ELECTROFORESISLa electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o cidos nucleicos) sobre la base de su tamao molecular y carga elctrica. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separacin se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando por la malla, por la que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida.Bsicamente, la electroforesis se define como un transporte bajo la accin de un campo elctrico. El parmetro que determina el comportamiento de una molcula bajo la accin de un campo elctrico se denomina movilidad electrofortica (U) y se define como la relacin entre la velocidad de migracin por unidad de campo elctrico.La velocidad de migracin de un sistema electrofortico es el valor caracterstico de la molcula y del campo elctrico. Esta es inversamente proporcional a la viscosidad del medio, directamente proporcional a la fuerza aplicada al campo y a la carga neta de la molcula.No existe una relacin clara entre dicha movilidad electrofortica y el resto de parmetros moleculares, aunque se sabe que depende de forma bastante compleja de la carga, la forma y el tamao de las molculas; esto es debido a que, por ejemplo, la carga de las molculas depende del medio (pH y fuerza inica) y, adems, en disolucin las molculas estn rodeadas de un conjunto de iones que forman una esfera de solvatacin, de tal forma que bajo la accin de un campo elctrico se desplaza todo el conjunto, aunque la esfera de solvatacin hacia el polo opuesto que la molcula.EQUIPAMIENTO ELECTROFORTICOPara llevar a cabo una separacin electrofortica se necesitan los siguientes elementos:

Fuente de alimentacin. Proporciona el campo elctrico mediante dos electrodos, uno positivo (nodo) y otro negativo (ctodo) entre los que se establece una diferencia de potencial.

Cubeta. Recipiente en cuyos extremos se sitan los electrodos.

Soporte electrofortico.

El elemento fundamental es el soporte. Aunque todas las electroforesis responden a un mismo principio, las de zona pueden ser de distintos tipos en funcin del soporte que se utilice. En todos los casos, la muestra se dispone inicialmente en una pequea zona del soporte, y posteriormente lo va recorriendo impulsado por el campo elctrico.El soporte es un material insoluble en medios acuosos. Para armarlo primero se prepara la solucin Buffer, luego se disuelve el gel que se vaya a utilizar y posteriormente se agrega el molde para la gelificacin

MODOS DE DISPOSICIN DEL SOPORTE1) Horizontal: Con esta disposicin casi siempre el tampn cubre al gel, esto se hace para evitar que ste se seque debido al calentamiento sufrido al pasar la corriente. El soporte queda impregnado de disolucin tampn, disuelve la muestra y mantiene el contacto elctrico. La muestra se deposita como una gota con una pipeta o un aplicador especfico

2) Vertical: Se usa casi exclusivamente cuando el soporte es gel de poliacrilamida. El gel se dispone entre dos placas rectangulares. La muestra se deposita en los pocillos con micropipetas. Esta disposicin sirve tanto como para electroforesis continuo (un solo tipo de gel) o electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composicin ligeramente diferente)

TIPOS DE SOPORTESe clasifican en dos grupos:1) Soportes No Restrictivos Tipo I.El Tamao de poro no se opone al paso de las molculas. El agar es el ejemplo ms representativo y se obtiene a partir de algas marinas y est formado por dos tipos de polisacridos: la agarosa y la agaropectina; sta ltima posee varios grupos cargados (grupos carboxilo y sulfato), lo que la hacen inadecuada como soporte electrofortico por el efecto electroendosmtico que produce. La agarosa se utiliza ampliamente sobre todo para la separacin de cidos nucleicos y para el anlisis de protenas. Los diferentes tipos de agarosas se caracterizan por su punto de fusin (entre 35-95C), su resistencia fsica y el grado de electroendsmosis.

Estructura qumica de la agarosa, polisacrido lineal formado por la repeticin de la estructura bsica (agarobiosa), con un peso molecular medio de 120kDa (que corresponde a unas 400 unidades). Las caractersticas de la agarosa se ven modificadas dependiendo de la naturaleza de los diferentes radicales R.La agarosa en polvo se aade sobre el tampn de electroforesis y se calienta a unos 100C para que se disuelva; la mezcla caliente se deposita sobre un molde colocado sobre un cristal. La disolucin gelifica al enfriarse, momento en el cual puede retirarse el molde. Las dimensiones y el grosor del soporte corresponden, por tanto, a las del molde y la cantidad de disolucin de agar utilizada. Las propiedades del gel de agar se modulan a voluntad variando la cantidad de agar, y as el tamao de poro, que suele ser lo ms crtico, depende de la concentracin de agar empleada en la disolucin y nunca se conoce con exactitud, ya que durante el proceso de preparacin del gel hay prdidas de agua.Preparacin de un gel de agarosa.

1El molde de plstico se adhiere a una placa de vidrio utilizando grasa.

2La disolucin de agarosa caliente se deposita sobre el cristal.

3Una vez gelificada la agarosa, se retira el molde, quedando el gel preparado para la electroforesis.

2) Soportes Restrictivos Tipo II.El tamao de poro si opone resistencia al paso de las molculas. El ejemplo caracterstico son los geles de poliacrilamida, que no slo evitan la conveccin y minimizan la difusin, sino que adems participan en el proceso de separacin. Estos geles son medios porosos en los que el tamao de poro es similar al de las protenas, de tal modo que existe un efecto de tamizado molecular y la separacin electrofortica depende de la densidad de carga de las molculas y de su tamao.MEDIOS DE SOPORTE USADOS EN LA ELECTROFORESISSon: Acetato de celulosa, papel filtro, geles y capilares*** Papel filtro: Mtodo sencillo y rpido que se usa bsicamente para la separacin de protenas oligonucletidos, carbohidratos y lpidos

Las desventajas de usar papel filtro son:1) si el papel es muy fino se puede desgarrar fcilmente y si el papel es grueso las bandas se distorsionan2) Ocurre interaccin entre las protenas y los hidroxilos de la celulosa del papel, ocasionando que la migracin frene*** Acetato de celulosa: se usa en anlisis de fluidos bilgicos, fundamentalmente se emplea en corridas de corto tiempo y con cantidades pequeas. La desventaja de usar este medio como soporte es que contiene algunos grupos carboxlicos y sulfatos que pueden frenar la migracin*** Geles: son polmeros de red tridimensional, se pueden usar geles de almidn, poliacrilamidas, agarosa y agarosa-poliacrilamidas, de los cuales el ms usado es el gel de poliacrilamida. Es una tcnica barata, fcil, rpida y eficaz para resolver mezclas complejas de protenas.*** Capilar: generalmente se usa un capilar de slica fundida que normalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia. Tiene una ventaja y es que el capilar permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualizacin es on-line. Con esta tcnica descrita es posible separar cationes, aniones, protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea.

Las desventajas son que se requiere el uso de elevados voltajes, el costo es mayor y la muestra debe ser en pequeas cantidades

TCNICAS DE REVELADO O DETECCINSe pueden emplear sustancias coloreadas o fluorescentes que se unan a las protenas o los cidos nucleicos. Las tcnicas de revelado son 2:1) Por anlisis del gel Autorradiografia: tanto protenas como cidos nucleicos pueden marcarse isotpicamente previamente a la electroforesis, en cuyo caso la deteccin se hace mediante autorradiografia del gel.

Teido o tincin: suelen utilizarse colorantes orgnicos que interaccionen con las protenas de forma poco selectiva, principalmente electrosttica. Entre esas sustancias tenemos: azul brillante de Coomassie, negro amido, rojo Ponceau. Para los cidos nucleicos se usa el azul de metileno, o ms frecuentemente, compuestos fluorescentes e intercalantes como el bromuro de etidio. (Compuesto intercalante: aquel que se introduce entre los pares de bases apilados del ADN). Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolucin del colorante y se espera a que aqul se impregne y as el colorante se una a las molculas separadas en el gel. Finalmente la observacin se puede realizar por luz ultravioleta

2) Por transferencia Southern Blot: permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de ste cido nucleico. Para ello, se desnaturalizan las molculas de ADN y se transfieren a la superficie de una membrana de nailon, ya que es capaz de conservar la distribucin espacial del ADN. Luego se emplea una sonda radioactiva la cual debe ser capaz de hibridar al ADN y de marcarlo con un istopo radiactivo para facilitar asi la deteccin de las molculas.

Northern Blot: con esta tcnica es posible detectar molculas de cido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja. Primero se toma la mezcla de ARN y se somete a electroforesis en gel para separar los fragmentos de acuerdo a su tamao. Luego se transfiere el gel a una membrana cargada positivamente en la que se efecta la hibridacin del ARN para posteriormente marcarlo radiactivamente y hacer fcil su deteccin.

Western Blot: se emplea para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos. Primero se transfieren las protenas desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de polifluoruro de vinilideno (PVDF). Esta transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin de un campo elctrico. Las membranas que se utilizan con el western blot se caracterizan por unir protenas de forma especfica, es decir, se adhieren a todas las protenas con idntica afinidad.Todas las tcnicas se deben al bilogo ingls Edwin Southern.

CRITERIOS DE SEPARACIN1) Electroforesis Analtica: orientada a la bsqueda de propiedades de un solo componente2) Electroforesis preparativa: orientada a la separacin entre gran cantidad de componentes

TIPOS DE ELECTROFORESIS1) Electroforesis libre.El campo elctrico se aplica a disoluciones o suspensiones (figura 1). Histricamente, es el origen de la electroforesis tal y como hoy la conocemos y fue desarrollada por Arne Tiselius en 1937. Actualmente est en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla, tiene poco poder de resolucin.

Las molculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no bien separadas por tratarse de una disolucin.2) Electroforesis en zona.Es una de las tcnicas ms utilizadas en bioqumica y biologa molecular por su elevada resolucin. El campo elctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo (figura 2). Con esta tcnica cada partcula migra de acuerdo a su propia movilidad.

Electroforesis de zona sobre un soporteLa electroforesis en zona incluye las siguientes tcnicas especiales:1) Inmunoelectroforesis (IEF)Es una combinacin de una electroforesis en geles de agarosa seguida de una inmunodifusin. En la primera parte, se realiza una aplicacin puntual de la muestra, por lo que al final las distintas protenas estarn distribuidas a lo largo del gel segn el eje de migracin. Acabada la electroforesis, y sin efectuar la tincin, se practica en el gel un canal (trinchera) paralelo a la direccin de migracin con un bistur de doble hoja (la separacin de las hojas determina la anchura de la trinchera) en el que se deposita un antisuero que contenga anticuerpos especficos frente a una o varias de las protenas separadas en la electroforesis. Los geles se mantienen as a temperatura ambiente (20-22C) durante 24-48 horas. Los anticuerpos y las protenas (que actan como antgenos) difunden, y si se encuentran en la proporcin adecuada, producen complejos antgeno-anticuerpo insolubles que precipitan y aparecen en el gel como bandas elipsoidales. Cada protena de la muestra produce una banda de precipitacin independiente, por lo que es posible identificar el nmero de constituyentes de la muestra que son reconocidos por los anticuerpos. La gran especificidad y sensibilidad de las reacciones de precipitacin, permite diferenciar sustancias con movilidades electroforticas idnticas y detectar componentes que se encuentren en concentraciones mnimas (g).La IEF es una tcnica principalmente cualitativa, que se desarrolla en condiciones nativas y es especialmente apropiada para el anlisis de lquidos fisiolgicos y extractos celulares. Permite identificar substancias en mezclas muy complejas y en concentraciones muy bajas. Sin embargo, requiere que dichas substancias sean inmunognicas y depende de los anticuerpos utilizados, por lo que es difcil de estandarizar.

Fases de una IEF2) Electroforsis en Geles con GradientesUn gel con gradiente significa que la concentracin del gel en el soporte va aumentando de un lado hacia el otro. En un gel con gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el lmite del poro no se produce una migracin apreciable aunque no se detiene completamente. El uso de gradientes de concentracin de poliacrilamida permite una mayor resolucin en un rango de pesos moleculares ms amplio.

3) Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)Se utiliza mayoritariamente para la separacin de protenas, aunque tambin puede ser til para cidos nucleicos. Los geles de poliacrilamida son soportes restrictivos del tipo II, por lo que, adems de evitar la conveccin y minimizar la difusin, participan directamente en el proceso de separacin. Se preparan de modo que sus poros sean de un tamao comparable al de las protenas, de manera que produzcan un efecto de tamizado molecular; la separacin electrofortica depende entonces de la densidad de carga de las molculas y de su tamao, por lo que dos protenas con idntica densidad de carga, pero de tamao diferente pueden ser separadas, ya que el soporte dificulta ms el avance de la de mayor tamao. Son qumicamente inertes frente a las molculas biolgicas, transparentes y estables en un amplio intervalo de valores de pH, temperatura y fuerza inica; son tambin resistentes a agentes desnaturalizantes (urea, detergentes), y son mecnicamente estables, por lo que pueden ser deshidratados y reducidos a una fina pelcula, lo que facilita su almacenamiento.Una variante ampliamente difundida de este tipo de electroferesis es la SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sdico). En ella se dispone del soporte verticalmente, la muestra se trata con SDS y se calienta brevemente entre 90 y 100C para provocar la desnaturalizacin. Permite obtener una estimacin de la masa molecular de las protenas separadas. Para ello es preciso analizar en la misma electroforesis unas protenas patrn, de tamao conocido, con las que se construye una curva de calibrado, representando movilidad frente a logaritmo de masa molecular.Para controlar el avance del frente de electroforesis (posicin de mxima movilidad) se aade a la muestra un colorante marcador (tracking dye), molcula cargada y de pequeo tamao que avanza ms que cualquier componente de la muestra; el ms habitual es elazul de bromofenol.Para mejorar la resolucin (obteniendo bandas ms compactas) se suele emplear electroforesis discontinua:

En la parte superior, ungel acumulador o concentrador (stacking gel), que tiene como efecto concentrar la muestra en una banda estrecha. Ocupando la mayor parte de la placa, ungel separador(resolving gel) en el que tiene lugar la separacin de los componentes. El efecto concentrador se debe a una mayor porosidad del gel acumulador combinada con una diferente composicin de los tampones de cubeta y de gel y distinto pH para ambos geles.

4) IsoelectroenfoqueSe trata de una variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en su preparacin molculas ionizables con valores de pH diferentes. Como consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornos de pH diferente, y eventualmente alcanzan una regin en la cual el pH es igual al punto isoelctrico de la molcula muestra (Pto. Isoelctrico: es el pH al cual la carga neta de la protena es nula en un gradiente continuo de pH) y, en consecuencia, sta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la separacin de los componentes de la muestra de acuerdo con su punto isoelctrico, que adems se puede medir, pues se conoce el gradiente de pH del gel.

5) Electroforesis BidimensionalEs una sucesin de dos electroforesis distintas (o en distintas condiciones) realizadas sobre una misma muestra. En la primera de ellas (primera dimensin) se separan los componentes de la muestra segn un criterio (carga, tamao o pI), y en la segunda (segunda dimensin) segn un parmetro distinto del anterior. De esta manera, se combinan dos modos de separacin diferentes y se consigue el mximo de resolucin posible mediante tcnicas electroforticas.

Normalmente, la idea de electroforesis bidimensional suele referirse a la combinacin de los dos tipos de electroforesis ms resolutivos: isoelectroenfoque (primera dimensin) y SDS-PAGE (segunda dimensin)

Primera dimensin (SDS-PAGE). En el pocillo I se aplica el marcador de pesos moleculares y en los pocillos II y III la muestra. El carril del pocillo III (sombreado) se corta y el resto del gel se tie. El carril III se coloca sobre un nuevo gel que se ha polimerizado sin pocillos, donde se desarrolla la segunda dimensin (EEF) perpendicularmente a la primera. Obsrvese que algunas bandas producen ms de una mancha en la segunda dimensin.

La electroforesis bidimensional puede considerarse como un criterio de pureza positivo debido a su gran poder de resolucin, aceptndose que la aparicin de una sola mancha indica una muestra homognea.

6) Electroforesis de Campo Pulsante (ECP)En esta tcnica se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera peridicamente la orientacin del campo elctrico aplicado, activando alternativamente dos pares de electrodos. El frecuente cambio de direccin del campo elctrico consigue que las molculas se desplieguen y avancen a travs de los poros en conformacin extendida. A mayor tamao, se reorientan con ms dificultad, por lo que avanzan ms despacio.

La ECP se utiliza para separar fragmentos de ADN lo cual se considera como un avance significativo, pero aun as no sirve para el estudio de los cromosomas humanos, sin embargo si funciona para los cromosomas de levadura

FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESISEl resultado de una electroforesis depende de numerosos factores y es necesario conocerlos para lograr la mxima resolucin.Campo Elctrico.Es un gradiente de potencial que posibilita que haya electroforesis. A su vez, depende de diferentes parmetros:Diferencia de potencial (V). Se mide en voltios y es lo que define el campo elctrico. Cuanto mayor sea, mayor ser la velocidad de migracin. Las electroforesis se consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la mayora) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10.000 voltios.Intensidad (I). Se mide en amperios y cuantifica el flujo de carga elctrica. Est relacionada con la diferencia de potencial por la Ley de Ohm: V = IR; y para una diferencia de potencial dada, su valor (normalmente entre 5-50mA) viene determinado por la resistencia del soporte, por lo que, en ltima instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las molculasResistencia (R). Se mide en ohmios y cuanto mayor sea la resistencia del soporte, menor ser la movilidad electrofortica (ya que la intensidad ha de ser menor para que se cumpla la Ley de Ohm). Depende de la naturaleza del soporte, sus dimensiones (anchura, longitud y seccin) y de la concentracin del tampn de electroforesis.Temperatura. Por el efecto Joule, el paso de una corriente elctrica produce calor, y este efecto ser tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia de potencial y la resistencia del sistema. Debe controlarse de forma estricta, puesto que puede afectar a la muestra (desnaturalizndola), al soporte e incluso al equipo electrofortico. Todo esto justifica, por s solo, la necesidad de un sistema de refrigeracin en las cubetas de electroforesis.Muestra.La movilidad electrofortica de una molcula es tanto mayor cuanto mayor sea su carga y disminuye segn aumenta su tamao, ya que mayor es la friccin de la molcula con el medio y menor es su carga por unidad de superficie. Por esta razn, las molculas globulares se mueven con mayor facilidad que las elongadas, ya que la esfera presenta la mnima superficie a igualdad de volumen. As, molculas del mismo tamao y carga, pero de diferente forma, pueden tener una movilidad electrofortica diferente y ser, por tanto, separables mediante una electroforesis.Tampn.Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por accin del campo elctrico, lo cual genera protones en la proximidad del nodo e iones hidroxilo en el ctodo. El tampn es, por esta razn, esencial durante la electroforesis para evitar que el nodo se acidifique y el ctodo se haga ms bsico, pero no debe afectar a las molculas a separar.Adems, la fuerza inica condiciona la movilidad electrofortica de las substancias a separar, ya que influye en su esfera de solvatacin y en la conductividad de todo el sistema, por lo tanto, es necesaria una fuerza inica suficiente para mantener el pH y la conductividad durante todo el proceso, pero no muy elevada, ya que llegara a interferir en el sistema.Normalmente, se emplean tampones con fuerzas inicas moderadas (0.05-0.10M), siendo el pH la caracterstica que debe ser ms controlada, puesto que determina la carga de la muestra. Conviene sealar tambin que atendiendo a la distribucin del tampn, los sistemas se clasifican en continuos cuando se emplea un nico tampn en el proceso, y discontinuos cuando se emplean, al menos, dos tampones de pH y composicin diferentes.Soporte. La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se presenten una serie de fenmenos de elevada trascendencia para el resultado del proceso:Adsorcin. Es una retencin inespecfica de las molculas de la muestra sobre el soporte, por lo que afecta negativamente a la resolucin, ensanchando las bandas de migracin.Electroendsmosis (EEO). Es un fenmeno que se da en algunos soportes (sobre todo en los no restrictivos de tipo I), en los que aparecen cargas negativas, debidas a grupos carboxilo o sulfato, al estar en contacto con una disolucin inica.Al aplicar el campo elctrico, los iones y las molculas se desplazan segn su carga, pero en su migracin se encuentran con un flujo de cationes desplazndose sobre la superficie del soporte y otro de aniones hacindolo por el centro de los poros (figura 6). Este flujo orientado se llama flujo electroendosmtico. El EEO va en contra de la resolucin de una electroforesis, ya que las bandas de la muestra se ensanchan y se distorsionan; sin embargo, la EEO contribuir a una mejor resolucin en las inmunoelectroforesis y en la electroforesis

Efecto electroendosmtico en la superficie de un soporte cargado negativamente. Los aniones migran desplazndose por el centro del poro, mientras que los cationes lo hacen por la superficieTamizado molecular. Es un efecto debido al mayor o menor reticulado de los soportes; cuanto ms tupida sea la red de fibras, menores sern los poros. El movimiento de las molculas a travs del soporte es ms o menos fcil en funcin de su tamao respecto al de los poros; aquellas molculas cuyo tamao se aproxime al del poro, ver impedido su avance respecto a aquellas cuyo tamao sea muy inferior. Por esta razn, el soporte acta como un cedazo que separa o tamiza las molculas en funcin de su tamao.

APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS Separacin de las hebras de ADN para permitir una mejor identificacin y examinacin de sus componentes Aislamiento de protenas de los fluidos biolgicos Anlisis del contenido de los distintos tipos de protenas presentes en la hemoglobinaDeterminacin de la masa molecularComo se ha indicado, se puede obtener una estimacin de la masa molecular (en kDa) de protenas empleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb) empleando electroforesis en agarosa. En ambos casos, en uno de los pocillos del gel se carga una mezcla de molculas patrn de tamao conocido, con el fin de poder trazar la curva de calibrado. Para las protenas, la validez del dato obtenido depende de que la desnaturalizacin con SDS haya sido completa y de que se hayan separado las subunidades gracias a la reduccin con mercaptoetanol; adems, la presencia de oligosacridos en las glicoprotenas altera la movilidad, que ya no proporciona valores de masa molecular fiables.Se aplica en uno de los pocillos del gel una mezcla de fragmentos de DNA de tamao conocido, denominados patrones, marcadores de masa molecular o escalera de DNA (DNA ladder). Tras su separacin en la electroforesis, se revelan y se representa para todas las bandas la movilidad (distancia avanzada o, mejor, cociente entre sta y el avance del frente de electroforesis) frente al logaritmo del tamao (longitud en pb). Sobre la recta ajustada se interpolan las distancias de avance de las muestras problema, calculando as su tamao en pb.En este ejemplo, los patrones empleados son fragmentos bien conocidos, aquellos obtenidos a partir del DNA del virus por la accin de las endonucleasas de restriccinEcoRI eHindIII..

Determinacin del punto isoelctricoComo se ha indicado, mediante isoelectroenfoque se obtiene una medida del punto isoelctrico de las protenas (pHIo pI).

IsoenzimasLas variantes de una enzima, con pequeas diferencias en su estructura y en su actividad enzimtica, se analizan rutinariamente mediante electroforesis o, en especial, mediante isoelectroenfoque. De hecho, los nombres de las isoenzimas derivan a veces de su movilidad electrofortica. Se puede aplicar anlogamente a lasisoformasde protenas no enzimticas.Mapas de restriccinUna de las formas de estudiar la secuencia de los cidos nucleicos, en especial el DNA, consiste en tratarlo con distintas enzimas de restriccin, analizar mediante electroforesis en gel de agarosa los fragmentos resultantes e intentar reconstruir la secuencia de la molcula original formando sumapa de restriccin, uno de los tipos de mapa fsico.Secuenciacin de cidos nucleicosLa obtencin de la secuencia completa, nucletido a nucletido, tambin depende del anlisis electrofortico de fragmentos de DNA, tanto en el mtodo qumico de Maxam y Gilbert como en el mtodo enzimtico de Sanger. Se utilizan en este caso geles de poliacrilamida, debido al tamao pequeo de los fragmentos, pudindose resolver fragmentos que se diferencian en un solo nucletido.

Aplicaciones 2La principal aplicacin es la caracterizacin y anlisis cuantitativo de molculas biolgicas, principalmente protenas, pptido y aminocidos.Tambin encuentra aplicacin para la separacin de otras sustancias bioqumicas (insulina, histonas, fibringeno, lipoprotenas, enzimas)La aplicacin de los geles de poliacrilamida en electroforesis es en la separacin de molculas circulares y lineales de DNA.AplicacionesEl explosivo avance de la electroforesis capilar se ha extendido al rea biomdica, en el campo de las protenas, pptidos, ADN, anlisis de lquidos de perfusin, monitoreo de drogas, marcadores genticos tumorales y neurobioqumicos, drogas xenobiticas, de abuso, y pericias forenses.En el rea biofarmacutica, para el control de calidad de productos farmacuticos y biotecnolgicos, quimioterpicos y de estructura quiral. En el rea de alimentos, se le aplica al fraccionamiento y cuantificacin de aminocidos, hidratos de carbono, cidos orgnicos, aditivos y contaminantes.En el rea de control ambiental, permite la identificacin de contaminantes y sus metabolitos, pesticidas, metales pesados e hidrocarburos.Como todo desarrollo de un rea analtica nueva, la incorporacin de tcnicas acopladas como la espectroscopia de masa, fluorescencia inducida por lser y otras variantes permiten augurar un promisorio futuro.