilada y con un bisturí estéril se les cortó un pedazo de estroma de aproximadamente 2-3 mm, este se aisló directamente en placas de Petri en medio estéril Agar Papa Dextrosa (PDA) y se incubó por 30 días a 25°C de acuerdo al método modificado de Kumar y Sagar (2006). Al término de este período se caracterizó la cepa macroscópicamente de acuerdo a Cruz-Ulloa (1995) y microscópicamente de acuerdo a Mains (1958). Estas cepas fueron secuenciadas, tal como se menciona en la parte de extracción de ADN.
RESULTADOS
Se recolectaron siete ejemplares, los cuales corresponden a dos especies de Cordyceps.
Caracterización macróscopica y microscópica:
Cordyceps sp.1 presenta de uno a dos estromas color amarillo (#FFFF00), forma clavada, estípite amarillo claro (#F3F781) alargado en posición vertical de 1.9-1.0 cm de largo, contexto compacto de color amarillo (#FFFF00), emergiendo de Lepidóptero, el micelio no se observa en la parte externa del hospedero, solo en la parte interna, peritecios inmersos en el estroma con forma de matraz de 473.6 µm de largo con un rango de 238.0-612.3 µm y 200.5 µm de ancho con un rango de 95.0-306.9 µm, ascosporas con forma irregular de látigo de 23.5 µm de largo con un rango de 13.0-37.2 µm y 5.08 µm de ancho con un rango de 2.8-9.4 µm, hifas de 3.8 µm de ancho y un rango de 1.5-3.8 µm (figura 6).
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Figura 6. Morfología de Cordyceps sp. 1. a. estroma emergiendo del hospedero (Lepidóptero), b. corte transversal del estroma, c. parte externa del estroma, d. peritecios en forma de matraz, 10X., e. crecimiento hifal apical del peritecio, 40X., f. liberación de segmentos de ascas y ascosporas, 100X., g. segmentos de ascas y ascosporas, 100X. Tinción Rojo Congo.
Cordyceps sp 6., presenta de uno a cuatro estromas, color amarillo (#FFFF00), de forma clavada, estípite amarillo claro (#F3F781) alargado en posición vertical de 0.7-1.9 cm de largo, emergiendo de pupa de Lepidóptero. Contexto cavernoso de color amarillo claro (#F3F781), peritecios inmersos en el estroma con forma subovoide de 331.7µm de largo con un rango de 216.8-627.1µm y 148.5µm de ancho con un rango de 112.0-257.1µm, ascas cilíndricas, filiformes con tapa apical bifurcada conteniendo las ascosporas con forma rectangular multiseptadas de 12.2
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µm de largo con un rango de 5.6-18.8 µm y 5.1 µm de ancho con un rango de 1.5-7.9 µm, hifas acomodadas longitudinalmente en el peritecio con 3.2 µm de ancho y un rango de 1.5-4.4 µm (figura 7).
Figura 7. Morfología de Cordyceps sp. 6. a. estromas emergiendo del hospedero (Lepidóptero), b. corte transversal del estroma, 4X., c. peritecios, 10X., d. peritecio con liberación de ascas, 40X., e. ascas con ascosporas, 100X. Tinción de Rojp Congo.
Caracterización de cepas
Se obtuvieron dos cepas en medio PDA, una de Cordyceps sp. 1. y otra de Cordyceps sp.6. La cepa C-1 presentó dos morfotipos, forma regular e irregular, convexa, borde fimbrado, algodonosa, color blanca en la superficie (#FFFFFF) y amarilla en la parte basal (#F3F781, #FFFF00). La cepa C-6 presentó forma circular, convexa, borde fimbrado, crecimiento micelial algodonoso y color blanca-crema (#F5F6CE) en la parte superficial y en la parte basal amarilla (#F3F781, #FFFF00) (Figura 8). Las dos cepas mostraron reproducción asexual, ya que produjeron conidios (Figura 9).
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Figura 8: a. Cepa de Cordyceps C-1, b. Cepa de Cordyceps C-6, en medio Agar Papa Dextrosa (PDA).
Figura 9. Caracterización microscópica de las cepas. a. hifas a 100x con tinción rojo congo de la cepa C-1, b. hifas y esporas a 100x con tinción rojo congo de la cepa C-6. Ambas en medio Agar Papa Dextrosa (PDA) en ausencia de luz.
Análisis genético de cepas y estromas
En total se obtuvieron 14 secuencias de ITS y LSU de dos especímenes y sus correspondientes cepas, se corroboró la identidad de las cepas al secuenciarlas, donde se encontró una similitud nucleotídica del 100% entre las secuencias de los esporomas y las cepas, se obtuvó el estado asexual de Cordyceps sp.6 como Isaria farinosa, y el estado asexual de Cordyceps sp.1. como Isaria cateniannulata, en la tabla 8 se muestra el porcentaje de identidad obtenido con el análisis de BLAST.
5 µm 5 µm
a
b
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Tabla 8. Porcentaje de identidad con análisis BLAST de las cepas y los estromas con los marcadores, ITS y LSU.
Especimen/Cepa Marcador molecular ITS Marcador molecular LSU
Cordyceps sp. 1 96% -Cordyceps submilitaris
95.3%-Isaria catennianulata
no amplifico
Cepa C-1 95.9%-Cordyceps submilitaris
95%- Isaria catennianulata
99.1%-Cordyceps submilitaris
99.1%-Cordyceps ningxiaensis
Cordyceps sp. 6 98.8%-Cordyceps submilitaris LSU- no amplifico
Cepa C-6 95.7%-Cordyceps submilitaris
94.5%-Isaria farinosa
99.1% Cordyceps submilitaris
99.1%-Cordyceps ningxiaensis
98.9%-Isaria farinosa
DISCUSIÓN
La caracterización e identificación de los ejemplares se realizó con caracteres morfológicos de acuerdo a la clave taxonómica de Mains (1958), Se confirma el género Cordyceps, debido a que las dos especies presentan un estroma y contexto color amarillo. Sin embargo hasta el momento no se ha descrito ninguna especie con características morfológicas similares a las reportadas en la presente investigación. Por otra parte Kepler et al. (2014), Quandt et al. (2014) y Sanjuan et al. (2015) mencionan que la identificación de hongos entomopatógenos utilizando solo caracteres morfológicos no es suficiente, se requiere la utilización de marcadores moleculares codificantes y no codificantes, siendo ITS, LSU, SSU, RPB1, RPB2 y TEF los diagnósticos. Por lo tanto se integro el análisis genético.
La identificación de Cordyceps sp. 1 con el análisis de BLAST utilizando el marcador LSU corresponde a los teleomorfos Cordyceps submilitaris y a C. ningxiaensis con un 99.1% de identidad, y con ITS presenta una identidad de 96.3% con C. submilitaris, sin embargo las características morfológicas son contrastantes con estas dos especies, ya que C. submilitaris se ha registrado parasitando larvas de coleóptero y una característica exclusiva de esta especie es el color naranja del estroma con rizomorfos color rojo (Moller 1901; Petch 1933), los cuáles no se observan en las dos especies tratadas en este estudio y el hospedero que se encuentran parasitando es lepidóptero. C. ningxiaensis se ha descrito en pupas de Díptera (Cyclorrhapha), la cual presenta la parte fértil color naranja y las partes de esporas son filiformes, multiseptadas en partes de esporas de 3.6-7.8 x 1-1.4 µm, contrastando con Cordyceps sp.1 que presenta la parte fértil color amarilla y las partes de esporas son de forma irregular con un tamaño de 13-37.2 x 2.8-9.4 µm.
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Cordyceps sp. 6 a pesar de que presenta el 99.1% de afinidad con C. submilitaris y con C. ningxiaensis, sus características morfológicas también son contrastantes, ya que presenta las partes de esporas filiformes multiseptadas (Jun-Qing y Tolgor 2015), tal como C. ningxiaensis el tamaño de estas es mayor, 1.5-7.9 µm de ancho.
Por lo tanto Cordyceps sp. 1 y Cordyceps sp. 6 corresponden probablemente a dos nuevas especies, a pesar de que las dos especies presentaron un 99.1% de identidad con el marcador LSU con C. submilitaris y C. ningxiaensis, los caracteres morfológicos y el hospedero no corresponden a estas especies, ambas se encuentran parasitando larvas de Lepidóptera y las características de la forma de las esporas es totalmente contrastante entre ambos ejemplares Cordyceps sp. 1 presenta esporas con forma irregular y de látigo, así como un contexto compacto y Cordyceps sp.6 presenta esporas simétricas con forma regular y contexto cavernoso, lo cual indica que se trata de dos especies diferentes, por lo que se considera crucial secuenciar y analizar los marcadores codificantes, así como realizar la filogenia para poder determinar las dos especies.
Para México se han reportado cinco especies de teleomorfos de Cordyceps sensu stricto (Cordyceps s.s.). Cordyceps scarabaeicola, C. takaomontana, Cordyceps militaris, Cordyceps polyarthra y C. pruinosa (ver capítulo 1). Por lo tanto el número de especies de teleomorfos de Cordyceps s.s aumentaría a seis si se considera que las especies aquí presentadas pertenecieran ha Cordyceps submilitaris
Sin embargo ésta cifra contrasta con la mencionada para Norteamérica debido a la enorme riqueza topográfica y biológica con que cuenta el país (Pérez-Silva 1977), cabe mencionar que la zona muestreada en el presente estudio corresponde a sólo una parte de un municipio del Estado de México (529ha) (INEGI 2009), en la cual se encontraron posiblemente dos nuevas especies para el país, lo cual indica que México presenta un carente número de estudios dirigidos a hongos entomopatógenos.
Las cepas de las dos especies se obtuvieron de teleomorfos. Cordyceps sp. 1 y Cordyceps sp. 6, estas presentan reproducción asexual ya que producen conidios con conidiosporas. Con el análisis de BLAST presentan afinidad con Isaria, el anamorfo de Cordyceps. Las cepas presentan características macroscópicas compartidas con las cepas de Cordyceps militaris (Kumar y Sagar 2006; Sherestha et al. 2006), como textura algodonosa, borde fimbrado, crecimiento aéreo y convexo, así como coloración blanca-amarilla. Es importante mencionar que no se han obtenido cepas de Cordyceps ningxiaensis y tampoco de Cordyceps submilitaris, por lo que se desconoce su potencial biotecnológico en la producción de metabolitos secundarios, así como también en la utilización como controladores biológicos de insectos plaga.
Diferentes especies de hongos entomopatógenos presentan importancia medicinal biotecnológica, tal como: Ophiocordyceps sinensis, C. militaris, C. cyushuensis, C. cicadae, C. pruinosa, C. cardinalis y C. bassiana debido a que se les ha extraído un metabolito secundario llamado cordicepina (Sung et al. 2010; Ling et al. 2002;
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Wang et al. 2001) que presenta propiedades anticancerígenas ya que inhibe la replicación de ADN en células cancerígenas (Chun-kit y Wing-hung 2012), por lo tanto las cepas obtenidas de Cordyceps sp. 1 y Cordyceps sp. 6 podrían presentar este potencial medicinal; sin embargo, para confirmarlo es necesario llevar a cabo estudios biotecnológicos.
CONCLUSIONES
Se registran dos especies de teleomorfos del grupo Cordyceps sensu stricto en México, posiblemente nuevas especies, las cuales no se han determinado a nivel de especie, pero presentan afinidad molecular con Cordyceps submilitaris y C. ningxiaensis. Por otra parte se obtuvieron las cepas de ambas especies por aislamiento vegetativo, lo que indic su potencial para cultivo.
Es indispensable emprender investigaciones dirigidas a la taxonomía, biología y ecología de este grupo poco conocido para México, para conocer la función de las especies en las poblaciones y comunidades, y detectar especies con importancia medicinal y como controladores biológicos.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece el financiamiento de la secuenciación de DNA a la Red MEXBOL CONACYT proyecto 280896.
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Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
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CAPITULO III. Cultivo in vitro y producción de cordicepina en Cordyceps aff. submilitaris, hongo silvestre del centro de México
RESUMEN
Actualmente se ha investigado la producción de metabolitos secundarios de
diferentes especies de Cordyceps, ya que presentan potencial medicinal.
Cordyceps militaris es una especie comercializada y cultivada in vitro ya que
presenta alto valor farmacéutico, sin embargo se sugiere la utilización de otras
especies con el mismo potencial y por lo tanto medicinal. En esta investigación se
determinaron las condiciones óptimas del cultivo in vitro a nivel de cepa en medio
sólido y sumergido, para la mayor producción de biomasa, cordicepina y velocidad
de crecimiento en Cordyceps aff. submilitaris, así como también se caracterizó la
morfología de las cepas y del micelio en medio líquido. Las cepas presentaron
pigmentaciones amarillentas en condiciones lumínicas y blanquecinas en
condiciones de oscuridad en todos los medios de cultivo (PDA, EMA, PDA+Y, SB)
a excepción del medio AA, donde en ambas condiciones se observó una coloración
blanquecina. En todos los tratamientos se observó una textura algodonosa y la
densidad del micelio fue diferente de acuerdo a los medios de cultivo, siendo mas
denso en los medios PDA+Y. La mayor producción de biomasa seca (0.28gr/caja
petri) se produjo en la cepa C1, en el medio SB. La máxima velocidad de crecimiento
(0.22cm/día) se observó en la cepa C1 en PDA+Y, sin ser significativas las
condiciones lumínicas. La menor velocidad de crecimiento se observó en la cepa
C6 en PDA en oscuridad (0.11cm/día). En el cultivo líquido, la producción de
biomasa fue diferente de acuerdo al medio de cultivo, no a la cepa ni las condiciones
lumínicas, siendo el medio EM en el que se obtuvó la mayor biomasa (9.5gr/L). La
máxima producción extracelular de cordicepina (12.37 gr/L) se observó en la cepa
C6, en el medio de cultivo PD+Y. Por lo tanto la producción de cordicepina no está
directamente relacionado con la máxima producción de biomasa y velocidad de
crecimiento, si no que esta relacionada con el medio de cultivo y a cepa, siendo el
medio adicionado con nitrógeno orgánico en el que se obtuvo la mayor cantidad.
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
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Estos resultados indican el potencial farmacéutico y biotecnológico que presenta
C. aff.submilitaris.
ABSTRACT
Currently, the production of secondary metabolites of different Cordyceps species
has been investigated, because they present medicinal potential. Cordyceps militaris
is a species marketed and cultivated in vitro because present high pharmaceutical
value, however it is suggested the use of other species with the same
pharmaceutical and medicinal potential. In this research, the optimal conditions of in
vitro cultivation at strain in solid and submerged medium were determined, with the
objetive the have high production of biomass, cordycepin and growth rate in
Cordyceps aff. Submilitaris. As well as strains and liquid culture media were
characterized. The strains showed yellow pigmentation in light conditions, and
whitish in dark conditions in all culture media (PDA, EMA, PDA + Y, SB) except for
the AA medium, where in both conditions a whitish coloration was observed. In all
the treatments a cottony texture was observed and the density of the mycelium was
different according to the culture media, being more dense in the PDA + Y media.
The highest production of dry biomass (0.28gr/caja) occurred in strain C1, in the
medio SB. The maximum growth rate (0.22cm/día) was observed in strain C1 in PDA
+ Y, without being significant light conditions. The slowest growth rate (0.11cm/día)
was observed in strain C6 in PDA. In the liquid culture, the production of biomass
was different according to the culture medium, not to the strain or the light conditions,
being the EM medium in which the highest biomass (9.5gr/L) was obtained. The
maximum extracellular production of cordycepin (12.37 gr / L) was observed in the
C6 strain, in the PD + Y culture medium. Therefore, the production of cordycepin is
not directly related to the maximum biomass production and growth rate, it is directly
related to the culture medium and to the strain, the medium being added with organic
nitrogen in which the greatest quantity was obtained. These results indicate the
pharmaceutical and biotechnological potential of C. aff. submilitaris.
PALABRAS CLAVE
Metabolitos secundarios, Cromatografia Líquida de Alta Resolución, Cordyceps
militaris, Cordyceps sensu stricto
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
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KEY WORDS
Secondary metabolites, High-performance liquid chromatography, Cordyceps
militaris, Cordyceps sensu stricto
INTRODUCCIÓN
El interés por especies de Cordyceps sensu lato se debe en primer instancia, a que
varias de ellas producen biomoléculas con efecto benéfico en la salud del humano,
por ejemplo la cordicepina, que es empleada como anticancerígena debido a que
inhibe las enzimas pirofosfocinasas y amidotransferasas que participan en la
biosíntesis de novo de purinas (Rottman et al., 1964). En segundo lugar son
controladores naturales de poblaciones de artrópodos (Sanjuan et al., 2002) y por
lo tanto son utilizados para su control biológico en cultivos con importancia comercial
(Carr et al., 2003), así como para el control de vectores que transmiten
enfermedades a humano, por ejemplo Metarhizium ha sido utilizado en África para
controlar a mosquitos del género Anopheles que transmiten malaria (Alves et al.,
2008).
El cultivo in vitro de diferentes especies de Cordyceps sensu lato como, C. militaris,
Ophiocordyceps sinensis, Isaria tenuipes, C. cardinalis, C. sphecocephala C. nidus
entre otros, se ha estudiado a nivel de cepa en medio superficial y líquido, hasta
nivel de estroma (Ling et al., 2002; Nam et al., 2006; Sung et al., 2006; Sung et al.,
2010; Dong et al., 2012; Chivirí et al., 2017). Su cultivo permite obtener biomasa,
estromas y/o metabolitos en menor tiempo y a menor costo, ya que estos son
hongos muy escasos en su hábitat natural, su tamaño es muy pequeño y el costo
económico es muy elevado, por ejemplo el costo de 1kg de Cordyceps colectados
en la India va de 318 a 633 dólares (Sharma, 2004), aunado a que en la actualidad
existe una problemática con respecto a la abundancia de especies de
Ophiocordyceps sinensis en el Tibet, debido a la sobreexplotación que realizan los
pobladores cada año (Shrestha et al., 2011).
El cultivo de Cordyceps militaris, la especie más ampliamente estudiada, atrajo la
atención de Bary (1867) desde hace 150 años. El estudio del cultivo superficial de
Cordyceps se ha optimizado implementando medios de cultivo con diferentes
fuentes de nitrógeno, carbono, minerales; cambiando variables físicas como el pH
y temperatura, estas modificaciones se han realizado para incrementar la
producción de biomasa y la velocidad de crecimiento de los aislados o las cepas
(Kumar y Sagar, 2006; Masuda et al., 2007; Shrestha et al., 2010; Chivirí et al.,
2017). El medio sólido en contraste con el medio líquido, permite caracterizar
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
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macroscópicamente los aislados y observar patrones de crecimiento, textura, forma
y pigmentación de acuerdo a condiciones con presencia y ausencia de luz (Shrestha
et al., 2006), las cuales son características propias de géneros o especies.
Por otra parte, el cultivo sumergido se ha estudiado con el objetivo de optimizar la
producción de biomasa y metabolitos secundarios como la cordicepina, manitol y
exopolisacáridos (Shih et al., 2006: Masuda et al., 2007; Hung et al., 2009; Kwon et
al., 2009). Los factores que más influyen para la óptima producción de metabolitos
y biomasa son los medios de cultivo adicionados con fuentes orgánicas de nitrógeno
y carbono (Shih et al., 2006) y la luz ultravioleta ha sido utilizada en el crecimiento
de estromas para optimizar la producción de cordicepina y polisacáridos (Dong et
al., 2012).
Para México, el estudio del cultivo in vitro superficial y sumergido de hongos
entomopatógenos es escaso, la obtención de aislados se ha realizado de estados
anamorfos como Beauveria (Hernández-Velázquez et al., 2011), sin embargo no se
ha estudiado el cultivo de teleomorfos, por lo que el principal objetivo de esta
investigación es caracterizar macroscópica y microscópicamente dos cepas de
Cordyceps silvestres de México, realizar su cultivo in vitro en medio sólido y
determinar los parámetros nutricionales que optimizan la producción de biomasa y
la velocidad de crecimiento en cultivo sólido, así como determinar los parámetros
nutricionales que optimizan la producción de biomasa y cordicepina en medio de
cultivo líquido bajo condiciones de luz y oscuridad.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo sólido y caracterización de cepas
Se caracterizó el fenotipo de las cepas 1 y 6, utilizando como variables, la forma,
margen, crecimiento, textura, superficie, coloración y densidad del micelio, en cinco
medios de cultivo, clasificados de acuerdo a su contenido nutrimental. Agar agua
(AA), agar papa dextrosa (PDA), agar extracto de malta (EMA), agar papa dextrosa
adicionado con levadura (PDA+Y) y sabourad (SB). La inoculación de los medios
sólidos se realizó tomando una muestra de 0.5cm de diámetro de las cepas en
medio PDA, se reaisló en placas de cultivo previamente esterilizadas y preparadas
con los diferentes medios de cultivo, se incubaron a 25°C en ausencia y presencia
parcial de luz (12 hrs luz/12 hrs oscuridad). Diariamente se midió el diámetro de las
cepas y se calculó la velocidad de crecimiento de acuerdo al método modificado de
Huerta et al. (2009), con la siguiente formula: Velocidad de crecimiento=(Df-Di)/(Df-
Di), donde, Df es el diámetro final, Di es el diámetro inicial y Tf-Ti son los días de
crecimiento micelial. Posteriormente se caracterizaron las cepas
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
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macroscópicamente de acuerdo a Mains (1958), y microscópicamente de acuerdo
a Cruz-Ulloa (1995), también se determinó la densidad del micelio de acuerdo a
Kornerup y Wanscher (1978) y Shrestha et al. (2006), donde (-) indica
extremadamente pobre, (+) pobre, (++) moderado y (+++) abundante. La
descripción de la coloración de las cepas se realizó mediante la clave de colores
(http://html-color-codes.info, 2016). Después se midió la producción de biomasa, se
hizó un triple lavado de las cepas con agua destilada calentada a 90-100°C,
posteriormente se filtró el micelio en papel filtro del número 4, este se dejó secar a
60°C por 24hrs de acuerdo a Sung et al. (2010). Se aplicó un análisis estadístico
multifactorial MANOVA utilizando un nivel de confianza de 95%, posteriormente una
prueba de Tukey y por último una correlación simple entre la velocidad de
crecimiento y la biomasa con el paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI.
Extracción y cuantificación de cordicepina en cultivo líquido
Para la extracción de cordicepina, se siguió el método de Shih et al. (2006), se
centrifugó el cultivo a 6000g/10min, posteriormente se filtró el sobrenadante en
papel filtro Whatman 4. Se midió el pH, se lavó el micelio con agua destilada y se
secó a 60°C por 48hrs, para obtener biomasa seca. Después el medio de cultivo
filtrado se mezcló con metanol al 15% (1:1), se centrifugó a 6000g/15min y se filtró
el sobrenadante en Syringe Filter estéril de 0.45µm/13mm de diámetro. El filtrado
obtenido se analizó en sistema HPLC para la cuantificación de la cordicepina. La
curva de calibración de cordicepina (Sigma Aldrich) se realizó utilizando diferentes
concentraciones desde 1-10ppm. El sistema de HPLC estuvo conformado por un
Automuestreador Waters 717 plus, bombas binarias Waters 1525, detector de
absorbancia dual Waters 2487, columna C18 Kromasil® (250mmx4.6mm; 5µm
tamaño de partícula), la fase móvil estuvo compuesta por una mezcla de metanol y
KH2PO4 (0.02M) en concentración (15:85), la tasa de flujo fue de 20µl/min, se utilizó
un detector de UV a 254nm, con temperatura de 25°C, con un tiempo de corrida de
40min. Posteriormente los resultados fueron analizados en el programa Breeze.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Caracterización fenotípica de las cepas
Las cepas de Cordycpes aff. submilitaris en condiciones de luz y oscuridad en los
diferentes medios de cultivo (EMA, PDA y PDA+Y) mostraron un crecimiento regular
e irregular, con un margen la mayoría de las veces fimbrado, con crecimiento aéreo,
algodonoso y convexo, y solo en AA se observó un crecimiento postrado,
algodonoso y plano (Tabla 9). El medio sólido ayudó ha conocer y observar las
características de crecimiento de estas cepas. Shrestha et al. (2006) menciona que
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
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recomienda el medio sólido para caracterizar cepas de Cordyceps ya que estas no
son acuáticas en su hábitat natural y por lo tanto el medio líquido no permite
observar las características fenotípicas de las cepas. Las características
observadas son similares a cepas de Cordyceps militaris (Shrestha et al., 2006;
Kumar y Sagar, 2006), Cordyceps cicadae (Wang et al., 2012), en contraste con
cepas de crecimiento irregular, convexo y margen lobulado de Cordyceps
sphecocephala (Nam et al., 2006).
La densidad del micelio en ambas cepas en condiciones de luz fueron menor en el
medio AA, poco en PDA y EMA, y moderado en PDA+Y y SB. En condiciones de
oscuridad, menor en AA, moderado en PDA y EMA, y abundante en PDA+Y y SB
(Tabla 9). Estos resultados concuerdan con lo reportado por Shrestha et al. (2006)
para C. militaris y Sung et al. (2010) para C. cardinalis, ellos mencionan que el
contenido nutricional de los medios de cultivo influye directamente en la densidad
del micelio. Para Shrestha et al. (2006), la luz es un factor inhibitorio de la densidad
micelial en Cordyceps militaris. En esta investigación también se observa una mayor
densidad del micelio en medios ricos en nitrogeno en condiciones de oscuridad a
comparación de los medios en presencia de luz.
Las dos cepas crecieron en todos los medios de cultivo, incluyendo AA, tal como se
ha reportado para Cordyceps militaris, ya que este es considerado un hongo
fagotrófico facultativo en hábito nutritivo, por lo tanto es común encontrar especies
de entomopatógenos en suelo, sin parasitar por un lapso largo de tiempo (Kamata,
2000: Shrestha et al., 2006), como es el caso de Metharizhium y Beauveria.
Tabla 9. Caracterización fenotípica de las cepas Cordyceps sp.1. y Cordyceps sp.6
en los diferentes tratamientos.
C MC Luz Características macroscópicas
Forma Margen Crecimiento Textura Superficie DM
C-1 AA L Irregular Fimbrado Postrado Algodonosa Plana -
C-1 EMA L irregular-
circular
Fimbrado Aéreo Algodonosa Convexa +
C-1 PDA L Irregular-
circular
Fimbrado Aéreo Algodonosa Convexa +
C-1 PDA+Y L Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa Convexa ++
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C-1 SB L Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++
C-1 AA O Irregular Fimbrado Postrado Algodonosa Plana -
C-1 EMA O Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++
C-1 PDA O Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++
C-1 PDA+Y O Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa +++
C-1 SB O circular-
irregular
fimbrado-
lobulado
Aéreo Algodonosa convexa +++
C-6 AA L Irregular Fimbrado Postrado Algodonosa Plana -
C-6 EMA L circular-
irregular
Fimbrado postrado-aéreo Algodonosa convexa +
C-6 PDA L Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa +
C-6 PDA+Y L Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++
C-6 SB L Circular-
irregular
Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++
C-6 AA O Irregular Fimbrado Postrado Algodonosa Plana -
C-6 EMA O circular-
irregular
lobulado-
fimbrado
Aéreo Algodonosa convexa ++
C-6 PDA O Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++
C-6 PDA+Y O Circular Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa ++
C-6 SB O circular-
irregular
Fimbrado Aéreo Algodonosa convexa +++
C-JC1: cepa de Cordyceps sp.jc; C-6: cepa de Cordyceps sp.6; C: cepa; MC: Medio de cultivo; AA: Agar agua;
PDA: Agar papa dextrosa; EMA: Agar extracto de malta; PDA-Y: Agar papa dextrosa adicionado con levadura;
L: luz; O: oscuridad; DM: densidad del micelio; -: extremadamente poco denso; +: poco denso; ++:
moderadamente denso; +++: abundante.
Con respecto a la coloración de las cepas, esta fue diferente de acuerdo a la
presencia y ausencia de luz, a excepción del medio AA, en la que en ambas
condiciones el micelio se observó blanquecino. En los medios PDA, EMA, PDA+Y
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y SB, se visualizaron pigmentaciones amarillentas en condiciones lumínicas y
blanquecinas en condiciones ausentes de luz (figura 10 y 11), esto indica la
producción de pigmentos inducidos por la luz. Shrestha et al. (2006) menciona que
que también se observan diferencias entre medios de cultivo; sin embargo, en este
estudio no se observó dicha diferencia. Por otra parte, la pigmentación amarilla se
debe a que Cordyceps produce carotenoides en los estromas (Harding y
Sphropshire, 1980). Ademas, también se observa la producción de pigmentos en
las cepas de C. militaris, C. cardinalis, C. unilateralis y C. nidus por mencionar
algunos ejemplos (Wongsa et al., 2005; Shrestha et al., 2006; Sung et al., 2010;
Chiriví et al., 2017).
Figura 10. Cepa C-1 en los diferentes tratamientos. a, b, c, d y e, en presencia de
luz, a1, b1, c1, d1 y e1 en ausencia de luz. a: en AA, b: PDA, c:EMA, d:PDA+Y y e:SB.
Figura 11. Cepa C-6 en los diferentes tratamientos. a, b, c, d y e, en presencia de
luz, a1, b1, c1, d1 y e1 en ausencia de luz. a: en AA, b: PDA, c:EMA, d:PDA+Y y e:SB.
a b c
a1
d e
c1
e1 d1 b1
a1 c1 d1 b1 e1
e d c b a
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Los hongos en general producen pigmentos y estos se han asociado a la
patogenicidad de las especies; sin embargo, no se han realizado estudios con
respecto a la patogenicidad de los carotenoides (Geis y Szaniszlo, 1984), los
pigmentos son sustancias químicas que dan color a otros materiales, y son
importantes ya que pueden ser utilizados en la industria alimentaria, farmacéutica y
textil, desde hace tiempo se han utilizado hongos filamentosos como por ejemplo
Penicillium purpurogenum para la producción de pigmentos, para sustituir los
colorantes sintéticos (Méndez-Zavala et al., 2007). Los carotenos son provitaminas
A con propiedades antioxidantes, y se ha demostrado que previenen enfermedades
en el humano como aterosclerosis y cáncer (Nishino, 1995; Meléndez-Martínez et
al., 2004).
Caracterización microscópica de las cepas
Las dos cepas crecidas en los cinco medios de cultivo en ausencia y presencia
parcial de luz presentaron hifas filamentosas, ramificadas, septadas, sinuosas con
gútulas y terminación apical redondeada. Las cepas se reproducieron asexualmente
ya que se observó la formación de conidios (figura 12). Las hifas presentaron
diferencias en el grosor de acuerdo al medio de cultivo. La conidiogénesis es
conocida para diferentes especies de Cordyceps y se ha observado que difiere entre
especies (Sung et al., 2010). Desde hace más de 40 años, Carilli y Pacioni (1977)
describieron el crecimiento hifal y la producción de esporas en cultivo sumergido de
C. militaris. Tal como C. militaris, C. aff. submilitaris produce hifas ramificadas,
septas y la terminación hifal de las ramificaciones se vuelve globosa y
posteriormente se diferencía y produce las esporas.
Figura 12. Conidios y esporas producidos en las cepas. a: cepa 1., b: cepa 6.
Medición de velocidad de crecimiento y producción de biomasa en cultivo
sólido
a 5µm 5µm b
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
100
La velocidad de crecimiento fue diferente respecto a los medios de cultivo F4,99
56.15; P<0.05, la cepa utilizada F1,99 472.45; P<0.05, y a la ausencia y presencia
parcial de luz F1,99 8.10; P>0.05. Siendo mayor en la cepa C-1 (0.23cm/día y
0.22cm/día), en ausencia y presencia de luz con PDA+Y. La menor velocidad de
crecimiento se observó en la cepa C-6 en condiciones de oscuridad en PDA (tabla
10).
Tabla 10. Velocidad de crecimiento, biomasa seca y densidad del micelio del cultivo
in vitro en medio sólido.
Cepa Medio
de
cultivo
Luz Velocidad de
crecimiento en
medio sólido
Biomasa seca de
medio sólido
Densidad del
micelio
C-1 AA L 0.17b 0.028def -
C-1 EMA L 0.18b 0.123cde +
C-1 PDA L 0.18b 0.132cde +
C-1 PDA+Y L 0.22a 0.143bcd ++
C-1 SB L 0.14dc 0.261ab ++
C-1 AA O 0.17b 0.017ef -
C-1 EMA O 0.18b 0.156cb ++
C-1 PDA O 0.17b 0.161abc ++
C-1 PDA+Y O 0.23a 0.184abc +++
C-1 SB O 0.12cde 0.278a +++
C-6 AA L 0.13cd 0.001f -
C-6 EMA L 0.12cde 0.131cde +
C-6 PDA L 0.13cde 0.2545ab +
C-6 PDA+Y L 0.14c 0.205abc ++
C-6 SB L 0.14cd 0.204abc ++
C-6 AA O 0.12cde 0.001f -
C-6 EMA O 0.11de 0.228abc ++
C-6 PDA O 0.11e 0.202abc ++
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Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
101
C-6 PDA+Y O 0.14c 0.241abc ++
C-6 SB O 0.13cde 0.185abc +++
C-1: cepa de Cordyceps sp 1; C-6: cepa de Cordyceps sp.6; AA: agar agua; EMA: Agar extracto de malta;
PDA: Agar papa dextrosa; PDA+Y: Agar papa dextrosa adicionado con levadura; SB: Medio Sabourad.
Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0.05).
Se encontró interacción significativa entre cepa y luz F1,99 6.47; P<0.05, entre cepa
y medio de cultivo F4,99 43.59; P<0.05 y entre luz y medio de cultivo F4,99 2.95;
P<0.05, para una mayor velocidad de crecimiento. Sin embargo, no se encontró
interacción entre la cepa, los medios de cultivo y el factor luz, F4,99 1.24; P>0.05
(Figura 13).
En el grupo de Cordyceps s.l. a pesar de que se estudian los medios que optimizan
la velocidad de crecimiento de los aislados y la producción de biomasa, se ha
observado que la velocidad de crecimiento difiere entre especies en los mismos
medios de cultivo, por ejemplo C. militaris, C. bassiana son especies con rápido
crecimiento y C. martialis presenta un crecimiento muy lento (Sung et al., 2010).
Con respecto a la producción de biomasa seca, ésta mostró diferencias estadísticas
de acuerdo al medio de cultivo (AA, PDA, EMA, PDA+Y y SB) F4,99 54.19; P<0.05.
Sin embargo, no hubo diferencias significativas de acuerdo a la cepa F1,99 2,70;
P<0.05 y a las condiciones lumínicas F1,99 2.70; P<0.05 (Tabla 10). Aunque se
presentó interacción entre el medio de cultivo y el factor luz F4,99 7.67; P<0.05 para
la mayor producción de biomasa (Figura 14). La mayor producción de biomasa
(0.28gr/caja) se obtuvó en la cepa C1 en condiciones de oscuridad en el medio SB.
Y la menor producción de biomasa se presentó en el medio AA (0.001gr/caja). Ya
que el medio agar agua no presenta nutrientes, sería interesante conocer como
puede crecer el hongo en un medio sin nutrientes sin mostrar diferencias
estadísticas con el medio PDA, con respecto a la velocidad de crecimiento.
Relacionando los resultados de velocidad de crecimiento, producción de biomasa y
densidad del micelio, se observa que la cepa C-1 presenta los valores más altos en
las tres variables. Al parecer está relacionada la mayor producción de biomasa con
la mayor densidad del micelio observada y con medios ricos en nutrientes,
presentándose la mayoría de las veces en condiciones de oscuridad. Shih et al.
(2006), menciona que la máxima producción de biomasa en hongos
entomopatógenos está correlacionada con la fuente orgánica de nitrógeno. Y
aunque se ha observado que la mayor densidad de micelio está relacionada con la
máxima velocidad de crecimiento (Wongsa et al., 2005; Shrestha et al., 2006; Sung et
al., 2006), también se ha observado que en medios carentes de nutrientes el micelio
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Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
102
crece rápidamente por la búsqueda de nutrientes, y en medios ricos en nutrientes
se observan colonias con diámetro menor y una densidad mayor (Sung et al., 2010).
Figura 13. Interacción entre cepa, condiciones lumínicas y medios de cultivo con
respecto a la velocidad de crecimiento (cepa a: cepa 1; cepa b: cepa 6)
Gráfico de Interacciones
CEPA
0.12
0.13
0.14
0.15
0.16
0.17
0.18
velo
cid
ad d
e c
recim
iento
a b
luz
0
1
Gráfico de Interacciones
CEPA
0.11
0.13
0.15
0.17
0.19
0.21
0.23
velo
cid
ad d
e c
recim
iento
a b
medio de cultivo
AA
EMA
PDA
PDAY
SB
Gráfico de Interacciones
luz
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
velo
cid
ad d
e c
recim
iento
0 1
medio de cultivo
AA
EMA
PDA
PDAY
SB
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
103
Figura 14: Interacción entre condiciones lumínicas y medios de cultivo con respecto
a la producción de biomasa.
Cinética de crecimiento de las cepas
La cinética de crecimiento micelial de la cepa C-1 y C-6 se observan en la figura 15
y 16. Las dos cepas presentan tres fases: fase inicial, fase de crecimiento y fase de
latencia. La cepa C-1 cubrió un diámetro de 9.0 cm en 45 días y la cepa 6 presentó
un diámetro de 9.0 cm en 60 días. Se ha observado que el tiempo de crecimiento
en medio sólido de hongos entomopatógenos depende de diferentes variables,
como son los nutrientes, pH, temperatura, cepa y especie (Sangdee y Sangdee,
2013). Por ejemplo, el tiempo que tarda en cubrir una caja petri Cordyceps
unilateralis es de 90 días (Wongsa et al., 2005), de 60 días Cordyceps
sphecocephala (Sung et al., 2006), de 15-20 días Cordyceps militaris (Shrestha et
al., 2006) y hasta de 7 días Cordyceps cardinalis (Sung et al., 2006).
Gráfico de Interacciones
luz
0
0.04
0.08
0.12
0.16
0.2
0.24
Bio
ma
sa
se
ca
0 1
medio de cultivo
AA
EMA
PDA
PDAY
SB
Gráfico de Interacciones
medio de cultivo
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
Bio
ma
sa
se
ca
AA EMA PDA PDAY SB
CEPA
a
b
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Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
104
Figura 15. Cinética de crecimiento de la cepa C-1. Los tratamientos se observan
del lado derecho: A: agar agar; PDA: agar papa dextrosa; EMA: agar extracto de
malta; PDA+Y: agar papa dextrosa adicionado con levadura.
Figura 16. Cinética de crecimiento de la cepa C-6. Los tratamientos se observan
del lado derecho: A: agar agar; PDA: agar papa dextrosa; EMA: agar extracto de
malta; PDA+Y: agar papa dextrosa adicionado con levadura.
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
55.5
66.5
77.5
88.5
9
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45
diá
met
ro(c
m)
Tiempo (días)
Cinética de crecimiento de Cordyceps aff. submilitaris (cepa C1)
A/luz
A/oscuridad
PDA/luz
PDA/oscuridad
PDAY/luz
PDAY/oscuridad
EMA/luz
EMA/oscuridad
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60
diá
met
ro
(cm
)
Tiempo (días)
Cinética de crecimiento de Cordyceps aff. submilitaris (cepa C6)
AA/ L
AA/O
PDA/L
PDA/O
EMA/L
EMA/O
PDAY/L
PDAY/O
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Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
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Caracterización macroscópica de pellets en medio de cultivo sumergido
Los pellets se desarrollaron de manera general, esponjosos y redondeados (Tabla
11). No se observan diferencias de acuerdo a las condiciones lumínicas. Se observa
que los medios adicionados con levadura presentan un mayor número de pellets, y
esto se relaciona con la mayor producción de cordicepina, aunque no con la mayor
producción de biomasa (tabla 12).
Tabla 11. Caracterización macroscópica de pellets
Cepa Medio de
cultivo
Condiciones luminicas
Número de pellets
Masa Tipo de pellets
Forma Color
C1 PD L ≥100 * Compactos Redondos e irregulares o aplanados
Crema (#F2F5A9)
C1 PD O ≥100 * Esponjosos Redondos, globosos
Crema (#F2F5A9)y café claro
(#F5ECCE)
C1 EM L ≥100 * Esponjosos y compactos
Irregulares y alargados
Crema (#F2F5A9)
C1 EM O ≥100 * Compactos Redondos Café claro (#F5ECCE)
C1 PD+Y L ≥500 - Compactos Irregulares Crema (#F2F5A9) y
café claro (#F5ECCE)
C1 PD+Y O ≥500 - Esponjosos Redondos Crema (#F2F5A9) y
café claro (#F5ECCE)
C6 PD L ≥100 - Esponjosos Redondos e irregulares
Crema (#F2F5A9)
C6 PD O ≥100 - Esponjosos Redondos, globosos con abundantes
pelos
Crema (#F2F5A9) y
café claro (#F5ECCE)
C6 EM L 22-30 * Esponjosos Redondos, globoso y con
pelos
Café (#F3E2A9-#F5DA81)
C6 EM O 23-150 * Esponjosos Redondos, globosos y con pelos
Crema (#F2F5A9) y
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Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
106
café (#F3E2A9-#F5DA81)
C6 PD+Y L ≥100 - Esponjosos Redondos, globosos y con pelos
Crema (#F2F5A9) y
café claro
C6 PD+Y O ≥500 - Esponjosos Redondos, globosos y con pelos
Crema (#F2F5A9) y
café claro (#F5ECCE)
C-1: cepa de Cordyceps sp 1; C-6: cepa de Cordyceps sp.6; AA: agar agua; EMA: Agar extracto de malta;
PDA: Agar papa dextrosa; PDA+Y: Agar papa dextrosa adicionado con levadura; SB: Medio Sabourad.
*:Presencia; -;Ausencia
Los pellets presentaron hifas con prolongaciones parietales, con presencia de
gútulas, terminación hifal algunas veces cuadrada y otras redondeada, así como la
presencia de esporas (Tabla 12). Cordyceps militaris en cultivo sumergido produce
esporas por mitosis y el grosor de las hifas difiere, ya que hay ramificaciones que
se diferencían para producir esporas y son más gruesas (Carilli y Pacini, 1977), en
esta investigación se observó un promedio de grosor de hifas diferente entre
tratamientos, pero no se observa un patrón general relacionado al medio de cultivo,
la cepa o las condiciones lumínicas.
Tabla 12. Caracterización microscópica de pellets en cultivo sumergido
Cepa
Medio
de
cultivo
CL Tipo de hifas Septos Terminación
hifal
G Grosor
de hifas
(x/
rango)
Esporas
(x)
C1 PD L Ramificadas
con
prolongaciones
parietales
* Alanoidea y
redondeada
* 1.9
1.0-3.1
3.0-6.1 x
3.4-5.1
C1 PD O Ramificadas
con
prolongaciones
parietales
* Redondeada * 2.2
1.1-3.5
6.0-12.6 x
2.0-4.0
C1 EM L Ramificadas * Cuadrada y
redonda
* 1.7
1.0-2.8
2.9-6.3 x
2.0-5.9
C1 EM O Irregulares * Redondeada * 1.7
1.0-2.4
4.1-7.3 x
1.4-3.8
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
107
C1 PD+
Y
L Ramificadas * Cuadrada * 2.0
1.0-3.1
2.5-5.0 x
1.0-4.4
C1 PD+
Y
O Ramificadas * Redondeada
y globosa
* 1.7
1.0-2.4
Sin
esporas
C6 PD L Ramificadas * Redondeada - 2.1
1.0-3.1
4.5-6.6 x
4.4-5,9
C6 PD O Lisas * Globosa y en
punta
- 3.2
1.8-4.4
1.9-5.7 x
1.5-4.4
C6 EM L Ramificadas,
tortuosas,
rizadas con
prolongaciones
parietales
* Alanoidea y
redondeada
- 1.4
1.0-2.1
2.9-6.0 x
2.5-4.9
C6 EM O Ramificadas
con
prolongaciones
parietales
- Redondeada * 3.1
1.0-4.8
3.4-10.9 x
2.9-11.3
C6 PD+
Y
L Ramificadas y
prolongaciones
parietales
* Redondeada * 1.9
1.0-3.4
2.9-4.9 x
2.4-4.9
C6 PD+
Y
O Ramificadas e
hifas
modificadas
* Cuadrada * 1.8
1.0-2.4
2.8-9.7 x
2.2-4.0
C-1: cepa de Cordyceps sp 1; C-6: cepa de Cordyceps sp.6; AA: agar agua; EMA: Agar extracto de malta;
PDA: Agar papa dextrosa; PDA+Y: Agar papa dextrosa adicionado con levadura; SB: Medio Sabourad. G:
gútulas; C.L.: condiciones lumínicas. * Indica presencia. – Indica ausencia.
Producción de biomasa y cordicepina en cultivo sumergido
Con respecto al cultivo líquido, la biomasa fue diferente de acuerdo al medio de
cultivo F2,59 15.0, P<0.05, no ha la cepa F1,59 0.13 P>0.05, ni ha las condiciones
lumínicas F1,59 0.96 P>0.05, siendo el medio EM donde se produjo la mayor cantidad
de biomasa (P<0.05) en comparación con el medio PD y PD+Y. La producción
extracelular de cordicepina se observó mayor en la cepa C-6 en el medio de cultivo
PD+Y, sin haber diferencias de acuerdo a las condiciones lumínicas (Tabla 13). No
se observó producción de cordicepina en los tratamientos C1+PD+L, C1+PD+O,
C6+PD+L y C6+EM+O. Es interesante observar que la mayor producción de
cordicepina no está directamente relacionada con la mayor producción de biomasa,
así como tampoco con las condiciones lumínicas, por lo que la luz no es un factor
que induzca la producción de cordicepina en medios de cultivo sumergidos. Se ha
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
108
observado que ha nivel de estroma se observa una diferencia en producción de
adenosina y cordicepina de acuerdo a diferentes longitudes de onda (Dong et al.,
2012).
Tabla 13: Biomasa y cordicepina extracelular producida en medio líquido.
Cepa Medio de
cultivo
Condiciones
luminicas
Biomasa
Seca (gr/L)
Producción
de
cordicepina
(mg/L)
pH final
C1 PD L 2.4e 0 5.1
C1 PD O 5.9bcd 0 4.3
C1 EM L 8.3ab 7.2 4.3
C1 EM O 5.2cd 1.7 3.5
C1 PD+Y L 3.8de 1.7 8.8
C1 PD+Y O 6.7bc 5.5 6.1
C6 PD L 5.9bcd 0 7.8
C6 PD O 4.6cde 1.6 8.4
C6 EM L 6.6bc 1.7 6.0
C6 EM O 9.5ª 0 5.1
C6 PD+Y L 4.4cde 12.1 7.6
C6 PD+Y O 2.5e 12.4 7.7
PD: papa dextrosa; EM: extracto de malta; PDY: papa dextrosa adicionada con levadura; L: luz; O:
oscuridad; C6: cepa 6; C1: cepa 1. Letras diferentes indican diferencias significativas de acuerdo a
la prueba de tuckey P<0.05
Por lo tanto, la producción de cordicepina en Cordyceps aff. submilitaris en esta
investigación es dependiente al tipo de medio, siendo el medio papa dextrosa
adicionado con levadura el que presenta la mayor producción de cordicepina. En
Cordyceps militaris, el extracto de levadura permite la mayor producción de
cordicepina, por lo que el nitrógeno orgánico es primordial para la producción de
este metabolito (Shih et al., 2006). Chiriví et al. (2017), encontraron que la intensidad
del valor de los metabolitos en Cordyceps nidus esta relacionada con el sustrato
utilizado, siendo mayor en medios de cultivo naturales a comparación de medios de
cultivo artificiales como SDAY. Los tratamientos de PD no produjeron cordicepina
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
109
debido posiblemente a que es considerado un medio artificial pobre en nutrientes y
no está adicionado con nitrógeno.
Con respecto al pH, éste no es un indicador relacionado con la cantidad de biomasa
ni de cordicepina producida, sin embargo, fue diferente en cada tratamiento, por lo
que se induce que es indicador de otro u otros metabolitos secundarios. Por otra
parte, el pH, temperatura y medio de cultivo son variables que regulan la cantidad
de cordicepina (Chíviri et al., 2017). Por lo que se sugiere seguir investigaciones
con Cordyceps aff. submilitaris modificando estas variables, así como también la
utilización de medios de cultivo naturales. Chíviri et al. (2017), mencionan que la
cordicepina, adenosina, inosina y guanosina son marcadores de calidad de
Cordyceps s.l, por lo tanto, ya que Cordyceps aff. submilitaris presenta cordicepina,
indica ser una especie con potencial medicinal, farmacéutica y biotecnológica.
La cordicepina (3´deoxiadenosina) al ser un análogo a la adenosina que inhibe la
actividad de enzimas pirofosfocinasas y amidotransferasas que participan en la
síntesis de novo de purinas (Legraverend y Robert, 1978; Müller et al., 1977; Wong
et al., 2010), interfiere en la replicación de DNA de células tumorosas, la cual es
reducida en células normales, ya que los mecanismos de reparación están activos,
el cual es ausente en células tumorosas (Holliday y Cleaver, 2008). Se ha
determinado su actividad antiprofilerativa de células cancerosas de pulmón
(Aramwit et al., 2015), en leucemia, melanoma, carcinoma cervico epiteloide y
cáncer de seno (Foss, 2000; Thomadaki et al., 2005).
En esta investigación, la producción máxima de cordicepina extracelular obtenida
por Cordyceps aff. submilitaris fue de 12.37 gr/L. Cordyceps militaris es la especie
más ampliamente analizada para la producción de cordicepina y se ha registrado
que puede producir de 2.2 gr/L (Shih et al., 2006) hasta 38.8gr/L (Kim y Yun, 2005).
En Ophiocordyceps sinensis se ha reportado una producción de 18.2mg/L (Shih et
al., 2006), por que que a pesar de que C. aff. submilitaris produce baja cantidad a
comparación de Cordyceps militaris, su cultivo es inicialmente estudiado en esta
investigación, y la producción de cordicepina se podría optimizar utilizando
diferentes tipos y cantidades de nutrientes.
Actualmente, Ophiocordyceps sinensis es la especie más valorada en el Tibet, sin
embargo no se ha podido realizar su cultivo in vitro a nivel de estroma, por lo tanto
se ha implementado el cultivo de Cordyceps militaris (Shrestha et al., 2012), el cual
ha sido exitoso debido a que se puede cultivar en laboratorio desde nivel de cepa
en medio sólido y sumergido hasta nivel de estroma y produce altas cantidades de
metabolitos secundarios, destacando la cordicepina y exopolisacaridos.
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
110
A pesar de que se han reportado mas de 400 especies de Cordyceps s.l.; 36 de
ellas se han cultivado artificialmente para la producción de cuerpos fructíferos, solo
Cordyceps militaris ha sido cultivada comercialmente, debido a su efecto
farmacéutico en un perído corto de tiempo (Shrestha et al., 2012).
En los últimos años, se han estudiado diferentes especies de entomopatógenos a
los cuales se les ha extraído cordicepina, tal como C. cicadae (Wang et al., 2012),
Ophiocordyceps aff. longissima (Sangdee y Sangdee), C. nidus (Chivirí et al., 2017),
entre otros, así como también se ha extraído de Antrodia camphorata, poliporal con
distribución en Taiwan (Chang et al., 2005). En esta investigación se incorpora a
Cordyceps aff. submilitaris, por lo que se considera que un amplio número de
especies del grupo Cordyceps sensu lato son una alternativa para su uso en la
farmacéutica.
CONCLUSIONES
Esta es la primer investigación en registrar la producción de cordicepina de un
teleomorfo silvestre de Cordyceps en México, así como también es el primer estudio
en reportar condiciones adecuadas del cultivo in vitro sumergido para la producción
de biomasa y cordicepina de Cordyceps aff. submilitaris.
Las cepas en medio sólido presentaron características morfológicas y
pigmentaciones amarillentas-blanquecinas, similares a C. militaris. Se obtuvó el
estado asexual, ya que en cultivo sólido y sumergido se observó la presencia de
esporas.
La velocidad de crecimiento fue mayor en la cepa C1, en condiciones de luz y
oscuridad en el medio PDA+Y, siendo la cepa 6 la que presentó la menor velocidad
de crecimiento. La biomasa en cultivo sólido fue mayor en la cepa C1 en condiciones
de oscuridad en medio SB, y en cultivo sumergido en el medio EM. La mayor
producción de cordicepina se observó en la cepa C6, en el medio PD+Y. Por lo
tanto, la mayor producción de biomasa en medio sólido y líquido, así como la mayor
velocidad de crecimiento no está directamente relacionada a la máxima producción
de cordicepina.
La óptima producción de cordicepina está directamente relacionada con el medio
adicionado con nitrogeno orgánico y a la cepa, no ha las condiciones lumínicas. Por
lo tanto, se sugiere continuar con la investigación del cultivo in vitro de C. aff.
submilitaris para optimizar la producción de cordicepina en medios de cultivo
suplementados, en diferentes condiciones físicas de pH y temperatura desde nivel
cepa hasta estroma, ya que esta investigación es la base para futuros trabajos de
esta y de otras especies de entomopatógenos de México. Debido a que C. aff.
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
111
submilitaris produce cordicepina, se destaca su potencial farmacéutico y
biotecnológico.
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno
Cordyceps sensu lato del Estado de México. Tesis de Maestría. Lorena López Rodríguez.
112
REFERENCIAS CONSULTADAS
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116
CONCLUSIONES GENERALES
Actualmente, el estado del conocimiento de Cordyceps sensu lato en México esta
representado por 25 especies, distribuidas en las tres Familias que conforman el
grupo. La Familia Clavicipitaceae está representada por una sola especie, la Familia
Cordycipitaceae por cinco especies del género Cordyceps y cuatro estados
asexuales, y la Familia Ophiocordycipitaceae presenta dos especies del género
Tolypocladium, diez del género Ophiocordyceps y tres estados asexuales del
género Hirsutella. De estas especies, solo Metarhizium anisopliae y Beauveria
bassiana han sido utilizadas como agentes de control biológico de insectos plaga,
y con respecto al conocimiento tradicional solo se conoce el uso antrópico
comestible de Tolypocladium capitatum y Tolypocladium ophioglosoides por nahuas
del centro de México, por lo que el conocimiento con respecto a la distribución
geográfica, uso medicinal y comestible, asi como aspectos bioquímicos,
farmacéuticos y biotecnológicos de Cordyceps son parcialmente desconocidos.
En el presente, se caracterizaron morfológica y genéticamente dos teleomorfos de
Cordyceps sensu stricto, que corresponden a Cordyceps aff. submilitaris, el cual es
nuevo registro para México.
Las características fenotípicas de las cepas obtenidas, incluida la pigmentación
amarilla en condiciones lumínicas y blanquecina en condiciones de oscuridad, así
como la producción de esporas por mitosis en cultivo muestran similitud a
Cordyceps militaris.
En el cultivo sólido de Cordyceps aff. submilitaris, se observó que la densidad del
micelio y la biomasa fue significativamente mayor en medios ricos en nutrientes
como PDA+Y y SB en condiciones de oscuridad en la cepa C1, y la máxima
velocidad de crecimiento se observó en el medio PDA+Y en la cepa C1.
En el cultivo sumergido se observó que la mayor producción de biomasa depende
del medio de cultivo, siendo el medio EM donde se obtuvó la mayor cantidad. Con
respecto a la producción de cordicepina ésta es dependiente al medio de cultivo y
la cepa, no a las condiciones lumínicas, siendo el medio adicionado con levadura y
la cepa C6 en la que se produce la mayor cantidad.
Por lo tanto, está investigación permite visualizar el potencial farmacéutico y
medicinal de Cordyceps aff. submilitaris.
Por último es conveniente continuar con la investigación de metabolitos secundarios
de esta especie, así como la optimización de su cultivo evaluando otras variables
físicas como el pH y la temperatura, incorporando nuevos medios de cultivo.
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato del Estado de México
117
Por otra parte, es importante iniciar el estudio etnomicologico, bioquímico y
biotecnológico de más especies de entomopatógenos silvestres de México al ser su
estudio incipiente, a pesar de que a nivel mundial los hongos entomopatógenos del
grupo Cordyceps sensu lato presentan importancia ecológica, agrícola, medicinal,
comestible y farmacéutica.
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato del Estado de México
118
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123
ANEXOS
Figura 17: Curva de calibración de cordicepina de 1-10ppm
Tabla 14: Curva de calibración de la cordicepina con los diferentes valores de
área y altura de la curva, así como el tiempo de retención
Concentración de cordicepina (ppm)
Área de la curva Altura de la curva Tiempo de retención
100 3908034 145266 6.453
90 1225376 46266 6.462
70 1370330 35159 6.471
50 698646 26078 6.488
40 525416 19722 6.510
30 1367980 34467 6.524
20 331920 8367 6.532
10 97097 2651 6.514
Tabla 15: Tiempo de retención, área y altura de las diferentes concentraciones de
cordicepina obtenidas en sistema de HPLC.
Injección Concentración
(ppm)
Tiempo de
retención
Área % Área Altura % Altura
1 0.3 6.76537757 8939.64769 95.3701728 824.813549 87.5796178
2 0.3 6.75802242 8806.06178 95.0766573 816.479387 86.9936034
2 0.5 6.75188539 12201.8336 94.0496377 1093.5349 85.8712716
1 0.5 6.74389409 11820.7932 94.3039489 1069.28415 85.8634538
2 1 6.74147093 19704.1274 93.7615989 1739.6607 85.5457227
1 1 6.7427081 19711.7329 93.9516706 1744.20559 85.3646598
2 2 6.74152423 35864.6396 94.5432977 3053.81768 87.4320069
1 2 6.73235366 35519.5043 94.4731103 3047.4359 87.4067699
AU
0.000
0.002
0.004
0.006
Minutes
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato del Estado de México
124
2 3 6.72848758 52835.9893 93.84558 4294.54412 87.6888526
1 3 6.7250014 52207.708 94.9046554 4292.533 88.66171
2 4 6.71652733 69432.3423 93.6839691 5350.46515 88.5468388
1 4 6.72336537 69122.9105 93.9809653 5321.97584 88.5671493
2 5 6.71212002 85260.8676 94.458416 6062.6772 89.0569918
1 5 6.70664215 85243.8679 93.7602429 6071.62232 88.9149217
2 6 6.69467318 100999.893 94.3228831 6646.27698 88.8027793
1 6 6.69269163 101151.514 94.3485277 6641.80376 89.0467891
2 7 6.68667066 118720.272 93.5901175 7075.0032 87.8336437
1 7 6.67450747 118410.683 93.3038634 7026.91282 87.7278402
2 8 6.66876435 133981.29 92.8836848 7288.6023 89.8656146
1 8 6.67423379 133600.155 93.4318004 7291.45672 90.5939364
2 9 6.67494897 148611.431 92.7954592 7406.7265 89.2409639
1 9 6.68411743 149938.652 93.3553742 7389.63058 89.4456548
2 10 6.69547196 167850.973 92.3750454 7452.04671 87.7118644
1 10 6.71375653 165975.45 92.6396222 7421.9339 88.0218216
Figura 17: Gráfica lineal y línea de tendencia de la curva de calibración de cordicepina.
y = 15923x - 25512r2 = 0.998
0
50000
100000
150000
200000
250000
are
a b
ajo
la c
urv
a
Concentracion de cordicepina (ppm)
Curva de calibración de cordicepina Donde:
y=15923x-25512
y= área
x= concentración de cordicepina
m=pendiente=15923
b=ordenada al origen= 25512
Para conocer la concentración de cordicepina,
despejamos:
x= y/15923+25512
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato del Estado de México
125
Figura 19: Cromatogramas de las replicas 1, 2 y 3 del tratamiento PD+O+C6.
Figura 20: Cromatogramas de las replicas 6, 7 y 8 del tratamiento PD+L+C6
AU
0.00000
0.00005
0.00010
Minutes
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AU
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Minutes
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AU
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Minutes
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AU
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Minutes
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AU
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Minutes
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AU
0.00000
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Minutes
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cordicepina
Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato del Estado de México
126
Figura 21: Cromatogramas de las replicas 11, 12 y 13 del tratamiento PD+O+C1.
Figura 22: Cromatogramas de las replicas 16, 17 y 18 del tratamiento PD+L+C1.
AU
-0.00002
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0.00002
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AU
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AU
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Minutes
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AU
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AU
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AU
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Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato del Estado de México
127
Figura 23: Cromatogramas de las replicas 21, 22 y 23 del tratamiento EM+L+C1.
AU
-0.00015
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-0.00000
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AU
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AU
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AU
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AU
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Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato del Estado de México
128
Figura 24: Cromatogramas de las replicas 26, 27 y 28 del tratamiento PDY+O+C1
Figura 25: Cromatogramas de las replicas 31, 32 y 33 del tratamiento PDY+L+C6
AU
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AU
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AU
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Aislamiento de cepas y obtención de metabolitos secundarios del género entomopatógeno Cordyceps sensu lato del Estado de México
129
Figura 26: Cromatogramas de las replicas 36, 37 y 38 del tratamiento PDY+O+C6
AU
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AU
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AU
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