UNIVERSIDAD ATONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA

INSTITUYO MEXICANO DEL PE'ROLEO REPORTE DE SERVICIO SOCIAL

ESTUDIO DEL EFECTO DE TRES BIOCIDAS COMERCIALES SOBRE EL

AISLADOS DEL AGUA D E INYECCION DEL COMPLEJO ABKATUN. DESARROLLO DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS Y HONGOS

ASESORES: BIOL. JUAN MANUEL ROMERO DOMINGUEZ Q.B.P. RAFAEL GARCIA ESQUIVEL

M. EN C. ABEL SENTIES GRANADOS

." . .. . . .. .. . r . 1

INTRODUCCION

Cuando se agota la energía propia de un yacimiento petrolífero, es necesario inyectarle un fluido a fin de proporcionarle energía adicional aumentando la producción y la recuperación final de hidrocarburos; a este proceso se le llama recuperacih secundaria y se lleva a cabo utilizando varios mhtodos, entre los que se pueden mencionar:

Inyección de agua, inyección de gas natural, inyeccibn de agua con polimeros, inyección de gas inerte (nitrógeno y C02 ), etc (IMP-1982). En la actualidad el método más usual en nuestro país es la inyección de agua por su disponibilidad y bajo costo. Dicho método se aplica tanto en tierra como en zona marina, en esta última se ubica el complejo Abkatun.

La inyección de agua se hace a través de tuberías de acero que llevan un flujo a presión, dichas tuberías son susceptibles de presentar en algún momento fenómenos de corrosión y10 incrustación. Una de las causas de corrosión en las tuberías es la fijación y crecimiento de microorganismos entre los que se puede mencionar a las bacterias sulfato- reductoras, bacterias del fierro, bacterias del limo, algas, hongos, etc. Por esta razón se han creado programas de control que contrarresten el crecimiento microbiológico. Dicho programa se está llevando a cabo en el complejo Abkatun, entre 'personal de PEMEX y de la Linea de Investigación de tratamiento de fluidos, de la Gerencia de Ingeniería de Producción del Instituto Mexicano del Petróleo.

El control del crecimiento microbiológico es solo una pequeiia parte de todo el programa de control de la corrosión que se lleva a cabo en el complejo de inyección de agua, sin ser por esto de poca importancia. La forma más común de tratar este problema es mediante el suministro de productos que inhiben o anulan el crecimiento de microorganismos, a estos productos se les llama biocidas.

Los biocidas son productos químicos que interactúan con las células de los organismos al estar en contacto con ellos, afectándolas hasta que mueren.

Por su composición química los biocidas se clasifican en: orgánicos, inorgánicos y

De acuerdo a su mecanismo de acción los biocidas se dividen en: mixtos.

1

MICROBIOCIDA

NO OXIDANTES

Metales pesados

Surfactantes

Sales cuaternarias de amonio

Compuestos fenólicos clorados

Compuestos órgano sulhrados

Sales de cobre

Aminas

OXIDANTES

Cloro

Propionamidas brominadas

MECANISMO DE ACCION

Atraviesan la pared celular y penetran al citoplasma destruyen proteínas.

Reducen la permeabilidad de la célula.

Reaccionan quimicamente con las cargas negativas asociadas con la pared celular.

Primero atacan la pared celular y después penetran, formando una suspensión coloidal con el citoplasma. Inhiben la reacción metabólica enzima- sustrato. Reaccionan en forma competitiva por la enzima en lugar del metabolito normal. Atacan también otros sitios enzimáticos.

Son alguicidas y bactericidas pero no afectan a los hongos.

Son alguicidas efectivos

Se dfinde a través de la pared celular de los microorganismos, reacciona con el citoplasma y produce enlaces estables con el nitrógeno de las proteínas.

Reacciona con ciertos grupos de proteínas, lo cual detiene la óxido reducción.

2

Los biocidas pueden ser de amplio espectro o para un grupo específico (bacterias,

La eficiencia de los biocidas está en fbnción de varios factores tales como: el algas, hongos).

tiempo de exposición de los organismos al biocida y la concentración del mismo.

La concentración y tiempo de exposición del biocida en un complejo de inyección de agua, se determinan después de haberlo dosificado y hacer un monitoreo de la población microbiológica. A partir de estos datos se planean los periodos y tiempo de dosificación, así como la concentración del biocida (Nalco, 1979).

No se deben utilizar altas concentraciones de biocida porque contaminarían el flujo

En el laboratorio se puede conocer la eficiencia de un biocida teniendo las que los transporta y por otro lado por el alto costo que implicaría

siguientes ventajas:

a) Conocer si el biocida es de amplio espectro o solo específico para un grupo de microorganismos b) Conocer la concentración óptima del biocida para su mayor eficiencia c) Determinar si la acción del biocida es inmediata o requiere de tiempo para actuar.

PROBLEMAS CAUSADOS POR L A S BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS Y HONGOS EN UN SISTEMA DE INYECCION DE AGUA.

El acercamiento de las bacterias hacia la superficie de la línea de transporte de agua, se produce por medio de fberzas de naturaleza fisicoquímica de atracción y repulsión (Fuerzas de London-Vander Waals, movimiento browniano, atracción electrostática e interacciones hidrófobas) y seguidamente se establecen contactos por medio de polímeros extracelulares . Este proceso de fijación es irreversible y puede realizarse en forma permanente, o temporal si hay algún agente que lo elimine (Ramírez, 1992):

El desarrollo de una comunidad de microorganismos sobre superficies en contacto con el agua es un proceso secuencial iniciado con la formación de UM película llamada "biofilm" o biopelícula . Esta biopelícula está compuesta por una intrínseca asociación de microorganismos, sus productos de secreción y partículas de materia orgánica e inorghica (Ramírez, 1992).

3

La matriz que incluye las células de cada uno de estos organismos y los adhiere a la superficie del metal, está básicamente formada por polímeros aniónicos polisacáridos altamente hidratados, que contienen largas cadenas de ácidos urónicos

La biopelícula (biofilm) se desarrolla como un proceso natural, en todos los sistemas acuáticos. Y las áreas internas del mismo, tienden a ser anaeróbicas aún en sistemas aerobios (Costerton,1988). Al establecerse la anaerobiosis en las partes internas del biofilm, las bacterias sulfato-reductoras encuentran un ambiente favorable para reproducirse, y esto gradualmente produce microcolonias de cblulas cerca de la superficie del metal.

Algunas microcolonias no permanecen con una sola especie y las primeras colonizadoras atraen a segundas colonizadoras por sus productos metabólicos. Esta unión metabólica bombea moléculas y/o protones al sustrato para colonizar la superficie metálica.

Una vez que las bacterias sulfato-reductoras sésiles se establecen en la superficie del metal, comienza el proceso de formación de celdas de corrosión y es posible que se lleguen a formar desde cavidades hasta prohndas picaduras. La generación de H2S producido por las sulfato-reductoras aumenta la corrosividad del agua cuando fluye a través de los ductos (PEMEX-I.M.P., 1990).

Con respecto al efecto de los hongos en la corrosión de metales se encuentran trabajos recientes como los de Ayllón (1988), Pope (1984) y McKenzie (1977) que reportan que algunas especies de hongos tienen efecto corrosivo sobre el aluminio.

Por otro lado Videla (1988) realizó un estudio sobre el efecto de contaminación por hongos en tanques de keroseno, en dicho estudio report6 que cuando no se controla el pH en el medio, los hongos tienen un efecto corrosivo sobre el acero similar al k i d 0 cítrico. Este es uno de los pocos trabajos donde se menciona la influencia de los hongos en la corrosión del acero.

4

OBJETIVOS

1. Conocer la eficiencia de tres biocidas comerciales utilizados para el control de hongos y bacterias sulfato-reductoras en el sistema de inyeccibn de agua del complejo Abkatun.

2. Establecer o adecuar una técnica que permita evaluar la eficiencia de biocidas en hongos y bacterias sulfato-reductoras.

3. Formar una colección de cepas de hongos para que sirvan de material de trabajo en el Laboratorio de Bacteriología de la linea de Investigación de tratamiento de fluidos.

4. Identificar si es posible las especies de hongos que heron aislados del agua de g l b"

mar, valiéndose de técnicas de microcultivos y microscopía.

OBJETIVOS ESPEClFICOS

1. Practicar técnicas de aislamiento y cultivo de microorganismos, como bacterias y hongos.

2. Comparar la eficiencia de tres biocidas que se esth usando actualmente en el complejo Abkatun.

3. Manejar el equipo que se usa en el Laboratorio de Microbiología.

4. Colaborar en las actividades que se requieran en el laboratorio de Bacteriología, de la Linea de Investigación de tratamiento de fluidos.

5

AREA DE ESTUDIO

El complejo de Inyección de agua Abkatun, se encuentra localizado en la sonda de Campeche a 19O 15' 42" Latitud Norte y a 92' 12' 24" Longitud Oeste.

Dicho complejo se ubica a 43.65 millas naúticas de Cd del Carmen, Camp. y a 74 millas naúticas del puerto de Dos Bocas,Tab.

Está constituido actualmente por ocho plataformas de las cuales, cinco son propiamente las de hyeccibn de agua,. conocidas como pIatafonnas satdites, ABK N, ABK R, ABK Q, ABK S y AJ3K P , ademb una de tratamiento y bombeo (PTB), una de control y servicios (PCS) y la que constituye la habitacional.

Este complejo pertenece a Petróleos Mexicanos. En el diagrama 1 se muestra la situación geogrhfica del complejo, y en el diagrama 2 se observa la distribucibn del complejo.

DIAGRAM2 I

c

Bar,

1. COMPLEJOABKATUN SITUACION GEOGRAFICA 93' , / y 92' 0 .

* A B K A T W - 1 9

de , ,

T6rminnc

1 5 3 8 4 6

DIAGRAMA 2. COMPLEJO ABKATUN

ABKP

ABKR

DISTRIBUCION GENERAL

7

ANTECEDENTES

El uso de biocidas en la Industria del Petróleo es relativamente reciente si consideramos que uno de los primeros trabajos es el de Paul Pena que report6 algunos biocidas que destruyen bacterias y hongos.Donde se daba a conocer la existencia de productos que se podían usar a nivel industrial para el control de microorganismos.

En 1982 Smith publicó su artículo " Biocides in Fuels ". En el aií0 de 1981 Garcia Esquive1 realiió como trabajo de tesis el proyecto titulado " Estudio Microbiológico del agua de los sistemas de enfriamiento del complejo Petroquímico de Pajaritos, Ver. y evaluación de biocidas ".

A partir de esta fecha los trabajos hacen más énfasis en la comparaci6n de biocidas en cuanto a su eficiencia. En 1988 Costerton reportó la relación entre el monitoreo de la corrosión con los Biofilms Bacterianos y las estrategias de uso de biocidas

Posteriormente los estudios realizados los elaboraron en 1994 Sweeny con "A novel nonoxidizing biocide for cooling water systems", y Rupi que publica su artículo "Biocide comparison: aldehyde versus mixture of aldehyde and quaternaq amine".

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METODOS

El presente estudio se llevó a cabo en dos etapas. La primera consistió en aislar bacterias sulfato-reductoras y hongos de muestras de agua del Complejo Abkatun para utilizarlos posteriormente en las pruebas de laboratorio. Dichas muestras se tomaron en los mismos puntos que actualmente se usan en el programa de control de la corrosión siendo los siguientes:

Captación, salida de filtros, salida de planta y plataformas satélites.

La segunda etapa consistió en realizar las pruebas de eficiencia de los biocidas en el laboratorio de Bacteriología, dentro del Instituto del Petróleo.

El aislamiento de bacterias sulfato-reductoras se llevó a cabo "in situ", tomando un ml de agua del flujo de cada punto de muestre0 e inoculándolo en fiascos ampoviales con medio de cultivo según la norma API RP 38. Los hongos se aislaron a partir de un concentrado de agua , obtenido mediante la filtración de la misma a través de una membrana Millipore de 48 mm de diámetro y 0.45 pm de abertura de poro, después se sembró en agar dextrosa y papa.

Los hongos que se aislaron keron sembrados con la tbcnica de microcultivo, después se hicieron preparaciones semipermanentes para observarlos al microsc6pio.

EFICIENCIA DE LOS BIOCIDAS

Se utilizaron tres biocidas denominados BIO-1, BIO-2, y BIO-3. Para probar su eficiencia con bacterias sulfato-reductoras, se usó medio de cultivo API líquido en fiascos ampoviales (NACE, 1990). A partir de un cultivo reciente, se tomaron 3 alícuotas para usarlas como blancos de cada uno de los biocidas y otras 3 se usaron para elaborar cultivos con dosificaciones de 40, 80, 120 y 200 ppm de cada uno de los biocidas. Se monitoreó el crecimiento bacteriano cada 2 hrs. durante 8 horas, y después a las 24 hrs. y a las 72 hrs. .

En el caso de los hongos se hicieron tres pruebas , que son modificaciones de una técnica que actualmente se está usando en el Laboratorio de Bacteriología , ya que la norma que se consultó no especifica el procedimiento exacto que se debe usar (ASTM E 645-91). La primera consistió en agregar dosificaciones de 25, 50, 100,250 y 350 ppm de cada biocida al agar y después de que solidificó en las cajas de petri, se sembraron los hongos mediante picadura con asa (Fig. 1).

9

En la segunda prueba se inoculó caldo nutritivo al 50 % con esporas de un hongo, después se inocularon en matraces con caldo nutritivo al 50 % ; donde se tomó uno como blanco y a los otros se les dosificó el biocida a las mismas concentraciones que en la primera prueba (Fig. 2).

La tercera prueba hé una adecuación basada en los resultados anteriores, primero se inoculó un matraz con caldo nutritivo al 50 % y a partir de este se inocularon 5 matraces con agua de mar estéril con 0.1 % de caldo nutritivo, uno se tomó como blanco y a los otros se les dosificó el biocida a concentraciones mayores que en las pruebas anteriores (400, 800, 1000 y 1500 ppm), como se muestra en la Fig. 3..

La eficiencia de un biocida se reporta en porciento y los cálculos se hacen como sigue:

Para bacterias sulfato-reductoras:

% Eficiencia = Q?. inicial - P. final 1 x 100 P. inicial

P. inicial - población inicial P. final. - poblaci6n final

Para los hongos se tomó en cuenta la presencia o ausencia y el &ea de cobertura en la caja de petri..

En las figuras 1, 2 y 3 se muestran las pruebas que se hicieron para la eficiencia

En la figura 4 se observa la prueba de eficiencia de los biocidas con bacterias de los biocidas con hongos.

sulfato-reductoras.

En el anexo 1 se detallan las t6cnicas utilizadas.

10

HG.1 PRIMERA PRUEBA DE EVALUACION DE UN BIOCIDA CON HONGOS

AGAR CON DOSlFlCAClONES DE BlOClDA

50 PPI

AGAR DEXTROSA Y

PAPA ESTERIL BLANCO

AGAR DEXTROSA PAPA

SIEMBRA DE HONGOS MEDIANTE PUNTEO

/

11

" . ..

FIG.2 SEGUNDA PRUEBA DE EVALUACION DE UN BIOCIDA CON HONGOS.

CALDO NUTRITIVO CON BIOCIDA

CALDO I IYT I IT IVO AL 3 0 s

IMOCULADO C O N E 8 C O I A 8 D E BLANCO H O Y 0 0 8

24 HRS

SIEMBRA

t l rn l

I l r n l

PLACAS CON AGAR DEXTROSA Y PAPA

INCUBACION A

55 'C POR 72

AGAR DEXTROSA PAPA

YONITOREO CADA 2 H R L D U W T E 10 HRS.

12

2 L

e 4 Q a

FIGURA 4, DISENO DE LA PRUEBA DE LOS BIOCIDAS CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS

1 m1

1 m1 1 ml 1 ml

DE MEDIO A.P.I. CON LAS DOSIFICACIONES DE LOS BlOClDAS SULFATO4EDUCTORAS

\ *h

1 ml

7 * * *

lml 1 mi 1 ml

REPETIR E l PROCEDIYIENTO PARA LAS CUATRO COWCENTRACIOIIES

I

14

RESULTADOS

Aislamiento y Cuantificaci6n de Microorganismos.

En la primera etapa del trabajo se llevó a cabo el aislamiento y cuantificación de los organismos que se utilizaron para la prueba, durante un ciclo semestral. La figura 11 muestra el número de especies de hongos que se aislaron mensualmente. En total íüeron 11 diferentes de especies las que se obtuvieron.

La figura 12 muestra el promedio mensual de bacterias sulfato-reductoras aisladas en el mismo ciclo y se puede observar que en los meses de Octubre de 1993 y Febrero de 1994 fié donde se incrementó la población.

Evaluaci6n de Biocidas con Hongos

Se llevaron a cabo tres pruebas para determinar la eficiencia de los biocidas con hongos. En la primera prueba se utilizó el biocida BIO-03 a concentraciones de 25, 50, 100,250 y 350 ppm. En esta prueba se esterilizó el agar dextrosa y papa con las diferentes concentraciones de biocida, luego de que se solidificó se sembraron los hongos por medio de punteo con un asa de siembra, distribuidos en cuatro cuadrantes, esperando que por cada cuadrante en donde hubiera crecimiento se tomaría como 25 5 de efeiciencia del biocida. Los resultados se muestran en la figura 5, donde de los nueve tipos de hongos que se utilizaron solo uno presentó inhibición de crecimiento a 50 ppm. Antes de probar los otros biocidas se decidió modificar el método por razones que se explican en la discusión de resultados.

La segunda prueba se realizó exponiendo las esporas a un medio líquido con nutrientes y con concentraciones conocidas del biocida, para posteriormente monitorear el crecimiento con respecto al tiempo. Los resultados esth en la figura 6, donde el crecimiento para todas las concentraciones en un lapso de 8 horas fbC del 100% del kea de la caja. La eficiencia se tomó en íünción de la densidad de crecimiento en la caja.

La tercera prueba se realizó exponiendo esporas en agua de mar estéril con una concentración mínima de nutrientes y con concentraciones de biocida mucho mayores que las usadas en las pruebas anteriores. Además se monitoreó el crecimiento a las 24 y 72 horas de haber dosificado el biocida. En la figura 7 se muestran las grhficas del crecimiento de los hongos con respecto al tiempo para las diferentes concentraciones utilizadas.

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.. . ..“-I)”.. ” . _,. I

La eficiencia de los biocidas con hongos solo se tom6 en base a la presencia o ausencia y a la cobertura de crecimiento en la caja. De acuerdo a esto los biocidas BIO-01 y BIO-03 fincionaron mejor a 1500 ppm en un tiempo de 2 hrs. de exposici6n . En el caso del BIO-03 solo inhibió el crecimiento por unas horas.

Evaluaci6n de los Biocidas con Bacterias sulfato-reductoras.

Las figuras 8, 9 y 10 corresponden a los resultados del crecimiento de bacterias sulfato-reductoras expuestas a los tres biocidas. También se monitoreó el crecimiento de las bacterias a las 24 y 72 horas. La eficiencia de los biocidas BIO-O1 y BIO-02 fié del 100% para todas las concentraciones, y del BIO-03 fué del 0% para una concentración de 40 ppm y del00 % para las demás concentraciones. En la discusión de resultados se explica las posibles causas de estos resultados.

Hongos aislados

En las fotografias 1-14 se observa el aspecto general de las colonias de las especies que se aislaron, para algunas de ellas se muestra una vista de sus estructuras de reproducción con un aumento de 40x. Por falta de tiempo no fbé posible hacer la identificación de las especies.

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FIG, 5 PRIMERA PRUEBA DE LOS BIOCIDAS CON HONGOS (BIO.03)

25 50 1 O 0 250 350

CONCENTRACION DEL BlOClDA EN ppm

* 8 ESPECIES * 1 ESPECIE

17

FIG, 6 SEGUNDA PRUEBA DE LOS BIOCIDAS CON HONGOS(BIO~O1)

E E! z Y a

z

o z O o U W a a

120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%

O 2 4 6 8

CONCENTRACION DEL BlOClDA EN ppm

*25,50,100,250 Y 350 pm +BLANCO

18

FIG. 7 TERCERA PRUEBA DE LOS BIOCIDAS CON HONGOS.

REOULAR

CAN NULO

NULO

. .

"

. .

O 2 4 8 10 24 72

TIEMPO EN HORAS

*400ppmt800ppm*1000ppm*1506ppm*BUNCO

BIOCIDA BI0.01 CON HONGOS,

CAM NULO"

NULO I

O 2 4 8 10 ' 24 R V ' V

TIEMPO EN HORAS

+466pprnt80Oppm*1oO0ppm*15ooppm*cBLANco

BIOCIDA BIO-02 CON HONGOS,

K o

O 2 a o IO 24 72

TIEMPO EN HORAS

+4aoppm +aOappm +lOOOppm *15Wppm *BLANCO

BIOCIDA BIO-03 CON HONGOS,

19

FIGURA 8. BIOCIDA BIO-O1 CON BSR

1.000E+07 I 1.000E+06

1.000E+05

1 .000E+04-s

O 2 4 8 10 24 72

TIEMPO EN HORAS

-40,80,120 Y 200 ppm +BLANCO

20

FIGURA 9. BIOCIDA BIO-02 CON BSR

1.000E+01

O 2 4 8 10 24 72

TIEMPO EN HORAS

* 40,80,120 Y 200 ppm *BLANCO

21

FIGURA 10. BIOCIDA BIO-03 CON BSR

O 2 4 8 1 0 2 4 i

TIEMPO EN HORAS

* 40 ppm '80,120 Y 200 ppm *BLANCO

2 2

FOTOGRAFIAS DE LAS COLONIAS DE LOS HONGOS AISLADOS DEL COMPLEJO ABKATUN

!

23

ESPECIE # 5

24

ESPECIE # 7 40 X

25

ESPECIE # 8

ESPECIE # I1 40 x

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DISCUSION DE RESULTADOS

AISLAMIENTO DE ORGANISMOS

El aislamiento de hongos y bacterias sufito reductoras se llevó a cabo solo para tener ejemplares de organismos que se desarrollan en las condiciones ambientales del Complejo Abkatun, que es donde interesa tener un control microbiológico y por tanto conocimiento de la eficiencia de un biocida. El anas is de la cantidad de organismos encontrados mensualmente está en fbnción de los periodos en que se suministró biocida en la planta de tratamiento y bombeo.

EVALUACIóN DE LOS BIOClDAS CON HONGOS

En la primera prueba que se realizó con hongos, se utilizó el biocida BIO-03 , cuyo componente activo son compuestos de sales de cuaternario de amonio. El crecimiento de las nueve especies utilizadas se'consideró como del 100% del kea de la caja. Analizando las posibles causas hay dos razones: la primera es que las concentraciones utilizadas heron muy bajas para hongos, la segunda fbé que el m&odo no cuenta con las bases suficientes para poder ver la eficiencia de un producto. Se tenía la idea de que al colocar el biocida en el agar y después sembrar con asa los hongos, se podía ver la eficiencia por el área de crecimiento en cuatro cuadrantes en los que se dividió la caja; sin embargo, es posible y lógico que las condiciones en los cuatro cuadrantes son exactamente las mismas, entonces no hay razón para que los hongos solo crezcan en un cuadrante.

A partir de este análisis se disefió UM prueba en la cual las esporas estuvieran expuestas al biocida y desde donde se pudieran monitorear cada determinado tiempo. Esta hé la base de la segunda prueba con hongos (Fig. 2), en donde se utilizó el BIO-O1 y aún así crecieron en toda la caja con una densidad y apariencia igual a la del blanco. La última posibilidad era aumentar la concentración del biocida y mantener los principios de la prueba anterior. Los resultados fberon los esperados, y como se observa en la fig. 7 a mayor concentración del biocida el crecimiento es menor. En esta última prueba se utilizaron los tres biocidas propuestos y la fig. 7 muestra que BIO-O1 y BIO-02 tienen mayor eficiencia a 1500 ppm, en tanto que BIO-03 la tiene a 1000 ppm pero al ver la concentración de 1500 ppm se ve que el crecimiento reincide y que el biocida solo actúa como un fbngistato a s í que es posible que lo mismo sucedería con las 1000 ppm si se hubiera monitoreado más tiempo.

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Estos resultados demuestran que los biocidas que se utilizaron no tienen poder fbngicida, y de los tres aún menos el BIO-03.

EVALUACION DE LOS BIOClDAS CON BACTERIAS SULFATO- REDUCTORAS

En las figuras 8 y 9 se puede observar que los biocidas BIO-O1 y BIO-02 tienen una eficiencia del 100 % , pero en términos de evaluación de un producto esto no es confiable; en primer lugar las concentraciones que se usaron debieron ser del rango inferior y superior a 40 ppm que fié en donde ya no hubo crecimiento de bacterias desde la hora en que se dosificó el biocida, y por otro lado se debi6 monitorear en espacios de tiempo m& cortos, sin descartar los monitoreos a las 24, 48 y 72 horas de haber dosificado el biocida. Estos últimos monitoreos nos dan la pauta para analizar si el biocida fbnciona como tal o solo es un biostato. La finalidad era encontrar una curva de la tasa de mortalidad con los parhetros de concentración y tiempo.

Para el caso del biocida BIO-03 se encontró que no es eficiente a 40 ppm pero a partir de 80 ppm la muerte de las bacterias es total. Igual que en el caso de los otros biocidas las concentraciones debieron ser cercanas a 40 ppm para establecer la curva de mortalidad, estas sugerencias son posibles de llevar a cabo en el laboratorio pero, por cuestión de tiempo ya no se hicieron

Con respecto a la eficiencia del BIO-03 tanto en hongos y BSR es claro que fié menor con respecto a los otros. Prasad (1994) establece que el glutaraldehido es m b eficiente que los compuestos de amonio cuaternario (componente activo de BIO-03), y aunque no se conoce cual es el activo de BIO-O1 y BIO-02 si se puede pensar que no es el mismo que el de BIO-03.

CONCLUSIONES

1.La eficiencia de los biocidas utilizados es muy diferente en hongos y en bacterias sulfato- reductoras, mientras que a las bacterias l a s controla a concentraciones bajas, los hongos necesitan concentraciones altas.

2. El control microbiológico en el complejo de Inyección de agua debiera usar combinaciones de biocidas para los diferentes tipos de organismos.

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3. Antes de iniciar una evaluación de biocidas con determinados organismos, es conveniente hacer prueba preliminares tanto del método como de las concentraciones a usar.

4. En el caso de las bacterias, sulfato-reductoras sería conveniente utilizar una cuantificación en placa para no trabajar con rangos de población, que es lo que se obtiene con fiascos ampoviales y es una solo una aproximación del número de organismos.

5. Cuando se dosifique un biocida es importante realizar pruebas de bioensayos con otros organismos, ya que siendo productos fabricados para matar, pudieran tener un efecto nocivo para la flora y fauna de las zonas a l e d m a un complejo de inyección de agua.

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BIBLIOGRAFIA

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30

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ANEXO 1

TECNICAS UTILIZADAS

TECNICAS UTILIZADAS

HONGOS

Aislamiento

1. Se colecta la muestra de agua, dejándola fluir durante 30 minutos aproximadamente a través de una membrana millipore de 0.45 pm de diámetro de abertura de poro y 48 mm de diámetro.

2. La membrana se coloca después dentro de un fiasco de vidrio con un poco de agua tomada del mismo flujo y se cierra para ser transportada al Laboratorio.

Siembra

1. Preparar agar dextrosa y papa, al mismo tiempo preparar una solucibn de tícido tartluico. Esterilizar ambos a 15 Lbs de presi6n por 15 minutos.

2. Ajustar el pH del medio de cultivo a 3.5, vaciar 15 ml de agar a cada caja de petri y dejar que solidifique.

3. Agitar vigorosamente la muestra, después tomar aproximadamente 1 ml de ella y vaciar sobre el agar. Con ayuda de un triángulo de vidrio, esparcir el líquido sobre la superficie.

4. Dejar en la incubadora y revisar cada 24 hrs.

5. Cuando ya crecieron las colonias, se toma una porción de la colonia que está en la caja de petri con ayuda de un asa de siembra, y en otra caja con agar, se puntea para que las hifas o esporas queden en el medio de cultivo. Repetir en una caja diferente para cada tipo de hongo que se desarrolle en la caja de aislamiento.

6. Se dejan en incubación, revisando el cultivo cada 24 hrs.

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MICROCULTNO

1. En la base de una caja de petri que contenga PDA &lido, hacer con un marcador una cuadrícula da aproximadamente 1 cm de lado

2.. Con un bisturí mojado en alcohol y flameado, cortar el agar siguiendo las lineas marcadas en el vidrio

3. Con el mismo bisturí colocar un cuadrito de agar sobre un portaobjetos dentro de una caja estéril con material para microcultivo (varilla de U, cubre y portaobjetos).

4. Con el asa de siembra previamente flameada y doblada en hgulo recto, tomar un pequefio fiagmento de la colonia de las cajas de siembra e inocular un lado del cuadrito del agar. Hacer lo mismo en los tres lados restantes

5. Con unas pinzas flameadas poner un cubreobjetos est6ril sobre el agar.

6 . Con el mango del asa presionar ligeramente sobre el cubreobjetos con el fin de que se adhiera al agar.

7 . Con una pipéta estéril, vaciar 10 ml de ghcerol al 10 % en la caja de petri procurando no mojar el microcultivo.

8 . Incubar a 32OC, revisando cada 24 hrs. hasta observar crecimiento y espórulación . Usar un microscópio estereoscópico para mayor precisión en las observaciones.

9. Con una pipeta Pasteur desechar el glicerol y substituirlo por una solución de formo1 al 10 %. Dejar actuar por una o dos horas.

10. Hacer una preparación y observarla al microscópio.

TECNICA PARA HACER UNA PREPARACION SEMIPERMANENTE

1. Colocar una gota de azul de algodón lactofenol en el centro de un portaobjetos limpio.

2. Con unas pinzas separar el cubreobjetos del microcultivo y si es necesario quitar con una aguja de disección los restos de agar.

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3. Poner el cubreobjetos sobre la gota de colorante y presionar un poco sobre 61 con el fin de eliminar las burbujas de aire.

4. Sellar la preparaci6n con spray Merckoglas o bien con esmalte de uAas transparente.

5. A partir del portaobjetos se puede obtener otra preparacibn, quitando el cuadro de agar con ayuda de la aguja de disecci6n, poner una gota de colorante en el centro del crecimiento y colocar un cubreobjetos limpio, presionar para eliminar burbujas de aire.

BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS

Aislamiento

1. Se deja correr el agua (drenado) durante 5 minutos antes de colectar la muestra.

2. Se toma la muestra en bolsas o recipientes esterilizados , evitando lo siguiente: contaminaci6n por contacto con la muestra, turbulencia excesiva dentro del contenedor de la muestra, espacios de aire.

3. Inocular "in situ" la muestra en los fiascos ampoviales por medio de una jeringa estkril.

4. Incubar durante 14 dias a una temperatura de 35 -37'~.

Los fiascos ampoviales se hacen de acuerdo a la norma API RP38.

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