Els bacteriòfags de bacteris entèrics: una eina fàcil pel seguiment de tractaments d’aigües residuals

JOAN JOFRE i FRANCISCO LUCENA

Departament de MicrobiologiaFacultat de Biologia Universitat de Barcelona

Infeccions de transmissió per aigua

a Menor incidència dels brots causats per bacteris

a Augment dels brots causats per virus i protozous paràsits

a Aparició d’alguns problemes emergents (i re-emergents)

a La reutilització requereix quantificar el risc

INFECCIONS DE TRANSMISSIÓ PER AIGUA

Perquè es produeixen infeccions víriques i de protozous en aigües bacteriològicamentsegures?

Persistència en medi aquàtic

Resistència a desinfecció

Dosis infeccioses molt baixes

NECESSITAT DE MICROORGANISMES MODEL

Detectar i enumerar virus i protozous en mostres d’aigües i aliments és difícil

Observació (directe o indirecte (c. f.))Cultivo cel·lularMètodes moleculars (PCR)

Usualment els nombres de virus i protozous són massa baixos per:

Seguir processos de DepuracióPotabilitzacióDesinfecció

Seguir els moviments de l’aigua

Necessitat de microorganismes model

Bacteriòfags per virus

Clostridis per protozous

BACTERIÒFAGS DE BACTERIS ENTÈRICS

Són virus

Presumiblement en el medi aquàtic es comporten com virus

Presumiblement s’originen en el tub digestiu

Detecció ràpida, fàcil i barata

Són més abundants en excrements que els virus (excepte en individus infectats)

Nombres molt constants en aigües residuals

GRUPS DE BACTERIÒFAGS PROPOSATS

Es defineixen en funció del bacteri hoste

Colifags somàtics

Infecten E. coli a través de la paret cel·lular

Bacteriòfags ARN F-específics

Infecten E. coli i altres enterobacteris a través dels pèls sexuals codificats pel plasmidi F

Bacteriòfags de Bacteroides

Infecten Bacteroides a través de la paret cel·lular

Bacteriòfags com indicadors

Mètodes

Detecció i enumeracióMaterials de referènciaConservació en laboratori i durant el transport Concentració

Extracció (biosòlids, sediments)

Mètodes estandarditzats de detecció i enumeracióISO

10705-1. Water quality. Detecction and enumeration of bacteriophages.Part 1. Enumeration of F-specific RNA bacteriophages

10705-1. Water quality. Detecction and enumeration of bacteriophages.Part 1. Enumeration of somatic coliphages

10705-1. Water quality. Detecction and enumeration of bacteriophages.Part 1. Enumeration of bacteriophages infecting Bacteroides fragilis

EPA 1602. Male-specific (F+) and Somatic Coliphages in Water by Single Agar

Layer (SAL) Procedure1602. Male-specific (F+) and Somatic Coliphages in Water by Two-step

Enrichment Procedure.

“Standard methods” (colifags somátics)

Enumeració de bacteriòfags.

1. Mètode “quantal” En medi líquid. Determinació de presència-absènciade bacteriòfags en un volum determinat de mostra. Confirmació pel “test de la gota”

2. Mètode quantitatiu directe En medi sòlid. Determinació de les unitats formadoresde clapes, mitjançant el mètode de la doble capa d’agar(DAL). Mesures a temps real

Enumeración de bacteriófagos. Método de la doble capa de agar (DAL).

1 ml cultivo inóculo de la bacteria huésped *

1 ml de la muestra (o dilución o concentrado)

2.5 ml de agarblando (45 ± 1) ºC

1.- Agitar suavemente

2.- Verter sobre placa de agar, distribuir uniformemente por toda la superficie evitando la formación de burbujas

3.- Dejar solidificar la capa superior de agar blando

5.- Contar el número de calvas (zonas de lisis) que aparecen sobre el césped confluente de la bacteria huésped. Expresar los resultados como pfu / 100 ml.

Placa agar base

4.- Incubar toda la noche, en posición invertida, (36 ± 2ºC) (y en anaerobiosis, si se trata de Bact. fragilis)

* Manejo de cultivos de trabajo

MÈTODES DE CONCENTRACIÓ

Mètodes de concentració de fins un litre d’aigua amb una eficiència contrastada de més d’un 50%

Coagulació (aigües tèrboles)Adsorció-elució a filtres d’acetat-nitrat de cel·lulosa

(aigües poc tèrboles)

Mètode estandarditzat de validació de mètodes de concentració

ISO10705-3 F. Water quality-Detection and enumeration of bacteriophages –Part 3: Validation of methods for concentration of bacteriophages from water

Bacteriòfags com indicadors

Organismes model

Organismes índexConcepte lligat a presència

Organismes indicadorsConcepte lligat a comportament

Bacteriòfags com indicadors

Bacteriòfags com microorganismes indicadors de processos

Efectes de la natura i dels tractaments sobre el microorganismes d’origen fecal

Separació- Sedimentació

- Adsorció en sòl i/o en filtres

- Retenció per filtració

Canvi de compartiment

Inactivació

- Factors físics: temperatura, radiacions

- Factors químics: pH, amoníac, concentració de

sal, desinfectants.

- Factors biològics: ”grazing”, agents virucides, etc.

Eliminació

REDUCCIÓ (en logaritmes decimals) DE MICROORGANISMES EN PLANTES CONVENCIONALS

CF 0.5-1.0 2-3 1-2 2-3

EF 0.5-1.0 1-2 1-2 2-3

Col. som. 0.5-1.0 1-1.5 1-2 2-3

F-ARN 0.5-1.0 2-3 1-2 2-3

B. B frag. 0.5-1.0 1-2 1-2 2-3

Enterov. 0.5-1.0 2-3 1-2 2-3

Rotav. 0.5-1.0 1-2 - -

Sedimentació Coag. Fangs Fangs activ + coag.

+ cal. activats (sim. o secuen.)

ELIMINACIÓ DE DIFERENTS MICROORGANISMES PER CLORACIÓ D’UN EFLUENT SECUNDARI

Efluent Efluent Reducció en secundari terciari log. decimalsufc o ufp per 100 ml

Coliforms fecals 1.6x105 251 3.8Enterococs 5.0x104 70 2.8Clostridis 5.6x103 109 1.7Colifagssomàtics 5.6x104 320 2.2BacteriòfagsF-específics 6.3x103 142 1.7Bacteriòfagsde Bacteroides 1.7x102 42 0.6Enterovirus(per l) 3.5 0.2 1.2

REDUCCIÓ (en logaritmes decimals) DE MICROORGANISMES EN LLACUNATGE

HIVERN ESTIU

Coliforms fecals 2.5 – 3.0 4.5 - 5.0

Estreptococs fecals 2.5 – 3.0 2.5 –3.0

Clostridis reductors de sulfit 1.0 - 1.5 1.0 -1.5

Colifags somàtics 2.5 – 3.0 3.5 - 4.0

Fags ARN F-específics 1.5 – 2.0 3.0 - 3.5

Fags de Bacteroides fragilis 1.0 – 1.5 1.0 - 1.5

Per enterovirus s’han descrit valors de 1 fins a 4 logaritmes.

Sensibilitat a la radiació ultraviolada

-1.5 - 2.0++Poliovirus

1.5 - 2.01.5 - 2.0++Fags B. fragilis

1.3 - 2.01.0 - 1.5+Fags F-RNA

2.8 - 3.22 – 3+++Colifags somàtics

1.7 – 2.42 - 3+++Estreptococs fecals

2.3 – 2.72 – 3++++Coliforms fecals

Plantes reals(red. Log.)

Planta pilot(red. Log.)

Experimentaciólaboratori

Efecte de la clarificació (filtració amb sorra amb/sense coagulació-floculació)

Reducció logarítmica (log10)

Coliforms fecals 0.3 - 1.0Enterococs 0.1 - 1.6Colifags somàtics 0.2 - 0.5 Fags F-específics RNA 0.4 - 0.6Fags de Bacteroides 0.3 – 0.9

Indicadors i patògens en dues plantes de tractament d’aigües residuals

Efluent secundari Efluent terciari

EDAR-1 EDAR-2 EDAR-1 EDAR-2

Coliforms fecals 5.5a) 5.6 0.3 0.8Enterococs 4.4 4.6 0.1 0.2Clostridis 3.8 3.9 0.2 1.9Colifags somàtics 4.4 4.8 2.1 2.6Fags F-especifics 3.6 4.1 1.2 3.0Fags de Bacteroides 2.2 2.9 0.1 1.5Enterovirus 2.0 2.0 0+/7b 2+/10b

a) Valors en unitats logarítmiques per 100 mL (bacteris i bacteriòfags) i per litre (enterovirus) b) Mostres positives/mostres analitzades