Universidad Nacional de RosarioUniversidad Nacional de Rosario

Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasFacultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas

Trabajo Final Trabajo Final

Carrera de Especialización en Bioquímica Clínica:Carrera de Especialización en Bioquímica Clínica:

EndocrinologíaEndocrinología

“……………………………..”“……………………………..”

Presentado por: Bioq. Lo Pilato Rosa MabelPresentado por: Bioq. Lo Pilato Rosa Mabel

Director: Dr. Ghersevich SergioDirector: Dr. Ghersevich Sergio

1

Rosario, ArgentinaRosario, Argentina

20132013

Título: “…………………………..”

Autor: Lo Pilato Rosa M.

Título de grado: Bioquímica, otorgado por la Universidad Nacional de UNR

Este Trabajo Final es presentado como parte de los requisitos para optar al grado académico de

Especialista en Bioquímica Clínica: Endocrinología, de la Universidad Nacional de Rosario y no ha

sido presentado previamente para la obtención de otro título en ésta u otra Universidad. El mismo

2

consistió en una revisión monográfica y en un trabajo experimental realizado bajo la dirección del

Dr. Ghersevich Sergio

3

DEDICATORIA

4

INDICE

5

ABREVIATURAS

6

INTRODUCCIÓN

ESTRUCTURA QUIMICA DE TSH

La hormona estimulante de tiroides (TSH) es una hormona glicoproteica e

hidrosoluble, con un peso molecular de 28.000 a 30.000 daltons, producida y

secretada por las células tirotropas adenohipofisarias.

Las hormonas glicoproteicas de la adenohipófisis (TSH; hormona luteinizante, LH;

hormona folículo estimulante, FSH; gonadotropina coriónica humana, hCG) están

formadas por dos subunidades denominadas alfa y beta unidas de forma

covalente. Cada una de las subunidades se sintetiza de manera independiente a

partir de RNA mensajeros (mRNA) diferentes. La subunidad alfa es común para

las cuatro hormonas en tanto que la beta es exclusiva de cada una y confiere la

especificidad biológica. Las subunidades, cuando actúan de manera

independiente, son biológicamente inactivas.

La subunidad alfa es más abundante que la beta y se puede encontrar libre en el

plasma. La subunidad beta, por el contrario se encuentra en el plasma en

concentraciones menores y es de difícil detección con los medios de análisis

convencionales (Ross y col., 1983). Esta presencia en exceso de subunidad alfa

ha llevado a pensar que la regulación de la síntesis de la subunidad beta es el

factor limitante en la síntesis hormonal, si bien la glucosilación puede desempeñar

también un importante papel (Weintraub y cols., 1985).

Mediante técnicas de clonación molecular se ha determinado la secuencia de

bases de ambas subunidades (Hirai y cols. 1989) así como su estructura (Reichert

y cols. 1991)

La secuencia primaria de las subunidades de TSH es especìfica de especies, por

ejemplo la Tsh humana difiere de la bovina en 28 aminoàcidos en la subundidad –

alfa y 12 en la subunidad beta.(Szkudlinsk,2002)

7

GENES QUE CODIFICAN TSH

Las subunidades alfa y beta de TSH son codificadas por genes localizados en

cromosomas 6 y 1 respectivamente.

La subunidad alfa está formada por una cadena de 92 aminoácidos en el hombre y

96 en otras especies animales, con dos grupos carbohidrato unidos al grupo N-

terminal. Su peso molecular es de 20 a 22 kDa y es codificada por un gen

localizado en el cromosoma 6q2 1y1-q23 (Fiddes y cols. 1984), con un tamaño de

13.5 kb que consiste en cuatro exones y tres intrones. El mRNA de la subunidad

alfa tiene una longitud entre 730 y 800 bases y codifica tanto la subunidad alfa

como una secuencia residual de 24 aminoácidos.

Por lo que respecta a la subunidad beta tiene un peso molecular de 18 kDa, está

formada por 110 a 112 aminoácidos y contiene un complejo carbohidrato a nivel

N-terminal (Pierce, 1971, Giudice y cols. 1977).

El gen de la subunidad beta de la TSH humana está localizado en el cromosoma

1p22 (Dracopoli y cols. 1986) y ha sido clonado en diferentes especies animales

incluida la rata (Chin y cols. 1985a, 1985b) y el hombre (Wondisford y cols. 1988).

El mRNA que codifica el precursor de la subunidad beta de la TSH tiene una

longitud de 700 bases.

Un esquema de estos genes se muestra en la figura 1.

Las mutaciones y polimorfismos en los genes que codifican estas hormonas son

relativamente poco frecuentes, al parecer a causa de su papel vital en la

regulación de las funciones metabólicas. Sin embargo, unas pocas alteraciones

genéticas en estos genes han sido identificados y ofrecen información valiosa,

sobre las relaciones estructura-función de las hormonas glicoprotèicas.

Algunos de los polimorfismos son relativamente frecuentes y pueden cambiar la

inmunorreactividad de la hormona, que puede resultar en hallazgos de laboratorio

anómalos (Alevizaki M, Huhtaniemi I., 2002)

8

Hipotiroidismo central aislado (ICH), debido a las mutaciones

de gen TSHb ha sido reportado en algunos pacientes. El trastorno se caracteriza

generalmente por los niveles de TSH indetectable, baja o normal,

dependiendo de los métodos de medición de TSH, acompañado de niveles bajos

de T4 y T3 libre. Los valores de TSH fueron altamente

variable en función del método de medición utilizado, mientras que se detectaron

niveles extremadamente altos niveles circulantes de la subunidad TSHa libre. A

pesar del hecho de que TSHb mutante carece de 60% de la C-terminal

secuencia de aminoácidos, forma con la subunidad TSHa un heterodímero

con inmunorreactividad conservada, en alguna medida, para los distintos métodos

de dosaje, pero el heterodímero mutante es completamente desprovisto de

bioactividad. La alta circulación libre de la glicoproteína A ,los niveles de TSH

variables, y, posiblemente, hiperplasia pituitaria glándula son el sello de la ICh

debido a mutaciones del gen TSHb.(M.Bonomi y cols, 2001)

Figura. 1. Estructura de los genes que codifican las subunidades de la hormona estimulante de la tiroides (TSH). Los

exones se indican mediante las cajas, y los intrones se indican mediante líneas. La longitud de los exones y los intrones se

muestran en la pares de bases. Codificación de las regiones de los exones están sombreadas; regiones no codificantes son

de color blanco. El sitio de inicio de transcripción se muestra por una inclinación flecha. Este diagrama sirve para ilustrar la

estructura general de cada gen, y está dibujado a escala. . (Adaptado de Rawal,2012) .

9

SINTESIS Y SECRECION

Lo mismo que sucede con la mayoría de las hormonas, el inicio de la síntesis de

TSH tiene lugar en el núcleo con la transcripción de la información genética en el

precursor del RNA mensajero (pre-mRNA).

A continuación se produce un proceso post- transcripcional de ruptura del RNA,

escisión de intrones y reagrupamiento de exones que da como resultado la

formación del mRNA.

Los extremos del mRNA se modifican por adición de capas de metilguanina en el

extremo 5' y de grupos de poli(A) en el extremo 3'. En el citoplasma, el mRNA se

ensambla a los ribosomas y a los aminoácidos, que son transportados por el RNA

de transferencia (tRNA), se polimerizan en una cadena polipeptídica. El punto final

de la síntesis proteica es el proceso post-translacional.

Este proceso tiene lugar tanto durante el crecimiento del péptido en formación (co-

translación) como después de la formación de la cadena completa (post-

translación). Durante esta fase se producen:

* ruptura de la cadena polipeptídica convitiéndose de esta forma las pre-

prohormonas en las hormonas definitivas,

* derivaciones de aminoácidos (glucosilación en unos casos, fosforilación en

otros),

* formación de uniones y ensamblaje de la cadena polipeptídica en su estructura

definitiva.

En todos estos procesos se requiere un transporte unidireccional de la cadena

polipeptídica a través de la doble membrana del retículo endoplásmico, lo que

lleva a un secuestro del polipéptido dentro de las cisternas del RER, su paso al

aparato de Golgi y la posterior liberación de las proteínas por la célula.

La mayoría de los cambios postranslacionales ocurren dentro de la célula

(presecretorios) y en algunos casos fuera de ella (postsecretorio). Un esquema del

proceso de síntesis descrito aparece en la figura 2.-

10

Figura 2. Esquema de las fases principales de la síntesis de las hormonas polipeptídicas: 1.- Transcripción del DNA en el

pre-mRNA; 2.- Procesos postranscripcionales y formación del mRNA y adición de "capas" de metilguanina (*) en el extremo

5' y de poli(A) (*) en el extremo 3'; 3.- Ensamblaje del mRNA a los ribosomas y formación de la pre-prohormona; 4.-

Formación de la prohormona; 5.- Formación de la hormona; 6.- Secreción. N = núcleo; R = ribosomas; RER =

retículoendoplásmicorugoso.(Adaptadodehttp://163.178.103.176/CasosBerne/8hEndocrino/Caso45-1/HTMLC/CasosB2/

Uno/hormona_7.html).

Algunas de las etapas de la síntesis de las hormonas polipeptídicas hipofisarias

son demostrables utilizando diversas técnicas y la microscopía electrónica permite

estudiar la participación de las diferentes organelas citoplasmáticas en los

procesos de transporte y secreción. Las primeras vesículas son transportadas e

incorporadas al aparato de Golgi donde se forman los gránulos secretores. Tras su

transporte hasta la membrana plasmática, los gránulos se fusionan con ella y

mediante un proceso de exocitosis se libera el contenido granular (hormona) al

espacio extracelular. No obstante, parte de la hormona es transportada por

vesículas y gránulos inmaduros, y otra es hidrolizada intracelularmente. Aunque

los mecanismos intrínsecos implicados en el transporte de los gránulos secretores

no están completamente aclarados, el transporte vesicular es el más aceptado.

Además, en las células de TSH es realizado, al menos en parte, por los

microtúbulos (Kurosumi,1991).

11

Los niveles de hormonas tiroideas circulantes están fuertemente regulados por la

tirotropina (TSH), que también representa el marcador diagnóstico más importante

para la función tiroidea

ESTRUCTURA DE LAS SUBUNIDADES

La TSH estructuralmente está clasificada como parte de la superfamilia CKGF

(cystine-knot growth factor)-

La estructura cristalina reveló que cada subunidad contiene un núcleo de Cystina y

tres bucles , 2 orquillas (Beta1-Beta2) unidas a un lado del núcleo y hacia el otro

lado uno largo; que contiene 3 vueltas de alfa hélice (alfa1, alfa 2, alfa 3) que

constituye la secuencia alfa. (Szkudlinsk,2002)-

Un esquema de esta estructura se muestra en la figura 3

12

Figura 3: El dibujo esquemático de hTSH que muestra dominios importantes para la bioactividad. Para mayor claridad, las

cadenas de carbohidratos no se muestran. La subunidad alfa de la cadena principal se muestra como una línea gris, y la

Subunidad beta se muestra como una línea de color negro. Los dominios funcionalmente importantes están marcados con

dibujos de líneas entrecortadas. (Adaptado de Szkudlinsk,2002)-

MODIFICACIONES POSTRANSLACIONALES

GLICOSILACION

Una de las etapas postranslacionales fundamentales en el proceso de síntesis de

la TSH es la glicosilación. Se realiza por la adición de oligosacáridos preformados

unidos a la asparagina en el retículo endoplásmico rugoso y sucesivas

modificaciones en el aparato de Golgi hasta que la hormona se almacena en los

gránulos de secreción. Se sabe que la glucosilación de las subunidades las

13

protege de la degradación intracelular y permite la formación de los enlaces

disulfuro entre las cadenas; este proceso es, por tanto, esencial para que la

hormona funcione con normalidad (Menezes-Ferreira y cols. 1986, Wondisford y

cols. 1988).

Se ha demostrado que la glicosilación en TSH humana

puede activar el fosfato inositol y cAMP las vías de transducción de señales en

diferentes grados.

Se confirma una mayor proporción de isoformas sialiladas de TSH en suero de

pacientes con hipotiroidismo primario. En contraste, los pacientes con

hipotiroidismo subclínico tienen una proporción menor de isoformas sialiladas.

Las dosis farmacológicas de TRH pueden causar un incremento en la cantidad de

TSH para ser liberado, pero no en la proporción de isoformas.

Las funciones fisiológicas de Isoformas de TSH no son todavìa precisamente

diluciladas, pero la modulación de la heterogeneidad de TSH por la regulación de

glicosiltransferasas puede ser un mecanismo para estimular aún más la función

tiroidea (Trojan,1998)t

Estudios realizados demuestran que los cambios en la glicosilación terminal altera

la expresión del epítope de TSH y de ese modo induce el reconocimiento de

anticuerpos altamente variable, dando lugar a discordancias significativas entre las

mediciones hormonales.

SULFONACION

La sulfonación de hormonas de glicoproteínas, pituitarias, especialmente LH y

TSH, no afecta a la unión a sus receptores afines, sin embargo, la sulfonación

juega un papel importante en su aclaramiento plasmático, lo que indirectamente

tiene un efecto significativo sobre la actividad biológica.

La sulfonación es una modificación postraduccional ubicua de hormonas y

componentes extracelulares que pueden conducir a dramáticos cambios

estructurales en las moléculas afectadas, la importancia biológica está empezando

a ser apreciada.(Strott y col,2002)

14

ROL DE LOS SEIS AMINOACIDOS DEL CABOXILO TERMINAL

La secuencia de nucleótidos del gen de la hormona estimulante de la tiroides

humana (TSH) puede codificar una proteína de 138 aminoácidos. Sin embargo, el

polipéptido maduro carece de 6 aminoácidos del carboxilo-terminal (C-terminal), lo

que sugiere la escisión postraduccional de estos residuos.

Para analizar una posible función de estos 6 aminoácidos, se sintetizò dos ADN de

cadena beta deTSH con o sin los 6 codones para la extensión C-terminal, junto

con ADN de la subunidad alfa en células CHO (células derivadas de ovario de

hámster chino Cricetulus griseus), se determinó la secuencia de aminoácidos del

C-terminal de cadena beta de TSH y propéptidos de cadena beta de TSH sin C-

terminal ,La TSH con subunidad alfa asociada al heterodìmero, o a los propéptidos

mostró bioactividad normal en el bioensayo.

Estos datos indican que los 6 aminoácidos C-terminal de la cadena beta no es

necesaria para la maduración TSH en el proceso de la biosíntesis y para su

bioactividad (Takata,1989)

RITMO CIRCADIANO

La TSH es secretada al espacio extracelular, y de allí a los capilares hipofisarios,

con ritmo pulsátil y circadiano. Por lo que se refiere al primero, se caracteriza por

fluctuaciones a intervalos entre 1 y 2 horas a lo largo de las 24 horas (Roelfsema y

cols. 1989). Las variaciones circadianas se corresponden con valores máximos

entre las 22 y las 6 hs, que precede al ritmo del sueño y que al parecer es

independiente del ritmo del cortisol; y mínimos entre las 16 y las 19 h. (Patel y

cols. 1972, Weeke 1973). (Figura 4)

TSH es secretada de forma pulsátil (Brabant G y col, 1986) con una amplitud de

pulso media de 0,6 mU / L y una frecuencia de 5 a 20 por 24 horas [(Greenspan

SLy col,1986). Los experimentos sugieren que no existe una correlación entre la

secreción pulsátil de la TRH y TSH (Samuels MH y col, 1993). .

Los pulsos de TSH se superponen por un ritmo de 24 horas que conduce a la

secreción de TSH máximo poco después de la medianoche (Brabant G y col,

1990). Curiosamente, la interacción parece ser más que la suma pura como la

15

amplitud de pulsos cortos de TSH, y también se eleva en la segunda mitad de la

noche. Por lo tanto, a diferencia de la frecuencia de los pulsos rápidos, su amplitud

y la del ritmo diurno de TSH parecen estar controlados por TRH, como se

demuestra en cortes de hipotálamo de rata (Covarrubias y col, 1994).

Los mecanismos que subyacen a este hecho, así como las causa de este ritmo

circadiano son desconocidos. (Ramírez-Hoffmann, 2007)

Figura 4. Ritmo de secreción de TSH en un individuo normal durante 24 horas. (adaptado de Ramirez-Hoffman, 2007)

EFECTOS DE TSH SOBRE TIROIDES

Tabla 1: acción de TSH sobre tiroides

• Aumenta la hidrólisis de la tiroglobulina.

• Estimula la hormonogénesis, la secreción, la proliferación celular y la

angiogénesis tiroidea.

16

• Estimula todas las fases del metabolismo del yodo (captación del yodo,

organificación del yodo por medio del cual transforma las tironinas a

tirosinas luego de la iodación).

• Aumenta la actividad lisosomal provocando un aumento de T3 y T4

glandular.

• Incrementa el ARN mensajero para la tiroglobulina y peroxidasa tiroideas

con aumento en la incorporación de ioduro en MIT (monoiodotironina), DIT

(diiodotironina), T3 y T4.

• Actúa en el metabolismo de la glándula: oxidaciones, síntesis de

fosfolípidos, síntesis de proteínas.

• Estimula el crecimiento celular, aumenta el tamaño de las células tiroideas,

incrementa la vascularización y con el tiempo se presenta crecimiento

tiroideo o bocio.

• Estimula la captación y oxidación de la glucosa, el consumo de oxígeno,

reducción del consumo de CO2.

• Actúa sobre la síntesis de hormonas tiroideas, exocitosis, endocitosis y

secreción hormonal. (Molero Garcìa y col, 2008)

MECANISMO DE ACCION DE TSH A NIVEL TIROIDEO

Tabla 2

. Aumento de los niveles de AMPc

. Aumento de los niveles de GMPc

. Aumento de la síntesis de prostaglandinas

. Activaciòn del metabolismo del fosfoinositol (Dieguez y col. Libro)

EFECTOS FISIOLOGICOS DE LAS HORMONAS TIROIDEAS

Tabla 3

Incrementa el gasto cardiaco.

Incrementa la frecuencia cardiaca.

17

Potencia el desarrollo del cerebro.

Incrementa el metabolismo de proteínas y carbohidratos.

Incrementa la tasa de ventilación.

Incrementa el metabolismo basal.

Generación de calor.

Aumenta el número de receptores de catecolaminas y amplifica la

respuesta postreceptor en el sistema simpático.

Aumenta la eritropoyetina.

Regula el metabolismo óseo.

Permite la relajación muscular.

Engruesa el endometrio en las mujeres.

Interviene en los niveles de producción de hormonas gonadotrofinas y

somatotropa o GH.

Permite la respuesta correcta del centro respiratorio a la hipoxia e

hipercapnia.

REGULACION DE LA FUNCION TIROIDEA

El control de la secreción prehipofisiaria lo ejerce la TRH (hormona de liberación

de tirotropina). Esta hormona ejerce una acción directa sobre la hipofisis anterior,

aumentando la secreción de TSH. La exposición al frío aumenta el ritmo de

secreción de TSH por la prehipòfisis. Se ha comprobado que los seres humanos

que se desplazan a regiones árticas tienen metabolismos basales de 15% a 20 %

superiores al normal, sin embargo si el hombre se abriga el efecto no es

mensurable.

Ni los efectos emocionales ni la acción del frío se observan cuando el tallo

hipofisiario se ha cortado, demostrando que éstos están regulados por el

hipotálamo.

18

Cuando la hormona tiroidea está aumentada en los líquidos corporales disminuye

la secreción de TSH por la prehipófisis.

El aumento de la hormona tiroidea inhibe la secreción de TSH por la hipófisis

anterior, principalmente debido a un efecto de retroalimentación directa de esta

glándula, pero , en forma secundaria, a causa de efectos mucho más débiles

actua a través del hipotálamo.

Se ha sugerido que la hormona tiroidea reduce el número de receptores de TRH

en las células que secretan hormona tiroestimulante(TSH) . Por tanto, disminuyen

considerablemente en estas células secretoras el efecto estimulante de la

hormona de liberación de tirotropina del hipotálamo(TRH)

El efecto del mecanismo de retroalimentación consiste en conservar en los

líquidos circulantes del organismo una concentración casi constante de hormona

tiroidea libre. Si hay un efecto de retroalimentación, a través del hipotálamo,

además de la referida anteriormente, opera muy despacio y podría ser causado en

parte por cambios en la temperatura del termostato hipotalámico, que ejerce

efectos importantes en el control del sistema de la hormona tiroidea de

retroalimentaciòn hipotálamo-hipofisario detecta las variaciones relacionadas con

la disponibilidad de las hormonas tiroideas libres aunque sean pequeñas y actùa

para corregirlo. Existe una estrecha relación entre el hipotálamo, la

adenohipòfisis, el tiroides y los centros nerviosos cerebrales. De esta manera y

mediante un control de retroalimentación negativa, la disponibilidad de hormonas

tiroideas modifica la función de todo el complejo. No obstante sobre el eje también

actúan otros neuropètidos y hormonas adicionales, (libro willians).

La producción de TSH está regulada por la concentración sérica de las hormonas

tiroideas circulantes, las cuales ejercen una retroalimentación negativa, y por el

factor hipotalámico estimulante de la secreción de TSH, el TRH. Las hormonas

tiroideas a nivel hipotalámico determinan la liberación de somatostatina, la cual

inhibe la producción de TSH. La figura 5 muestra un esquema de la regulación.

19

Fig. 5 Esquema eje hipotálamo- hipófisis-. Tiroides. (Adaptado de Mariani y col, 2007)

.La hormona tiroidea (TH) desempeña un papel crítico en el desarrollo, crecimiento

y metabolismo celular. La producción TH está controlada por un complejo

mecanismo de regulación positiva y negativa por la hormona hipotalàmica

liberadora de TSH (TRH) que estimula la secreción de TSH por la pituitaria

anterior. TSH luego inicia la sìntesis y la liberación de TH de la glándula tiroides.

Los genes que regulan la síntesis de TRH y TSH se inhiben en el nivel

transcripcional por TH, que también inhibe la modificación postraduccional y la

liberación de TSH. La retroalimentación negativa TH en la pituitaria se cree que es

el principal regulador de los niveles séricos de TSH. Sin embargo, el estudio de los

animales transgénicos mostraron un inesperado papel, dominante para TRH en la

regulación del eje hipotálamo-hipófiso-tiroideo (Chiamolera y col ,2009).

Un cambio importante en la regulación de tiroides se produce en diversas

condiciones clínicas tales como enfermedad grave y los trastornos psiquiátricos.

Ultimos hallazgos sugieren que en células gliales hipotalámicas, la prohormona

tiroxina (T4) se convierte en triyodotironina biológicamente activa (T3) a través de

la enzima D2, y que T3 es posteriormente transportado a las neuronas del Nùcleo

20

paraventricular (PVN) para producir TRH. En estas neuronas la T3 puede unirse a

los receptores o bien metabolizarse a su forma inactiva T3r. (Fliers E, 2006)

RECEPTOR DE TSH

La función biológica del receptor de TSH (TSHR) en la glándula tiroides es regular

la síntesis y secreción de hormonas tiroideas de las células foliculares del tiroides,

como asì también desempeña un papel importante en el control del crecimiento y

el desarrollo de la glándula tiroides (Vassart y Dumont 1992)

 El receptor de TSH es una cadena glicoproteica de 744 aminoácidos de un peso

molecular de aproximadamente 100 KD, ubicado en la membrana basolateral de la

célula tiroidea. Al igual que los receptores para las hormonas

luteinizante/gonadotrofina coriónica (LH/CG) y la folículo estimulante (FSH), el

receptor de TSH es un miembro de una superfamilia de receptores acoplados a la

proteína G, presenta un largo dominio amino-terminal extracelular de 398

aminoácidos que codifica el reconocimiento y la unión específica a la TSH, siete

segmentos de transmembrana conectados por tres uniones intracelulares y tres

extracelulares que en conjunto tienen 270 aminoácidos y un corto dominio carboxi-

terminal intracelular de 76 aminoácidos (Rivolta y col, 2003).

El TSHR es un receptor acoplado a proteína G, con la estructura clásica de la

familia de receptores serpentina (es decir, siete segmentos que abarca la

membrana, tres bucles extracelulares, tres bucles intracelulares, un ectodominio

amino terminal y un extremo carboxi intracelular). La especificidad hormonal de

unión del receptor se determina por el ectodominio o subunidad α; ) mientras que

el acoplamiento a la proteína G es a través de la parte de serpentina.(Lloyd y col,

2010)

El receptor de TSH está formado por dos subunidades unidas entre si por puentes

disulfuros, y probablemente deriven de la escisión proteolítica de un solo precursor

de 90 kDa. La subunidad alfa; extracelular; tiene una masa molecular de 53 kDa

21

La subunidad Beta; que atraviesa la membrana; parece heterogènea y tiene un

aparente peso molecular de 33- 42 kDa.

La membrana de las células tiroideas humanas contiene entre 2,5 a 3 veces mas

subunidad beta que alfa .

Estudios inmunoquímicos demuestran la presencia de ambas subunidades en las

células foliculares de tiroides pero restringido a la región basolateral de la

membrana celular (Hugues y col, 1992)

. El gen del TSHr se encuentra localizado en el cromosoma 14.  Su tamaño es de

188 kilobases, conteniendo 10 exones (Parmentier M. y col,1989) Un esquema

del gen, el receptor y de sus mutaciones de muestra a continuación en la figura 6

Figura 6. Representación esquemática de la organización estructural del gen del receptor de TSH y de su proteína

correspondiente. Se indican los dominios funcionales de la proteína y las principales mutaciones activantes e inactivantes

identificadas. (Adaptada de Rivolta y col,2005)

22

RECEPTOR DE HORMONAS TIROIDEAS

El receptor de hormona tiroidea es un tipo de receptor nuclear que es activado por

la unión de la hormona tiroidea.( Flamant F, 2006)

Entre las funciones más importantes de los receptores de hormona tiroidea se

encuentran la regulación del metabolismo y de la frecuencia cardíaca Además,

juegan un papel crucial en el desarrollo de los organismos.(Brent GA , 2000)

Se han descrito dos isoformas del receptor de hormona tiroidea (TR) codificados

por genes distintos denominadas alfa y beta (Fig 7), que son capaces de unir

dicha hormona. Además, se obtienen dos variantes del receptor de hormona

tiroidea alfa TR-alfa mediante ''splicing alternativo'' del gen THRA, y otras dos

variantes del receptor de hormona tiroidea betaTR-beta mediante ''splicing

alternativo'' del gen THRB (Flamant F y col ,2006)

* '''TR-α1''': expresado en diversos tejidos, con elevados niveles en músculo

esquelético y en músculo cardíaco.

'''TR-α2''': homólogo del oncogén viral c-erb-A, también expresado en diversos

tejidos pero incapaz de unir la hormona.

* '''TR-β1''': expresado de forma predominante en cerebro, hígado y riñón.

* '''TR-β2''': expresión limitada al hipotálamo y a la glándula pituitaria.

Estudios in vivo sugieren papeles separados para las dos isoformas de receptor

de hormona tiroidea, TR-alfa y TR-beta . Se realizaron ensayos con una única

línea celular tirotrópicos pituitaria (TαT1.1) para determinar la importancia relativa

de TR-alfa y TR-beta en la regulación de la subnidad betaTSH (Tshb).

Con el uso de ensayos de inmunoprecipitación de cromatina, se encontró TR-beta,

no TR-alfa, unido al gen promotor Tshb. Por agotamiento selectivo de los

receptores, se encontró que la caída de ambos receptores inactiva la down

regulation mediada por T3 de Tshb, a concentraciones de T3 tan altas como

100nm. En contraste, la caída sola de trhA no tiene efectos negativos en la

regulación, mientras que la caída de trhB inhibe la down regulation mediada por

23

T3 de los niveles de RNAm de Tshb a concentraciones de T3 de 10 nm pero no de

100 nm. Esto sugiere que probablemente el efecto diferente de las isoformas TR-

alfay TRbeta puede estar basado en su diferente afinidad al punto de unión del

gen promotor de Tshb. (Chiamolera y col , 2012)

EVALUACION DE LA FUNCIÒN TIROIDEA

La síntesis de hormonas tiroideas requiere una glándula tiroides normalmente

desarrollado, un eje que funcione correctamente hipotálamo-pituitaria-tiroides, y la

ingesta de yodo suficiente. Los defectos en la síntesis de hormonas por lo general

se asocian con el desarrollo de un bocio, a condición de que la bioactividad y la

acción de la tirotropina (TSH) no se deterioran. En contraste, hipoplasia de la

glándula puede ser causada por defectos en el desarrollo, o TSH bioinactiva, o la

resistencia a la TSH en el nivel del receptor o su vía de señalización. En el otro

extremo del espectro, el hipertiroidismo puede resultar de ganancia de función de

mutaciones en los genes que regulan el crecimiento.

El objetivo de la evaluación de la función tiroidea es la detección de las

disfunciones tiroideas, en pacientes sintomáticos y asintomáticos y establecer su

etiología. La historia clínica y la exploración física orientarán la sospecha

diagnóstica y las pruebas complementarias que se deben realizar.

La evaluación se realiza mediante un estudio bioquímico funcional y una

exploración inmunopatológica. Las técnicas de imagen completan el diagnóstico

etiológico. (Gillam, 2001)

TSH se utiliza como análisis de primera línea en el diagnóstico debido a que un

valor normal excluye casi siempre una disfunción tiroidea. Sin embargo, en el

seguimiento de un tratamiento para el hipo o hipertiroidismo, se han de determinar

hormonas libres ya que la respuesta de TSH se retrasa y no refleja con precisión

la restauración del eutiroidismo. La medición de los anticuerpos anti-tiroperoxidasa

(anti-TPO) muestra la presencia de una tiroiditis autoinmune y la de los

anticuerpos estimulantes de la tiroides (TSI) establecerá el diagnóstico de la

enfermedad de Graves. La medición de la tiroglobulina circulante no tiene cabida

24

en el diagnóstico de la disfunción tiroidea ni en la evaluación de un bocio, pero

ahora es el estándar de oro en el seguimiento de pacientes con cáncer

diferenciado de tiroides después de la cirugía y ablación con radio yodo en

pacientes sin anticuerpos antitiroglobulina. La ecografía es el examen de primera

línea para evaluar la morfología tiroidea La gammagrafía tiroidea con 99m Tc

permite establecer las características funcionales de los nódulos tiroideos (caliente

o fría) y de precisar el origen de una tirotoxicosis (nódulo tóxico autónoma vs

Graves-Basedow, tiroiditis subaguda o en silencio)( Bergman P, 2012)

EXPLORACION FUNCIONAL DE TIROIDES

DETERMINACIÒN DE TIROTROFINA (TSH)

Es la prueba de elección para el estudio diagnóstico inicial, cribado y seguimiento

del tratamiento de la disfunción tiroidea. Es el marcador más sensible y específico

de la función tiroidea. Cualquier modificación de las concentraciones hormonales

(tiroxina [T4]libre) modifica notablemente los valores de la tirotrofina (TSH)

(relación logarítmica/lineal inversa), y constituye la prueba más sensible para el

diagnóstico de las alteraciones subclínicas. Se utilizan métodos

radioinmunométicos de tercera o cuarta generación (TSH ultrasensible), con

límites de detección entre 0,10-0,001 μU/ml. El rango de normalidad oscila entre

0,5 y 4 μU/ml. A partir de 4 μU/ml se sospecha hipotiroidismo y por debajo de 0,5

μU/ml, hipertiroidismo. Un valor normal de TSH excluye una alteración primaria de

la función tiroidea.

Estos valores dependen tanto de la metodología como de la población de

referencia. Por lo cual cada laboratorio debe establecer sus propios rangos de

referencia.

Diversos estudios han encontrado que los pacientes aparentemente sanos con

valores de TSH mayor a 2,0 μUI/mL tienen un riesgo incrementado de desarrollar

enfermedades tiroideas.

Se ha sugerido que es probable que el límite superior del rango de referencia

25

eutiroideo de TSH en suero sea reducido a 2,5 μUI/mL porque màs del 95% de los

voluntarios eutiroideos normales cribados rigurosamente tienen valores de TSH en

suero entre 0,4 y 2,5 μIU/mL. (Reed L. y col, 2006)

Existen situaciones de discordancia entre TSH y T4 libre: hipotiroidismo

secundario o terciario o de causa hipotalamohipofisaria (incluye el tumor

hipofisario productor de TSH y la resistencia hipofisaria a hormonas tiroideas);

fases tempranas del tratamiento de hipertiroidismo (2-3 primeros meses) e

hipotiroidismo (primer mes) o en el cambio de dosis de T4 libre, tiroiditis y

fármacos .

Se puede observar una disminución de TSH en enfermedad del eje hipotálamo-

hipofisaria fisiológico: primer trimestre del embarazo (secreción de HCG),

ancianos, síndrome del enfermo eutiroideo, enfermedades mentales agudas.

Podemos encontrar aumento de TSH en tumores hipofisarios productores de

TSH, resistencia hipofisaria a hormonas tiroideas hipotálamo, lesiones hipofisarias

que interrumpen la circulación portal hipotálamo-hipofisaria. (Molero, 2008)-

La tabla 4 resume la utilidad clínica de su dosaje:

Screening de la función tiroidea en la población general.

Screening de hipotiroidismo congénito.

Diagnóstico de las patologías tiroideas (hipo o hipertiroidismo). Debido a la

relación lineal/logarítmica existente entre las concentraciones de T4 libre y

TSH, se observa que la duplicación de los niveles de T4 libre corresponde a

una variación de 100 veces la concentración de TSH.

Diagnóstico de patologías tiroideas subclínicas: la TSH es un indicador muy

sensible del estado metabólico-tiroideo, por ello se diagnostican patologías

subclínicas en las cuales los niveles de TSH post estímulo con TRH son

patológicos, mientras que los niveles de las hormonas tiroideas

permanecen normales en ese estadio. -.Monitoreo del tratamiento

sustitutivo o de la terapia supresiva (levotiroxina o agentes antitiroideos).

Debido a la larga vida media de la levotiroxina se necesitan

aproximadamente seis semanas para que se completen sus efectos

26

biológicos, por lo que se debería esperar este tiempo antes de decidir un

cambio de la dosis propuesta.

Evaluación de la función tiroidea en casos de hiperprolactinemia o

hipercolesterolemia. (Mariani V. y col, 2007)

Variables por drogas:

Un resumen de drogas que causan aumento o disminución de los niveles de TSH

se citan a continuación.

Niveles séricos elevados:

Atenolol, ioduro, metoclopramida, domperidona, carbamazepina, piramidona,

fenobarbital, aminoglutetimide, amiodarona (luego de 6 meses), benserazide,

calcitonina (incremento pequeño y transitorio), clorpromazina.

Niveles séricos disminuidos:

L-dopa, D tiroxina, amiodarona (hipertiroideos), somatostatina, dopamina,

agonistas de dopamina (bromoergocriptina), glucocorticoides, esteroides

anabólicos, aspririna, clofibrate (en pacientes hipotiroideos), terapia con

citostáticos, ciproterona asociado a etinilestradiol, danazol (no inicialmente),

dobutamida, ácido fusárico, GH-RH, interferón 2, iodoamina, levodopa (en

hipotiroideos), lisuride. (Mariani y col, 2007)

Varios medicamentos pueden causar disfunción tiroidea. Estos medicamentos que

alteran el metabolismo de la hormona tiroidea o la unión a TBG o los que inhiben

la absorción de la hormona tiroidea puede causar hipotiroidismo o deteriorar en

pacientes con hipotiroidismo tratadas con hormona tiroidea o con capacidad

disminuida reservados. Cuando se produjo la disfunción tiroidea, es mejor

suspender el fármaco causante, pero en muchos casos, los pacientes se ven

obligados a ser tratado con el medicamento a pesar de sus efectos.(Nishikawa y

col, 2012)

MEDICIONES DE HORMONAS TIROIDEAS

Se determinan tras una alteración de la TSH e identifican el estado funcional

glandular.

27

DETERMINACION DE TIROXINA TOTAL (T4)

Es la hormona tiroidea más importante en la circulación, su síntesis se limita a la

glándula tiroides. El principal papel fisiológico de T4 es servir como una pro-

hormona que, a través de su órgano específico de deshalogenación, puede ser

convertida en una familia de compuestos yodados activos o inactivos.(Orozo y col,

2012)

DETERMINACION DE TIROXINA LIBRE (T4l)

Es la prueba que mejor se correlaciona con la situación funcional del tiroides, ya

que toda la hormona circulante se produce íntegramente en el tiroides. Sus niveles

son independientes de la concentración de proteínas transportadoras. Los niveles

normales de T4 libre, oscilan entre 0,7 y 1,8 ng/dl (9-23 pmol/l).

No detecta las disfunciones leves o subclínicas. Es útil para confirmar la disfunción

tiroidea y seguimiento inicial del tratamiento del hipotiroidismo secundario o

terciario tratado con tiroxina.(Molero y cols, 2013)

La recuperación de la secreción hipotalamohipofisaria de la TSH se retrasa 3-6

meses en la corrección del hipertiroidismo y 6-8 semanas en el hipotiroidismo

DETERMINACION DE TRIODONINA TOTAL Y LIBRE (T3 Y T3l)

La glándula tiroidea produce un 20-25% de T3 y el resto procede de la

desyodación de la T4 en los tejidos periféricos.

También, como en el caso de la Tiroxina, La Triyodotironina se encuentra en

sangre ligada a la globulina TBG y también en este caso en una proporción

igualmente elevada (99.7%), circulando en forma libre solo el 0.3 %. Realmente

esta última es la fracción hormonal realmente activa. Se encuentra en un equilibrio

muy dinámico en el que siempre hay T4 convirtiéndose en T3 y esto ocurre tanto

en el tiroides, como en la sangre, como a nivel intracelular.

El rango de referencia para la T3 oscila de 80 a 180 ng/ dL, la cual depende de la

metodología a utilizarse. Existen numerosas condiciones no relacionadas con

28

enfermedades tiroideas que pueden dar lugar a valores anormales de T3.

Consecuentemente, los valores de T3 total no deberían usarse por sí solos para

establecer el estado tiroideo de un individuo. . (Reed L. y col, 2006)

La valoración analítica de la T3 no es mucho más compleja que la de la T4L y se

realiza por los mismos métodos. La cuantía de esta hormona en sangre es mucho

màs baja que la de T4 y los técnicas analíticas son algo mas imprecisas que las e

valoración de T4 o T4L.

La valoración de T3 en sangre puede no ser imprescindible y muchas veces no se

solicita, pero es la única forma de descubrir lo que se denomina "Hipertiroidismo-

T3" que es una forma muy poco frecuente de Hipertiroidismo en el que sólo hay

elevación de esta hormona.

Es una prueba menos específica que la T4 libre en el diagnóstico del

hipotiroidismo, pues se detecta en pacientes eutiroideos con enfermedades

sistémicas y se mantiene en valores normales en el 20-30% de los hipotiroidismos

(fases precoces).

Es útil en el diagnóstico de los hipertiroidismos por T3 (5% de los hipertiroidismos)

que cursa con valores de T4 libre normales y TSH suprimida.

La determinación de T3 total es una herramienta importante para la monitorización

de pacientes hipotiroideos que reciben terapia.(Leise M. y col, 1995)

PRUEBA DE ESTIMULACION DE TIROTROFINA

Valora el estado funcional del mecanismo secretor de la TSH. Se usa en el

diagnóstico de hipotiroidismo secundario (hipofisario) y adenoma secretor de TSH.

Su uso clínico es cada vez menor, al ser desplazado por la determinación de TSH

de tercera y cuarta generación. (Molero Garcìa y col, 2008)

EXPLORACION ETIOLOGICA

ANTICUERPOS ANTITIROIDEOS

Permiten el diagnóstico de la enfermedad tiroidea autoinmunitaria.

29

Se determinan anticuerpos frente a estructuras tiroideas (antitiroglobulina,

antiperoxidasa) y al receptor.

ANTICUERPOS ANTITIROGLOBULINAS, ANTI-MICROSOMALES Y ANTI-

PEROXIDASA

En la actualidad se determinan los 2 tipos de anticuerpos antitiroideos.

Los anticuerpos antimicrosomales/antiperoxidasa tiroidea (anti-TPO) son más

sensibles y específicos para el diagnóstico de la enfermedad tiroidea de base

autoinmunitaria como la tiroiditis de Hashimoto (80-90%) o linfocitaria y en valores

inferiores en la enfermedad de Graves (50-80%), bocio multinodular (20-30%) y

cáncer diferenciado de tiroides. La tiroiditis de Quervain cursa con títulos inferiores

La amiodarona, el interferón alfa o la nicotina pueden aumentar los valores

plasmáticos.

Son buenos marcadores de evolución en el hipotiroidismo en las formas

subclínicas y en la tiroiditis posparto.

El 7-15% de la población eutiroidea tiene anticuerpos antitiroideos (títulos

moderados) y su prescencia eleva el riesgo de disfunción tiroidea.

La prevalencia de anticuerpos antitiroglobulina (Tg) en enfermedades tiroideas

autoinmunitarias es menor a la de antimicrosomales. Un valor muy elevado es

patognomónico de tiroiditis de Hashimoto. En concentraciones menores y con

frecuencia de forma transitoria pueden elevarse en el carcinoma papilar-folicular

de tiroides, bocio no tóxico, tiroiditis subaguda y linfocitaria (60%) y linfoma tiroideo

primario. No es habitual su detección de forma aislada y su positividad sin

elevación de anti-TPO no se relaciona con enfermedad tiroidea. ((Molero Garcìa y

col, 2008)

ANTICUERPOS PEROXIDASA TIROIDEA

La peroxidasa tiroidea (TPO) es una hemoproteína integral de la membrana (peso

molecular aproximado de 100 kDa), que cataliza la yodación de la tiroglobulina

(TG), al igual que el acoplamiento de los dos residuos de diyodotirosina de la

molécula TG para formar tiroxina. Durante casi tres décadas se ha desconocido la

30

naturaleza real del "antígeno microsómico", hasta que en 1985 Portmann et al.

pudieron demostrar que el antígeno microsómico es idéntico a la TPO. La

sensibilidad y especificidad de los ensayos de anticuerpos anti-TPO dependen en

gran medida de la pureza y calidad del antígeno del test, y en particular de la

ausencia de contaminantes de la TG. (Rapoport B y col, 1996).

ANTICUERPOS ANTIRECEPTORES DE TSH

Son inmunoglobulinas G, estimuladoras del receptor tiroideo de TSH, que

favorecen la producción hormonal (TSI). Existen otros anticuerpos que bloquean el

receptor de la TSH (TSBab) y producen crecimiento glandular sin hiperfunción.

Tienen elevada sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de la enfermedad

de Graves-Basedow (80-90%) y la oftalmopatía de Graves. Son útiles para el

seguimiento de la enfermedad y selección del tratamiento farmacológico o

quirúrgico. No existe relación entre concentraciones y gravedad del

hipertiroidismo. Se presentan en el 10-30% de las tiroiditis de Hashimoto y en el

6% de las tiroiditis linfocitarias subagudas.

Existe un riesgo de hipotiroidismo fetal (atraviesan la barrera placentaria), por lo

que se recomienda la determinación en el tercer trimestre del embarazo en

mujeres con enfermedad de Graves. (Molero, 2008)

TIROGLOBULINA SERICA

Su principal utilidad radica en el control del tratamiento y seguimiento del

carcinoma diferenciado de tiroides. Concentraciones detectables (> 1-2 ng/ml)

indican recidiva o ablación incompleta en estos casos. También es útil para el

diagnóstico del hipertiroidismos facticio (Tg no elevada) y neonatal (Tg baja)

(Molero, 2008).

Un elevado nivel de Tiroglobulina sérica puede ser indicativo de cáncer de tiroides

residual o recurrente, sin embargo también provoca un aumento trauma en el

tiroides (por ejemplo, cirugía o biopsia). Anticuerpos antitiroglobulina endógenos

puede provocar interferencia de falsos negativos en los ensayos inmunométricos y

31

puede causar resultados positivos falsos en radioinmunoensayo. Se debe realizar

medición de los anticuerpos para la predicción de interferencia.( Clark P, Franklyn

J., 2012).

CALCITONINA

Esta hormona se encuentra elevada en el carcinoma medular de tiroides. No se

recomienda su determinación sistemática (Molero,2008)

MÉTODOS EMPLEADOS PARA DETERMINAR TSH

Se ha cuantificado TSH, básicamente, por inmunoensayos. El radioinmunoensayo

(RIA), si bien constituyó en su momento un paso de avance tecnológico, limitaba

la utilidad clínica de la TSH al diagnóstico del hipotiroidismo primario. El desarrollo

de inmunoensayos no competitivos tipo "sandwich" con potencialidades analíticas

y clínicas superiores, ha ampliado la utilidad clínica de esta prueba. Actualmente,

estos ensayos se están usando ampliamente desplazando a los RIAs en la

evaluación de disfunción tiroidea. Por sus características, cumplen con una serie

de directivas, tanto analíticas como clínicas, que los catalogan de primera línea

para la evaluación funcional tiroidea, de forma que permiten diseñar estrategias

que proporcionan una máxima información con la mejor eficiencia y un mínimo de

costo para la generalidad de las situaciones clínicas encontradas en las consultas

de tiroides.

El advenimiento del RIA de TSH y su disponibilidad a partir de la segunda mitad

de la década del 60, constituyó un gran paso de avance analítico y práctico sobre

los bioensayos. A pesar de las mejoras metodológicas de que fueron objeto los

RIAs de TSH, su utilidad clínica se reducía básicamente al diagnóstico del

hipotiroidismo primario. Por ser un ensayo competitivo, que utilizaba reactivos a

concentraciones limitantes, no alcanzaba una sensibilidad suficiente para separar

los valores suprimidos de TSH de los valores en el límite bajo del rango normal.

Si bien los ensayos inmunométricos (IMAs) surgieron en 1968, no fue hasta la

década del 80 que experimentaron un gran desarrollo como resultado de un

incremento en la disponibilidad de anticuerpos monoclonales (MAbs) anti-TSH, de

32

mejor afinidad y especificidad, que permiteron un acelerado crecimiento de IMAs

de "dos sitios" o "sandwich". Este diseño es el que actualmente está presente en

todos los ensayos de TSH disponibles comercialmente, sustituye a los RIAs en la

evaluación de disfunción tiroidea. Se basa en el uso de, al menos, 2 MAbs que

reconozcan diferentes epítopes sobre la molécula de TSH, de los cuales, uno

debe ser específico para la beta-TSH, de manera que ésta quede atrapada entre

ellos formando un sandwich. Un anticuerpo es marcado (anticuerpo señal y el otro

es acoplado a un sistema de fase sólida (anticuerpo de captura) y ambos se

encuentran en exceso con respecto al antígeno, es un ensayo no competitivo en

que a medida que aumenta la cantidad de antígeno, la cantidad de

inmunocomplejo precipitado aumenta en una relación directa.

Los IMAs se dividen en diferentes tipos en dependencia de la molécula utilizada

para marcar. Cuando se emplea un radioisótopo (I125) se llaman

inmunorradiométricos (IRMA); una enzima inmunoenzimométricos (IEMA); una

partícula fluorescente, inmunofluorimétricos (IFMA) y una molécula

quimiluminiscente(QLIA), inmunoquimiluminimétricos (EQLIA).

Los avances en el campo de la metodología diagnóstica han permitido que hoy

podamos contar con este tipo de ensayo de mejor precisión, especificidad, mayor

amplitud de rango de trabajo, sensibilidades de 10 a 100 veces mejor que los RIAs

la posibilidad de realizar protocolos sencillos y rápidos que lo hacen muy prácticos

para la asistencia clínica.

La no uniformidad de criterios y el uso de diferentes formas de cálculo de la

sensibilidad, determinaron que la definición de "ensayo sensible" fuera en parte,

dependiente de los criterios y formas de cálculo empleados. Así se les llamaban

ultrasensibles, supersensibles o altamente sensibles empleándose indistintamente

los criterios de sensiblidad analítica y/o funcional. Sobre la base de la sensibilidad

funcional, surgió una nomenclatura generacional donde, de forma general, los

RIAs se clasifican como ensayos de primera generación, los IRMAs, IEMAs,

IFMAs son de segunda generación y los ICMAs (QLIA; EQLIA) son de tercera y

cuarta generación Una forma alternativa de evaluar la sensibilidad de un ensayo

de TSH es por su capacidad de separar los valores normales de TSH de los

33

suprimidos. Para esta última forma, el Comité de Nomenclatura de la Asociación

Americana del Tiroides propuso que el 99 % de los sueros de pacientes

hipertiroideos deben estar por debajo del límite inferior del rango normal para ser

clasificado como sensible. Ninguna de estas formas del cálculo de la sensibilidad,

por sí solas, tienen en cuenta todos los factores analíticos que influyen en la

sensibilidad de un ensayo. Debido a la importancia que tiene la sensibilidad en la

utilización clínica de los ensayos de TSH fue necesario que se trazaran directivas

que abarcan no sólo criterios analíticos sino también clínicos y que deben ser

aplicadas en la evaluación de nuevos IMAs de TSH. Un ensayo que cumpla estos

requerimientos se clasifica como sensible y avala la determinación de TSH como

una prueba de primera línea en la evaluación de disfunción tiroidea. (Rodríguez

González,1997)

La determinación de TSH es el mejor indicador de la integridad del eje hipotálamo-

hipófisis-tiroides y de la acción reguladora de los niveles circulantes de las

hormonas tiroideas y su determinación por métodos sensibles la hace más

conveniente que los estimados de T4 libre (FT4) para el estudio de la disfunción

tiroidea. Este planteamiento se basa en 2 principios básicos de la relación

fisiológica inversa entre la TSH y la T4, los que son válidos si se mantiene la

integridad del eje hipotálamo-hipófisis-tiroides y no hay trastornos en los niveles de

las proteínas transportadoras, es decir, un estado tiroideo estable.(Spencer,CA

1989)- Por un lado, una variación en 2 veces de los niveles de FT4 produce un

cambio en 160 veces de las concentraciones de TSH, lo cual describe una

relación log/lineal entre ambas que se mantiene tanto en el estado eutiroideo

como en el hipertiroidismo subclínico, demostrado, al menos, hasta los límites de

sensibilidad de los ensayos de 3ra. generación. Por otro lado, esta relación está

individualizada, es decir, los niveles de FT4 necesarios para normalizar los valores

de TSH, pueden ser distintos entre individuos. La exquisita sensibilidad de los

tirocitos a pequeñas variaciones en las hormonas tiroideas explica como, en el

hipotiroidismo subclínico, los niveles de TSH se elevan por encima de la

normalidad mucho antes que los niveles de T4 sean subnormales y, solamente

cuando la disfunción se hace más severa (hipotiroidismo clínico), altos valores de

34

TSH están asociados a valores subnormales de T4 y durante el desarrollo del

hipertiroidismo los niveles de TSH son subnormales cuando aún los niveles de T4

y triiodotironina (T3) sólo están mínimamente elevados, pero dentro del rango

normal (hipertiroidismo subclínico), hasta que se presenta el estado de

hipertiroidismo clínico con niveles extremadamente bajos de TSH y altos valores

de T3 y T4. .(Spencer y col, 1990)

Figura 7. Representación esquemática del sistema generacional de nomenclatura para los ensayos de TSH .Nota: Cada

generación representa una sensibilidad funcional (valor de TSH al 20 % de CV interensayo) 10 veces mejor que la

generación anterior. Las zonas oscuras representan el 95 % del límite de confianza de las mediciones en el rango de

concentraciones bajas, críticas para la evaluación de la sensibilidad en cada generación de ensayos. (Adaptado de Alavez

Martín, 2008)

VARIABILIDAD ENTRE METODOS

La variación en los resultados para los distintos métodos refleja las diferencias en

el reconocimiento de diferentes epitopes de las diferentes isoformas de TSH por

los anticuerpos del ensayo. (Quiroga S y col,2003)

35

La medición de hormonas es una herramienta fundamental para el diagnóstico y

tratamiento de las enfermedades endocrinológicas. El establecimiento de

estándares de calidad en dichas mediciones y su aplicación es indispensable para

reforzar su utilidad, analizar la influencia de las distintas metodologías y poder

armonizar los resultados obtenidos por distintos laboratorios CITA 20 LIBRO HIPO

El análisis de la hormona tiroestimulante (TSH) de tercera generación permite la

diferenciación de pacientes con hipertiroidismo real y pacientes con niveles

suprimidos de TSH asociados con otras patologías, lo cual era imposible

determinar con los análisis de primera y segunda generación. La sensibilidad

funcional (0,001 mUI/L) y la analítica (0,002 mUI/L) permiten establecer esta

diferenciación.

Con la hipótesis de que la TSH de tercera generación es tan sensible como la

prueba de estimulación con la hormona liberadora de tirotropina TRH y podría

reemplazarla, se estudiaron 111 personas, 46 con hipotirodismo, 29 con

hipertiroidismo y 36 controles sanos a quienes se les tomó una muestra basal de

TSH y se les administraron 200 ug IV de TRH obteniendo muestras 30, 60 y 90

minutos post TRH. Se pudo afirmar que un valor de TSH de tercera generación

por debajo de 0,44 mUI/L tiene la misma sensibilidad que la prueba de TRH en el

diagnóstico de hipertiroidismo. (William Kattah,1997)

IRMA

Desde mediados de 1980, la metodología de ensayos inmunométricos (IMA) ha

reemplazado progresivamente los antiguos métodos de radioinmunoensayos

competitivos (RIA) utilizados para medir la mayoría de las proteínas en fluídos

biológicos. La ventaja principal de los métodos IMA comparados con los métodos

RIA, es su sensibilidad incrementada (5 a 10 veces más sensible), menores

tiempos de incubación y mayor rango útil de trabajo.

36

El advenimiento de la tecnología que emplea anticuerpos monoclonales (MAb), ha

sido lo que fortaleció el desarrollo del IMA, ya que estos métodos trabajan con

exceso de anticuerpo. Requieren un exceso del anticuerpo único o mezcla de

anticuerpos MAb unidos a un soporte sólido. Este anticuerpo monoclonal asociado

a la fase sólida "capta" el analito de la muestra de suero mientras un anticuerpo

monoclonal o policlonal (Pab) diferente, marcado con una señal (isótopo, enzima,

fluoróforo, molécula quimioluminiscente o bioluminiscente), se une a un epitope (s)

diferente del analito. Durante un período de incubación de 0,5 - 24 horas

(dependiendo del tipo de ensayo) las moléculas del analito en el suero se unen

tanto al anticuerpo de captura como al asociado a la señal para formar un

sandwich (Anticuerpo de captura-Analito-Anticuerpo señal). Después de lavar el

soporte sólido, existe una relación lineal entre la señal unida al soporte sólido y la

concentración sérica del analito. Una relación lineal entre las concentraciones de

analito en los standards y la señal unida al soporte sólido forma la curva de

calibración, base contra las cuales se cuantifican las muestras de concentración

desconocida.(Maccalini G.,2002)

LIMITACIONES DE LA METODOLOGIA DE ENSAYOS INMUNOMETRICOS

PROBLEMAS HOOK

Se produce efecto hook cuando un exceso de antígeno satura la capacidad de

unión del anticuerpo de captura. Esto provoca una señal inadecuadamente baja

que se traduce en un resultado bajo o paradójicamente normal para un paciente

con una concentración excesivamente elevada

Como fuera descripto anteriormente, la cantidad de anticuerpo monoclonal unido

al soporte sólido de un IMA tiene que estar en exceso, es decir, en cantidad

suficiente para unir todo el analito presente en la muestra de suero. En

condiciones donde los tumores producen grandes cantidades de analito por un

lado, la concentración del anticuerpo de captura puede ser inadecuada y por otro

37

lado la formación de los sandwich ser insuficiente y el resultado es una

disminución en la curva de respuesta lineal, resultando en un valor

inapropiadamente bajo.

Los problemas Hook no son encontrados en los métodos IMA para TSH, porque la

máxima concentración de TSH observada en los pacientes hipotiroideos más

severos (aproximadamente 1000 mUI/L) es sólo alrededor de 10 veces mayor que

entre el límite superior del rango reportable (aproximadamente 100 mUI/L).

(Bergoglio,2007)

LIMITACIONES DE LA ESPECIFICIDAD

La TSH circulante tiene múltiples formas moleculares (isoformas), por el grado de

sialización o sulfatación de los oligosacáridos que la conforman. Estas isoformas

pueden tener distinto nivel de bioactividad. En el hipotiroidismo central, la TSH

sérica inmunoreactiva puede encontrarse disminuida, normal o ligeramente

incrementada, aunque posee disminución de su actividad biológica. En los casos

en que se encuentra aumentada, puede existir dificultad diagnóstica y ser

interpretada como hipotiroidismo primario. (Ferrada y col, 2012)

Ensayos inmunométricos miden la cantidad total de TSH en suero, y bioensayos

reflejan la suma de los biopotencias de las diversas isoformas circulantes de TSH.

Cuando la TSH que contiene

las muestras se cuantificaron simultáneamente por inmunométrico

y ensayos biológicos, la relación entre la bioactividad y inmunoactividad

sirve como un índice de la potencia global de

moléculas circulantes de TSH. (Oliveira y col, 2001)

Dado que los anticuerpos de captura tienen que estar presentes sobre el soporte

sólido en una cantidad en exceso, se usan los Anticuerpos del tipo Monoclonal

porque éstos pueden producirse en cantidades ilimitadas. Sin embargo, los

mismos tienen limitado reconocimiento de epitopes. Cuando el analito en el suero

es heterogéneo, tal como en el caso de las hormonas glicoproteicas hipofisarias ,

existe una posibilidad de que el anticuerpo de captura sólo reconozca un número

38

limitado de las isoformas del analito en la muestra de suero. Otros métodos que

usan un anticuerpo monoclonal diferente reconocen una selección diferente de

isoformas. Las isoformas que son reconocidas pueden no ser necesariamente

biológicamente activas. Tales discordancias entre actividad inmunológica y

biológica se observan en la medición de TSH en el hipotirodismo central donde

son secretadas isoformas inmunoreactivas pero biológicamente inactivas. Este

problema de reconocimiento selectivo puede llevar a diferencias entre las

mediciones hechas con distintos métodos que, a pesar de estar estandarizados

contra Preparaciones Internacionales de Referencia, usan Anticuerpos

Monoclonales de captura diferentes y producen resultados distintos (un problema

visto en los métodos para medir TSh).

Los estándares usados para TSH tienen que ser diluídos en una matriz de suero

humano desprovisto de estos analitos. Desafortunadamente es virtualmente

imposible para los fabricantes obtener cantidades suficientes de suero de tales

características. Los fabricantes resuelven típicamente este problema

seleccionando una matriz proteica que ellos creen dará un valor cero que es

similar a los sueros humanos libres de analito. Estas matrices son frecuentemente

lejanas a lo ideal y pueden producir desvíos entre las mediciones de standard y la

de los sueros de los pacientes. La selección de una matriz subóptima también

introduce diferencias entre los métodos y reduce la sensibilidad.

La TSH circulante presenta heterogeneidad molecular pudiendo, inmunoensayos

(IEs) que utilizan diferentes anticuerpos monoclonales, reconocer diferentes

epitopes y en consecuencia presentar diferencias cuando la TSH circulante se

encuentra formando parte de un complejo con inmunoglobulinas (TSH-Ig) o

macroTSH (MTSH). (Fenilli C y cols, 2007)

DETERMINACION DE SENSIBILIDAD

La sensibilidad es el parámetro que ha sido usado para definir la "calidad" de un

ensayo de TSH. Debido a que la Sensibilidad es una marca reconocida de la

39

performance de un ensayo, los fabricantes son proclives a sobre estimar la

sensibilidad puesta para sus ensayos. La comunidad científica ha aceptado ahora

algunos conceptos fundamentales para establecer un parámetro de sensibilidad

clínicamente relevante para determinar el menor límite de detección para la

determinación de TSH. Estos conceptos se basan en una apreciación de la

diferencia entre Sensibilidad "Analítica" y "Funcional".

SENSIBILIDAD ANALITICA (PARAMETRO INTRAENSAYO)

Los fabricantes son proclives a citar en sus instructivos la sensibilidad analítica

porque este cálculo provee los estimados más optimistas de sensibilidad.

La sensibilidad analítica se calcula de la precisión de 20 replicados en un ensayo

de la matriz cero, que claramente no se relacionaría con la sensibilidad potencial

del test en la práctica clínica.

Específicamente, en las muestras de la práctica clínica se miden de un modo inter

ensayos de modo que las muestras seriadas de un paciente pueden ser usadas

para determinar la eficacia de la terapia. Estas muestras pueden ser analizadas en

diferentes ensayos hechos en términos de semanas para TSH -Cuanto mayor es

el período entre análisis, es probable que la medida de la precisión del test se

debilite debido a la variabilidad entre lotes de los reactivos, diferencias en la

performance del instrumento, diferencias en el operador y una serie de otros

factores pobremente identificados. (Maccalin G,2007)

SENSIBILIDAD FUNCIONAL (PARÁMETRO INTER ENSAYO)

Ha sido aceptado que la Sensibilidad Funcional es el parámetro más apropiado

para establecer el límite de detección inferior de TSH y de otros analitos.

Específicamente, la sensibilidad funcional debería ser establecida usando una

mezcla de suero humano con un valor de TSH asignado de alrededor del 10% por

sobre el límite de detección esperado. Los ensayos deberían ser realizados en un

40

período de 6 - 8 semanas, ya que representa el intervalo clínico típico para la

evaluación seriada de mediciones de TSH en pacientes ambulatorios.

La Sensibilidad Funcional del ensayo de TSH corresponde al valor de

concentración de TSH màs baja cuyo coeficiente de varaciòn es inferior a 20%.

(Nicoloff JT, Spencer CA, 1990)

DEFINICIÓN DE SENSIBILIDAD FUNCIONAL

La sensibilidad funcional debería usarse para determinar el límite de detección

más bajo del ensayo. 

* La sensibilidad funcional del ensayo de TSH se define como la concentración

que puede ser determinada con un coeficiente de variación (CV) interensayo del

20% determinada con el protocolo recomendado (Bergoglio y col, 2006)

CONSIDERACIONES DE LA ESPECIFICIDAD.

 La TSH es una molécula heterogénea con diferentes isoformas que circulan en

sangre y que están presentes en los extractos hipofisarios utilizados para la

estandarización de los ensayos (Medical Research Council (MRC) 80/558). En el

futuro, las preparaciones de TSH humana recombinante (rhTSH) se podrían

utilizar como estándares primarios para los inmunoensayos de TSH . Los métodos

TSH IMA actuales utilizan anticuerpos monoclonales que eliminan virtualmente la

reactividad cruzada con otras hormonas glucoproteicas. Estos métodos, sin

embargo, pueden detectar epitopes de isoformas anormales de TSH secretadas

por algunos individuos eutiroideos, así como por algunos pacientes con patologías

hipofisarias. Por ejemplo, los pacientes con hipotiroidismo central provocado por

disfunción hipofisaria o hipotalámica, secretan isoformas de TSH con glucosilación

anormal y reducida actividad biológica. La mayoría de los métodos,

paradójicamente miden estas isoformas de TSH como normales o incluso

elevadas). Asimismo, es posible observar niveles paradójicamente normales de

41

TSH en pacientes con hipertiroidismo debido a tumores hipofisarios, secretan

isoformas de TSH con aumento de la actividad biológica.(Bergoglio y col, 2006).

La adopción de la metodología IMA que emplea anticuerpos monoclonales, tiene

en general un mejoramiento en la especificidad de la medición para la mayoría de

los analitos proteicos. En el caso de la TSH, el desarrollo de métodos IMA que

emplean anticuerpos monoclonales de captura con especificidad para la

subunidad beta de TSH, ha eliminado virtualmente los problemas de la reacción

cruzada que aparecían en los métodos RIA. Estos métodos RIA empleaban

anticuerpos policlonales y sufrían típicamente de reacción cruzada con la

subunidad alfa común de las otras hormonas glicoproteicas (LH, FSH y HCG).

Sin embargo, la especificidad restringida de un anticuerpo monoclonal puede ser

un impedimento cuando se miden analitos tales como TSH que circulan como

isoformas heterogéneas. Específicamente, el epitope reconocido por un anticuerpo

monoclonal comprende típicamente sólo 6 aminoácidos. Estos aminoácidos

pueden no ser necesariamente parte de una secuencia lineal en la estructura

proteica, pero pueden ser conformacionales, es decir, discontínuos pero próximos

debido a la conformación terciaria de la proteína. Así, las condiciones patológicas

que cambian la conformación de la proteína, secundarias a cambios en la

glicosilación (para TSH) tienen el potencial de influir en la conformación molecular

y así enmascarar o exponer epitopes que a su vez, pueden influir en la

inmunoreactividad de la molécula.

Estos hechos de especificidad, probablemente explican la sorprendente magnitud

de las diferencias entre los métodos de diferentes fabricantes para TSH, aún

cuando el método sea estandarizado contra la misma preparación internacional de

referencia. La utilidad clínica de las mediciones de TSH se ve afectada en forma

negativa por las diferencias entre los métodos de modo diferente.

La especificidad del anticuerpo de captura seleccionado para un método de TSH

determina qué isoformas de TSH son detectadas por el ensayo. Es bien conocido

que la glicosilación (especialmente el grado de sialización) de la molécula de TSH

42

determina su clearance así como también su actividad biológica. También está

bien establecido que situaciones fisio-patológicas influyen en la glicosilación

molecular. Las mediciones de TSH séricas hechas en el Hipotiroidismo central

(disfunción hipofisaria o hipotalámica) provee un claro ejemplo de discordancia

entre bioactividad e imunoactividad. Específicamente, tales pacientes tienen

hipotiroidismo clínico y pese a eso tienen TSH sérica en el rango normal o aún

ligeramente elevada. Las moléculas de TSH aisladas del suero de tales pacientes

muestran claramente glicosilación anormal y disminuída potencia biológica. En

contraste, los pacientes con tumores hipofisarios pueden exhibir TSH con

glicosilación anormal que aumenta la actividad biológica.

Todos los métodos de TSH están estandarizados contra la misma preparación de

referencia internacional (MRC 80/558) pero están construídos usando diferentes

anticuerpos monoclonales. Ya que diferentes anticuerpos monoclonales sobre el

soporte sólido capturan diferentes isoformas de TSH de la muestra, existen

diferencias entre métodos que usan anticuerpos monoclonales de captura

diferentes. Como se muestra en la figura, esto afecta principalmente el límite de

referencia superior y así el valor de corte que se debería usar para definir el

hipotiroidismo leve (subclínico). (Maccalini G, 2002)

43

Fig.8.Rangos de referencia para 12 ensayos inmunométricos de TSH. (Adaptado de Maccalini G, 2002)

PARTE EXPERIMENTAL

OBJETIVO

Dada la elevada prevalencia de las patologías tiroideas en la población general, en

este trabajo se realizará una revisión actualizada de la información disponible

sobre la utilidad de pruebas de laboratorio para evaluar la función tiroidea y en

particular el valor de la determinación de TSH.

Debido a la importancia del dosaje de TSH en el diagnóstico de la patología

tiroidea y dado que los resultados de dicha determinación en una misma muestra

sérica obtenidos por diferentes ensayos pueden discrepar y llevar a un diagnóstico

erróneo, se procederá a investigar la variabilidad de los valores TSH determinados

por distintos métodos. Para ello se utilizarán muestras con distintos rangos de

concentración de TSH, dosándose la hormona por dos métodos inmunométricos

de 3° generación, comparándose estadísticamente los resultados obtenidos.

METODOLOGIA

44

Obtención de las muestras

Se utilizaron muestras de suero de pacientes a los que se les requiere la

determinación de la concentración de TSH sérica por orden médica. Las muestras

se procesaron en la Cooperativa Bioquímica de Rosario, lugar en donde estoy

encargada de su procesamiento.

Determinación de TSH:

Se procesaron …. muestras de suero para TSH mediante dos métodos de 3°

generación, en un autoanalizador INMULITE 1000 (quimioluminiscencia, DPC

INMULITE) y en un COBAS 611 (electroquimioluminiscencia, Roche Diagnostic),

respectivamente. Las muestras se dividieron en 3 rangos de concentración

diferentes según los valores hallados con el autoanalizador COBAS 611.

- Rango bajo (menores a 0,5 uU/ml),

- Rango medio (0,5 a 5 uU/ml).

- Rango alto (mayores a 5 uU/ml)

Dentro de cada grupo los resultados se expresaron como la media DS.

Análisis estadístico

Se compararon estadísticamente los valores obtenidos con el fin de establecer si

había concordancia en los valores de TSH obtenidos por los dos métodos en los

rangos de valores evaluados. Se utilizó un análisis de correlación. Un valor de p <

0,05 se consideró estadísticamente significativo.

RESULTADOS

45

Los resultados de la determinación de TSH en el rango bajo utilizando los 2

ensayos propuestos se indican en la siguiente tabla :

Rango bajo TSH< 0,5 uU/mlCOBAS 611 IMMULITE1000 p0.46 0.430.34 0.250.33 0.320.01 0.010.26 0.260.66 0.590.01 0.010.62 0.640.98 0.770.58 0.470.40 0.320.01 0.010.47 0.410.20 0.180.15 0.170.12 0.120.35 0.30

46

0.42 0.380.02 0.020.41 0.480.28 0.240.09 0.090.33 0.320.10 0.070.09 0.070.51 0.48<0.01 <0.010.16 0.130.34 0.280.48 0.34

Tabla 4 : valores de TSH en rango bajo obtenidos por los dos métodos ensayados

Rango medio TSH 0,5 a 4,5 uU/ml COBAS INMULITE P0.61 0.530.87 0.751.52 1.450.60 0.561.54 1.410.80 0.710.91 0.871.82 1.720.98 1.131.13 1.01.90 1.491.57 1.452.15 1.771.66 1.272.59 1.931.08 1.01.89 1.470.98 0.850.72 0.71

47

0.53 0.320.51 0.350.63 0.590.93 0.710.51 0.390.98 0.793.45 2.983.96 3.392.70 2.574.65 4.532.91 2.804.32 4.093.42 2.673.43 2.813.02 2.093.39 2.772.64 2.452.59 1.933.82 3.80

Tabla 5: valores de TSH en rango medio obtenidos por los dos métodos

ensayados

Rango alto TSH > 4,5 Uu/mlCOBAS INMULITE P4.65 4.257.65 6.625.59 5.236.30 5.446.01 5.806.94 6.047.96 8.055.85 4.647.05 6.05.48 5.297.39 8.337.59 6.115.48 5.875.36 5.216.04 6.145.24 5.585.53 5.66

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11.91 10.2013.15 10.8047.11 36.79.89 9.3110.41 9.3317.87 15.0013.09 13.3016.87 13.7032.75 21.39.94 8.9123.25 20.346.95 34.324.07 14.0129.63 16.0915.0 9.8164.06 40.0761.93 38.458.35 35.5

Tabla 6: valores de TSH en rango alto obtenidos por los dos métodos ensayados

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