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Química Biológica Patológica 2017 Licenciatura en Bioquímica

Área de Química Biológica 35

TP N°3: PCR-II AMPLIFICACIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GEN DE CFTR

MEDIANTE LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

� Diagnóstico molecular de Portadores de la Mutación ∆F508 por Mutagénesis Dirigida

� Diagnóstico molecular de la mutación ∆F508 y G542X por MAS-PCR (PCR Múltiple Alelo Específica)

Dra. Silvia Mabel Varas – Dra. María Gabriela Lacoste

Objetivos: - Aplicar las técnicas de PCR Múltiple Alelo Específica (MAS-PCR) y de

Mutagénesis Dirigida mediada por PCR para ser utilizadas como herramientas diagnósticas de las mutaciones dF 508 y G452X.

- Interpretación de los resultados obtenidos; justificación del uso de controles. Introducción La fibrosis quística es la enfermedad autosómica recesiva más frecuente en la

población de raza caucásica. Aparece como consecuencia de mutaciones en el gen que codifica para el CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), esta proteína reguladora actúa como un canal iónico interviniendo en el transporte activo de electrolitos como son los iones cloruros. El gen para la CFTR consta de 250 Kb y está ubicado en el cromosoma 7. La mutación más frecuente que da origen a la enfermedad es la conocida como ∆F508 que implica una deleción de 3 pb en el exón 10 con la consiguiente pérdida de Fenilalanina en la estructura proteica. Esta mutación es la responsable de la patología con un 60-90% de frecuencia en las poblaciones de origen caucásico; aunque existen otras mutaciones que producen modificaciones en el marco de lectura, afectan el sitio de splicing, producen codones stop, etc, todas ellas alterando la proteína CFTR y dando origen la enfermedad.

Diagnóstico El diagnóstico estándar de la fibrosis quística se realiza basado en la

sintomatología clínica del paciente, sus antecedentes familiares y realizando el Test del sudor.

Se sospecha de FQ con: • La presencia de una o más de las siguientes características fenotípicas: 1) Enfermedad sinusopulmonar crónica 2) Anormalidades gastrointestinales o nutricionales 3) Síndrome de pérdida de sal 4) Azoospermia • un hermano/a con FQ, • pesquisa neonatal positiva. Se confirma la patología con: • Resultado positivo de la prueba del sudor en al menos 2 ocasiones,



• presencia de 2 mutaciones del CFTR causantes de FQ, • demostración de diferencia de potencial nasal transepitelial anormal. La Pesquisa Neonatal de FQ se realiza mediante la determinación de Tripsina

Inmunorreactiva (TIR) en manchas de sangre. En caso de que esta prueba resultase positiva, existen distintas estrategias para la confirmación de la enfermedad. Las mismas pueden ser: TIR/TIR/SUDOR o TIR/TIR/ADN (ver figura a continuación).

La confirmación bioquímica de FQ se realiza mediante el Test del Sudor. La

prueba consiste en la estimulación de las glándulas sudoríparas mediante iontoforesis con pilocarpina, la recolección del sudor y la cuantificación de la concentración de electrólitos en sudor (cloruro o cloruro y sodio) colectados en papel de filtro

Valores de referencia de Cloruros: • Valores normales: inferiores a 40 mmol/l. • Valores intermedios o dudosos: de 40-60 mmol/l. • Valores patológicos compatibles con diagnóstico de FQ: superiores a 60

mmol/l. Algunos datos evidencian que, en menores de 3 meses, una concentración mayor a

40 mmol/l es altamente sugestiva de diagnóstico de FQ. Estudios Moleculares realizados en la Argentina han mostrado un amplio espectro

de alteraciones en el gen CFTR. En total se han descrito 52 mutaciones más frecuentes: la mutación ΔF508 está presente en el 58-60% de los alelos FQ. La segunda mutación más frecuente es la G542X, presente en alrededor del 5% de los alelos. Otras 16 mutaciones (N1303K, W1282X, 1717-1G>A, 3849+10KbC>T, R334W, G85E, DI507, 2183AA>G, 2789+5G>A, 1811+1.6KbA>G, R1162X, R553X, R1066C, 621+1G-T, 3659delC y 1898+1G>A) presentan frecuencias cercanas al 1-2%, de acuerdo a la población analizada. El resto de las mutaciones se presentan con frecuencias menores.

El análisis conjunto de las mutaciones más frecuentes permite detectar, en promedio, alrededor del 75% de los alelos afectados en nuestra población.

/SUDOR



A. AMPLIFICACION DE UN FRAGMENTO DEL GEN CFTR: DETECCIÓN DE LA MUTACIÓN ΔF508 POR MUTAGÉNESIS

DIRIGIDA MEDIADA POR PCR

Esta técnica se basa en la inserción artificial de un sitio de corte para una enzima de restricción generado por una modificación de un nucleótido en uno de los cebadores o primers. Específicamente, en esta técnica se utiliza un cebador forward (F) con un cambio puntual (C�G) en la base 433 (�) del exón 10 del gen del CFTR. Dicho cambio artificial es adyacente al sitio de mutación ΔF508 (recordemos que en dicha mutación hay una pérdida del triplete CTT que codifica para el aminoácido fenilalanina).

La enzima MboI reconoce la secuencia (↓GATC). El cambio introducido genera un sitio de corte para la enzima MboI en el alelo sano, pero no aparece en el alelo con la deleción ΔF508, ya que debido a la ausencia del triplete no se puede completar la secuencia de reconocimiento para el corte de la enzima.

En el alelo normal hay corte con la ER (+) mientras que en el alelo mutado no hay corte (-).

Además, se eligió un cebador reverse (R) que permitiera la inclusión de un sitio de corte constitutivo para la enzima MboI, a efectos de servir como control interno de la actividad de la enzima de restricción (posición 634�).

Sin el corte con la enzima, el tamaño de los productos de amplificación será de 262 pb para el alelo normal y de 259 pb para el mutado. Luego del corte con la enzima, se observan los siguientes fragmentos para el alelo normal: 17 pb, 201 pb y 44 pb y para el alelo mutado: 215 pb y 44 pb.

PROTOCOLO



1) Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de PCR será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos. Conclusión: el ADN de la muestra debe estar contenido en 5 µl. A partir de los datos de concentración de su ADN muestra, calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 1 µg. En el caso de que este volumen sea menor a 5 µl, llevar a volumen con agua destilada estéril.

2) Rotular todos los tubos con el número de comisión que le corresponde. Identificar cuatro de los tubos de PCR con una M1, M2 y M3 (M: muestra) y al restante con el signo (-), ya que será su Control Negativo.

3) El tubo Eppendorf más grande (de 1500 µl) es el que usted utilizará para preparar la Master MIX. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número de tubos que procesará: n (en su caso, 4). Multiplique TODOS los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix). En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique entonces, todo por cinco.

Composición de la Master Mix

H2O (c.s.p. 20 μl)……………. 11,25 μl ….56,25 μl Buffer 10X………………….. 2,5 μl ….12,5 μl MgCl2 25 mM……………….. 2 μl ….10 μl dNTPs 2,5 mM………………. 2 μl x5 ….10 μl Primer S (25 pmol//μl)………. 1 μl ….5 μl Primer AS (25pmol/μl)……… 1 μl ….5 μl Taq pol (5U/μl)……………… 0,25 μl ….1,25 μl

(ACLARACION: c.s.p.: cantidad suficiente para) 4) Preparación de la master mix: Adicionar al tubo de 1500 µl los distintos

reactivos en orden de volumen decreciente (y vaya tildándolos para no agregar nuevamente un reactivo). La Taq polimerasa es la última en agregarse para evitar que esté demasiado tiempo fuera del freezer.

PRECAUCIONES: • Trabajar SIEMPRE sobre hielo. • NO HABLAR durante la preparación de la mix, para evitar contaminaciones. 5) Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo M. En el tubo de Control

Negativo colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin (centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador.

CONTROL NEGATIVO: tiene los mismos componentes que el tubo “M” (ya que

se usa la misma master mix) pero NO tiene ADN, DE MANERA QUE EN EL NO DEBE HABER AMPLIFICACION. Entonces el objeto de realizar el control negativo es: detectar cualquier contaminación que exista; ya que al revelar el gel corrido con GelRed, si se ve alguna banda el control negativo está contaminado, lo que inutiliza toda la reacción (ya que si una muestra presenta una banda, no sabré con certeza si es positiva o si es un falso positivo por contaminación de la master mix).



Programa de ciclado

Temperatura (ºC) Tiempo

Ciclo Inicial 94 3 minutos

Se repiten 35 ciclos

95 1 minuto

50 2 minutos

72 1 minuto

Ciclo Final 72 5 minutos

6) Una vez culminada la amplificación, se hace una corrida electroforética en gel

de poliacrilamida al 12% en una cuba vertical para la visualización del producto. La migración de ADN a través de los geles de poliacrilamida depende de:

• tamaño molecular del ADN • la concentración de poliacrilamida • la conformación espacial del ADN • la corriente aplicada. Preparación del gel poliacrilamida al 12%: (cantidad suficiente para 10 ml)

Reactivos ↓/ Concentración de poliacrilamida→ 12 % Acrilamida (30%) 4 ml Agua 3,93 ml TBE 5X 2 ml Persulfato de amonio (25%) 70 µl TEMED 3,5 µl Rango de separación 40-200 pb

Buffer para electroforesis: TBE 1X, pH 8. 7) Preparación de las muestras a sembrar: a) Enumerar tantos tubos como muestras (incluido el control negativo) más un

tubo para un control de peso molecular. b) Colocar en cada tubo 8 µl del amplificado + 2µl de buffer de siembra. c) En el tubo para el control de PM, en cambio: colocar 5µl del Marcador de Peso

Molecular. d) Realizar un spin. e) Sembrar en el gel con micropipeta, en forma vertical. f) Correr a 100 V aproximadamente. g) Terminada la corrida, sacar el gel y teñir aproximadamente 10 minutos en una

solución 1X de GelRed. h) Visualizar en el transiluminador, con protección adecuada, las bandas del

amplificado.



Posición Nombre Muestra Resultado 1 . 2 . 3 . 4 . 5 . 6 . 7 . 8 . 9 . 10 . Notas generales Al visualizar en el transiluminador, puede ocurrir que:

1) No observe bandas en ningún carril ⇒ olvidó agregar alguno de los reactivos a la Master Mix o el ADN (en todos los tubos). Debe realizar otra vez la reacción.

2) Observe bandas en todos los carriles. En este caso, debe proceder de la siguiente forma: dejar correr más tiempo y volver a observar:

• si continúa observando bandas en todos los carriles y las mismas son de igual tamaño, se contaminó la Master Mix con un ADN extraño. Esto inutilizó toda la reacción y deberá procesar nuevamente las muestras.

• si observa dos bandas (una más gruesa y una más fina y pequeña ⇒ que corre por delante) en los carriles de las muestras y en el carril del control negativo observa una sola banda que se corresponde con la más pequeña de las observadas en las muestras, la reacción estuvo bien realizada; sólo que hubo un exceso de primers que son los que forman la banda más pequeña. Al ser de pocos nucleótidos, migran rápidamente, de manera que si se deja correr el tiempo suficiente, desaparecerán con el frente y sólo quedarán en el gel las bandas del producto de amplificación.

3) Observe bandas en los carriles de las muestras y nada en el control negativo. Esta es la condición óptima de reacción de PCR.

Interpretación de resultados: Los pacientes homocigotas, tanto sanos como enfermos, presentan la formación de

homoduplex de 262 y 259 pb (indistinguibles entre sí), luego de la PCR. Los pacientes heterocigotos presentan alelos normales como mutados, por lo que al final de la PCR se forman 2 homoduplex y el heteroduplex. En caso de observar el producto de PCR, sin tratamiento con la enzima de restricción, mediante esta técnica solo podrán reconocerse los heterocigotas, por visualización del heterodúplex.



Cuando al producto de amplificación se lo somete a digestión con la enzima MboI

previo a la electroforesis, se observan las siguientes bandas:

Los pacientes homocigotos normales (N) presentan un homoduplex de 201pb y los mutados (M) de 215 pb que en un gel al 12% son perfectamente distinguibles. Los pacientes heterocigotos (H) presentan los homoduplex de 201 y de 215 pb y el heteroduplex.

A partir de la información obtenida, se le pide que: 1- Interprete los siguientes geles en donde se usa la técnica de Mutagénesis

Dirigida mediada por PCR para realizar el diagnóstico de la mutación ΔF508 en el gen CFTR, causante de fibrosis cística.

2- Escriba el informe del análisis de la mutación para todos los pacientes cuyos ADN fueron analizados por esta técnica.

M

N



a) Productos de PCR sin corte de enzima de restricción:

b) Productos de PCR con corte de enzima de restricción:



B. AMPLIFICACION DE UN FRAGMENTO DEL GEN CFTR: Detección de la Mutación ΔF508 y G542X por PCR Múltiple Alelo

Específica (MAS-PCR) La PCR Múltiple Alelo Especifica (MAS-PCR) es la amplificación, en un único

tubo, de múltiples fragmentos de una determinada secuencia. Esta estrategia involucra la elección correcta de pares de primers que deberán dar lugar a fragmentos de diferente tamaño y que deberán ser fácilmente resueltos en una única línea de corrida de un gel. Los primers usados son alelo-específicos. Esta técnica se ha usado con éxito en el screnning de 4 de las mutaciones más comunes para fibrosis cística (dF508, G542X, G551D y N1303K).

Los tamaños de los productos de amplificación son: N1303K (240pb), G551D (202pb), G542X (174pb) y ∆F508 (136pb), WT-CF508 (139).

Línea 1 y 12 Marcador de Peso Molecular (ϕX174 digerido con HaeIII). En las

líneas 2,4, 6, 8 y 10 se usaron los primers con las secuencias normales. Líneas 2 y 3: Paciente 1 con primers N y M. Líneas 4 y 5: Paciente 2 con primers N y M. Líneas 6 y 7: Paciente 3 con primers N y M Líneas 8 y 9: Paciente 4 con primers N y M. Líneas 10 y 11: Paciente 5 con primers N y M.



Basado en los datos brindados por esta publicación, realice el informe de las mutaciones analizadas de los pacientes 1 al 5

En el TP se realizara el diagnóstico de las mutaciones ∆F508 y G542X. Cada muestra se amplifica en dos tubos: en el primer tubo se colocarán los pares de cebadores para los alelos normales (cebadores F: CF-W1468-N y R: CF-508 RP para la mutación ∆F508 y cebadores F: 5’IVS-11 y R: G542X-N para la mutación G542X). En el segundo tubo se colocarán los pares de cebadores para los alelos mutados (cebadores F: ∆F508 y R: CF-508 RP para la mutación ∆F508 y cebadores F: 5’IVS-11 y R: G542X-M para la mutación G542X).

Primers Secuencia Tipo

CF-W1468-N 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC TT -3’ F1 ∆F 508 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT GG-3’ F2

CF-508 RP 5’-TAG TGT GAA GGG TTC ATA TGC ATA AT-3’ R1

G542X-N 5’-GTG TGA TTC CAC CTT CTC C-3’ R3 G542X-M 5’-GTG TGA TTC CAC CTT CTC A-3’ R4 5’IVS-11 5’-CAA CTG TGG TTA AAG CAA TAG TGT-3’ F3 Los tamaños de los productos de amplificación obtenidos serán de 139 pb para el

alelo normal de ∆F508, 136 pb para el alelo con la mutación dF508, 174 pb para el alelo normal G542X y de 174 pb para el alelo mutado de G542X.

PROTOCOLO

1) Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de PCR será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos y 5 µl a la muestra de ADN. A partir de los datos de concentración de su ADN muestra, calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 0,1 µg.

2) Rotular todos los tubos con el número de comisión que le corresponde. 3) Identificar ocho de los tubos más pequeños (de 500 µl) con una M1N, M1M,

M2N, M2M, M3N y M3M y a los dos restantes con el signo (-N) y (-M). 4) Se utilizarán dos tubos Eppendorf (de 1500 µl) para preparar la Master MIX N

(que amplificará los alelos normales, en caso de estar presentes) y la Master MIX M (que amplificará los alelos que presenten las mutaciones analizadas). Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número de tubos que procesará: n (en su caso, 4 para cada MIX). Multiplique TODOS los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix). En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique entonces, todo por cinco.



Entonces se deben realizar DOS MASTER MIX : a) Composición de la Master Mix NORMAL:

1. H2O (csp 20µl)………………………..... 11,4 µl ……... 34,2 µl 2. Buffer 10X……………………………… 2,5 µl ……... 7,5 µl 3. Mg Cl2 50mM………………………….. 1 µl ……... 3 µl 4. dNTPs 2,5 mM………………………….. 2 µl X 3 ……... 6 µl 5. Primer CF-W1468-N (25 pM/µl)...……. 0,6 µl ……... 1,8 µl 6. Primer CF-508-RP (25pM/µl)…………... 0,6 µl ……... 1,8 µl 7. Primer G-542-X N (25pM/µl)…………... 0,8 µl ……... 2,4 µl 8. Primer 5´IVS-11 (25pM/µl)…………….. 0,8 µl ……... 2,4 µl 9. Taq pol. (5U/µl)……………………….... 0,3 µl ……... 0,9 µl

(ACLARACION: c.s.p.: cantidad suficiente para) b) Composición de la Master Mix MUTANTE:

1. H2O (csp 20µl)…………………………... 11,4 µl ……... 34,2 µl 2. Buffer 10X……………………………… 2,5 µl ……... 7,5 µl 3. Mg Cl2 50mM………………………….. 1 µl ……... 3 µl 4. dNTPs 2,5 mM………………………….. 2 µl X 3 ……... 6 µl 5. Primer ∆F508 (25 pM/µl)...……………… 0,6 µl ……... 1,8 µl 6. Primer CF-508-RP (25pM/µl)…………... 0,6 µl ……... 1,8 µl 7. Primer G-542-X M (25pM/µl)…………... 0,8 µl ……... 2,4 µl 8. Primer 5´IVS-11 (25pM/µl)…………….. 0,8 µl ……… 2,4 µl 9. Taq pol. (5U/µl)…………………………. 0,3 µl ……... 0,9 µl

(ACLARACION: c.s.p.: cantidad suficiente para) 5) Preparación de la master mix: Adicionar al tubo de 1,5 ml los distintos

reactivos en orden de volumen decreciente (y vaya tildándolos para no agregar nuevamente un reactivo). La Taq polimerasa es la última en agregarse para evitar que esté demasiado tiempo fuera del freezer.

PRECAUCIONES: • Trabajar SIEMPRE sobre hielo. • NO HABLAR durante la preparación de la mix, para evitar contaminaciones. 6) Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo. En el tubo de Control Negativo

colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin (centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador.

Programa de ciclado

Temperatura (ºC) Tiempo

Ciclo Inicial 95 5 minutos

Se repiten 30 ciclos

95 1 minuto

60 1 minutos

72 1 minuto

Ciclo Final 72 5 minutos



8) Una vez culminada la amplificación, se hace una corrida electroforética en gel de agarosa al 3% en una cuba horizontal para la visualización del producto.

9) Preparación de las muestras a sembrar: Enumerar tantos tubos como muestras (incluido el control negativo) más un tubo

para un control de peso molecular. Colocar en cada tubo 8 µl del amplificado + 2µl de buffer de siembra. En el tubo para el control de PM, en cambio: colocar 5µl del Marcador de Peso

Molecular. Realizar un spin. Sembrar en el gel con micropipeta, en forma vertical, tratando de no romper el gel. Correr a 100 V aproximadamente. Terminada la corrida, sacar el gel y observar en el transiluminador. Interpretación de los resultados Los tamaños de los productos de amplificación obtenidos serán de 139 pb para el

alelo normal de ∆F508, 136 pb para el alelo con la mutación dF508, 174 pb para el alelo normal G542X y de 174 pb para el alelo mutado de G542X.



BIBLIOGRAFÍA: Fortina P, Conant R, Monokian G, Dotti G, Parrella T, Hitchcock W, Kant J,

Scanlin T, Rappaport E, Schwartz E, et al. 1992. Non-radioactive detection of the most common mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene by multiplex allele-specific polymerase chain reaction. Hum. Genet. 90: 375-378.

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