Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias Biológicas Laboratorio de Biología Molecular y Genética Profesores: Lorena Villarroel

Martin Galaz

TRABAJO PRÁCTICO N°2:

Extracción de DNA plasmidial y electroforesis en gel de agarosa

BIO041

Autores: Cynthia Astudillo Yessica Godoy

Felipe Irarrázabal Mauricio Toloza

Karen Yuri

Fecha: 13 de abril del 2015

Introducción

Los plásmidos son moléculas circulares de DNA que están separados del DNA cromosómico de una

célula. Son de tamaño variable y el tipo de genes que portan pueden conferirle a la célula ventajas

adaptativas, como genes de resistencia a antibióticos, genes de producción de sustancias tóxicas

para otras bacterias o genes que codifican enzimas útiles para degradar sustancias químicas. (1)

Éstos se encuentran naturalmente en bacterias y en células eucariontes.

Para purificar el DNA plasmidial a partir de bacterias, hay tres pasos: el crecimiento del cultivo

bacteriano, la recolección y lisis bacteriana, que corresponde a la recolección de bacterias por

centrifugación a partir del cultivo bacteriano en donde éstas son lisadas por detergentes iónicos,

solventes orgánicos, alcalinos o calor. (2) Y por último la purificación del DNA plasmidial, en donde

éste se obtuvo gracias a los métodos de lisis, pero están contaminados con grandes cantidades de

RNA y DNA cromosomal, por lo que deben ser removidos. Ya obtenido el DNA plasmidial de buena

calidad, éste puede ser visualizado mediante electroforesis.

La electroforesis en gel de agarosa es una técnica que separa fragmentos de DNA según su tamaño.

Consiste en someter los fragmentos de DNA inmersos en este gel a un campo eléctrico. Como las

moléculas de DNA tienen una carga negativa debido a los grupos fosfato que posee, éstas son

atraídas hacia el polo positivo. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las grandes.

Una vez hecha la electroforesis se tiñen las bandas con gel red y al iluminar con luz UV se ven

bandas de fluorescencia que corresponderían a las moléculas de DNA.

En este práctico se hizo la extracción de DNA plasmidial y luego se realizó una electroforesis en gel

de agarosa para así visualizar el plásmido extraído.

Objetivos

Generales: Tener la capacidad de comprender, analizar y realizar de manera eficiente un

experimento de extracción de DNA plasmidial a partir de una transformación bacteriana y ser

capaces de efectuar una electroforesis en gel de agarosa para así visualizar el plásmido extraído.

Específicos:

1. Tener la capacidad de poder realizar la separación de DNA plasmidial.

2. Comprender el procedimiento y realizar una electroforesis en gel de agarosa de manera

eficiente.

3. Tener la capacidad de poder analizar los posibles resultados que se obtendrán del trabajo

práctico.

Materiales y Métodos

Se comienza el práctico preparando 500mL de buffer diluido con 50mL de solución buffer mezclado

con 450mL de agua destilada, a esta solución se le extrajeron 150mL de Buffer para proceder a

mezclar con 1,5 gramos del gel agarosa. Luego a los 150mL de solución buffer en gel agarosa se le

agrega 10μL de gel Red, el cual se intercala en la hebra de ADN para dar fluorescencia roja,

mientras que el buffer tiene por finalidad que las sales hagan circular la corriente de los electrodos en

el proceso de electroforesis. Ya preparada esta solución se introdujo por 5 minutos en el microondas

para que la solución buffer y el gel agarosa se mezclen homogéneamente, hasta hervir y que se

observe transparente sin grumos. Finalmente este gel se introduce en la cámara de electroforesis y

al mismo tiempo se introduce el peine antes que se solidifique el gel.

A nuestro cultivo líquido de caldo control de siembra LB/amp posteriormente incubado, se tapa

correctamente y se procede a revolver en un vórtex para que se re-suspenda, de esto se saca 1,5mL

o 500μL del caldo de DNA (+) introduciéndolo con una micropipeta de 100-1000μL con punta azul

con 3 intentos de 500μL para mayor exactitud en un tubo Eppendorf nuevo, para luego centrifugar a

8000RPM durante 10 minutos formando un pellet en el fondo con las bacterias de estudio que se

desean conservar y retirando el sobrenadante con un giro rápido del tubo en el cementerio. Además

se sacaron 500μL de la solución I (sirve para estabilizar la célula en un tampón) y 5μL de RNAasa (la

RNAasa tiene por finalidad romper el ARN plasmidial porque al revelar en el gel se ven manchones

producto de este ARN) ambas bajo mechero, los cuales se mezclan e introducen en un tubo

Eppendorf donde tenemos el pellet obtenido. A un tubo con DNA (-) también se le agregó de esta

solución I/RNAasa para tener un control negativo, debido a que este no tiene el plásmido, es decir

que al momento de observar ésta no debería aparecer en la cámara de electroforesis. Luego se

transfieren ambas soluciones tanto (+) como (-) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2mL, para

agregar 500μL de la solución II, que es una solución de NaOH (2M) que tiene por función provocar

lisis, esta va a romper la pared celular y ADN cromosomal, por el contrario el plásmido puede

resistirlo ya que es una hebra de ADN circular cerrada covalentemente. Luego estas se mezclan por

inversión de 4-6 veces para obtener un lisado claro (ya agregada la solución II se debe tener en

cuenta que no se deben sobrepasar los 5 minutos con esta solución alcalina ya que produciría

ruptura también del plásmido). Habiendo mezclado cuidadosamente por inversión se procede a

agregar 700μL de Buffer de lavado DNA o solución III, la cual tiene como objetivo neutralizar la

solución II dejando el pH neutro. También se mezcla por inversión de 4-6 veces inmediatamente

después de agregar la solución III y además se centrifuga a máxima velocidad a 13000RPM durante

10 minutos a temperatura ambiente (37°C). Se procede a insertar la columna HiBind DNA mini a un

tubo de 2mL, agregándole 100μL de buffer de equilibrio con el objetivo de provocar su activación,

luego centrifugar a máxima velocidad por 30-60segundos descartando el filtrado. Se trasfiere 700μL

del lisado tanto (+) como (-) a la columna HiBind DNA mini, sin transferir el resto de pellet, en donde

se vuelve a centrifugar a máxima velocidad por 60 segundos descartando nuevamente el filtrado. Se

vuelve a repetir todo este procedimiento hasta que todo el lisado sea transferido. Luego se agrega

500μL de Buffer HB a ambas columnas (tubos) y se vuelve a centrifugar por 60 segundos

(descartando el filtrado).

Se procede a agregar 700μL del Buffer de lavado DNA y centrifugar por 60 segundos, descartando el

filtrado. También se centrifuga la columna vacía durante 2 minutos para retirar los restos de etanol,

traspasando las columnas HiBind DNA mini a nuevos tubos Eppendorf de microcentrifuga de 1,5mL.

Luego se agrega 80-100mL del Buffer de Elución (agua desionizada estéril de pH 8,5) directamente

en el centro de la columna, el cual se mantiene a temperatura ambiente (37°C) durante 1 minuto,

luego se centrifuga a máxima velocidad por 60 segundos.

De ambos tubos de 100μL se extrae 20μL y a estos se le agrega 4μL de la solución cargadora (6X)

en donde hay un colorante bromo fenol que le otorgará la tonalidad azul al DNA (el bromo fenol al

ser una molécula pequeña se adelanta a las proteínas y ácido nucleico indicando cuando detener la

electroforesis). Para finalizar el experimento se procedió a realizar la electroforesis en donde con una

micropipeta de 2-20 uL en el primer bolsillo se introdujo el DNA Ladder, terminado esto se cambia la

punta de la micropipeta por una nueva para agregar al segundo bolsillo el DNA (+) eliminando el

cementerio la punta nuevamente y finalmente en el tercer bolsillo se introdujo la micropipeta con una

punta nueva el DNA (-), finalizado esto se programa la cámara de electroforesis para que funcione

hasta los 45 minutos a 90°C.

Resultados

*Experimento número 1: Transformación Genética Bacteriana

Cálculo de la Tasa de Transformación:

Fórmula:

Tasa de transformación = Nº total de células que crecen en placa / Cantidad ADN (ug) en placa.

1. El Nº total de colonias verde fluorescente que crecen en placa LB/amp/ara 2. Nº de plásmido pGL0 en células bacterianas presente en placa LB/amp/ara Según:

A) Cantidad inicial de ADN al iniciar el experimento.

Formula:

- ADN (ug) = [ADN (ug/uL)] x Volumen ADN (uL)- ADN (ug) = 0.2 (ug/uL) x 10 (uL) - ADN (ug) = 2 (ug)

Nota: La concentración de ADN (ug/uL) se calcula:

- [ADN (ug/uL)] = 50 (ug) ADN / 250 (uL)- [ADN (ug/uL)] = 0.2 (ug/uL)

B) Determinación de la fracción de ADN realmente transferido a la placa de LB/amp/ara.

Fórmula:

- Fracción ADN utilizada = Volumen en placa (uL) / Volumen total tubo (uL)- Fracción ADN utilizada = 100 (uL) / 510 (uL)- Fracción ADN utilizada = 0.2

Entonces Nº de plásmido pGLO en células bacterianas presente en placa LB/amp/ara se calcula:

- ADN pGLO transferido (ug) = cantidad total ADN pGLO usada (ug) x Fracción de ADN pGLO- ADN pGLO (ug) = 2(ug) x 1.96 (ug)- ADN pGL0 (ug) = 3.92 (ug)

Finalmente hacemos el conteo para proceder con el cálculo final de la tasa de transformación:

- Tasa de transformación = 380 (colonias verdes) / 3.92 (ug)- Tasa de transformación = 96.93 (colonias verdes/ ug)

Tras la incubación de las placas a 37°C y situarlas bajo luz UV se observó lo siguiente:

Placas de agar Color Número de colonias

1.- LB/amp/+DNA Blanco (Fenotipo silvestre)

No se aprecian colonias.

2.- LB/amp/ara/+DNA Verde fluorescente No se logra distinguir la cantidad de colonias que hay en la placa. Sólo se ve un manchón de color verde fluorescente.

3.-LB/amp/-DNA No hay crecimiento de colonias por lo tanto no se observa algún color

No se aprecian colonias.

4.- LB/-DNA Blanco (Fenotipo silvestre)

No se aprecian colonias, solo se observa una mancha de color blanco.

RESULTADOS DE EXTRACCION DE DNA PLASMIDIAL Y ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA.

Se observa en la electroforesis en gel de agarosa lo siguiente:

DNA Ladder (escalera):

Se observa la escalera con bandas de referencia (no muy bien demarcadas) que van desde 1kpb a 15kpb.

DNA (+):

Se observa una banda cercana a la banda de referencia de 5kb.

DNA (-):

Se logra apreciar igual a la banda del DNA (+).

Ejercicio

Un biólogo se propone clonar el gen Lys A que está involucrado en la biosíntesis del aminoácido

lisina en Escherichia coli. Se dispone de un vector cuyo mapa genético se representa en la siguiente

figura y corresponde al pBR 322 que posee los genes de resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina.

El pBR 322 se abre por acción de Bam HI. Además, se dispone de DNA proveniente de una cepa

silvestre de Escherichia coli tratado con Bam HI. Estos DNA se mezclan en presencia de la enzima

ligasa. Los plásmidos recombinados producidos por ligación se usan para transformar cepas de

bacterias auxótrofas para lisina [lys A-]. Las bacterias transformadas se colocan en siete medios de

selección y, después de la incubación, se registra la presencia o la ausencia de colonias. Los

resultados se muestran en la siguiente tabla:

1) Enuncie dos hipótesis que expliquen el crecimiento de bacterias en el medio 1.

R: La primera hipótesis podría ser que hay crecimiento de colonias en el medio 1 porque está

ausente tanto la tetraciclina como la ampicilina, éstas serían las que evitarían el crecimiento debido a

que el pBR 322 posee genes de resistencia a éstos.

La segunda hipótesis es que al no estar presente la lisina, no podría afectarle ya que al ser una

bacteria exótrofa, ésta puede producirla y por lo tanto no afecta en su crecimiento.

2) ¿Cuál es el tipo de plásmido presente en las bacterias seleccionadas en el medio 2?

R: Es un plásmido de resistencia, debido a que contiene genes de resistencia a antibióticos como la

tetraciclina y la ampicilina.

3) ¿Qué propiedades debe tener el medio que permite la selección de bacterias que poseen un

plásmido que lleva el gen Lys A silvestre? ¿Por qué?

R: El medio que permitiría la selección de bacterias que poseen el plásmido deseado debería

carecer de los antibióticos y de lisina. Ya que si los antibióticos están presentes es muy probable que

no crezcan las colonias, además al no estar la lisina impediría que las bacterias auxótrofas crezcan

en el medio. Por lo tanto de esa manera las que llevan el gen Lys A podrían sobrevivir.

4) Solamente uno de los siete medios de cultivo utilizados permite seleccionar sin

ambigüedad las bacterias que poseen el plásmido deseado. ¿Cuál es?

R: El medio 4 permite seleccionar sin ambigüedad, debido a que estando solo éste presente en el

medio no hay crecimiento de colonias, no como cuando hay sólo ampicilina en donde de todas

formas hay un crecimiento. Por esa razón la tetraciclina es la que permite la selección de las

bacterias que contienen el plásmido deseado. Además posee la lisina, que al estar en el medio

permite también el crecimiento.

5) ¿Qué se puede concluir en cuanto al lugar donde se localiza el sitio Bam HI en el DNA

vector?

R: Se puede concluir que la diana BamHI está dentro del gen de resistencia a la tetraciclina.

Discusión

Los resultados obtenidos en el experimento N° 1 sobre la transformación a luz normal y bajo luz

ultravioleta no estuvieron tan lejanos de lo esperado. A continuación un análisis de cada placa.

1. Placa LB/amp/DNA+: Crecimiento bacteriano de color blanco (Fenotipo silvestre) con o sin luz

ultravioleta debido a que no expresa el gen GFP, ya que no está presente el azúcar

arabinosa, el cual regula la expresión de dicho gen. (3)

No se aprecian colonias, solo se observa una mancha de color blanco debido a que no se

realizó bien la siembra homogénea en la superficie del agar.

2. LB/amp/ara/DNA+: Crecimiento de color verde fluorescente por la expresión del gen GFP

debido a que está presente la azúcar arabinosa que regula la expresión en dicho gen.(3)

No se aprecian colonias, solo se observa una mancha de color verde fluorescente debido a

que no se realizó adecuadamente la siembra homogénea en la superficie de agar.

3. LB/amp/DNA- : No hay crecimiento bacteriano debido a que estas bacterias no fueron

transformadas con el plásmido pGL0, por ende no poseen el gen de resistencia amp. (3)

4. LB/DNA- : Esta cepa al no ser transformada con el plásmido pGLO no expresa el gen GFP,

pero si presenta crecimiento bacteriano de color blanco (Fenotipo silvestre) debido a que en el

medio de cultivo no está presente la ampicilina.(3)

Por otra parte los resultados de la Extracción de DNA plasmidial y electroforesis en gel agarosa

en el experimento N° 2 no cumplieron nuestros objetivos a cabalidad. Esto porque:

1. En el DNA Ladder las bandas no se ven bien demarcadas debido a que no se utilizó la

concentración de DNA adecuada, en este caso se ocupó más de lo necesario.

2. En la corrida de DNA+ se logró el objetivo ya que se observa solo una banda cercana a la de

referencia de 5kb de DNA Ladder, una cantidad de pb muy cercano al indicado en la guía de

laboratorio para el plásmido PGL0. Esto nos demuestra que el plásmido fue extraído y

purificado correctamente. (2)

3. Finalmente en la corrida DNA- se observa una banda menos definida que en la corrida de

DNA+. Esto que no debiese haber ocurrido se explica por una contaminación de la muestra

DNA- a causa de un mal uso de la micropipeta (No cambiar las puntas cuando corresponde).

Conclusión

En el presente trabajo se logró aprender y comprender el proceso de separación de DNA plasmídico

y purificarlo para su posterior utilización en la digestión de éste mediante el uso de enzimas de

restricción (ARNasa), las cuales nos permiten recombinar moléculas de DNA, pero no son capaces

de cortar éste simplemente en cualquier ubicación, cada enzima tiene una secuencia de DNA

específica a la que se une y lo corta. Se logró comprender el principio de la electroforesis que se

basa en la separación mediante cargas y por tamaño de las hebras de DNA en donde éste con carga

negativa tiene que correr hacia el polo positivo y la utilización de un marcador de peso molecular que

nos permite comparar los diferentes puntos de corte. Se procedió al revelado en donde se tiñen las

bandas de DNA con algún agente fluorescente en presencia de luz ultravioleta dando como resultado

una “escalera” que son los fragmentos de ADN plasmídico. En el práctico se tuvo que mantener un

manejo metódico de los instrumentos, además de seguir adecuadamente los procedimientos que

requerían medios estériles y la preocupación de los estudiantes de seguir las medidas estándar

correspondientes para disminuir los errores y así poder obtener los resultados esperados.

Bibliografía

(1) http://medmol.es/glosario/87/

(2) Universidad Andrés Bello. Guía de laboratorio N°3: Extracción de DNA plasmidial y

electroforesis en gel de agarosa, curso BIO041 Biología Molecular y Genética general, 2015.

(3) Universidad Andrés Bello. Guía de laboratorio N°2: Transformación Genética Bacteriana,

curso BIO041 Laboratorio de Biología Molecular y Genética General, 2015.