UNIDAD 3. BIOTECNOLOGÍA. TEMA 3.1 INGENIERÍA GENÉTICA.

El término “biotecnología” es relativamente nuevo para el público en general. Pero, la

biotecnología está presente en la vida cotidiana más de lo que la gente se imagina. De

hecho, la biotecnología es una actividad antigua, que comenzó hace miles de años cuando

el hombre descubrió que al fermentar las uvas se obtenía un producto como el vino.

También es biotecnología la fabricación de cerveza a partir de la fermentación de cereales

que el hombre empezó a elaborar hace 4.000 años, y la fermentación de jugo de manzanas

para la fabricación de sidra. En estos procesos intervienen microorganismos que

transforman componentes del jugo de frutas o de cereales en alcohol.

Asimismo es biotecnología la fabricación de pan mediante el

uso de levaduras, la elaboración de quesos mediante el

agregado de bacterias. El yogurt también es un producto que

se obtiene mediante procesos biotecnológicos desde la

antigüedad. Aunque en ese entonces los hombres no

entendían cómo ocurrían estos procesos, ni conocían la

existencia de microorganismos, podían utilizarlos para su

beneficio. Estas aplicaciones constituyen lo que se conoce

como biotecnología tradicional y se basa en la obtención y

utilización de los productos del metabolismo de ciertos microorganismos. Se puede definir

la biotecnología tradicional como “la utilización de organismos vivos para la obtención de

un bien o servicio útil para el hombre”.

En el mundo antiguo ya se aplicaban las propiedades

de las plantas para aliviar las enfermedades del ser

humano. En nuestro país, las culturas prehispánicas

desarrollaron un amplio conocimiento sobre los usos

de las plantas. Así, se aplicó el conocimiento sobre

los seres vivos, en particular las nociones sobre

genética en la obtención de productos biológicos. A

mediados del siglo pasado la producción de

alimentos se vio incrementada por la aplicación de nuevas tecnologías para mejorar el

rendimiento de los sistemas agrícolas y ganaderos. A estos cambios radicales se les llamó

“Revolución verde” por la comunidad internacional. Por un lado, se utilizaron fertilizantes

que mejoraban la fertilidad del suelo, y por otro, se controlaron las plagas por el empleo de

insecticidas, herbicidas y fungicidas. Además, se seleccionaron genéticamente las plantas

más adecuadas y se produjeron variedades de arroz, trigo y maíz. De esta forma, la

producción se incrementó de forma espectacular y se creía que pronto desaparecerían el

hambre y la desnutrición.

A pesar de los buenos resultados en la producción de alimentos, surgieron complicaciones

inesperadas, como: la contaminación de los alimentos por el uso de agroquímicos; la

aparición de plagas resistentes a los plaguicidas; los costos más elevados que tuvieron que

absorber los pequeños agricultores; la transformación de los ambientes naturales en

sistemas de cultivo de un solo tipo o monocultivos; la pérdida de la biodiversidad; la

erosión y la desertificación del suelo; los altos costos de la irrigación y el cambio en los

patrones de consumo de la población. En la actualidad se llevan a cabo mejoramientos

genéticos en plantas y animales de importancia alimenticia. La modificación del genoma de

los seres vivos se ha hecho desde 1978, cuando la ingeniería genética ya había modificado

el genoma de bacterias, al introducir el gen humano de la insulina. Desde entonces se han

realizado modificaciones en el material genético

La biotecnología moderna.

Actualmente, los científicos comprenden

mucho más cómo ocurren los procesos

biológicos que permiten la fabricación de

productos biotecnológicos. Esto les ha

permitido desarrollar nuevas técnicas a fin de

modificar o imitar algunos de esos procesos y

lograr una variedad mucho más amplia de

productos. Los científicos hoy saben, además,

que los microorganismos sintetizan compuestos químicos y enzimas que pueden emplearse

eficientemente en procesos industriales. Estos conocimientos dieron lugar al desarrollo de

la biotecnología moderna.

La biotecnología es todo uso o alteración industrial o comercial de organismos, células o

moléculas biológicas encaminado a alcanzar metas prácticas específicas. La biotecnología

moderna genera material genético alterado mediante la ingeniería genética. En muchos

casos la ingeniería genética comprende la producción da ADN recombinante por

combinación del ADN de organismos diferentes. El ADN se transfiere entre organismos por

medio de vectores como plásmidos bacterianos, por ejemplo. Los organismos resultantes se

describen como transgénicos. Algunas de las metas principales de la ingeniería genética son

mejorar el conocimiento de la función de los genes, tratar enfermedades y mejorar la

agricultura.

La recombinación natural del ADN se lleva a cabo mediante procesos como la reproducción

sexual (durante el entrecruzamiento), la trasformación bacteriana, donde las bacterias

adquieren ADN de plásmidos y otros bacterias, y la infección viral, en la que los virus

incorporan fragmentos de ADN de sus huéspedes y transfieren los fragmentos a miembros

de la misma o de otra especie. ¿Cómo se recombina el ADN en los laboratorios de

ingeniería genética? En el laboratorio el ADN se corta en fragmentos mediante enzimas de

restricción. Estos fragmentos se insertan en un

vector, que hace posible la replicación del ADN

dentro de una célula huésped. La unión de un

fragmento de ADN y un vector produce

moléculas de ADN recombinante.

La biotecnología moderna se puede definir

como una actividad multidisciplinaria, cuyo

sustento es el conocimiento de frontera

generado en diversas disciplinas (entre otras:

biología molecular, ingeniería bioquímica,

microbiología, inmunología, bioquímica, genómica, bioinformática e ingeniería de

proteínas), que permite el estudio integral y la manipulación de los sistemas biológicos

(microbios, plantas y animales). A partir de dicho estudio integral y del uso de los sistemas

biológicos, sus productos y sus partes, la biotecnología moderna busca hacer una

utilización inteligente, respetuosa y sustentable de la biodiversidad, mediante el desarrollo

de tecnología eficaz, limpia y competitiva para facilitar la solución de problemas

importantes en sectores tales como el de la salud, el agropecuario, el industrial y del medio

ambiente. De lo anterior, se desprende que hay un conjunto de disciplinas y campos

disciplinarios (alimentos, agronomía, agrobiotecnología, biorremediación, medicina

molecular, monitoreo y diagnóstico, etc.), que se sustentan a su vez en la biotecnología.

Actualmente es rutina aislar fragmentos concretos de un genoma para obtener su secuencia

y estudiar su función. También es corriente poder introducirlos en otro organismo diferente

y analizar sus características de expresión o modificar el fenotipo del organismo receptor.

Así, aislar, caracterizar y modificar el ADN es posible gracias a la tecnología del ADN

recombinante, al conjunto de métodos experimentales que permiten introducir un

fragmento de ADN de una especie en otra y hacer que el organismo receptor lo exprese

como si fuera suyo. Los fragmentos de interés se obtienen tratando el ADN con

endonucleasas de restricción, estas enzimas pueden cortar la doble hélice de dos maneras

produciendo extremos cohesivos. Una vez aislado este segmento, el paso siguiente es

incorporarlo a un vector de clonación, con sitios de restricción compatibles, y sellar

covalentemente los extremos gracias a la acción de una ADN ligasa para originar una

molécula de ADN recombinante. La elección del vector depende del tamaño del segmento

de ADN que se quiere clonar. En la siguiente figura se representa esta recombinación de

ADN.

Los plásmidos (vector), además de transportar los genes de interés, contienen genes que

confieren propiedades importantes al hospedador, como la resistencia a antibióticos, que

pueden permitir el proceso de selección posterior. Además de utilizar bacterias o levaduras

como células receptoras de las moléculas de ADN recombinante, hay vectores para

conseguir la transformación de eucariotas pluricelulares, como animales y plantas. A los

organismos modificados genéticamente se les denomina transgénicos. Todas estas

metodologías, junto con el desarrollo de las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos

cada vez más precisas y automatizadas, la amplificación de pequeñas cantidades de ADN

mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cartografía física y el análisis

funcional de los genes, todo ello y más ha permitido la expansión de la genómica. Estos

estiletes moleculares han abierto de par en par la puerta de la investigación de las

funciones genéticas en organismos pluricelulares.

Pero los avances no son puramente científicos. Desde el primer desarrollo en la década de

1970, los objetivos tecnológicos de la llamada ingeniería genética, son evidentes. El

repertorio de aplicaciones de la biotecnología es extraordinario: producción de moléculas

de interés farmacológico (hormonas, antibióticos) o alimentario (vitaminas, aditivos), diseño

de organismos con características deseadas (plantas resistentes a la salinidad, peces de

crecimiento rápido, etcétera. INGENIERÍA GENÉTICA.

• La Ingeniería Genética es la ciencia biológica que

trata de la manipulación de los genes. La

aplicación de los conocimientos de la Ingeniería

Genética constituye la Biotecnología.

• El ADN puede cortarse en fragmentos por medio de las enzimas de restricción. Estos

fragmentos quedan con unos extremos o bordes cohesivos, también llamados

bordes pegajosos, que hacen que se puedan unir fragmentos de distinto origen,

formando un ADN llamado recombinante.

• En Ingeniería Genética es necesario la obtención de muchas copias de fragmentos

de ADN para su estudio y manipulación. Se consigue mediante la clonación, que

puede ser "en vivo" utilizando células que actúan como agentes replicativos, o "in

vitro", mediante la PCR, (Reacción en Cadena de la Polimerasa).

• Para introducir ADN recombinante en células hospedadoras, se recurre a elementos

génicos llamados vectores génicos. Estos son los plásmidos, los bacteriófagos y los

cósmidos.

• La localización de determinados segmentos de ADN se lleva a cabo mediante

diversas técnicas, entre las que destacan las sondas de hibridación.

• La determinación de la secuencia de nucleótidos de un ADN se puede realizar por

diversos métodos, como el de Sanger o de los didesoxinucleótidos.

• La Biotecnología es importante en medicina, agricultura y ganadería y reporta una

serie de provechos, entre ellos está la síntesis de productos necesarios para la vida,

diagnosis y remedio de muchas enfermedades, la prevención de enfermedades

hereditarias y la consecución de plantas y animales transgénicos.

• El estudio del genoma humano, gracias a la tecnología de la ingeniería genética,

completado en junio de 2000 abre un campo imposible de predecir y cuya finalidad

es producir mejoras en la humanidad.

• Todas estas investigaciones y aplicaciones, deben ser realizadas teniendo en cuenta

las normas universales de la ética, la dignidad humana y la conservación de la

naturaleza, constituyendo un patrimonio común a todos los pueblos.

La ingeniería genética es una técnica que consiste en la introducción de genes en el

genoma de un individuo que carece de ellos. Se realiza a través de las enzimas de

restricción que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN

recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño un un ADN

receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular.

Técnicas biotecnológicas de la Ingeniería genética.

La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que

destacan:

• la tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un

fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

• La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o secuencia de los

nucleótidos que forman parte de un gen.

• la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el

número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una

mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite

para un determinado estudio.

• las aplicaciones de la ingeniería genética: Son numerosas las aplicaciones prácticas

y comerciales de la ingeniería genética.

Se abre un campo que nos ofrece además la posibilidad de utilizar plantas y animales

transgénicos así como microorganismos modificados genéticamente para producir

fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la

insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto

perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser humano y en el propio planeta.

La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten

manipular el genoma de un ser vivo.

Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que

llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las células

de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la

información de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir que "cortamos"

un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que

regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al ponérselo a una bacteria es "obligar" a

ésta a que fabrique la insulina. Por lo tanto en la tecnología del ADN recombinante

podemos diferenciar cuatro etapas básicas:

1. Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la

utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que

pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas se aislaron en

bacterias y se identifican con distintos nombres, siendo lo característico de ellas

estos dos principios:

o Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de

nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN.

o Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque

pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la

misma enzima de restricción.

En los siguientes dibujos puede verse como actuarían estas enzimas.

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se aprecia la actuación en ambas hebras.

En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción.

Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosos

por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie

diferente.

Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción,

se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que

llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos. Según donde

se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado

en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay que

confirmar.

En el proceso de la electroforesis se prepara una mezcla de fragmentos de ADN y se ponen

en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazan en relación inversa con su tamaño, los

fragmentos más pequeños se mueven rápidamente, mientras que los grandes lo hacen muy

lentamente.

Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado,

que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras.

Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para

autorreplicarse dentro de las células hospedadoras. Se utilizan con frecuencia dos tipos de

vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras.

• Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del

cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que

tienen su propio origen de replicación.

En esta secuencia de dibujos se puede ver

como se realiza la inserción de un gen en

un plásmido.

En la figura tenemos un gen(color rojo)

que interesa insertar en un plásmido

(color turquesa)

En la figura, vemos como una enzima de

restricción ha cortado el gen y el plásmido,

quedando unos bordes cohesivos o

pegajosos.

La unión del ADN que contiene el

gen que se desea clonar con el

vector de clonación, se realiza por

medio de otras enzimas,

denominadas ADN-ligasas, que

unen ambos trozos de ADN. El

resultado es una molécula de ADN

recombinante, ya que contiene

fragmentos de ADN de distinta

procedencia.

• Bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un

fragmento de ADN vírico (figura d) Posteriormente se ensamblarán las distintas

partes del virus (figura e). Así quedará el virus completo(figura f). En el siguiente

paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIÓN.

figura d

figura e

figura f

Aquí tienes otro pequeño juego para que construyas tu virus. Tienes dos moléculas de ADN

• Cósmidos.

Son plasmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un borde cohesivo

procedente del genoma del fago lambda (extremo cos)y se empaqueta en el interior de un

fago. Se construye el cssmido uniendo los tres elementos ginicos, y el resultado final es

poder introducir en la cilula receptora fragmentos largos de ADN.

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes

denominados marcadores

• Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen

el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen

marcador.

, que sirven para identificar las células que contienen el vector de

clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes

de bioluminiscencia.

• Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere

clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora

determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula

hospedadora es una célula eucariota.

Métodos de introducción del vector. El siguiente paso será introducir el vector de

clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta,

al multiplicarse, origine un clon celular

que lleve el gen concreto. Existen varios métodos

que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.

En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:

• Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se

consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y

químicos. La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo,

las introduce en su interior y las incorpora a su genoma. En las siguiente animación

puede verse el proceso.

• Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora

mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus. En la

siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al

virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya

con el gen que interesa clonar. El siguiente

momento 2, corresponde al contacto entre el virus

y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se

produce un poro por donde como vemos en la

etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la

célula bacteriana.

CLONADO DEL ADN

Clonado del ADN. Una vez que se ha conseguido la población de bacterias transformadas,

(recuerda que llevan además del gen de interés un gen por ejemplo de resistencia a un

antibiótico por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina), por lo que las bacterias que

se consideran transformadas, serán aquellas que sobrevivan.

El siguiente paso es poner a las bacterias en un medio de cultivo apropiado para que se

multipliquen. A la vez que se reproducen las bacterias lo hace también el plásmido con el

gen que interesa, el resultado es que se obtiene un clon de células que llevan todas ese gen

de interés. Se pueden formar por tanto diferentes clones con genes de interés para el

hombre. Este conjunto de clones se denomina biblioteca genómica.

Otra técnica propia de la Ingeniería Genética es la determinación de la secuencia de

nucleótidos de un ADN, conocida como secuenciación de dicho ácido nucléico.

Se ha conseguido gracias a las enzimas de restricción y a la posibilidad de obtener

numerosas copias de un ácido nucléico por clonación

Se pueden conseguir muchos fragmentos , de diversos tamaños y lo que se trata es de

recomponer la molécula original como si se tratase de un puzzle.

.

Así se han secuenciado genes, desde virus hasta el genoma humano.

El método más usado para la secuenciación es el conocido como técnica de terminación

de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conociéndose actualmente como la

técnica del didesoxi.

Se denomina así por ser necesario los didesoxirribonucleótidos

(figura 1), que han perdido

su grupo alcohol OH del carbono 3'. En la figura 2 vemos un nucleótido normal con el

grupo alcohol en el carbono 3'.

Figura 1

Figura 2

Como los nucleótidos se unen por este grupo OH del carbono 3', hay que pensar que si nos

encontramos con un didesoxinucleótido será imposible que se una otro nucleótido y la

cadena terminará aquí. Figura 3 (Es necesario tener esto presente para comprender la

técnica del didesoxi)

Figura 3

Abreviadamente, éste sería el método a seguir:Como la técnica se basa en la síntesis de

ADN, para hacer la reacción de secuenciación se necesita:

• Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a

secuenciar.

• Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido

complementario del extremo de la cadena.

• desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP.

• didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de

secuenciación.

Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el

incorporarse un didesoxinucleótido (Figura 4).

Figura 4

Se produce un conjunto de cadenas dobles cuyas longitudes dependen de la situación del

didesoxinucleótido incorporado. En el caso expuesto en el dibujo, esta reacción de

secuenciación se hace con un didesoxi de ADENINA, lo que significa que cuando se

incorpore esta Adenina no podrá continuarse la polimerización de nuevos nucleótidos, nos

queda por tanto un pequeño fragmento de ADN que termina en la ADENINA, lo que nos

dice que en el ADN original, en ese lugar estará el nucleótido complementario que lleva

TIMINA.

En el caso expuesto deducimos tres fragmentos con 5, 10 y 14 nucleótidos (sin contar el

cebador) en cuyos extremos tenemos ADENINA, nos permite interpretar que en el ADN

original, en esas situtaciones tendremos TIMINA.

Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciación, cada una con un didesoxi distinto .

Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis, se

autorradiografían, y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones,

comparándolas entre sí,dan la secuencia del ADN. (Figura 5)

Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas. La reacción es muy sencilla, necesita cantidades de ADN muy pequeñas y sólo se precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y unas pequeñas cadena de nucleótidos que actúan como cebadores. La reacción es un proceso cíclico:

1. La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras.

2. Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus

3. Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se repiten hasta que se

, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas).

obtiene el número de copias deseado.