FISIOLOGÍA GENERAL

“SIMULACIÓN DE POTENCIALES EN CÉLULAS NERVIOSAS”

Alumnos: Juan Viecenz Verónica Ortega

Profesor: Diego Golombek

Instructores: Juan José Chiesa María Eugenia Alzugaray

Fecha de entrega: 12-04-2012

RESUMEN

Los programas de simulación de registros electrofisiológicos MemCable y Axocavs permiten observar y comprender detenidamente las diferentes propiedades pasivas de las membranas mediante la manipulación de sus diferentes parámetros.

Con MemCable se realizaron experimentos de Voltage Clamp inyectando corrientes de diferente intensidad en neuronas esféricas y en fibras nerviosas.

Utilizando el programa Axovacs se logró comprender la importancia de los experimentos realizados por Hodgkin y Huxley sobre el potencial de acción en el axón del calamar gigante. Se simularon experimentos de Current Clamp; además se logró determinar el valor del umbral y el período refractario relativo y absoluto.

Mediante la incorporación de distintos fármacos que afectan la permeabilidad a los distintos iones se pudo analizar la respuesta en el axón de calamar.

Finalmente se analizó el efecto sobre los potenciales de acción, al variar las concentraciones de Na+ y K+ dentro y fuera de la membrana celular.

INTRODUCCIÓN

Muchas células tienen una diferencia de potencial a través de sus membranas. Esto ocurre por la distribución desigual de iones de una o más especies a uno y a otro lado de la membrana, es decir, se forma un gradiente de concentración; además, porque la membrana es permeable a uno o más de los tipos de iones. Esta permeabilidad se da por la existencia de canales iónicos en la doble capa lipídica.

En algunas células, como las nerviosas y las musculares, sus membranas pueden producir impulsos electroquímicos gracias a dichos potenciales, para transmitir señales. Estos potenciales de membrana pueden suceder tanto en estado de reposo, como de acción, en estas células.

El potencial de reposo es aquél que se registra cuando la célula está en reposo fisiológico; es decir, no está excitada. Este potencial de reposo es constante, y con el interior negativo con respecto al exterior. El mismo representa una situación de equilibrio, porque la fuerza impulsora del desplazamiento de los iones a favor del gradiente de concentración es igual y opuesta a la fuerza que impulsa el desplazamiento de estos iones a favor de sus gradientes eléctricos.

En las fibras nerviosas, la concentración de K+ es mayor en el exterior que en el interior de las células. Con el Na+ ocurre lo contrario. El gradiente de concentración de K+ hacia el exterior celular ocurre por difusión pasiva cuando se abren los canales de este ion. De la misma forma, el gradiente de concentración de Na+ provoca un desplazamiento pasivo de sodio al interior celular cuando se abren sus respectivos canales. Como en reposo hay más canales de K+

abiertos que canales de Na+, la permeabilidad de la membrana al K+ es mayor. Estos desplazamientos constantes de iones son detenidos por la acción de la ATPasa que activamente mueve los iones en contra de sus gradientes electroquímicos.

Los potenciales de acción son cambios del potencial de membrana que se propagan velozmente por la membrana de la fibra nerviosa. Todo potencial de acción comienza con un

cambio de potencial de membrana negativo en reposo hasta un potencial positivo y termina con un cambio igual de rápido hacia el potencial negativo.

Las distintas fases del potencial de acción:

Fase de reposo: Se trata del anteriormente mencionado potencial de membrana en estado de reposo, donde la membrana está polarizada por el potencial de membrana negativo que está presente.

Fase de despolarización: Con un estímulo despolarizante la membrana se hace muy permeable a los iones de sodio permitiendo que éstos difundan hacia el interior. El potencial aumenta rápidamente de manera positiva hasta llegar al umbral que es la mínima intensidad de estímulo con lo que se produce un proceso de feedback positivo llamado potencial de acción.

Un exceso de Na+ provoca una sobreexitación en la membrana más allá del nivel cero. Aunque en algunos casos, el potencial no aumenta tanto y no ocurre la sobreexitación.

Fase de repolarización: Una vez que la membrana se haya hecho muy permeable a los iones de Na+, los canales de estos iones comienzan a cerrarse (se desactivan) porque el potencial de membrana no encontró el equilibrio para el Na+. Entonces se abren los canales de potasio reestableciéndose el potencial de membrana en reposo mediante el pasaje K+. Estos canales se abren más lento y duran más tiempo abiertos que los de sodio. Con este paso, se da por terminada la repolarización. Finalmente, los canales de K+ activados por voltaje terminan el potencial de acción y se cierran mediante un proceso de feedback negativo. Los canales de Na+ se reactivan antes de llegar al estado de reposo.

Fase de Hiperpolarizacion: Es cuando se genera una Inhibición del potencial eléctrico de la membrana, de tal manera que el potencial caiga por debajo del valor del potencial de descanso. Reduce en forma efectiva el flujo del potencial eléctrico positivo.

El experimento de Hodgkin y Huxley

Los fisiólogos y biofísicos, Hodgkin y Huxley, presentaron un ingenioso modelo que describe a la membrana celular del músculo en forma de circuito equivalente. Los investigadores midieron, con una pinza de voltaje, el efecto del voltaje sobre la apertura y el cierre de los distintos canales activados por voltaje. Cuando se utiliza este aparato, se insertan dos electrodos en la fibra nerviosa. Uno de ellos mide el voltaje del potencial de membrana y el otro conduce la corriente eléctrica hacia el interior o el exterior de la fibra nerviosa. El voltaje en el interior de la fibra nerviosa puede ser ajustado de manera deseada para inyectar automáticamente la electricidad por medio del electrodo de corriente.Al aumentar el potencial de membrana hasta cero, se abren los canales de sodio y de potasio activados por voltaje permitiendo el pasaje de los iones. Para mantener el voltaje intracelular a nivel cero, el flujo de corriente inyectado debe ser igual al flujo de corriente que pasa por los canales de la membrana, pero de polaridad inversa. Un osciloscopio conectado al electrodo de corriente registra este flujo.

Otra metodología para el estudio del flujo de estos iones se consigue analizando un tipo de canal específico mediante el bloqueo de un tipo de canal cada vez. Los canales de sodio pueden bloquearse con tetrodotoxina (TTX), potente neurotoxina que se encuentra en las vísceras de muchas especies de peces, como el pez globo. Colocando TTX al exterior de la membrana celular, se consiguen bloquear estos canales porque allí se encuentran las compuertas de activación del sodio. En cambio, los canales de potasio pueden bloquearse con el ion tetraetilamonio (TEA) aplicándolo en el interior de la fibra nerviosa.

Constante de tiempo

La Constante de Tiempo (ح) es el tiempo donde se alcanza el 63% del potencial máximo.Al inyectar una corriente en la membrana celular, se genera un potencial local en la membrana. En el periodo de tiempo que no se inyecta corriente, el potencial de membrana tendrá valor de reposo.Al volver a inyectar corriente para que se forme un potencial de membrana, debe pasar un cierto tiempo (τ). Cada neurona tiene su propio τ.τ = C x R , siendo C la capacitancia y R la resistencia.

Constante de espacio

Al inducir un estímulo en una célula y colocar varios microelectrodos separados a lo largo del axón, vemos que los registros de los microelectrodos son distintos. La respuesta se hace menor al alejarnos del foco del estímulo. Llegando a ser cero en el punto más alejado donde midamos.La constante de espacio es la distancia del punto del estímulo en la que el potencial de membrana es el 37% del que se alcanza en la vecindad del lugar de estimulación.

MATERIALES

Se utilizaron los programas simuladores de potencial de membrana: Axovacs y Memcable.

PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS

Se simularon experimentos de voltage clamp y de current clamp modificando las concentraciones iónicas, la amplitud y el tiempo de duración del estímulo, la frecuencia y el agregado de drogas bloqueadoras de distintos canales iónicos (TTX, TEA), en los programas de Axovacs y Memcable.

Primera parte: MemCable

1. Neurona esféricaSe aplicaron distintos voltajes en la membrana de una célula neuronal esférica, y luego se calculó la resistencia (Ω), mediante el uso de la Ley de Ohm, R = V / i.Rango de corriente: 0.01-0.05 uA

Tabla 1.

Zona de la neurona Corriente (uA) Voltaje ∞ (mV) Resistencia (uΩ)

izquierda 0.01 24.87 2.4870

arriba 0.025 62.17 2.4868

derecha 0.01 24.87 2.4870

abajo 0.03 66,85 2.4867

derecha 0.04 89.13 2.4857

Cálculo de las constantes de tiempo ( ح ) La Constante de Tiempo (ح) es el tiempo donde se alcanza el 63% del potencial máximo.Este valor se lo utiliza para calcular el tiempo al cual se alcanza el potencial máximo, al analizar la gráfica diseñada por el programa del voltaje versus tiempo.

Tabla 2.

Corriente (uA) Voltaje ∞ (mV) 63% V∞ tiempo (ms)

0.01 24.87 15.67 2.8

0.025 62.17 39.16 2.8

0.03 66.85 42.11 2.8

0.04 89.13 56.15 2.8

Como ح= R x C , podemos calcular la capacitancia de la membrana, que también es un valor constante.

C = ح/R = 2.8/2.23 = 1.2556 nF

2. Fibra nerviosa

Cálculo de la constante de espacio ( )⋋

Se pusieron dos electrodos en distintas posiciones del axón para medir el potencial de membrana. Se inyectó siempre 0,1 uA de corriente; además, teniendo en cuenta que la relación de caída del voltaje según la distancia es logarítmica, se calcularon los logaritmos para poder hacer el gráfico de una recta. Al no tratarse de una neurona esférica, la resistencia no es constante y por lo tanto, depende del lugar donde se coloca la corriente. Se inyectó corriente en 7 lugares distintas (X).El intervalo de corriente permitido para la experiencia: 0.01-0.25 uA.

Tabla 3.

X (mm) V∞ (mV) Log (voltaje)

0 32.40 1.51

+0.52 25.42 1.40

+1.11 19.34 1.30

+2.03 12.65 1.10

-0.79 22.51 1.35

-1.34 17.39 1.24

-2.07 12.45 1.09

A continuación se puede visualizar la tendencia que toma la curva, frente a una misma corriente eléctrica.

Gráfico 1.

Gráfico 2.

Log (voltaje)= -0,201x + 1,510 corresponde al cociente 1/⋋.⋋ representa el espacio que recorre la señal para que sea el 63% el voltaje original. Entonces:

1/⋋ = - 0,201 mV/mm

Segunda parte: Axovacs

1. Potencial de AccionSe realizan estimulaciones a diferentes tiempos, intensidades y duración de las corrientes, pudiéndose observar: los potenciales de acción, el tiempo refractario relativo y absoluto.V(0)= -60 mVi= 100 uAR (membrana)=600 uΩ (A tiempo fijo)

Estímulo 1 Amplitud: 100 uA/cm2 Tiempo de duración: 0.1 mSegEstímulo 2 Amplitud: 150 uA/cm2 Tiempo de duración: 0.3 mSeg

A partir de los datos anteriormente expuestos, se puede obtener:* Tiempo refractario relativo: 7-8 mSeg* Tiempo absoluto: 5-7 mSeg

2. Escala ExpandidaSe estudia las condiciones necesarias para que el potencial alcance el umbral, y se dispare el potencial de acción.

Potencial de membrana inicial: -60 mVDuracion: 0.1 msEl valor del Umbral se da a 63 uA/cm2

3. FarmacologíaSe estudió el comportamiento de los potenciales de acción al bloquear gradualmente los canales de K+ y Na+, mediante el uso de Tetraetilamonio y TTX, respectivamente.

Variación de la concentración de TEA

Se variaron las concentraciones de tetraetilamonio entre 0 y 100 mM. Al aumentar la concentración de TEA, los potenciales se repolarizan más lento porque cada vez se abren menos canales de potasio y se alargan los períodos refractarios.

Variación de la concentración de TTX

En este caso el TTX bloquea los canales de Na+ , los cuales son necesarios para que se dispare un potencial de acción; por lo que, a medida que la concentración de TTX aumenta, la señal se va haciendo más débil hasta que directamente no se dispara el potencial de acción y tampoco se abren los canales de potasio.

4. Sustitución de Iones

Variación de la concentración del ión Na + Se analizó el comportamiento de la membrana al variar la concentración relativa del ión Na+ y manteniendo constante la concentración relativa del ión K+. A medida que disminuye la concentración de sodio también disminuye la despolarización que se produce en el disparo de un potencial de acción hasta que directamente ya no se dispara más.

Variación de la concentración del ión K + Mediante la variación de la concentración del ión K+ y con la concentración del ión Na+

constante, se observó que el impulso nervioso se produce, pero la membrana no se vuelve a repolarizar en seguida, sino que tarda más.

5. Conductancia Voltaje dependienteSe estudia la simulacion de voltaje-clamp, mediante la conductancia macroscópica de los canales de K+ y Na+

En este caso, como la conductancia depende del voltaje aplicado, a mayor voltaje aplicado, hay mayor conductancia.

CONCLUSIONES

Con este trabajo práctico se ha podido demostrar, evidentemente, lo fundamental que es la utilización de programas simuladores para el conocimiento y entendimiento de los distintos procesos biofísicos que ocurren a través de la membrana.La utilización del programa computacional Memcable permitió observar cómo que se cumple la ley de Ohm a través de la membrana. Además, se pudo apreciar cómo la resistencia es constante en la membrana esférica al aplicar corriente en distintos lugares de la célula, a diferencia de la fibra nerviosa que es asimétrica. Con el programa Axovacs se pudo determinar la importancia de las concentraciones de los iones de Na+ y K+ en los potenciales de la membrana y el envío de un impulso nervioso. Gracias a la aplicación de farmacología, fue posible apreciar el protagonismo del Na+ en la producción del potencial de acción y del potasio en la repolarización de la membrana.

ANEXOCaso clínico

Supongamos que ustedes se encuentran en la calle con los otrora sobrios y discretos profesor e instructor de la materia, pero los notan con los siguientes síntomas: nistagmo, dismetría, disartria, adiadococinesia y marcha atáxica (¿a qué síndrome corresponde esto?). Ustedes prefieren no saludarlos, para no quedar identificados en la vía pública con tales personajes, pero a los dos años. Luego de haber intentado infructuosamente rendir el examen final de Fisiología General en reiteradas oportunidades, se encuentran con que los que supieron ser sensibilísimos y agudos docentes presentan déficits visuales y un aumento en la latencia de los potenciales evocados. Finalmente, a los cuatro años, quienes eran conocidos como apolíneos maestros presentan paraplejia.

¿Qué diagnóstico propondrías para los docentes? ¿Alguna relación con la velocidad de conducción del potencial de acción? ¿Qué pensás llevarle a tus ex-profesores al asilo?

La enfermedad de los profesoresse trata de un tipo de esclerosis, por los signos que presentanEl síntoma primordial de este tipo de enfermedades es la mioclonía (contracciones breves y bruscas en los músculos) . Le siguen en importancia la epilepsia, los trastornos de la marcha y del equilibrio (ataxiaAl perder el recubrimiento de la vaina de mielina los impulsos nerviosos se transmiten a menor velocidad.

BIBLIOGRAFÍA

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