Un Papel Para El Ácido Úrico En La Progresión De La Enfermedad Renal

Resumen. La hiperuricemia está asociada con enfermedad renal, pero por lo general se considera un marcador de la disfunción renal en lugar de un factor de riesgo para la progresión. Estudios recientes han informado que la hiperuricemia leve en ratas normales inducidas por el inhibidor de la uricasa, ácido oxónico (AO), resultó en hipertensión, enfermedad vascular intrarrenal, y lesión renal. Esto condujo a la hipótesis de que el ácido úrico puede contribuir a la enfermedad renal progresiva. Para examinar el efecto de la hiperuricemia en la progresión de la enfermedad renal, las ratas se alimentaron con AO 2% durante 6 semanas después de nefrectomía de 5/6 del riñón (RK) con o sin el inhibidor de la xantina oxidasa, alopurinol, o el agente uricosúrico, benziodarona. Dadas las observaciones de que el ácido úrico induce la enfermedad vascular, también se analizó el efecto del ácido úrico en las células del músculo liso vascular en cultivo. Ratas RK desarrollaron hiperuricemia transitoria (2,7 mg/dl en la semana 2), pero entonces los niveles volvieron a la línea de base a la semana 6 (1,4 mg/dl). En contraste, Ratas RK+AO desarrollaron hiperuricemia más alta y más persistente (6ta semana, 3,2 mg / dl). Las ratas hiperuricémicas demostraron mayor presión arterial (PA), mayor proteinuria y creatinina sérica en relación a las ratas RK. Las ratas RK hiperuricémicas tenían mayor hipertrofia renal y glomeruloesclerosis (24,2 ± 2,5 versus 17,5 ± 3,4%;

P< 0,05) y fibrosis intersticial (1,89 ± 0,45 versus 1,52 ± 0,47; P< 0,05). Las ratas hiperuricémicas desarrollaron enfermedad vascular que consiste en el engrosamiento de las arterias preglomerulares con proliferación de las células de músculo liso; estos cambios fueron significativamente más graves que un grupo RK histórico con PA similar. El alopurinol redujo significativamente los niveles de ácido úrico y bloqueó los cambios funcionales e histológicos renales. Benziodarona redujo los niveles de ácido úrico menos efectivamente y sólo mejoró parcialmente PA y la función renal, con un efecto mínimo sobre los cambios vasculares. Para comprender mejor el mecanismo de la enfermedad vascular, la expresión de COX-2 y de la renina fue examinada. Las ratas hiperuricémicas mostraron un aumento de la expresión de la renina renal y COX-2; este último, especialmente en los vasos arteriales preglomerulares. En estudios in vitro, las células musculares lisas vasculares cultivadas con ácido úrico también generaron COX-2 con una proliferación tiempo-dependiente, lo que fue impedido por cualquier inhibidor del receptor de COX-2 o TX-A2. La hiperuricemia acelera la progresión renal en el modelo RK a través de un mecanismo relacionado con presión arterial sistémica alta y mediado por COX-2; la enfermedad vascular inducida por tromboxano. Estos estudios proporcionan evidencia directa de que el ácido úrico puede ser un verdadero mediador de la enfermedad renal y su progresión.

La hiperuricemia ha sido asociada con enfermedad renal. Aproximadamente 20 a 60% de los pacientes con gota tienen insuficiencia renal leve o moderada; antes de la disponibilidad de agentes reductores de ácido úrico, alrededor de 10 a 25% de los pacientes con gota desarrollaron enfermedad renal en etapa terminal. La lesión histológica denominada "nefropatía gotosa" se compone de glomerulosclerosis, fibrosis intersticial, y arteriolosclerosis renal, a menudo con depósito focal intersticial de cristales de urato. Estos hallazgos histológicos se han observado en las autopsias de 79 a 99% de los pacientes con gota.

A pesar de la asociación de gota con enfermedad renal, existe controversia en cuanto a si el ácido úrico tiene un papel etiológico. En primer lugar, ha sido difícil atribuir la lesión renal generalizada en la gota a la deposición de cristales de urato, ya que a menudo sólo son focalmente presentes. En segundo lugar, muchos pacientes con gota tienen hipertensión o son de edad avanzada, y las lesiones renales podrían simplemente reflejar el daño renal hipertensivo o asociarse con el envejecimiento. En tercer lugar, los resultados de los estudios se mezclan en cuanto a si la reducción de ácido úrico ralentizará la progresión renal en pacientes con gota. La incapacidad para resolver este problema ha hecho hincapié en la necesidad de estudios adicionales.

Para investigar el papel de ácido úrico en la enfermedad renal, se desarrolló recientemente un modelo de la hiperuricemia en ratas. La mayoría de los mamíferos tienen un ácido úrico sérico bajo debido a la presencia de uricasa; en los seres humanos y los grandes simios, el gen de la uricasa está mutado y se vuelve no funcional. Por lo tanto, se indujo hiperuricemia inducida en ratas al proporcionar dosis bajas de ácido oxónico, un inhibidor de la uricasa. A diferencia de los modelos anteriores de inhibición de uricasa, que se traducen en uricosuria masiva con deposición de cristales intrarrenales y nefropatía obstructiva; este modelo ha dado lugar a una hiperuricemia leve y sin depósito de cristales intrarrenales. Sin embargo, se desarrolló lesión renal intersticial sutil, y esta se asoció con la activación del sistema renina-angiotensina (SRA) y el desarrollo de hipertensión. Los animales hiperuricémicos también desarrollaron una arteriolopatía aferente independiente de los cambios en la PA. La lesión vascular fue mediada en parte por efectos directos de ácido úrico para inducir la proliferación vascular de células de músculo liso (VSMC) y también por la activación del SRA. Mientras que la hiperuricemia indujo lesión renal y enfermedad vascular en ratas normales, también demostró acelerar la lesión vascular inducida por ciclosporinas y la enfermedad renal intersticial. La exacerbación de la nefrotoxicidad por ciclosporina mediada por el ácido úrico también se asoció con un aumento de la activación del SRA y el bloqueo de las vías específicas de óxido nítrico.La observación de que la hiperuricemia leve activa el SRA y causa la enfermedad renal a través de una vía independiente de cristales planteó la hipótesis de que la hiperuricemia puede ser un factor de riesgo general para la progresión renal. Curiosamente, la hiperuricemia es una característica común de la enfermedad renal de todas las etiologías; cuando la tasa de filtrado glomerular (TFG) cae, aumenta el ácido úrico en suero debido a la excreción renal reducida. La hiperuricemia en pacientes con insuficiencia renal es generalmente leve, debido a un aumento compensatorio en la excreción fraccional, reducción de la producción, y el aumento de la excreción de ácido úrico a través de vías no renales (gastrointestinales). Debido a que la hiperuricemia es a menudo leve, la gota es rara en pacientes con enfermedad renal en fase terminal y el aumento de ácido úrico es a menudo considerado inocuo. Sin embargo, la posibilidad de que la hiperuricemia podría estar contribuyendo a la progresión renal no ha sido probada. Para probar esta hipótesis, se analizó el papel del ácido úrico en el modelo clásico de la progresión renal inducida por la nefrectomía 5/6 (modelo de riñón remanente). Además, dado el hecho de que en la corteza renal se incrementa la

expresión de COX-2 después de la ablación renal subtotal y la COX-2 es un regulador importante de la producción de renina, también se investigó los cambios en la COX-2 por hiperuricemia.

Materiales y MétodosProtocolo ExperimentalTodos los procedimientos en animales fueron aprobados por los Comités de Cuidado de Animales de la Universidad de Washington y el Colegio Baylor de Medicina. Las ratas macho Sprague-Dawley (190 a 200 g; Simonsen Laboratorios, Gilroy, CA) fueron sometidos a un riñón remanente (RK) operación después de la medición de línea de base de PA y la función renal. La operación de RK se realizó mediante una nefrectomía derecha subcapsular y la resección quirúrgica de los tercios superiores e inferiores del riñón izquierdo en total de 17 ratas. Después de la asignación al azar por el porcentaje de peso del riñón remanente eliminado [(peso del riñón derecho-Peso de polos superior e inferior del riñón izquierdo) / peso del riñón derecho X 100], los animales se dividieron en cuatro grupos. El grupo 1 (n=4) recibió dieta normosódica (dieta NS) (0,27% NaCl) (RK); el grupo 2 (n=5) recibió dieta conteniendo ácido oxónico 2% (AO, inhibidor de uricasa hepática; Sigma, St. Louis, MO) (RK+AO); el grupo 3 (n=4) recibieron dieta NS + AO 2% y alopurinol (inhibidor de la xantina oxidasa, 13 mg/dl en el agua potable; Schein Pharmaceutical, Florham Park, NJ) (RK+AO+AP); y el grupo 4 (n=4) recibió dieta NS, AO 2% y benziodarona (agente uricosúrico, 13 mg/dl en el agua potable; Sanofi, Barcelona, España) (RK+AO+BZ). EL AO 2% podría ser dado sin aparente toxicidad en ratas de acuerdo con los estudios anteriores, y no hubo mortalidad durante el período de estudio. Las dosis de AP y BZ se determinaron sobre la base del efecto de disminución de ácido úrico en los estudios anteriores. Las ingestas diarias medias de alopurinol y benziodarona fueron de 20,4 ± 5,3 mg/kg por día y 21,3 ± 6,2 mg/kg por día en los grupos RK+AO+AP y RK+AO+BZ, Respectivamente. A las 6 semanas, las ratas se sacrificaron para la evaluación histológica.

PA sistólica, ácido úrico, proteinuria y la función renalLa PA sistólica se controló mediante un manguito de esfigmomanómetro en la cola utilizando un sistema automatizado con un sensor fotoeléctrico (CITI; Ciencias de la Vida, Woodland Hills, CA) que ha demostrado que se correlaciona estrechamente con la medición intraarterial de PA. Todas las ratas fueron acondicionadas previamente para esta máquina al menos dos veces antes de la medición real de la PA. La

concentración de ácido úrico en suero se determinó mediante el método de carbonato de fosfotungstato y el método estándar de ácido úrico (Sigma, St. Louis, MO). La excreción de proteínas urinarias (24 h) se midieron usando el método del ácido sulfosalicílico, y el nitrógeno ureico en sangre y la creatinina se determinaron colorimétricamente utilizando un kit comercial (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO).

Morfología Renal e inmunohistoquímicaLos tejidos para su examen microscópico y tinción con inmunoperoxidasa fueron fijados en solución de metilo de Carnoy y embebidos en parafina. Secciones de 4 micras se tiñeron con el reactivo de ácido peryódico de Schiff (PAS) y contrastadas con hematoxilina. La tinción de inmunoperoxidasa indirecta de las secciones de 4 micras se realizó como se ha descrito anteriormente, con anticuerpos monoclonales específico y anticuerpos policlonales dirigidos a los siguientes antígenos: actina de músculo liso (α-SMA) con anticuerpo monoclonal de ratón (αSM-1; Sigma, St. Louis, MO), renina con anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano (Sanofi Recherche, Motpellier, Francia); colágeno tipo III con anticuerpo de cabra anti-humano (Southern Biotechnology, Birmingham, AL); COX-2 con el anticuerpo policlonal de conejo anti-ratón (Cayman, Ann Arbor, MI); monocitos-macrófagos con anticuerpo monoclonal de ratón ED-1 (Serotec, Indianapolis, IN). Los controles incluían la omisión del anticuerpo primario y la sustitución del anticuerpo primario con el conejo preinmune o suero de ratón.Para examinar si existe alguna evidencia de proliferación endotelial o del músculo liso, se realizó doble inmunotinción con actina de las células musculares lisas y un anticuerpo contra el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) (PC 10; Cappel, Aurora, OH). Las secciones de tejido se incubaron primero con el anticuerpo PCNA durante la noche a 4 ° C, seguido secuencialmente por IgG biotinilado de caballo anti-ratón en suero, conjugado con peroxidasa de avidina D, y el desarrollo de color con diaminobencidina (DAB) con cloruro de níquel. Después de la incubación en H2O2 al 3% durante 8 min para eliminar cualquier actividad de peroxidasa remanente, las secciones se incubaron con anticuerpo primario durante 3 h a temperatura ambiente, seguido IgG biotinilado de caballo anti-ratón durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la incubación con fosfatasa alcalina de estreptavidina (Vector, Burlingame, CA), se desarrolló el color usando el kit de sustrato de AP-RED (Zymed, San Francisco, CA).

Cuantificación de datos morfológicos

Todos los análisis fueron ciegos. El número de células endoteliales y de músculo liso fueron contados en la arteriola aferente, la arteria interlobular, y la arteria arqueada. Se evaluaron todas las arteriolas y arterias seccionadas transversalmente disponibles en cada sección. Los buques que no fueron seccionados transversalmente, proporcionando una pared asimétrica, se excluyeron del presente análisis. Para evaluar la hipertrofia de células del músculo liso y/o hiperplasia, el área de la pared de la sección transversal y el grosor de cada arteria se midió por análisis de imágenes por ordenador (Optimas 6.2; Media Cybernetics, Silver Springs, MD). Las arterias y arteriolas se identificaron por su localización anatómica y el patrón de ramificación de los vasos circundantes y la forma del endotelio y las células musculares lisas, que se describen en otra parte. Teniendo en cuenta el ciclo de reducción continua de la arteria interlobular, se evaluó la arteria interlobular en el mismo nivel de cada riñón (1/3 proximal de la unión cortico-medular). Las arteriolas aferentes cuidadosamente diferenciadas de las arteriolas eferentes por sus características generales, incluyendo la presencia de células endoteliales finas y continuas con una pared de músculo liso más gruesa que la de la arteriola eferente.La expresión de renina se cuantificó por el número de glomérulos con tinción positiva para la renina yuxtaglomerular utilizando un mínimo de 40 glomérulos en cada biopsia, un método que ha sido previamente demostrado que se correlaciona con cambios en el contenido de la renina tejido. La expresión de COX-2 cortical se midió como el porcentaje de área positiva a inmunotinción a COX-2 en la corteza renal utilizando el analizador de imágenes computarizado. El porcentaje de glomeruloesclerosis y la puntuación de fibrosis tubulointersticial (0-5) se evaluaron sobre la base de la tinción de PAS como se describió anteriormente.

Generación de Ratas COX-1 y COX-2 ribosonda para ensayo de protección de RNasa (RPA)Un fragmento de ADNc de COX-1 producido por BstX1 (desde el bp 1350 a bp 1690), 340 bp, se embota y se subclonó en el sitio Smadi de pGEM4Z. Un fragmento de 241 bp de rata COX-2 de ADNc producido por BamHI y EcoRI (desde el bp 409 hasta el bp 650) se subclonó en pGEM4Z.

RPA para COX-1 y COX-2 ARNmDespués de la incubación de VSMC con ácido úrico para 4, 8, y 24 h, el ARN total se preparó a partir las monocapas de VSCM utilizando el protocolo de aislamiento de ARN total de RNeasy96 fabricado por Qiagen (Valencia, CA).

Después de la determinación de la pureza del ARN y la concentración por espectrofotometría, 2µg de muestras de ARN se hibridaron durante 30 minutos a 90 ° C con una mezcla de ribosonda marcada con 32P-UTP y la limpieza de genes (L32) (1 x 105 cpm para cada sonda), y el EPR se realizó como se ha descrito previamente utilizando un kit RPA (21) (Torrey Pines Biolabs, Houston, TX) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La hibridización del ARN protegido se desnaturalizó a 85 ° C y fue sometido a electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%. Los geles se transfirieron a papel de filtro Whatman 3M, se secaron, y se expusieron a una película estera Kodak X-O durante la noche a -70 ° C.

Efecto in-vitro del ácido úrico y del inhibidor selectivo de COX-2 sobre la proliferación de células musculares lisasLas ratas de células musculares lisas vasculares (RVSMC) fueron adquiridas de la American Type Culture Collection (CRL-2018) y se cultivaron en DMEM suplementado con FBS 10%, gentamicina (G418, 50 mg/ml), y L-glutamina. Después de que le crecimiento celular fue de 70%, confluyeron en placas de múltiples pocillos (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), el medio de cultivo fue cambiado a un medio libre de suero durante 24 a 48 h antes de cada experimento. Después de la sincronización del crecimiento celular, las células se lavaron tres veces con HBSS y se expusieron a ácido úrico (3 mg/dl) (Sigma, St. Louis, MO) para 6, 24, 48, y 72 h. En cada punto de tiempo, el número de células se contó por hemocitómetro y contador Coulter. Alternativamente, se determinó el número de células usando el ensayo de proliferación celular CellTiter (Promega, Madison, WI). La proliferación celular también se evaluó mediante la medición de la captación de timidina 3H. El efecto de un inhibidor selectivo de la COX-2 (NS398 [10 µM/L]; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) y el tromboxano A2 (TXA-2) antagonista de los receptores (SQ-29548 [2,5 µM/ml?]; Biomol, Plymouth Meeting, PA) sobre la proliferación de SMC inducida por ácido úrico, también fue evaluada. No había pruebas de citotoxicidad a las concentraciones de todos los reactivos utilizados, como se documenta mediante tinción con azul de tripano y la liberación de LDH.

Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media de SD±. Las diferencias en los diferentes parámetros entre los grupos se evaluaron mediante ANOVA de dos vías, seguido de la corrección para comparaciones múltiples. Las diferencias en los parámetros en cada punto de tiempo después de la cirugía RK y

administración de medicamentos se compararon mediante la prueba de t pareada. La relación entre las variables fue evaluada mediante el análisis de correlación de Pearson. La significancia se define como P< 0.05.

ResultadosLa hiperuricemia induce hipertensión e hipertrofia renal en el modelo de riñón remanenteLos niveles basales de ácido úrico promedio fueron de 1,1 mg/dl en los cuatro grupos (Figura 1). En ratas RK, se observó un aumento transitorio de ácido úrico (semana 2, 2,7 ± 0,6 mg/dl, P< 0,05), pero los niveles regresaron al nivel basal en la semana 6 (1,4 ± 0,5 mg/dl). En contraste, las ratas RK+AO desarrollaron hiperuricemia más grave y persistente (semana 2, 4,0 ± 0,6 mg/dl; semana 6, 3,2 ± 0,6 mg/dl; P< 0,01 versus solo RK la semana 2 y 6).Este aumento de ácido úrico en suero en ratas RK+AO fue seguido por una elevación de la presión arterial a las 4 semanas en comparación con las ratas solo RK (Figura 1B). Alopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa, disminuyó significativamente el nivel de ácido úrico en el suero y previno el desarrollo de la hipertensión.

Figura 1. Cambios del ácido úrico en suero (A) y PA (B) en el riñón remanente (RK; ¨¨º¨¨), riñón remanente + ácido oxónico (RK+AO -- --), riñón remanente + ácido oxónico + alopurinol

(RK + AO + AP –X-), y el riñón remanente + ácido oxónico + benziodarona (RK + OA + BZ ¨-o-¨). P< 0,05 de RK versus RK +AO + AP.

Benziodarona (agente uricosúrico) sólo redujo parcialmente el ácido úrico y tuvo un menor efecto sobre la presión arterial (Figura 1).Durante el período de estudio, la ingesta media diaria de alimento fue similar entre los grupos (RK versus RK+AO versus RK+ AO+ AP frente RK+ AO+ BZ, 24 ± 0,4 frente a 21 ± 0,5 frente a 22 ± 0,6 frente a 22 ± 0,5 g/kg). A pesar de la ganancia de peso corporal comparable, el peso del riñón remanente (RKW) y la relación RKW/peso corporal (PC) a las 6 semanas fueron significativamente mayores en ratas RK+AO, lo que sugiere una hipertrofia renal más severo (Tabla 1). El porcentaje de aumento en RKW/PC en ratas RK+AO fue de 1,6 veces en comparación con las ratas RK (RK+ AO versus RK, 380,4± 37,3 versus 241,9 ±20,5%; P< 0,05). La hipertrofia renal inducida por el ácido oxónico se previno significativamente por la administración de alopurinol o benziodarona (Tabla 1).

La hiperuricemia acelera la progresión renal en el modelo de riñón remanenteLos niveles basales de creatinina en suero fueron comparables en cuatro grupos (RK versus RK+ AO versus RK+ AO+ AP versus RK+ AO+ BZ, 0,72± 0,01 versus 0,69± 0,04 versus 0,75± 0,05 versus 0,70± 0,03 mg/dl). A las 6 semanas de administración de AO, ratas RK+ AO mostraron peor función renal con alta creatinina en suero en comparación con el grupo de sólo RK (1,44± 0,08 versus 1,23± 0,13 mg/dl, RK+ AO versus RK; P< 0,05). La administración de alopurinol o benziodarona impidió el aumento de la creatinina sérica (RK+ AO+ AP, 1,12± 0,15 mg/dl; RK+ AO+ BZ, 1,23 0,15 mg/dl; p< 0,05 versus RK+AO, respectivamente). Después de la ablación renal, las ratas RK mostraron un aumento progresivo de la excreción urinaria de proteínas. La administración de AO en ratas RK resultó en mayor proteinuria a las semanas 4 y 6 (Figura 2) en comparación con las ratas RK. Tanto el alopurinol y benziodarona impidieron el aumento de la proteinuria obtenida por AO (Figura 2). El alopurinol fue especialmente eficaz y redujo la proteinuria en el mismo nivel que el observado en el modelo RK solo.Las ratas RK mostraron evidencia clásica de enfermedad renal progresiva con

glomeruloesclerosis focal y fibrosis intersticial. Las ratas RK+AO mostraron características histológicas similares; en particular, no hubo evidencia de obstrucción tubular a partir de cristales. La glomeruloesclerosis fue más común en las ratas RK+AO en comparación con las ratas RK (24,2 ± 2,5 versus 17,5± 3,4%; P< 0,05) (Figura 3).

Figura 2. Cambios en la proteinuria en las ratas RK, (¨¨º¨¨), RK+AO (- -), RK + AO + AP (–X-), y RK + OA + BZ (¨-o-¨). *P< 0,05 de RK versus RK +AO + AP. #P< 0,05 de RK versus RK +AO + AP versus RK +AO + BZ

La fibrosis intersticial también fue mayor en las ratas RK+AO en comparación con solo RK (1,89± 0,45 versus 1,52± 0,47; P< 0,05) (Figura 3). El alopurinol impidió tanto el aumento de la glomeruloesclerosis y fibrosis intersticial. En contraste, el agente uricosúrico, benziodarona, fue capaz de prevenir el aumento de la glomerulosclerosis pero no el aumento de la fibrosis intersticial en ratas RK+AO (Figura 3).

La Hiperuricemia Induce Enfermedad Vascular Preglomerular Severa en Ratas RKLos vasos arteriales preglomerulares (arteria arqueada, arterias interlobulares, y arteriolas aferentes) de las ratas RK+AO mostraron diferencias dramáticas en comparación con las ratas de control RK (Figura 4, A a C). Las ratas RK+AO mostraron un marcado incremento en el espesor de la pared del vaso, así como un aumento en el número de células del músculo liso (Figura 4B). En algunas ratas RK+AO, los vasos arteriales mostraron cambios consistentes con una arteriopatía obliterante (Figura 4C). La doble tinción de PCNA y α-SMA documentaron la presencia de numerosa proliferación SMC en el grupo de ratas RK+AO en comparación con las ratas de control RK (Figura 4, D y E).La fibrosis adventicia periarterial también fue prominente en las ratas RK+AO (Figura 4F) en

asociación con mayor infiltración celular. La cuantificación del número de células de músculo liso en proliferación (PCNA / α-SMC + células) y el espesor de la pared medial de los diversos vasos preglomerulares se muestra en la Tabla 2. Otro hallazgo característico en los vasos

preglomerulares era la infiltración de macrófagos inflamatorios evaluados por células ED-1+¿¿, especialmente en áreas subendoteliales y adventicia. También hubo algunas células ED-1+¿¿ en el medio.

Tabla 1. Cambios en el peso corporal (PC) y en el peso del riñón remanente (RKW) a las 6 semanas

AO, ácido oxónico; AP, alopurinol; BZ, benziodarona. Los datos son expresados en el promedio de SD±.PC basal y RKW después de 6 semanas de la cirugía RK.Incremento RKW= (RKW/PC en la sexta semana)/ (RKW basal/PC) X 100.RKW basal= Peso basal del riñón derecho - (peso del polo superior e inferior del riñón izquierdo).e= P < 0.05 versus RK, RK+AO+AP, y RK+AO+BZ.

El alopurinol previno significativamente la proliferación de las células musculares lisas (SMC) y el engrosamiento de la pared engrosamiento de la arteriola aferente y la arteria interlobular en ratas RK-OA (Tabla 2). Por el contrario, benziodarona no mostró ningún efecto sobre la proliferación de SMC. Curiosamente, el número de células endoteliales en las arterias interlobulares y arqueadas también se incrementó con la administración de AO (Tabla 2) y no se vio afectada por la administración de alopurinol o benziodarona.

Figura 3. Comparación de las cicatrices renales. (A) glomeruloesclerosis; (B) fibrosis túbulo-intersticial en las ratas RK, RK+AO, RK+AO+AP, RK+AO+BZ. *p< 0.05 versus RK, RK+OA+AP, y RK+AO+BZ; #p< 0.05 versus RK and RK+AO+AP.

Figura 4. La morfología de los vasos preglomerulares en las ratas RK y RK+AO. En comparación con las ratas RK (A, X400, PAS; D, X400, doble tinción PCNA+ α-SMA), hubo marcado engrosamiento de la pared con proliferación de células musculares lisas (SMC) en ratas RK+AO (B, X400, PAS; E, X400, doble tinción PCNA+ α-SMA). Las arterias ocasionales en las ratas RK+AO mostraron un aumento en el número de células musculares lisas, la migración de SMC en la íntima consistente con una arteriopatía obliterante (C, X400, PAS). La fibrosis perivascular de la adventicia también era prominente en las ratas RK+AO (F, X400, inmunotinción de colágeno III).

El papel de la PA en los cambios vasculares inducidos por la hiperuricemia Debido a que las ratas RK+AO tenían mayor PA sistólica en comparación con las ratas de control RK (Figura 1), la hipótesis de que la lesión vascular observada en las ratas RK+AO podría atribuirse a lesión inducida por una presión más alta. Para diferenciar el efecto de la elevación de la hiperuricemia inducida por la PA de la hiperuricemia en sí, sobre la proliferación de SMC, se evaluaron los cambios en los vasos preglomerulares en un grupo control RK con PA comparable a las ratas RK+AO (n=6; RK+AO versus RK histórico con PA alta, 177,8± 20,1 versus 175,7± 45,8 mm de Hg; p= NS) y los pesos corporales (336,6± 23,2 versus 362,5± 55,4 g; p= NS). Como se muestra en la Figura 5, el número de células musculares lisas de las arterias preglomerulares en las ratas RK+AO fue mayor en comparación con las ratas RK con PA comparable. Esto sugiere que el aumento de PA observada en las ratas RK+AO no tiene en cuenta las diferencias en lesión vascular observadas.

Figura 5. Efecto de la hiperuricemia en la proliferación de SMC independiente de PA. El número de células musculares lisas (SMC) de las arterias interlobulares en las ratas RK+AO fue significativamente mayor en comparación con las ratas RK con PA comparable. *p< 0,05 versus PA normal, RK, y RK con PA elevada.

La hiperuricemia activa el SRA y la vía de COX-2 en el modelo RKHemos informado anteriormente que la hiperuricemia incrementa la expresión de renina en las células yuxtaglomerulares de las ratas normales y en ratas tratadas con ciclosporina. También hemos demostrado que la arteriopatía preglomerular en ratas hiperuricémicas se puede prevenir mediante el tratamiento con inhibidores de la ECA o bloqueadores del receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1). Por ello, se investigó si existe incremento de la renina por hiperuricemia en el modelo RK. En consonancia con los otros estudios, se halló una mayor expresión de renina en ratas RK+AO versus solo RK (RK+AO versus RK, 39,2 ± 7,39 versus a 31,2 ± 4,48% de glomérulos con tinción de renina yuxtaglomerular; p< 0,05). Tanto alopurinol (20,2± 7,93%) como benziodarona (27,8± 8,35%) redujeron significativamente la expresión de renina renal inducida por AO (p<0,005). Hubo una fuerte correlación entre la cantidad de renina con el ácido úrico en suero, en ratas individuales (r2 0,52; p< 0,05) (Figura 6).

Figura 6. Correlación del ácido úrico sérico con la expresión de renina en la corteza renal

Un importante regulador de la expresión de renina es la ciclooxigenasa 2 (COX-2). Por lo tanto, se examinó la expresión de COX-2 en este

modelo. En la corteza de la rata normal, la inmunoreactividad a COX-2 está presente casi exclusivamente en las células de la mácula densa. De acuerdo con los estudios de Wang et al. en el modelo RK, la expresión de COX-2 se incrementó en las ratas RK en comparación con las ratas normales (0,10± 0,01 versus 0,24± 0,05%; p< 0,05), especialmente en las células tubulares de la rama ascendente cortical. Las ratas RK+AO mostraron aún mayor expresión de COX-2 que implicaba no sólo a la rama ascendente cortical, sino también las células del músculo liso en las arteriolas aferentes e interlobulares (Figura 7).

Figura 7. Expresión de COX-2 en las ratas RK y RK+AO. En las ratas normales y ratas RK, la inmunoreactividad a COX-2 está presente casi exclusivamente en las células de la mácula densa (A, ratas RK, x200), mientras que en las ratas RK+AO se muestran mayor expresión de COX-2, que involucra no sólo a las células tubulares de la rama ascendente gruesa cortical, sino también s las células de músculo liso en las arteriolas aferentes (C, x400, flecha) y las arterias interlobulares (D, x400).

El aumento de la expresión de COX-2 se cuantificó por análisis de imagen computarizado de la corteza. Las ratas RK+AO mostraron significativamente mayor expresión de COX-2 que las ratas solo RK (0,24± 0,05 versus 0,70± 0,36%; p< 0,05); y alopurinol (0,27± 0,18%) y como benziodarona (0,48± 0,26%) podrían impedir el aumento de la expresión COX-2. Dentro de las ratas individuales, los niveles de ácido úrico estuvieron directamente correlacionados con el grado de expresión de COX-2 (Figura 8A). A su vez, la expresión de la COX-2 también se correlacionó con el aumento de la renina yuxtaglomerular (Figura 8B). Estos estudios demuestran que tanto la COX-2 y SRA se indujo con la hiperuricemia en el modelo RK.

Tabla 2. Cambios macrovasculares en las ratas RK y ratas RK + administración AO −¿a¿

a los datos son expresados como un promedio de SD±. SMC, células musculares lisas. CE, células endoteliales.b p< 0.05 versus RK and RK+AO+ AP.c p<0.05 versus RK.

Figura 8. Correlación de la expresión de COX-2 con la expresión de ácido úrico sérico (A) y renina (B)

El ácido úrico estimula la proliferación de las células musculares lisas vasculares (VSMC) a través de la vía de COX-2 La observación de que el ácido úrico indujo enfermedad vascular independientemente de la PA sugirió un potencial efecto directo del ácido úrico en las células musculares lisas. De acuerdo con la constatación in vivo, la estimulación con ácido úrico (3 mg/dl; Sigma, St. Louis, MO) resultó en un incremento tiempo-dependiente de células de músculo liso (VSMC) en la aorta de la rata (Figura 9A). Se observó la expresión in-novo de COX-2 de músculo liso en la pared vascular de las ratas RK+AO; por lo tanto, la hipótesis de que la expresión de COX-2 inducida por ácido úrico, puede desempeñar un papel importante en el desarrollo de arteriopatía observado en las ratas RK+AO. En consonancia con esta observación, se encontró que el ácido úrico podría inducir un aumento marcado del ARNm de COX-2 en células musculares lisas vasculares cultivadas (Figura 9B), mientras que se observó una expresión comparable de ARNm de COX-1. Para determinar el papel de la COX-2 en la proliferación de SMC, se examinó el efecto de un inhibidor selectivo de la COX-2 (NS398 [10 M/L]: Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) en el número de SMC. NS398 inhibe significativamente la proliferación de SMC inducida por el ácido úrico (Figura 9C), lo que sugiere el posible papel de las prostaglandinas

generadas por la COX-2 en la proliferación de SMC mediada por el ácido úrico. Es importante destacar que, NS398 no afectó el número de células en ausencia de estimulación de ácido úrico. Estudios previos han informado que la angiotensina II inducida por la proliferación de VSMC es mediada por la generación de COX-2 y tromboxano (TXA-2). Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que TX-A2 puede ser un mediador probable de la respuesta proliferativa de VSMC a ácido úrico. VSMC se incubaron con ácido úrico (3 mg/dl) en ausencia o en presencia del antagonista selectivo TXA2 (SQ-29548 [2,5 M/ml]; Biomol, Plymouth Meeting, PA). SQ-29548 redujo significativamente la proliferación de SMC inducida por ácido úrico.

Figura 9. Proliferación VSMC inducida por el ácido úrico a través de la vía COX-2. La estimulación con ácido úrico (3 mg/dl, - -) resultó en incremento tiempo-dependiente en el número células de músculo liso de la aorta (A, n= 6) en comparación con los medios de control sin ácido úrico (--o--). Se observó un marcado aumento de la expresión de ARNm de COX-2 en VSMC cultivadas a las 4 y 8 h después de la estimulación con ácido úrico (B, n=3) en contraste con ningún cambio en la expresión de ARNm de COX-1. Los inhibidores selectivos de COX-2 (NS398, 10 µM/L) inhibieron la proliferación de SMC inducida por ácido úrico, mientras que NS398 no afectó la absorción de 3H-timidina en ausencia de estimulación UA (C, n=6 por grupo). *p< 0,01 versus otros grupos.

DiscusiónLa hiperuricemia es frecuente en pacientes con enfermedad renal, pero casi nunca ha sido considerado como un factor de riesgo para la progresión. Sin embargo, dos estudios han encontrado que la hiperuricemia es un factor de riesgo independiente para la progresión de la nefropatía por IgA. Además, en un estudio reciente de 6400 sujetos con función renal normal, un ácido úrico sérico >8,0 mg/dl, en comparación con un nivel de ácido úrico sérico <5,0 mg/dl, se asoció con un 2,9 veces mayor riesgo de el desarrollo de insuficiencia renal dentro de 2 años en los hombres y un aumento del riesgo 10,0 veces mayor en las mujeres. Este aumento del riesgo relativo fue independiente de la edad, índice de masa corporal, presión arterial sistólica, colesterol total, albúmina sérica, glucosa, tabaquismo, consumo de alcohol, hábitos de ejercicio, proteinuria y hematuria. De hecho, un ácido úrico elevado era más predictivo para el desarrollo de insuficiencia renal de proteinuria. Por ello, se investigó los efectos y el mecanismo de acción de la hiperuricemia en la progresión de la enfermedad renal en el modelo clásico RK en ratas.El ácido úrico sérico aumentó en las ratas RK, pero fue mayor en las ratas en que se administró AO 2% (inhibidor de la uricasa). El nivel de ácido úrico sérico alcanzó su punto máximo a las 2 semanas, tanto en ratas RK y RK+AO y luego disminuyó gradualmente durante las 4 semanas siguiente. La caída de ácido úrico en las ratas RK y RK+AO puede reflejar excreción extrarrenal (principalmente entérica) y la producción deprimida de ácido úrico (reducción de la actividad xantina oxidasa) en la insuficiencia renal crónica como informó Vaziri et al.Se encontraron varios descubrimientos nuevos en este estudio. El principal hallazgo novedoso fue que hiperuricemia moderada exacerbó marcadamente la progresión renal. En concreto, las ratas hiperuricémicas RK+AO mostraron más hipertrofia renal, hipertensión, proteinuria, insuficiencia renal, y mayor glomeruloesclerosis y fibrosis intersticial. La lesión renal no parece estar mediada por depósito de cristales de urato, ya

que no había características de obstrucción tubular consistente con el depósito de cristales de urato intrarrenal.Uno de los mecanismos por los que el ácido úrico puede haber exacerbado la lesión renal puede ser la activación del SRA, que se ha demostrado ser un importante mediador de la progresión de la enfermedad renal, no sólo por sus efectos hemodinámicos para aumentar la presión sistémica y glomerular; también, por su efecto fibrogénico directo sobre las células renales y vasculares. Hemos informado anteriormente de que la administración de AO a ratas normales aumenta la expresión de renina yuxtaglomerular y que el tratamiento con enalapril puede controlar la PA, mejorar la arteriolopatía, y prevenir el daño renal en este modelo. También se encontró que el tratamiento con AO en un modelo de nefropatía inducida por ciclosporina resultaba en hiperuricemia, aumento de la expresión de renina y progresión acelerada. Saito et al. también informó que los niveles de ácido úrico en suero de seres humanos se correlacionan con la actividad de la renina plasmática. Aunque no se midió la actividad de la renina plasmática, se ha documentado un aumento en la expresión de renina renal en las ratas hiperuricémicas que se correlacionaban con el ácido úrico sérico. Además, la prevención de hiperuricemia en las ratas AO tratadas con alopurinol, y en menor medida con benziodarona, resultó en niveles más bajos de renina y a su vez con menos lesión renal.Un segundo hallazgo nuevo en el estudio fue la observación de que las ratas RK hiperuricémicas desarrollaron vasculopatía preglomerular severa. Aunque el engrosamiento de las arteriolas aferentes se había observado en estudios anteriores de ratas hiperuricémicas con función renal normal, la hiperuricemia se asoció con una vasculopatía severa en el modelo RK. Los vasos preglomerulares mostraron engrosamiento con un aumento en el número SMC y la infiltración de macrófagos en las áreas subendoteliales, media y adventicia. Estos cambios vasculares, que en ocasiones dieron lugar a una arteriopatía obliterante, podrían potenciar la lesión renal al causar isquemia de la circulación postglomerular. La reducción en el lumen también podría proporcionar un estímulo para el aumento de la expresión de renina y también podría contribuir al desarrollo de la hipertensión marcada en estas ratas.Se estudió el mecanismo para el desarrollo de la enfermedad vascular. Hemos informado anteriormente, como lo hizo Rao et al., que el ácido úrico puede estimular directamente la proliferación de VSMC. En este estudio, hemos identificado un nuevo mecanismo que implica la COX-2. Específicamente, se encontró que las

células musculares lisas vasculares (VSMS) de la aorta de rata mostraban expresión de ARNm de COX-2 después de la incubación con ácido úrico. La incubación de las SMC, ya sea con un inhibidor de COX-2 o con un inhibidor de receptor TX-A2 podría prevenir la proliferación en respuesta al ácido úrico. La COX-2 también demostró que se expresa de novo en los vasos preglomerulares de las ratas RK+AO, y su expresión está correlacionada tanto con los niveles de ácido úrico, como con el grado de proliferación de SMC. Por tanto, estos estudios sugieren un papel crítico de la mediación del ácido úrico, del tromboxano generado por COX-2 en la proliferación de VSMC en este modelo. Curiosamente, la COX-2 también ha sido recientemente demostrada ser importante en el mecanismo por el que la angiotensina II estimula la proliferación de VSMC.Además de la COX-2, es probable que la angiotensina II también está contribuyendo a la vasculopatía. Como se ha mencionado, la renina también se incrementó en este modelo y se correlacionó con la cantidad de COX-2. No está claro si el aumento de la renina refleja los efectos directos del ácido úrico en las células yuxtaglomerulares o un efecto indirecto a través de la estimulación de la COX-2 en la mácula densa y las arteriolas o un efecto indirecto en relación con el desarrollo de enfermedad vascular por la perfusión renal reducida. En cualquier caso, la generación de angiotensina II puede dar lugar a la proliferación de VSMC e hipertrofia así como a la infiltración de células inflamatorias. Hemos informado anteriormente de que la vasculopatía en ratas normales con hiperuricemia inducida por AO se puede evitar en gran medida mediante el bloqueo del SRA, y también han encontrado que la proliferación de VSMC mediad por ácido úrico puede ser parcialmente inhibida por el bloqueo del receptor AT1. Por tanto, es probable que tanto la angiotensina II y COX-2 están implicadas en la proliferación vascular y la inflamación observada en nuestro modelo. Estudios in vivo para evaluar el efecto de la inhibición del SRA o COX-2 en este modelo de enfermedad renal progresiva con hiperuricemia proporcionarían una prueba más directa de la importancia de estos sistemas.Es importante destacar que los cambios observados en los vasos preglomerulares en las ratas RK+AO no fueron únicamente una consecuencia de la elevación de la presión arterial sistémica (Figura 5), como se evidencia por los cambios vasculares más prominentes en los vasos preglomerulares de las ratas RK hiperuricémicas en comparación con las ratas RK históricos con PA sistémica comparable; pero con niveles de ácido úrico significativamente menores. Este hallazgo sugiere que la vasculopatía inducida por el ácido úrico es independiente de la presión arterial

sistémica elevada. Además, aunque el aumento de expresión de la COX-2 se informó en arterias de ratas hipertensas, el aumento de la expresión cortical de la COX-2 inducida por la ablación renal o infusión de angiotensina II ha demostrado ser independiente de la PA.Una observación interesante fue que el alopurinol fue notablemente eficaz en la reducción de ácido úrico y la prevención de la disfunción renal inducida por AO, proteinuria, hipertensión, enfermedad vascular, hipertrofia renal, y la cicatrización renal. El beneficio del alopurinol está correlacionado con su capacidad para reducir el ácido úrico. Sin embargo, es posible que algunos de los beneficios también podrían referirse a la conocida capacidad del alopurinol para prevenir la formación oxidante. La benziodarona, un agente uricosúrico, fue menos eficaz en la reducción de ácido úrico y redujo sólo parcialmente el aumento de la expresión de renina; esto se explica su beneficio parcial en el proceso de la enfermedad. Curiosamente, fue más eficaz en el bloqueo de los cambios glomerulares (proteinuria y glomeruloesclerosis) que los cambios vasculares o intersticiales. Esto puede reflejar que los cambios glomerulares pueden estar mediadas más por un fenómeno de umbral relacionado con el nivel de ácido úrico. Otra posibilidad, es que la lesión intersticial no fue bloqueada con la mayor eficacia debido a que los efectos del aumento de ácido úrico urinario en las células tubulares se produjeron como consecuencia de la acción uricosúrica de la benziodarona.

En resumen, hemos identificado al ácido úrico como un nuevo y potencialmente importante mediador de la progresión renal en el modelo de riñón remanente de la enfermedad renal progresiva. La hiperuricemia incrementó la PA sistémica, proteinuria, disfunción renal y daño renal progresivo. La hiperuricemia también induce la enfermedad vascular a través de una vía COX-2-dependiente. Aunque hay que tener cuidado en la interpretación de los modelos animales para enfermedades humanas, estos estudios proporcionan un mecanismo para explicar los últimos datos epidemiológicos que muestran que el ácido úrico es un factor de riesgo independiente para la progresión renal. Además, nuestros estudios sugieren que la hiperuricemia puede ser uno de los mecanismos clave y previamente desconocidos para la activación del sistema renina angiotensina y de la vía de la COX-2 en la enfermedad renal progresiva. Se necesitan estudios para determinar si el tratamiento temprano de la hiperuricemia puede retrasar la enfermedad renal progresiva en los seres humanos.