Trasplante experimental de islotes de páncreas en el...

RESUMENTRASPLANTE EXPERIMENTAL DE ISLOTES DE PÁNCREAS EN EL TRACTO GENITOURINARIO

ASOCIADO AL TRASPLANTE RENALConceptualmente el trasplante de páncreas (TP) asociado al trasplante renal (TR) puede resolver la

insuficiencia renal crónica (IRC) y la diabetes (DM). Aunque el lugar de implantación más frecuente-mente utilizado es la vena porta, el tracto genitourinario puede ser adecuado desde un punto de vistatécnico durante el TR.

20 animales con una edad media de 5,5 (SD 1,1) meses y una mediana de peso de 53 (30,102) kgse sometieron al siguiente protocolo experimental. El primer día, se lleva a cabo la nefrectomía izquier-da y el injerto es perfundido con solución de Wisconsin, lo que se sigue de una pancreatectomía dis-tal y el aislamiento de islotes por medio de la digestión enzimática con Colagenasa. Los islotes sonteñidos con el colorante vital Ditizona (DTZ) y cultivados durante 24 horas a 37º y 5% de Co2. El día2 se realiza la nefrectomía derecha y un TR ortotópico del injerto renal izquierdo preservado. Los islo-tes son trasplantados en 4 localizaciones diferentes en el tracto genitourinario: el espacio subcapsu-lar del injerto renal, en la submucosa de vejiga, en el parénquima testicular y por vía deferencial. Eldía 7, los animales son sacrificados para estudio histopatológico.

Se demostraron islotes viables en la submucosa vesical y en el testículo tras infusión por vía defe-rencial.

Palabras clave: Trasplante de islotes pancreáticos. Modelos experimentales.

ABSTRACTEXPERIMENTAL PANCREATIC ISLET TRANSPLANT INTO THE GENITO-URINARY

TRACT SIMULTANEOUS TO KIDNEY TRANSPLANTIntroduction and objectives: Simultaneous kidney and pancreas transplant is a good treatment for

both renal and pancreas insufficiency. Experimental apply of genitourinary tract for pancreas implan-tation is reported in this work.

Material and method. Twenty animals aged as average 5.5 monts (SD 1.1) and an average weightof 53 kgr were submitted to this protocol. In the day 1 a left nephrectomy is completed and the graftis perfused with University of Wisconsin solution. A partial pancreatectomy is completed at following,isolation of pancreatic islets by colagenase enzymatic digestion. Islets are dryed with Ditizone andculptured for 24 hours at 37ºC and 5% CO2. Day-2 a right nephrectomy is performed and orthotopicrenal autotransplant using the left kidney is completed. Pancreatic islets are transplanted in 4 diffe-rent locations of the genitourinary tract: renal subcapsular space, bladder submucosae, testisparenchyma and vas deferens. Day-7, all the animals were sacrifized to complete pathological study.

Results and conclusions: Viable islets were isolated in bladder submucosae and testis after trans-deferential injection.

Keywords: Pancreatic islets transplant. Experimental models.

Trasplante experimental de islotes de páncreas en el tractogenitourinario asociado al trasplante renal

Gómez Dos Santos V1, Burgos Revilla FJ2A, Pascual Santos J3, Marcen Letosa R3A,Villafruela Gómez JJ3, Correa Gorospe C4, Cuevas Muñoz B4, Mampaso F4A, García Gonzalez R5.

1Unidad de Urología. Fundación Hospital Alcorcón. 2Servicio de Urología, 3Nefrología, 4Investigación y5Anatomía Patológica. Hospital Ramón y Cajal. AUniversidad de Alcalá. Madrid.

Actas Urol Esp. 2008;32(1):102-118

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ACTAS UROLÓGICAS ESPAÑOLAS ENERO 2008ORIGINAL

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Gómez Dos Santos V et al./Actas Urol Esp. 2008;32(1):102-118

La Asociación Americana de Diabetes (Ame-rican Diabetes Association, ADA) ha revisado

los criterios diagnósticos de diabetes y recomen-dado su clasificación según los términos tipo 1 ocon deficiencia de insulina y tipo 2 en los que nose evidencia una deficiencia severa de insulina.La diabetes tipo 1 a su vez se subclasifica en tipo1A o mediada inmunológicamente y tipo 1B o noinmune lo que tiene relevancia desde el punto devista de su tratamiento1.

La diabetes tipo 1 es el resultado de la des-trucción de las células beta productoras de insu-lina pancreáticas. Su incidencia es muy variableentre diferentes poblaciones aunque con una ten-dencia uniforme a su incremento a nivel mundialque se puede calcular en un 3-4% interanual. Lapatogénesis de la enfermedad parece conllevar lainterrelación de una susceptibilidad genética denaturaleza poligénica y factores ambientalesentre los que se han implicado infecciones víri-cas, factores dietéticos en edades tempranas,tóxicos, vacunas o factores psicológicos sin que,en ninguno de los casos, se haya puesto de mani-fiesto una relación causa1-5.

La población con diabetes presenta un riesgoelevado de desarrollo de macro y microangiopatíacomo consecuencia de los cambios del metabolis-mo de los carbohidratos que son responsables delas principales complicaciones a largo plazo de laenfermedad. La microangiopatía es la responsa-ble de las retinopatía, neuropatía vegetativa ysomática y nefropatía6,7.

Aunque la etiología de la insuficiencia renal cró-nica (IRC) en el paciente diabético es múltiple, laprimera causa es la nefropatía diabética, definidacomo la presencia persistente de microalbuminuriasin otra enfermedad renal. Se trata de una mani-festación relativamente tardía de la enfermedadrenal y con frecuencia se acompaña o es seguida enpoco tiempo por el desarrollo de HTA y deterioro dela función renal. La prevalencia de IRC en pacien-tes diabéticos tipo 1 alcanza 30-40%. La diabetesrepresenta en el momento actual la primera causade IRC en EEUU, con una prevalencia en torno al30%. En nuestro entorno y según datos delRegistro de la Asociación Europea de Diálisis yTrasplante (EDTA) la prevalencia se estima en un14%. En EEUU, Japón y Norte de Europa la nefro-patía diabética es más frecuentemente consecuen-

cia de diabetes tipo 1, por el contrario en el Centroy Sur de Europa la causa más frecuente de nefro-patía diabética es la diabetes tipo 2. El trasplanterenal constituye la mejor alternativa terapéutica enestos pacientes; sin embargo, no resuelve el tras-torno metabólico subyacente por lo que no evita eldesarrollo del resto de las complicaciones de laenfermedad ni previene la recidiva de la nefropatíaen el injerto, lo cual hace deseable la asociación deltrasplante de tejido pancreático que permitiría laresolución del trastorno metabólico sin incremen-tar de modo significativo la morbi-mortalidad delTR8-11.

TRASPLANTE DE TEJIDOPANCREÁTICO

El trasplante de tejido pancreático puede rea-lizarse en forma de órgano vascularizado o comoun injerto libre de células beta, lo que desde unpunto de vista teórico supone una alternativamuy atractiva al disminuir la morbi-mortalidaden el paciente.

TRASPLANTE DE PÁNCREAS Desde que en 1966, en la Universidad de

Minnesota, se llevó a cabo el primer trasplante depáncreas (TP) hasta diciembre de 2004 se ha co-municado al Registro Internacional de Trasplantede Páncreas (International Páncreas TransplantRegistry, IPTR) la realización de 23.043 trasplan-tes de órgano que incluyen 17.127 realizados enEEUU y casi 6.000 en el resto de países con pro-grama de trasplante pancreático12 (Fig. 1).

La necesidad de inmunosupresión mantenidaque resulta en morbi-mortalidad cardiovascular yun incremento en la incidencia de infecciones,neoplasias y procesos linfoproliferativos, es la res-ponsable de que hasta el 75% de los TP se realicende forma simultánea con un TR en pacientes condiabetes tipo 1 con IRC (Figs. 2 y 3).

En el trasplante simultáneo páncreas-riñón(SPK, simultaneus páncreas kidney), el origen delinjerto pancreático suele ser un donante cadávercomún para el injerto renal. Sin embargo, existenotras opciones que permiten el trasplante simultá-neo, como el donante vivo renal que se mantiene enespera hasta la obtención de un donante cadáverpancreático o la obtención simultánea de donantevivo del injerto renal y del injerto segmentario

pancreático. Los resultados obtenidos con losdiversos procedimientos alcanzan supervivenciasal año del 94% y del 86% para los injertos renaly pancreático respectivamente12,13.

Aunque los resultados del TP han mejoradodramáticamente después de 1998 con la introduc-ción de nuevos inmunosupresores, los resultadosdel TP en el paciente de un injerto renal funcio-nante (PAK, páncreas after kidney) y del injertopancreático aislado (PTA, páncreas trasplantalone) aún no son equivalentes a los del SPK. Lasupervivencia del injerto en el PAK alcanza un 74%y sólo un 68% en el PTA. Esta última forma detrasplante se restringe al paciente con diabetestipo 1 muy inestable con episodios múltiples dehipoglucemia que comprometan su vida. Elpaciente debe conservar una función renal que lepermita tolerar la nefrotoxicidad de las potentespautas de inmunosupresión empleadas. Hasta un10% de los pacientes sometidos a PTA, en algunasseries, requieren un TR posterior12-14.

En el momento actual el TP es el único trata-miento con capacidad para reestablecer consisten-temente un estado de insulin-independencia repre-sentado por una glucemia normal y determinacio-nes de hemoblobina glicosilada, a su vez, normaleso muy próximas a la normalidad. El paciente recu-pera la respuesta normal de liberación de insulinafrente a la estimulación tanto oral como intraveno-sa a la glucosa si bien la concentración de insulinaen sangre periférica en respuesta a la estimulaciónes 2 ó 3 veces superior a la normal. El estado dehiperinsulinemia es consecuencia del drenajevenoso sistémico del injerto y de la resistencia peri-férica a la insulina inducida por el uso de corticoi-des como inmunosupresores. El estado de contra-rregulación de la glucosa también mejora tras el TPdebido a la normalización de la secreción de gluca-gón en respuesta a la hipoglucemia así como de larespuesta de la secreción de adrenalina y por tantodel reconocimiento por parte del paciente de lossíntomas de hipoglucemia15,16.

Los resultados alcanzados en el control me-tabólico y de las complicaciones a largo plazo enel paciente diabético hacen, en el momentoactual, posible la recomendación del TP en aquelpaciente con IRC que obliga a un TR y por tantoa su inmunosupresión crónica sin que el tras-plante simultáneo o posterior de un injerto pan-

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FIGURA 2. Número de Trasplantes de Páncreas en EEUUclasificados por categorías. PTA: Trasplante Aislado dePáncreas. PAK: Trasplante de páncreas posterior aTrasplante renal. SPK: Trasplante simultáneo páncreas-riñón. Tomado de “International Pancreas TransplantRegistry (IPTR)” con base en la Universidad de Minnesota.EEUU. 2003.

FIGURA 3. Número de Trasplantes de Páncreas fuera deEEUU clasificados por categorías. Tomado de “Interna-tional Pancreas Transplant Registry (IPTR)” con base enla Universidad de Minnesota. EEUU. 2003.

FIGURA 1. Número de Trasplantes de Páncreas a nivel mun-dial. Tomado de “International Pancreas TransplantRegistry (IPTR)” con base en la Universidad de Minnesota.EEUU 2003.

creático incremente significativamente la morbi-mortalidad del procedimiento. Por ello es esencialla selección estricta del receptor, esto es depacientes jóvenes (menos de 50 años) y sin car-diopatía isquémica significativa, ya que éstaconstituye la primera causa de mortalidad eneste grupo.

En ausencia de necesidad de un TR el TPAsólo se recomendará en aquellos pacientes conuna historia de complicaciones metabólicas agu-das frecuentes y severas que requieran atenciónmédica y que supongan el fallo reiterado de unrégimen intensivo de tratamiento insulínico.

TRASPLANTE DE ISLOTESPANCREÁTICOS

En este contexto, conceptualmente el tras-plante de islotes de páncreas (TI) conllevaría ven-tajas potenciales muy significativas17.

La glándula pancreática está constituida por,aproximadamente un 3% de tejido endocrino, losllamados islotes pancreáticos de Langerhans,cuyo número se calcula en torno a 1 x 106 en elpáncreas humano normal. Cada islote está for-mado por 4 tipos celulares: alfa, beta, gamma ycélulas PP; cada una de las cuales posee una fun-ción. Las células alfa secretan glucagón, cuyafunción es estimular la glucogenolisis y la movili-zación de glucosa desde el hígado. Las célulasbeta, productoras de insulina, por el contrariodisminuyen la producción de glucosa por el híga-do e incrementan la captación de la misma portejidos periféricos. Las células gamma producensomatostatina que regula la producción de gluca-gón e insulina. Las células PP, productoras delpolipéptido pancreático, poseen una función des-conocida hasta el momento. El correcto controlmetabólico depende de la función integral delislote y no de la liberación exclusiva de insulina1.

Conceptualmente, los objetivos de insulinindependencia y prevención de complicacionessecundarias de la diabetes pueden lograrsemediante el trasplante selectivo del tejido endo-crino. Las ventajas potenciales sobre el trasplan-te de órgano incluyen una morbilidad quirúrgicamenor, la posibilidad de retrasplante en caso defracaso del injerto, evitar las complicaciones aso-ciadas con el componente exocrino pancreático yla posibilidad de disminuir la inmunogenicidad

del injerto mediante técnicas de inmunoaisla-miento o de inducción de tolerancia inmune en elreceptor que eliminase la necesidad de inmuno-supresión y potenciase el trasplante en fasestempranas de la evolución de la diabetes17.

En 1967, Lacy y Kostianowsky describen laprimera técnica de digestión pancreática median-te distensión intracanalicular, disrupción mecá-nica manual del tejido e incubación en soluciónde colagenasa. El modelo fue progresivamenteperfeccionado hasta la descripción en 1988 porRicordi de un procedimiento de digestión auto-matizada cuyo objetivo era disminuir el trauma-tismo mecánico a que son sometidos los islotes através de un proceso de digestión continuo quepermitía la liberación progresiva de los islotes deltejido exocrino18. Un año más tarde, en 1989, elmismo método automatizado es aplicado a unmodelo humano de aislamiento19 que incrementósignificativamente las tasas de aislamiento y con-dujo al logro de los primeros casos bien docu-mentados de insulin-independencia en el modelohumano y por lo tanto al establecimiento duran-te la década de 1990 de ensayos clínicos, cuyosresultados han sido recogidos en el RegistroInternacional de Trasplante de Islotes.

El TI, actualmente, como en sus inicios, seenfrenta aún a 4 dificultades básicas que limitansu efectividad: el aislamiento y purificación delcomponente endocrino; la preservación; el lugaróptimo de implantación y los fenómenos derechazo alo y autoinmune.

Aislamiento y purificación Después de 3 décadas de desarrollo, la obten-

ción de una masa adecuada de islotes proceden-tes de un único donante para su implante en unreceptor continúa siendo un factor limitante de latécnica y aunque actualmente se dispone de pro-cedimientos de digestión y purificación práctica-mente automatizados y que consiguen el aisla-miento de islotes con un elevado grado de purifi-cación, los efectos biológicos deletéreos de ambosprocesos son conocidos y motivo de continuacontroversia20,21.

El primer problema que nos encontramos enel proceso de aislamiento, es la elección de undonante adecuado. La presencia de episodios dehipotensión prolongados durante el periodo de

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mantenimiento del donante, estados de hiperglu-cemia en el cadáver, el desarrollo de parada car-díaca y la duración de la isquemia fría afectannegativamente la tasa de aislamiento22.

Todos los métodos de aislamiento conllevan ladigestión enzimática de la glándula con colagena-sa con o sin disrupción mecánica asociada segui-da de su lavado por centrifugación lo que permi-te la obtención de un pellet no purificado de islo-tes y tejido acinar. En este proceso, la principalfuente de variación hasta este momento en elprocesamiento de la glándula viene determinadapor la efectividad de la colagenasa utilizada en ladigestión. La colagenasa más comúnmente utili-zada es una enzima obtenida del Clostridium his-tolitycum, cuya actividad varía ampliamente de-terminando la masa de islotes obtenidos. Laintroducción de la Liberasa, una mezcla conocidade enzimas purificadas ha resuelto parcialmenteel problema incrementando la tasa de aislamien-to y la función de los islotes en los tests in vitro.Los métodos de digestión utilizados en la actuali-dad, aunque se basan en la técnica automatiza-da desarrollada por Ricordi aún requieren de laintervención humana para decidir el momentoóptimo en el que debe cesar el proceso de diges-tión introduciendo por lo tanto un elemento desubjetividad20,21,23-30.

La purificación de los islotes respecto al tejidoacinar es otro paso del aislamiento que no essolamente complejo técnicamente sino que supo-ne un significativo impacto en la masa final deislotes obtenida y continúa siendo motivo de con-troversia31. La justificación de la purificación haresidido en la creencia de que la inmunogenici-dad del tejido trasplantado residía exclusivamen-te en el tejido exocrino y linfoide contaminantes.La capacidad inmunogénica inherente al tejidoendocrino demostrada y la posibilidad de recidi-va de la respuesta autoinmune hacen necesariala inmunosupresión del receptor y no justificarí-an la purificación.

La defensa de la purificación supone asumirque el islote aislado conserva su capacidad ínte-gra de funcionamiento y supervivencia e ignorarla existencia de mecanismos de regulación auto-crinos y paracrinos en la estructura altamenteorganizada del islote pancreático, cuyo sistemade microcirculación portal ha sido ampliamente

descrito y de cuya reproducción en el lugar ectó-pico de implante depende su supervivencia.

Los métodos de purificación más ampliamen-te utilizados se basan en el establecimiento degradientes de densidad. La eficacia relativa delprocedimiento depende, en primer lugar, de lafalta de homogeneidad de tamaño, tanto de losislotes como del tejido acinar, obtenidos de ladigestión enzimática y que se usa como paráme-tro de separación y en segundo lugar de la modi-ficación de la densidad del tejido acinar secunda-ria al edema celular que sucede durante el proce-samiento del tejido. Otro motivo en contra de lapurificación puede estar constituido por la demos-tración de la existencia de precursores de célulasbeta en el componente acinar que podrían supo-ner el potencial de crecimiento del islote implan-tado in vivo32,33.

El resultado final es la pérdida de hasta el50% de los islotes obtenidos en la digestión.

PreservaciónLa solución de Wisconsin ha demostrado ser,

hasta el momento y uniformemente, en todos losmodelos animales y en el humano la más ade-cuada para la preservación de la glándula pan-creática durante la extracción y hasta el momen-to de llevar a cabo el aislamiento de los islotescon recuentos sistemáticamente elevados. Losmejores resultados se han obtenido con tiemposde preservación inferiores a 8 horas. En 1989 seintrodujo la conocida como preservación en 2capas que permite la perfusión continua con O2de la glándula que permanece en un medio conperfluorocarbono34-36.

Lugar de implantaciónEl lugar óptimo de implantación requiere

accesibilidad, adecuada perfusión tisular yobtención de factores tróficos del tejido circun-dante que permita la función a largo plazo de losislotes. Ninguno de los lugares de implantaciónheterotópica ensayados hasta el momento handemostrado su idoneidad. Hasta el momento losúnicos lugares que se han demostrado eficaceshan sido la implantación hepática intraportal y laimplantación esplénica. Se pueden considerar 2grupos de lugares de implantación en base aldrenaje venoso: sistémico o portal. El drenaje

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venoso portal parecería ventajoso frente al sisté-mico ya que éste consigue la normoglucemia aexpensas de un estado de hiperinsulinemia.Entre los lugares de implantación con drenajevenoso sistémico se han ensayado: el espaciosubcapsular renal, los tejidos subcutáneo y mus-cular esquelético, el timo, el testículo y el espaciointratecal. Entre los lugares de implantación condrenaje portal se encuentran: el hígado, el bazo,la cavidad peritoneal, el epiplón y el espacio sub-mucoso de los tractos digestivo alto y anorrectal.

Los lugares de implantación más accesibles,tejidos subcutáneo37 y muscular esquelético, hanmostrado su inviabilidad como consecuencia dela pobre perfusión tisular y casi ausente implan-tación de los islotes. El espacio subcapsularrenal38,39 muestra, por el contrario, una rica vas-cularización a expensas de las arterias capsula-res, sin embargo, requiere un acceso quirúrgicoque limita su utilidad en el TI como proceso ais-lado no asociado al trasplante hepático o renal,por otro lado los resultados en humanos no hansido tan prometedores como en modelos anima-les. El implante intratímico40,41 proporciona,junto con la accesibilidad, la protección del injer-to frente a la respuesta inmune. La presenciaintratímica del aloinjerto desarrolla cierto gradode tolerancia inmunológica por parte de los timo-citos en maduración frente a los antígenos deldonante. El testículo42,43 se ha considerado clási-camente un lugar inmunoprivilegiado que permi-te la supervivencia prolongada de diversos aloin-jertos tisulares, para lo cual se ha propuestocomo mecanismo la expresión por parte de lascélulas de Sertoli del ligando Fas (FasL) que seune al receptor Fas en células T e inhibe su res-puesta inmune. Diversos autores han ensayadoel implante de islotes en el espacio intratecal44,45

demostrándose su viabilidad, con supervivenciasprolongas de alo y xenoinjertos. En la clínica, sinembargo, el acceso muestra claras dificultadesque podrían ser resueltas con la instalación deun dispositivo integrado en un conducto de deri-vación ventrículo-peritoneal modificado. El ca-rácter de lugar inmunoprivilegiado del espaciointratecal es controvertido y requiere la integri-dad de la barrera hematoencefálica. La implanta-ción hepática mediante infusión intraportal46 hasido ampliamente ensayada en el ámbito experi-

mental y clínico; reúne las ventajas de proporcio-nar adecuada vascularización y viabilidad delimplante, siendo así mismo accesible por pun-ción percutánea. El implante esplénico47 se harealizado tanto en su espacio subcapsular comopor inyección directa o canulación de los vasoshiliares, los dos últimos procedimientos con cla-ros riesgos hemorrágicos. El espacio submuco-so48-51 de los tractos gastrointestinal alto y ano-rectal proporcionan una abundante vasculariza-ción con drenaje venoso portal y la posibilidad derealizar el implante con control endoscópico, asícomo accesibilidad para su control y biopsia en elseguimiento. Finalmente, el espacio intraperito-neal52 presenta requerimientos elevados de volu-men tisular implantable para revertir el estadodiabético.

Los métodos de exclusión inmunológica atien-den al principio de separar los islotes del mediointerno del receptor por interposición de unamembrana artificial semipermeable que permitala difusión de moléculas de bajo peso molecular,como nutrientes e insulina, impidiendo el accesoa anticuerpos o células53,54. Los ensayos clínicoscon dispositivos de exclusión inmunológica hanpresentado un éxito parcial, limitado por lascaracterísticas físicas de las membranas y su bio-compatibilidad.

Control del rechazo alo y autoinmuneTras su trasplante, los islotes pueden ser des-

truidos por 3 mecanismos: la respuesta inflama-toria inespecífica, el rechazo antígeno específico yla recurrencia de la respuesta autoinmune.

La respuesta inflamatoria parece mediada porcitokinas como la inteleukina 1 (IL-1), el factor denecrosis tumoral alfa (TNF-alfa) y el interferóngamma (INF-gamma) que estimulan la produc-ción de radicales libres de oxígeno en una varie-dad de células, fundamentalmente macrófagos ya las que son extremadamente vulnerables lascélulas beta. El importante contenido retículo-endotelial del hígado, representado por las célu-las de Kupfer, podría explicar que se calcule quesólo un 30% de la masa de islotes trasplantadapor infusión portal se implante finalmente.

En ausencia de mecanismos efectivos deinducción de un estado de inmunotolerancia, lainmunosupresión a largo plazo es obligada para

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proteger el injerto de las respuestas alo y autoin-mune. La inmunosupresión convencional hademostrado un amplio potencial diabetogénicosecundario a toxicidad sobre el islote y a resis-tencia periférica a la insulina.

Los glucocorticoides no sólo inducen resisten-cia periférica a la insulina, sino que se handemostrado capaces de disminuir la secreción dela misma.

La CSA, un inhibidor de la calcineurina quebloquea la transcripción del gen del receptor de laIL-2 y por lo tanto la activación subsecuente decélulas T, disminuye la secreción de la insulinacomo resultado probablemente de la interferenciacon el funcionamiento de canales de calcio volta-je dependientes, mecanismo común con el inmu-nosupresor tacrolimus.

El micofenolato mofetil es un inhibidor de lasíntesis de las purinas como la azatioprina yreduce de forma potente la secreción de insulinapor un mecanismo de bloqueo también de loscanales de calcio.

El desarrollo de nuevos inmunosupresores seha convertido en el factor determinante que hapermitido incrementar la tasa de insulin inde-pendencia tras el trasplante.

El sirolimus, cuya función depende de launión a receptores intracitoplasmáticos forman-do un complejo que impide la proliferación decélulas T dependiente de IL-2 (inhibe las señalesde proliferación de células T por IL-2 y otras cito-kinas y factores de crecimiento) no modifica lasecreción de insulina por las células beta y por lotanto carece de efecto diabetógeno.

El daclizumab, un anticuerpo monoclonalfrente a la cadena alfa (CD 25) del receptor de laIL-2, no ha demostrado efectos deletéreos sobrela secreción de insulina55,56.

Resultados del modelo clínico de trasplantede islotes en el humanoSegún datos recogidos en el Registro

Internacional de Trasplante de Islotes (Univer-sidad de Giessen, Alemania) entre los años 1983y 1999 se realizaron un total de 493 alotrasplan-tes de islotes, 237 de los cuales lo fueron en ladécada 1990-1999 (Fig. 4). La supervivencia delreceptor al año fue del 96% mientras la supervi-vencia del injerto, definida como la determinación

de niveles de péptido C > 0,5 ng/ml fue del 41%y la independencia de insulina del 11%57 (Fig. 5).

En junio del año 2000 fueron comunicadospor Shapiro et al. los resultados obtenidos por unnuevo protocolo de trasplante clínico. Se selec-cionaron pacientes con DM tipo 1 de más de 5años de evolución con niveles indetectables depéptido-C y cuya característica fundamental erasu labilidad con persistencia de niveles de gluco-sa no controlados a pesar de un estricto progra-ma de tratamiento insulínico que conllevabamúltiples y severos episodios de hipoglucemia,así como episodios de cetoacidosis diabética.

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FIGURA 4. Número de Trasplantes Alogénicos de Islotesde Páncreas entre los años 1974-2000 (previo al Pro-tocolo de Edmonton). Tomado de “International IsletTransplant Registry. ITR” con base en el Tercer Departa-mento Médico del Centro Médico Universitario de Giessen.Alemania. 2001.

FIGURA 5. Independencia de Insulina al año postras-plante en pacientes diabéticos tipo 1 (péptido C negativo)En la década 1990-1999). Tomado de “ International IsletTransplant Registry. ITR” con base en el TercerDepartamento Médico del Centro Médico Universitario deGiessen. Alemania. 2001.

El TI se llevó a cabo como procedimiento ais-lado, no asociado a TR, iniciándose el protocolode inmunosupresión inmediatamente antes delTI con Sirolimus, Tacrolimus a dosis bajas yDaclizumab. Dicho protocolo, a diferencia de lospreviamente utilizados, evitaba el empleo en todomomento de glucocorticoides con reconocidacapacidad diabetogénica.

Los páncreas se obtuvieron de donante cadá-ver. El procesamiento de la glándula comienzacon su distensión canalicular con la enzimaLiberasa y se sigue de la disrupción mecánica ydigestión automatizada en cámara. El aislamien-to de islotes se completa con la purificación auto-matizada en un separador celular COBE 2991utilizando un gradiente continuo de Ficoll-Ditriazoato. El procedimiento evita el uso de deri-vados xenoproteicos como suplementos de lassoluciones de lavado o medios de cultivo paradisminuir el riesgo de estimular la respuestainmune. El producto del aislamiento se trasplan-taba en fresco. Las preparaciones se considera-ron adecuadas para el trasplante cuando conte-nían >4.000 IE/Kg peso del receptor y un volu-men <10 ml y se trasplantaron mediante infusiónportal trans-hepática percutánea de una suspen-sión de islotes en una solución constituida pormedio 199 y albúmina humana con heparinamientras se efectúan el control de la presiónintraportal. Al finalizar la infusión y para evitar elsangrado del trayecto de punción se embolizó conpartículas hemostáticas.

El tratamiento insulínico se suspendía inme-diatamente tras el trasplante y sólo se reiniciabasi el paciente presentaba glucemias > 200 mg/dlen cuyo caso se llevaba a cabo un retrasplante.

El protocolo descrito y sus resultados fueroninicialmente comunicados en 7 pacientes. Conun seguimiento medio de 11,9 meses (4,4-14,9meses) el 100% de los pacientes se manteníaindependiente del uso exógenos de insulina. Paraello, 6 de los 7 pacientes requirieron una segun-da infusión de islotes y el paciente restante requi-rió hasta una tercera infusión. El número totalmedio de islotes trasplantados fue de 11.547IE/Kg (DE 1604 IE/Kg).

La estrategia inmunosupresora utilizada, querepresenta la modificación fundamental introdu-cida responsable del éxito del protocolo, previene

la activación de la cascada inmune inhibiendo laactivación de células T (Tacrolimus), la produc-ción de interleukina 2 (IL-2) y otras citoquinas(Sirolimus) y la unión de IL-2 a su ligando(Daclizumab) y por lo tanto inhibiendo la expan-sión clonal de los linfocitos.

En enero de 200258, 17 pacientes habían sidoreceptores de un TI bajo el conocido comoProtocolo de Edmonton, con un total de 38 pro-cedimientos (13 pacientes requirieron 2 procedi-mientos y 4 precisaron 3 infusiones secuenciales)y un número medio de islotes equivalentes de12.330 IE/Kg (DE 581 IE/Kg). El tiempo mediode seguimiento fue de 20,4 meses (3,2 – 34,2). Delos 17 pacientes, 11 permanecían insulin-inde-pendientes con una HgbA1c media de 5,8 % (DE0,13%) para lo cual 2 pacientes requirieron el usode hipoglucemientes orales. Cuando se aplicancriterios estrictos en el test de estimulación oralde la glucosa sólo 2 pacientes tienen una tole-rancia normal a la glucosa. De los 6 pacientesrestantes que precisaron de nuevo tratamientoinsulínico, 3, no tenían péptido-C detectable y 2de ellos tuvieron seroconversión para anti GAD yanti ICA lo que expresa recurrencia de la enfer-medad autoinmune. Asímismo uno de los pacien-tes en tratamiento con insulina pero con péptido-C detectable (3) ha verificado un incremento deanticuerpos ICA y GAD.

A pesar de lo expuesto, ningún paciente volvióa presentar episodios de hipoglucemia o un con-trol glucémico lábil.

Los resultados obtenidos por Shapiro et al.fueron posteriormente reproducidos por otrosgrupos integrados en un ensayo multicéntricobajo el patrocinio de la Inmuno Tolerance Net-work59.

Markmann et al. publican en diciembre de2003 los resultados en el TI de 9 pacientes en elperiodo comprendido entre febrero de 2000 ydiciembre de 2002. Siete pacientes lograron laindependencia de insulina, de los cuales 5 sólorequirieron un procedimiento, mientras los 2 res-tantes precisaron 2 infusiones. Sin embargo, delos 5 pacientes sometidos a un procedimientoúnico, 2 recibieron la infusión de islotes proce-dentes de 2 donantes. Tras un seguimiento míni-mo de 1 año, 6 de los 7 receptores mantuvieronla insulin-independencia.

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En mayo de 2005 el Grupo de Edmontonpublica la revisión de su resultados. Se habíantratado 70 receptores de islotes aislados60. Losestudios de supervivencia demostraban la pérdi-da progresiva de insulin-independencia con sóloel 50% de los receptores independientes de insu-lina a los 3 años. Sin embargo, el 83% de lospacientes continuaban mostrando detección depéptido-C a los 5 años.

A nivel mundial, más de 471 pacientes conDM tipo 1 han recibido un TI en 43 institucionesdistintas desde el año 2000. A pesar de excelen-tes resultados a un año post-TI, a largo plazo lafunción del injerto declina significativamente conmenos del 10% de los receptores independientesde insulina a los 5 años61-63.

Aunque la independencia de insulina se haconsiderado el objetivo terapéutico primordialtras el TI, ésta debería lograrse simultánea-mente a un adecuado control metabólico. Lafunción del islote puede encontrase severamen-te alterada aún en condiciones de insulin inde-pendencia.

Los estudios llevados a cabo en receptoresde auto TI ponen de manifiesto la posibilidad,tras el implante de una masa suficiente de islo-tes, el lograr un estado persistente de normo-glucemia con una respuesta de insulina a lossecretagogos glucosa y arginina característica-mente bifásica, es decir, cualitativamente nor-mal aunque con frecuencia cuantitativamentereducida. La reserva insulínica se encuentratambién reducida, lo que se traduce en un ries-go de hiperglucemia en situaciones de estrésfisiológico. Sin embargo, la función secretoradel alotrasplante de islotes parece significativa-mente alterada. La infusión portal de islotes enel hígado es una situación claramente desfavo-rable para la función endocrina de un islotedenervado y desvascularizado, dado que, enprimer lugar, la modulación autonómica de lasecreción de insulina es fundamental para lahomeostasis de la glucosa y en segundo lugar,la sangre venosa portal contiene niveles eleva-dos de metabolitos intestinales, glucosa y dro-gras inmunosupresoras64.

La respuesta fisiológica al incremento deglucosa circulante es la secreción de insulinaque alcanza el hígado por vía portal inhibiendo

la producción de glucosa por el mismo. Lospacientes receptores de un alotrasplante mues-tran una primera fase de secreción de insulinadefectuosa, así como una reducción de lasegunda fase de secreción aguda de insulinaque es primordial en la inhibición de la produc-ción hepática de glucosa; el resultado es lahiperglucemia postpandrial detectada en lospacientes receptores de alotrasplantes funcio-nantes.

Los estudios de la homeostasis de la glucosallevados a cabo por el grupo de Edmonton enpacientes con insulin independencia prolongadaponen de manifiesto en los test de tolerancia a laglucosa, respuestas de secreción de insulina sig-nificativamente inferiores a las de individuos con-troles no diabéticos.

Concomitantemente a una reproduccióndefectuosa del patrón de secreción de insulina seobjetiva la ausencia de restablecimiento de la res-puesta fisiológica a la hipoglucemia, conocidacomo contrarregulación de la glucosa. El defectode la secreción de glucagón en respuesta a unahipoglucemia aguda o sostenida no es el resulta-do de la destrucción de células α en el islote, sinode la utilización del hígado como lugar receptordel implante pues la secreción de glucagón, sinembargo, es preservada en el contexto del TI peri-toneal. El defecto de secreción de glucagón esespecífico del estímulo hipoglucémico pues semantiene en respuesta al aminoácido arginina. Elmecanismo propuesta para la inhibición específi-ca del glucagón es la producción intrínseca deglucosa por los hepatocitos que constituyen trasel TI el microambiente insular. La producción deglucosa hepática que ocurre normalmente duran-te una situación de hipoglucemia (gluconeo-génesis/glucogenolisis) sistémica es suficiente parainhibir la producción de glucagón en las célulasα del islote.

Finalmente, no se ha demostrado tras el TI lamodificación de la alteración conocida de otroscomponentes de la respuesta contrarreguladora:la secreción de adrenalina y noradrenalina, lasecreción de cortisol y hormona de crecimiento.La ausencia de recuperación de la secreción deadrenalina puede ser el resultado de la neuropa-tía autonómica instaurada en el paciente diabéti-co de larga evolución.

110


MODELO EXPERIMENTAL DEAISLAMIENTO DE ISLOTES

Sería deseable en el mismo momento del TRasociar un trasplante de tejido pancreático en eltracto genitourinario o en su proximidad, quepermita la resolución del trastorno metabólicosin incrementar de modo significativo la morbi-mortalidad del TR.

Las consideraciones expuestas llevaron a con-siderar deseable, en el mismo momento del TR,asociar un trasplante de tejido pancreático en eltracto genitourinario o en su proximidad, quepermita la resolución del trastorno metabólicosin incrementar de modo significativo la morbi-mortalidad del TR.

Se desarrolló una hipótesis de trabajo experi-mental en modelo animal cuyo objetivo fuera eva-luar la viabilidad de una técnica de aislamientode islotes y a analizar comparativamente la ido-neidad de distintos sitios de implantación en eltracto genito-urinario que incluyera la subcápsu-la renal del injerto, la submucosa vesical y elparénquima testicular.

MATERIAL Y MÉTODOS El trabajo experimental se llevó a cabo en 2

fases diferenciadas. El objetivo de la PrimeraFase fue el desarrollo de la técnica de aislamien-to de islotes para lo cual se desarrolló un modelode animal pequeño en rata. La técnica de diges-tión pancreática perfeccionada en la fase previapermitió el aislamiento y TI en un modelo experi-mental de autoTR en cerdo que constituye laSegunda Fase del trabajo experimental.

MODELO EXPERIMENTAL EN CERDO Una vez desarrollada la metodología de diges-

tión pancreática manual, ésta se trasfirió a unmodelo experimental en cerdo. La hipótesis detrabajo exigía la asociación del TI a un modeloexperimental de autoTR.

Animales de experimentación. Preparaciónpreoperatoria Los animales de estudio fueron 20 cerdos

macho adultos de tipo hébrido comercial (mezclagenética de los tipos Landrace, large White yPietrain) con una media de edad de 5,5 (SD 1,1)meses y una mediana de peso de 53 (30, 102) Kg.

El cerdo es un animal ampliamente utilizadoen el ámbito del trasplante experimental ya queposee una anatomía y fisiología muy similares alhumano. Se trata además, de un animal de fácilobtención, crecimiento rápido y reproducciónnumerosa. Sin embargo, es, asímismo, un animalde naturaleza lábil y sensible a las situaciones deestrés por lo que su manejo debe ser cuidadosopara evitar la muerte del animal durante supreparación para la intervención. Todos los ani-males, procedentes de la misma granja especia-lizada, se mantuvieron en condiciones estándarde estabulación donde se les proporcionabaagua y comida en forma de pienso. Los anima-les eran sometidos a un periodo de ayunas de24 h previo a la cirugía pero con acceso libre alagua. La premedicación del animal se lleva acabo con la administración intramuscular deketamina a dosis de 10 mg/kg. Trasladado alprequirórfano el animal se pesa y se canaliza lavena del pabellón auricular y se traslada a la mesade quirófano donde se realiza la inducción anesté-sica con Sulfato de atropina (0,7 mg/kg) yTiopental sódico intravenoso (15 mg/kg) que sesigue de la intubación orotraqueal y ventilacióncontrolada del animal. Se realiza profilaxis anti-biótica con Cefazolina/1 g iv) y Metronidazol(500 mg iv).

Modelo quirúrgico. Extracción renal ypancreática. Técnica anestésicaEl mantenimiento anestésico se realiza con

Isoflurano al 0,7% y el bloqueo neuromuscularcon Bromuro de pancuronio (2 mg/kg/h). Laanalgesia intraoperatoria se realiza con Fentaniloa dosis de 50 µgr/h. La monitorización hemodi-námica de los animales se lleva a cabo mediantela canulación del paquete vascular femoral en elque arteria vena son cateterizadas con un catéterde doble luza (CVP Catheter 2 lumen AbbottR) loque permite la monitorización continua de la pre-sión arterial (PA) y de la presión venosa central(PVC).

Técnica quirúrgica de extracción renal El animal se coloca en decúbito lateral dere-

cho en posición de lumbotomía izquierda y seprepara el campo quirúrgico correspondiente alacceso de lumbotomía subcostal. Tras acceder

111


a la fosa lumbar se penetra en el espacio retrope-ritoneal y se procede a la disección del espacioperirrenal y a la identificación y disección de loselementos del pedículo renal, arteria y vena y eluréter. La colocación en la arteria renal principalde una sonda de ultrasonidos (T10S Samall ani-mal blood flowmeter. Probe 4R1182. TransonicSystems Inc. New York. USA) permite la monito-rización del flujo arterial renal. A continuación secanula el uréter previamente seccionada con unasonda de alimentación K-30 lo que permite lamonitorización de la diuresis y la determinacióndel aclaramiento renal. Finalizado lo cual se rea-liza la nefrectomía izquierda.

Técnica quirúrgica de pancreatectomíasegmentaria El páncreas del cerdo es un órgano retroperi-

toneal cuyos 3-4 cm distales correspondientes ala cola pancreática están recubiertos por unacápsula fibrosa y se disponen sobre el hilio esplé-nico mientras el cuerpo de la glándula envuelvela vena porta.

Una vez efectuada la nefrectomía izquierda, elpáncreas del animal se identifica inmediatamen-te anterior a la posición que ocupaba el polosuperior del riñón izquierdo. La cápsula fibrosaque envuelve el segmento caudal de la glándulafacilita su disección conservando íntegra dichacápsula. Una vez alcanzado el eje portal se reali-za la sección mecánica automática del órganocon un dispositivo Roticulator (DisposableStapler Autosuture) (Fig. 6).

Preservación del injerto pancreático.Preservación del injerto renalUna vez finalizada la nefrectomía izquierda, el

riñón es inmediatamente perfundio con 250 mlde solución de Wisconsin a 4º C e introducido enun contenedor, asimismo, con solución deWisconsin y sumergido en hielo en nevera parasu preservación por enfriamiento de superficie.

El injerto pancreático obtenido es sumergidoen solución de Wisconsin a 4 ºC y trasladado alLaboratorio de Inmunopatología para iniciar suprocesamiento.

Curso postoperatorio La intervención quirúrgica finaliza con el cie-

rre de la lumbotomía izquierda y la creación deun bolsillo subcutáneo para la introducción yconservación del acceso vascular femoral. Unavez recuperado el tono neuromuscular el animales extubado y trasportado a las dependencias delanimalario.

Procesamiento pancreático El procesamiento del segmento pancreático se

lleva a cabo en condiciones de esterilidad bajocámara de flujo laminar en el Laboratorio deInmunopatología a donde ha sido trasladado inme-diatamente tras su extracción. La media de tiempode isquemia fría fue de 13,76 (SD 6,03) min.

El procedimiento comienza con el pesado delsegmento pancreático en una balanza de preci-sión, tras lo cual se dispone en una cápsula deacero inoxidable. Se canula el conducto pancreá-tico con un Abbocath-t 24 G y se perfunde conun volumen de solución de colagenasa de con-centración 1,5 mg/ml, igual al peso del segmen-to pancreático multiplicado por 3 hasta obtenerla distensión de la glándula (Fig. 7). A continua-ción se procede a la disección de la cápsula ygrasa peripancreáticas y a la dispersión mecáni-ca del páncreas en solución de colagenasa. Seinicia la agitación en baño termostatizado a 38º Cdurante 10-12 min. Finalizada la agitación sedistribuye el producto de digestión en tubos deFalcon de 50 ml para su centrifugación a 400 G a4º C durante 2 min, proceso que se repite en igua-les condiciones una vez retirado el sobrenadantey resuspendido el pellet en solución de HANKS.Tras la segunda centrifugación se resuspende el

112


FIGURA 6. Sección mecánica del segmento distal del pán-creas.

pellet resultante en medio de cultivo RPMI 1640y se dispone en placas de Petri para su cultivo enestufa a 37º C y 5% CO2 donde permanecenhasta su implante. El recuento de islotes requie-re la separación de un alicuota de 100 µl del pro-ducto de digestión que se incuba con 10µl de DTZdurante 5 min para la tinción selectiva de losislotes viables. En una placa de Petri de 25 mmse visualizan bajo microscopio de luz invertidacon visor graduado y se cuentan distribuidos portamaño. El producto obtenido es , pues, el resul-tado de la digestión enzimática y dispersiónmecánica pancreática.

Trasplante de islotes asociado a trasplanterenalTrascurridas 24 horas, el animal es traslada-

do de nuevo al área quirúrgica.

Técnica anestésicaEl procedimiento anestésico sigue el protocolo

previamente descrito, comenzando con la preme-dicación del animal con Ketamina (10 mg/kg). Laconservación del acceso vascular femoral permi-te su empleo para la inducción anestésica conTiopental sódico (15 mg/kg) y Solfato de atropina(0,7 mg/kg) que se sigue de la intubación de lavía aérea del animal y su ventilación mecánica.

Técnica de nefrectomía derecha. Animal anéfrico Con el animal en posición de decúbito lateral

izquierdo, se prepara el campo quirúrgico paraacceso de lumbotomía subcostal derecha. Sealcanza el espacio retroperitoneal a nivel de lafosa lumbar procediéndose a la disección delespacio perirrenal y al aislamiento del pedículorenal, momento en el que se determina el flujoarteria renal en el animal monorreno con sondade ultrasonidos. Concluida la determinación serealizará la nefrectomía derecha tras el clampajede la a. Renal a nivel del ostium aórtico, el clam-paje de la v. Renal en el ostium de la cava y lasección ureteral.

Técnica de auto-trasplante renal ortotópico El injerto renal izquierdo, que ha permanecido

preservado mediante inmersión en solución deWisconsin y enfriamiento de superficie se saca dehielo. El autoTR ortotópico se inicia con la anas-tomosis venosa termino-terminal a v. Renal consutura continúa interrumpida de ProleneR 5-0,seguida pro la anastomosis arterial terminoter-minal a a. Renal con sutura continua interrum-pida de ProleneR 5-0. Una vez finalizada la ansto-mosis arterial se coloca la sonda de ultrasonidosdistal a la línea de sutura. El desclampaje suce-sivo venoso y arterial permite la reperfusión delinjerto mientras la sonda monitoriza el flujo arte-rial y su modificación en el tiempo. La cateteriza-ción del uréter del injerto permite la monitoriza-ción de la diuresis y junto con el flujo arterial ladeterminación del aclaramiento renal. El auto-TRfinaliza con la anastomosis urétero-ureteral ter-mino-terminal con puntos sueltos de VycrilR 4-0.

Técnica de autotrasplante de islotespancreáticos Los islotes pancreáticos (IP) que han perma-

necido en cultivo, previa verificación de su viabi-lidad mediante tinción selectiva con DTZ, sondistribuidos en 4 volúmenes homogéneos y dis-puestos en 4 jeringas de 1 cc.

TI en la subcapsula renal del injerto A nivel del injerto renal, la creación de un túnel

subcapsular mediante un catéter balón (Biliaryballoon probe. 5Fr. Dispomédica. Hamburg.

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1400000

1200000

1000000

800000

600000

400000

200000

0

NIAislados

O18

O6

FIGURA 7. Resultados. Número de Islotes Pancreáticos.

Germany) permite la inyección de los islotes y elsellado de la cápsula renal con cola de fibrina(Tissucol

R). A continuación se cierra el acceso de

lumbotomía.

TI en la submucosa vesicalCon el animal en decúbito supino y a través de

una laparotomía media se accede a la vejiga loca-lizada en posición intraperitoneal. A nivel de lacúpula vesical la incisión de la capa muscularpermite la disección del espacio submucoso y lainyección de un segundo alicuota de islotes.

TI en el testículo La luxación intra-abdominal del testículo per-

mitirá la inyección intra-parenquimatosa y víadeferencial de islotes y su permanencia intra-abdominal.

Curso postoperatorio El procedimiento finaliza con el cierre del

acceso de laparotomía media, la reanimación delanimal y su traslado a las dependencias de esta-bulación del animalario.

Sacrificio El 7º día postoperatorio el animal se traslada

a quirófano y tras la inducción anestésica segúnprotocolo, el animal se coloca en posición de lum-botomía derecha y a través de la incisión previase accede al espacio retroperitoneal. Se efectúa laliberación extracapsular del injerto y el controldel pedículo vascular que permita la determina-ción del flujo arterial con sonda de ultrasonidos,tras lo cual se realiza nefrectomía del injerto. Através de la laparotomía media se verificarán lacistectomía parcial del segmento donde se realizóla inyección submucosa de islotes y finalmente laorquiectomía.

Las piezas de nefrectomía, cistectomía parcialy orquiectomía son incluidas en formol para suestudio anatomopatológico.

El sacrificio del animal se lleva a cabo median-te inyección letal de ClK.

RESULTADOS El modelo se llevó a cabo en un total de 20

animales. Todos ellos procedentes de la mismagranja de estabulación y pertenecientes a la raza

híbrido comercial (mezcla genética de los tiposLandrace, large White y Pietrain). La edad mediade los animales fue de 5,5 (SD 1,1) meses y unamediana de peso de 53 (30, 102) Kg.

En 4 de los animales (4/20) la extracción pan-creática no se realizó. El animal 1, que fue elúnico en el que el acceso pancreático se verificópor vía de una laparotomía media, sufrió unalesión quirúrgica del eje venoso portal que oca-sionó su muerte. El animal 5 murió a conse-cuencia de un cuadro de hipertermia malignadurante el mantenimiento anestésico. El animal13 presentó una lesión vascular arterial del riñónizquierdo destinado al autotrasplante durante laextracción que le inhabilitó para el modelo.Finalmente el animal 19 sufrió una lesión delsegmento distal del páncreas.

Los segmentos pancreáticos obtenidos quirúrgi-camente estuvieron perfundidos hasta su sección ypor lo tanto no sufrieron isquemia caliente. El tras-lado del segmento pancreático al Laboratorio deInmunopatología para su procesamiento se realiza-ba de forma inmediata tras su obtención por lo queel tiempo medio de isquemia fría fue de 13,76 (SD6,037) min. El peso medio de la glándula fue de 25,47 (SD 11,19) g (Tablas 1, 2 y 3).

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Tabla 1. Características de los animales

Animal Peso Edad del Tiempo de Peso deldel animal animal isquemia páncreas

(Kg) (meses) fría (min) (g)

11 1 36 3 – –12 2 42 4 8 19,013 3 76 5 12 32,014 4 95 6 15 46,015 5 55 5 – –16 6 31 5 30 15,017 7 63 5 12 38,018 8 34 3 10 13,019 9 37 4 25 17,010 10 42 4 8 16,511 11 51 4 15 13,512 12 41 4 10 15,513 13 84 6 10 36,014 14 30 3 15 16,015 15 31 3 12 –16 16 59 5 20 24,017 17 102 6 10 39,018 18 98 6 12 38,019 19 64 5 – –20 20 91 6 10 29,0Total N 20 20 20 17 16

Limitados los primeros 100 casos

Cuatro segmentos pancreáticos procesados(animales 8, 11, 14 y 17) tuvieron una digestiónfallida, no pudiéndose identificar islotes viablestras la tinción con DTZ del producto de digestiónenzimática.

Se obtuvieron, por lo tanto, islotes tras el pro-cedimiento de digestión en 12 animales La Tablamuestra los resultados de aislamiento expresa-dos como Número de Islotes Aislados (Tablas 4 y5) (Fig. 7).

El estudio anatomopatológico tras el sacrificiodel animal permitió identificar la presencia deislotes en 2 ejemplares (2/12, 16%). En el prime-ro de ellos la localización viable correspondió altestículo tras inyección intracanalicular (Fig. 8),mientras en el segundo se identificaron en lasubmucosa vesical.

DISCUSIÓNEl primer factor limitante en el proceso de ais-

lamiento es la preservación del órgano para locual la solución de Wisconsin se ha demostradola más idónea tanto en modelos animales como

humanos con tiempos de isque-mia fría inferiores a 6-8 horas.En nuestro modelo el tiempo deisquemia fría fue siempre infe-rior a 1 hora y la preservaciónse realizó por inmersión simpleen Wisconsin a 4 °C. Se ha de-mostrado la eficacia de la dis-tensión pre-enfriamiento delconducto pancreático con solu-ción de Wisconsin o de colage-nasa en Wisconsin para preser-var la integridad del conducto ypermitir la completa distensiónde la glándula. La solución decolagenasa permanece inactiva

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Tabla 2. Resultados. Estadísticos descriptivos

N Mínimo Máximo Media Desviación estándar

Peso del animal (Kg) 20 30 102 58,10 24,770

Edad animal (meses) corregida 20 3,50 6,50 5,1000 1,09545

Peso del páncreas (gr) 16 13,0 46,0 25,469 11,1900

Tiempo de isquemia fría (min) 17 8 30 13,76 6,037

Valid N (listwise) 16

Tabla 3. Resultados. Características de los animales.

Peso del Edad del Peso del Tiempo de animal animal páncreas isquemia fría

(Kg) (meses) (g) (min)

N Validos 20 20 16 17

Missing 0 0 4 3

Media 58,10 5,1000 25,469 13,76

Error estándar de la media 5,539 0,24495 2,7975 1,464

Mediana 53,00 5,5000 21,500 12,00

Desviación estándar 24,770 1,09545 11,1900 6,037

Rango 72 3,00 33,0 22

Mínimo 30 3,50 13,0 8

Máximo 102 6,50 46,0 30

Tabla 4. Resultados. Digestión de islotes

Peso del Animal páncreas (g) NIAislados

1 1 – –

2 2 19,0 450000

3 3 32,0 16000

4 4 46,0 520000

5 5 – –

6 6 15,0 1260000

7 7 38,0 170000

8 8 13,0 Digestión Fallida

9 9 17,0 300000

10 10 16,5 700000


12 12 15,5 300000

13 13 36,0 –


15 15 – 520000

16 16 24,0 300000


18 18 38,0 1350000

19 19 – –

20 20 29,0 640000

Total N 20 16 12

durante el periodo de preservación a 4°. Unareciente modificación conocida como preserva-ción en 2 capas utiliza el perfluorocloruro comoun transportador de oxígeno al órgano sumergidoen Wisconsin.

El método de disociación pancreática elegidodetermina su volumen final y pureza. El métodode preparación varía desde la microdisecciónpancreática hasta la asociación de dispersiónmecánica, digestión enzimática y purificaciónque consiguen la obtención de preparacionesprogresivamente más puras, constituidas portejido endocrino disociado del tejido acinar. Losprocesos de purificación inicialmente desarro-llados para disminuir la inmunogenicidad de lapreparación continúan siendo motivo de contro-versia. La demostración de la capacidad inmu-nogénica intrínseca de los islotes cuestiona sunecesidad.

Las técnicas de aislamiento no automatizadasrequieren mínimos recursos y los recuentos obte-nidos pueden, en principio, ser tan adecuados

como con los métodos automatizados, si bienmenos reproducibles. La sencillez del métodomanual fue la razón de elección en nuestro mode-lo. Aunque la técnica básica reproduce la descri-ta por Lacy y Kostianowsky, ha sufrido modifica-ciones. El procesamiento y cultivo, generalmenteaceptado a 37° se ha visto modificado por lademostración de que el cultivo a temperaturasentre 22 y 24° en primer lugar mejora la actividadde colagenosa y la tasa de aislamiento y ensegundo lugar colabora al desarrollo de inmuno-tolerancia destruyendo las células presentadorasde antígeno acompañantes del islote y que esti-mulan la vía directa de la respuesta inmune65.

Los resultados de nuestro estudio confirmanlos hallazgos de la literatura. La técnica manualde procesamiento y digestión permite induda-blemente la obtención de islotes, sin embargo elnúmero de los mismos es ampliamente variablecomo resultado de la falta de reproductibilidaddel procedimiento. La escasez de tejido conecti-vo en torno a los islotes en el páncreas del ani-mal joven hace que los mismos resulten enor-memente frágiles y con tendencia a la fragmen-tación, limitación que encontramos en nuestromodelo en el que se utilizaron animales con eda-des comprendidas entre 3 y 6 meses. La técnicaclásica de evaluación de los resultados de ladigestión que es el contaje de islotes equivalen-tes (definido islote equivalente como aquelmayor de 150 micras) resulta, en el caso delcerdo por tanto, inadecuada, motivo por el cualnuestros resultados se expresaron como núme-ro de islotes identificables mediante tinciónobtenidos. Los métodos automatizados disminu-yen el traumatismo sobre los islotes, consiguenresultados reproducibles y pueden ser utiliza-dos para procesar grandes cantidades de tejido,motivos que nos condujeron a la construcciónde una cámara automatizada según el diseñoanterior de Ricordi66.

La relación donante-receptor determina lacarga antigénica y por lo tanto la necesidad depurificación, la posibilidad de rechazo y la obliga-ción de inmunosupresión.

La elección de un modelo de autotrasplantenos permitió eliminar los factores de confusióninmunológicos y la inmunosupresión así como lanecesidad de purificación.

116


Tabla 5. Resultados. Número de islotes aislados

Peso del NIAisladospáncreas (g)

N Válidos 16 12Missing 4 8

Mediana 21,500 485000,00

Rango 33,0 1334000

Mínimo 13,0 16000

Máximo 46,0 1350000

Percentiles 25 15,625 300000,0050 21,500 485000,0075 37,500 685000,00

FIGURA 8. Imagen histopatológica. Tinción H-E. Islotesviables en el parénquima testicular.

El conocimiento de que el implante en unambiente hiperglucémico ejerce un efecto deleté-reo en la función y supervivencia del injerto jus-tifica la realización de una pancreatectomía par-cial en el modelo de autotrasplante en cerdo.

El pequeño volumen de la preparación obteni-da por la combinación de microdisección pancreá-tica y digestión enzimática hizo viable los diferen-tes lugares de implantación elegidos. Un determi-nante clave en la supervivencia a largo plazo delinjerto, es la posibilidad de neovascularizaciónque ofrece el lugar de implantación. Múltiplestrabajos experimentales han demostrado la posi-bilidad de supervivencia del injerto a nivel hepá-tico tras su infusión portal, esplénica y de la sub-cápsula renal así como a nivel testicular. Ennuestro trabajo el espacio subcapsular renal nopermitió la identificación de islotes tras su inyec-ción lo que podría estar en relación con la des-vascularización y denervación capsular del riñónobtenido para su trasplante. El ensayo del espa-cio submucoso de la vejiga que como lugar deimplantación reuniría las características de acce-sibilidad y adecuada perfusión tisular permitió laidentificación de islotes en el animal de experi-mentación. Así mismo, se identificaron islotes anivel testicular por vía intracanalicular retrógra-da. El testículo se ha propuesto como lugarinmunoprivilegiado que sustenta aloinjertosvariados, aunque en el momento actual el meca-nismo responsable y el papel último de la célulade Sertoli no se conocen.

CONCLUSIONES 1. La técnica de digestión enzimática manual

permitió la obtención de islotes pancreáticos enun modelo en cerdo.

2. La escasa reproducibilidad de la técnicahace aconsejable la utilización de técnicas auto-matizadas.

3. La viabilidad de los islotes resultado de ladigestión pancreática fue inicialmente demostra-da por su tinción con el colorante vital DTZ trassu permanencia en cultivo.

4. El implante de los islotes obtenidos en elespacio subcapsular del injerto renal no permitióla supervivencia de los mismos como probableconsecuencia de la desvascularización y denerva-ción de la cápsula renal.

5. La supervivencia del implante testicularintracanalicular aporta una nueva vía de accesoque no requiere la punción directa del parénqui-ma testicular.

6. Por primera vez, se demostró la viabilidadde la submucosa vesical como lugar de implante.

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Correspondencia autora: Dra. V. Gómez Dos SantosUnidad de Urología. Fundación Hospital AlcorcónBudapest, 1 - 28922 Alcorcón (Madrid). Tel.: 916 219 400E-mail autora: [email protected]ón artículo: Original

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