UNE-EN_ISO_5983-22009 Proteinas.pdf

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2: Digestión en bloque y método de dest

5983-2:2009)

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des animaux. Dosage de l'azote et calcul de la teneur en protéines en bloc et distillation à la vapeur (ISO 5983-2:2009).

rma es la versión oficial, en español, de la Norma Europu vez adopta la Norma Internacional ISO 5983-2:2009.

rma anula y sustituye a la Norma UNE-EN ISO 5983-2:

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22 Páginas

102 201 104 032

Grupo 15

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S


NORMA EUROPEA EUROPEAN STANDARD NORME EUROPÉENNE EUROPÄISCHE NORM

EN ISO 5983-2 Junio 2009

ICS 65.120 Sustituye a EN ISO 5983-2:2005

Versión en español

Alimentos para animales Determinación del contenido en nitrógeno y cálculo del contenido en proteína bruta

Parte 2: Digestión en bloque y método de destilación por vapor (ISO 5983-2:2009)

Animal feeding stuffs. Determination of nitrogen content and calculation of crude protein content. Part 2: Block digestion and steam distillation method. (ISO 5983-2:2009).

Aliments des animaux. Dosage de l'azote et calcul de la teneur en protéines brutes. Partie 2: Méthode de digestion en bloc et distillation à la vapeur (ISO 5983-2:2009).

Futtermittel. Bestimmung des Stickstoffgehaltes und Berechnung des Rohproteingehaltes. Teil 2: Blockaufschluss- und Dampfdestillationsverfahren (ISO 5983-2:2009).

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2009-05-30. Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de Gestión de CEN, o a través de sus miembros. Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al Centro de Gestión, tiene el mismo rango que aquéllas. Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, Rumanía, Suecia y Suiza.

CEN COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN

European Committee for Standardization Comité Européen de Normalisation Europäisches Komitee für Normung

CENTRO DE GESTIÓN: Avenue Marnix, 17-1000 Bruxelles

© 2009 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.


EN ISO 5983-2:2009 - 4 -

PRÓLOGO

El texto de la Norma EN ISO 5983-2:2009 ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 34 Productos alimenticios en colaboración con el Comité Técnico CEN/TC 327 Alimentos para animales. Métodos de muestreo y análisis, cuya Secretaría desempeña NEN. Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto idéntico a ella o mediante ratificación antes de finales de diciembre de 2009, y todas las normas nacionales técnicamente divergentes deben anularse antes de finales de diciembre de 2009. Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén sujetos a derechos de patente. CEN y/o CENELEC no es(son) responsable(s) de la identificación de dichos derechos de patente. Esta norma anula y sustituye a la Norma EN ISO 5983-2:2005. De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma europea los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, Rumanía, Suecia y Suiza.

DECLARACIÓN El texto de la Norma ISO 5983-2:2009 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 5983-2:2009 sin ninguna modificación.


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ÍNDICE

Página

PRÓLOGO .............................................................................................................................................. 6 1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ............................................................................. 7 2 NORMAS PARA CONSULTA ............................................................................................. 7 3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES .......................................................................................... 7 4 PRINCIPIO............................................................................................................................. 8 5 REACTIVOS .......................................................................................................................... 8 6 APARATOS .......................................................................................................................... 10 7 TOMA DE MUESTRAS ...................................................................................................... 11 8 PREPARACIÓN DE LA PORCIÓN PARA ANÁLISIS .................................................. 11 9 PROCEDIMIENTO ............................................................................................................. 11 9.1 Generalidades ....................................................................................................................... 11 9.2 Porción para análisis ............................................................................................................ 11 9.3 Determinación....................................................................................................................... 11 9.4 Análisis en blanco ................................................................................................................. 13 9.5 Análisis de recuperación ...................................................................................................... 13 10 CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS .................................................. 14 10.1 Cálculos ................................................................................................................................. 14 10.2 Cálculo del contenido de proteína bruta ............................................................................ 14 10.3 Expresión de los resultados del contenido de proteína bruta ........................................... 15 11 PRECISIÓN .......................................................................................................................... 15 11.1 Análisis interlaboratorios .................................................................................................... 15 11.2 Repetibilidad ......................................................................................................................... 15 11.3 Reproducibilidad .................................................................................................................. 15 12 INFORME DEL ANÁLISIS ................................................................................................ 16 ANEXO A (Informativo) RESULTADOS DEL ANÁLISIS INTERLABORATORIOS .............. 17 ANEXO B (Informativo) RESULTADOS DE UN ANÁLISIS DE COMPETENCIA, COMPARACIÓN ENTRE LA DETERMINACIÓN DEL PUNTO DE EQUIVALENCIA DE LA TITULACIÓN MEDIANTE COLORIMETRÍA Y MEDIANTE POTENCIOMETRÍA .............................................................................. 21 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 22


ISO 5983-2:2009 - 6 -

PRÓLOGO ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de preparación de las normas internacionales normalmente se realiza a través de los comités técnicos de ISO. Cada organismo miembro interesado en una materia para la cual se haya establecido un comité técnico, tiene el derecho de estar representado en dicho comité. Las organizaciones internacionales, públicas y privadas, en coordinación con ISO, también participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) en todas las materias de normalización electrotécnica. Las normas internacionales se redactan de acuerdo con las reglas establecidas en la Parte 2 de las Directivas ISO/IEC. La tarea principal de los comités técnicos es preparar normas internacionales. Los proyectos de normas internacionales adoptados por los comités técnicos se envían a los organismos miembros para votación. La publicación como norma internacional requiere la aprobación por al menos el 75% de los organismos miembros que emiten voto. Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan estar sujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificación de cualquiera o todos los derechos de patente. La Norma ISO 5983-2 fue preparada por el Comité Técnico ISO/TC 34 Productos alimenticios, Subcomité SC 10 Alimentos para animales. Esta segunda edición anula y sustituye a la primera edición (Norma ISO 5983-2:2005) que ha sido revisada técnicamente. La Norma ISO 5983 consiste en las siguientes partes, bajo el título general: Alimentos para animales. Determinación del contenido en nitrógeno y cálculo del contenido en proteína bruta: − Parte 1: Método de Kjeldahl. − Parte 2: Digestión en bloque y método de destilación por vapor.


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AVISO. La utilización de este método puede suponer el uso de equipamiento, procedimientos y materiales peligrosos. Esta norma no pretende abarcar todos los problemas de seguridad relacionados con su uso, sino que es responsabilidad del usuario establecer prácticas de seguridad e higiene apropiadas y determinar las limitaciones reglamentarias que sean de aplicación con anterioridad a su puesta en práctica. 1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta parte de la Norma ISO 5983 describe un método para la determinación del contenido de nitrógeno en los productos para alimentación animal mediante el procedimiento Kjeldahl y un método para el cálculo del contenido proteína bruta. Supone un método de rutina semi-micro rápido que utiliza digestión en un bloque digestor, un catalizador de cobre y destilación en vapor sobre ácido bórico. El método resulta aplicable para la determinación de niveles de nitrógeno Kjeldahl superiores al 0,5% en los productos para alimentación animal, alimentos para mascotas y sus materias primas. El método no mide formas oxidadas de nitrógeno ni compuestos nitrogenados heterocíclicos. El método no distingue entre el nitrógeno que forma parte de las proteínas y el nitrógeno que no forma parte de las proteínas. NOTA Cuando sea importante determinar el contenido de nitrógeno que no forma parte de las proteínas, puede utilizarse un método adecuado. 2 NORMAS PARA CONSULTA

Las normas que a continuación se indican son indispensables para la aplicación de esta norma. Para las referencias con fecha, sólo se aplica la edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición de la norma (incluyendo cualquier modificación de ésta). ISO 1871 Productos alimenticios de origen agrícola. Directrices generales para la determinación de nitrógeno mediante el método Kjeldahl. ISO 6498 Alimentos para animales. Guía para la preparación de muestras.1) 3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES

Para los fines de este documento, se aplican los términos y definiciones siguientes:

3.1 contenido de nitrógeno: Fracción en masa de nitrógeno determinada mediante el procedimiento descrito en esta parte de la Norma ISO 5983. NOTA El contenido de nitrógeno se expresa en forma de tanto por ciento en masa o en gramos por kilogramo.

3.2 contenido de proteína bruta: Contenido de nitrógeno (3.1) multiplicado por el factor 6,25. NOTA El contenido de proteína bruta se expresa en forma de tanto por ciento en masa o en gramos por kilogramo.

1) Pendiente de publicación. (Revisión de la Norma ISO 6498:1998).


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4 PRINCIPIO

Se digiere la porción para análisis utilizando un bloque digestor o un aparato equivalente. Se utiliza ácido sulfúrico concentrado para convertir el nitrógeno de las proteínas en sulfato amónico a un punto de ebullición elevado por la adición de sulfato potásico. Se utiliza un catalizador de cobre para acelerar la velocidad de la reacción. Se añade un exceso de hidróxido sódico al producto de la digestión, una vez enfriado, para liberar amoniaco. El amoniaco liberado se destila utilizando una unidad de destilación al vapor manual, semi-automática o completamente automática. Para la destilación en vapor manual o semi-automática, la destilación del amoniaco en un exceso de disolución de ácido bórico va seguida de titulación con una disolución de ácido clorhídrico con detección colorimétrica del punto de equivalencia. Cuando se utiliza un sistema completamente automático, la titulación automática del amoniaco se realiza de forma simultánea a la destilación y el punto de equivalencia de la valoración también puede detectarse mediante un sistema de pH potenciométrico. El contenido de nitrógeno se calcula a partir de la cantidad de amoniaco producido. El contenido crudo de proteína se obtiene multiplicando este resultado por el factor de conversión convencional de 6,25. NOTA En principio, también podría emplearse ácido sulfúrico para la titulación. 5 REACTIVOS

Se utilizan exclusivamente reactivos de grado analítico reconocido, salvo que se especifique lo contrario y agua destilada o desmineralizada, o agua de una pureza equivalente.

5.1 Tabletas de catalizador de Kjeldahl, compuestas de 3,5 g de sulfato potásico y 0,4 g de sulfato de cobre(II) pentahidratado por tableta. Estas tabletas están disponibles comercialmente. Pueden utilizarse otros tipos de tabletas siempre que: a) contengan una cantidad de sulfato potásico que permita dispensar 7 g de sulfato potásico y 0,8 g de sulfato de

cobre(II) pentahidratado utilizando un número entero de tabletas completas; y b) no contengan sales de metales tóxicos tales como el selenio o el mercurio.

5.2 Ácido sulfúrico, (H2SO4), de una fracción en masa de como mínimo el 98% y libre de nitrógeno (ρ20 ≈ 1,84 g/ml aproximadamente).

5.3 Disolución de peróxido de hidrógeno, que contenga aproximadamente 30 g de H2O2 por cada 100 ml.

5.4 Agente antiespumante

Se recomienda utilizar una preparación de silicona, por ejemplo una emulsión acuosa de una fracción en masa del 30%.

5.5 Disolución de hidróxido sódico, (NaOH), de una fracción en masa de aproximadamente el 40%, libre de nitrógeno (< 5 μg de nitrógeno por gramo).

5.6 Disoluciones indicadoras 5.6.1 Disolución de rojo de metilo

Se disuelven 100 mg de rojo de metilo (C15H15N3O2) en 100 ml de etanol o de metanol.


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5.6.2 Disolución de verde de bromocresol

Se disuelven 100 mg de verde de bromocresol (C21H14Br4O5S) en 100 ml de etanol o de metanol.

5.7 Disolución de ácido bórico concentrado, c(H3BO3) = 40,0 g/l

Se disuelven 400 g de ácido bórico en un volumen aproximado de entre 5 l y 6 l de agua caliente. Se mezcla y se añade más agua desionizada caliente hasta un volumen de aproximadamente 9 l. Se deja enfriar hasta temperatura ambiente. Se añaden 70 ml de la disolución de rojo de metilo (5.6.1) y 100 ml de la disolución de verde de bromocresol (5.6.2) y se mezcla. Se diluye con agua hasta un volumen final de 10 l y se mezcla bien. Dependiendo de las propiedades del agua que se haya utilizado, el pH de la disolución de ácido bórico puede diferir entre preparaciones distintas. Con frecuencia, es necesario realizar un ajuste con un pequeño volumen de base para obtener un blanco correcto (entre 0,05 ml y 0,15 ml del reactivo de titulación). El color debería virar a verde cuando se añaden 100 ml de agua destilada a 25 ml de la disolución de ácido bórico. Si todavía se mantiene un color rojo, se titula con 0,1 mol/l de NaOH hasta que aparezca un color “gris neutro” y se calcula la cantidad de base necesaria para el conjunto de los 10 l. La disolución, que será de color rojo, se conserva a temperatura ambiente, protegiéndola de la luz y de las fuentes emisoras de gases de amoniaco durante su almacenamiento.

5.8 Disolución de ácido bórico diluido, c(H3BO3) = 10,0 g/l (disolución opcional de atrapado para los tituladores que comienzan automáticamente la titulación al iniciarse la destilación). Se disuelven 100 g de ácido bórico en un volumen aproximado de entre 5 l y 6 l de agua caliente, se mezcla y se añade más agua caliente hasta un volumen de aproximadamente 9 l. Se deja enfriar hasta temperatura ambiente. Se añaden 70 ml de la disolución de rojo de metilo (5.6.1) y 100 ml de la disolución de verde de bromocresol (5.6.2) y se mezcla. Se diluye hasta un volumen final de 10 l con agua y se mezcla bien. Dependiendo de las propiedades del agua que se haya utilizado, el pH de la disolución de ácido bórico puede diferir entre preparaciones distintas. Con frecuencia, es necesario realizar un ajuste con un pequeño volumen de base para obtener un blanco correcto (entre 0,05 ml y 0,15 ml del reactivo de titulación). El color debería virar a verde cuando se añaden 100 ml de agua destilada a 25 ml de la disolución de ácido bórico. Si todavía se mantiene el color rojo, se titula con 0,1 mol/l de NaOH hasta que aparezca un color “gris neutro” y se calcula la cantidad de base necesaria para el conjunto de los 10 l. La disolución, que será de color verde claro, se conserva a temperatura ambiente, protegiendo la disolución de la luz y de las fuentes emisoras de gases de amoniaco durante su almacenamiento. NOTA La adición de un volumen de entre 3 ml y 4 ml de NaOH 0,1 mol/l en 1 l de ácido bórico al 1% de fracción másica proporciona generalmente

un ajuste correcto.

5.9 Disolución volumétrica patrón de ácido clorhídrico, c(HCl) = 0,100 0 mol/l.

Pueden utilizarse otras concentraciones de HCl o ácido sulfúrico, si se realizan las correcciones adecuadas para los cálculos. Las concentraciones deberían expresarse siempre con cuatro cifras decimales.

5.10 Sulfato amónico [(NH4)2SO4], como mínimo del 99,5%, fracción en masa, de pureza certificada. El sulfato amónico se seca a 102 ºC ± 2 ºC durante 4 h y se almacena en un desecador. El tanto por ciento de nitrógeno del sulfato amónico (para una pureza del 99,5%) es de 21,09.

5.11 Sulfato de hierro(II) y amonio [(NH4)2·Fe(SO4)2·6H2O], de pureza certificada.

El tanto por ciento de nitrógeno del sulfato de hierro(II) y amonio (para una pureza del 100% en fracción en masa) es de 7,145.

5.12 Sustancias patrón

Puede utilizarse una de las sustancias patrón indicadas a continuación en el apartado 5.12.1 o el 5.12.2.


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Además de las sustancias patrón citadas más adelante en los apartados 5.12.1 y 5.12.2, deberían utilizarse materiales de referencia adecuados con valores de proteína/nitrógeno de Kjeldahl certificados, siempre que sea posible. NOTA El contenido de agua puede determinarse en una porción aparte. 5.12.1 Triptófano (C11H12N2O2), de punto de fusión de 282 ºC; contenido de nitrógeno 137,2 g/kg. El triptófano se seca antes de utilizarse. 5.12.2 Acetanilida (C8H9NO), de una pureza mínima del 99% en fracción en masa. Contenido de nitrógeno 103,6 g/kg. No se seca en estufa antes de utilizarse.

5.13 Sacarosa (C12H22O11), de un contenido de nitrógeno no superior a 0,002% en fracción en masa. No se seca en estufa antes de utilizarse. 6 APARATOS

Los aparatos comunes de un laboratorio y en particular, lo siguiente.

6.1 Balanza analítica, capaz de pesar con una aproximación de 0,1 mg y de proporcionar lecturas de 0,1 mg.

6.2 Bloque digestor, un bloque de aleación de aluminio o un bloque equivalente, con control ajustable de temperatura y un sistema de medida de la temperatura del bloque, calentado a una temperatura de 420 ºC ± 5 ºC.

6.3 Tubos de digestión, de 250 ml de capacidad, que se puedan utilizar en el bloque digestor (6.2).

6.4 Extractor de gases múltiples, donde puedan adaptarse los tubos de digestión (6.3).

6.5 Centrífuga de extracción de gases, bomba de filtro o aspirador, fabricados de un material resistente al ácido, conectados a la toma de agua corriente.

6.6 Pipetas automáticas (dispensadoras), capaces de dispensar porciones de hasta 25 ml, Norma ISO 8655-2[6] (ISO 8655-5[8]).

6.7 Probetas graduadas, de 50 ml de capacidad.

6.8 Unidad de destilación, manual o semi-automática, capaz de destilar con vapor, en la que puedan acoplarse los tubos de digestión (6.3) y los matraces erlenmeyer (6.9), o capaz de realizar destilación en vapor y autotitulación.

6.9 Matraces erlenmeyer, de 250 ml de capacidad.

6.10 Bureta, de 25 ml de capacidad o de una capacidad adecuada distinta, que permita realizar lecturas de cómo mínimo 0,05 ml, que cumpla los requisitos de la Norma ISO 385[1], de clase A. Alternativamente, puede utilizarse una bureta automática, Norma ISO 8655-3[7] que cumpla los mismos requisitos.

6.11 Titulador automático, con un pH-metro calibrado en un intervalo de pH 4 a pH 7.


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7 TOMA DE MUESTRAS

Debería haberse enviado al laboratorio una muestra representativa. La muestra no debería haber sufrido daño o transformación durante el transporte o el almacenamiento. La toma de muestras no es parte del método descrito en esta parte de la Norma ISO 5983. En la Norma ISO 6497[5] se describe un método de toma de muestras recomendado. 8 PREPARACIÓN DE LA PORCIÓN PARA ANÁLISIS

La muestra para análisis se prepara conforme a la Norma ISO 6498. 9 PROCEDIMIENTO 9.1 Generalidades

Normalmente, las porciones para análisis deberían analizarse en lotes conforme al procedimiento descrito. Véase la Norma ISO 1871 sobre los requisitos generales de la aplicación del método Kjeldahl.

9.2 Porción para análisis

Para obtener la porción para análisis, se pesa con una aproximación de 0,1 mg. a) aproximadamente 1,0 g para materiales con un contenido de proteínas de entre el 3% y el 30% en fracción en masa; b) aproximadamente 0,5 g para materiales con un contenido de proteínas de entre el 30% y el 80% en fracción en

masa; o c) aproximadamente 0,3 g para materiales con un contenido de proteínas superior al 80% en fracción en masa. No se debe sobrepasar la cantidad de 1,2 g. Se realiza siempre un control de calidad y de patrones, así como un blanco de reactivos dentro de cada serie.

9.3 Determinación 9.3.1 Digestión

Se transfiere la porción para análisis (9.2) al tubo de digestión (6.3) y se añaden dos tabletas de catalizador (5.1) a cada tubo. Utilizando una pipeta dispensadora (6.6), se añaden 12 ml de ácido sulfúrico (5.2) a cada tubo. Se utilizan 15 ml para materiales de alto contenido de materia grasa (> 10% de materia grasa). Si es posible, se detiene el proceso en este punto y se continúa con el trabajo al día siguiente. Si se presenta el problema de la formación de espuma, se añaden lentamente entre 3 ml y 5 ml de peróxido de hidrógeno (5.3). Se remueve con suavidad y se deja que se desarrolle la reacción. De forma alternativa, se pueden utilizar unas gotas de agente anti-espumante (5.4). Se colocan las protecciones laterales de calor a la gradilla de los tubos. Se ajusta perfectamente el extractor múltiple (6.4) sobre los tubos y se conecta al máximo el aspirador de agua o la centrífuga de extracción de gases (6.5). Se introduce la gradilla con los tubos en el bloque digestor previamente calentado a 420 ºC (6.2). Después de 10 min, se baja la intensidad del aspirador de agua hasta que los vapores de ácido lleguen justamente a quedar confinados dentro de la cámara del extractor. Debería mantenerse una zona de condensación dentro de cada tubo. Una vez producida la mayor parte de los vapores de óxido de azufre durante las primeras etapas de la digestión, debe reducirse la intensidad del vacío para evitar pérdidas de ácido sulfúrico.


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Se digiere durante un período adicional de 50 min. El tiempo total de digestión debería ser aproximadamente de 60 min. Se apaga el digestor. Se retira la gradilla con los tubos con el extractor aún en posición y se pone a enfriar en la bandeja durante un tiempo de entre 10 min y 20 min. Cuando haya terminado la liberación de vapores, se retira el extractor múltiple y se apaga el aspirador. Se retiran las protecciones laterales. Se dejan enfriar los tubos. Se recomienda diluir previamente las muestras de forma manual con anterioridad a la destilación. Utilizando guantes y protectores oculares, se añaden cuidadosamente unos mililitros de agua desionizada a cada tubo. Si se producen salpicaduras, esto significa que los tubos están todavía demasiado calientes. Se deja enfriar durante algunos minutos más. Se añade agua a cada tubo hasta alcanzar un volumen total de aproximadamente 80 ml. Si la muestra se solidifica, se introduce el tubo que contiene el producto digerido diluido dentro del bloque digestor y se calienta cuidadosamente, agitando ocasionalmente, hasta que se disuelvan las sales, o bien se destila durante un período adicional de entre 30 s y 60 s. NOTA 1 Algunos instrumentos realizan automáticamente la adición de agua. Solamente se necesita realizar la dilución previa antes de introducir el

tubo en el aparato si se forma una pasta sólida muy compacta. NOTA 2 Algunos aparatos de destilación comienzan con la adición de vapor con anterioridad a la adición de base, lo cual permite la disolución de

las pastas sólidas de sales y que la reacción producida durante la adición de la base sea menos violenta. La cristalización durante el proceso de digestión puede causar pérdidas de nitrógeno.

9.3.2 Destilación

Se introduce el tubo de digestión (véase 9.3.1) en la unidad de destilación (6.8). Cuando la titulación del contenido de amoniaco del destilado se realice de forma manual, se aplica el procedimiento indicado a continuación. Cuando la unidad de destilación sea completamente automática para incluir la titulación del contenido de amoniaco del destilado, se siguen las instrucciones del fabricante para manejar la unidad de destilación. Se sitúa un matraz erlenmeyer (6.9) que contenga entre 25 ml y 30 ml de la disolución de ácido bórico concentrado (5.7) bajo la salida del condensador, de forma que el extremo del tubo de salida quede sumergido por debajo de la superficie de la disolución del exceso de ácido bórico. Se ajusta la unidad de destilación de manera que dispense 50 ml de la disolución de hidróxido sódico (5.5). La unidad de destilación se mantiene en funcionamiento siguiendo las instrucciones del fabricante, destilándose el amoniaco liberado por la adición de la disolución de hidróxido sódico. El producto de la destilación se recoge en la disolución de recogida de ácido bórico. La cantidad de producto de destilación (tiempo de destilación en vapor) depende de la cantidad de nitrógeno de la muestra. Se siguen las instrucciones del fabricante. NOTA En una unidad de destilación semi-automática, la adición del exceso de hidróxido sódico y la destilación en vapor se realizan de forma automática. 9.3.3 Titulación 9.3.3.1 Colorimétrica

El contenido del matraz erlenmeyer (6.9) se titula con la disolución volumétrica patrón de ácido clorhídrico (5.9) utilizando una bureta (6.10) y leyendo la cantidad de reactivo de titulación utilizado. El punto de equivalencia se alcanza cuando aparecen las primeras trazas de color rosa en el matraz. Las lecturas de la bureta se estiman con una precisión de 0,05 ml. El empleo de una placa de agitación magnética iluminada o de un detector fotométrico puede ayudar a visualizar el punto de equivalencia. Esto puede realizarse de forma automática utilizando un destilador de vapor con titulación automática. 9.3.3.2 Potenciométrica

El contenido del matraz erlenmeyer (véase 6.9) se titula con disolución volumétrica patrón de ácido clorhídrico (véase 5.9) utilizando un titulador automático calibrado adecuado provisto con un pH-metro (6.11). El punto de equivalencia de pH de la valoración se alcanza a un pH de 4,6, que es el punto más alto de la curva de titulación (punto de inflexión). Se lee la cantidad de reactivo de titulación utilizada por el titulador automático.


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Se siguen las instrucciones del fabricante para manejar cada destilador o destilador/titulador determinado. Cuando se utilice un sistema de titulación automática, la titulación comienza inmediatamente después de que empiece la destilación y debería emplearse la disolución de ácido bórico diluido (5.8). 9.4 Análisis en blanco

Se realiza un análisis en blanco siguiendo el procedimiento descrito entre los apartados 9.1 y 9.3.3, sustituyendo la porción para análisis por 2 ml de agua y aproximadamente 0,7 g de sacarosa (5.13). Se mantiene un registro de los valores de los blancos. Si los valores de los blancos cambian, se identifican los motivos. La cantidad del reactivo de titulación utilizado en el análisis en blanco debería ser siempre mayor de 0,0 ml. Los valores de los blancos dentro de un mismo laboratorio deberían ser consistentes a lo largo del tiempo.

9.5 Análisis de recuperación 9.5.1 Generalidades

En los apartados 9.5.2 a 9.5.4 se describen los análisis de recuperación, realizados de forma regular para comprobar la precisión del procedimiento y de los equipos. 9.5.2 Pérdidas de nitrógeno

Se utilizan 0,12 g de sulfato amónico (5.10) y 0,67 g de sacarosa (5.13) por matraz. Se añaden el resto de los reactivos según se indica en el apartado 9.3. Se digiere y se destila en las mismas condiciones que en el caso de la muestra. Los rendimientos de recuperación deben ser ≥ 99% en fracción en masa. 9.5.3 Eficacia del proceso de digestión

Se utiliza una porción para análisis cómo mínimo 0,15 g de triptófano (5.12.1) o de acetanilida (5.12.2), pesados con una precisión de 0,1 mg, a la que se añaden aproximadamente 0,7 g de sacarosa (5.13). Se determina el contenido de nitrógeno conforme al procedimiento descrito entre los apartados 9.1 y 9.3.3. Los rendimientos de recuperación deberían ser ≥ 99,5% en fracción en masa para la acetanilda y ≥ 98,5% en fracción en masa para el triptófano (Referencia [9]). 9.5.4 Eficacia de los procesos de destilación y titulación

Se pesan entre 0,10 g y 0,15 g de sulfato amónico (5.10), con una aproximación de 0,000 1 g o entre 0,3 g y 0,5 g de sulfato de hierro(II) y amonio (5.11), con una precisión de 0,000 1 g y se introducen dentro de un tubo. Se añaden 80 ml de agua destilada y se continúa conforme a los apartados 9.3.2 y 9.3.3. El rendimiento de recuperación debe ser ≥ 99,5% en fracción en masa. 9.5.5 Límites

Unos rendimientos de recuperación inferiores a los indicados o superiores al 101,0% en fracción en masa en cualquiera de los anteriores análisis de recuperación indica fallos en los procedimientos y/o una concentración indebida de la disolución volumétrica patrón de ácido clorhídrico (5.9).


ISO 5983-2:2009 - 14 -

10 CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS 10.1 Cálculos 10.1.1 Cálculo del contenido de nitrógeno

El contenido de nitrógeno de la muestra, wN, en tanto por ciento en fracción en masa, se calcula como:

s b sN

1,400 7 ( )V V cw

m

−= (1)

donde VS es el valor numérico del volumen de la disolución volumétrica patrón de ácido clorhídrico (5.9) utilizada en la

determinación (9.3), en mililitros, expresado con una aproximación de 0,05 ml; Vb es el valor numérico del volumen de la disolución volumétrica patrón de ácido clorhídrico (5.9) utilizada en el

análisis en blanco (9.4), en mililitros, expresado con una aproximación de 0,05 ml; cS es el valor numérico de la concentración exacta, en moles por litro, de la disolución volumétrica patrón de ácido

clorhídrico (5.9), expresada con cuatro cifras decimales; m es el valor numérico de la masa de la porción para análisis (9.2), en gramos. Para expresar el resultado en gramos por kilogramo, puede utilizarse en la ecuación (1) un factor de corrección de 14,007 en lugar de 1,400 7. 10.1.2 Cálculo del rendimiento de recuperación de las sales de amonio

El rendimiento de recuperación de sulfato amónico de una pureza del 99,5% en fracción en masa, w1, se calcula de la siguiente manera:

N,r1 100

21,09

ww = × (2)

donde wN,r es el tanto por ciento de recuperación de nitrógeno, como un porcentaje en fracción en masa. El rendimiento de recuperación de sulfato de hierro(II) y amonio de una pureza del 100%, w2, se calcula de la siguiente manera:

N,r2 100

7,145

ww = × (3)

Los denominadores en las ecuaciones (2) y (3) se ajustan si se utilizan sales de amonio de grados de pureza diferentes.

10.2 Cálculo del contenido de proteína bruta

El contenido de proteínas bruta, wp, en tanto por ciento de fracción en masa, se calcula utilizando la siguiente ecuación: wp = wN fk (4) donde wN es el contenido de nitrógeno de la muestra, expresado como tanto por ciento de masa con cuatro cifras decimales (10.1); fk es el factor de conversión del nitrógeno Kjeldahl a proteína; para productos para alimentación animal, fk = 6,25.


- 15 - ISO 5983-2:2009

Para expresar el resultado del contenido de proteína bruta en gramos por kilogramo, puede multiplicarse el resultado obtenido con la ecuación (4) por 10.

10.3 Expresión de los resultados del contenido de proteína bruta

Los resultados se expresan con cuatro cifras decimales si se necesitan para realizar cálculos adicionales. Para los resultados definitivos, el contenido de nitrógeno se expresa con tres cifras decimales y el contenido de proteínas con dos cifras decimales. Los resultados no deberían redondearse más hasta que se haya hecho un uso definitivo del valor del análisis. Esto es especialmente importante cuando los valores se vayan a utilizar para realizar cálculos adicionales. EJEMPLO 1 Un ejemplo es cuando se utilizan los valores de análisis individuales procedentes del análisis de muestras de muchos materiales para

calcular la estadística del funcionamiento del método respecto a la variación intra- e inter-laboratorios. EJEMPLO 2 Cuando se utilizan los valores como referencia para la calibración de un instrumento (por ejemplo, un analizador infrarrojo), utilizando

los valores procedentes de múltiples muestras para realizar cálculos de regresión simple o múltiple antes de emplearse para la realización de cálculos adicionales.

11 PRECISIÓN

11.1 Análisis interlaboratorios

Los detalles relacionados con la precisión del método de un análisis interlaboratorios utilizando detección colorimétrica del punto de equivalencia se resumen en el anexo A. Los valores obtenidos a partir de dicho análisis interlaboratorios pueden no resultar aplicables a rangos de concentraciones y matrices diferentes de las indicadas. En el anexo B se resumen los detalles de un análisis de confianza en el que se realizó una comparación mostrando la equivalencia de la determinación colorimétrica y potenciométrica del punto final de la valoración.

11.2 Repetibilidad

La diferencia absoluta entre los resultados de dos análisis individuales independientes, obtenidos mediante la aplicación del mismo método sobre un material para análisis idéntico, realizados dentro de un corto intervalo de tiempo, en el mismo la-boratorio, por el mismo analista y utilizando los mismos equipos, no debe ser superior en más de un 5% de los casos, al va-lor del límite de la repetibilidad, r, como un porcentaje de fracción en masa de proteína obtenido a partir de la ecuación (5): p0, 234 0,005r w= + (5)

donde pw es la media de los dos resultados individuales del contenido de proteína bruta, en tanto por ciento de fracción

en masa.

11.3 Reproducibilidad

La diferencia absoluta entre los resultados de dos análisis individuales, obtenidos mediante la aplicación del mismo método sobre un material para análisis idéntico, realizados en laboratorios diferentes por analistas distintos que utilizan equipos diferentes, no debe ser superior en más de un 5% de los casos, al valor del límite de la reproducibilidad, R, como un porcentaje de fracción en masa de proteína obtenido a partir de la ecuación (6):

p0,193 0,029R w= + (6)


ISO 5983-2:2009 - 16 -

12 INFORME DEL ANÁLISIS

El informe del análisis debe detallar: a) toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra; b) el método de toma de muestras utilizado, si se conoce; c) el método de análisis empleado, haciendo referencia a esta parte de la Norma ISO 5983; d) todos los detalles experimentales no descritos en esta parte de la Norma ISO 5983, o considerados opcionales, junto

con los detalles de todo tipo de incidencias que pudieran haber influido sobre los resultados; e) los resultados obtenidos en el análisis, bien en forma de contenido de nitrógeno en tanto por ciento o en gramos por

kilogramo, o bien en forma de contenido de proteína bruta en tanto por ciento o en gramos por kilogramo, relacionados mediante el factor de conversión de 6,25;

f) si se ha comprobado la repetibilidad, el intervalo del resultado final obtenido; g) si se ha verificado el grado de recuperación, el intervalo del resultado final obtenido.


- 17 - ISO 5983-2:2009

ANEXO A (Informativo)

RESULTADOS DEL ANÁLISIS INTERLABORATORIOS Se llevó a cabo un primer análisis interlaboratorios utilizando el método del bloque de digestión y de destilación al vapor con detección colorimétrica del punto de equivalencia organizado por AOAC Internacional conforme a la Norma ISO 5725-2[3]. En este análisis participaron trece laboratorios procedentes de América del Norte y de Europa. Se investigaron catorce muestras en ciego, incluyendo harinas cárnicas de huesos y carne, alimentos para perros, alimentos para chinchillas, semillas para pájaros, semillas de soja, cereales verdes ensilados troceados, heno de hierba, heno de alfalfa, sustituto de leche, albúmina, pienso compactado para cerdos, semillas de girasol, bloques de proteínas (con urea) y harina de pescado, véase la tabla A.1. El rendimiento de recuperación de nitrógeno a partir de los compuestos patrón fue del 100,1% para la acetanilida y del 98,8% para el triptófano.


ISO 5983-2:2009 - 18 -T

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A.1

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[9]

, [10

]).


- 19 - ISO 5983-2:2009

En 2004, en Tailandia, se organizó un segundo análisis interlaboratorios utilizando detección colorimétrica del punto de equivalencia, implicando a 26 laboratorios de la administración y públicos siguiendo la Norma ISO 5725-2[3]. Se analizaron siete muestras. Los resultados se muestran en la tabla A.2.

Tabla A.2 − Resultados del segundo análisis interlaboratorios

Parámetro

Muestraa

1 Alimentos para peces,

bolitas flotantes pequeñas (extruido)

2 Alimentos para peces,

bolitas flotantes grandes

(extruido)

3 Alimentos

para gambas migajas

4 Alimentos

para gambas, bolitas

flotantes pequeñas

5 Alimentos

para gambas bolitas

flotantes grandes

6 Alimentos

para larvas, copos

7 Granos de trigo

Número de laboratorios mantenidos tras eliminar a los discrepantes

24 24 24 25 26 26 25

Valor medio del contenido de proteína bruta,

pw , % (en base a su presentación original)

33,65 29,18 40,48 37,73 38,04 51,07 15,76

Desviación estándar de la repetibilidad, sr, % de proteína bruta

0,20 0,13 0,10 0,17 0,14 0,18 0,10

Desviación estándar relativa de la repetibilidad, %

0,58 0,44 0,24 0,44 0,37 0,35 0,63

Límite de la repetibilidad r (= 2,8 sr), % de proteína bruta

0,55 0,36 0,28 0,46 0,39 0,50 0,28

Índice de HorRat 0,38 0,28 0,16 0,29 0,24 0,24 0,36

Desviación estándar de la reproducibilidad, sR, % de proteína bruta

0,40 0,38 0,42 0,49 0,45 0,64 0,25

Desviación estándar relativa de la reproducibilidad, %

1,18 1,31 1,03 1,31 1,18 1,26 1,59

Límite de la reproducibilidad, R (= 2,8 sR), % de proteína bruta

1,11 1,07 1,17 1,38 1,26 1,80 0,70

Índice de HorRat 0,50 0,54 0,45 0,56 0,51 0,57 0,60

a Método de muestreo: ISO 6497[5].


Leyenda

pw valor medio de contenido de proteína bruta, % tracc

Y valores de precisión, % tracción en masa

♦ r Límite de la repetibilidad r = 0,005 pw + 0,234

■ R Límite de la reproducibilidad R = 0,029 pw + 0

Figura A.1 − Relación entre los valores d

- 20 - I

ción en masa

4

0,193

de precisión (r, R) y el valor medio del contenido de p

ISO 5983-2:2009

proteína bruta, pw


- 21 - ISO 5983-2:2009

ANEXO B (Informativo)

RESULTADOS DE UN ANÁLISIS DE COMPETENCIA, COMPARACIÓN ENTRE LA DETERMINACIÓN DEL PUNTO DE EQUIVALENCIA DE LA TITULACIÓN

MEDIANTE COLORIMETRÍA Y MEDIANTE POTENCIOMETRÍA En un programa de análisis de competencia holandés, organizado por el laboratorio Kwaliteitsdienst Landbouwkundige Laboratorio (KDLL), se aplicaron, a distintos tipos de alimentos, tanto la potenciometría como la colorimetría y la potenciometría para la determinación del punto de equivalencia para la aplicación. Los resultados presentados en la tabla B.1 muestran que ambos métodos de detección del punto de equivalencia proporcionan idénticos resultados.

Tabla B.1 − Evaluación estadística de un test de competencia

Parámetro

Muestra

1 Alimento

para gatos

2 Alimento

para gatos

3 Maíz

4 Maíz

5 Brotes de soja

6 Alimentos

para cerdos

Determinación colorimétrica

Contenido medio de proteína bruta,

p,colw , % fracción en masa

29,8 29,7 9,2 9,2 42,2 16,0

Desviación estándar, scol, % fracción en masa

0,38 0,33 0,17 0,13 0,63 0,24

Nº laboratorios, Ncol 24 24 25 25 25 22

Determinación potenciométrica

Contenido medio de proteína bruta,

p,potw , % fracción en masa

29,9 29,9 9,3 9,2 42,3 16,0

Desviación estándar, spot, % fracción en masa

0,25 0,43 0,13 0,15 0,60 0,21

Nº laboratorios, Npot 14 14 14 14 15 15

Test de la F para igualdad de las varianzas

F 2,28 1,65 1,76 1,30 1,11 1,39

Fcrit 2,43 2,18 2,42 2,15 2,35 2,38

Conclusión no existen diferencias

significativas

no existen diferencias

significativas


significativas


significativas


significativas


significativas

Test de la t para igualdad de las medias (dos valores)

tstat 0,94 1,40 0,48 0,85 0,55 0,12

tcrit 2,03 2,03 2,03 2,03 2,02 2,03

Conclusión no existen diferencias

significativas


significativas


significativas


significativas


significativas


significativas

NOTA Nivel de significancia = 5%; F < Fcrit = no existen diferencias significativas; tstat < tcrit = no existen diferencias significativas.


- 22 - ISO 5983-2:2009

BIBLIOGRAFÍA [1] ISO 385:2005, Laboratory glassware - Burettes [2] ISO 5725-1, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 1: General principles

and definitions [3] ISO 5725-2, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2: Basic method for

the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method [4] ISO 5983-1, Animal feeding stuffs. Determination of nitrogen content and calculation of crude protein content.

Part 1: Kjeldahl method [5] ISO 6497, Animal feeding stuffs. Sampling [6] ISO 8655-2, Piston-operated volumetric apparatus. Part 2: Piston pipettes [7] ISO 8655-3, Piston-operated volumetric apparatus. Part 3: Piston burettes [8] ISO 8655-5, Piston-operated volumetric apparatus. Part 5: Dispensers [9] THIEX, N.J. MANSON, H., ANDERSON, S., PERSSON, J.A. Determination of crude protein in animal feed, forage,

grain and oilseeds by using block digestion with a copper catalyst and steam distillation into boric acid: Collaborative study, J. AOAC Int. 2002, 85, pp. 309-317

[10] HORWITZ, W. Evaluation of analytical methods used for regulation of foods and drugs. Anal. Chem. 1982, 54,

pp. 67A-76A [11] PEELER, J.T., HORWITZ, W., ALBERT, R. Precision parameters of standard methods of analysis for dairy

products. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1989, 72, pp.784-806


Génova, 6 [email protected] Tel.: 902 102 201 28004 MADRID-España www.aenor.es Fax: 913 104 032


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