Uchuva - Physalis Peruviana - Hipoglicemiante - UNAL

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Implementación de una metodología para la obtención de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluación de actividad hipoglicemiante Diana Paola Medina Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia Bogotá, Colombia 2012
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Uchuva - Physalis peruviana - hipoglicemiante - UNAL

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  • Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de

    frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad

    hipoglicemiante

    Diana Paola Medina

    Universidad Nacional de Colombia

    Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia

    Bogot, Colombia

    2012

  • Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de

    frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad

    hipoglicemiante

    Diana Paola Medina

    Tesis presentada como requisito parcial para optar al ttulo de:

    Magister en Ciencias Farmacuticas

    Directora:

    Q.F., Ph.D. Pilar Ester Luengas Caicedo

    Codirector:

    Q.F., Ph.D. Luis Fernando Ospina Giraldo

    Lnea de Investigacin:

    Farmacognosia y Fitoqumica

    Grupo de Investigacin:

    Grupo de investigacin en Tecnologa de Productos Naturales

    Universidad Nacional de Colombia

    Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia

    Bogot, Colombia

    2012

  • A mi directora de tesis, Pilar Ester Luengas

    Caicedo, quien merece todo mi cario, admiracin y

    gratitud; pues fue la persona que me mostr una luz

    de esperanza para iniciar y culminar este proceso;

    brindndome toda su confianza y apoyo

    incondicional.

    A mis padres, quienes han sido mi fuerza e

    inspiracin; a mis hermanos, quienes merecen lo

    mejor de la vida y a mi amado esposo, un hermoso

    regalo que me ha dado Dios, para continuar

    aprendiendo del amor, de la vida.

  • Agradecimientos A Dios; el ser supremo que nunca me abandona, quien me ha permitido lograr metas maravillosas en mi vida, como sta.

    A la profesora Pilar Ester Luengas, quien merece mi cario, admiracin y gratitud, por sus aportes en mi vida personal y profesional, su amistad, confianza y apoyo incondicional.

    Al profesor Jairo calle lvarez q.e.p.d.; quien dirigi mis primeros pasos en el campo de los Productos Naturales, por sus invaluables enseanzas.

    Al profesor Luis Fernando Ospina y a la profesora Marcela Aragn por la asesora en los ensayos de actividad, por su tiempo, sus aportes continuos para el trabajo y su buena energa.

    Al Doctor Carlos Andrs Coy; quien con sus conocimientos logr promover mi inters inicial, por el rea de los Productos Naturales, por sus enseanzas, amistad y buenos consejos.

    Al profesor Rubn Daro Torrenegra; quien particip en mi proceso de aprendizaje en el campo de los Productos Naturales, como joven investigadora, por su paciencia, aportes, y por su cario.

    A Javier Rincn, profesor del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia; por sus valiosos aportes y sus muestras de afecto.

    A todos los profesores del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia que hicieron parte de mi formacin integral en este proceso. Especialmente a los profesores Juan Camilo Marn, Norma Anglica Valencia y Javier Garca; por sus aportes al presente trabajo.

    A Leonardo Castellanos, por su disposicin constante, su colaboracin incondicional con material o equipos de laboratorio y por sus aportes como profesional.

    A Luis Enrique Cuca y Eliseo Avella; profesores del Departamento de Qumica de la Universidad Nacional de Colombia, por su disposicin y sus aportes.

    A Elizabeth Gil, profesora del Departamento de Qumica de la Universidad Javeriana, por su colaboracin con algunos equipos de laboratorio.

  • VIII Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    A mis compaeros Juan, Andrea, Jorge; con quienes compart gran parte de este proceso, e hicieron parte de mi formacin integral, por su amistad y paciencia.

    A los estudiantes de Pregrado del rea Curricular de Farmacia David Felipe Martnez, Juan David Rivera, Dalia, Diana Paola Rivas; quienes colaboraron en el desarrollo de la tesis, por su dedicacin, paciencia y valiosos aportes.

    Especial agradecimiento a todos los integrantes del Grupo de Investigacin en Tecnologa de Productos Naturales, del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia; por sus muestras de afecto y por cada uno de los aportes recibidos.

    Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, ASOHOFRUCOL, Laboratorios Bussi S.A. y a la Universidad Nacional de Colombia, por la financiacin del proyecto Diseo desarrollo y evaluacin de un producto fitoteraputico a partir de un extracto de frutos de uchuva (Physalis peruviana), obtenido, caracterizado, estandarizado y adecuado tecnolgicamente para este fin; por medio del cual fue financiado este trabajo.

  • Resumen y Abstract IX

    Resumen Los frutos de Physalis peruviana (Solanaceae), son reconocidos por su alto valor nutricional, usos etnobotnicos y diversas actividades biolgicas reportadas. Son utilizados principalmente para el tratamiento de la diabetes. Para la planta entera se reporta la presencia de varios tipos de metabolitos, destacndose entre stos, compuestos tipo witaesteroides. El presente trabajo estuvo dirigido a la generacin de una propuesta metodolgica para la obtencin de metabolitos a partir de frutos de P. peruviana, tiles como marcadores de un extracto con actividad hipoglicemiante. Para ello se ensayaron y adaptaron metodologas propuestas en la literatura, dirigidas principalmente hacia la obtencin de compuestos tipo witaesteroides, guiados adems por resultados de actividad de los extractos y fracciones, evaluados por el modelo de sobrecarga oral de almidn (SOA) en ratas Wistar o ratones ICR. Se aislaron tres compuestos, identificados como 5-hidroximetil-2-furancarboxaldehido, 4-hidroxiwitanlido E y 3-O-isobutiril--D-fructofuranosil-2-O-decanoil-3,4-di-O-isobutiril--D-glucopiranosido. Adicionalmente se detect por GC-MS la presencia de tres fitoesteroles (-sitosterol, campesterol y estigmasterol), en una subfraccin proveniente de la fraccin diclorometnica. Dos de los compuestos puros (5-hidroximetil-2-furancarboxaldehido y 4-hidroxiwitanlido E) se proponen como marcadores teraputicos y cuatro compuestos no activos, como marcadores analticos de los frutos de P. peruviana y sus extractos. El compuesto 5-hidroximetil-2-furancarboxaldehido se propone adicionalmente como un marcador de la estabilidad trmica del extracto. Adems de proponer los marcadores, se establecieron las metodologas para obtenerlos a escala laboratorio.

    Palabras clave: Physalis peruviana, frutos, marcadores, actividad hipoglicemiante, estandarizacin.

    Abstract

    The Physalis peruviana fruits (Solanaceae) are known for their high nutritional value, ethnobotanical uses and reported biological activities. They are mainly used in the diabetes treatment. Whole plant has several metabolites types, but the more abundant are withasteroids. The present paper was aimed to generate a methodological way to get identified metabolites to be used as markers for P. peruviana fruits extract with hypoglycemic activity; for it there were tested and adapted methodologies proposed in the literature to get withasteroids type compounds, guided also by the activity of the extracts and fractions, tested in Wistar rats or ICR mice by oral overload of starch (SOA). Three

  • X Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    compounds were isolated and identified as 5-hydroxymethyl-2- furancarboxaldehyde, 4-hydroxiwithanolide E and 3-O-isobutyryl--D-fructofuranosyl-2-O-decanoyl-3 ,4-di-O-isobutyryl--D-glucopyranoside. Additionally was detected by GC-MS the presence of three phytosterols (-sitosterol, campesterol and stigmasterol) in a sub-fraction from the dichloromethane fraction. Two of the pure compounds (5-hydroxymethyl-2- furancarboxaldehyde and 4- hydroxiwithanolide E) are proposed as therapeutic markers and four not active compounds, as analytical markers of P. peruviana fruits and their extracts. The compound 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyde is proposed additionally as a marker of the thermal stability of the extract. In addition were established methodologies to obtain to laboratory scale these markers.

    Keywords: Physalis peruviana, fruits, markers, hypoglycemic activity, standardization.

  • Contenido 1

    Contenido Pg.

    Resumen .............................................................................................................................. IX

    Lista de figuras .................................................................................................................... 1

    Lista de tablas ...................................................................................................................... 1

    Lista de smbolos y abreviaturas ....................................................................................... 1

    Introduccin ......................................................................................................................... 1

    1. Marco Referencial ......................................................................................................... 51.1 Fitoqumica y actividad biolgica de Physalis peruviana L. ............................... 5

    1.1.1 Estudios fitoqumicos de P. peruviana ..................................................... 71.1.2 Witanlidos ............................................................................................. 101.1.3 Actividad biolgica de P. peruviana ....................................................... 121.1.4 Ensayos clnicos ..................................................................................... 121.1.5 Toxicidad ................................................................................................ 13

    1.2 Diabetes mellitus ............................................................................................... 141.2.1 Tratamiento .................................................................................................. 161.2.1 Modelos para evaluar actividad antidiabtica /hipoglicemiante de productos naturales ............................................................................................... 20

    1.3 Marcadores qumicos de una droga o producto vegetal .................................. 221.3.1 Definicin ................................................................................................ 221.3.2 Clasificacin ............................................................................................ 231.3.3 Criterios de seleccin: ............................................................................ 26

    2. Parte experimental ..................................................................................................... 292.1 Obtencin de marcadores ................................................................................. 29

    2.1.1 Adquisicin y adecuacin del material vegetal ...................................... 322.1.2 Obtencin de extractos .......................................................................... 322.1.3 Fraccionamiento y purificacin del extracto EEt .................................... 332.1.4 Fraccionamiento y purificacin del extracto ED-MV .............................. 392.1.5 Fraccionamiento y purificacin del extracto EJF ................................... 40

    2.2 Ensayos de actividad hipoglicemiante .............................................................. 412.2.1 Protocolo experimental ........................................................................... 412.2.2 Anlisis estadstico ................................................................................. 43

  • 2 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    3. Resultados y discusin ............................................................................................. 45

    3.1 Obtencin de marcadores ................................................................................. 453.1.1 Material vegetal ...................................................................................... 453.1.2 Obtencin de extractos .......................................................................... 463.1.3 Fraccionamiento y purificacin del extracto EEt .................................... 473.1.4 Fraccionamiento y purificacin del extracto ED-MV .............................. 493.1.5 Fraccionamiento y purificacin del extracto EJF ................................... 503.1.6 Anlisis de los procedimientos ensayados para obtener los marcadores52

    3.2 Determinacin estructural de los compuestos identificados y/o purificados .... 553.2.1 Identificacin por GC-MS de compuestos presentes en F4CM ............ 553.2.2 Identificacin de fitoesteroles en MST ................................................... 583.2.3 Determinacin estructural de F2 ............................................................ 613.2.4 Determinacin estructural de F4-PREP ................................................. 703.2.5 Determinacin estructural de Fw ........................................................... 75

    3.3 Actividad hipoglicemiante .................................................................................. 803.3.1 Efecto hipoglicemiante de extractos y fracciones primarias de P. peruviana ............................................................................................................... 813.3.2 Efecto hipoglicemiante de fracciones obtenidas a partir de FD ............ 843.3.3 Efecto hipoglicemiante de fracciones primarias obtenidas del EE por metodologas diferentes. ....................................................................................... 863.3.4 Efecto hipoglicemiante de fracciones purificadas .................................. 883.3.5 Compuestos propuestos como marcadores qumicos para los frutos de P. peruviana .......................................................................................................... 91

    4. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................... 934.1 Conclusiones ..................................................................................................... 934.2 Recomendaciones ............................................................................................. 94

    A. Anexo: Cromatograma por HPLC preparativa de la fraccin F5-5RP .................. 95

    B. Anexo: Reporte de la base de datos para DCM-ED-MV ......................................... 97

    C. Anexo: Reporte de la base de datos para F4CM .................................................... 99

    D. Anexo: Espectro IR de F2 ........................................................................................ 101

    E. Anexo: Espectro IR de F4-PREP ............................................................................. 103

    F. Anexo: Espectro de masas ESI modo positivo de F4-PREP............................... 105

    G. Anexo: Espectro de masas ESI en modo ionizacin positiva de FW. ............... 107

    Bibliografa ....................................................................................................................... 109

  • Contenido 1

    Lista de figuras Pg.

    Figura 1-1: Algunos compuestos aislados de P. peruviana ................................................ 8Figura 2-1: Obtencin de extractos ................................................................................... 33Figura 2-2: Fraccionamiento de EEt Procedimiento A ...................................................... 34Figura 2-3: Fraccionamiento de EEt mediante el procedimiento B .................................. 36Figura 2-4: Purificacin de la fraccin DCM-B .................................................................. 37Figura 2-5: Fraccionamiento de EEt mediante el procedimiento C .................................. 38Figura 2-6: Fraccionamiento de EEt mediante el procedimiento D .................................. 38Figura 2-7: Fraccionamiento de ED-MV ............................................................................ 39Figura 2-8: Fraccionamiento y purificacin del extracto EJF ............................................ 40Figura 3-1: Frutos de P. peruviana, seleccionados para el estudio fitoqumico ............... 45Figura 3-2: Perfiles HPLC de los extractos EEt y ED-MV ................................................ 46Figura 3-3: Perfil HPLC del extracto EJF .......................................................................... 47Figura 3-4: Perfil cromatogrfico por HPLC EEt, FD y AE-FD. ........................................ 48Figura 3-5: Perfil cromatogrfico por HPLC-b de EEt, DCM-B y F2, procedimiento B .... 49Figura 3-6: Perfil cromatogrfico por HPLC-a de F2. ....................................................... 49Figura 3-7: Perfil cromatogrfico por HPLC de ED-MV y su fraccin DCM-ED-MV. ....... 50Figura 3-8: Perfil HPLC-a de la fraccin FDF ................................................................... 51Figura 3-9: CCD de la fraccin FDF .................................................................................. 51Figura 3-10: Perfil HPLC-b de la fraccin FDF ................................................................. 52Figura 3-11: Cromatograma obtenido por GC-MS para la fraccin DCM-ED-MV ........... 56Figura 3-12: Cromatograma obtenido por GC-MS para F4CM ........................................ 57Figura 3-13: Estructura qumica de biciclo[10.1.0]tridec-1-eno, compuesto mayoritario de F4CM y DCM-ED-MV ......................................................................................................... 58Figura 3-14: Espectro RMN 1H de MST (CDCl3, 400 MHz) ............................................ 59Figura 3-15: Cromatograma de gases obtenido para MST .............................................. 59Figura 3-16: Espectro RMN 1H DE F2 (CDCl3, 400 MHz) ................................................ 61Figura 3-17: Espectro 13C y DEPT 135 de F2 (CDCl3, 100 MHz). .................................. 62Figura 3-18: Espectro HMQC de F2 (CDCl3, 400 MHz). .................................................. 63Figura 3-19: Espectro COSY de F2 (CDCl3, 400 MHz). .................................................. 64Figura 3-20: Cromatograma de F2 obtenido por GC-MS ................................................. 65Figura 3-21: Espectro de masas obtenido para F2 vs sugerido por la base de datos*. .. 65Figura 3-22: Estructura qumica de F2 (5-(hidroximetil)-2-Furancarboxaldehido) ........... 66Figura 3-23: Espectro HMBC de F2 (CDCl3, 400 MHz) .................................................... 66Figura 3-24: Esquema de reaccin propuesto para la formacin de 5-HMF ................... 69

  • 2 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    Figura 3-25: Espectro RMN 1H de F4-PREP (CDCl3, 400 MHz). ..................................... 70Figura 3-26: Espectros RMN DEPT135 y 13C de F4-PREP (CDCl3, 100 MHz). ............. 71Figura 3-27: Espectro COSY de F4-PREP (CDCl3, 400 MHz). ........................................ 72Figura 3-28: Estructura molecular para F4-PREP (un ster de sacarosa)....................... 75Figura 3-29. Espectro RMN 1H de Fw (CD3OD, 400 MHz). ............................................. 76Figura 3-30: Espectro RMN 13C, DEPT 90 y 135 de Fw (CD3OD, 100 MHz). ................ 77Figura 3-31: Espectro HMQC de Fw (4bHWE); (CDCl3, 400 MHz). ................................. 78Figura 3-32: Estructura molecular de 4-hidroxiwitanlido E ........................................... 80Figura 3-33: Efecto de los extractos y fracciones primarias de los frutos de P. peruviana sobre la hiperglicemia inducida por almidn en ratas normoglicmicas. .......................... 82Figura 3-34: Efecto de algunas fracciones obtenidas a partir de FD sobre la hiperglicemia inducida por almidn en ratas normoglicmicas ................................................................ 85Figura 3-35: Efecto de algunas fracciones obtenidas por diferentes metodologas sobre la hiperglicemia inducida por almidn en ratones normoglicmicos. ................................ 87Figura 3-36: Efecto de algunos metabolitos aislados de los frutos de P. peruviana sobre la hiperglicemia inducida por almidn en ratones normoglicmicos. ................................ 89Figura 3-37: Efecto de Fw (4bHWE) aislado de los frutos de P. peruviana sobre la hiperglicemia inducida por almidn en ratones normoglicmicos. .................................... 90

  • Lista de tablas Pg.

    Tabla 1-1: Nombres comunes de Physalis peruviana L. ..................................................... 5Tabla 1-2: Usos teraputicos de Physalis peruviana en medicina tradicional .................... 6Tabla 1-3: Compuestos qumicos aislados de P. peruviana entre 1930 y 1990. ............... 7Tabla 1-4: Compuestos identificados en P. peruviana entre 1991 y 2010 ......................... 8Tabla 1-5: Esqueletos bsicos de witaesteroides ............................................................. 11Tabla 1-6: Actividades biolgicas reportadas para cada rgano de P. peruviana ........... 13Tabla 1-7: Criterios de diagnstico de alteracin de la glucosa plasmtica ..................... 15Tabla 1-8: Uso de hipoglicemiantes o antidiabticos orales ............................................. 18Tabla 1-9: Principales familias de plantas que poseen actividad hipoglicemiante ........... 19Tabla 1-10: Marcadores qumicos, Intereses y desventajas ............................................. 25Tabla 3-1: Compuestos identificados por GC-MS a partir de la fraccin DCM-ED-MV y su fraccin F4CM ..................................................................................................................... 57Tabla 3-2: Esteroles identificados a partir de MST ........................................................... 60Tabla 3-3: Datos de RMN para F2 y 5-hidroximetil-2-furfural (5-HMF) ............................ 67Tabla 3-4: Contenido de 5-HMF de algunos productos alimenticios ................................ 68Tabla 3-5. Datos de RMN 1H y 13C para F4-PREP y Glucsido 1 .................................... 73Tabla 3-6. Datos de RMN para el compuesto Fw (4-hidroxiwitanlido E) ...................... 79Tabla 3-7: Efecto de los extractos y fracciones primarias de los frutos de P. peruviana sobre la hiperglicemia inducida por almidn en ratas normoglicmicas. .......................... 82Tabla 3-8: Efecto de fracciones obtenidas a partir de FD sobre la hiperglicemia inducida por almidn en ratas normoglicmicas............................................................................... 84Tabla 3-9: Efecto de algunas fracciones obtenidas por diferentes metodologas a partir de frutos de P. peruviana sobre la hiperglicemia inducida por almidn en ratones normoglicmicos. ................................................................................................................ 87Tabla 3-10: Efecto de algunos metabolitos obtenidos a partir de frutos de P. peruviana sobre la hiperglicemia inducida por almidn en ratones normoglicmicos. ...................... 88Tabla 3-11: Efecto de Fw (4bHWE) sobre la hiperglicemia inducida por almidn en ratones normoglicmicos. ................................................................................................... 90

  • Lista de Smbolos y abreviaturas !Abreviatura Trmino 5-HMF 5-hidroximetil-2-furfural (5-hidroximetil-2-furancarboxaldehdo) AcOEt Acetato de etilo AcOEt-C Fraccin acetato de etilo obtenida por el procedimiento C AE-FD Fraccin acetato de etilo obtenida desde FD AS Aceite sobrenadante obtenido desde el extracto EE ATP Adenosin trifosfato CC Cromatografa en columna CCD Cromatografa en capa delgada CD3OD Metanol deuterado CDCl3 Cloroformo deuterado COSY Espectroscopa de correlacin homonuclear (Correlation Spectroscopy) D.E. Desviacin estndar DCM-AS Fraccin diclorometnica obtenida desde AS por el procedimiento A DCM-B Fraccin diclorometnica obtenida por el procedimiento B DCM-ED-MV Fraccin diclorometnica obtenida desde ED-MV por el procedimiento E DCM-FD Fraccin diclorometnica obtenida desde FD

    DEPT Mejoramiento sin distorsin por transferencia de polarizacin (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) ECA Enzima convertidora de angiotensina I ED-M II Fraccin diclorometnica obtenida por la metodologa II ED-MV Extracto diclorometnico obtenido directamente del material pulverizado EE Extracto etanlico EP-FD Fraccin ter de petrleo obtenida desde FD ESI Ionizacin por electrospray EtOH Etanol F. acuosa Fraccin acuosa obtenida desde EE Metodologa I F2 Fraccin purificada desde la DCM-B, identificada como un carboxaldehdoF4CM Fraccin mayoritaria obtenida de ED-MV F4-PREP Fraccin purificada desde AE-FD, identificada como un ster de sacarosa FD Fraccin diclorometnica obtenida a partir de EE FW Fraccin purificada desde la ED-M II, identificada como un witanlido GC-MS Cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas HEX D Fraccin hexnica obtenida por el procedimiento D HPLCUV high-performance liquid chromatography-ultraviolet detection HPLC-ELSD high-performance liquid chromatography-evaporative light scattering

    detection

  • 2 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    Abreviatura Trmino GC-FID gas chromatography-flame ionization detection HPLC-MS Cromatografa lquida de alta eficiencia acoplada a espectrometra de

    masa (high-performance liquid chromatography mass spectrometry)

    HMBC Espectroscopa de correlacin heteronuclear a varios enlaces (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

    HMQC Espectroscopa de correlacin heteronuclear directa (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) HPLC Cromatografa lquida de alta eficiencia Hz Hertz IMC ndice de masa corporal IR Infrarrojo J Constante de acoplamiento Me-FD Fraccin metanlica obtenida desde FD MeOH Metanol

    MST Fraccin purificada desde la fraccin AE-FD, identificada como una mezcla de fitoesteroles NGS Niveles de glucosa en sangre OMS Organizacin mundial de la salud RMN Resonancia magntica nuclear SO Sobrecarga oral SOA Sobrecarga oral de almidn STZ Estreptozotocina tR Tiempo de retencin UV Ultravioleta Desplazamiento qumico

  • Introduccin La Diabetes mellitus se sita entre las diez principales causas de muerte en los pases occidentales, y a pesar de los avances en su control clnico, an no se ha logrado controlar sus consecuencias letales (Negri, 2005). De acuerdo con la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) se estima la prevalencia de la diabetes, para todos los grupos de edad en todo el mundo, en 2,8% en 2000 y 4,4% en 2030; es decir, el nmero total de personas con diabetes se incrementar de 171 millones en 2000 a 366 millones en 2030 (Wild et al., 2004). En Colombia, la Asociacin Colombiana de Diabetes ha estimado que el 7% de la poblacin colombiana mayor de 30 aos tiene Diabetes tipo 2 y alrededor de un 30 a 40% de los afectados desconocen su enfermedad. En Colombia, la diabetes es la tercera causa de muerte en las mujeres de 45 a 64 aos y la quinta en los hombres del mismo grupo de edad. Esta enfermedad por su naturaleza crnica, la severidad de las complicaciones y los medios que se requieren para su control se constituye en el momento en una enfermedad altamente costosa (Martnez, et al.; 2007).

    La Diabetes es una enfermedad crnica que se caracteriza por la presencia excesiva de glucosa en la sangre, debido a que el cuerpo no produce insulina o no la utiliza adecuadamente. Un 90% de los 171 millones de diabticos del mundo, segn las estimaciones, sufre diabetes tipo 2. Las personas con diabetes tipo 2 controlan el nivel de glucosa en la sangre siguiendo un plan de alimentacin saludable, un programa de ejercicios, bajando de peso y tomando medicacin oral (medicamentos hipoglicmicos) (OMS, 2008).

    Los frmacos utilizados como hipoglicemiantes orales controlan los valores de glicemia, pero pueden presentar efectos secundarios, como hipoglicemia, intoxicacin por cido lctico, malestar gastrointestinal o aumento de peso. Adems muchos pacientes necesitan tomar dos o tres medicamentos para alcanzar valores aceptables de glicemia, lo que conlleva un alto costo econmico y una mayor probabilidad de interacciones con otros tratamientos. Una alternativa para pacientes con diabetes tipo 2, es complementar su tratamiento hipoglicemiante con productos de origen vegetal; incluso sustituyendo totalmente la medicacin empleado fitoterapia, siempre y cuando la glicemia se encuentre estabilizada, se mantengan unos hbitos higinico-dietticos adecuados y el mdico considere oportuna esta terapia. (Castillo y Sols, 2007).

    En este sentido, ms de 1200 especies vegetales han sido descritas con propiedad antidiabtica; estas representan ms de 725 gneros en 183 familias. Las familias que abarcan un mayor nmero de stas especies son Fabaceae, Asteraceae, Lamiaceae, Liliaceae, Poaceae y Euphorbiaceae (Negri, 2005). Entre las especies que se utilizan en

  • 2 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    medicina tradicional como antidiabticos slo cerca del 50% han sido estudiadas experimentalmente. En este sentido, la OMS promueve este tipo de estudios buscando contribuir al desarrollo de un tratamiento econmico y efectivo de la diabetes (Castillo y Sols, 2007).

    Physalis peruviana (Solanaceae), es una de las diversas especies que son usadas popularmente por pacientes diabticos no insulino-dependientes; esta propiedad ha sido objeto de diversos estudios en el Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia (Bula y Cruz, 1993; Garca y Sa, 1997; Mora, 2008), en los cuales se ha comprobado la actividad hipoglicemiante de sus frutos.

    P. peruviana (uchuva) es una especie de alta y fcil produccin en Colombia; esto aunado a la actividad hipoglicemiante reportada, permite proponerla como una alternativa promisoria como coadyuvante en el tratamiento de la diabetes tipo 2. El Grupo de investigacin en Tecnologa de Productos Naturales (TECPRONA), del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia con base en el potencial reportado para los frutos de P. peruviana, tiene inters en la generacin de un producto fitoteraputico a base de esta especie. Para lo cual se requiere la estandarizacin de un extracto o fraccin enriquecida de compuestos que contribuyan con la actividad; as como la seleccin de marcadores analticos o teraputicos de dicho extracto o fraccin.

    La utilizacin de frutos de Physalis peruviana (uchuva), como materia prima para la industria de productos fitoteraputicos constituye una alternativa de aprovechamiento de la fraccin de los excedentes de exportacin que cumplan con las caractersticas de calidad para la elaboracin de extractos y productos fitoteraputicos; adems el suministro de la planta se encuentra garantizado por la disponibilidad y facilidad de cultivos en Colombia. De esta manera, se genera un valor agregado a la uchuva dentro de su cadena productiva (frutales y su industria).

    El presente trabajo tuvo como objetivo, proponer un mtodo para la obtencin de metabolitos secundarios potencialmente tiles como marcadores de un extracto con actividad hipoglicemiante de frutos de P. peruviana; para lo cual se realiz una serie de fraccionamientos al extracto etanlico, dirigidos a obtener compuestos que conservaran la actividad. Con este fin se evalu la actividad hipoglicemiante a extractos, fracciones y algunos metabolitos identificados.

    Inicialmente el fraccionamiento fue dirigido hacia la bsqueda de compuestos tipo witaesteroides, teniendo en cuenta los reportes encontrados sobre su presencia en P. peruviana. Sin embargo, en estudios realizados a ejemplares colombianos de los frutos de esta especie, no haban sido aislados an este tipo compuestos. Bajo esta premisa, nuestra intencin fue obtener algn compuesto de este tipo para comprobar la existencia de dichos compuestos especficamente en los frutos colombianos y verificar el grado de participacin de stos en la actividad hipoglicemiante del extracto. De esta manera los

  • Introduccin 3

    principales candidatos para ser marcadores del extracto con actividad hipoglicemiante eran compuestos tipo witaesteroides.

    De acuerdo con los reportes encontrados en la literatura, este tipo de compuestos son encontrados en fracciones obtenidas con solventes de polaridad media como diclorometano o acetato de etilo; motivo por el cual, las metodologas planteadas en este estudio se enfocaron en fracciones diclorometnicas y de acetato de etilo. Sin embargo, la obtencin del nico witanlido encontrado en este estudio no fue fcil; pues fue necesario modificar los procedimientos de extraccin en varias ocasiones para lograr visualizarlo.

    Los procesos de fraccionamiento dirigidos al reconocimiento de compuestos mayoritarios, condujeron a la obtencin de fitoesteroles, de dos compuestos tiles como marcadores teraputicos (uno de ellos un witanlido) y otro compuesto (un ster de sacarosa) que aunque no est relacionado con la actividad, s es til como marcador analtico, por su exclusividad hasta el momento en esta especie. Estos compuestos fueron obtenidos por medio de tcnicas convencionales que conllevan a la inversin de gran cantidad de tiempo y solventes; por lo que la utilizacin de equipos como HPLC preparativo, podra ser de gran ayuda para evitar estos inconvenientes. Las metodologas generadas en este estudio, establecen las bases para proponer metodologas optimizadas que permitan disponer de cantidades suficientes de los marcadores propuestos, para los ensayos de preformulacin, formulacin y control de calidad del extracto.

    En general, en este documento se presentan las metodologas utilizadas para la obtencin de los compuestos aislados y propuestos como marcadores; dando especial importancia a la metodologa utilizada para la obtencin del witanlido, el cual fue aislado bajo condiciones especficas de procesamiento del fruto. As mismo, se muestra la manera en que fueron identificados los compuestos aislados y los resultados obtenidos a partir de la evaluacin de actividad hipoglicemiante de extractos, fracciones y algunos metabolitos.

    El presente trabajo tuvo como fin, alcanzar los siguientes objetivos:

    Objetivo general

    Establecer un mtodo para la obtencin de metabolitos secundarios potencialmente tiles como marcadores de extractos de frutos de Physalis peruviana L. con actividad hipoglicemiante.

    Objetivos especficos

    Establecer una metodologa para obtener fracciones enriquecidas con actividad

    hipoglicemiante, a partir de frutos de uchuva.

  • 4 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    Aislar, purificar e identificar metabolitos potencialmente tiles como marcadores;

    desde fracciones enriquecidas con actividad hipoglicemiante de los frutos de P.

    peruviana.

    Evaluar la actividad hipoglicemiante de fracciones enriquecidas y/o compuestos

    obtenidos a partir de frutos de P. peruviana.

    Proponer compuestos o grupos de metabolitos secundarios como marcadores

    analticos o teraputicos de un extracto y/o producto fitoteraputico de P.

    peruviana.

  • 1. Marco Referencial

    1.1 Fitoqumica y actividad biolgica de Physalis peruviana L.

    Aunque no es clara la procedencia de Physalis peruviana L., existen indicios de que es originaria del Per y fue aclimatada en los altiplanos de Brasil y Chile (Flrez et al., 2000; Fisher et al., 2005). Fue introducida por los espaoles en Sudfrica hace ms de 200 aos como fruto antiescorbuto. Desde Sudfrica ha sido distribuida a Kenia, Zimbabue, Australia, Nueva Zelanda, Hawai y la India. Crece como una planta silvestre y semisilvestre en las zonas tropicales altas entre los 1.500 y 3.000 m.s.n.m. (Flrez et al., 2000). En Colombia esta especie se cultiva en los Departamentos de Antioquia, Boyac, Cesar, Cundinamarca, Huila, Magdalena, Nario, Putumayo, Quindo y Tolima, a altitudes desde 1300 a 3700 msnm, mientras que en Nueva Zelanda crece al nivel del mar (Fisher et al., 2005).

    La especie Physalis peruviana L. pertenece a la familia Solanaceae y al gnero Physalis, el cual incluye ms de 120 especies en el sur y norte de Amrica (Ahmad et al., 1999a); (Lan et al., 2009). Esta especie se conoce con diversos nombres comunes segn el pas (Bernal y Correa, 1998), como se muestra en la Tabla 1-1.

    Tabla 1-1: Nombres comunes de Physalis peruviana L.

    Pas Nombres comunes Bolivia Awei llamantu, Capuli, Motojobobo embolsado, Ruru chinchi chinchi Chile Bolsa de amor, Capul Colombia Uchuva, Uchuba, Uchubo, Alquenque, Buchuvba, Capul,

    Guachuvo vejign, Guchuba, Guchero, Tomate, Vejign Peru Aguaymanto, Capul, Tomate de bolsa Venezuela Cuchuva, Huevo de sapo, Topotopo y Topo-topo Ecuador Uvilla En ingls Golden berry o Cape gooseberry

    Adaptado de Bernal y Correa (1998)

  • 6 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    El producto comercial de P. peruviana es el fruto, una baya jugosa en forma de globo, con un dimetro que oscila entre 1,25 y 2,5 centmetros y pesa entre 4 y 10 gramos, que est cubierto por un cliz formado por cinco spalos que lo protege contra insectos, pjaros, patgenos y condiciones climticas extremas (Flrez et al., 2000; Trinchero et al., 1999; Mayorga et al., 2001). En la actualidad, Colombia es el mayor productor de uchuva del mundo, seguido por Sudfrica (Flrez et al., 2000; Fisher et al., 2005; Mayorga et al., 2001; Cedeo y Montenegro, 2004).

    Segn el DANE (clculos CCI), las exportaciones de uchuva representaron en 2003 el 48% del total de las frutas exportadas (excluyendo banano), lo cual la posiciona como el primer producto promisorio de exportacin (Fisher et al., 2005; Salazar et al., 2008).

    Los frutos de P. peruviana tienen un alto valor nutricional, por lo que son consumidos en fresco y se emplean para preparar ensaladas, cocteles, helados, mermeladas y otros alimentos (Fisher et al., 2005; Trinchero et al., 1999). En Colombia adems es utilizado popularmente en el tratamiento de pterigios, para fortificar el nervio ptico y limpiar cataratas, purificar la sangre, disminuir problemas de garganta, para el tratamiento de diabetes, como diurtico, expectorante, para fortalecer dientes y evitar su cada, como amebicida, expectorante, antisptico y cicatrizante (Bernal y Correa, 1998); adems se utiliza en el tratamiento de cncer, leucemia, hepatitis y reumatismo (Wu et al., 2009). En la Tabla 1-2 se presentan algunos usos teraputicos de P. peruviana en la medicina tradicional (Garca y Lozano, 2002).

    Tabla 1-2: Usos teraputicos de Physalis peruviana en medicina tradicional

    PPaarrttee ddee llaa

    PPllaannttaa

    UUssoo ttrraaddiicciioonnaall FFoorrmmaass ddee aaddmmiinniissttrraacciinn

    Fruto

    Contra los pterigios y la conjuntivitis Zumo de la fruta, dos gotas dos veces al da Expectorante Infusin

    Tratamiento de albuminuria Frutos exprimidos mezclados con agua Para fortificar los dientes y evitar su cada Contra la diabetes Consumo diario del fruto crudo

    Flor Tratamiento de la tos rebelde Infusin: tres tomas al da

    Hojas

    Antisptico y cicatrizante de heridas Pulverizadas mezcladas con cenizas de lea Diurtico, antiespasmdico, antiasmtico, tratamiento de la litiasis renal, gota, tuberculosis y depresin nerviosa

    Infusin

    Hojas y tallos

    Sobre contusiones, torceduras y dislocaciones seas

    Frescos o secos en forma de pomadas o como cataplasma

    Planta entera Diurtico, antilitisico, antipirtico Maceracin en alcohol

    Adaptado de Garca y Lozano (2002)

  • Marco Referencial 7

    1.1.1 Estudios fitoqumicos de P. peruviana Bernal y Correa (1998), proporcionan una valiosa informacin acerca de los constituyentes qumicos encontrados en Physalis peruviana desde 1930 hasta 1990; en donde se destacan principalmente compuestos del tipo witaesteroide, como se evidencia en la Tabla 1-3.

    Tabla 1-3: Compuestos qumicos aislados de P. peruviana entre 1930 y 1990.

    Parte analizada

    Tipo de compuesto Compuestos aislados

    Hojas Witaesteroides, terpenos

    Fisalina A 2,3-dihidrowitanlido E 4-hidroxiwitanlido E

    Witanlido E Fisalolactona Witanlido S Perulactona

    5,6-epoxi-1,14,17,20-tetrahidroxi-24-enlido

    Fisalolactona B, perulactona B, witaperuvina D 3-O--D-glucopiransido de fisalolactona B

    24-metilenocolesterol Sitosterol.

    Fruto carotenos

    cido 16-hidroxioxohexadecanico Carotenoides

    Raz

    Alcaloides

    Higrina

    Witaesteroides

    Witaperuvina F Witaperuvina G

    Fisalinas Witaperuvina

    Cultivo de tejidos Terpenos

    Acetato de isofucosterilo

    Cicloartenol Isofucosterol

    Adaptado de Bernal y Correa (1998). En la Tabla 1-4 se exponen los estudios fitoqumicos realizados a P. peruviana entre 1991 y 2010 para cada rgano de P. peruviana. Los compuestos aislados en los ltimos aos, comprenden principalmente compuestos tipo witaesteroide, alcaloides, glicsidos, flavonoides y vitaminas como , y -tocoferol, vitamina K1, -Caroteno y calisteginas (Figura 1-1).

  • 8 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    Figura 1-1: Algunos compuestos aislados de P. peruviana

    Tabla 1-4: Compuestos identificados en P. peruviana entre 1991 y 2010

    Caempferol (Arun y Asha, 2007)

    Fiperunlido A (Lan et al., 2009)

    4-hidroxiwitanlido E (Baumann y Meier, 1993)

    (1S,2S)-1-fenilpropano-1,2-diol 2-O--D-glucopiranosido (Mayorga et al., 2001)

    Calistegina B2 (Asano et al., 1997)

    Peruvianxido (Lan et al., 2009)

  • Marco Referencial 9

    Parte analizada

    Tipo de compuesto Compuestos identificados Referencia

    Partes areas, (hojas)

    Alcaloides

    3-acetoxitropano y dos ismeros N-metilpirrolidinilhigrina Kubwabo et al., 1993

    Witanlidos

    Fiperunolide A Fiperunolide B Fiperunlido C Fiperunlido D Peruvianoxide Fiperunlido E Fiperunlido F 1,10-seco witaperuvina C 4-hidroxiwitanlido E Visconolido Witanlido F Witafisanlido

    Lan et al., 2009; Fang et al., 2010; Baumann y Meier, 1993.

    Flavonoides No especificados Wu et al., 2006

    Clices Witanlidos 4-hidroxiwitanlido E 28-hidroxiwitanlido E Dinan et al., 1997; Sakurai et al. 1976

    Fruto

    Glucsidos

    1-O-trans-Cinamoil--D-glucopiranosil-(16)--D-glucopiranosa Latza et al., 1996

    1S,2S)-1-fenilpropano-1,2-diol 2-O--D-glucopiransido P-ment-4(8)-ene-1,2-diol 1-O--L-arabinopiranosil-(1-6)--D-glucopiransido 1-fenilpropane-1,2-diol y p-ment-4(8)-ene-1,2-diol

    Mayorga et al., 2001

    3-O--D-glucopiranosil-(16)--D-glucopiransido de etil3-hidroxioctanoato 3-O--L-arabinopiranosil-(16)--D-glucopiransido de butil (3R)-hidroxibutanoato 3-O--L-arabinopiranosil-(16)--D-glucopiransido de butil(3S)-hidroxibutanoato

    Mayorga et al., 2002

    Vitaminas

    , y -tocoferolVitamina k1 Vitamina C Vitamina A -caroteno cidos grasos

    Ramadan y Mrsel, 2003

    Witanlidos 4-hidroxiwitanlido E , witanlido E Yen et al., 2010; Baumann y Meier, 1993

    Alcaloides Calisteginas A3, B1, B2, y C1 Asano et al., 1997

    Raz

    Alcaloides Figrina Keith et al., 1992

    Witanlidos 4-hidroxiwitanlido E Velsquez, 2004; Castillo et al., 2006; Caldern, 2009

    Planta entera

    Witanlidos

    17-hidroxi-14,20-epoxi-1-oxo-[22R]-3 -[O--D-glucopiranosil]-wita-5,24-dienolido Ahmad et al., 1999a

    4-hidroxiwitanlido E Caldern, 2009 (20R,22R)-5,6,14,20,27-pentahidroxi-1-oxowit-24-enolido, y (20S,22R)-5,6-epoxy-4,14,15-trihidroxi-1-oxowit-2,24-dienolido

    Ahmad et al., 1999b

    Flavonoides Quercetina y campferol Arun y Asha, 2007 Alcaloides (+)-Fisoperuvina Zaed et al., 2009

  • 10 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    1.1.2 Witanlidos Los compuestos tipo witaesteroides son los ms reportados para la especie Physalis peruviana (Tabla 1-4). De acuerdo con Eich (2008), los witaesteroides junto con capsaicinoides y saponinas esteroidales, representan metabolitos secundarios especficos de algunos taxones de solanceas. Sin embargo, los witaesteroides se constituyen en los metabolitos ms abundantes y reconocidos en la familia Solanacea, siendo Physalis el gnero que contiene mayor cantidad de witanlidos y compuestos relacionados, aunque stos tambin se presentan con gran frecuencia en el gnero Withania. Considerando el nivel de oxidacin biogentica, el gnero Physalis es el ms evolucionado de la familia Solanaceae, contando con la presencia de metabolitos polioxigenados como los witaesteroides, que presentan funciones lactona, epxido y enona (Tomassini et al., 2000).

    Se denominaron originalmente witanlidos a un conjunto de esteroides naturales de veintiocho tomos de carbono, los cuales contienen el esqueleto base del ergostano, y en el cual los carbonos 22 y 26 se encuentran oxidados formando una -lactona (San Feliciano et al., 2008). El primer witanlido descubierto fue witaferina; aislado de las hojas de Whitania somnifera (L.) Dun. (Solanaceae) por Yarden y Lavie (1962). Este metabolito represent un nuevo tipo de esteroides caracterizados por una lactona --insaturada y hasta la fecha se han descubierto alrededor de 400 witanlidos o congneres en 58 especies de solanceas, pertenecientes a 22 gneros (Eich, 2008).

    Los witanlidos pertenecen al grupo de los witaesteroides, compuestos derivados del ergostano que se encuentran polioxigenados y estn presentes principalmente en la familia Solanaceae; no obstante, tambin se han encontrado en algunas plantas de las familias Leguminoseae y Taccacedae. Los witaesteroides se clasifican en 8 grupos de acuerdo a la estructura formada por su funcin lactnica en C-26 (Tomassini et al., 2000). En la Tabla 1-5 se presentan los esqueletos bsicos de cada tipo.

    Por sus caractersticas estructurales, la mayora de estos compuestos suelen aislarse de los extractos obtenidos con disolventes de polaridad media, como cloroformo y ter etlico o con disolventes ms polares, como metanol y etanol. Tambin se han aislado witanlidos poco polares de extractos realizados con hexano. Por otra parte, ocasionalmente estos compuestos se presentan como glicsidos o como sulfatos.

    Dentro de las actividades biolgicas reportadas para los witaesteroides se encuentran antiinflamatoria, inmunomoduladora, antitumoral, tripanosomicida, entre otras (Tomassini et al., 2000).

  • Marco Referencial 11

    Tabla 1-5: Esqueletos bsicos de witaesteroides

    Tipo de witaesteroide

    Esqueleto bsico Descripcin

    Witanlido

    Son los ms abundantes Se conocen como precursores de witafisalinas y acnistinas; se subdividen en dos clases principales de acuerdo con la orientacin ( o ) de la cadena lateral ubicada sobre el C-17: del tipo se encuentran reportados 36, mientras que entre los witanlidos se han reportado alrededor de 132 sustancias

    Fisalina

    Son molculas de estructuras bastante complejas, ya que adems de presentar la lactona tpica de witaesteroides, tienen una -lactona fusionada al anillo D. Son derivados esteroidales del tipo 13,14-seco-16,24 ciclo ergostano con, carbonilo en C-15

    Witafisalina

    Tienen el esqueleto ergostano-carboxlico de los witanlidos intacto, pero se aproximan a las fisalinas por presentar la lactona de 5 miembros ligada al anillo D

    Acnistina Tienen una cadena lateral bicclica insertada en C-17.

    Ixocarpalactona

    Presentan un anillo -lactnico saturado con orientacin tipo ; por alteraciones debidas a un grupo hidroxilo en C-22.

    Adaptada de Tomassini et al. (2000)

  • 12 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    Tabla 1-5: (Continuacin)

    Tipo de witaesteroide

    Esqueleto bsico Descripcin

    Perulactona Estn relacionados con witaesteroides cuyo C-28 es oxidado a alcohol primario.

    Adaptada de Tomassini et al. (2000)

    1.1.3 Actividad biolgica de P. peruviana Entre las actividades reportadas para P. peruviana se encuentran principalmente actividad antiinflamatoria, antioxidante, antidiabtica/hipoglicemiante y anticncer/citotxica. Esta ltima asociada directamente a witanlidos, compuestos muy comunes en esta planta. En la Tabla 1-6 se resumen las actividades reportadas para los diferentes rganos de P. peruviana.

    1.1.4 Ensayos clnicos En un estudio de tipo experimental prospectivo, con diseo de prueba cruzada (2 x 2), desarrollado en el ao 2007 en el Laboratorio de Anlisis Clnicos y Microbiolgicos KRISMARC de Per, se encontr que la ingesta de Physalis peruviana (aguaymanto) reduce en adultos jvenes la glicemia postprandial, a los 90 y 120 minutos. El estudio se llev a cabo con 26 personas voluntarias (edad promedio 25.03 2.74 aos, IMC promedio 22.76 1.48 kg/m2), quienes fueron divididos aleatoriamente en dos grupos: el grupo I ingiri 25 g de frutos de P. peruviana y luego de 40 minutos se le administr una sobrecarga de glucosa, mientras que al grupo II slo se le administr esta ltima. Las muestras de sangre fueron tomadas a los 30, 60, 90 y 120 minutos. Luego de 3 das se intercambiaron los tratamientos. Se encontr en el grupo control un promedio de glicemia basal de 89.2 7.75 mg/dl, a los 30 minutos postprandial 130.6 14.92 mg/dl, a los 60 minutos 116.2 16.57 mg/dl, a los 90 minutos 106.3 13.65 mg/dl y a los 120 minutos 93.1 10.55 mg/dl. En el grupo problema se obtuvieron glicemias de 85.9 10.99 mg/dl, 123.6 13.65 mg/dl, 109.1 13.69 mg/dl, 96.8 12.12 mg/dl y 86.3 13.22 mg/dl respectivamente. A los 90 minutos postprandial hubo una diferencia muy significativa (p < 0.01) y a los 120 minutos, una diferencia significativa (p < 0.05) entre los valores de glicemia de ambos grupos (Rodrguez y Rodrguez, 2007).

  • Marco Referencial 13

    Tabla 1-6: Actividades biolgicas reportadas para cada rgano de P. peruviana

    Parte de la planta Actividad reportada

    Extracto, fraccin o metabolito Referencia

    Planta entera

    Actividad antihepatoma

    Extracto etanlico

    Wu et al., 2004a.

    Induccin de apoptosis en clulas humanas, antitumoral

    Extracto etanlico

    Wu et al., 2004b; Wu et al., 2006; Zavala et al., 2006.

    Actividad antioxidante

    Extracto etanlico

    Wu et al., 2005; Wu et al., 2006.

    Hojas Actividad antiinflamatoria y antioxidante

    Extracto etanlico Wu et al., 2006.

    Actividad antihepatotxica Apoptosis en clulas cancergenas

    Extracto acuoso Extracto denominado SCEPP-5.

    Arun y Asha, 2007. Wu et al., 2009.

    Partes areas

    Actividad citotxica contra clulas cancergenas (Pulmn, mama, hgado)

    Witanlidos

    Lan et al., 2009.

    Clices

    Actividad antiinflamatoria

    Fraccin denominada Pp-D28-LF

    Franco et al., 2007.

    Frutos

    Actividad antimicrobiana Hipoglicemiante, antioxidante

    Jugo de pulpa frutos Fruto entero, Extracto hidroalcohlico,

    Bernal y Correa, 1998. Rodrguez y Rodrguez, 2007; Bula y Cruz, 1993; Garca y Sa, 1997; Mora, 2008; Pinto et al., 2009; Ramadan y Mrsel, 2003; Rodrguez y Rodrguez, 2007

    Actividad antidiabtica Extracto Mora et al., 2008

    Leve actividad antiinflamatoria Jugo de los frutos Pardo et al., 2008.

    1.1.5 Toxicidad

    En un estudio realizado en el Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia a 29 especies de Angiospermas colombianas, entre ellas Physalis peruviana, se encontr que el extracto etanlico de P. peruviana present una alta letalidad frente a Artemia salina; una larva que ha sido til para la seleccin de especies vegetales como fuente de principios bioactivos, pues el estudio de la letalidad que producen los extractos sobre estas larvas es relacionada con otras actividades biolgicas como citotoxicidad. La concentracin letal 50 (CL50) que presentaron las partes areas de P. peruviana fue de 42 g/mL (Sanabria et al., 1997).

    En los frutos de una muestra de P. peruviana colectada en el Reino Unido se detect por cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (GC-MS) la presencia de Calisteginas A3, B1, B2, y C1; alcaloides polihidroxilados tipo nortropano. Estos

  • 14 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    alcaloides presentan potente actividad contra glicosidasas. La potente inhibicin in vitro de -glucosidasa y -galactosidasa de mamferos determinada en este estudio, plantea la posibilidad de toxicidad en seres humanos que consumen grandes cantidades de plantas que contienen estos compuestos (Asano et al., 1997).

    Arun y Asha en 2007 realizaron estudios de toxicidad aguda al extracto acuoso de las hojas de P. peruviana a dosis de 1250 mg/kg. Los animales (ratas) fueron observados a las 0.5, 2, 4, 8, 24 y 48 horas despus de la administracin, evaluando sntomas toxicolgicos o clnicos durante dos semanas. Al inicio y final del estudio, se monitore peso y temperatura corporal, estado de la materia fecal y suministro de comida y agua. De acuerdo con los resultados obtenidos, los animales tratados con el extracto acuoso (1250 mg/kg) no presentaron ningn signo txico microscpico o clnico significativo en los tiempos observados. La tasa de mortalidad fue cero, lo que confirma que la dosis letal 50 (DL50) fue mayor que 1250 mg/kg en ratas Wistar. Los parmetros bioqumicos sricos y hematolgicos de las ratas tratadas con el extracto no mostraron cambios significativos comparados con las ratas control.

    1.2 Diabetes mellitus La Diabetes mellitus es una enfermedad metablica caracterizada por hiperglicemia e intolerancia a la glucosa, ya sea debido a la deficiencia de insulina o deterioro de la eficacia de la accin de la insulina, o una combinacin de ambos. La OMS reconoce tres tipos de diabetes: la diabetes de tipo 1, que se caracteriza por la ausencia de sntesis de insulina; la diabetes de tipo 2, que tiene su origen en la incapacidad del cuerpo para utilizar eficazmente la insulina, generalmente como consecuencia del exceso de peso o la inactividad fsica, y la diabetes gestacional que corresponde a una hiperglicemia que se detecta por primera vez durante el embarazo (American Diabetes Association, 2010; OMS, 2008).

    En la diabetes tipo 1, en el momento del diagnstico se aprecia la virtual desaparicin de las clulas del pncreas encargadas de producir insulina debido a un proceso autoinmune (tipo 1 autoinmune) o si ste no es apreciado, tipo 1 idioptico. Aparece por lo general antes de los 30 aos, pero puede manifestarse a cualquier edad. Se caracteriza por insulinopenia, que determina el cuadro clnico y su tratamiento (Flrez, 1997). Sus sntomas, que pueden aparecer bruscamente, consisten en una produccin excesiva de orina (poliuria), sed (polidipsia), hambre constante, prdida de peso, alteraciones visuales y fatiga (OMS, 2008).

    La diabetes tipo 2 (DM2) es mucho ms frecuente y, en general, de aparicin ms tarda. Suele asociarse a la obesidad y previamente fue denominada diabetes no dependiente de insulina. El pncreas secreta cantidades muy variables de insulina, de forma que su concentracin plasmtica puede ser normal o incluso superior a la normal, pero relativamente insuficiente para mantener niveles normales de glicemia. Esto indica que

  • Marco Referencial 15

    en DM2 puede existir una resistencia a la accin de la insulina, es decir, una excesiva produccin heptica de glucosa y una deficiente utilizacin perifrica a pesar de la presencia de la insulina, por lo que se puede hablar de una deficiencia relativa en la secrecin pancretica de la hormona (Flrez, 1997; Gerich et al., 2001).

    La diabetes gestacional se manifiesta con mayor frecuencia en afroamericanos, hispanos/latinos estadounidenses e indios americanos. Tambin es ms comn en mujeres obesas y en mujeres con antecedentes familiares de diabetes. Durante el embarazo, la diabetes gestacional requiere de un tratamiento para normalizar los niveles de glucosa en la sangre de la madre, con el fin de evitar complicaciones en el beb. El 70% de las mujeres que tuvieron diabetes gestacional desarrollarn diabetes tipo 2 en algn momento de su vida. Luego del embarazo, entre el 5% y el 10% y entre un 20% y un 50% en los 5-10 aos siguientes. (American Diabetes Association, 2006).

    Existen otros tipos de diabetes que se producen debido a trastornos genticos especficos (como diabetes de adulto en la juventud), cirugas, medicamentos, desnutricin, infecciones y otras enfermedades. Esos tipos de diabetes representan entre el 1% y el 5% del total de los casos diagnosticados (American Diabetes Association, 2006 y 2010).

    Es posible diagnosticar diabetes, cuando existe una glucosa en plasma iguales o superiores a 200 mg/dl (11.1 mmol/l) durante una prueba oral de tolerancia a la glucosa (en ingls, OGTT o PG) y esto es confirmado con la prueba en ayunas (por ms de 8h) de glucosa plasmtica (FPG) con valores iguales o superiores a 126 mg/dl (7.0 mmol/l); realizando repeticiones de las pruebas. Otra forma es realizando pruebas de glucosa aleatorias en las que se observan valores de glucosa iguales o superiores a 200 mg/dl (11.1 mmol/l) y la existencia de sntomas de diabetes (Tabla 1-7) (American Diabetes Association, 2006 y 2010; Organizacin Mundial de la Salud, 1985).

    Tabla 1-7: Criterios de diagnstico de alteracin de la glucosa plasmtica

    Muestra Normoglicemia Tolerancia de glucosa Diabetes

    Glucosa plasmtica en ayunas (FPG)

  • 16 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    Cuando la diabetes no est bien controlada, el nivel de azcar en la sangre aumenta, fenmeno conocido como hiperglicemia. Un nivel alto de azcar en la sangre puede provocar problemas en muchas partes del cuerpo, especialmente en riones, corazn, vasos sanguneos, ojos, pies y nervios; adems puede provocar presin arterial alta y endurecimiento de las arterias (arteriosclerosis). Dichos factores pueden originar enfermedades cardiacas y vasculares (Fundacin Nacional del Rin, 2007a).

    1.2.1 Tratamiento La teraputica de la diabetes se centra en dos objetivos ntimamente relacionados: a) mejorar la utilizacin de la glucosa y otros nutrientes en los tejidos (aminocidos, glicerol, cidos grasos y cuerpos cetnicos) y b) normalizar al mximo posible los niveles de glicemia sin perturbar de manera notable el estilo de vida del paciente (Flrez, 1997).

    El tratamiento actual del enfermo diabtico exige un abordaje mltiple, el cual se basa en la dieta ajustada a las necesidades vitales de cada persona y en el empleo de insulina o de diversos frmacos orales que, por uno u otro mecanismo, consiguen reducir los niveles de glicemia (Flrez, 1997; Gerich et al., 2001).

    Insulina La insulina es un polipptido de 51 aminocidos (5,8 kD) sintetizado por las clulas del pncreas. Hasta hace pocos aos, la insulina utilizada clnicamente proceda de la extraccin de pncreas bovinos y porcinos. En la mayora de los pases actualmente se utiliza insulina humana (pureza del 100 %), obtenida por tecnologa recombinante a partir de ADN plasmdico inyectado en Escherichia coli (Flrez, 1997).

    La insulina es secretada por las clulas del pncreas; esta glndula pesa cerca de 200g, est situada abajo y detrs del estmago, produce adems, otras dos hormonas importantes en el organismo, la somatostatina (clulas ) y el glucagn (clulas ) entre las cuales existe una relacin, en parte de tipo paracrino (Negri, 2005; Flrez et al., 1997; Gerich et al., 2001). El glucagn estimula la secrecin de insulina y de somatostatina, mientras que la somatostatina inhibe la secrecin de insulina y glucagn. El flujo sanguneo circula en el islote desde las clulas hacia las y , de este modo la somatostatina ha de pasar por la circulacin general para poder llegar a las clulas y ; en cambio, la insulina puede desempear cierto papel paracrino y estimular la secrecin de glucagn y polipptido pancretico (clulas PP) (Flrez, 1997).

    El tratamiento con insulina suele ser usado en pacientes con diabetes tipo1, sin embargo, tambin se usa en pacientes con diabetes tipo 2 en los que las terapias tales como la modificacin de la dieta, ejercicio y antidiabticos orales no han logrado mantener el control glucmico. Algunos pacientes con diabetes tipo 2 requieren tratamiento con

  • Marco Referencial 17

    insulina en dosis de 0,4 a 0,6 U/kg por da, como en pacientes con diabetes tipo 1 (Gerich et al., 2001).

    Hipoglicemiantes orales Segn la Asociacin Latinoamericana de Diabetes (2006), el tratamiento con antidiabticos orales debe iniciarse en toda persona con diabetes tipo 2 que no haya logrado alcanzar las metas de control glicmico despus de un perodo de tres a seis meses con cambios teraputicos en el estilo de vida (CTEV). Para considerar que los CTEV han sido efectivos la persona debe haber logrado modificaciones en el rgimen alimentario, reduccin del 5 a 7% del peso corporal (si ste estaba excedido) e incremento de la actividad fsica programada. Si no se observa una reduccin gradual de las glicemias que permita predecir que la persona va a alcanzar la meta en el plazo de tres a seis meses, puede ser necesario adelantar el inicio del tratamiento farmacolgico.

    Sin embargo, tambin puede iniciarse el tratamiento con antidiabticos orales desde el momento del diagnstico cuando el grado de descontrol de la diabetes permite anticipar que los CTEV no van a bastar para reducir gradualmente las glicemias y alcanzar las metas de control glicmico al cabo de 3 a 6 meses. Este es el caso de las personas con glicemias en ayunas mayores de 240 mg/dL (13.3 mmol/L) y/o HbA1c mayor de 8.5%, en particular cuando han perdido peso asociado a sntomas de hiperglicemia (Asociacin Latinoamericana de Diabetes, 2006).

    Los agentes antidiabticos orales incluyen las sulfonilureas, meglitinidas y anlogos de la meglitinida, inhibidores de la -glucosidasa, y tiazolidinedionas; los cuales pueden ser utilizados como monoterapia o en combinacin para lograr el control glicmico (Gerich et al., 2001). En la Tabla 1-8 se encuentran los hipoglicemiantes ms utilizados, en la dosis requerida, de acuerdo con la dolencia que acompaa a la diabetes; as mismo las contraindicaciones y efectos secundarios causados por cada frmaco.

    Sulfonilureas

    Son derivados de las sulfamidas, en los cuales la estructura sulfonilurea constituye el grupo esencial de la actividad hipoglicemiante. Dentro de las ms comunes se encuentran gliburida, glipizida y glimepirida. Este tipo de antidiabticos actan estimulando la secrecin de insulina cuando se unen a receptores en las clulas beta- pancreticas. Para ello, las sulfonilureas actan con gran afinidad sobre receptores asociados a los canales de K+ sensibles a ATP; como consecuencia de esta accin, el canal se cierra y la despolarizacin causada facilita la secrecin de insulina (Flrez, 1997; Gerich et al., 2001).

    Meglitinidas y anlogos de meglitinida

    Las meglitinidas tales como repaglinida y anlogos de meglitinida como nateglinida, al igual que las sulfonilureas, estimulan la liberacin de insulina al cerrar los canales de potasio dependientes de ATP en las clulas del pncreas. Comparadas con las

  • 18 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    sulfonilureas, stas inician la accin con mayor rapidez, pero son de corta duracin (Gerich et al., 2001).

    Tabla 1-8: Uso de hipoglicemiantes o antidiabticos orales

    Grupo/Medicamento

    Dosis inicial (mxima) Indicacin Contraindicacin

    Efectos secundarios

    Biguanidas Metformina 500 mg [2,500 mg]

    Obesidad Dislipidemia Resistencia a la insulina

    Edad > 80 aos Insuficiencia cardaca Embarazo

    Acidosis Lctica Hipoxia Trastornos gas-trointestinales Anorexia

    Sulfonilureas Clorpropamida Glibenclamida Gliburida Microgliburida Glipizida Glimepirida

    5.0 mg/da [15 mg] 2.5 mg/da [20 mg] 1.5 mg/da [12 mg] 5.0 mg/da [40 mg] 5.0 mg /da [20 mg] 1.0 mg/da [8 mg]

    Deficiencia insulnica Glucosa en ayunas >250 mg/dl Glucosa postprandial >300 mg/dl

    Embarazo Enfermedad renal

    Hipoglicemias Aumento de peso Alergia a las sulfas

    Inhibidores de alfa glucosidasa

    Acarbosa Miglitol

    25 mg antes de la comida principal [100 mg]

    Obesidad Resistencia a la insulina Hiperglicemia postprandial

    Embarazo Enfermedad renal Enfermedad intestinal crnica Cirrosis heptica Cetoacidosis

    Trastornos gastrointestinales

    Tiazolidinedionas Pioglitazona Rosiglitazona

    15 mg [45 mg] 4 mg [8 mg]

    Obesidad Resistencia a la insulina Hiperglicemia postprandial

    Enfermedad cardiovascular Hepatopatas Uso de contraceptivos orales Embarazo

    Aumento de peso

    Meglitinidas Repaglinida Nateglinida

    0.5 mg [4.0 mg] 60 mg [120 mg]

    Deficiencia de insulina Horas de comida variables Insuficiencia renal

    Embarazo y lactancia Maternal Diabetes tipo 1 Hipersensibilidad

    Hipoglicemia Aumento de peso

    Tomado de: Barcel et al. (2009).

    Biguanidas

    Los derivados de compuestos biguandicos, entre los cuales el nico aceptado actualmente es la metformina, no provocan liberacin de insulina (Flrez, 1997). Su accin principal es la disminucin de la produccin heptica de glucosa, aunque tambin pueden mejorar la eficacia de la captacin de glucosa por los tejidos perifricos (Gerich et al., 2001).

    Inhibidores de la -glucosidasa

    Para que los carbohidratos de la dieta se absorban, deben ser hidrolizados en monohidratos en el tubo intestinal. Los polisacridos, oligosacridos y disacridos son

  • Marco Referencial 19

    transformados en monosacridos mediante la hidrlisis producida por las -glucosidasas (glucoamilasa, sacarasa, maltasa y dextrinasa), que se encuentran en la superficie luminal de las microvellosidades intestinales, estando su mxima concentracin en el tercio superior del duodeno desde donde desciende progresivamente hasta el leon. Los inhibidores de la -glucosidasa tales como acarbosa y el miglitol, reducen la formacin de monosacridos y, consiguientemente, la disponibilidad de la glucosa y otras hexosas para ser absorbidas en el intestino (Flrez., 1997).

    Tiazolidinedionas

    Se caracterizan por sensibilizar o incrementar la accin de la insulina sin que aumente su secrecin, por lo que son tiles en situaciones en que se desarrolla resistencia a la insulina. Entre las ms estudiadas de encuentran troglitazona, seguido de pioglitazona y ciglitazona. (Flrez, 1997).

    Plantas antidiabticas Las plantas utilizadas etnofarmacolgica y experimentalmente como hipoglicemiantes, comprenden ms de 725 gneros en 183 familias que van desde algas marinas y hongos a plantas superiores (Tabla 1-9) (Negri, 2005).

    Tabla 1-9: Principales familias de plantas que poseen actividad hipoglicemiante

    Familia Especies con reportes de actividad hipoglicemiante

    Especies totales en la familia

    Fabaceae 127 18.000 Asteraceae 98 21.300 Lamiaceae 36 3.500 Liliaceae 35 6.460 Poaceae 30 10.000 Euphorbiaceae 30 7.000

    Tomado de: Negri (2005).

    Actualmente se conocen ms de 200 compuestos qumicos de origen vegetal con actividad hipoglicemiante, que pertenecen a distintos grupos qumicos; el grupo ms numeroso es el de los hidratos de carbono, seguido de los alcaloides, y en menor medida, pptidos y terpenos. Algunos de ellos producen hipoglicemia como efecto secundario de su toxicidad, especialmente hepatotoxicidad, mientras que otros tienen un potencial teraputico real y su estudio en profundidad puede servir para el desarrollo de nuevos frmacos antidiabticos (Negri, 2005). Es as como de la leguminosa Galega officinalis L. (lila de Francia), planta ampliamente usada como hipoglicemiante oral en Europa Occidental durante la Edad Media, se aisl galegina o guanidina isoamlica, que sirvi como modelo para la sntesis de la biguanida metformina (Castillo y Solis, 2007).

  • 20 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    De acuerdo con Negri (2005), los mecanismos implicados en la accin de las plantas como hipoglicemiante, estn relacionados con los siguientes factores:

    Aumento de la liberacin de insulina a travs de la estimulacin de las clulas -pancreticas

    Resistencia a las hormonas que aumentan la cantidad de glucosa en sangre Aumento del nmero y de la sensibilidad de los sitios receptores de insulina Disminucin de la prdida de glucgeno Aumento del consumo de glucosa en rganos y tejidos Eliminacin de radicales libres Resistencia a la peroxidacin de los lpidos Correccin de los trastornos metablicos causados en lpidos y protenas y Estimulacin del aumento de la microcirculacin de la sangre en el cuerpo.

    Algunos de los parmetros importantes que se deben tener en cuenta para evitar efectos txicos de las plantas son: identificacin de la parte de la planta utilizada, estandarizacin qumica y biolgica del extracto, estabilidad del extracto, dosis teraputica, efectos secundarios, interacciones con alimentos y medicamentos, y contra-indicaciones; los cuales deben ser incorporados a la farmacopea nacional. La toxicidad es influenciada por la parte de la planta utilizada en la preparacin del extracto, mtodo de preparacin y va de administracin. La alergenicidad y fotosensibilizacin son otros aspectos de toxicidad, que representan un riesgo significativo (Negri, 2005).

    1.2.1 Modelos para evaluar actividad antidiabtica /hipoglicemiante de productos naturales

    Recientemente, se ha desarrollado una gran diversidad de modelos animales para comprender mejor la patognesis de la Diabetes mellitus e introducir nuevos medicamentos en el mercado para tratar esta enfermedad. La diabetes es estudiada en animales (ratas, ratones, perros, conejos, etc.) utilizando modelos in vivo e in vitro; en la mayora de estudios, principalmente con productos naturales derivados de plantas, han sido probados modelos de diabetes inducida por agentes qumicos. (Frde y Medeiros, 2008).

  • Marco Referencial 21

    Modelos animales in vivo para Diabetes mellitus La diabetes puede ser inducida farmacolgica, quirrgica o genticamente en diversas especies animales. Los modelos in vivo ms utilizados para el estudio de diabetes son en roedores tratados con aloxano (31%) y estreptozotocina (STZ, 69%); la accin citotxica de estos agentes diabetognicos es mediada por especies reactivas de oxgeno, sin embargo, ambos tienen diferentes mecanismos de accin (Frde y Medeiros, 2008; Negri, 2005). A continuacin se describen los modelos por induccin farmacolgica de diabetes, ms utilizados:

    Ensayo con estreptozotocina

    Estreptozotocina (STZ) es un glucsido nitrosourea natural aislado de Streptomyces achromogenes que estimula la produccin de radicales libres como el xido ntrico. STZ ingresa a las clulas del pncreas va transportadores de glucosa, causando alquilacin en el ADN; lo que conduce a la destruccin de las clulas de los islotes de Langerhans del pncreas. Este xenobitico se ha utilizado para inducir la diabetes con la consiguiente deficiencia de insulina. La dosis ms comn para inducir la diabetes insulino-dependiente en ratas es 60mg/kg; una sola dosis puede producir en las ratas un modelo experimental de la diabetes tipo II. El problema potencial con STZ es que sus efectos txicos no se limitan a las clulas pancreticas nicamente, pudiendo causar dao renal, estrs oxidativo, inflamacin y disfuncin endotelial (Negri, 2005; Frde y Medeiros, 2008).

    Ensayo con Aloxano

    Aloxano, un derivado de la pirimidina, es una toxina muy selectiva de las clulas -pancreticas que causa inhibicin de la glucoquinasa (enzima encargada de controlar la secrecin de insulina en funcin de la concentracin de glucosa en sangre). Este modelo presenta problemas debido a su inestabilidad qumica, metabolismo rpido y factores tales como la dieta que hacen casi imposible establecer una relacin clara entre la dosis de aloxano y su concentracin efectiva en pncreas (Negri, 2005). La dosis intravenosa comnmente utilizada en ratas es 65mg/kg, pero cuando se administra por va intraperitoneal o subcutnea su dosis efectiva debe ser mayor, por ejemplo, va intraperitoneal una dosis inferior a 150 mg/kg puede ser insuficiente para inducir la diabetes en esta especie. En ratones, las dosis varan entre 100-200 mg/kg, administrados por va intravenosa (Frde y Medeiros, 2008).

    Otros modelos animales in vivo menos utilizados en la actualidad, son los modelos quirrgicos, en los cuales se extrae completamente el pncreas; y genticos, que pueden ser animales que desarrollan diabetes espontnea, o inducida mediante la utilizacin de ingeniera gentica (Frde y Medeiros, 2008).

    Sobrecarga oral de carbohidratos

  • 22 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    En el modelo de sobrecarga oral de carbohidratos se evala el posible efecto hipoglicemiante por la administracin oral de los extractos, fracciones o compuestos puros obtenidos del material vegetal en animales normoglicmicos; a los cuales se les ha inducido una hiperglicemia transitoria mediante una sobrecarga oral de carbohidratos como glucosa, sacarosa, maltosa y almidn (2000 mg/kg) (Mora, 2008). El modelo busca evaluar la modificacin causada por la administracin oral de productos naturales, a los resultados tpicos que se obtienen mediante una prueba oral de tolerancia a la glucosa (OGTT); sin embargo, en el modelo de SOC adems de glucosa, son utilizados otros carbohidratos. Los niveles de glucosa en sangre son evaluados con respecto a la administracin del carbohidrato, a las horas 0 (antes de inducir la hiperglicemia transitoria.), 1, 2, y 4.

    Estudios In vitro Los estudios in vitro, sirven como herramienta complementaria para explorar hallazgos obtenidos con modelos in vivo y avanzar en el mecanismo de accin de un producto natural. Los agentes antidiabticos convencionales pueden afectar diferentes vas del metabolismo de la glucosa, como la secrecin de insulina, la captacin de glucosa por los rganos diana, y la absorcin de nutrientes. Existen estudios in vitro, en los cuales se evala la secrecin de insulina (con lneas celulares aisladas de los islotes pancreticos o, con lneas celulares secretoras de insulina), o la captacin de glucosa. (Frde y Medeiros, 2008). Otro de los enfoques teraputicos en este tipo de estudios, es disminuir la hiperglicemia postprandial al retardar la absorcin de la glucosa mediante la inhibicin de enzimas como la -amilasa y la -glucosidasa (Wang et al., 2010).

    1.3 Marcadores qumicos de una droga o producto vegetal

    1.3.1 Definicin El trmino marcadores ha sido introducido recientemente en el campo de productos fitoteraputicos, por lo que se encuentra muy poca informacin en la literatura acerca de ellos. Con respecto a su definicin, la EMEA: European Medicines Agency (2008) establece para marcadores:

    Constituyentes qumicamente definidos o grupos de constituyentes de una sustancia o producto a base de plantas medicinales, que son de inters para propsitos de control de calidad; independientemente de su actividad teraputica. Los marcadores, sirven para calcular la cantidad de sustancia(s) vegetal, o de preparaciones en los productos de

  • Marco Referencial 23

    plantas medicinales; siempre y cuando, el marcador haya sido determinado cuantitativamente en la sustancia o preparacin vegetal.

    En Colombia, el Ministerio de la Proteccin Social (2004), mediante el Decreto 2266, en el cual se reglamentan los regmenes de registros sanitarios, y de vigilancia y control sanitario y publicidad de los productos fitoteraputicos; establece la siguiente definicin para un marcador:

    Constituyente natural de una parte de una planta que se puede utilizar para garantizar la identidad o calidad de una preparacin vegetal, pero que no es necesariamente causante de la actividad biolgica o teraputica de la planta.

    1.3.2 Clasificacin Los marcadores presentan varias clasificaciones; pues a medida que se ha ido implementando su utilizacin, se han ido identificando diversos tipos de marcadores. A continuacin se presentan algunas clasificaciones encontradas en la literatura:

    La EMEA (2008) reconoce, adems de constituyentes con actividad teraputica conocida, marcadores activos y marcadores analticos como los constituyentes de una sustancia o producto a base de plantas. A continuacin se describe cada uno:

    Constituyentes con actividad teraputica conocida: Constituyentes que generalmente son aceptados por contribuir sustancialmente con la actividad

    Marcadores activos: constituyentes o grupos de constituyentes que son aceptados por contribuir a la actividad teraputica, pero no son responsables del efecto teraputico completo. Son tiles para propsitos de control.

    Marcadores analticos: constituyentes o grupos de constituyentes que sirven nicamente para propsitos analticos.

    De acuerdo con Busse (2000), los constituyentes de una droga vegetal pueden clasificarse en diversos grupos que podran ser determinantes para propsitos analticos y teraputicos. Desde el punto de vista teraputico son de inters tres grupos: principio(s) activo(s), marcadores activos (o teraputicos) y marcadores negativos. Un cuarto grupo; los marcadores analticos (o inactivos) son de inters, cuando no se logra identificar constituyentes de relevancia teraputica en una droga vegetal. Los principios activos y los marcadores pueden ser compuestos o clases de metabolitos secundarios. A continuacin se define cada tipo de marcador:

  • 24 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    Marcadores de relevancia teraputica:

    Principio(s) activo(s): constituyentes con actividad teraputica, para los cuales se ha logrado establecer una alta correlacin entre la presencia y concentracin de estos compuestos o clases de metabolitos secundarios con la eficacia de la droga o sus preparaciones. A este grupo pertenece un grupo muy limitado de drogas vegetales. Ejemplo; preparaciones de Aloe.

    Marcadores activos o marcadores teraputicos: son constituyentes asociados con la actividad presentada por la droga, pero que no explican la totalidad de la respuesta farmacolgica observada. Ejemplos de marcadores activos, son las terpenlactonas y los flavonoides glicosilados de Ginkgo biloba, as como hiperforina e hipericina para Hierba de San Juan.

    Marcadores negativos: Son constituyentes no deseados como toxinas o alrgenos. A este grupo pertenecen tambin, sustancias que interfieren con la absorcin de constituyentes activos. Ejemplos de sustancias con relevancia toxicolgica son los valepotriatos de la valeriana.

    Marcadores de relevancia analtica: Los marcadores analticos o inactivos, corresponden a compuestos o clases de metabolitos secundarios que apoyan el seguimiento analtico en procesos de normalizacin o estandarizacin, as como el control de calidad de material vegetal, extractos y fitoteraputicos. Estos constituyentes no tienen actividad teraputica o sta no ha sido evaluada. Se utilizan cuando no se conocen o no estn disponibles principios activos o marcadores activos.

    Recientemente, Li et al. (2008) propusieron una nueva clasificacin para los marcadores qumicos, en ocho categoras denominadas: componentes teraputicos, bioactivos, sinrgicos, caractersticos, principales, correlativos, txicos y componentes generales acoplando perfiles cromatogrficos con anlisis espectroscpico. En la Tabla 1-10, se resumen las ocho categoras con los intereses del control de calidad y las desventajas de cada tipo de marcador qumico. Cabe aclarar, que un componente puede pertenecer a varias categoras; stas de describen brevemente a continuacin.

    Componentes teraputicos: Poseen los efectos teraputicos directos de una droga vegetal. Pueden ser utilizados como marcadores qumicos para ensayos

    tanto cualitativos, como cuantitativos.

  • Marco Referencial 25

    Componentes bioactivos: Componentes de una droga o producto vegetal de

    estructura qumica diferente; que no presentan efectos teraputicos directos; pero la combinacin de sus bioactividades, contribuye con el efecto teraputico. Estos pueden ser utilizados como marcadores qumicos para la evaluacin cuantitativa y cualitativa.

    Componentes sinrgicos: No contribuyen directamente a los efectos teraputicos o a bioactividades relacionadas. Sin embargo, actan sinrgicamente para reforzar bioactividades de otros componentes, modulando as el efecto teraputico de la droga o producto vegetal. Pueden ser utilizados como marcadores qumicos para la evaluacin cuantitativa y cualitativa.

    Componentes caractersticos: Pueden contribuir a los efectos teraputicos y deben ser ingredientes especficos y/o nicos de la droga vegetal. Pueden ser utilizados como marcadores qumicos para la evaluacin cuantitativa, cualitativa y estudios de estabilidad.

    Tabla 1-10: Marcadores qumicos, Intereses y desventajas

    Categora

    Intereses en el control de calidad Desventajas

    Componentes teraputicos

    Indican eficacia

    No siempre son obtenidos

    Componentes txicos

    Aseguramiento de inocuidad Necesidad de amplios estudios toxicolgicos

    Componentes bioactivos

    Pueden indicar eficacia No siempre indican calidad general

    Componentes principales

    Pruebas de estabilidad y coherencia No siempre indican calidad general

    Componentes caractersticos

    Identificacin cualitativa No siempre son obtenidos

    Componentes sinrgicos

    Revelan acciones sinrgicas de varios componentes

    Necesidad de amplios estudios farmacolgicos

    Componentes correlativos

    Prediccin de periodos de almacenamiento, mtodos de extraccin y algunas veces sitio de coleccin, etc.

    Necesidad de amplios estudios fitoqumicos

    Componentes generales acoplando perfiles cromatogrficos con espectros.

    Indican calidad general cuando son usados acoplando espectros con perfiles cromatogrficos

    Anlisis de datos de masas.

    Adaptada de Li et al. (2008)

    Componentes principales: Son los ms abundantes (o significativamente ms abundantes que otros componentes) en la droga o producto vegetal. No son componentes caractersticos y su bioactividad puede ser desconocida. Pueden ser utilizados como marcadores qumicos para el anlisis tanto cuantitativo como cualitativo y especialmente, para diferenciacin y evaluacin de estabilidad.

  • 26 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    Componentes correlativos: Componentes correlativos en drogas vegetales que

    guardan una relacin entre s. Por ejemplo, estos podran ser precursores, productos o metabolitos de una reaccin qumica o enzimtica. Pueden ser utilizados como marcadores qumicos para evaluar la calidad de drogas vegetales originadas de diferentes regiones geogrficas y almacenadas por periodos de tiempo diferentes.

    Componentes txicos: La literatura de la medicina tradicional China y los estudios toxicolgicos modernos, han documentado algunos componentes txicos de drogas vegetales. Por ejemplo, el cido aristolquico y los alcaloides de la pirrolizidina pueden causar nefrotoxicidad y hepatotoxicidad respectivamente.

    Componentes generales acoplando perfiles cromatogrficos con espectros: Son componentes comunes y especficos presentes en una especie, gnero o familia particular. Estos pueden ser utilizados con perfiles cromatogrficos para fines de control de calidad.

    En Colombia, legalmente an no existe una clasificacin de los marcadores. Con relacin a constituyentes para el control de calidad de un producto fitoteraputico, Sharapin (2000) plantea que se requiere definir los marcadores o principios activos; en donde los marcadores son grupos de sustancias que pueden estar presentes y permiten lograr la identificacin de la planta, y los principios activos, son aquellas sustancias capaces de ejercer las actividades farmacolgicas. Al respecto, la legislacin vigente en Colombia presenta las siguientes definiciones:

    Principio activo: Compuesto o mezcla de compuestos que tiene una accin farmacolgica (Presidencia de la Repblica de Colombia, 1995).

    Marcadores: Constituyente natural de una parte de una planta que se puede utilizar para garantizar la identidad o calidad de una preparacin vegetal, pero que no es necesariamente causante de la actividad biolgica o teraputica de la planta (Ministerio de la Proteccin Social, 2004).

    1.3.3 Criterios de seleccin: Recientemente la agencia europea de medicamentos EMEA (2008), realiz un anlisis en cuanto a temas relacionados con marcadores qumicos para el control de calidad de drogas vegetales o productos a base de plantas medicinales, y recomienda tener en cuenta, en la medida de lo posible, los siguientes criterios para la seleccin de un marcador qumico:

    La seleccin de los marcadores debe ser justificada.

  • Marco Referencial 27

    Los marcadores deben ser adecuados para su propsito (por ejemplo,

    identificacin, cuantificacin, control analtico, estabilidad).

    Los marcadores deben conectar pasos del proceso de produccin y medidas de

    control de calidad.

    Los marcadores se utilizan con fines cuantitativos y cualitativos. Los marcadores

    propuestos constituyen una herramienta importante para vincular la droga activa

    (sustancia vegetal (s) y / o preparacin a base de hierbas) a el producto vegetal

    independientemente de si tienen alguna actividad teraputica o no. En general, el

    (los) mismo (s) marcador(es) es (son) usado (s) desde la sustancia vegetal hasta

    el final de la vida til, del producto terminado. Todas las excepciones deben estar

    justificadas.

    Los lmites de aceptacin para el contenido de un marcador propuesto deben ser

    especificados y justificados.

    Puesto que la sustancia vegetal o preparado vegetal en su totalidad es

    considerado como el principio activo, no ser suficiente una mera determinacin

    de la estabilidad del marcador. La estabilidad de otras sustancias presentes en la

    sustancia vegetal o en la preparacin a base de hierbas, debera, en la medida de

    lo posible, ser demostrada tambin (por ejemplo, por perfiles cromatogrficos

    apropiados). Tambin habr que demostrar que su contenido sigue siendo

    proporcional comparado con el perfil inicial.

    Para anlisis cuantitativo, deben considerarse los siguientes pasos: Si estn presentes los componentes con actividad teraputica conocida, su

    contenido debe ser determinado cuantitativamente.

    Si los componentes responsables de la actividad teraputica, no se conocen, pero

    se conoce un marcador activo, este marcador activo debe ser seleccionado para

    el anlisis cuantitativo a menos que se justifique lo contrario.

    Si no es posible la seleccin de componentes responsables de la actividad

    teraputica o de un marcador activo, para el anlisis cuantitativo; debe

    seleccionarse un marcador analtico; teniendo en cuenta los siguientes principios:

    a) La prioridad debe ser que el marcador seleccionado permite una prueba

    especfica para la sustancia activa.

  • 28 Implementacin de una metodologa para la obtencin de marcadores de frutos de Physalis peruviana L., y evaluacin de actividad hipoglicemiante

    b) El marcador debe servir como medio para calcular la cantidad de

    sustancia activa (sustancia vegetal o preparacin vegetal) en el producto

    final (pr