· TRABAJO PRÁCTICO N° 4: Agua para uso en laboratorios biológicos.....24 TRABAJO PRÁCTICO N°...

Guía de Trabajos Prácticos: Prácticas en Laboratorios Biológicos

2020 I

PRESENTACIÓN DEL CURSO PRÁCTICAS EN LABORATORIOS BIOLÓGICOS

La presente guía de Trabajos Prácticos está dirigida a los estudiantes del Curso:

Prácticas en Laboratorios Biológicos de la carrera Tecnicatura Universitaria en

Laboratorios Biológicos (TULB), Plan de estudio Ord. CD 15/12. Este curso se dicta en

tercer año de la carrera, segundo cuatrimestre, es de carácter obligatorio y posee un crédito

horario total de 100 horas.

Debido a su posición en el Plan de Estudios, se nutre de otras disciplinas para la

adquisición de un conjunto de capacidades básicas necesarias para desempeñar funciones

de asistencia técnica, de investigación y productivas, entre otras, con base en las Buenas

Prácticas de Laboratorio (GLP por sus siglas en inglés) y las Buenas Prácticas Clínicas

(GCP por sus siglas en inglés), según el ámbito de desempeño en el laboratorio biológico.

En este sentido, las Prácticas en Laboratorios Biológicos tienen como Objetivo

General: propender a que el alumno fortalezca los conocimientos teóricos y las habilidades

prácticas necesarias para el manejo de material e instrumental de laboratorio y el desarrollo

de distintas técnicas habituales o de rutina en el Laboratorio Biológico. Sus objetivos

particulares son: 1) Instruir al alumno en el manejo de animales de experimentación

(rata/ratón); 2) Entrenar sobre rutinas de mantenimiento y uso de los equipos de laboratorio;

3) Integrar los conocimientos adquiridos en el transcurso de la carrera y aplicarlos, con el fin

de lograr destrezas y habilidades en diferentes técnicas de laboratorio biológico; 4) Aplicar

normas de higiene, seguridad, calidad, confiabilidad y cuidado del medio ambiente, durante

la realización de ensayos; 5) Fomentar la capacidad para trabajar en equipo y la

interacción con profesionales relacionados con el laboratorio biológico.

Requisitos para cursar. Tener aprobado: Química Inorgánica, Química Orgánica I,

Anatomía Humana, Taller de Primeros Auxilios, Fisiología, Química Analítica General e

Instrumental, Técnicas Histológicas, Fundamentos de Informática, Inglés Técnico. Además,

tener regularizado: Técnicas de Parasitología y Micología, Microbiología General, Química

Biológica. Para aspirar a la promoción o rendir examen final, todas las materias nombradas

deberán estar aprobadas.

Modalidad de cursada y régimen de aprobación. Se desarrollarán 10 Trabajos

Prácticos, cada uno con la revisión de su correspondiente base teórica, a razón de 7 horas

semanales y durante 15 semanas totales. De acuerdo con la reglamentación vigente, la

regularización de la materia se logrará alcanzando al menos el 80% de asistencia a las

actividades obligatorias y la aprobación de todos los Trabajos Prácticos. La evaluación de


2020 II

los estudiantes, además de ser constante por la participación activa, se realizará mediante la

exposición de seminarios a definir por el equipo docente. Aquellos alumnos que estén en

condiciones de promocionar, deberán realizar una presentación oral de tipo integradora de

los prácticos realizados, cuya modalidad y características se informarán con anterioridad

El equipo docente de la asignatura que trabajó en la elaboración de la presente GUÍA

DE TRABAJOS PRÁCTICOS, está constituido por los siguientes docentes:

• Prof. Responsable: Dra. Casais, Marilina

• Prof. Co-Responsable: Dra. Vallcaneras, Sandra

• Responsable de Práctico: Dra. Delsouc, María Belén


2020 III

ÍNDICE

Presentación del curso ............................................................................................................ I

Normas de seguridad en Laboratorios Biológicos ................................................................. IV

TRABAJO PRÁCTINO N° 1: Cuidado y mantenimiento de animales de experimentación

(rata/ratón). ............................................................................................................................ 1

TRABAJO PRÁCTICO N° 2: Procedimientos experimentales en ratones y ratas de

laboratorio – PARTE 1............................................................................................................ 8

TRABAJO PRÁCTICO N° 3: Procedimientos experimentales en ratones y ratas de

laboratorio – PARTE 2.......................................................................................................... 18

TRABAJO PRÁCTICO N° 4: Agua para uso en laboratorios biológicos ............................... 24

TRABAJO PRÁCTICO N° 5: Uso y mantenimiento de instrumentos del laboratorio ............ 30

TRABAJO PRÁCTICO N° 6: Fundamentos sobre aislamiento de ARN y Reacción en

Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Reversa (RT-PCR). ........................................ 39

TRABAJO PRÁCTICO N° 7: Desarrollo de la RT-PCR........................................................ 47

TRABAJO PRÁCTICO N° 8: Electroforesis en gel de agarosa para la separación de

fragmentos de ADN .............................................................................................................. 50

TRABAJO PRÁCTICO N° 9: Fundamentos sobre extracción y cuantificación de proteínas 56

TRABAJO PRÁCTICO N° 10: Cuantificación de proteínas por el método de Lowry ........... 64


2020 IV

NORMAS DE SEGURIDAD EN LABORATORIOS BIOLÓGICOS

Las prácticas que se realizan en los laboratorios biológicos presentan riesgos propios

de cada actividad. Por consiguiente, aquí se describen un conjunto de reglas básicas

destinadas a cuidar la seguridad personal, las instalaciones y los equipos, y evitar

accidentes y contaminaciones tanto dentro del ámbito de trabajo como hacia el exterior.

Normas generales en laboratorios

1. En todos los casos los estudiantes deberán demostrar conocimiento de las

actividades a realizar, de la teoría que las sustenta, de los riesgos y medidas de

seguridad, tanto previo a la práctica de laboratorio como durante el transcurso de

toda la realización de la práctica experimental.

2. Los estudiantes deberán conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el

lugar de trabajo tales como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignífugas,

lavaojos, etc.

3. Deberán asistir con el cabello recogido y la vestimenta apropiada (no se podrá

ingresar con falda, pantalones cortos, calzado abierto, accesorios colgantes,

anillos).

4. Será obligatorio el uso de guardapolvo (de tela Acrocel y mangas largas) y guantes

de látex en el laboratorio.

5. Se deberá conservar el orden y la limpieza, manteniendo las mesadas libres de

elementos innecesarios.

6. No se permitirá comer, beber o fumar en el laboratorio.

7. Las manos deberán lavarse cuidadosamente antes y después de cada práctica.

También luego de toda operación donde se produzca contacto con agentes

químicos o biológicos.

8. Siempre que sea necesario, proteger los ojos (por ejemplo, durante la manipulación

de productos químicos volátiles o el uso de lámparas ultravioletas). Para tal fin, se

utilizarán gafas de seguridad.

9. Los estudiantes deberán estar vacunados contra el tétanos y la hepatitis B.


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10. Se deberá informar al responsable de los prácticos sobre aquellas

circunstancias personales que puedan hacer al alumno más susceptible o sensible

ante posibles riesgos (embarazo, alergias, etc.).

11. En caso de emergencia, es fundamental mantener la calma y seguir las

instrucciones del jefe de trabajos prácticos quien indicará como proceder.

Normas de procedimiento en el laboratorio biológico

1. Al usar material de vidrio, comprobar su perfecto estado (no usar material sucio,

con roturas o rajaduras).

2. Será obligatorio el uso de barbijo cuando se asista al bioterio y manipulen animales

de experimentación.

3. La manipulación de los animales se hará bajo unas determinadas pautas que

garanticen el mínimo estrés de los mismos y eviten con ello respuestas agresivas.

Por ello, siempre se seguirán las recomendaciones del responsable del práctico.

4. Cualquier incidente ocasionado durante la manipulación de los animales, se

comunicará al profesor responsable del práctico para que tome las medidas

oportunas.

5. Cuando se manipule un producto químico, se deberán conocer sus características

fisicoquímicas, su toxicidad y los elementos de protección personal (EPP) sugeridos

según la hoja de seguridad.

6. Siempre se deberá comprobar cuidadosamente los rótulos de los envases antes de

utilizarlos.

7. La apertura de frascos que contengan sustancias químicas deberá hacerse con

cuidado y lentamente, asegurándose de que no haya ningún desprendimiento

violento. Después de su utilización, se tendrá ESPECIAL CUIDADO EN CERRAR

BOTELLAS Y FRASCOS.


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Signos convencionales de seguridad en las etiquetas de las sustancias químicas. Fuente:

https://issuu.com/santillanavenezuela/docs/quimica_3_practicas

8. Nunca se manejarán equipos sin conocer perfectamente su funcionamiento y sin la

supervisión que para cada caso se determine.

9. Las centrífugas deberán equilibrarse correctamente teniendo en cuenta las

características de las mismas. Se prestará especial cuidado en la limpieza del

equipo al finalizar la tarea, especialmente del rotor.


2020 VII

10. En caso de detectar alguna anomalía durante el funcionamiento de cualquier

equipo o aparato, se avisará al responsable del laboratorio o al profesor encargado.

Normas de desecho de residuos

1. No está permitido descartar ningún tipo de sustancia líquida o sólida sin consultar

previamente al encargado del trabajo práctico.

2. Los residuos ordinarios o comunes se desecharán en bolsa negra.

3. Los residuos patológicos recibirán el tratamiento que determine el responsable del

laboratorio a quien se solicitarán instrucciones para su eliminación.

4. Luego de cada práctico, los guantes se desecharán en bolsas rojas colocadas en

recipientes provistos para tal fin. Los mismos deberán quitarse como se muestra en

la siguiente imagen:

Forma segura de quitarse los guantes. Fuente: https://es.slideshare.net/vegeta78/uso-correcto-del-equipo-de-

proteccion-personal-17383988


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TRABAJO PRÁCTICO N° 1

CUIDADO Y MANTENIMIENTO DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN (RATA/RATÓN)

OBJETIVO

-Adquirir conocimientos en el cuidado y mantenimiento de ratas y ratones de

experimentación.

INTRODUCCIÓN TEÓRICA

Un animal de experimentación es aquel producido y mantenido bajo condiciones

controladas, que posee claros antecedentes genéticos y microbiológicos, y se utiliza como

instrumento de medida en investigación biológica y biomédica, desarrollo tecnológico e

innovación, pruebas de laboratorio y docencia, para la generación de datos. Ejemplos de

estas especies son: rata, ratón, hámster, conejo, perro, mono, etc.

Los más utilizados son las ratas y los ratones (Figura 1) (80 y 90 % de la demanda

para experimentación) por presentar las siguientes VENTAJAS:

✓ Tamaño pequeño.

✓ Bajos costo de manutención.

✓ Se adaptan muy bien a la producción en cautiverio.

✓ Diversidad de características específicas que sirven como modelo.

✓ Altos índices reproductivos (20-22 días de gestación y camadas de 6-12 crías).

✓ Corto tiempo de generación.

✓ Por su vida relativamente corta es excelente para su uso en ensayos crónicos de

toxicología, microbiología, virología, farmacología, etc.

Estos animales también presentan algunas DESVENTAJAS:

✓ Dificultad en la recolección de material biológico.

✓ Dificultad la administración de drogas.

✓ Dificultad en las técnicas quirúrgicas.

Figura 1. Características físicas de ratas (A) y ratones (B) de laboratorio. Fuente: https://es.dreamstime.com


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Características generales

-Son mamíferos de sangre caliente y de hábitos nocturnos.

-Posee un agudo sentido de la audición, por lo que se alteran rápidamente con los

ruidos, es por ello que hay que tener cuidado con los equipos que se utilizan.

-Su sentido del olfato está muy desarrollado, no sólo para detectar comida y

depredadores, sino también para percibir un orden social. Por ello, no se deben usar

desodorantes, perfumes, desinfectantes que emanen olores, etc.

-Su visión es muy pobre y no pueden percibir los colores. En la órbita del ojo se

encuentran las glándulas Harderianas que, en situación de estrés, excretan porfirina.

-Generalmente, son muy dóciles a excepción de algunas cepas exocriadas que

mantienen su agresividad, al igual que sus antecesores salvajes.

-Por su pequeño tamaño son muy susceptibles a cambios ambientales. Una variación

de la temperatura entre 2 a 3°C, puede afectar su temperatura corporal y modificar su

fisiología.

-Tienen una vida útil de 10 a12 meses y se obtienen de ocho a diez camadas por

pareja.

Como se trata de seres vivos sensibles, que podrían experimentar dolor y terminar

perdiendo la vida, es importante manipularlos de manera adecuada para incrementar el

bienestar animal, disminuir el estrés, evitar alteraciones en las pruebas o repeticiones

innecesarias, y obtener resultados válidos y reproducibles.

En este sentido, los comités institucionales para el cuidado y uso de animales de

experimentación (abreviados como CICUAE, CICUAL o CICUA) tienen el rol de garantizar


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que las actividades que involucran animales de experimentación se rijan por la normativa

internacional y nacional, el principio de las 3R y un balance ético a favor del bienestar.

Por definición, cada CICUAE analiza los protocolos de investigación en línea con el

cumplimiento de los principios básicos referidos al trato ético y humanitario de los animales

como modelos experimentales. Evalúan, especialmente, la relación entre beneficios que

pretende lograr la investigación y los daños a los animales y los criterios de retiro

humanitario anticipado del ensayo y eutanasia, en virtud de considerar las normas

internacionales.

Entre los requisitos, estas comisiones solicitan que los proyectos científicos adjunten

un detalle de los métodos que se utilizarán para disminuir o paliar el dolor producido durante

los procedimientos. Esto implica la descripción de las drogas analgésicas y anestésicas que

se suministrarán, con la indicación de dosis y frecuencia de administración.

Asimismo, tienen la función de procurar la formación especializada de los

investigadores que manipulan animales, la participación –o supervisión– de un veterinario o

especialista en la especie animal que se emplea en los procedimientos experimentales y el

acondicionamiento de bioseguridad de las instalaciones.

Las R (s)

Se puede decir que la investigación en animales es éticamente aceptable, si se sigue

el principio de las tres R propuesta por William Russell (zoólogo y psicólogo) y Rex Burch

(microbiólogo) en 1959: Reemplazar, Reducir y Refinar.

El Reemplazo tiene que ver con la búsqueda de alternativas en el uso de animales de

experimentación. Algunas posturas hablan del reemplazo relativo (sustitución de animales

conscientes por no conscientes, o empleo de organismos menos complejos desde el punto

de vista celular), otras del reemplazo absoluto (sustitución de animales por cultivos

celulares, modelos matemáticos computarizados, simuladores, entre otros, etc.).

En lo concerniente a la Reducción del número de animales utilizados en los

experimentos, el logro de este propósito requiere un buen trabajo en el diseño y el análisis

estadístico de los datos, a la par de promover la publicación de resultados negativos para

evitar repeticiones. Ello no implica, sin embargo, sacrificar el valor científico del estudio, y

mucho menos exponer a los pocos animales empleados a mayores sufrimientos.

En cuanto a Refinamiento, la recomendación es adherir a normas y parámetros

internacionales para el manejo animal, la definición genética y del estado microbiológico de

las especies empleadas, la optimización del ambiente de cría y mantenimiento durante los

estudios; como así también la utilización de métodos que menguan el dolor potencial y la


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angustia. También se encarga la aplicación de técnicas que permiten procesar muestras

cada vez más pequeñas y consecuentemente lesionar menos.

En este nuevo siglo se terminó consagrando una R adicional, el Reciclaje. Vale decir,

utilizar a los animales más de una vez, para fines investigativos distintos o bien de otra

naturaleza.

En el año 2006, dos autores mexicanos publicaron en Gaceta Biomédicas una serie de

recomendaciones tendientes a afianzar la adherencia a las R(s) las cuales establecían: i)

Precisar y controlar las condiciones de preservación de los animales en experimentación; ii)

Verificar la existencia de una probabilidad razonable que los estudios con animales

contribuyan de manera importante a la adquisición de conocimientos; iii) Emplear métodos

estadísticos, modelos matemáticos y sistemas biológicos in vitro cuando sean oportunos

para complementar la experimentación animal y reducir así su número; iv) Hacer uso del

animal más apropiado para la investigación en curso, teniendo en cuenta la condición

sensorial y psíquica propia de cada especie; v) Evitar al animal todo sufrimiento físico o

psíquico infructuoso.

Bioterio

Se denomina así a la estructura física y organizacional especialmente diseñada para la

cría y mantenimiento de los animales de experimentación.

En la Argentina, los roedores se producen en bioterios de universidades nacionales y

del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), principalmente,

con destino a estudios biomédicos en las áreas de inmunología, neurociencia, oncología,

genética y farmacéutica.

Los determinantes para un buen desempeño en bioterio son:

Aspecto de infraestructura

Según la Disposición de la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y

Tecnología Médica (A.N.M.A.T.) N° 6344/96, los locales de producción, mantenimiento y/o

experimentación animal no pueden estar en relación directa con áreas administrativas, de

elaboración o analíticas. Deben construirse a prueba de roedores salvajes e insectos. Las

superficies interiores (paredes, suelos y techos) deben ser lisas, no han de desprender

partículas y deben ser fáciles de limpiar y desinfectar. De existir rejillas de desagüe dentro

de los locales, las mismas deben reunir condiciones que impidan la entrada de roedores e

insectos, de preferencia con tapa de seguridad. Y los recintos deben ser lo suficientemente

espaciosos como para permitir el trabajo cómodo de los operarios en sus tareas y evitar la

sobrecarga animal.


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En los bioterios deben estar controlados los factores ambientales (temperatura,

humedad, ventilación, presurización) y físico (iluminación, ruido, etc.).

Si se trata de un bioterio de producción, debe contar con: local de cría o producción;

local de mantenimiento o stock; local de experimentación animal; local de cuarentena; área

de depósito y área de lavado.

Animales definidos

Debe acreditarse la calidad y definición genérica de las cepas animales que se utilicen.

De poseer cría propia, es necesario un control genético periódico que asegure la pureza

genética. De adquirirse los animales, deberá exigírsele al vendedor dicha acreditación,

avalada por Médico Veterinario.

*También debe acreditarse la calidad sanitaria de los animales, producidos o

adquiridos, mediante estudios adecuados que certifiquen la ausencia de enfermedades

bacterianas, virales o parasitarias, clínicas o subclínicas, que pudieran interferir con los

resultados experimentales. Tal acreditación, deberá ser avalada por una Institución o

Profesional responsable.

Personal capacitado

El personal debe estar capacitado en: i) identificar las principales enfermedades

zoonóticas que afectan a los animales de laboratorio; ii) manejo de animales de laboratorio,

según las buenas prácticas de crianza; iii) peligros microbiológicos y físicos (incluyendo

aquellos relacionados con la radiación y las alergias); iv) limpieza y sanitización de

ambientes y materiales; v) higiene personal; vi) salud y seguridad ocupacional; vii) manejo

de materiales de desecho; viii) seguridad química e industrial; ix) manejo de equipos

utilizados en la producción: autoclaves, hornos, caldero, ablandador de agua, cabinas de

seguridad biológica y otros (Figura 2).

Figura 2. Personal de Bioterio. Fuente: Alexandre Dornelas. Centro de Biologia da Reprodução da UFJF


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*Es importante tener presente que el uso de los EEP (ropa apropiada, guantes, cofia,

barbijo, etc.), los procedimientos normalizados de limpieza y desinfección de materiales e

instalaciones conjuntamente con los flujos adecuados de personal y material, constituyen

una verdadera barrera sanitaria, que se recomienda mantener vigente a pesar de las

limitaciones en equipamiento e infraestructura.

ACTIVIDADES A DESARROLLAR

Teniendo en consideración la base teórica previa y el material bibliográfico

proporcionado por el profesor, desarrolle los siguientes puntos:

1. ¿Cuáles son las diferencias entre roedores endocriados y exocriados?

2. Destaque las principales características a tener en cuenta sobre cada factor del

micro- y macroambiente de una rata o ratón criado y mantenido en bioterio:

3. En caso de desarrollar su labor en un bioterio, ¿qué normas de higiene y seguridad

debería cumplir?

4. ¿Por qué es importante utilizar animales estandarizados/definidos?


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5. Elabore un Procedimiento Operativo Estandarizado (P.O.E.) para limpieza de pisos

y paredes o lavado de jaulas y mamaderas.

BIBLIOGRAFÍA

• DISPOSICIÓN A.N.M.A.T. N° 6344/96 Laboratorio – Bioterio – Requisistos.

• Fuentes FM, Mendoza RA, Rosales AL, Cisneros RA (2008). Guía de manejo y

cuidado de animales de laboratorio: ratón. Lima, Perú. Instituto Nacional de Salud.

• INTA. Guía para cuidado y uso de animales de experimentación. Buenos Aires,

Argentina. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias. Disponible en:

https://inta.gob.ar/sites/default/files/script-tmp-inta-

_gua_cuidado_y_uso_de_animales.pdf (última consulta: 04/03/2020).


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PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES EN RATONES Y RATAS DE

LABORATORIO – PARTE 1

OBJETIVOS

-Conocer el uso de instalaciones del Bioterio de la UNSL.

-Adquirir destreza en técnicas de manejo, identificación, sexado y ciclado de ratas y

ratones de experimentación.


Entre los alcances e incumbencias de la carrera TULB, se contempla el manejo de

animales de experimentación. Por consiguiente, en el presente trabajo práctico se procurará

que los estudiantes conozcan las instalaciones de nuestro bioterio, su correcto uso, y

adquieran experiencia en técnicas de uso frecuente como: sujeción, identificación, sexado y

ciclado de rata y ratones.

Técnicas de manejo para rata y ratones

Para realizar cualquier técnica de manejo, es importante que el operario use guantes

de tamaño exacto a la mano, barbijo, guardapolvo, cofia y esté protegido contra el tétanos y

la hepatitis B.

Una buena técnica de sujeción permite llevar a cabo los procedimientos de cambio de

lecho o caja, administración de sustancias o toma de muestra de la forma adecuada,

provocando el menor estrés en el animal.

Captura y traslado de jaula

Para el traslado de RATONES, se sujetará al animal de la base de la cola con los

dedos índice y pulgar (Figura 1). Otra forma es abrazándolo del cuello con el dedo índice y

el pulgar.


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Figura 1. Sujeción de ratones para el traslado de jaula. Fuente: Mourelle, 2012.

Para el traslado de RATAS, se tomará al animal por el dorso rodeándolo con la mano

de manera firma pero suave (Figura 2). Si el animal es más grande que la mano del

operario, se debe dar apoyo a los cuartos traseros para evitar que el animal se incomode y

caiga.

Figura 2. Sujeción de ratas para el traslado de jaula. Fuente: Mourelle y col., 2013.

Sujeción con restricción de movimiento

Ante todo, es importante evitar los ruidos innecesarios, olores, movimientos bruscos y

temor.

➢➢ RRaattóónn::

Con la mano no diestra se debe sacar al ratón de la jaula tomándolo de la zona media

de la cola, y se lo debe apoyar (sin soltarlo) sobre una superficie rugosa o rejilla contra la

que pueda ejercer resistencia. Seguidamente, se debe flexionar suavemente sobre la base

de la cola del animal para extenderlo sobre la superficie. Sin soltar la base de la cola, se

puede tomar con los dedos índice y pulgar la piel del dorso del animal, comenzando a la

altura de las orejas del mismo (Figura 3). Al levantar al animal debe quedar en posición

vertical formando una línea, colocando la cola entre el dedo meñique o anular. No se debe

ejercer mucha presión a la altura del cuello.


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Figura 3. Técnica de pinzamiento en ratón. Fuente: Mourelle y col., 2013.

➢➢ RRaattaa::

Pasando los dedos índice y medio a los costados de la rata se logra una buena forma

de sujeción para procedimientos menores (Figura 4).

Figura 4. Sujeción con restricción de movimiento en rata. Fuente: Mourelle, 2012.

Si se requiere una sujeción con mayor restricción de movimiento, se debe proceder de

la misma forma que con los ratones, pinzando la piel del cuello del animal que estará sujeto

con sus patas delanteras a una superficie rugosa. Sin soltar el pinzamiento, se debe

flexionar hacia atrás la piel del cuello y, al mismo tiempo, se debe tomar la piel del dorso con

los otros dedos y la palma de la mano (“técnica de pinzamiento”). Si el animal queda bien

sujeto, no moverá su cabeza y se podrá levantar sin dificulta. Aquí no es necesario sujetar la

cola, pero es importante darle soporte a los cuartos traseros del animal con la otra mano

(Figura 5).

Figura 5. Técnica de pinzamiento en rata. Fuente: Mourelle y col., 2013.


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Existen dos formas de inmovilizar la cabeza de una rata de gran tamaño (Figura 6): 1)

pasando los dedos índice y mayor por el cuello, y el pulgar y anular por debajo de las patas

delanteras; 2) cruzando, con el dedo pulgar, una pata delantera por debajo de la mandíbula.

Estos dos métodos son los que generan menor estrés al animal.

Figura 6. Técnicas para inmovilizar la cabeza de una rata. Fuente: Mourelle, 2012.

Restricción de movimiento con uso de cepo

Existen en el mercado cepos de acrílico donde el animal se introduce normalmente

solo, quedando sujeto y permitiendo trabajar por los orificios que presenta, ya sea para la

administración de sustancia o tomando muestras en procedimientos que no requieran

anestesia ni sedación. También se pueden conseguir cepos de polipropileno, descartables,

para ratas (Figura 7).

Figura 7. Cepos. Fuente: Mourelle, 2012.

Manipulación de crías (rata/ratón)

➢ Neonatos:

En general, no se aconseja manipular animales tan pequeños porque la madre podría

desconocer el olor que le dejamos impregnado y matarlos o dejarlos fuera de la camada, sin

alimentarlos.


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En el caso de traslado de jaula, se debe pasar primero la madre y luego las crías. Los

neonatos deben tomarse todos a la vez y, de manera rápida, pero suave y tranquila, se

deben depositar en la jaula donde se encuentra la madre (Figura 8).

Figura 8. Manipulación de crías recién nacidas. Fuente: Mourelle y col., 2013.

➢➢ CCrrííaass ddee 33--99 ddííaass::

A partir de los 3 días de edad, las crías son más movedizas. Por consiguiente, se

deben tomar con dos dedos desde la parte media del cuerpo, ejerciendo sólo la presión

necesaria para sujetarlas y trasladarlas una a una (Figura 9).

Figura 9. Sujeción de un neonato. Fuente: Mourelle y col., 2013.

➢➢ CCrrííaass ddee 1100--2211 ddííaass::

En el caso de las crías con pelo, a partir de los 10 días de nacidas y hasta el día 21

(momento del destete), se deben tomar de la misma forma que el caso anterior. Aquí se

tiene la ventaja de tener más piel para sujetarlas.

Métodos para la identificación de animales

TEMPORALES

Corte de pelo, según un código numérico

Identificación con colorantes o tintes no tóxicos. Puede realizarse sobre el pelo o en la

cola en ratas o ratones. El marcado puede durar de 10-20 días, por lo que se recomienda


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para experimentos de corta duración y en los que se usan pocos animales. En el caso de

neonatos, el tinte puede durar 24 horas como máximo ya que la madre se encargará de

limpiar a sus crías.

PERMANENTES

Perforaciones y/o muescas. La identificación se realiza en las orejas con un

sacabocado o una tijera para cirugía, de acuerdo a un código preestablecido (Figura 10). Es

fácil y causa poco trauma. Cada grupo requiere su propio equipo de perforación. El tejido

extraído se puede usar para genotipificación. Es posible que las perforaciones cierren

después de algunos meses.

Figura 10. Perforaciones en orejas de ratón como método de marcación permanente. Fuente:

https://www.researchgate.net/publication/283056744 (modificada)

Grampas enumeradas. Son de acero inoxidable y se colocan en la oreja con una pinza

especial. En el caso de los ratones no es el método recomendado por excelencia, porque se

suelen lastimar mucho las orejas tratando de sacárselo.

Tatuajes. Solo deben ser realizados por personal capacitado, quien primero

inmovilizará al animal y luego introducirá la tinta en las capas intradérmicas de la cola. Con

la misma aguja se pueden marcar hasta 50 ratones, pero se debe desinfectar entre ratón y

ratón. Aunque el método es permanente, la marca se puede hacer borrosa después de

cierto tiempo.

Transmisores subcutáneos. Los microchips se insertan subcutáneamente en el cuello

o espalda. Son permanentes, pero costosos.

Sexado

La determinación del sexo de los animales (sexado) se realiza por simple observación

de la zona perianal a partir de las tres semanas (antes de la tercera semana es más difícil y


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requiere más experiencia). Para dicho propósito, se evalúa la distancia entre la papila genital

y la apertura anal, la cual es casi el doble en los machos. El tamaño de la papila genital es

también ligeramente mayor en los machos. Como una alternativa, es posible observar la

parte ventral de las crías, entre los días 9 y 15, y distinguir a las hembras por la falta de pelo

alrededor de las mamas. También es posible observar una pequeña mancha negra en el

escroto de los machos, pigmentados desde el primer día de vida (Figura 11).

Figura 11. Sexado en ratones y ratas. Fuente: https://www.pinterest.es/pin/291397038367286084/ (modificada)

Ciclado

Durante mucho tiempo, la evaluación de los cambios en las células epiteliales

vaginales ha sido empleada como un método relativamente no invasivo para documentar los

ciclos de reproducción en ratas y ratones de laboratorio. Las ratas suelen comenzar a ciclar

inmediatamente después de la apertura del orificio vaginal, lo que tiende a ocurrir entre el

día postnatal 32 y 36, y pueden inicialmente mostrar algunos ciclos irregulares antes de

establecer un patrón recurrente de ciclos ovulatorios con una duración de 4 o 5 días. Estos

continuarán hasta aproximadamente los 10 a 12 meses de edad.

En ratones de laboratorio, la relación entre la citología vaginal y la ciclicidad ovárica es

comparable a la de las ratas, a pesar que la apertura vaginal que se produce alrededor del

día 23 no refleja el inicio de la madurez sexual. Los siguientes ciclos tienden una duración

promedio de 5 días, aunque al igual que las ratas son comunes irregularidades y pueden ser

influenciadas por las condiciones ambientales. Cabe destacar que las hembras mantenidas

aisladas pueden presentar períodos de anestro que pueden durar semanas.


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La progresión a través del ciclo implica esencialmente la recurrencia regular de tipos

de células distintivas. El aspecto de estas células normalmente se correlaciona con el

estado de la mucosa vaginal, útero, y ovarios y está vinculado a las variaciones en las

concentraciones de esteroides sexuales y gonadotrofinas circulantes. En un ciclo estándar

de 4 días, el proestro es identificado por la presencia de grupos de células epiteliales

redondeadas y nucleadas, que a menudo tienen un aspecto granular bajo el microscopio.

Esta etapa tiene una duración de 1 día y finaliza con el celo en el estro, identificable por la

presencia de un gran número de células cornificadas (o queratinizadas). El predominio de

estas células es de un día de duración en un ciclo de 4 días, o pueden estar presente

durante 2 días consecutivos en un ciclo de 5 días. El metaestro es un término que se ha

utilizado para describir el período de transición entre el estro y el diestro, y su frotis se

caracteriza por una combinación de los leucocitos y células epiteliales cornificadas y

redondeadas. Estas células epiteliales redondas normalmente persisten junto con los

leucocitos durante los días 1 y 2 del diestro. La concentración de leucocitos puede variar, y

el frotis puede llegar a ser casi exclusivamente leucocitario. El segundo día del diestro,

también puede mostrar algunos pequeños grupos de células epiteliales nucleadas que

anuncian el proestro al día siguiente (Figura 12). Algunas ratas con un ciclo regular de 5

días pueden presentar 3 días consecutivos de diestro en lugar de los 2 días de estro

mencionados anteriormente.

Figura 12. Citología del exudado vaginal según la etapa del ciclo estral. Fuente:

https://www.jove.com/video/4389/realizar-el-lavado-de-la-vagina-tincin-de-cristal-violeta-y-

evaluacin?language=Spanish (modificada).

Para la obtención del frotis vaginal se utiliza un gotero que sólo necesita contener un

pequeño volumen (~0,2 ml) de agua o solución fisiológica y se debe insertar la punta del

gotero aproximadamente 5 mm en el orificio vaginal; es importante tener en cuenta que si es

demasiado profunda, esto puede ocasionar una estimulación excesiva del cuello uterino,

induciendo una pseudogestación, que aparece como un diestro persistentes y si la toma de

muestra se realiza desde más de un animal, se debe enjuagar minuciosamente entre

lavados para eliminar las células residuales del gotero. Los frotis pueden ser evaluados

inmediatamente en fresco o pueden ser fijados y teñidos para su posterior análisis, usando

un microscopio de luz estándar.


2020 16


Después de recibir una clase teórica sobre los procedimientos experimentales en

ratones y ratas de laboratorio previamente detallados, los estudiantes visitarán el Bioterio de

la UNSL para conocer sus instalaciones y llevar a cabo las actividades propuestas en el

punto 1. Posteriormente, en el laboratorio, abordarán las situaciones planteadas en los

puntos 2 y 3.

1. Visita guiada al Bioterio de la UNSL.

a) Observe y discuta si las instalaciones cumplen con los requerimientos de

A.N.M.A.T.

b) ¿Qué sugerencias haría para optimizar su funcionamiento y asegurar la calidad de

los animales?

c) La profesora responsable del práctico le asignará 2 cajas con animales. Caja 1:

deberá sexar crías de rata. Caja 2: podrá ciclar 1 hembra adulta ¿Qué técnica de sujeción

utilizará para cada procedimiento?

2. Considere la siguiente situación: es 2 de abril y el Director del Bioterio le informa

que han solicitado 10 ratas hembras, endocriadas, de 2 meses de edad, para la primera

semana de septiembre ¿Qué tendría en consideración antes de realizar el apareamiento?

¿Cuándo pondría a aparear? ¿Cuándo y cómo realizaría el destete?

3. Considere la siguiente situación: mediante protocolo CICUA solicitan 8 hembras de

4 meses de edad y con 19 días de preñez ¿Cómo llevaría a cabo el apareamiento? ¿Cómo

podría confirmar el día 1 de preñez?

BIBLIOGRAFÍA


cuidado de animales de laboratorio: ratón. Lima, Perú. Instituto Nacional de Salud.

• INTA. Guía para cuidado y uso de animales de experimentación. Buenos Aires,

Argentina. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias. Disponible en:

https://inta.gob.ar/sites/default/files/script-tmp-inta-

_gua_cuidado_y_uso_de_animales.pdf (última consulta: 04/03/2020).


2020 17

• Mourelle C (2012). Curso: Procedimientos experimentales en ratas y ratones de

laboratorio. Chile, Asociación Chilena en Ciencias de Animales de Laboratorio

(ASOCHICAL).

• Mourelle AC, Herrero E, Ricca M (2013). Recomendaciones para manipulación y

sujeción de ratas y ratones de laboratorio. Spei Domus; 9(19):39-47.


2020 18


PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES EN RATONES Y RATAS DE

LABORATORIO – PARTE 2

OBJETIVO

-Identificar las vías de administración de sustancias y conocer las técnicas de

eutanasia recomendadas en ratones y ratas.


Administración de sustancias

Cuando se administra una sustancia a un animal el objetivo debe ser conseguir la

mejor práctica, puesto que los errores en cualquier estadio pueden provocar un sufrimiento

evitable e incluso hasta la muerte del animal. La mejor práctica se basa en minimizar o evitar

efectos adversos, disminuir cuanto se pueda el número de animales utilizados y maximizar

la calidad y aplicabilidad de los resultados.

Algunas vías son más estresantes que otras. Por ello, dependiendo de las

características físico-químicas de la sustancia (y/o su vehículo) y del volumen a administrar,

se debe elegir la vía que menos interaccione con el propósito del experimento.

*Es fundamental recordar que, inmediatamente antes de la administración, toda

sustancia debe calentarse a la temperatura corporal para evitar malestar y shock.

Vía oral

Se puede usar el alimento o el agua, en volumen máximo de 1 ml de solución por cada

100 g de peso del animal, cuando es vehículo oleoso y 2 ml de solución cuando es solución

acuosa. Lo ideal es mediante sonda orogástrica y teniendo un buen conocimiento de la

anatomía de la zona orofaríngea; los pasos a seguir son los siguientes: inmovilizar al animal

en forma correcta e introducir la sonda hacia la izquierda en forma lenta y suave a lo largo

de la rama mandibular derecha, aquí el ratón comienza a tragar y la sonda se inserta dentro

del esófago (Figura 1).


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Figura 1. Administración de sustancias vía oral. Fuente: Falconi y col., 2010.

Vía subcutánea

Es utilizada como alternativa a la intramuscular en los ratones. Proporciona una lenta

liberación, evitando el metabolismo de primer paso por el hígado. El lugar de elección para

la inyección es la región escapular. La aguja se inserta en la piel paralela a la columna

vertebral (Figura 2). Se utiliza agujas de 25 G con jeringas de tuberculina. El volumen

máximo para esta vía es de 0,2-0,5 ml por cada 100 g de peso del animal.

Figura 2. Administración de sustancias vía subcutánea. Fuente: Falconi y col., 2010.

Vía intraperitoneal

Se utiliza para administrar volúmenes relativamente grandes de sustancias solubles

(como analgésicos), cuando se necesita que se absorban rápidamente y cuando la vía oral o

la vía intravenosa no son las apropiadas. Implica una inyección en la cavidad peritoneal a

través de la pared abdominal, empleando una aguja calibre 25–27G X ½. Para sujetar a los

ratones y ratas menores a 200 g se puede emplear la técnica de pinzamiento.

Posteriormente, se coloca al animal levemente con la cabeza hacia abajo (para evitar la

punción del intestino), se limpia el abdomen con un algodón con antiséptico y en el

cuadrante izquierdo inferior se inserta parte la aguja paralela a la piel, luego se termina de

introducir la aguja formando un ángulo de 45° entre el abdomen del animal y la mano del


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operario (Figura 3). El volumen máximo para esta vía es de 1 ml por cada 100 g de peso del

animal.

Figura 3. Administración de sustancias vía intraperitoneal. Fuente: Falconi y col., 2010.

Es importante tener en cuenta que una rápida administración del fluido puede causar

daños en el tejido y hemorragia debido a la presión interna. Esta vía no se recomienda para

hembras preñadas, puesto que la aguja puede penetrar el útero.

Vía intravenosa

Esta vía asegura la consecución de la máxima exposición al plasma, de la forma más

rápida posible, evitando la posibilidad de eliminación por el metabolismo preenterohepático.

El animal debe inmovilizarse empleando un cepo (Figura 4).

Figura 4. Administración de sustancias vía intravenosa. Fuente: Falconi y col., 2010.

El volumen a inocular es de 0,2 a 0,5 ml como máximo. Mejores resultados se logran

si la cola se introduce en agua tibia o es frotada con alcohol. No se deben utilizar

medicamentos con vehículo oleoso o sustancias irritantes.


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Vía intramuscular

Se utiliza como una vía de administración sistémica, en estudios de liberación lenta

(formulaciones oleosas) y en valoración de vacunas. Se realiza en la región antero-lateral

del muslo con agujas de 25 a 27 G y jeringa de tuberculina (Figura 5). El volumen máximo

es de 0,05 ml. Esta vía no es muy usada debido a la poca masa muscular del ratón o rata y

al posible daño que se le puede causar a las estructuras vitales.

Figura 5. Administración de sustancias vía intramuscular. Fuente: https://inta.gob.ar

Métodos de eutanasia en roedores

Hace referencia a los procedimientos empleados para inducir la muerte de los

animales de manera humanitaria (ver Tabla 1).

Características de una buena eutanasia

• Debe producir el mínimo dolor y angustia.

• Debe causar el mínimo estrés al animal o al operador.

• Debe producir inconsciencia y muerte rápida.

• Debe ser adecuado a la edad, especie y estado de salud.

• Debe ser reproducible.

• Debe ser sencillo de administrar.

• Debe ser seguro para el operador.


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Tabla 1. Métodos de eutanasia en roedores. Fuente:

http://cea.unizar.es/Disenos_experimentales/Metodos%20eutanasia/ROEDORES.pdf

Signos de dolor y angustia en el animal

• Conducta de huida.

• Inmovilidad.

• Defensa o agresividad.

• Taquicardia.

• Micción.

• Vocalizaciones (no siempre audibles para el hombre).

*No se debe sacrificar a un animal en presencia de otros animales, ya que les produce

miedo y angustia..


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ACTIVIDAD A DESARROLLAR

1. Luego de haber abordado la parte teórica, preste atención a la proyección de

material audiovisual sobre: “Vías de administración de sustancias en ratas y ratones”.

2. Proponga o busque un tema de investigación que requiera el uso de animales de

experimentación y complete el Protocolo de Experimentación CICUA-UNSL

(http://www.fqbf.unsl.edu.ar/cicua.html). Debe contemplar la administración de una sustancia

y método de eutanasia.

BIBLIOGRAFÍA

• Falconi E, García ML, Marín RO, Padrón LRM, Rivas AMG, Vargas SG (2010).

Manual para el manejo de animales con fines de experimentación y enseñanza.

México, Universidad Juárez Autónoma de tabasco, División Académica de Ciencias

Biológicas, 14.


cuidado de animales de laboratorio: ratón. Lima, Perú, Instituto Nacional de Salud.

• Morton DB, Jennings M, Buckwell A, et al., (2001). Refinando los procedimientos

para la administración de sustancias. Laboratory Animals; 35:1.41.

• Mourelle C (2012). Curso: Procedimientos experimentales en ratas y ratones de

laboratorio. Chile, Asociación Chilena en Ciencias de Animales de Laboratorio

(ASOCHICAL).


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AGUA PARA USO EN LABORATORIOS BIOLÓGICOS

OBJETIVOS

-Conocer los distintos grados de pureza del agua según su uso en el laboratorio.

-Identificar los métodos que se emplean para purificar el agua.


Uno de los reactivos de uso frecuente en el laboratorio biológico, y considerado como

disolvente universal, es el agua. De ahí la importancia vital de considerar su calidad y

pureza para uso en laboratorio, a fin de eliminar sesgos en los resultados, evitar

interferencias o reacciones secundarias y aumentar la confiabilidad de estos resultados.

El agua contiene sales de calcio y magnesio que proporcionan dureza, sustancias

como hierro, sílice, manganeso, cloruros, sulfatos, sodio y otros materiales en suspensión

(ver Tabla 1). Por lo tanto, existen diferentes procesos para eliminar las impurezas y el uso

de cada uno depende del objetivo que se persiga con el agua tratada.

Tabla 1. Impurezas adquiridas por el agua en su ciclo natural. Fuente: González Ruiz, 2018.

Parámetros de calidad de agua para uso en laboratorio

Según ISO 3696: 1987 y la NC-ISO 3696: 2004, atendiendo al grado de impureza, el

agua se puede clasificar en tres grupos o tipos (ver Tabla 2):


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AGUA TIPO 3- Apropiada para la mayoría de los procesos llevados a cabo en los

laboratorios químicos y biológicos, salvo indicación en contrario. Se utiliza para la

preparación de disoluciones de reactivos, la producción de agua de grado superior y para

enjuagues y lavados. Se puede preparar mediante destilación simple, desionización o por

osmosis inversa.

AGUA TIPO 2- Con muy pocos contaminantes inorgánicos, orgánicos o coloidales. Es

apropiada para uso farmacéutico, soluciones de análisis y medios de cultivo microbiológicos.

Se puede preparar por destilación múltiple o por desionización u osmosis inversa seguida de

destilación.

AGUA TIPO 1- Exenta básicamente de contaminantes constituidos por iones disueltos

o coloidales y materias orgánicas. Es apropiada para los requisitos de análisis más

exigentes: análisis de trazas, enzimología, ingeniería genética. Se puede preparar por un

tratamiento adicional del agua de grado 2 (por ejemplo osmosis inversa o desionización

seguida de filtrado a través de una membrana con tamaño de poro de 0,2 μm para separar

las partículas, o por redestilación en un aparato de sílice fundido).

Tabla 2. Valores específicos de parámetros en función a los patrones de agua purificada. Fuente: González Ruiz,

2018.

El AGUA ULTRAPURA (conocida comercialmente como Milli-Q) es aquella libre de

cualquier tipo de contaminante, obtenida por osmosis inversa combinada con ultrafiltración y

desionización. Se la utiliza en análisis de ultratrazas, fertilización in vitro, producción de

anticuerpos monoclonales, medios de cultivo celular.

En el mercado también se encuentra el AGUA LIBRE DE DNasas y RNasas, que

hace referencia al agua ultrapura sometida a un proceso de radiación por el cual se eliminan

impurezas biológicamente activas. Es necesaria para llevar a cabo la técnica de PCR*.

*Tanto la especificidad del gen diana como la eficiencia de la reacción catalizada de la enzima son

altamente dependientes de las condiciones físicas (pH, temperatura, etc.) y de la composición de la mezcla de la

reacción. La presencia de nucleasas –enzimas que rompen los enlaces de fosfodiéster entre las subunidades de


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los ácidos nucleicos– dentro del recipiente de reacción llevará a la interrupción severa del proceso de PCR, ya

que el material genético se fragmentará rápidamente bajo las condiciones de reacción. Por lo tanto, es

fundamental garantizar que todos los reactivos y soluciones utilizados en las aplicaciones de PCR estén libres de

nucleasas (Whitehead, 2012).

Métodos de purificación del agua

➢ Filtración con membranas. Consiste en hacer pasar el agua a través de membranas

semipermeables (Figura 1). La calidad de la filtración depende del tamaño del poro; un poro

de 0,2 µm puede eliminar materiales insolubles, sólidos emulsionados y microorganismos.

Figura 1. Membrana de filtración. Fuente: www.mgfiltration.com/index.php/en

➢ Destilación. Es el método más antiguo para la purificación de agua. Consiste en

calentar el agua hasta que se evapore y luego condensarla y recolectarla en un recipiente

apropiado (Figura 2 y 3).

Figura 2. Modelo de destilación simple. Fuente: www.definiciones-de.com/Definicion/de/destilacion.php


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Figura 3. Destilador de acero inoxidable para laboratorios, con sistema continúo de alimentación. Fuente:

www.tecnodalvo.com.ar/producto/16/destiladores-de-agua

Sirve para eliminar el material orgánico no volátil, las impurezas inorgánicas y los

microorganismos. Las impurezas volátiles como el amoníaco, el dióxido de carbono y el

cloro permanecen en el destilado. El agua destilada puede emplearse en el trabajo diario sin

que produzca errores apreciables.

El pH del agua destilada oscila entre 4-5, debido a la presencia de dióxido de carbono

atmosférico disuelto. Por consiguiente, si se requiere de un pH neutro (por ejemplo: para la

preparación de medios de cultivo o soluciones) el agua destilada puede ser sometida a un

proceso de descarboxilación: i) se coloca el agua destilada en un erlenmeyer y se la somete

a temperatura de ebullición durante 5 min; ii) antes de retirar la fuente de calor, se tapa el

erlenmeyer con un tapón de caucho perforado, provisto de un tubo trampa con perlas de

hidróxido de sodio ; iii) una vez enfriada, se vierte en un recipiente apropiado.

Si se requiere agua grado 2, el agua destilada puede ser sometida al proceso de

destilación para obtener agua bidestilada.

➢ Desionización. Consiste en hacer pasar el agua a través de una columna de resinas

de intercambio de cationes o aniones. Este tratamiento produce el intercambio de hidrógeno

(H+) o iones hidróxido (OH-), localizados en la superficie de la resina, por las impurezas

catiónicas o aniónicas respectivamente, presentes en el agua (Figura 4). Pasado un tiempo,

las resinas pierden su capacidad de intercambio y necesitan ser repuestas.


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Figura 4. Representación esquemática de una resina de intercambio de cationes. Fuente:

http://dardel.info/IX/IX_Intro_ES.html (modificada)

El agua desionizada puede cambiar su pH con facilidad al ser almacenada,

aumentando su acidez debido a la incorporación de dióxido de carbono atmosférico.

Además, el agua desionizada es muy agresiva con los metales, incluso con el acero

inoxidable; por consiguiente, debe utilizarse plástico o vidrio para su almacenaje y su

manejo.

Para obtener agua de grado 1 es necesario un tratamiento posterior con carbón

activado o membranas filtrantes para eliminar impurezas orgánicas, materiales insolubles y

microorganismos.

➢ Osmosis inversa. El agua se hace pasar bajo presión a través de una membrana

semipermeable de acetato de celulosa, poliamidas aromáticas y otros materiales (Figura 5).

Este tratamiento elimina las impurezas orgánicas, materiales insolubles y microorganismos,

pero no elimina los gases disueltos.

Produce agua de grado 3 y se usa para tratar el agua antes de pasarla por la columna

de resina de intercambio iónico.

Figura 5. Elementos típicos de una membrana de ósmosis inversa. Fuente: https://verlek.com/osmosis-inversa/


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1. Teniendo en cuenta la base teórica otorgada, responda:

a. ¿Por qué es importante purificar el agua para su uso en el laboratorio biológico?

b. ¿Qué pH tiene el agua destilada? ¿Por qué?

c. Mencione ventajas y desventajas de la destilación, desionización y purificación

por ósmosis inversa.

d. ¿Qué propiedad del agua puede poner en evidencia su grado de pureza?

2. Para conocer el proceso de purificación de agua por ósmosis inversa, se coordinará

una visita a un laboratorio perteneciente al Instituto de Investigación en Tecnología

Química (INTEQUI)-CONICET-UNSL (UNSL, Bloque III).

BIBLIOGRAFÍA

• González Ruiz ML (2018). La calidad del agua para fines analíticos. Trabajo Final

de Grado en Farmacia. Sevilla.

• Valdivia-Medina RY, Pedro-Valdés S, Laurel-Gómez M (2010). Agua para usos en

laboratorios. Boletín Científico Técnico INIMET; 3-10.

• Whitehead P (2012). Agua ultrapura libre de impurezas biológicamente activas apta

para técnicas PCR. FarmEspaña Industrial.


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USO Y MANTENIMIENTO DE INSTRUMENTOS

DEL LABORATORIO

OBJETIVO

-Conocer el correcto uso y mantenimiento de diferentes instrumentos del laboratorio

biológico.


En el presente trabajo práctico se darán a conocer las formas apropiadas de utilizar y

mantener los instrumentos más sensibles y de uso habitual en los laboratorios biológicos:

las micropipetas, la balanza analítica y el pH-metro. El uso inapropiado de ellos genera

desajustes en la calibración y pueden llevar a resultados falsos.

Micropipetas

Instrumental de laboratorio que se usa para tomar y poder transferir pequeños

volúmenes de líquido empleando puntas desechables (tips) que en general son estériles.

Los volúmenes que son capaces de captar varían según los modelos: los más habituales,

que se denominan p10, p20, p200 y p1000, admiten un volumen máximo de 10, 20, 200 y

1000 μl respectivamente.

Tipos de micropipetas

Existen micropipetas que son manuales, en las que el volumen a recoger se fija al

girar el calibrador o botón de control que se encuentra localizado en su parte superior y que

está conectado a un sistema analógico para ayudar a confirmar el volumen captado, y las

micropipetas automáticas, en las cuales dicho sistema es digital.

A su vez, las micropipetas pueden clasificarse en simples, que sólo pueden llevar

montada una punta a la vez, y las multicanales, que pueden llevar múltiples puntas siendo

capaz de absorber el mismo volumen en cada una de ellas (Figura 1).


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Figura 1. Diferentes tipos de micropipetas. Fuente: https://www.onelab.com.ar

Partes de una micropipeta

Las partes básicas de una micropiteta automática son (Figura 2):

Figura 2. Esquema de las partes de una micropipeta. Fuente: https://idoc.pub/documents/partes-de-una-pipeta-

d47emxj8r2n2

Cuidados básicos y control del instrumento

− Antes de cada uso, limpiar la parte exterior de cualquier resto de polvo o suciedad.

Usar solamente un paño con etanol al 70% y empezar desde el ejecutor de tip hacia

el botón de control.


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− Para su esterilización, hay que seguir las instrucciones del fabricante. Algunas se

pueden esterilizar en autoclave.

− Verificar en cada uso la integridad y ajuste de los mecanismos.

− Emplear los tips que sean adecuados para las pipetas a utilizar y para la cantidad de

solución a medir.

− Evitar los golpes y caídas porque producen un desajuste en su calibración.

− Las pipetas se deben guardar siempre en posición vertical, sobre un soporte

diseñado para tal fin, con la punta hacia abajo y en su volumen máximo.

− Las pipetas deben ser calibradas por un especialista técnico 2 veces al año si se

utilizan a diario.

*Los buenos cuidados conservan el instrumento calibrado por más tiempo.

Técnica de pipeteo

− Controlar que la punta o tip esté bien colocado y que no haya ningún tipo de residuo

entre éste y el cuerpo de la pipeta.

− Presionar el botón superior suavemente hasta el primer tope.

− Sumergir el tip (3-5 mm) en la solución que se necesita pipetear.

− Mantener la pipeta en posición vertical mientras se toma la solución.

− Para descargar la solución del tip, presionar el botón hasta el segundo tope.

− Descartar los tips utilizando el eyector que traen las pipetas.

Técnica de pipeteo para líquidos con alta viscosidad

− Presionar el botón superior hasta el segundo tope.

− Sumergir el tip (3-5 mm) en la solución y soltar el botón despacio.

− Descargar el líquido del tip presionando suavemente el botón superior hasta el primer

tope.

Balanza analítica

Es un instrumento de medición que se utiliza para saber cuánta masa tiene un objeto,

órgano, tejido, etc. En el laboratorio biológico se la utiliza principalmente para preparar

soluciones de concentración exacta (Figura 3).


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Figura 3. Balanza analítica. Fuente: https://onelab.com.ar

Se trata de un instrumento sumamente exacto y sensible al medio, de manera que las

medidas generales que debemos tomar respecto a su cuidado son las siguientes:

Las condiciones ambientales

− Instalar la balanza en un lugar cerrado, antimagnético (no contener metales o acero)

y protegido de cargas electrostáticas.

− Mantener la temperatura de la sala constante.

− Mantener la humedad entre 45% y 60% (debe de ser monitoreada siempre que sea

posible).

− No permitir la incidencia de luz solar directa.

− Evitar pesar cerca de aparatos que utilicen ventiladores (ej. aire acondicionado,

ordenadores, etc.) o cerca de una puerta.

Cuidados básicos

− Colocar la balanza sobre un soporte antivibratorio.

− Verificar siempre la nivelación de la balanza.

− Dejar siempre la balanza conectada a la toma y prendida para mantener el equilibrio

térmico de los circuitos electrónicos. Si se quiere ahorrar energía, se puede hacer

uso del modo standby.

− Conservar su limpieza según los pasos y frecuencia indicados en el P.O.E.

correspondiente.

Reglas de limpieza: qué hacer y qué no hacer

− Corroborar que los usuarios reciban las instrucciones apropiadas sobre cómo limpiar

la balanza. Una manipulación incorrecta puede dañar el sistema de pesaje o los

componentes electrónicos.


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− En primer lugar, quitar el polvo y la suciedad; a continuación, eliminar las sustancias

pegajosas del plato y/o paredes.

− Para el polvo y la suciedad, usar un paño. Nunca soplar el plato, ya que la suciedad

o los materiales derramados de la muestra podrían depositarse en el interior de la

balanza.

− Para retirar las sustancias pegajosas, usar un paño húmedo sin pelusas y un

disolvente suave (isopropanol o etanol al 70 %); evitar los materiales abrasivos.

− No pulverizar ni verter líquidos directamente sobre la balanza.

− Al usar un paño o cepillo, limpiar lejos de la abertura del cono (donde se asienta el

plato) o de los conductos de aire (espacios en la parte frontal o trasera del corta-aires).

− Cuando sea posible, desmontar las piezas para su limpieza (p. ej., plato de pesaje,

plato colector). Desmontar únicamente las piezas que se puedan quitar sin

herramientas y cuya extracción se describa en las instrucciones de manejo.

− No desconectar los dispositivos periféricos si no interfieren con la limpieza.

− Limpiar la balanza en su ubicación de trabajo; la balanza no se debe inclinar, mover

o transportar sin la formación adecuada sobre cómo transportarla. Una manipulación

incorrecta puede causar daños costosos.

Calibración

La práctica habitual que se lleva a cabo para calibrar una balanza de forma manual es:

− Tomar un objeto de masa conocida (pesas de calibración certificadas).

− Colocar el objeto en la balanza y comprobar que el valor estipulado del mismo y el

obtenido en la medición coincidan.

− En caso de no coincidir, realizar los ajustes hasta obtener el número esperado.

*Los ajustes pueden cambiar de una balanza a otra, por ello, se debe consultar el

manual y las instrucciones del fabricante.

Medidores de pH

El pH es una medida de la acidez o alcalinidad de una solución. Cuanto mayor es la

concentración de H+ más ácida es la solución y más bajo es el pH. La escala de medición va

de 0 a 14 (de ácido a básico, siendo pH= 7 neutro).


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Tiras medidoras de pH

Tiras reactivas de funcionamiento muy intuitivo, sencillo y limpio. Hay de diversas

modelos, calidades y graduaciones (Figura 4). Las más simples varían en un rango de pH

entre 1 y 14. Se humedecen con la solución durante 2 segundos y posteriormente se

compara el color obtenido en las tiras con el patrón que viene en el empaque comercial.

Aquellas que tienen sólo un color y rango de pH entre 1 y 14 tienen muy poca exactitud, del

orden de 2 puntos en los valores de pH.

Figura 4. Diferentes tiras reactivas para medición del pH. Fuente: https://issuu.com

pH-metro Digital

Existen varios modelos comerciales (Figura 5). Estos instrumentos son más exactos

que las tiras reactivas (saltos de 0,1 en pH). Como los electrodos de vidrio de pH mesuran la

concentración de H+ relativa a sus referencias, tienen que ser calibrados periódicamente

para asegurar la precisión. Para ello, se utilizan buffers para calibración (disoluciones

reguladoras de pH conocido).

Figura 5. pH-metros digitales. (A) pH-metro tipo bolígrafo; (B) pH-metro de mesada; (C) pH-metro de mano.

Fuente: https://medidordeph.com

A) B) C)


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➢➢ MMaanntteenniimmiieennttoo ddee llooss eelleeccttrrooddooss::

− Los electrodos tienen que ser enjuagados con agua destilada entre muestras. No

deben ser secados con un paño porque podrían cargarse electrostáticamente. Para

quitar el exceso de agua, deben ser colocados sobre un papel sin pelusa.

− Mantener siempre el electrodo húmedo para evitar daños al mismo.

− Guardar el electrodo en una solución saturada de KCl (ver recomendaciones del

fabricante).

− No guardar el electrodo en agua destilada, porque eso causaría que los iones

resbalaran por el bulbo de vidrio y el electrodo se volvería inútil.

➢➢ EErrrroorreess qquuee aaffeeccttaann aa llaass mmeeddiicciioonneess ddee ppHH ccoonn eelleeccttrrooddoo ddee vviiddrriioo::

− Error Alcalino: Los electrodos de vidrio ordinarios se vuelven sensibles a los

materiales alcalinos con valor de pH mayores a 9.

− Error Ácido: El electrodo de vidrio típico exhibe un error en soluciones de pH menor

de 0,5. Como consecuencia, las lecturas del pH tienden a ser demasiado elevadas

en esta región. Las causas del error ácido no se comprenden bien.

− Deshidratación del electrodo: Resultados falsos.

− Temperatura: La medición de pH varía con la temperatura. Se recomienda trabajar

con las soluciones a temperatura ambiente.


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1. Según la teoría previa, ¿cómo puede verificar si una micropipeta está calibrada?

Controle si las micropipetas otorgadas por la profesora funcionan correctamente.

2. ¿Por qué es importante mantener la balanza limpia? Coloque verdadero o falso a

cada una de las opciones y justifique.

a. Seguridad de los operadores…………….

b. Evitar la contaminación cruzada. …………….

c. Evitar resultados incorrectos en las técnicas……………..

d. Extendiendo la vida útil del instrumento………………

3. Lea el manual de instrucciones para operar el pH-metro digital disponible en el

laboratorio y luego, bajo supervisión de la profesora, calibre el instrumento. Elabore

un P.O.E. sobre el correcto uso, calibración y mantenimiento del pH-metro

4. Con base en lo enseñado, haga uso de la balanza analítica y del pH-metro

preparando una solución TBE (Tris, Ac. Bórico, EDTA) 1X y ajustando su pH a 8,3

(esta solución se utilizará en el TP N° 8). Antes de pesar las drogas, recuerde leer

las Fichas de Datos de Seguridad.

BIBLIOGRAFÍA

• Arguello M (2015). Instrumentación y manipulación de micropipetas automáticas,

usos y cuidados. Disponible en:

https://marioarguello.wordpress.com/2015/07/15/instrumentacion-y-manipulacion-de-

micro-pipetas-automaticas-usos-y-cuidados/ (última consulta: 08/04/2020).

TBE 1X

TRIS (CAS# 77-86-1) 3,02 g

Ácido bórico (CAS# 10043-35-3) 1,54 g

EDTA (CAS# 60-00-4) 0,184 g

Agua bidestilada Volumen Final= 500 ml


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• METTLER TOLEDO. Cleaning Recommendations and Regulations for Balances.

Disponible en: https://www.mt.com/int/es/home/perm-lp/product

organizations/labtec/Competence/Cleaning.html (última consulta: 07/04/2020).

• OMEGA. Medidores de pH. Disponible en: https://es.omega.com/prodinfo/medidor-

ph.html (última consulta: 07/04/2020).


2020 39


FUNDAMENTOS SOBRE AISLAMIENTO DE ARN Y REACCIÓN EN CADENA DE LA

POLIMERASA CON TRANSCRIPTASA REVERSA (RT-PCR)

OBJETIVO

-Conocer la metodología convencional para aislamiento de ARN y las bases teórico-

prácticas de la técnica RT-PCR, así como sus aplicaciones.


Los ácidos nucleicos, el ADN y ARN reciben su nombre del hecho de ser moléculas

con características acídicas (como la carga negativa en soluciones acuosas) y haberse

identificado inicialmente en el núcleo de células eucariotas, aunque ahora se sabe que se

encuentran en mitocondrias y cloroplastos, en células procariotas, e incluso en virus.

Para su estudio, los ácidos nucleicos deben aislarse del resto de los componentes

celulares, como lípidos y proteínas, más abundantes que los ácidos nucleicos. Asimismo,

dependiendo del objeto de estudio debe aislarse de preferencia el ADN o ARN; así, para

estudios de niveles de expresión génica se extraerá ARN, mientras que para la búsqueda de

modificaciones o alteraciones génicas se extraerá ADN.

En este trabajo práctico se dará a conocer la técnica de extracción de ARN con TRIzol

y una de las variantes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la RT-PCR, donde

se retrotranscribe una hebra de ARN en ADN complementario (ADNc) para hacer millones

de copias de una región particular del ADN. Esta región de ADN puede ser cualquier

fragmento que le interese al operador.

La PCR se utiliza en muchos laboratorios de investigación, y también tiene

aplicaciones prácticas en medicina forense, pruebas genéticas y diagnósticas. Por ejemplo,

la PCR se utiliza para amplificar genes asociados con trastornos genéticos a partir del ADN

de los pacientes (o de ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La PCR también puede

utilizarse para detectar ácidos nucleicos de una bacteria o un virus en el cuerpo de un

paciente.


2020 40

Método de extracción de ARN con TRIzol y síntesis de ADNc

El TRIzol es un reactivo listo para utilizarse en el aislamiento de ARN de diferentes

tipos celulares y tejidos. Es una solución monofásica de fenol e isocianato de guanidina que

durante la homogenización o lisis de la muestra mantiene la integridad del ARN, al mismo

tiempo que altera la estabilidad de las células y disuelve los componentes celulares. Ha

demostrado estabilidad hasta por 12 meses a temperatura ambiente; sin embargo, se

recomienda almacenarlo a temperatura de 2-8°C para un óptimo rendimiento. También se

puede utilizar la marca comercial Quick-Zol, cuya composición y aplicación es similar a la del

TRIzol.

Para tejidos, se puede utilizar 1 ml de TRIzol por cada 50-100 mg de tejido. La

homogeneización se puede realizar utilizando un digestor o el aparato homogeneizador

(Ultra Turrax). Para células en suspensión, la homogeneización se puede realizar

mediante pipeteo suave y repetido, utilizando 1 ml de TRIzol para cada 5-10x106 células

animales. Para células en mono-capa, se debe agregar 1 ml de TRIzol para diámetros de

3,5 cm de área de cultivo y homogenizar mediante pipeteo suave y repetido.

La adición de cloroformo seguida de centrifugación separa la muestra en dos fases,

una de ellas acuosa y la otra orgánica. El ARN permanece exclusivamente en la fase

acuosa y puede ser recuperado por precipitación con alcohol isopropílico. Posteriormente, el

ARN se lava con etanol 75% y finalmente el pellet de ARN se resuspende en agua libre de

nucleasas.

Cabe destacar que desde la interfase y capa orgánica se puede extraer el ADN al

precipitarlo con etanol. La proteína se precipita desde el sobrenadante de fenol-etanol con

precipitación de isopropanol.

Precauciones para prevenir la contaminación con ARNasas

Las ARNasas pueden introducirse accidentalmente en cualquier punto del aislamiento

del ARN a través de una técnica inadecuada. Dado que la actividad ARNasa es difícil de

inhibir, es esencial tener en cuenta las siguientes pautas para prevenir su introducción

cuando se trabaja con el ARN:

− Siempre usar guantes. La piel a menudo contiene bacterias que pueden contaminar

una preparación de ARN y ser una fuente de ARNasas.

− Usar material estéril y limpiar cuidadosamente las pipetas automáticas y mesadas

con etanol 70%.

− En presencia del reactivo TRIzol, el ARN se encuentra más protegido de la

contaminación con ARNasas.


2020 41

Cuantificación del ARN

Los ácidos nucleicos presentan la absorción máxima de luz ultravioleta (UV) a una

longitud de onda de 260 nm. Por lo tanto, para cuantificar la cantidad de ARN de una

muestra, se realiza una lectura espectrofotométrica a 260 nm teniendo en cuenta que una

densidad óptica (DO) de 1 corresponde aproximadamente a 40 μg/ml de ARN. Dado que las

proteínas (en particular los aminoácidos aromáticos) absorben luz UV a una longitud de

onda de 280 nm, por lo común el índice de absorción 260÷280 nm (DO260/DO280) se utiliza

para valorar la pureza de los ácidos nucleicos con respecto a la contaminación con

proteínas. Preparaciones puras de ARN presentan una relación entre 1,8 y 2,0. Si existe

contaminación con proteínas, la relación 260÷280 nm es menor que 1,8. Sin embargo, esta

determinación no permite estimar la integridad del ARN o la contaminación con DNA

genómico.

Análisis de la integridad del ARN

Para verificar la integridad del ARN total se realiza una electroforesis de la muestra en

gel de agarosa al 0,8% teñido con GelRedTM (0,05 μl/ml), un colorante fluorescente de

ácidos nucleicos. Se considera que el ARN se encuentra íntegro cuando en el gel se

visualizan las bandas correspondientes al ARN ribosomal 28s y 18s. La visualización de las

bandas de ácidos nucleicos se realiza en transiluminador.

Transcripción reversa o retrotranscripción

La RT es dependiente de la pureza e integridad del ARN usado como templado. Para

resultados óptimos, el ARN debe estar libre de ADN genómico porque, de lo contrario, se

podrían generar productos de amplificación no deseados si hay ADN con secuencias

similares al templado. Esta metodología requiere el uso de una transcriptasa reversa (RT) y

hexámeros random u Oligo (dT) primer para sintetizar ADNc a partir del templado de ARN.

Entre las enzimas más utilizadas se encuentra la RT del virus de la leucemia murina

mieloide (MMLV-RT). La máxima conversión del ARN en ADNc es un punto crítico para el

éxito de la RT-PCR.


2020 42

PCR

La PCR presenta varias ventajas: tiene alta sensibilidad (es decir, permite detectar

cantidades mínimas de ADN y ADNc), genera resultados en poco tiempo y permite el

diagnóstico de diferentes patologías.

Para llevar a cabo esta reacción se requieren los siguientes reactivos:

− El ADNc, a partir del cual se quiere amplificar un determinado fragmento. Puede ser

extraído de una muestra de sangre, células en cultivo, etc.

− Un par de primers, también llamados cebadores: “forward” primer (o cebador

sentido) y “reverse” primer (o cebador antisentido). Los primers son secuencias

cortas de ADN de cadena simple y están diseñados para flanquear la región blanco

(la región que debe ser copiada). La unión de los primers al extremo 3’ de cada

hebra del ADNc, mediante complementariedad de bases, proporciona un extremo 3’

necesario para que la ADN polimerasa lleve a cabo su acción (Figura 1).

Figura 1. Hibridación de los primers. Fuente: CK-12 Foundation.

− La ADN polimerasa termoestable a temperaturas de 90-95 °C. La ADN polimerasa

que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria

tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus). Esta ADN polimerasa es

termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70°C (temperatura a la

que la ADN polimerasa de ser humano o de E. coli no funcionaría). La Taq

polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad térmica. Como veremos,

la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN

o separar sus cadenas.

− Cloruro de magnesio de determinada concentración, el cual actúa como cofactor de

la enzima Taq polimerasa.

− Los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) en un buffer adecuado.


2020 43

− Agua libre de DNasas y RNasas.

− El equipo Termociclador que proporciona temperaturas de 90-94°C, 55-60°C y 70-

72°C que se repiten determinado número de ciclos.

Pasos de una PCR

Los pasos básicos son:

➢ Desnaturalización (96 °C): la muestra se calienta bastante para separar, o

desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena

sencilla para el siguiente paso.

➢ Hibridación de primers/ Annealing (55-65 °C): la reacción se enfría para que los

primers puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de

cadena sencilla.

➢ Extensión (72 °C): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq

polimerasa extienda los primers y sintetice así nuevas cadenas de ADN (Figura 2).

Figura 2. PCR Ciclo 1. Fuente: CK-12 Foundation.


2020 44

Factores a tener en cuenta al realizar la PCR

− Elección de los primers: se recomienda que el tamaño sea de 18-24 nucleótidos. Si

son muy largos surgen problemas annealing y si son cortos producen resultados

inespecíficos. La temperatura de annealing debe ser semejante entre ambos primers.

El contenido de GC debe ser del 40-60%. Se deben evitar las repeticiones de

nucleótidos, las secuencias complementarias en el extremo 3’ y las secuencias que

formen estructuras secundarias. Los primers no deben ser complementarios entre sí

porque formarían una doble cadena y no se pegarían al ADNc en estudio. Es

conveniente agregarlos en exceso para favorecer la cinética de la reacción pero debe

ser controlado, ya que si se agregan demasiado se pegan en forma inespecífica y se

forman dímeros de primers, lo que le quita eficiencia a la reacción.

− ADN polimerasa: si se coloca en exceso se acumula producto inespecífico; si se

coloca en defecto se obtiene insuficiente cantidad de producto.

− Concentración de MgCl2: es muy importante la elección de la concentración de esta

sal, ya que determina especificidad y rendimiento. El exceso de la misma aumenta la

inespecificidad y la insuficiente cantidad reduce el rendimiento.

− dNTPs: 50-200 μM es suficiente para sintetizar 6,5 -25 μg de ADN. Los 4 deben ser

colocados en igual concentración. Altas concentraciones determinan incorporaciones

erróneas. Los dNTPs secuestran iones Mg, por lo que si se aumenta la

concentración de los mismos, es necesario aumentar la concentración de Mg.

− Condiciones de ciclado: la temperatura de desnaturalización no debe elevarse

demasiado porque inactiva la ADN polimerasa. Una falla frecuente en la PCR es la

insuficiente temperatura para lograr la desnaturalización del ADNc y favorecer la

correcta separación de las cadenas.

− Temperatura de annealing: el pegado de los primers es rápido. Se alcanza en 20

segundos. Al aumentar la temperatura se aumenta la especificidad. Al disminuir la

temperatura se disminuye la especificidad. A menor tiempo, se disminuyen los

errores de pegado inespecífico.

Efectos no controlables

− Efecto Plateau: es una limitación intrínseca de la PCR, el cual no permite fidelidad

por encima de 30 a 40 ciclos. Los efectos que conducen al Plateau son: 1)


2020 45

Inactivación térmica de la polimerasa, 2) Concentración límite de la polimerasa, 3)

Reducción de la eficiencia de desnaturalización por ciclo, 4) Insuficiencia en el

alineamiento de los primers por ciclo, 5) Destrucción de los productos por la

contaminación con nucleasa.

¿Quieres ver los pasos de la extracción del ARN con TRIzol? ¿Tienes curiosidad por

saber cómo se extrae el ADN? ¿Quieres informarte sobre cómo se diagnostica COVID-19

mediante la PCR? ¿Quieres saber en qué consiste la PCR tiempo real o qPCR (otra variante

de la PCR muy utilizada en investigación)? Entonces…..


1. Observe la siguiente fotografía correspondiente a un gel de integridad. Con base en

lo enseñado, ¿considera que hay muestras degradadas? ¿Qué muestras servirían

para continuar con la RT-PCR y que otro requisito, aparte de la integridad, deberían

reunir?


2020 46

2. ¿Por qué es importante utilizar agua libre de nucleasas en la técnica de PCR?

3. Observe los siguientes primers. Con base en lo enseñado, ¿cuál opción, diseñada

para analizar la expresión de un gen X en muestras de rata, le parece el más

apropiado para llevar a cabo una PCR convencional? Justifique su elección.

✓ Opción 1

✓ Opción 2

✓ Opción 3

4. En el próximo Trabajo Práctico se desarrollará la técnica de PCR. Por consiguiente,

teniendo en consideración lo aprendido en el curso “Microbiología General- Tema 2:

Esterilización”, acondicione todo el material a utilizar y proceda a esterilizarlo en

autoclave. También prepare etanol al 70% que empleará para la limpieza y

desinfección de pipetas y zona de trabajo.

BIBLIOGRAFÍA

• CK-12 Foundation. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Disponible en:

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-

pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr (última consulta: 13/04/20).

• Salazar Montes AM, Sandoval Rodríguez AS, Armendáriz Borunda JS (2013).

Biología Molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. México:

McGraw-Hill Education.


2020 47


DESARROLLO DE LA RT-PCR

OBJETIVO

-Desarrollar la técnica RT-PCR en el laboratorio.

-Poner en práctica lo aprendido sobre uso de

micropipetas.

-Instruirse en el uso del termociclador.

PROTOCOLO

→Recuerde utilizar los EPP para evitar contaminación cruzada.

→Limpiar la mesada y las micropipetas con etanol al 70%. Controlar que las pipetas

funcionen adecuadamente según lo enseñado en el TP N° 5.

→Salvo indicaciones específicas, mantener las muestras y los reactivos sobre hielo picado.

*Materiales necesarios: microtubos de 0,2 y 1,5 ml estériles; micropipetas; tips

estériles; hielo; descartador. REACTIVOS: muestra (2 µg de ARN); dNTPs; Hexámeros;

Agua libre de nucleasas; M-MLVRT 200U y su Buffer; GoTaq y su Buffer; fordward (FW)

primer y reverse (RV) primer. EQUIPOS: termociclador, baño termostático.

− Set de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) marca Promega: cada dNTP viene en una

concentración de 100 mM. Llevar a una concentración final de 10 mM con agua libre

de nucleasas, preparándolos juntos dentro de un microtubo estéril. Para ello:

10 ul de c/u = 40 μl + 60 μl agua libre de nucleasas= 100 μl dNTPs (10mM)

− Hexámeros/ Random Primers marca Biodynamics: vienen en concentración 2 μg/μl

(volumen= 20 μl) y se necesitan diluir a 1 μg/μl. Entonces, al vial de tapa roja

agregar, por única vez, 20 μl de agua libre de nucleasas (1μg/μl).

*Si se utilizan reactivos de diferentes marcas, leer detenidamente las instrucciones del

fabricante.


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Obtención del ADNc (RT)

a) En un microtubo para PCR de 0,2 ml estéril ubicado sobre hielo, colocar x μl de

muestra (2 µg), 1 µl de hexámeros (1μg/μl) y llevar con agua libre de nucleasas hasta

un volumen final de 15 µl (trabajar siempre con los reactivos y muestras sobre hielo).

Calentar los microtubos a 70 ºC por 10 min, luego pasar inmediatamente a hielo

picado durante 5 min y, posteriormente, hacer un spin en microcentrífuga.

b) Preparar la mix dentro de un microtubo de 1,5 ml según el número de muestras + 2

(como margen de error y considerando la incorporación de un control). Por ejemplo,

si tenemos 8 muestras:

M-MLV Buffer Promega 5 µl---------------5 µl x 10= 50 µl

dTNPs (10mM) 5 µl--------------------------5 µl x 10= 50 µl 110 µl/10= 11 µl c/u

M-MLVRT 200U Promega 1 µl------------1 µl x 19= 10 µl

c) A los microtubos del punto 1, agregar 11 µl de la mix. Volumen final= 26 µl. En

termociclador, someter a los tubos a un ciclo de 60 min a 37 ºC.

PCR

d) Colocar la muestra (1,25 μl ADNc) en microtubos de PCR estériles de 0,2 ml,

previamente rotulados.

e) Preparar la master mix en un tubo plástico de 1,5 ml. La Taq polimerasa se debe

adicionar al final y devolver lo antes posible al freezer -20°C.

Por cada muestra:

Buffer 5X Promega (con MgCl2 incluido)------------- 5 µl

dNTPs (10mM)---------------------------------------------- 0,5 µl

FW primer ---------------------------------------------------- 0,5 µl

RV primer ---------------------------------------------------- 0,5 µl

Agua libre de nucleasas---------------------------------- 17,125 μl

GoTaq® DNA Polymerase Promega------------------ 0,125 µl

_________

Σ = 23,75 µl Mix + 1,25 muestra

= 25 µl volumen final


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f) Iniciar la reacción de PCR en el termociclador. Por ejemplo, para 3β-HSD (enzima de

síntesis de progesterona), 20α-HSD (enzima que degrada a progesterona) y S16

(control endógeno), disponibles en nuestra cátedra, los ciclos son:

*Recordar siempre secar todos los tubos con papel absorbente antes de colocarlos en

el equipo, y asegurarse de que estén debidamente tapados.

ANEXO: limpieza y mantenimiento preventivo del termociclador

Para mantener el termociclador en condiciones óptimas de trabajo, después de desconectarlo de la corriente

eléctrica y verificar que no está caliente hay que realizar las siguientes operaciones de limpieza:

1) Limpiar la carcasa o parte externa con un paño suave, ligeramente humedecido en una solución jabonosa de

pH neutro (no usar ceras o abrasivos).

2) Limpiar los pocillos de la placa con bastoncillos de algodón humedecidos en isopropanol o en metanol. El

área térmica de la tapa debe limpiarse también con un paño o papel suave humedecido en isopropanol. Si los

pocillos del bloque térmico están muy sucios hay que utilizar bastoncillos humedecidos en una solución de

hipoclorito sódico al 1%, y a continuación completar la limpieza con etanol 95%. Los pocillos no deben quedarse

húmedos nunca.

3) Limpieza del sistema de ventilación. Es muy importante que no esté obstruido por partículas adheridas,

para lo cual no debe haber tener otro equipo que genere calor o que requiera aire en un radio de 30 cm. El

proceso de limpieza es el siguiente:

3.1) Desconectar el equipo de la corriente eléctrica y esperar unos minutos para evitar daños por cargas

electrostáticas.

3.2) Utilizar una brocha pequeña para eliminar las obstrucciones, y pasar un paño humedecido en

isopropanol. No se deben usar ceras, agentes abrasivos, solventes o soluciones ácidas.

BIBLIOGRAFÍA

• IdiPAZ. Manual Termociclador. Disponible en:

http://www.idipaz.es/ficheros/files/Que%20es/2015/TERMOCICLADOR(2).pdf (última

consulta: 13/04/2020).


2020 50


ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA PARA LA SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS

DE ADN

OBJETIVOS

-Adquirir experiencia en el armado de geles de agarosa y la técnica de electroforesis

horizontal.

-Comprender cómo analizar e interpretar la foto de un gel de agarosa.

INTRODUCCIÓN

La electroforesis en gel de agarosa es la forma más eficaz de separar fragmentos de

ADN de diferentes tamaños. La agarosa es un polímero lineal compuesto de residuos

alternantes de D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa unidos por enlaces glucosídicos α

(1→3) y β (1→4) formado por galactosas alfa y beta, que se extrae de las algas de los

géneros Gellidium y Gracillaria. Las cadenas del polímero de agarosa forman fibras

helicoidales, que al solidificar forma una malla tridimensional con canales de 50 nm a más

de 200 nm de diámetro.

Existen diferentes tipos de agarosa que se clasifican en función de la temperatura a la

que se disuelven y solidifican. Las agarosas estándar se disuelven en buffer a una

temperatura de 90-95 °C y solidifican a 35-45 °C. Las agarosas de bajo punto de fusión se

disuelven a unos 65 °C y solidifican a 30-35 °C. Existen además otros tipos, como las

agarosas de alta fuerza de gel o las de baja viscosidad, que permiten respectivamente una

mejor separación y un rango inferior del tamaño de las moléculas a separar. La

concentración (p/v) de la agarosa es un parámetro de gran importancia, pues determina el

rango de tamaños en los que obtendremos una buena separación de los fragmentos de

ADN (ver Tabla 1).


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Tabla 1. Rango de separación de tamaños de ADN en función de la concentración y el tipo de agarosa.

Fuente: Fierro Fierro, 2014.

Para separar el ADN utilizando electroforesis en gel de agarosa, la muestra se carga

en pocillos prefabricados en el gel (Figura 1) y se aplica corriente. Sometidos a un campo

eléctrico, la carga neta negativa del ADN (aportada por el grupo fosfato) hará que estos se

muevan en dirección al ánodo. Si se fuerza a los ácidos nucleicos a moverse a través de un

gel formado por una malla tridimensional de un polímero como la agarosa, la fricción hará

que las moléculas de mayor tamaño migren con más lentitud, mientras las de menor tamaño

avanzan más en el gel, permitiendo que las diferentes moléculas se separen en función de

su tamaño. Del mismo modo, moléculas de ADN con topologías o estructuras

tridimensionales diferentes también se comportarán de forma diferente ante la fricción con la

malla del polímero, permitiendo su separación.

Luego de la separación, las moléculas de ADN pueden ser visualizadas bajo luz UV

después de la tinción con un colorante adecuado.


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Figura 1. Procedimiento y materiales para la polimerización de un gel de agarosa. Fuente:

http://conogasi.org/articulos/metodo-gel-de-electroforesis-agarosa.

GelRed

Es un tinte fluorescente intercalante para ácidos nucleicos, muy estable, utilizado en

técnicas de biología molecular para la electroforesis en gel de agarosa. GelRed consiste

estructuralmente en dos subunidades de etidio que están unidas por un separador lineal

oxigenado.

Su fluoróforo, y por lo tanto sus propiedades ópticas, son esencialmente idénticas a las

del bromuro de etidio. Cuando se expone a la luz UV, fluoresce con un color naranja que se

intensifica fuertemente después de unirse al ADN. La sustancia se comercializa como una

alternativa menos tóxica y más sensible al bromuro de etidio. GelRed se vende como una

solución en dimetilsulfóxido (DMSO) anhidro o agua ultrapurificada.

Agarosa vs Poliacrilamida

La electroforesis en geles de agarosa es el método estándar para separar fragmentos

de ADN; no obstante, estos geles tienen un poder de resolución mucho menor que los de


2020 53

poliacrilamida, porque no permiten separar moléculas de ADN que difieren en menos de

unas 50 pb. Sin embargo, el rango de tamaños que pueden separarse es mucho mayor:

moléculas desde 100 pb hasta 25 kb, dependiendo de la concentración del mismo. Por su

parte, la electroforesis en geles de poliacrilamida, aunque tiene una mayor limitación en

cuanto al tamaño de los fragmentos que podemos separar (5-600 pb), posee un poder de

resolución mucho mayor, permitiendo la separación de moléculas que difieren en un sólo par

de bases. Otra diferencia, es que los geles de poliacrilamida se corren de forma vertical y

tienen la desventaja de ser más complicados en su elaboración y manipulación.

PROTOCOLO

A partir de los productos de PCR obtenidos en el práctico anterior, continuaremos con

el presente protocolo.

→Limpiar la mesada y las micropipetas con etanol al 70%. Controlar que las micropipetas

funcionen adecuadamente según lo enseñado en el TP N° 5.

*Materiales necesarios: micropipetas; tips estériles; erlenmeyer de 150 ml;

descartador. REACTIVOS: solución TBE (Tris, Ac. Bórico, EDTA) 1x pH 8,3 (500 ml);

GelRedTM; marker. EQUIPOS: cámara horizontal de electroforesis con los accesorios

correspondientes (molde para hacer el gel, peine, cables para conectar a la fuente de

alimentación); fuente de alimentación o de poder; transiluminador; equipo fotográfico que

permita tomar fotos del gel.

a) Determinar la concentración y volumen de gel que se necesita para separar los

fragmentos de ADN en estudio.

b) En el matraz de Erlenmeyer colocar X gr de agarosa y X ml de TBE 1X para

preparar, por ejemplo, un gel al 2%.

c) Llevar a microonda, baño térmico o llama de Bunsen hasta fundir la mezcla de

agarosa/buffer. En intervalos de 30 seg, retirar el matraz y agitar el contenido para

mezclar bien. Repetir hasta que la agarosa se haya disuelto completamente.

d) Adicionar 3 μl de GelRed.

e) Verter la agarosa fundida en el molde de gel. Colocar los peines.


2020 54

f) Dejar gelificar por al menos 30 min.

g) Retirar los peines y colocar el gel en la cuba.

h) Sembrar el marker/ DNA Ladder (leer las instrucciones del fabricante) y las muestras

(10 μl). Si se utiliza Buffer 5X Promega, las muestras pueden sembrarse

directamente. De lo contrario, se necesitará prepara un buffer de carga: 0,25% azul

de bromofenol, 0,25% cianol xileno, 30% de glicerol.

i) Correr a 90 volt 30 min aproximadamente.

j) Cuando se haya completado la electroforesis, apagar la fuente de alimentación y

retirar el gel de la cubeta.

k) Colocar el gel en transiluminador UV (usar gafas para proteger los ojos). Visualizar

las bandas y fotografiar.

l) Retirar el gel y limpiar el transiluminador con papel y etanol al 70%.

m) Deseche el gel de acuerdo a las normas de la institución y recuperar el buffer TBE

1X (puede reutilizarse 3-4 veces). Lavar la cuba con agua destilada.

n) Utilizar el programa Image J (Image Processing and Analysis in Java from

http://rsb.info.nih.gov/ij/), para cuantificar el valor de intensidad promedio de cada

banda y semicuantificar, normalizando contra el valor de intensidad promedio de la

banda de S16. Los resultados se expresan en Unidades Relativas.

Tamaño de los fragmentos esperados según los primers utilizados:

FW primer RV primer Producto

3β-HSD GTCTTCAGACCAGAAACCAAG TAAGGCACAAGTATGCAG 447 pb

20α-HSD TTCGAGCAGAACTCATGGCTA CAACCAGGTAGAATGCCATCT 440 pb

S16 CGTTCACCTTGATGAGCCCATT TCCAAGGGTCCGCTGCAGTC 100 pb

Para desarrollar en grupo:

1. ¿Se obtuvieron las bandas esperadas? ¿Qué interpretación hacen de los resultados?

2. ¿Se observaron bandas inespecíficas? De haber observado, ¿qué creen que pudo

haber sucedido? ¿Qué cambios harían?


2020 55

3. ¿Consideran que un estudio de expresión génica es suficiente, por ejemplo, para

concluir si incrementó o no la síntesis de una proteína? ¿Por qué?

4. En base de datos, busquen al menos un trabajo donde hayan utilizado la técnica de

RT-PCR. Comenten para qué propósito fue aplicada.

BIBLIOGRAFÍA

• CK-12 Foundation. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Disponible en:

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-

pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr (última consulta: 13/04/20).

• Fierro Fierro F (2014). Electroforesis de ADN. En: A. Cornejo-Romero, A. Serrato-

Díaz, B. Rendón-Aguilar y M. G. Rocha-Munive (eds.). Herramientas moleculares

aplicadas en ecología: aspectos teóricos y prácticos. México: Semarnat, INECC,

UAM-I; 27-51.

• Lee PY, Costumbrado J, Hsu CY, Kim YH (2012). Agarose gel electrophoresis for

the separation of DNA fragments. J Vis Exp; (62):e3923.


2020 56


FUNDAMENTOS SOBRE EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

OBJETIVO

-Conocer y comparar diferentes métodos para extraer proteínas totales de una

muestra y determinar la concentración en solución.

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son las macromoléculas más abundantes de toda célula. Con la

posibilidad de que 20-22 aminoácidos diferentes se puedan unir en cualquier orden para

hacer polipéptidos de cientos de aminoácidos, tienen el potencial extraordinario de producir

una gran cantidad de variantes. Esto explica las diversas funciones que pueden

desempeñar: estructural (p.ej., colágeno, elastina, queratina), de transporte (p.ej., en el

transporte de oxigeno por la hemoglobina), de reserva (p.ej., caseína y ovoalbúmina, por sus

aminoácidos como elementos nutritivos), como transmisores de información entre células

(p.ej., hormonas proteicas), defensa frente a infecciones (p.ej., anticuerpos), como

elementos esenciales en estructuras motiles y contráctiles (p.ej., actina y miosina en tejido

muscular), y como catalizadores biológicos (enzima) que participan en la mayoría de las

reacciones químicas en los sistemas biológicos.

De allí la importancia de identificarlas, comprender su estructura y función

(proteómica), determinar su expresión (western blot, ELISA) o actividad (técnicas

espectrofotométricas), entre otras. Para ello, primero es necesario extraer las proteínas de

tejidos y células.

Extracción de proteínas

Los métodos más utilizados se basan esencialmente en la homogenización de los

tejidos y la destrucción de los límites celulares, por medio de diferentes procedimientos

mecánicos y/o químicos, con el fin de maximizar la liberación de las proteínas y, al mismo

tiempo, evitar su degradación por factores como la temperatura, o modificaciones por

proteólisis, oxidación, entre otros (revisar los conceptos abordados en Química Biológica-

Tema 2: Introducción al metabolismo. Enzimas. Cinética. Inhibición. Regulación).


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Una de las situaciones que se presenta después de la disrupción celular es la

liberación de proteasas que pueden degradar las proteínas de interés, por lo tanto, es

importante que durante la preparación de la muestra se evite la actividad proteolítica. Entre

las acciones que se realizan para evitar este proceso se encuentran: evitar un exceso de

ciclos de congelación-descongelación, agregar soluciones inhibidoras de proteasas y

trabajar rápido, manteniendo todo sobre hielo.

Para la obtención del extracto proteico, al momento de elegir el protocolo a seguir, es

importante tener en cuenta:

➢ CCaarraacctteerrííssttiiccaass pprrooppiiaass ddee llaa pprrootteeíínnaa: carga, tamaño, solubilidad, localización

celular, función.

➢ MMaatteerriiaall bbiioollóóggiiccoo ddee ppaarrttiiddaa ((aanniimmaall,, vveeggeettaall,, mmiiccrroooorrggaanniissmmooss)):: en el caso de

tejidos animales o vegetales, es necesario disgregarlos antes de proceder a la lisis celular.

En general, se suele realizar una ruptura mecánica grosera empleando un mortero o un

homogeneizador. Si se trabaja con cultivo celular, la extracción puede realizarse

adicionando un detergente, realizando un shock osmótico, o por sonicación.

➢ FFiinnaalliiddaadd ddeell eexxttrraaccttoo pprrootteeiiccoo: esto determinará el buffer de extracción a utilizar,

considerando grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos.

A continuación se presentan algunos de los métodos de lisis celular más comunes:

➢ SSoonniiccaacciióónn: implica pasar una onda de sonido de alta intensidad a través de la

muestra para romper los tejidos y células (Figura 1). La sonicación es fácil y puede aplicarse

a muestras de casi cualquier tamaño, pero debe usarse con cuidado ya que este método

puede causar que las proteínas se sobrecalienten y desnaturalicen (descomposición).

Figura 1. Dispositivo de ultrasonidos VialTweeter. Fuente: https://www.hielscher.com


2020 58

➢ MMoolliieennddaa ccoonn nniittrróóggeennoo llííqquuiiddoo: las muestras se muelen en mortero con el agregado

de nitrógeno líquido para volverlas quebradizas. La molienda implica un bajo riesgo para la

integridad de las proteínas, pero el nitrógeno líquido puede ser peligroso para el operador.

Esta técnica es ideal cuando se trabaja con muestras vegetales.

➢➢ BBeeaadd BBeeaatteerr:: implica someter a la muestra a altas velocidades en tubos con

cuentas de acero, vidrio (sílice) o circonio, agregadas para molerla y liberar los contenidos

subcelulares de ADN, ARN y proteínas (Figura 2). Para evitar el sobrecalentamiento de la

muestra, esto se debe hacer en un ambiente frío y se debe dejar que la muestra descanse y

se enfríe entre ciclos de batido.

Figura 2. Homogeneizador BeadBlaster 24. Fuente: https://www.medicalexpo.es

➢ HHoommooggeenneeiizzaaddoorr: instrumento de laboratorio que disgrega los tejidos y rompe las

células de manera similar a como opera una licuadora (Figura 3). Para evitar que la muestra

se sobrecaliente, se recomienda seguir las mismas indicaciones descriptas para Bead

Beater.

Figura 3. Homogeneizador WiseStir HS-30E. Fuente: https://www.labolan.es


2020 59

➢ BBuuffffeerrss ddee lliissiiss:: es la forma más simple, pero también la más costosa, de lisar

células y tejidos. Los buffers de lisis están diseñados para romper las células y tejidos

químicamente. Existe una amplia variedad de buffers que van desde buffers de lisis suaves

hasta buffers desnaturalizantes fuertes (ver Tabla 1).

Tabla 1: Reactivos comerciales para extracción de proteínas totales. Fuente: https://www.thermofisher.com


2020 60

Por lo general, los buffers usan una combinación de agentes tamponantes, sales,

detergentes, agentes reductores, caotrópicos (que aumentan la solubilidad en agua de las

sustancias no polares y, por ende, tienden a desnaturalizar las proteínas) y enzimas líticas

para liberar proteínas. Para mejorar la extracción de proteínas, el uso de la lisis química

también se puede combinar con las técnicas de lisis mecánica.

Las proteínas también pueden aislarse desde la fase orgánica del TRIzol, siguiendo

las instrucciones del fabricante (ver material complementario/Código QR-Trabajo Práctico N°

6).

Cuantificación de proteínas

La cuantificación exacta de proteínas es esencial para todos los experimentos

relacionados con proteínas y en una multitud de temas de investigación. Se han

desarrollado diferentes métodos para cuantificar proteínas totales (o alguna proteína en

particular). Entre ellos, destacan: la medición de la absorbancia a 280 nm, ácido

bicinconínico, Bradford y Lowry (ver Tabla 2), u otros novedosos ensayos desarrollados por

diferentes empresas comerciales.

Tabla 2: Ensayos comunes para medir proteínas totales. Fuente: Johnson, 2012.

Absorbancia a 280 nm

Los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano confieren a las proteínas su

característico espectro de absorción ultravioleta (UV) a 280 nm. La fenilalanina y los

puentes disulfuro también pueden contribuir a la absorción en esa longitud de onda, aunque

en menor medida. Este método es simple y requiere de un volumen de muestra

extremadamente pequeño. Sin embargo, debe ser pura y no contener componentes no


2020 61

proteicos con el mismo espectro de absorción, tales como ácidos nucleicos contaminantes.

Este método es el más rápido, no requiere de reactivos, la muestra se puede recuperar,

pero es propenso a errores y es menos sensible que los colorimétricos.

Los ensayos colorimétricos más utilizados son:

Ácido bicinconínico (BCA) o ensayo basado en cobre

Tanto el ensayo de BCA como el de Lowry se basan en la conversión del Cu2+ a Cu1+

en condiciones alcalinas, donde la cantidad de Cu2+ reducido depende de la concentración

de proteínas. Esta conversión es definida como la reacción de Biuret, que es influenciada

por cuatro aminoácidos (cisteína, cistina, tirosina y triptófano) y también por la cadena

peptídica (Figura 4).

Figura 4. Esquema de las reacciones que ocurren en el ensayo de BCA. Fuente: Johnson, 2012 (modificada).

BCA es un reactivo cromogénico específico para Cu1+; dos moléculas de BCA

reaccionan con un ion Cu1+ dando como resultado el cambio de color de la solución a

púrpura (coloración que se mantiene estable por varias horas). Entonces, la concentración

de proteínas puede ser determinada espectrofotométricamente a 562 nm. La absorbancia

es directamente proporcional a la cantidad de proteínas presente en la solución y puede ser

estimada por comparación con un estándar de proteína conocido, tal como la albúmina

sérica bovina (BSA).

El ensayo de BCA es más sensible que Lowry y puede realizarse en un amplio rango

de temperaturas. Además, es más tolerante a diversos detergentes iónicos y no iónicos tales

como NP-40, Tritón X-100 y agentes desnaturalizantes como la urea y el cloruro de

guanidinio. Sin embargo, el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), los azúcares reductores

y los lípidos, pueden interferir con el ensayo de BCA. El efecto de estas interferencias puede

ser eliminado o reducido eliminando la sustancia interferente por diálisis o cromatografía de

exclusión molecular, o diluyendo la muestra si la concentración de la proteína es lo

suficientemente alta.


2020 62

Ensayo de Bradford o azul brillante de Coomassie

Involucra la formación de un complejo entre el colorante azul brillante de Coomassie

G-250 y las proteínas en un medio ácido, y su concomitante cambio de absorbancia de 465

a 595 nm. El colorante se une principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina,

histidina y fenilalanina (Figura 5).

Figura 5. Esquema de la reacción que ocurre en el método de Bradford. Fuente: Johnson, 2012 (modificada).

Entre las ventajas de este método se encuentran su compatibilidad con agentes

reductores utilizados para estabilizar las proteínas en solución, los cuales no son

compatibles con el ensayo de Lowry y en algún grado con el ensayo de BCA, y la posibilidad

de medir proteínas de alto peso molecular (el colorante no se une a péptidos de bajo peso

molecular). Además, es simple, rápido y económico.

La principal limitación del ensayo de Bradford es su incompatibilidad con soluciones

básicas y detergentes, los cuales se utilizan de rutina para solubilizar proteínas de

membrana. No obstante, algunas empresas están comercializando un reactivo de Bradford

modificado, para cuantificar los extractos de tejido animal y cultivo celular que contienen

detergente.

La mayoría de los investigadores utilizan BSA como estándar proteico. No obstante,

una de las desventajas de utilizar BSA en Bradford es que produce una fuerte tinción con el

colorante, pudiéndose subestimar el contenido de proteínas. Se recomienda utilizar

inmunoglobulina G (IgG) o lisozima, u otro estándar proteico.

Ensayo de Lowry

Combina la reacción del Biuret (primera reacción) con la reducción del reactivo de

Folin-Ciocalteu por los grupos R aromáticos de residuos de cistina, cisteína, tirosina y

triptófano (segunda reacción). Esto causa un cambio de color a azulado en la solución, con

mayor absorción en el rango de 650 a 750 nm (Figura 6).

Figura 6. Esquema de las reacciones que ocurren en el método de Lowry. Fuente: Johnson, 2012 (modificada).


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Las ventajas de este ensayo son su sensibilidad, exactitud y que el color es estable.

Sin embargo, requiere de más tiempo que otros ensayos y muchos de los compuestos

comúnmente utilizados en los buffers de lisis (tales como: detergentes, glicerol, EDTA, Tris)

interfieren con el ensayo y forman precipitados. El efecto de estas interferencias puede ser

eliminado o reducido diluyendo la muestra, si la concentración de la proteína es lo

suficientemente alta.

La cantidad de proteína en la muestra puede ser estimada utilizando BSA para la

curva de calibración.


Teniendo en consideración la base teórica previa, responda:

1. Si un investigador ha trabajado estimulando ratas durante un mes con un quelante de

cobre y le piden extraer proteínas totales de ovario y luego cuantificarlas porque

necesita realizar Western blot ¿Qué buffer de extracción utilizaría? ¿Qué método de

cuantificación sería el más apropiado? Consulte la Tabla de Compatibilidad de

Sustancias de Noble y Bailey (2009).

2. ¿Qué tipo de agua utilizaría para desarrollar las técnicas colorimétricas? ¿Por qué?

3. Si pretendiera cuantificar la concentración de proteínas en una muestra de suero,

¿qué haría?

4. Si la medición de su muestra se encuentra fuera del rango de la curva de calibración,

¿se puede extrapolar la curva de calibración?

BIBLIOGRAFÍA

• Johnson M (2012). Cuantificación de proteínas. Mater Methods; 2:115

• Noble JE, Bailey MJ (2009). Quantitation of Protein. Methods Enzymol; 463:73-95.


2020 64


CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY

OBJETIVO

-Desarrollar el método de Lowry para la cuantificación de proteínas totales.

-Poner en práctica los conocimientos sobre espectrofotometría.

PROTOCOLO

→Controlar la integridad, ajuste de los mecanismos, y funcionamiento adecuado de las

micropipetas según lo enseñado en el TP N° 5.

*Materiales necesarios: tubos tipo khan; gradilla; vasos de precipitado; micropipetas;

tips; tubos de plástico de 1,5 ml; erlenmeyer (25-50 ml); piseta; papel; descartador; cubeta

plástica para espectrofotómetro. REACTIVOS: muestras otorgadas por el docente (proteínas

extraídas desde la fase orgánica del TRIzol); agua bidestilada; Na2CO3; CuSO4 ⋅ 5H2O;

tartrato sódico-potásico; reactivo de Folin-Ciocalteau; BSA. EQUIPOS: balanza analítica,

espectrofotómetro.

Método de Lowry

a) Preparar las soluciones a utilizar (aplicar los conocimientos adquiridos en Química

Analítica General e Instrumental). Antes de pesar las drogas, recuerde leer las

Fichas de Datos de Seguridad.

-Reactivo A: Na2CO3 al 2% y NaOH 0,1 M en volumen final de 100 ml.

-Reactivo B1: CuSO4 ⋅ 5H2O al 1% en volumen final de 10 ml.

-Reactivo B2: tartrato sódico-potásico al 2% en volumen final de 10 ml.

-Solución patrón de BSA: 1 mg/ml.

b) Enumerar los tubos tipo khan (se recomienda hacer todo por duplicado).


2020 65

c) Pipetear las cantidades de agua bidestilada, solución patrón de albúmina y muestras

en estudio señaladas en la tabla:

Tubo Patrón (BSA)

Muestra (µl)

H2Obd

(µl) Reactivo C

(µl) Folin-

Ciocalteau (µl)

Absorbancia 750 nm

Proteína (µg)

1 0 (Blanco) - 400 2000 200

2 20 µl (20µg) - 380 2000 200

3 40 µl (40 µg) - 360 2000 200

4 60 µl (60 µg) - 340 2000 200

5 80 µl (80 µg) - 320 2000 200

6 100 µl (100 µg) - 300 2000 200

7 Muestra A 10 390 2000 200

8 Muestra A 10 390 2000 200

9

10…

d) Preparar el reactivo C, a partir de A, B1 y B2 en proporciones 100:1:1 (se prepara y

se usa en el momento).

e) Pipetear a todos los tubos el reactivo C. Mezclar el contenido de cada tubo por

agitación con vórtex y dejarlo reposar 15 min en oscuridad.

f) A continuación, añadir a todos los tubos el reactivo de Folin-Ciocalteau (diluir 1:4 en

el momento requerido), mezclando bien por agitación con vórtex. Dejar reposar 30

min en oscuridad para que se desarrolle completamente la reacción coloreada

(Figura 1).

Figura 1. Coloración de la curva patrón luego de la adición del reactivo de Folin-Ciocalteau. Fuente:

http://bioqss.byethost15.com/sat/acordeon/p3.html?i=2


2020 66

g) Encender el espectrofotómetro al menos 30 min antes de su uso para obtener una

perfecta estabilización de su línea de base.

h) Seleccionar la longitud de onda adecuada (750 nm).

i) Ajustar el aparato a transmitancia 100% con el blanco (tubo nº 0).

j) Realizar las lecturas correspondientes. La cubeta se debe limpiar con agua

bidestilada entre muestra y muestra.

k) La concentración que tiene la muestra problema se calcula al extrapolar su

absorbancia en la gráfica de la curva patrón. La misma se expresa en µg/µl.

Para desarrollar en grupo:

1. Indaguen si aquí aplica la Ley de Beer-Lambert.

2. En Excel, analicen el coeficiente de determinación (R2) para la curva patrón ¿Qué

información arroja?

3. ¿Qué concentración de proteínas se obtuvo en cada muestra?

4. ¿Por qué se analiza la absorbancia a 750 nm en la metodología de Lowry?

BIBLIOGRAFÍA

• BIOQUIMICA_LAB. Determinación de la Concentración de Proteína. Disponible en:

http://bioqss.byethost15.com/sat/acordeon/p3.html?i=1 (última consulta: 05/05/20).

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