Transferencia de Métodos de HPLC a UHPLC: …2.1mm x 50mm 1.8µm 1.00ml/min, 40 C Grad.: 35-95% en...

1

Transferencia de Métodos de HPLC a UHPLC: Estrategias y Criterios de Selección de Columnas.

Álvaro Arnau

Responsable de

Ventas

Agenda1. Introducción y Fundamentos UHPLC

2. ¿Cómo transferir métodos entre

HPLC y UHPLC?:

• Estrategias de Traspaso de Métodos

- Isocrático y Gradientes Concentración

• ¿Cómo reducir tiempos sin sacrificar resolución?.

• ¿Cómo ganar resolución manteniendo tiempos de

análisis?.

• Criterios de Selección de Columna

- Longitud y Tamaño Partícula

- Fase estacionaria y tipo de columnas

- Diámetro

3. Conclusiones.

Página: 22-58m 11:00-12:00

UHPLC “versus” HPLC: Definiciones

1. La columna (tamaño de partícula y tipo) es quien define la

modalidad de trabajo (UHPLC/HPLC), NO el cromatógrafo.

• HPLC: partículas de 3.5 y 5µm.

• UHPLC:

– partículas totalmente porosas <2 µm.

– partículas superficialmente porosas 2.7 µm

2. El cromatógrafo debe estar adaptado al VOLUMEN

y PRESIÓN de la columna utilizada.

• El volumen muerto (por donde circula la muestra) debe ser:

Conexiones+ Celda detector ~≤ 0.02 x V0 columna <0.1x V pico

– Se deben utilizar capilares y celda adecuados.

• El volumen de retardo del gradiente se recomienda no sea muy superior al Vo de la columna (el retardo definirá el d.i, de la columna a utilizar).

• La presión máxima del cromatógrafo deberá ser adecuada a la LONGITUD y TAMAÑO DE PARTICULA de las columnas utilizadas.

¿Porqué la Tendencia de pasar de HPLC UHPLC?

UHPLC responde a la cada vez mayor presión para:

1. Analizar un mayor nº de muestras.

2. Reducir los tiempos de análisis.

3. Reducir costes: mayor nº muestras/instrumento, menor

consumo disolvente

4. Aumentar Resolución para analizar muestras más

complejas: con un mayor nº de analitos a controlar.

5. Combinando UHPLC con Espectrometría de Masas mejorar

los límites de cuantificación y especificidad: UHPLC/MS (o

LC/MS).

Página: 4

5

INCISO:

Resolución en HPLC

Eficacia Selectividad Retención

2.1mm x 50mm 1.8µm

1.00ml/min, 40°C

Grad.: 35-95% en 0.9 min

Analysis Time= 1.1min

UHPLC, 40°C

10x faster

PW = 0.5 sec

min0.2 0.4 0.6 0.8 10

Aportaciones Ejemplo de Mejora de Velocidad HPLC vs UHPLC Agilent

1200-RRLC (UHPLC-600bars)

HPLC, 40°C

PW = 3.4sec

4.6 x 150mm, 5µm

1.20ml/min, 40°C

Grad.: 35-95% en 10.8 min

Analysis Time = 11minmin0 2 4 6 8 10

0.2 0.60 0.4 min

2.1mm x 50mm 1.8µm

2.40ml/min, 95°C

Grad.: 35-95% en 0.38 min

Analysis Time: 0.4min

Presión < 600bars

UHPLC, 95°C

27x faster

PW = 197msec

150mm > 50mm: 3x

1.2ml/min on 4.6 > 2.4ml/min on 2.1: 10x 3 x 10 = 30x

Hasta +20x más rápido que un HPLC. manteniendo la resolución

Página: 6

F xTg /

V0

1.2 x10.8

/1.5 =

8.6

1.0 x 0.9

/0.1 =

9.0

2.4x0.38

/0.1=

9.1

4.6 x 150, 1.8um

490 bar

N = 28669

RS = 1.80 (+ 57%)

S/N = 44

7 Impurezas

Las 7 Separadas

a línea de base

4.6 x 150, 5um

93 bar

N = 7259

RS = 1.15

S/N = 42

Ejemplo de un cliente

Método Impurezas Isocr.

Zoom zona critica

rango tiempo @ 7min

4.6 x 150, 3.5um

165 bar

N = 14862

RS = 1.37 (+19%)

S/N = 50

7 Impurezas

6 No Separadas

a línea de base

Aportaciones Ejemplo de Mejora de Resolución HPLC vs UHPLC con Columnas de 150mm x 1.8µmEjemplo con muestra compleja: hasta un 60% de Mejora en la Resolución Manteniendo Tiempo de Análisis

4 Impurezas

2 No Separadas

a línea de base

HPLC UHPLC

Página: 7

Fundamentos de la UHPLC:

1. Ecuación de Van Deemter:

• Capacidad de poder trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia, con columnas:

- De pequeño tamaño de partícula totalmente porosas (TP <2µm).

- Fino espesor de fase estacionaria; columnas núcleo sólido superficialmente porosas (SP 2.7µm).

- Éstas además proporcionan más eficacia.

2. Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:

• La capacidad de separación de picos trabajando con gradientes de concentración es directamente proporcional al flujo de trabajo y al tiempo de gradiente subir el flujo permitirá mejorar la separación con gradientes.

Página: 8

k α F x Tg k = (87 x F x Tg) / (Δ % x V0 x S)

1.-Fundamentos UHPLC: Ecuación de Van Deemter Partículas pequeñas proporcionan Mayor Eficacia y ésta NO se reduce a flujos elevados

Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18

Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m)

Eluyente: 85:15 ACN: Agua

Velocidades de flujo: 0,05 – 5,0 mL/min

Temp: 20°C

Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente

1/ 2.5

+ EFI

CA

CIA

-

HPLC:EFICACIA A FLUJOS ALTOS:

EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS

Partícula H_min

5 μm 9,1 μm

3,5 μm 5,8 μm

1,8 μm 3,7 μm

N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm)

1.6 x Rs(5µm)

0.0000

S.T.M.: Sub Two Microns

Ultra Fast LC

Particulas1,8 μm a 5ml/min* dan más eficacia

N(1.8µm) = 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm)

* 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I.

HPLC

GC: Diám. col. cap.

Espesor film f.estac. N

Página: 9

o Poroshell 120

+ info en Anexo final

H (HEPT) = A + B/u + C x uA: Difusión de Eddy

B: Difusión Longitudinal

C: Resistencia a la transferencia de materia

2.- Fundamentos UHPLC: Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes

• S: definirá la “sensibilidad” del analito a variaciones en la proporción de modificador orgánico.

• Valores típicos S: aumentan con el tamaño de la molécula

2-5 moléculas pequeñas / 10 moléculas grandes (péptidos) / 40 moléculas muy grandes (proteínas)

• Al aumentar el tamaño de la molécula aumenta su “sensibilidad” a cambios de composición del eluyente.

k = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

Parámetro dependiente de:

• Analito

• Modificador Orgánico

Volumen muerto de la columna

% de incremento de Modificador OrgánicoTiempo del gradiente (min)

Flujo (ml/min)

“Factor de Retención o Capacidad” en Gradientes

Página: 10

• La Capacidad de Separación de picos en Gradientes es DIRECTAMENTE

proporcional al FLUJO.

• Flujos elevados permiten maximizar el poder de separación en gradiente por

unidad de tiempo: Doblar el flujo produce la misma mejora en resolución que

doblar el tiempo del gradiente!!!

• P. Petersson et al., J.Sep.Sci, 2008,31, 2346-2357

• D. Guillarme et al., Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 3232–3243

k α F x Tg (sin cambiar de columna)

HPLC con GRADIENTES: NO es Imprescindible Cambiar de Columna para Reducir Tiempos SIN perder ResoluciónIncluso con tamaños de partícula de 5 y 3.5µm

• Sin cambiar de columna, ni de tiempo de gradiente, SUBIR el FLUJO, permitirá

mejorar la resolución/capacidad de separación.

• El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de

eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm.

k = (87 x F x Tg) / (Δ % x V0 x S)

• La capacidad de separación no cambiará si: F1xTg1 = F2xTg2

Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8

4.6x50, 3.5µm

Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min

Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3

B: Metanol

Flujo: 2 y 3 mL/min

Temperatura: 35°CMuestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam

2. Dipyradamole 3. Nifedipina

4. Lidoflazina 5. Flunarizina

1

2 3

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)

F1 = 2.0 mL/min

Tg1 = 3 min

3min

1

23

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)

F2 = 3.0 mL/min

Tg2 = 2 min

2min

Con Tg=3 y F=3 se obtendría:

+Resolución y un tiempo análisis < 3min

Página: 11

Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación GRADIENTE 10 min a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm

3mL/min

1mL/min

5mL/min 1290 Infinity Cuaternario

Columna: 5µm 4.6x150mm Eclipse XDB-C8

Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en 10 min

Flujo: 1, 3 y 5mL/min (pruebas respetando

Pmáx columna: 400bars) 40ºC.

Inyección: 2 µl muestra (1500ppm dimetilftalato y

dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o-

terfenilo en metanol)

8min

4.5min

3.3min

Al subir flujo se reduce el tiempo

y el ancho de los picos

Página: 12

FxTg= 10

FxTg= 30

FxTg= 50

Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación en ESCALA TIEMPO NORMALIZADA GRADIENTE 10 min a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm

3mL/min

1mL/min

5mL/minAl subir flujo en gradiente se reduce el tiempo y el

ancho de los picos y en especial de los del principio

mejora la capacidad de separación de picos

8min

4.5min

3.3min

Peak width:

0.0546

Peak width:

0.0242

Peak width:

0.0171

Peak width:

0.0496

Peak width:

0.0542

Peak width:

0.0696

Página: 13

Peak width:

0.0696

Peak width:

0.0446

Peak width:

0.0371

Flujo

mL/

min

Capacidad

Separación

Nº picos(ref.1º)

Capacidad

Separación

Nº picos(ref.3º)

1 35 30

3 45 35

5 55 40

• Nº de picos que se pueden

separar con resolución

hasta línea de base en

función del ancho en línea de

base del 1er (zona inicial) y

3er pico (zona central) del

cromatograma a distintos

flujos con la columna de 5µm

totalmente porosa.

• Eficacia (N) 5µm a 5mL/min =

½ de la N a 1mL/min

Al subir flujo aumenta el nº de picos que se pueden separar -INCLUSO con una

columna de 5µm- y además se reduce el tiempo e análisis.

FxTg= 10

FxTg= 30

FxTg= 50

¿Porqué se reduce el ancho del pico ?

Ejemplo

INCREMENTANDO

FxTg de 10 a 50

Agenda

1. Introducción

2. ¿Cómo transferir métodos entre

HPLC y UHPLC?:





análisis?.




- Diámetro

3. Conclusiones.

Página: 1429-41m

Estrategias Transferencia Métodos HPLC UHPLC

OBJETIVOS / Estrategias:

• Reducir Tiempos de Análisis SIN perder Resolución.

• Aumentar la Resolución SIN incrementar tiempo de Análisis.

HPLC UHPLC:

• Columnas HPLC 5 y 3.5µm UHPLC: 1.8µm (TP) o 2.7µm (SP).

Página: 15

* Trabajando con gradientes de concentración

Estrategias en el Traspaso de Métodos de

HPLC a UHPLC

Reducción de Tiempo*:

• Reducir la longitud y tamaño de partícula de la columna: cambio .a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).

• Aumentar el flujo.

• Aumentar la temperatura.

• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo).

Mejora de Resolución**:

• Reducir el tamaño de partícula manteniendo longitud columna: Cambio a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).

• Aumentar el flujo con gradientes de concentración.

• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo)

• Alternativa: acoplar varias columnas en serie de 5μm.

1.8 µm Máxima eficacia / min. ó cm columna.

5 µm Máxima eficacia / bar presión (pero ↑ tiempo)

Página: 16

* Manteniendo Resolución

** Manteniendo Tiempos

Conversión Métodos de HPLC a UHPLC/RRLC:

Estrategias en el Traspaso de Métodos









• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo)

• Alternativa: acoplar varias columnas en serie de 5μm.



Página: 17



22-38m

min5 10 15 20 25 30 35 40

mAU

0

5

10

15

20

25

30

Gradiente = 67min

Capacidad picos = 694 (10/min)

“Resolución GC”

Mapa péptidico de BSA digerida con tripsina con Agilent 1200-RRLC (SL)

Zorbax SB-C18, 2.1x150mm, 1.8µm

Página 18

min2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Gradiente = 30min

Capacidad picos = 540 (18/min)

Cromatografía de Alta Resolución con el Agilent

1200 RRLC (SL) + Columnas 1.8µm y 150mm

Capacidad de Separación de Picos: 700

Eficacia : 36.000 platos/columna 15cm x 1.8µm

(típica de columna GC de 10metros x 0.32mm)

8 Columnas x 5µm 200.000 platos/ 2 metros

Cromatografía de Alta Resolución por Acoplamiento en Serie de Columnas de 5μm

Página 19

0.4ml/min H2O/CH3CN 60/40 80ºC


4 Columnas en serie 5 x 25cm x 4.6mm - 5μm

8 Columnas en serie 8 x 25cm x 4.6mm - 5μm

1 Columna 25cm x 4.6mm - 5μm

70bars

177bars

360bars

20.000 platos

100.000 platos

200.000 platos

105min

14min

80ºc

Conversión Métodos de HPLC a UHPLC/RRLC:

Estrategias en el Traspaso de Métodos









• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo

• Acoplar varias columnas en serie de 5μm.



Página: 20



24-36m

Traspaso de Métodos Isocráticos a UFLC.

Columna referente: 5µm x 150mm (12.500 platos)

Long. Col. equivalentes Reducción del Tiempo de Análisis*

1.8µm 1/3 // 3.5µm 3/5 Flujo Constante Flujo x 2 Flujo x 3

1.8µm x 50mm

(12.000 platos)

1/3

30min10min

1/6

30min5min

1/9

30min3.3 min

3.5µm x 75mm

(10.500 platos)

1/2

30min15min

1/4

30min7.5min

1/6

30min5 min

3.5µm x 100mm

(14.000 platos)

2/3

30min20min

1/3

30min10min

2/9

30min6.7 min

La resolución será semejante a la original. La misma proporción aplica a D.I. 2.1 y 3mm*Nota: Reducción del tiempo de análisis calculada con respecto a columna de 150x4.6mm 5µm

**Incremento presión: +2% para 7.5cm x 3.5µm +35% para 10cm x 3.5µm +150% para 5cm y 1.8µm (∆P = f (η.u.L/ dp2))

1.- Reducir volumen inyección (proporcionalmente a reducción volumen columna).

2.- Subir Flujo (hasta p.e. 75% presión máxima columna/ instrumento).

3.- Mantener: composición y nº puntos muestreo pico (↑ Hz).

Página: 21

Ajuste de la Frecuencia de Adquisición de Datos: Compromiso entre Resolución Cromatográfica y Sensibilidad.

• Aumentar la frecuencia de adquisición de datos proporcionalmente a la reducción del tiempo de análisis.

- Ajustar “Peak width” adquisición al “width” de integración de los resultados del pico más fino de interés.

- Proporcionará unos 35-40 puntos de medición por pico para máxima resolución cromatográfica.

• Para óptima repetibilidad cuantitativa adquirir >15 puntos (15-20) (RSD< 1%).

• Para máxima sensibilidad ajustar a 8-10 puntos(RSD% ≈ 10-15%).

• El ruido se reduce con el aumento del nº puntos promediados:

• Ruido α ~ 1 / √ nº promedios

Página: 22

Parámetros Optimización Resolución Cromatográfica

Página 23

Rs= 2 (T1-T2) /( Wb1+Wb2) N= 5.54 ( Tr / w50%)1/2

α = (T2 – T0)/(T1 – T0) k = (Tr – T0) / T0

* Para picos de tamaños muy distintos se recomienda Rs > 2

Parámetro

Modificado

% Mejora

ResoluciónIncremento

Tiempo Análisis

Long. x 2 40% x 2

k: 0.5 2 100% x 2

k: 5 10 10% x 2 El incrementar la retención por encima de K’=5

apenas mejorará la resolución.

OBJETIVO Rs > 1.5 (2)*

1 < k< 10Rs= 0.25 N1/2 ((α- 1)/ α ) (k/(k+1))

RETENCIÓNPoder Eluotrópico Eluyente

% modificador OrgánicoSELECTIVIDADFase Estacionaria y Soporte

pH Fase Móvil (si pH próximo a pK)

Modificador Orgánico y su %

Aditivos Fase Móvil

Temperatura

EFICACIA√

Tamaño Partícula del RellenoLongitud de la ColumnaExcesivos Volúmenes Muertos (-)Flujo

ISOCRÁTICO:

k' k'/k'+1 T. análisis

0,2 0,17 1.2 x T0

0,5 0,33 1.5 x T0

1 0,50 2 x T0

2 0,67 3 x T0

3 0,75 4 x T0

4 0,80 5 x T0

5 0,83 6 x T0

10 0,91 11 x T0

20 0,95 21 x T0

La mejora de Resolución

es muy importante al

incrementar la retención

hasta K’= 5

Rs = f ( k/[k+1] )

0,2

0,5

1

2

34

510

20

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

k

k/(

k+

1)

k'/k'+1

La mejora de Resolución

es muy importante al

incrementar la retención

hasta k = 5

N= f(L/ 2dp)

Para mejorar resolución de picos con k > 5 (2) mejor

aumentar long. columna. Para k <2 reducir “poder

eluotropico” del eluyente

DISMINUCION 10% ORGANICO ===> k2 = (2 ó 3) x k1

Log k =aprox flineal(%orgánico)

Traspaso de Métodos con Gradientes

Página 24

Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8

4.6x50, 3.5µmGradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min

Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3

B: Metanol

Flujo: 2 y 3 mL/min

Temperatura: 35°CMuestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam

2. Dipyradamole 3. Nifedipina

4. Lidoflazina 5. Flunarizina

1

2 3

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)

F1 = 2.0 mL/min

Tg1 = 3 min

3min

1

23

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)

F2 = 3.0 mL/min

Tg2 = 2 min

2min

Si k se mantiene constante el poder de separación no variará

Página: 24

Se mantendrá constante el factor de retención en cada punto (%) del gradiente

FxTg = 6 FxTg = 6

k = (87 x F x Tg) / (Δ % x V0 x S)

• La capacidad de separación no cambiará si: F1xTg1/V0 col.1 = F2xTg2/V0 col.2

Comparación Estrategias Mejora de la Resoluciónk = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

Columna: ZORBAX SB-C8

Gradiente: 20 – 60% B en 10 min o 60 min

Fase Móvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2

B: Acetonitrilo

Flujo: 1.0 mL/minTemperatura: 35°C

Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine

5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor

Tg = 10 min

4.6 x 150 mm, 5 µm

N = 12,000

V0=1.5ml

15min

1,2

34 5

6

7

8

0 5 10 15Time (min)

• Aumentar Tg (el resto de parámetros no se modifican )1

Tg = 60 min a 1mL/min 4

2

0 25 50Time (min)

3

5

8

6

7 40min

4.6 x 150 mm, 5 µm

N = 12,000

V0=1.5ml

Tradicional

• Reducir V0 y Subir Flujo4.6 x 75 mm, 3.5 µm V0=0.75ml

N = 10,000

Tg = 15 min a 2mL/min

“Moderna”:

Si k se aumenta (↑Tg, ↑F, ↓V0) el poder de separación mejorará.

Página: 25

Time (min)0 5 10

2

3

45

67

8

1

7min

1x10/1.5= 6,7

2x15/0.75= 40

1x60/1.5= 40

¡¡¡Se reduce Tiempo análisis

a 1/6 pero se mantiene la

Separación !!!

¿Cómo mejorar?

Transferencia de métodos de HPLC a UHPLC

www.agilent.com/chemInstruments

Liquid Chromatography

Buscar: Method translator

Página: 26

http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe

para descargárselo (6Mb – requiere Flash Player).

¿Criterios Selección Columna UHPLC?

http://www.agilent.com/chem

http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe

Agenda

1. Introducción

2. ¿Cómo convertir métodos entre

HPLC y UHPLC?:





análisis?.




- Diámetro

3. Conclusiones.

Página: 2740-20m

Selección de la Longitud Columna y Tamaño de Partícula del Relleno“versus” Eficacia

• Reduciendo Longitud y Tamaño de partícula, pero manteniendo el nº platos proporcionados

por la columna, se conseguirá reducir el tiempo de análisis y consumo de disolvente sin perder

Resolución.

• La eficacia aumenta con la reducción del tamaño de partícula ( N= f(L / 2dp) )

• El tiempo de análisis se reduce acortando la longitud de la columna. ( Tr = f(L / F) ).

Recomendación Columna UHPLC: 5cm gradiente ≤ 5min, 10cm para 5-30min, 15cm para > 30min

Página: 28

% Ahorro

Tiempo/

Disolvente

Longitud

(mm)

Eficacia

N (5 µm)

Eficacia

N (3.5 µm)

Eficacia N(1.8

µm) ( 2.7 µm

SP)

- 0% 150 12.500 21.000 36.000

- 33% 100 8.500 14.000 24.000

- 50% 75 6.000 10.500 18.000

- 67% 50 4.200 7.000 12.000

- 80% 30 2.500 4.200 6.500

- 90% 15 1.250 2.100 2.500

Selección Longitud y Tamaño Partícula:

Tipo Cromatógrafo

(Presión Máxima)

“Máxima” Longitud Columna*

1.8µm (TP)** Poroshell-120

2.7µm (SP)**

400 (“HPLC”) 5 (10) cm 10 (15) cm

600 (“UHPLC”) 10 (15) cm 15 (20) cm

1200 (“UHPLC”) 25 (30) cm 35 (40) cm

* En UHPLC suele utilizarse acetonitrilo (eluyente contemplado en esta tabla); el utilizar metanol reducirá los flujos máximos de

trabajo (especialmente con contenidos de agua alrededor del 60%).

** TP: Totalmente Porosa *** SP: Superficialmente Porosa; las columnas SP permiten utilizar columnas entre un 40 y 60% más largas

que las TP (o trabajar a flujos mayores). *** L(3.5µm) 3/5 L(5µm)

.

Equivalencia Eficacia columnas UHPLC1.8µm TP (total. porosas) ó 2.7µm SP (superf. porosas)

Columnas HPLC3.5 µm 5 µm

5 cm 10 cm 15 cm

10 cm 20 cm 30 cm

15 cm 30 cm 45 cm

L (1.8µm TP o 2.7µmSP) 1/2 L(3.5µm) 1/3 L(5µm) ***

+ info en Anexo finalPágina: 29

TPTotalmente

Porosas SPSuperficialmente

Porosas

Poroshell 120: 2.7µm

NO es imprescindible un cromatógrafo de Alta Presión (600-1200bars) para trabajar en UHPLC

Agilent LC calculator- version web:

http://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Columns-Sample-Preparation/LC-LC-MS-Columns/Pages/lccalcweb.aspx

Viscosidad “versus” Composición Orgánico/Agua.En UHPLC se suele utilizar Acetonitrilo

Tener en cuenta:

La alta viscosidad de las mezclas metanol/agua (máximo a 40/60)

Perfiles de Presión con Gradientes Concentración.

Perfil de Concentración

Presión CH3-CN / H2O

Presión CH3OH / H2O

3 3

η

0 20 40 60 80

1

2

1

2

Vis

cosid

ad

[cP]

a 20º C

100%

n-Propanol

Etanol

Metanol

Acetonitrilo

Este gráfico es útil para poder calcular relaciones

aproximadas de viscosidad entre distintas

composiciones de eluyentes y poder calcular

presiones equivalentes: p.e. 100 bars con CH3-CN/H20 70/30 equivalen a

100 x (1.3/0.6) = 217 bars con CH3OH/H20 70/30

η ~ 0.6

η ~ 1.3

70/30 org. /agua

CH3OH

CH3CN

% Orgánico[w/w]

Gradiente 10100%

Metanol

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

Bar25 o C (355b)

80ºC (140bars)

50ºC (220bars)

ºCPosible Δ flujo con

respecto a 25ºC

50ºC x 1.6

80ºC x 2.5

Página: 30 + info en Anexo final

Traspaso de Métodos de H20/CH30H a H20/CH3CN. Composiciones Fase Móvilcon Fuerza Eluotrópica Equivalente

Acetonitrilo / Agua (da menor presión)

Metanol / Agua

Tetrahidrofurano* / Agua

%MeOH %ACN %THF

20 15 10

40 30 25

60 50 38

80 72 53

100 98 72

%ACN %MeOH %THF

20 30 18

40 50 30

60 72 45

80 85 58

100 >100 72

%THF %MeOH %ACN

20 35 28

40 65 55

60 88 82

80 >100 >100

100 >100 >100

72%

53%

80%

En UHPLC se recomienda trabajar con fases poco viscosas

* Con THF, solventes clorados y acetato etilo, la vida de las juntas de equipos de +1000bars se reduce.

Página: 31

Agenda

1. Fundamentos de la UHPLC:

• Ecuación de Van Deemter


HPLC y UHPLC?:




- Fase estacionaria y tipo de

columnas.

- Diámetro

3. Conclusiones.

Página: 3245-15m

Selección Fase Estacionaria (Relleno)

• Si es posible, mantener el mismo relleno que en HPLC

simplemente cambiando tamaño partícula (p.e. Zorbax XX).

Muchas fases de HPLC NO están disponibles en formato

UHPLC.

• Si NO se quiere revalidar de nuevo los métodos al transferir

HPLCUHPLC, la limitación en la reducción de tamaño de

partícula en métodos validados obliga a pasar de rellenos

5µm (TP) a 2.7µm (SP)*.

• Con HPLC convencionales (400 bars) es mejor utilizar

rellenos SP de 2.7µm.

* EUP sólo admite reducir tamaño partícula en isocrático.Página: 33

Núcleo

Sólido

1.7um

} 0.5µm

2.7

µm

¿Tipo de Columna: Superficial o Totalmente Porosas?

Superficial Totalmente Porosa

Poroshell-120 reduce 40-50% de presión con similar resolución

2.7µm (capa porosa: 0,5µm)

1.8µm

Ventajas Poroshell 120:

• Reducir la presión para aumentar el flujo.

Importante con HPLC de 400 bars

• Mejorar la resolución en Métodos USP con 5µm

(2.7µm <50% en disminución del tamaño de partícula).

• Robustez: fritas 2µm (en lugar de 0.5µm de las de 1.8µm)

Ventajas 1.8µm Totalmente Porosas:

• Mayor surtido de fases.

• Zorbax 1.8-3.5-5µm con idéntica

selectividad.

• 10-20% más eficacia/cm.

Página: 34

Poroshell -120


Muestra de tranquilizantes

Columna: Porosa superficial

Poroshell-120 50 x 2.1mm, 2.7um

Flujo 3.5ml/min, ~ 700 barGradiente 2-92% ACN en 0.4min

T= 80 °C

0.095sec PW

0.140secPW

Agilent 1290 Infinity UHPLC: Poder de

separación con todo tipo y marcas de columnas

Columnas Superficialmente Porosas:

permiten muy elevadas velocidades lineales

con elevada resolución y menor presión

0.5 s

Núcleo

Sólido

1.7um

} 0.5µm

2.7µm


Selección del Tipo de Fase Estacionaria con Columnas ZORBAX 1.8µm

• Utilice el mismo tipo de Zorbax: muy fácil escalabilidad debido a la

idéntica selectividad de Zorbax - independiente del tamaño de

partícula (5, 3.5,1.8µm) y dimensiones de la columna.

• Zorbax Eclipse Plus / XDB para separaciones a

pH’s intermedios y traspaso de columnas de otros fabricantes (excepto a pH’s extremos).

• Zorbax Stablebond (SB) para separaciones a pH muy ácidos (hasta pH 0.8) y/o a Alta

Temperatura hasta 90° C (100ºC).

• Zorbax Extended para separaciones a pH básicos (hasta pH 11.5 y 40ºC),

HPH para pH’s básicos y temperaturas elevadas (hasta pH 11.0 y 60ºC).

• Excelente tiempo de vida y resistentes a las más altas presiones gracias a la alta

resistencia mecánica de las partículas ZORBAX (+1300 b) .

• En equipos 400-600bars utilice Zorbax 1.8μm de 600bars*. Reducen la presión de trabajo en >20%,

gracias a su distribución asimétrica del tamaño de partícula ingeniada por Agilent.. Las de 400bars (año

2003 distribución simétrica tamaño partícula) generan más presión que las de 600bars.


* alternativa: Poroshell

Agenda

1. Fundamentos de la UHPLC:

• Ecuación de Van Deemter


HPLC y UHPLC?:




- Nuevos tipos de columnas para

poder hacer UHPLC en HPLC's

convencionales (Poroshell).

- Diámetro

3. Conclusiones.

Página: 3749-11m

Selección Diámetro Columna según Tipo Instrumento

• Mantener d.i. en métodos validados (o reducirlo en un máx.25% EUP).

• La selección del d.i. de la columna (2.1 a 4.6mm) dependerá de:

• 1.- Flujo Máximo del sistema de bombeo:

- Flujos “elevados”: 0,6mL/min (2.1mm d.i.) 1.2 mL/min (3mm d.i.) 3mL/min (d.i. 4.6mm).

Tipos Instrumentos UHPLC

- Presión máx.≈ 1000-1300 bars y Flujo máx. 5 – 10 mL/min. (Fluj. elev. todo tipo columnas)

- Presión máx.≈ 1000-1300 bars y Flujo máx. 1 -2 mL/min (Fluj. elev. sólo columnas 2-3mm d.i.)

- Presión máx.≈ 600 bars y Flujo máx. 5 – 10 mL/min (Fluj. elev. columnas SP)

- UHPLC’s que permitan llegar a 5 mL/min permitirán obtener todo el rendimiento de las columnas Superficialmente Porosas y de columnas con 4.6mm d.i.

• 2.- Tipo de sistema de Bombeo/ Generación del Gradiente:

• Con 2.1mm d.i. se recomiendan sistemas de mezclado en alta presión.

• Con 4.6mm d.i. se puede utilizar cualquier sistema de mezcla (alta o baja presión).

Página: 38

Con columnas UHPLC el trabajar a flujos elevados

permitirá mejorar la capacidad de separación en gradientes

El flujo máximo es un parámetro clave en un UHPLC

Tipos de Sistemas de Generación de Gradientes Distinto volumen de retardo del Gradiente de concentración

El volumen de retardo se recomienda no sea superior al Vo de la columna

V0 (col. 4.6mm d.i.) 1mL /10cm – V0 (col. 2.1mm d.i.) 0.2mL /10cm V0 (col. 3mm d.i.) 0.43mL /10cm

Gradientes con Mezclado a Baja Presión

(en válvula proporcional)

Válvula proporcional

Mayor volumen de retardo – NO configurable600-900µL / (<350 1290 cuaternario)

Bombas cuaternarias 1100,1200, 1220, 1260 y 1290

Página: 39

sólo 1220/1260*

Gradientes con Mezclado a Alta

Presión

Menor volumen de retardo – Configurable

120-800µL (1100,1200,1260) // 10-45µL (1290)

Bombas binarias 1100, 1200, 1260 y 1290

Amortiguador /Damper (no en los 1290)*


*Los modelos 1290 NO llevan “Damper”

Mixer

Ejemplo Distintos Volúmenes Retardo del Gradiente

Pág.:

Programa de gradiente teórico

1290 gradiente real

1200 gradiente real

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

0

50

100

150

200

250

300

350

400

min

mAU

Inyección

ISET: Las mismas condiciones de gradiente

pero desplazando el gradiente y emulando el

perfil del gradiente a clonar.

ISET-1290: Tecnología de Emulación Inteligente de otras bombas

Fruto de la mayor precisión del 1290 y su menor volumen de retardo del gradiente.

¿Cómo trabaja un 1290 emulando un 1200?:

1290 binarioMezcla alta

presión

1200 cuaternario: mezcla en baja presión mayor duración

de la etapa isocrática al principio de todo gradiente

teórico

Equipos Emulados ISET-3:

• Agilent: 1100,1120,1200,1220,1260 binarios y cuatern., 1290 cuat.

• Waters: Alliance, Acquity UPLC, Acquity H-class.

• Shimadzu: LC-20AT, LC-20AB.

• Emulación “genérica”: para “emular” cualquier instrumento

especificando su volumen de retardo.

Emula Volumen de Retardo

Emula Pendiente Grad.

+ Comportamiento Mezcla


Ejemplo Impacto de Distintos Volúmenes de Retardo: Reproducción de Analisis en

Gradiente con diferentes HPLC´s: Columna: 3 x 50 mm, 2.7 µm Poroshell

min1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Rs= 1.90 1100 Series Binario LC(configurado con mixermayor vol.)

1290 Infinity LC- El gradiente llega antes

Rs= 1.15

Me

tam

itro

n

Chlo

rid

azo

ne

Sim

azin

e

Chlo

rto

luro

n

Diu

ron

Pro

pa

zin

eTe

rbu

tyla

zin

e

Pro

me

tryn

Cya

niz

ine

1290 Infinity LC

with iSET

Rs= 1.87

Página: 41

Influencia del Volumen Muerto en la Eficacia

Página: 42+ info en Anexo final

V0 500µL

V0 500µL

V0 100µL

Flujos ajustados al d.i. de la columna:

4.6 mm columna 1 mL/min

3 mm columna 0.43 mL/min

2.1 mm columna 0.21 mL/min

Ejemplo para compuesto con K’=4

Columna:

50 mm long.

1.8 µm tam. part.

*

* Volumen dispersivo: el que recorre la muestra fuera de la columna ** 0.12mm recomendado para columnas de 2-3mm d.i.

Típico 60 cm capilar 0.12mm = 7µL + X µL celda + Y µL vol. Inyectado total > 10µL

20uL/500uL = 4% del V0 columna

6uL/100uL = 6% del V0 columna

Volumen muerto conexiones+celda detector < 0.02 x V0 columna <0.1x V pico

d.i. mm capilar V0 µL/cm.

0.17 mm 0.227 µL/cm

0.12 mm ** 0.113 µL/cm

0.075 mm (ss) 0.044 µL/cm

0.025 (sílice fundida) 0.0047 µL/cm

Columnas de menor d.i. exigen utilizar capilares más finos y cortos, también reducir el volumen de inyección proporcionalmente

Agenda

1. Introducción


HPLC y UHPLC?:





- Fase estacionaria y tipo de

columnas

- Diámetro

3. Conclusiones.

Página: 4354-6m 11:00-12:00

44

Transferencia de Métodos de HPLC a UHPLC: Estrategias y Criterios de Selección de Columnas.

Resumen

• Reducir Tiempo Análisis sin perder Resolución:

• Reducir tamaño de partícula y longitud de la columna pero manteniendo constante nº platos columna . (15cm x 5µm = 10cm x 3.5µm = 5cm x 1.8µm).

• Maximizar Resolución Manteniendo los Tiempos:

• Reducir tamaño de partícula y mantener la longitud de la columna (p.e. 150mm x 1.8µm). Requiere un equipo de alta presión.

Alternativa; aumentado tiempo de análisis: acoplar varias columnas en serie de 5µm.

• Columnas Superficialmente Porosas (Poroshell 120):

• Permiten trabajar en UHPLC con HPLC’s convencionales.

• Poder trabajar a mayores flujos (que las de 1.8µm) para reducir sus tiempos de análisis e incrementar la capacidad de separación y resolución en gradientes.

Capacidad de separación en gradientes proporcional a F x Tg / V0 Trabajar a flujos elevados permite mejorar la capacidad de separación en gradientes de concentración.

Transferencia de Métodos de HPLC a UHPLC: …2.1mm x 50mm 1.8µm 1.00ml/min, 40 C Grad.: 35-95% en...

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