10Métodos fotométricos

de dispersión de la radiación:turbídimetría y nefelometría

sustancia cn suspensión, cambia la dirección de propaga-ción cle algunos fotones del haz (Fig. 10-1). El cambio de

dirección de propagación y de intensidad de la radiacióndispersacta clepende de numerosos factores. A través de

los años, se han desarrollado las bases teoricas de los

procesos de dispersión de la radiación. Dado que su

desarrollo matemático es complicado y que ofrece un

bajo significado práctico, no expondremos en el texto stts

bases teóricas. Consideramos, sin embarSo, los aspectos

generales en el párrafo siguiente.En primer lugar, la longitud de onda de la radiación

transmitida, dispersada e incidente es la misma. El segun-

clo hecho es que con frecuencia la intensidad de laradiación dispersada no es la misma en todas las direccio-nes. En numerosas aplicaciones clfnicas la mayorfa de la

dispersión, es dispenión hacia adelante, la cual emana

clescle el centro de la cubeta, opuesta a la radiaciónincidente.

En tercer lugar, lg concentración de las partículas en

suspensión puede ser determinada midiendo la disminu-ción cle P" al atravesar la cubeta o midiendo la radiaciónclispersada a un ángulo determinado. I-a elección del

mótoclo tlc¡lcndc dc la conccntración dc la suspensión. Si

En capftulos antcriorcs sc han cstucliaclo diversos mé-

todos espectrofotométricos de análisis, los cuales se

basan en la absorción o emisión de la radiación electro-

magnética. La mayorfa de los métodos están diseñados

para medir la concentración de un analito, aunque tam-

bién alguno de ellos se usan en análisis cualitativo.En contraste con capítulos anteriores, éste trata sobre

un métotlo no espectroscópico importante para la deter-

minación cle la concentración, el cual se denomina foto-metrfa de dispersión de radiación. Algunas aplicacionesimportantes de esta fotomettlase pueden encontrar en el

laboratorio clínico. Comencemos este estudio conside-

rando la clispersión de la energfa radiante por partículasen solución.

DISPERSION DE LA RADIACIONPOR PARTICUI-AS EN SOLUCION

Crnnclo tur haz, de radiación monocromática, dc longitucl

dc onda no ahsortlihlc choc¿l contra las partfcul¿ts dc unÍl

Cubetacontenie ndo

la suspensiónEnergíaradianteincldente

_>Po -->

_>

Energíaradiantetransmitida

La radiación dispersada se muestracomo flechas continuas

Figura 10-I

t29

L30 METODOS INSTRITMENTALES DE

la concentración es alta, se pueclen medir P Y Po' Este

método se denomina turbidimetría. si la concentración es

baja, P puede no ser suficientemente distinta de Po como

puiu clár lugar a una medida exacta. En este caso se

obtien"n *á¡ores resultados micliendo la radiación dis-

persada. Está técnica sc clcnomina nefclometrfa'

TURBIDIMETRIA

cuando la concentración cle una suspensión de partí-

culas se micle por turbidimetrfa, la suspenlión se sitúa cn

una cubeta de-un instrurncnto sinrilar al ilustratlo cn la

Figura L0-2,e1 cual permite real izar las medidas de-P,.y

p. Esto hace posibie calcular la concentración de la

suspensión. Consideremos los cor¡ponentes ópticos que

se muestran en la Figura IO-2'

Figttra I0-2. I'urbidímetro sencillo'

I-a fuente de racliación más frecuentementc util i'nrJa

es la lámpara de wolframio, pero pueden utilizarse tam-

bién otras fuentes de racliación visible. si el contenido dc

la cubeta es colorearJo, se debe util izar un filtro para

eliminar toclos los fotones absorbibles de Po. Dc otro

modo los resultados obtcnidos scrfan una mczcla dc

espectroscopia dc absorción y turbiclimetrfa. Esto darfa

lugar a meáidas cle concentración falsamentc elcvádas'

h- turbidfmetros pueden incorporar cualquier dctector

quc sea sensible a la longitud de ónda de P, el más común

es el fotodiodo semiconductor.Teniendo en cuenta el instrumento mostrado en la

Figura IO-2, conviene tener presentes los tratamientos

mát"máticos cle la turbidimctrfa. son muy similares a los

cle la espectroscopia de absorción. [,os valoret- dt p" Y.P

medidos experimbntalmente están relacionados con la

concentracibn de las partfculas suspendidas mediante la

ecuación:

P/?" = s-rbc

donde

Ilcuación 10- I

b es el esPesor de la cubeta

c es la conccntración clc partfculas dispersantcs dc la

radiaciónf es una constantc para una partfcula de un tamaño

determinado a una longitud dc onda dada.

ANALISIS E,N QUIMICA CLINICA

Tomando logaritmos en

ecuación, se obtiene:

2,3031og P/?o = -fbc

ReagruPando la ecuación

ambos miembros de la

Ecuación L0-2

10-2 se obtiene,

Ecuación 10-3

f,F'lFriraFFFFrFF;

irFFFFFrFFFFFFFFT?FrTITITT

IT

IT

II¡

f

-log P/P" =- bc

2,303

se puede llamar al término (f/2,303) "turbicidad> y se

le da br sfmboro T, r-a turbicidad es para la medida

turbiclimétrica lo que la absortividad es pala la meclida de

absorción. El valoi clc turbidiciclad es una función depen-

diente clcl tamaño de partfcula y dc la longitud de onda

utilizada en la medidá. su valOr no se ve afectado por el

o los productos que componen.lgs n1lfculal' ,

Sütituyendo T en la ecuación 10-3 se obtiene'

-log P/?" = Tbc Ecuación 10-4

Hay que tener en cucnta que el tórmino -lgg P{1"

puede l*i la absorbancia si se mide la radiación absorbi-

cla. sc pueclc denominar al -log P/?." "turbidancia>' Algu-

nas veces se denomina absorbancia aparente'

I¿ turbidimetría puede realizarse en espectrofotóme-

tros de visible o ultraviolcta. Esto es una práctica frecuen-

te en laboratorios de aprendirale'

Aptícaciones ctlnícas de la turbldimetrla

El uso más frecuente de la turbidimetrfa en clfnica es

en bacteriolo gfa.una bacteria tfpica posee un diámetro o

una longitud óomprendido entreZy 5 [rm; pol tanto tiene

un tamaño suficientc como para dispersar la radiación

visible. Debido a ello, la turbidirnetrfa es ampliamente

utilizada en instrurncntos automatiz¡dos los cuales mi-

clcn la scnsibilidatl a antitrióticos. En cstos instrumentos

se utiliza un sistema óptico como el que se rcpresenta en

la Figu ra ra-Z.1Á turüioinretrfa se usa para detectar si

hay óno crecimiento. Al aumentar el crecimiento bacte-

riano aumenta la dispersión detectada.

En el laboratorio se usan espectrómetros cle haa sen-

cillo, en el visible a 500 nm paia determinar en el caldo

de cultivo el número dc bacterias por mililitro. I"os

instrumentos se estand anzan mediante el análisis de

muestras de contenitlo bacteriano conocido. se realiza

una curva patrón de la turbidancia (absorbancia aparente)

flrente u ronrentraciones de bacterias y postcriormente se

utiliza para hallar la concentración dc bacterias en mues-

tras de concentración desconocida'

una scgunda aplicación importante dc la turbidime-

trfa la coniituyen los analizadore,s clc coagulación. t as

células sangufneas poseen un tamaño suficicnte como

para tlispcrsár la eneigla radiante visiblc, debido a ello se

han construido un bucn númcro de instrumentos que se

basan en los procesos de clispersión de la radiación. Estos

instrumentoi se discutirán en el Capftulo 24.

Fuente Detector

Cubeta

METODOS FOTOMETRICOS DE DISPERSION DE f"{ RADIACION: TURBIDIMETRIAYNEFELOMETRIA 131

Nefelometrfa

Cuando la concentración dc una suspensión dc partí-culas es baja cs prelbrible nlcclirla por ncfelometría. Ennctblonretría, la suspcnsión sc coloca cn una cutleta, lacual sc sitúa cn cl instrumento tal como sc muestra cn laFigura 10-3. El instrumento pcrmite la medida de inten-

CubetaColector de

rad iaciones neg ro

Filtro sise requiere

Tubo fotom u ttiplicado r

Itigurn I0-3

siclad dc clispcrsión, S, la cual cstá rclacionada con laconccntración. [ás fucntcs dc radiación utilizadas en losequipos instrumentales son de laser* helio-neón, lámpa-ras de halógcnos de cuarzo y lámparas de xenón. Dadoque el laser de helio-neón es muy frecuente en ne[e-lometría, nos ocuparemos de él a continuación.

El laser de helio-neón sc obticne introduciendo cn untubo largo y estrecho, horada,lo y cerrado por dos espejos,una mezcla de gas formada por 7 partes de helio y 1 partede neón (Fig. 10-4). l-a presión del gas de helio-neón enel tubo es de algunos torr. Un torr es igual a 1 mm demercurio (Hg). Se aplica un voltaje suficientemente altocomo para producir una descarga eléctrica a través del

* El término IASER procede de l,ight Amplification by theStimulated Emission of Racliation, cuya traducción pcxlría seramplificación de la luz por emisión estimulacla de la radiación.

2s

Estado metastable

Energ íaen electrón-

voltios

Figrn I0-s

gas. La descarga elóctrica cs la f uente de energfa que setranstbrma en radiación laser. E,n el proceso, los átomosde helio absorben cnergfa eléctrica y son excitados a unestado electrónico denominado estado metaestable (Fig.10-5). El nivel de energía metaestable es relativamenteinusual y su tiempo de vida es bastante largo con relacióna los estándares.

l-a energfa eléctrica puede ser almacenada durantecierto tiempo por estos átomos de helio metaestables, loscuales chocan posteriormente con los átomos de neón.Cuando esto ocurre, el átomo de helio metaestable cedesu ener g{a al de neón volviendo éste al estado fundamen-tial. El helio, que ha regresatlo al estado fundamental,toma más energfa eléctrica y vuelve al estado metaesta-ble, comenzando el proceso de nuevo. El helio puedeconsiderarse como el sistema de bombeo del laser.

I-a energfa cedidg al neón excitaa los átomos de estecn estaclo fundamental produciendo átomos de neón en

T-0r-

Espejo

-ft

SalidaL,ASER

Conexión dealto voltaJe

Conexión de

alto voltaje

Figura I0-4. Laser de helio-neon.

(vista superior)Fuente

Espejo de salidasem i-transparente

-t

r32 ME,-I'ODOS INSTRUME,NTALES DE, ANALISIS trN QUIMICA CLINICA

{ii(({(

I{{

raramente ut ilizada. Es suficiente saber que en la mayorfa

de los casos a bajas concentraciones existe una relación

:,?T!:ffi :i:1,:,11"x"i"Í:"i',:::fi i'J;Iffjiff ::ü:T--.--!-!?- i- , a^rñ se puede desanollar una calibración no lineal'I ranstcton 06 [_45trñ632,8 nm

Energíaen electrón-

voltios

Rápido

Nivel motastablede energía del neón

Desactivación Por'colisión (ráPida)

3'nivel de neón

Figrrn I 0-6. D iagrantn .sinlpli ficadoclc los orbitales altinlicos dc ncirn.

estado excitado. El estado favorecido es el orbital 5s. Esto

se representa en un cliagrama muy simplificado dc orbi-

tales atómicos para el neón, Figura 10-6. Este proceso es

muy eficazpaia la producción de una amplia poblaciónde átomos de neón en estado excitado. El proceso es tan

eficaz que hay más átomos de neón en estado excitado

que átomos en estado fundamental. Estos átomos de neón

Cxcitados picrden parte de su cnergía por emisión dc

fotones a632,8 nm, los cualcs son reflcjados hacia atrírs

y hacia adelante por los cspejos. Cuando pasan a través

clel gas, producen una mayor cmisión. La cxplicación dc

este efccto estimulador sobrcpasa cl alcancc dc cstc tcxttlpero el efecto es un fcnómeno ohservado con frecucncia'Esta emisión estimulada se denomina bombco de laser.

I¡s fotones de 632,8 nm salen a través cle un espejo dc

salida parcialmente transmisor. Los fotones son poste-

riormente usados en el instrumento . IA energfa cle los

átomos de neón excitados que no se ha perdido en el

proceso cle bombeo, se pierde por colis iíln con las parcdcs

del tubo de laser. Los átomos de ncón pueclen despuós,

reiniciar el proceso.El filtro puede incluirse o no en cl instrumento usado

para medir la intensidad dc dispersión (Fig. 10-3)' pcro

generalmcntc hay uno. La cubcla es de alta calitlad y cS

iimilar a la e rnplcatla cn cspcctroscopía dc fl uorcsccncia.

El valor tlel ángtrlo dc dispcrsión sclcccionado 0, oscilaentre algunos grados y 90 gradosr peto el ntás frecucntcestá comprendido gencralntentc cntrc 30 y 70 gracltls; slt

valor sc selccciona clc ¿rcucrdo con la aplicación cspccf-

fica considerada.[¿ relación matcmírtica entrc la intensidad tlc clispcr-

sión, S y la concentración de partfculas suspendidas cs

Aptícacíones clfnicas de Ia nefelometrla

Existen trcs aplicacioncs importantc's tlc la nefelome-

tría en el laboratorio clínico. Primero, el método se utilizacn algnnos contaclorcs clc células sanguínffis para distin-

guir los distintos tipos tlc cólulas dc lA sangrc-v También se utiliza para cgntar células. El rnétodo

cxacto cmpleaclo se discutc en cl Capftulo 23.

L,asegunda aplicaciíln clc la ncf clometrfa es la medida

de complejos anifgtno-anticuerpo. El mecani,bmo quími-

co dc estos procesos se discute en el Apóndice A. Para

potler seguir cstas reacciones inrnunoqufmidl¿s algunos

instrumcntos utiliz.anuna radiación quc sigue una trayec-

toria como lif quc aparccc cn la Figura l0-3. tr31 írngtllo 0

de estc instrunrcnto cstíl comprentlido cn cl intcrvalo

cntre 30 y 70 graclos. Estc intervalo proporciona el

ángulo óptimo para el tamaño tle las partfculas generadas

en este tipo cle reacción .I-aclispersión de'sarrollada porlamuestra es corregicla por otras fucntes de cl ispersión

mccliante un proceso suprcsor. La clispcrsión cofregida de

csta mancra sc compara con la proclucitla por soluciones

estándar. Este instrumento sc utilizapara medir los nive-

les en suero cle muchas proteínas importantes. Se han

fabricado "Kits> para IgA, IgG, IgM, cornplemento C'complemento Co, albúminh, transferrina, Cr.'-macroglo-

buli ña, haptoglotlina, protcína C rcactivE, orosomucoidc,

y lactor rcumatoiclc. Atlcrnírs, lu ncfclotttctrfa sc usa para

ia dctermin¿rci(ln de algunos fármacos, los cuales se

nritlen utilizanclo csta tócnica conjunlanlcntc con innlu-

noqufrnica.tá terccra aplicación cs cl anírlisis clc enzimas que

actúan sobrc cleicrminados sustratos, El analizador ami-

lasa-lipasa modelo 91 clc Colcman es un ejemplo de

instrumento que realiz.a cstc tipo de análisis. Tanto laamilasa como la lipasa trabajan rncjor cn la interfase

agua-sustrato. Para cl análisis dc lipasa el sustrato es

amilopectina, cn cl caso cle la lipasa el sustrato es aceite

cle oliva. [,os procluctos de reacción que Se producen

cuanclo las emimas actúan sobrc estas partículas de

sustrato, son tlemasiado pequcños para dispcrsar laradiación.

En ambos análisis la suspcnsión establc de sustrato sc

mczcla con la mucstra quc conticnc la cnz.itna, clcsptrós la

rcducción dc la turbiúc't, sc rclacitlna con la conccntra-

ción dc cnzima.El analizador antilasa-lipasa, cs un ncIclómctro tfpico

(ptc utiliza radiaci(rn policrornfitica blanca y tlctccciónfotocléctrica. Su calibrado sc rcaliza utilizando un cstán-

clar gclatinoso cstablc quc pucclc scr sustituitlo por cl que

aconrpaña al kit dc análisis.

Desactivación porcolisión (rápida)

I(

(

{

;;ttt1ll

|'rtr'I}It;;

METODOS FOTOMETRICOS DE DISPERSION DE

FUENTES DE ERROR

En las medidas turbidimétricas, ras cubetas suciaspueden causar pérdida en po produciendo un aumcntofalso de los valores cle P. Estdtiende a elevar de un modofalso los valores cle la turbidancia de la solución. Lapresencia en lasolución de sustancias cxtrañas capaces dedispersar la energfa radiante tiende a disminuir de unmodo ineal los valores de P. Esta tendencia da lugar avalores de la turbidancia falsamente elevados. I-a radia-ción perdida limita la linealidad en la calibración envalores altos de turbidancia. [.os compuestos fluores@n-tes que son excitdr por p", producen valores aparente-mente elevados de P. Esto dalugar a valores bajos en la

I.A RADIACION: TURBIDIMETRIA Y NEFEL,OMETRTA 133

turbidancia de la solución, que tienden a disrninuir de unmodo erróneo las meclidas dé concentración de partículasen suspensión.

En nefelometrfa, ras cubetas sucias pueden causarproblemas. Si la suciedad hace disminuir ir^

"n la trayec-

toria que llcva la energfa radiante hacia el Obiector, serándetectados valores erróneamente bajos cle S. [¿ presenciade sustancias extrañas en la cubeta es capazoe oispersarla energla radiante con tentlencia a la clevación cle S. I¿presencia de compuestos fluorescentes que son excitadospor-P" da lugar a valores falsamente elevados de s.

lás r*ry].ones qufmicas usadas pana preparar ra muesrrapara un análisis son fuentes potbnciáles de error, loscuales son especfficos, de cada ánálisis y no se discutiránaquí.

fi::