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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Facul tad de Ciencias Qumicas

Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular I

Marcadores de activacin

alternativa de macrfagos:

DC-SIGN y FR

Tesis Doctoral

Elena Sierra Filardi

Madrid, 2010

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A mis padres,

Rafael y Mara

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La felicidad humana generalmente no se logra con grandes golpes de suerte,que pueden ocurrir pocas veces, sino con pequeas cosas que ocurren todos los das

Benjamin Franklin

http://www.proverbia.net/citasautor.asp?autor=932http://www.proverbia.net/citasautor.asp?autor=932http://www.proverbia.net/citasautor.asp?autor=932

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ndice

ABREVIATURAS ......................................................................................................................... 1

INTRODUCCIN ......................................................................................................................... 5

1. El sistema inmunitario y sus componentes celulares .............................................................. 7

2. Monocitos ................................................................................................................................. 8

3. Clulas dendrticas.................................................................................................................... 9

4. Macrfagos ............................................................................................................................. 11

4.1 Diferenciacin de macrfagos ................................................................................... 12

4.1.1 Citoquinas implicadas ................................................................................... 12

4.1.1.1 Macrfagos generados en presencia de GM-CSF y M-CSF .......... 13

4.1.1.2 Fenotipo y funcin de macrfagos M1 y M2 ................................... 14

4.1.2 Tejido-especificidad ...................................................................................... 16

4.1.2.1 Macrfagos intestinales ................................................................... 16

4.1.2.2 Macrfagos peritoneales ................................................................. 16

4.2 Activacin de macrfagos .......................................................................................... 17

4.2.1 Activacin clsica vs.activacin alternativa ................................................. 17

4.2.2 Caractersticas fenotpicas de macrfagos activados .................................. 19

4.2.3 Macrfagos asociados a tumores ................................................................. 21

4.3 Estudios de expresin gnica en diferenciacin y activacin de macrfagos ........... 23

5. El receptor de patgenos DC-SIGN ....................................................................................... 24

5.1 Expresin y localizacin tisular .................................................................................. 25

5.2 Estructura y dominios funcionales ............................................................................. 25

5.3 Estructura gnica, isoformas y polimorfismos ........................................................... 26

5.4 Funcin y sealizacin ............................................................................................... 28

OBJETIVOS ............................................................................................................................... 31

RESULTADOS ........................................................................................................................... 35

1. El receptor de folato se expresa en macrfagos asociados a tumores y constituye un

marcador de macrfagos anti-inflamatorios/reguladores M2 ..................................................... 39

2. Activina A previene la adquisicin de marcadores anti-inflamatorios/M2 y sesga la

secrecin de citoquinas por los macrfagos .............................................................................. 53

3. Requerimientos estructurales para la multimerizacin del receptor de patgenos DC-

SIGN (CD209) en la superficie celular ....................................................................................... 79

4. Identificacin de eptopos en la molcula de DC-SIGN ......................................................... 99

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ndice

DISCUSIN ..............................................................................................................................111

El receptor de folato es un marcador de macrfagos anti-inflamatorios M2 y TAM, cuya

expresin es regulada por activina A .......................................................................................113

Requerimientos estructurales de DC-SIGN para su multimerizacin. Influencia de la

presencia de variantes con menor tamao en la regin del cuello .......................................... 125

Identificacin eptopos en la molcula de DC-SIGN................................................................. 130

CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 133

BIBLIOGRAFA ........................................................................................................................ 137

ANEXO .....................................................................................................................................157

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Abreviaturas

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Abreviaturas

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MyD88Myeloid differentiation primary response gene (88)

NFB Nuclear factor-kappaBNKNatural killer

NONitric oxideNOD Nucleotide-binding oligomerization domain

PAMP Pathogen-associated molecular patterns

PBMC Peripheal blood-mononuclear cells

PPARPeroxisome proliferator-activated receptor gammaPRR Pattern recognition receptor

RA Rheumatoid arthritis

RNARibonucleic acid

RNSReactive nitrogen species

ROS Reactive oxygen species

SARSSevere acute respiratory syndrome

SCFStem cell factor

TAMTumor-associated macrophages

TCR T cell receptor

TGFTransforming growth factor-beta

ThT helper

TLR Toll-like receptor

TNFTumor necrosis factor-alpha

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Introduccin

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Introduccin

1. El sistema inmunitario y sus componentes celulares

La funcin esencial del sistema inmunitario es proteger al organismo de agentes infecciosos y

microorganismos presentes en el ambiente. Para ser eficaz, el sistema inmunitario debe detectaruna gran variedad de patgenos, y distinguirlos de las clulas y tejidos del propio organismo. En

vertebrados, en este sistema de defensa colaboran el sistema inmunitario innato y el sistema

inmunitario adaptativo [1].

El sistema inmunitario innato constituye la primera lnea de defensa que limita la infeccin tras

la exposicin a microorganismos, y proporciona una respuesta inmediata e inespecfica, pues

reconoce y responde a los patgenos de forma genrica y sin conferir inmunidad duradera contra

ellos [2]. Este sistema de defensa incluye componentes celulares (clulas epiteliales, clulas

dendrticas, macrfagos, neutrfilos y clulas NK), molculas del sistema del complemento y

citoquinas. Sus clulas estn equipadas con receptores de reconocimiento de patrones (PRR), que

reconocen patrones moleculares asociados a patgenos (PAMP) y seales endgenas asociadas a

dao tisular (DAMP). El sistema inmunitario innato es capaz de activarse nicamente frente a estas

seales de peligro detectadas por los PRR de forma especfica [3]. Por contra, el sistema

inmunitario adaptativo genera respuestas antgeno-especficas y confiere memoria inmunolgica tras

el primer contacto con el antgeno. La respuesta inmunitaria adaptativa est mediada por

componentes celulares (linfocitos T y B) y humorales (anticuerpos). Las clulas presentadoras de

antgeno (APC), y en especial clulas dendrticas y macrfagos, juegan un papel fundamental en laconexin entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa, ya que son las responsables de

procesar y presentar antgenos a los linfocitos T en el contexto de las molculas del complejo de

histocompatibilidad (MHC) presentes en su superficie [1]. En consecuencia, el sistema de defensa

innato tiene como segunda funcin estimular y polarizar la respuesta inmunitaria adaptativa con

objeto de optimizar la eliminacin del patgeno y minimizar los daos tisulares colaterales [4].

El sistema inmunitario de los vertebrados superiores est compuesto por gran variedad de

clulas funcionalmente diferentes que derivan de clulas madre hematopoyticas (HSC) [5]. Las

HSC se renuevan a s mismas y dan lugar a clulas progenitoras mieloides (CMP) y linfoides (CLP),

con potencial ms limitado y que dan origen a granulocitos, monocitos, macrfagos, clulas

dendrticas y mastocitos [6], o linfocitos B y T, y clulas NK [7], respectivamente.

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Introduccin

2. Monocitos

Los monocitos se originan en la mdula sea a partir de un precursor mieloide y se liberan

posteriormente al torrente sanguneo, donde constituyen un 10% de los leucocitos circulantes enhumanos [8]. Los monocitos de sangre perifrica tienen una vida media relativamente corta (24-72

horas) [9], y contribuyen a la renovacin de los macrfagos y clulas dendrticas tisulares [10]. Los

monocitos son heterogneos en trminos de morfologa, marcadores de superficie y capacidad

fagoctica [11], y exhiben una elevada plasticidad en su proceso de diferenciacin, que es tejido y/o

estmulo dependiente [12]. Como consecuencia, el fenotipo y las funciones efectoras de los

macrfagos residentes en los diferentes tejidos (macrfagos alveolares, clulas de Kupffer,

microgla, osteoclastos) varan considerablemente. La plasticidad del sistema de diferenciacin

mieloide se refleja en la capacidad de transdiferenciacin que exhiben los distintos tipos celulares

derivados de monocitos. As, por ejemplo, los macrfagos pueden ser inducidos a adquirir

propiedades fenotpicas y funcionales de clulas dendrticas, mientras que las clulas dendrticas

derivadas de monocitos (MDDC) in vitropierden sus funciones efectoras al retirar las citoquinas que

promueven su generacin [13] (Figura 1). Dicha plasticidad tambin se refleja en procesos

fisiolgicos como la resolucin de la inflamacin, donde la presencia de clulas apoptticas facilita la

transformacin de macrfagos citotxicos/pro-inflamatorios en macrfagos promotores de

crecimiento/anti-inflamatorios encargados de reparar y limitar el dao tisular asociado al proceso

inflamatorio [14].

GM-CSFM-CSF

GM-CSF + IL-4/IL-13/IFNIL-3 + IL-4

Clula dendrticaMacrfago

Monocito

IL-6 / IL-10 / IFN

IL-4

GM-CSF + IL-4

cytokine remove + M-CSF

Figura 1.- Diferenciacin in vitro de monocitos. Esquema ilustrativo de la plasticidad y la estmulo-

dependencia de la diferenciacin de monocitos de sangre perifrica.

Las citoquinas son el estmulo crtico para que los monocitos progresen hacia cada una de sus

alternativas de diferenciacin. De hecho, la primera citoquina con la que los monocitos entran en

8

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Introduccin

contacto determina su programa de diferenciacin y su perfil de respuesta a otras citoquinas [15]. La

diferenciacin in vitro de monocitos a macrfagos o clulas dendrticas es un ejemplo de dicha

dependencia (Figura 1). Las citoquinas comnmente empleadas para generar MDDC in vitroson

GM-CSF e IL-4 [16-18], mientras que los macrfagos se diferencian en presencia de GM-CSF o M-

CSF [19]. En humanos, IL-4 favorece la diferenciacin a clulas dendrticas e impide la generacin

de macrfagos [16, 20], mientras que la presencia de IL-6 limita la generacin de estas clulas y

promueve la diferenciacin a macrfagos de manera dependiente de M-CSF [21]. Por otra parte, el

entorno celular y la presencia de estmulos externos tambin condiciona la diferenciacin del

monocito inducida por citoquinas [10].

Por lo que se refiere a factores de transcripcin, el factor PU.1 junto con C/EBP, RUNX1 y AP-

1, es crtico en la diferenciacin monoctica, ya que ratones deficientes en PU.1 carecen de linaje

mielomonoctico, lo que es debido fundamentalmente a su papel esencial en la regulacin de losgenes que codifican los receptores de GM-CSF, M-CSF y G-CSF [22].

3. Clulas dendrticas

En 1973 Ralph M. Steinman y Zanvil A. Cohn describieron un tipo celular presente en losrganos linfoides perifricos de ratn y al que denominaron clula dendrtica (DC) [23].

Posteriormente las DC fueron identificadas como un componente minoritario de las clulas

mononucleares de sangre perifrica (PBMC) en humanos [24], y se caracterizaron por ser las

clulas estimuladoras ms potentes en cultivos leucocitarios mixtos y en la activacin de linfocitos

citotxicos [25, 26]. En la actualidad, las DC se consideran centinelas del sistema inmunitario y APC

profesionales, ya que son las nicas APC eficaces en la activacin de linfocitos T naive, debido a

su elevada expresin de molculas de MHC, coestimuladoras y de adhesin en su superficie. Las

DC son capaces de presentar antgenos exgenos en el contexto de MHC-II y MHC-I (cross-

priming), lo que justifica su capacidad de induccin de respuestas inmunitarias primarias [27].

En funcin de su linaje o de su estado de activacin, las DC tienen la capacidad de iniciar una

respuesta inmunitaria o promover tolerancia [28]. An ms, las DC determinan el tipo de respuesta

inmunitaria que se genera frente a un antgeno, pues son ellas quienes determinan la polarizacin

de los linfocitos Th naivehacia Th1 (productores de IFNy eficaces en la eliminacin de patgenos

intracelulales), Th2 (productores de IL-4 y efectivos en la eliminacin de patgenos extracelulares),

Th17 (productores de IL-17 e implicados en respuestas autoinmunes) o Treg (clulas T reguladoras

implicadas en procesos inmunosupresores) [29].

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Introduccin

Las DC humanas son una poblacin heterognea en cuanto a fenotipo, localizacin anatmica

y funcin, y se clasifican en dos grupos segn su grado de parentesco con linajes celulares bien

establecidos: DC mieloides y DC plasmacitoides [30]. Las DC mieloides (CD11c+ CD123-) se

distribuyen prcticamente en todos los tejidos y se denominan de formas diversas dependiendo de

su localizacin tisular: clulas de Langerhans (en epidermis y mucosas), DC drmicas, DC tmicas,

DC intersticiales (en casi la totalidad de rganos), etc. [29]. Las DC mieloides circulantes

representan slamente un 0.5% de las PBMC totales [31]. Por el contrario, las DC plasmacitoides o

linfoides (CD11c- CD123+) proceden de progenitores distribuidos en el timo y en reas T de los

rganos linfoides secundarios [32], y residen en ndulos linfticos, bazo, timo, mdula sea y sangre

perifrica [33]. Las DC plasmacitoides son importantes mediadores de la inmunidad anti-viral,

produciendo grandes cantidades de IFNal ser estimuladas [34].

SSiisstteemmaa ccii rrccuullaattoorriioo

Figura 2.- Ciclo vital de las clulas dendrticas. Las clulas dendrticas se diferencian a partir de

progenitores de mdula sea que llegan a los tejidos a travs del sistema circulatorio, y donde residen como

DC inmaduras hasta que reciben seales que promueven su migracin y maduracin. Las DC maduras migran

a los ganglios linfticos, donde activan y polarizan a los linfocitos T naivehacia los diferentes tipos de clulas

Th.

DIFERENCIACIN

Progenitores demdula sea

DC de sangre perifrica DC inmaduras

TTe

MMdduullaasseeaa

ejj iiddoo

VVaall iinnfftt iiccaa

NNdduullooll iinnfftt iiccoo

MADURACINMIGRACIN

DC maduras

Sealesde peligro

Antgenosoluble

Clula Tefectora

Clula T naive

10

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Introduccin

Las DC mieloides se originan a partir de progenitores de mdula sea, que generan

precursores circulantes cuya extravasacin a los tejidos da lugar a las DC inmaduras residentes

(Figura 2). La elevada capacidad fagoctica de estas clulas les permite captar y procesar

contnuamente antgenos que son cargados en molculas de MHC [30]. La deteccin de seales de

peligro a travs de los receptores tipo Toll (TLR) y protenas NOD hace que las DC maduren y

migren hacia los rganos linfoides secundarios. Durante ese trayecto, estas clulas disminuyen su

capacidad de captura y procesamiento de antgenos, y aumentan los niveles de expresin de

molculas coestimulatorias y MHC en membrana. En las reas T de los ndulos linfticos, las DC

acaban interaccionando con linfocitos T que portan TCR especficos para los antgenos que las DC

capturaron en los tejidos de origen, iniciando as la respuesta inmunitaria adaptativa [35]. Las DC

maduras presentan antgenos a los linfocitos T CD8+ y CD4+, y estos ltimos a su vez regulan a

otras clulas del sistema inmunitario, como clulas T citotxicas CD8 y clulas B especficas de

antgeno, o clulas no especficas de antgeno como macrfagos, eosinfilos y clulas NK [36].

Como se ha comentado anteriormente, las DC estn especializadas en la presentacin de

antgeno a clulas T naive, y se diferencian de los macrfagos por su eficiente capacidad de

presentacin de antgeno. Recientemente se ha planteado que las DC no constituyen una poblacin

celular diferente de los macrfagos, ya que prodecen de un mismo precursor comn, son sensibles

a los mismos factores de crecimiento, y no existen marcadores especficos ni funciones efectoras

nicas de las DC que justifiquen su distincin de los macrfagos [37].

4. Macrfagos

Metchnikoff, Premio Nobel de Fisiologa y Medicina en el ao 1908 por sus trabajos sobre el

sistema inmunitario, identific clulas capaces de digerir partculas exgenas en el tubo digestivo de

las larvas de peces. A estas clulas las llam fagocitos, y ms tarde las defini como glbulos

blancos integrantes de la primera lnea de defensa contra las infecciones en los seres vivos [38]. El

trmino macrfago (M; del griego makros "grande" y phago "comer") fue asignado en 1924 por

Aschoff a un conjunto de clulas del sistema retculo-endotelial, que inclua monocitos, macrfagos,

histiocitos, fibroblastos, clulas endoteliales y clulas reticulares [39]. Posteriormente se reemplaz

este trmino por el de sistema fagoctico mononuclear (MPS), que comprende monoblastos y

promonocitos de mdula sea, monocitos de sangre perifrica y macrfagos tisulares.

Los macrfagos juegan un papel crtico en el desarrollo de la respuesta inmunitaria, debido a

que actan como primera barrera de defensa, al detectar y eliminar partculas extraas

(microorganismos, macromolculas txicas, clulas propias daadas o muertas) mediante

11

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Introduccin

fagocitosis o secrecin de enzimas, citoquinas o produccin de especies reactivas de oxgeno

(ROS) y nitrgeno (RNS) [40]. Durante la respuesta inmunitaria adaptativa los macrfagos presentan

antgenos a los linfocitos T en el contexto de MHC-II y/o MHC-I, y colaboran con la respuesta

humoral en la eliminacin de agentes extraos [41]. Adems, los macrfagos tienen un papel

importante en procesos de reparacin de heridas y resolucin de la inflamacin, promoviendo el

reclutamiento de otras clulas inflamatorias hacia los focos de inflamacin, as como a remodelacin

de matriz extracelular y angiognesis. En consecuencia, el trmino macrfago agrupa una

multiplicidad de clulas cuya finalidad es el mantenimiento de la homeostasis y la integridad tisular

[12].

4.1 Diferenciacin de macrfagos

Los macrfagos se originan a partir de HSC, y derivan en su mayora de monocitos circulantes

que se extravasan a los tejidos por el influjo de citoquinas y quimioquinas [19]. A pesar de ello, un

pequeo porcentaje de macrfagos (aprox. 5%) derivan de la divisin local de fagocitos

mononucleares en los tejidos [42]. Como se coment anteriormente, el fenotipo de los macrfagos

residentes en tejidos est determinado por el microambiente tisular, la matriz extracelular y los

productos de secrecin y molculas de superficie de las clulas prximas [8].

4.1.1 Citoquinas implicadas

Las principales citoquinas que determinan la supervivencia, diferenciacin y quimiotaxis de los

macrfagos son GM-CSF, M-CSF e IL-3 [12] [43]. El M-CSF es sintetizado constitutivamente por

numerosos tipos celulares (macrfagos, clulas endoteliales, fibroblastos, osteoblastos, clulas del

estroma, etc.), y su concentracin en suero oscila entre de 3-8 ng/ml [44]. Adems, su produccin es

inducida por la activacin de clulas hematopoyticas y fibroblastos con GM-CSF, TNF[45], IL-1 e

IFN [46]. La sntesis de M-CSF es regulada de manera tejido-especfica [43] y sus niveles sonelevados en estados de inmunosupresin (embarazo, tumores), siendo su papel importante en el

establecimiento de la tolerancia materna hacia el embrin [47]. A diferencia del GM-CSF, esta

citoquina juega un papel fundamental en el desarrollo mieloide, ya que ratones M-CSF -/-exhiben una

generacin deficiente de macrfagos [48], mientras que los ratones GM-CSF-/- slo muestran

alterada la maduracin de macrfagos alveolares [49]. El receptor de M-CSF de alta afinidad (CSF-

1R, M-CSFR, c-fms, CD115) se expresa principalmente en clulas del linaje monoctico, como

monocitos, DC, macrfagos y sus precursores [43, 50].

12

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Introduccin

Por otro lado, el GM-CSF es producido por diferentes tipos celulares, incluyendo linfocitos T y

B, macrfagos, mastocitos, eosinfilos, neutrfilos y clulas endoteliales [43]. En condiciones

fisiolgicas el GM-CSF se encuentra en suero a una concentracin de 20-100 pg/ml y, aunque

puede ser producida constitutivamente por clulas tumorales, en la mayora de los casos se requiere

activacin de las clulas productoras [18]. El GM-CSF promueve viabilidad, proliferacin y

maduracin de precursores de neutrfilos, eosinfilos y macrfagos, y sus funciones dependen de

su concentracin, ya que efectos en viabilidad celular requieren menores concentraciones que las

precisas para afectar a la proliferacin celular [18]. Los efectos biolgicos del GM-CSF estn

mediados por el receptor de GM-CSF que, a diferencia del receptor homodimrico del M-CSF (M-

CSFR), est compuesto por una cadena de unin a GM-CSF, y una cadena necesaria para la

transduccin de seales [51].

4.1.1.1 Macrfagos generados en presencia de GM-CSF y M-CSF

GM-CSF y M-CSF presentan una modulacin cruzada de sus respectivas actividades

funcionales: mientras que el M-CSF aumenta la generacin de macrfagos en presencia de bajos

niveles de GM-CSF [52], altas concentraciones de esta ltima impiden el desarrollo de macrfagos

mediado por M-CSF, debido a la accin inhibitoria de GM-CSF sobre la expresin de M-CSFR [53,

54]. Aunque los macrfagos humanos derivados de monocitos (MDM) diferenciados en presencia de

GM-CSF o M-CSF in vitrose consideran equivalentes a los macrfagos residentes en los tejidos en

condiciones homeostticas [19], ambas citoquinas se usan indistntamente en la generacin in vitro

de MDM, dando lugar a poblaciones fenotpica y funcionalmente diferentes [19] (Figura 3). As, en

presencia de GM-CSF se generan macrfagos, denominados M1, que producen citoquinas pro-

inflamatorias (IL-23, IL-12, IL-1, IL-6, TNF) en respuesta a Mycobacterium y promueven

inmunidad de tipo Th1 (pro-Th1) [55, 56]. Por contra, los macrfagos inducidos por M-CSF o M2

secretan IL-10 en respuesta a estmulos externos, inhiben respuestas Th1, y se han implicado en la

induccin de tolerancia [55-57]. Los macrfagos M2 actan como moduladores de autoinmunidad,

ya que inducen clulas Treg e inhiben la diferenciacin de linfocitos Th1 y Th17 [58]. Por todo ello,

los macrfagos M1 y M2 juegan papeles opuestos durante la respuesta inmunitaria, y sonconsiderados como macrfagos pro- y anti-inflamatorios, respectivamente (Figura 3). Del mismo

modo, GM-CSF y M-CSF se emplean para la generacin in vitro de macrfagos a partir de

precursores de mdula sea de ratn, y sus propiedades pro- y anti-inflamatorias se ajustan a las de

los macrfagos M1 y M2 derivados de monocitos humanos [59, 60].

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Introduccin

Macrfago pro-inflamatorio(M1)

Macrfago anti-inflamatorio(M2)

IL-23, IL-12, IL-1, IL-6, TNF

GM-CSF

M-CSF

IL-10Th1

Figura 3.- Macrfagos diferenciados en presencia GM-CSF y M-CSF. Esquema ilustrativo de los

macrfagos generados en presencia de GM-CSF (M1 o pro-inflamatorios) o M-CSF (M2 o anti-inflamatorios) y

sus diferencias en la respuesta inmunitaria.

4.1.1.2 Fenotipo y funcin de macrfagos M1 y M2

Adems de diferencias en la produccin de citoquinas en respuesta a LPS o Mycobacterium,

los macrfagos generados en presencia de GM-CSF (M1) y M-CSF (M2) tienen caractersticas

fenotpicas diferentes (Tabla 1). Los macrfagos M2 presentan una morfologa elongada en forma

de huso, mientras los macrfagos M1 son ms redondeados [19]. Por otro lado, los macrfagos M2

presentan mayor expresin de CD14, M-CSFR y del receptor scavenger CD163, mientras los

macrfagos M1 expresan mayores niveles de HLA-DQ y HLA-DR [19, 56]. Respecto a la expresin

de PRR, ambos tipos de macrfagos expresan niveles similares de TLR2 y TLR4, y la expresin de

DC-SIGN es baja pero significativa en macrfagos M1 y mayor en macrfagos M2 [56].

Desde el punto de vista funcional, ambas poblaciones de macrfagos tambin se comportan de

forma diferente (Tabla 1). Los macrfagos M2 presentan mayor capacidad de fagocitosis mediada

por receptores de Fc [61], mayor actividad fungicida debida a la produccin de ROS [62], y mayorproduccin de H2O2 en respuesta a estmulos fagocticos [63]. Por su parte, los macrfagos

generados en presencia de GM-CSF tienen mayor capacidad de presentacin de antgeno que los

macrfagos M2 [56]. Aunque ambos tipos de macrfagos son diana para la infeccin inicial por HIV-

1, convirtindose en reservorios virales, los macrfagos M2 tienen mayor capacidad de produccin

de partculas virales, mientras que los macrfagos M1 inhiben la replicacin viral a nivel post-

transcripcional [64].

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Introduccin

Caractersticas M1 M2

Antgenos de superficie

CD11b ++ ++CD11c ++ ++

CD14 - ++

CD71 + -

CD163 - +

CD209 - +

HLA-DR ++ +

HLA-DQ + -

710F + -

Receptores

FcR I (CD64) + +

FcR II (CD32) + +

FcR III (CD16) - +

Receptor scavenger tipo A + +

M-CSFR (c-fms) + +++

Integrinas v3 v5

Funciones

Fagocitosis mediada por FcR Dbil Fuerte

Produccin de H2O2 Dbil Fuerte

Sensibilidad a H2O2 Resistente Sensible

Actividad catalasa Alta Baja

Susceptibilidad a HIV-1 Resistente SusceptibleSusceptibilidad a M. tuberculosis Susceptible Resistente

Produccin de IL-10 Dbil Fuerte

Tabla 1.- Caractersticas fenotpicas y funcionales de los macrfagos generados in vitroen presencia de

GM-CSF (M1) o M-CSF (M2). [19, 56].

Otra de las diferencias existentes entre los macrfagos generados en presencia de GM-CSF y

M-CSF es la secrecin de quimioquinas. Los macrfagos M2 slo son capaces de producir CCL18

(PARC) tras estimulacin, mientras que los macrfagos M1 secretan niveles constitutivos de CCL22(MDC), CCL17 (TARC) y CCL18, que mantienen al ser estimulados [56]. A pesar de que los

macrfagos M2 producen niveles bajos de citoquinas pro-inflamatorias y altos niveles de IL-10 tras

estimulacin, son capaces de secretar quimioquinas atrayentes de otros tipos celulares (neutrfilos,

monocitos y linfocitos T), lo contribuye a su fenotipo anti-inflamatorio/regulador. En ese sentido,

CXCL8 (IL-8) es producida tanto por macrfagos M1 como M2, mientras que slo los macrfagos

M2 secretan constitutivamente CCL2 (MCP-1). A su vez, ambos tipos de macrfagos son capaces

de secretar CXCL10, CCL3 (MIP-1), CCL4 (MIP-1) y CCL5 (RANTES) tras estimulacin con LPS

[56].

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Introduccin

4.1.2 Tejido-especific idad

La heterogeneidad y plasticidad funcional de los macrfagos se refleja en su especializacin en

las diferentes localizaciones anatmicas [65]. Los macrfagos localizados en tejidos en contacto con

el entorno exterior (pulmn, placenta, mucosas intestinales) se encuentran continuamente expuestos

a patgenos y desafos ambientales. Por ello existen mecanismos de inhibicin temporal de las

funciones de estos macrfagos, lo que evita daos colaterales en el tejido y permite que slo se

generen reacciones pro-inflamatorias cuando son absolutamente requeridas. Los macrfagos

peritoneales y los situados en el intestino son ejemplos de macrfagos que han desarrollado

estrategias para regular a la baja sus funciones efectoras [66].

4.1.2.1 Macrfagos intestinales

Los macrfagos del tracto digestivo se encuentran estratgicamente localizados en la lmina

propia [67], y en tejidos linfoides secundarios asociados al sistema digestivo, como amgdalas y

placas de Peyer [68]. Funcionalmente, los macrfagos intestinales carecen de actividad

presentadora de antgeno y actividad respiratory burst, pero poseen gran capacidad fagoctica y

bactericida [69]. Estasclulas tienen reducida la produccin de citoquinas pro-inflamatorias debido a

la inhibicin de NFB por el TGF liberado por las clulas del estroma [70]. Este estado de falta

parcial de respuesta a estmulos externos ha sido definido como anergia inflamatoria, y explica la

incapacidad de los macrfagos intestinales de mediar en la inflamacin de la mucosa [71]. De

hecho, en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal se han descrito alteraciones en la va de

sealizacin de TGF, lo que hace que un gran porcentaje de macrfagos sean capaces de liberar

citoquinas pro-inflamatorias [72, 73]. En consecuencia, los macrfagos intestinales son un claro

ejemplo de macrfagos anti-inflamatorios in vivo[70].

4.1.2.2 Macrfagos peritoneales

En humanos, la concentracin de M-CSF en el fluido peritoneal es muy elevada y se

correlaciona con el nmero de macrfagos peritoneales [74]. Estudios realizados con macrfagos

aislados de muestras de dilisis peritoneal han mostrado que dichas clulas son fenotpica y

funcionalmente similares a los macrfagos anti-inflamatorios generados in vitro, por cuanto exhiben

alta capacidad de fagocitosis, endocitosis y macropinocitosis, produccin de elevadas cantidades de

IL-10 tras estimulacin, y una disminuida capacidad de estimulacin de clulas T [75].

16

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Introduccin

4.2 Activacin de macrfagos

4.2.1 Activacin clsica vs.activacin alternativa

La variedad de estmulos de activacin/desactivacin de macrfagos [43], combinado con la

heterogeneidad y plasticidad de los macrfagos residentes en tejidos en condiciones homeostticas,

permite la existencia de numerosos estados de activacin de macrfagos [8]. As, el IFN producido

por clulas Th1, T citotxicas CD8+y clulas NK, convierte a los macrfagos en clulas con elevada

capacidad citotxica, microbicida (especialmente de patgenos intracelulares) y anti-proliferativa. La

adquisicin de estas propiedades es debida a la produccin de mediadores txicos (ROS, RNS) y

citoquinas pro-inflamatorias [75]. Este tipo de activacin, denominada clsica (CAM, M1) [76], da

lugar a macrfagos que secretan altos niveles de IL-12 e IL-23 y muy bajos niveles de IL-10 en

respuesta a Mycobacterium[77], y promueven fuertes respuestas inmunitarias Th1 (Figura 4).

Activacin clsica(CAM)

IL-12

IFN

NK

IL-4

Th2

Th1

IL-13

IL-10

Activacin alternativa(AAM) Basfilo

Eosinfilo NK

Figura 4.- Tipos de activacin de macrfagos.Representacin esquemtica de la activacin de macrfagos

mediante estimulacin con IFN(activacin clsica) o citoquinas Th2 como IL-4 e IL-13 (activacin alternativa).

Las funciones inflamatorias y citotxicas de los macrfagos activados contribuyeron a la

percepcin de que slo citoquinas Th1 promovan activacin de macrfagos, mientras que

citoquinas de tipo Th2 las bloqueaban o desactivaban [78]. Sin embargo, adems de inhibir

respuestas Th1, las citoquinas Th2 provocan un aumento de las funciones de los macrfagos como

presentacin de antgeno, reparacin tisular y capacidad endoctica [77]. Por ello, los factores que

inhiben la generacin y actividad de los CAM (citoquinas Th2 como IL-4 e IL-13, citoquinas

desactivadoras como IL-10 y TGF, hormonas como glucocorticoides y la vitamina D3), e incluso las

clulas apoptticas, han sido agrupados como inductores de una forma alternativa de activacin de

macrfagos (AAM, M2) [77] (Figura 4). Los AAMproducen grandes cantidades de IL-10 y TGF

y niveles muy bajos de IL-12 bajo estimulacin [79], y pueden presentar funcionesinmunosupresoras e inhibir la proliferacin de clulas T [80].

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Introduccin

Las diferencias en las funciones de CAM y AAM han sido demostradas en numerosos

ensayos in vitro, donde los AAMinducen mayor proliferacin celular y deposicin de colgeno de

clulas fibroblsticas [81], e inhiben la proliferacin de linfocitos inducida por mitgenos [82]. Al

mismo tiempo, los AAMcontribuyen a la vascularizacin in vivoy exhiben actividad angiognica in

vitro [83], similar a la de MDDC maduras en presencia de citoquinas como IL-10, TGF, o

glucocorticoides [84]. Por otro lado, existen numerosos estudios que ponen de manifiesto que los

AAMactivados con IL-4 son esenciales en la eliminacin y control de la infeccin por patgenos

extracelulares [77].

Aunque el trmino AAM fue inicialmente propuesto para identificar exclusivamente a

macrfagos activados por IL-4/IL-13 [85], la variedad de estmulos anti-inflamatorios que provocan

una activacin no clsica de macrfagos ha hecho necesario establecer una nomenclatura ms

precisa. Mantovani y colaboradores han clasificado estas formas de activacin alternativa deacuerdo con el estmulo inductor: los macrfagos estimulados por las citoquinas Th2 IL-4/IL-13 son

denominados M2a, los activados por complejos inmunes y ligandos de TLR son denominados M2b,

y los macrfagos activados en presencia de IL-10 son denominados M2c [86] (Figura 5, izquierda).

Recientemente se ha propuesto otra clasificacin de macrfagos activados de acuerdo con sus

funciones en el mantenimiento de la homeostasis: macrfagos involucrados en la defensa del

organismo, en reparacin de heridas y en regulacin inmunitaria. Sin embargo, es preciso enfatizar

que adems de estos tres grupos es posible definir numerosos estados funcionales intermedios, lo

que avala la existencia de un amplio rango de estados de activacin de macrfagos [87] (Figura 5,

derecha).

M1

M2b

M2a

M2c

INF IL-4

IL-13

LPS

Inmuno-complejos

IL-10

TGF

Defensa

Reparacinde heridasReguladores

Figura 5.- Propuestas de clasificacin de macrfagos activados. Los macrfagos polarizados se pueden

clasificar en funcin del estmulo de activacin (izquierda) [86] o de su funcin efectora primordial (derecha)

[87]. Los tres colores primarios (rojo, amarillo, azul) representan las tres poblaciones de macrfagos definidas,

mientras que los colores secundarios representan macrfagos con funciones intermedias.

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Introduccin

La expresin de genes que controlan el metabolismo celular tambin se utiliza para discernir

entre los diferentes tipos de macrfagos activados. As, la expresin de genes que participan en el

metabolismo de la arginina, permite diferenciar CAM y AAM en ratn, pero no en macrfagos

humanos [96, 97]. La arginasa 1 (Arg1) es un marcador prototpico de activacin alternativa, ya que

su expresin es dependiente de IL-4/IL-13, mientras que la xido ntrico sintasa (iNOS) es inducida

por IFN. Los CAM metabolizan arginina va iNOS, generando xido ntrico, que posee elevada

actividad microbicida. Por el contrario, la expresin de Arg1 permite a los AAM producir poliaminas

y prolina, que son esenciales para la proliferacin celular y la produccin de colgeno,

respectivamente [98]. Otros marcadores de AAM en ratn, y que carecen de homlogos en

humanos, son los miembros de la familia quitinasa Ym1 y Ym2 (Chi3l3 y Chi3l4), y Fizz1,

involucrado en el metabolismo de lpidos [99].

Por otro lado, la polarizacin del macrfago hacia un fenotipo alternativo lleva asociada unaumento en la expresin de genes relacionados con el metabolismo de lpidos, especialmente de

aquellos implicados en la captacin y oxidacin de cidos grasos [100]. As, adems de Fizz1, Stab-

1 y la lipoxigenasa ALOX15 presentan mayor expresin en AAM [77, 93]. A diferencia de AAM,

los CAM sobre-expresan genes involucrados en el metabolismo del colesterol como ABCA1 y

apolipoprotenas L (APOL1-3,6), involucrados en su transporte y en el desarrollo de aterosclerosis

[93, 101]. A su vez, genes que codifican para las enzimas implicadas en el metabolismo de

mediadores lipdicos (eicosanoides, leucotrienos, esfingosina y ceramida) tambin se expresan

diferencialmente entre CAM y AAM. Ms concretamente, la expresin de COX-2 est asociada

con el metabolismo de cido araquidnico en CAM, mientras que las enzimas esfingosina y

ceramida quinasas, que catalizan el equilibrio ceramida-esfingosina, estn ms expresadas en

CAM y AAM, respectivamente [93].

El receptor PPAR, y alguno de sus genes diana (FABP4), tambin se incluyen dentro de los

genes con mayor expresin en AAM, ya que IL-4 es un inductor de este receptor y de sus

activadores metablicos [102]. Los ratones deficientes en PPARtienen disminuidos los niveles de

mRNA y la actividad de Arg1, no presentan macrfagos con fenotipo alternativo y, dado su papel en

el metabolismo de cidos grasos, tienen mayor tendencia a la obesidad [103]. Adems, se hadescrito a PPARcomo regulador negativo de la activacin clsica del macrfago [104]. Por tanto,

PPAR regula las respuestas dependientes de IL-4, y es requerido para la adquisicin y

mantenimiento del fenotipo alternativo en macrfagos activados [103].

Mientras que PPAR es un factor crtico para la activacin alternativa inducida por IL-4, la

activacin de los factores de transcripcin NFB, STAT-1 y AP-1 son esenciales para la polarizacin

clsica del macrfago [105]. Estmulos inflamatorios como LPS, activan rutas de sealizacin

dependientes de MyD88, que llevan a la activacin de NFB y AP-1, y rutas independientes de esteadaptador intracelular, con la activacin de IRF3 y STAT-1 [106].Por el contrario, la IL-10 liberada

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Introduccin

por algunos AAMinhibe la activacin de NFB y mantiene su fenotipo inmunosupresor [107-109].

De hecho, la prdida de expresin de IRF3, STAT-1 y NFB en macrfagos derivados de mdula

sea de ratn est asociada a la supresin de la polarizacin pro-inflamatoria [110].

4.2.3 Macrfagos asociados a tumores

Los macrfagos asociados a tumores (TAM) constituyen un ejemplo paradigmtico de la

plasticidad del proceso de activacin de macrfagos y de su repercusin fisiolgica y patolgica. En

los tumores existe una gran infiltracin de leucocitos inflamatorios [111], cuyo estado de maduracin

y localizacin espacial determina su influencia sobre el tumor. Los macrfagos son el componente

mayoritario de dicho infiltrado tumoral [112], y constituyen un claro ejemplo de activacin alternativa

patolgica de macrfagos.

Los TAM se originan a partir de monocitos de sangre perifrica reclutados hacia el tumor, en su

fase inicial de formacin, por factores como M-CSF, MCP-1, VEGF y Angiopoietina-2 [113-117]

(Figura 7). La diferenciacin intratumoral da lugar a macrfagos con niveles reducidos de receptores

de quimioquinas, lo que evita su migracin desde los tejidos tumorales. Los TAM regulan varios

pasos clave en el desarrollo del tumor, y su abundancia se correlaciona con la progresin tumoral,

remodelacin de matriz extracelular, estimulacin de la proliferacin, migracin e invasin de las

clulas cancerosas, e inhibicin de la inmunidad adaptativa (inmunosupresin) [117]. La elevada

densidad de macrfagos en zonas metastticas, como los ndulos linfoides regionales, favorece el

crecimiento del tumor [113].

Anergia, supresin, respuesta Th2

TAM Clula tumoral

IL-10, TGF

Factores de crecimiento

Reclutamiento/supervivencia

M-CSF, VEGF, MCP-1

VEGF, FGF, TGFQuimioquinas

IL-10, TGF

Angiognesis yremodelacin de matriz

MMP-9, uPA

Figura 7.- Interaccin entre macrfagos y clulas tumorales. Las clulas tumorales secretan factores que

atraen y determinan la polarizacin de los macrfagos en los tumores. A su vez, los TAM producen factores de

crecimiento que promueven angiognesis y remodelacin del tejido, y contribuyen a la progresin ydiseminacin del tumor [118].

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Introduccin

El fenotipo y funcin de los TAM est determinado por los factores microambientales presentes

en el tumor [118, 119] (Figura 7). Citoquinas y factores de crecimiento derivadas del tumor (IL-10,

TGF, M-CSF, VEGF, MCP-1) aumentan la generacin de macrfagos y reducen la diferenciacin

de DC y, en consecuencia, determinan los niveles relativos de APC en el tumor y en los tejidoscercanos [21]. Junto con TGF, M-CSF es el mayor responsable del ambiente inmunosupresor

intratumoral [111]. De hecho, en un modelo de carcinoma mamario espontneo, los ratones M-CSF-/-

presentan una progresin tumoral ms lenta que los ratones normales [120]. La IL-10 presente en el

tumor induce en los TAM la adquisicin de funciones asociadas a macrfagos M2 [121]. Por ello, los

TAM tienen reducida la capacidad de producir molculas anti-tumorales (TNF, IL-1, ROS, NO) y

citoquinas inflamatorias (IL-12, IL-1, TNF, IL-6) [122], y no presentan activacin de NFB [111].

La produccin de mediadores inmunosupresores (prostaglandinas, IL-10 y TGF)permite a los

TAM inducir la diferenciacin de clulas Treg, que suprimen la actividad de los linfocitos T efectores

y de otras clulas inflamatorias [111], favoreciendo por tanto el crecimiento tumoral [123, 124]. La

actividad angiognica del tumor est asimismo favorecida por la acumulacin de TAM en regiones

de hipoxia poco vascularizadas, a las que se adaptan por la activacin de factores como HIF-1 y

HIF-2 [125]. Los TAM tambin promueven angiognesis a travs de la liberacin de factores de

crecimiento (VEGF, FGF y HGF), metalo-proteasas (MMP-9) y el activador de plasmingeno (uPA),

todos los cuales contribuyen a degradar la matriz extracelular, facilitando por tanto la migracin e

invasin de clulas tumorales [126] (Figura 7).

La expresin de marcadores tpicos de macrfagos M2 de ratn como Arg1, Ym1, Fizz1 y Mgl2

se observa en TAM procedentes de fibrosarcoma y de linfoma T BW-Sp3, lo que corrobora el

fenotipo alternativo de estos macrfagos [127, 128]. Sin embargo, en ese mismo modelo se

observan tambin altos niveles de quimioquinas Th1 como CCL5, CXCL9 y CXCL10, lo que sugiere

la desviacin de las caractersticas tpicas de macrfagos M2 [127]. Aunque los TAM son

considerados macrfagos con fenotipo anti-inflamatorio por su secrecin de citoquinas y la deficiente

activacin de NFB, tambin contribuyen a la angiognesis y crecimiento tumoral mediante la

secrecin de mediadores tpicos de macrfagos M1 y reguladores de NFB, como TNF, IL-1 y

MMP-9. Por otro lado, en un estado tumoral avanzado, los TAM de ratn expresan constitutivamente

NOS2 y Arg1 que, implicados en el metabolismo de la arginina, producen liberacin de NO y

aumento en la produccin de ROS (O2- y H2O2) y RNS (ONOO-), deteniendo la proliferacin y,

eventualmente, provocando la muerte de clulas T [116]. En consecuencia, los TAM son capaces de

expresar caractersticas pro-inflamatorias y supresoras, existiendo un equilibrio en su polarizacin

entre un fenotipo M1 y M2. Esta versatilidad en el fenotipo de los TAM es posiblemente debida al

cambio dinmico existente en el microambiente tumoral desde eventos tempranos hasta los estados

avanzados del tumor, y est regulada por mecanismos moleculares, como la modulacin de la

actividad de NFB o las vas de sealizacin activadas por hipoxia [129]. En los casos que la

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Introduccin

presencia de TAM se correlaciona con un buen pronstico del tumor, el GM-CSF podra ser

responsable de la adquisicin de un fenotipo citotxico por los macrfagos intratumorales [130].

4.3 Estudios de expresin gnica en diferenciacin y activacin de

macrfagos

La identificacin de genes diferencialmente expresados en distintas poblaciones de macrfagos

activados permite determinar su papel en la adquisicin de un fenotipo de polarizacin concreto, y

su posible participacin en determinados procesos celulares o fisiolgicos [131-133]. En este

sentido, estudios realizados en macrfagos peritoneales tratados con IL-4 han permitido identificar

marcadores de activacin alternativa de macrfagos en ratn, como Ym1 y Arg1 [134]. La expresin

diferencial de estos genes dependientes de IL-4 se ha corroborado en un modelo de infeccin con el

nematodo Brugia malayi [135]. La identificacin de genes asociados a los diferentes estados de

polarizacin de macrfagos puede proporcionar nuevas dianas teraputicas en patologas

inflamatorias y/o autoinmunes.

Respecto a los estudios realizados en macrfagos humanos polarizados en presencia de

citoquinas, Mantovani y colaboradores han determinado los cambios gnicos inducidos en la

diferenciacin de monocitos CD14+

en presencia de M-CSF, y las diferencias existentes entremacrfagos polarizados por LPS e IFNo IL-4 [93]. Posteriormente, se han identificado genes cuya

expresin se modifica en monocitos expuestos a GM-CSF o GM-CSF e IL-4 [136], o a estmulos

alternativos como IL-13 [101] o IL-10 [137]. Por otro lado, Hamilton y colaboradores han analizado

macrfagos de ratn generados en presencia de GM-CSF (M1) o M-CSF (M2), y han evidenciado la

contribucin de IFN de tipo I en las diferencias fenotpicas de ambas poblaciones [138]. Segn estos

autores, la expresin diferencial de citoquinas y quimioquinas en respuesta a LPS se justifica porque

la sealizacin desde TLR4 se lleva a cabo de forma distinta en ambos tipos de macrfagos, por la

ruta MyD88-independiente (caso de los M2) o MyD88-dependiente (en los M1) [138].

Estos estudios de expresin gnica han permitido identificar marcadores moleculares asociados

a respuestas inmunitarias frente a infecciones bacterianas [139, 140], patologas como la

enfermedad pulmonar obstructiva crnica (EPOC), y el desarrollo de tumores [141, 142]. Por otro

lado, estudios realizados sobre la interaccin macrfago-patgeno han identificado estrategias de

defensa del hospedador y de evasin por parte del patgeno [143]. En consecuencia, todas estas

aproximaciones han hecho posible diseccionar la polarizacin de macrfagos frente a estmulos

patognicos concretos, lo que ha permitido establecer que los procesos de activacin/polarizacin

de macrfagos y de maduracin de MDDC son especficos del estmulo que los provoca [140, 141,

144].

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Introduccin

5. El receptor de patgenos DC-SIGN

Las lectinas son protenas que reconocen de manera especfica carbohidratos presentes en

antgenos propios y patgenos [145]. En vertebrados, las lectinas se clasifican en diferentessubgrupos, siendo los receptores lectina de tipo C (CLR) uno de los mejor estudiados. Los CLR se

caracterizan por tener al menos un dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) a travs del

cual unen carbohidratos de forma dependiente de Ca2+ [146]. Los CLR pueden ser protenas

solubles o protenas transmembrana, y se han definido siete sub-grupos en funcin de su homologa

de secuencia, estructura y disposicin del CRD respecto al resto de la molcula [147] (Tabla 2). Los

grupos I, III y VII engloban lectinas solubles, mientras que el resto de grupos corresponden a

lectinas de membrana, que a su vez pueden ser protenas de tipo I, como el receptor de manosa

(MR), o de tipo II, como DC-SIGN [148].

Grupo Molculas representativas Caractersticas

I Agrecano, versicano, neurocanoProteoglicanos, glicoprotenas de matriz

extracelular

IIReceptor de asialoglicoprotena, CD23,

DC-SIGN, LSECtinReceptores de membrana tipo II

III Protena de unin a manosa, SP-A, SP-DColectinas. Oligmeros asociados por un dominio

tipo colgeno. Extracelulares y solubles

IV Selectinas L, P y E Glicoprotenas de membrana de tipo I, implicadasen adhesin leucocitaria

V NKG2, LY49, CD69 Antgenos linfocitarios de tipo II

VI Receptor de manosa, DEC-205Receptores de membrana de tipo I con varios

CRD extracelulares

VIIProtena asociada a

pancreatitis/hepatomaExtracelulares y solubles

Tabla 2.- Clasifi cacin de las lectinas de tipo C.

DC-SIGN (Dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin, CD209, CLEC4L) fue descrito

en 1992 por Curtis y colaboradores como una lectina de tipo C que reconoce la protena gp120 de la

envuelta del HIV-1 [149]. Posteriormente se caracteriz como un receptor presente en MDDC que

participa en la interaccin DC-clula T mediante el reconocimiento de la molcula de adhesin

intracelular ICAM-3 [150]. En la actualidad y, como se ha mencionado anteriormente, DC-SIGN

constituye un marcador de macrfagos anti-inflamatorios M2 y AAM [56, 151].

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Introduccin

5.1 Expresin y localizacin tisular

Aunque descrita como especfica de clulas dendrticas, DC-SIGN no slo se expresa in vivoen

DC de tejidos perifricos y linfoides [152], sino que tambin se expresa en poblaciones CD14+

desangre perifrica [153] y en determinadas subpoblaciones de macrfagos presentes en sinusoides

medulares de ndulos linfticos [151], intestino [154], pulmn [152], placenta [152, 155, 156] y

macrfagos sinoviales [157]. La expresin de DC-SIGN se induce in vitropor IL-4 en monocitos [92,

150], en macrfagos [91, 158] y en la lnea celular mieloide THP-1 [91], y sus niveles de expresin

son controlados por el factor de transcripcin PU.1 [159]. Estudios de localizacin subcelular han

situado a DC-SIGN en lipid rafts, microdominios de membrana ricos en colesterol y esfingolpidos,

lo que puede favorecer a su capacidad de unin e internalizacin de partculas vricas, as como a

su capacidad sealizadora tras el reconocimiento de ligandos [160, 161].

5.2 Estructura y dominios funcionales

Estructuralmente, DC-SIGN es una protena transmembrana tipo II de 404 aminocidos, cuya

regin extracelular incluye un CRD, un cuello o stalk que le separa de la zona transmembrana, y

con una corta regin citoplsmica de 42 aminocidos [162] (Figura 8).

DOMINIOFUNCINESTRUCTURAL

Figura 8.- Estructura y funcin de los dominios de DC-SIGN.Ct, extremo carboxilo-terminal; Nt, extremo

amino-terminal; NLT, motivo de glicosilacin; EEE, dominio triacdico; LL, motivo dileucina; Y, tirosina del motivo

YKSL.

Y

LLEEE

Y

LLEEE

Y

LLEEE

Nt

NLT

NLT

NLT

Ct

Dominio Interaccinlectina con ligandos

CuelloMultimerizacin(dominios

repetidos)

Internalizacin,Dominiotrfico ycitoplsmico

sealizacin

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Introduccin

El CRD de DC-SIGN es una estructura globular que consta de 12 cadenas , 2 hlices y 3

puentes disulfuro, adems de 2 sitios de unin a Ca2+[162] . Uno de esos sitios es esencial para la

conformacin del CRD, mientras que el otro participa en la interaccin con los ligandos

carbohidratados y determina su especificidad. La secuencia de aminocidos de este segundo sitiocontiene un motivo EPN que confiere a DC-SIGN especificidad por manosa. El cuello de DC-SIGN

est compuesto por 8 dominios repetidos de 23 aminocidos ricos en leucinas, el primero de los

cuales contiene un motivo de glicosilacin (NLT) (Figura 8) [163]. Esta regin es fundamental para

la formacin de estructuras multimricas, ms concretamente tetrmeros, lo que incrementa

considerablemente la avidez de interaccin de DC-SIGN por sus ligandos [164-166]. La regin

transmembrana comprende desde Leu43 a Ser61 [163]. La zona amino-terminal constituye la cola

citoplsmica, que posee un motivo dileucina (LL) que promueve la rpida internalizacin de DC-

SIGN tras interaccionar con ligandos solubles, un motivo triacdico (EEE), que determina que los

complejos DC-SIGN-ligando sean dirigidos a compartimentos lisosomales [163, 167], y un motivobasado en tirosina (ITIM-like), que capacita a esta lectina para transmitir seales intracelulares [161]

(Figura 8).

5.3 Estructura gnica, isoformas y polimor fismos

El gen de DC-SIGN mapea en la regin p13 del cromosoma 19, y consta de 7 exones [168](Figura 9). Los exones 1a y 1c codifican la cola citoplsmica, el exn 3 codifica la regin del cuello,

y los exones 4, 5 y 6 codifican el CRD [163]. En ratn no existe un gen ortlogo de DC-SIGN

humano, aunque existen molculas homlogas dentro de la familia SIGN: mDC-SIGN (murineDC-

SIGN) o SIGNR5, SIGNR1 (SIGN related), SIGNR2, SIGNR3, SIGNR4, el pseudogen SIGNR6,

SIGNR7 y SIGNR8 [169, 170].

El gen de DC-SIGN est sometido a un complejo sistema de splicingalternativo, que origina

un gran nmero de transcritos con estructuras diferentes de la prototpica [168]. Entre estas

variantes se incluyen isoformas con una cola citoplsmica alternativa, isoformas sin regintransmembrana e isoformas con CRD incompletos, as como una gran variedad de transcritos con

un nmero variable de repeticiones en la regin del cuello. El patrn de isoformas y los niveles de

expresin de cada una de ellas es variable, tanto en individuos de una poblacin como en los

distintos estadios de diferenciacin de un mismo tipo celular [168].

26

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Introduccin

Figura 9.- Estructura gnica de DC-SIGN.En el esquema se representan los exones que codifican para cada

una de las regiones que forman DC-SIGN (nmeros romanos) y su tamao (nmeros arbigos), as como la

localizacin y tamao de los intrones (nmeros romanos y arbigos en gris).

La variabilidad estructural del gen de DC-SIGN a nivel poblacional puede tener importantes

repercusiones patolgicas, ya que se han descrito polimorfismos en la regin codificante y

reguladora que se asocian con susceptibilidad alterada a infecciones como tuberculosis o HIV-1

[171, 172]. Existen discrepancias entre el posible papel protector de las variantes gnicas de DC-

SIGN, que pueden ser debidas a las diferentes poblaciones estudiadas, e incluso a la existencia de

otros polimorfismos. La mayora de estos estudios se han centrado en un cambio en el nucletido

-336 (variante G o A) en la regin promotora de esta lectina, que afecta al sitio de unin del factor de

transcripcin Sp1 [173]. Martin y colaboradores asocian la presencia de la variante DC-SIGN-336G

con una mayor susceptibilidad a la infeccin por HIV-1 por va parenteral pero no por va mucosa[174], mientras que otros autores encuentra asociacin nicamente entre la variante DC-SIGN-139C

y una progresin acelerada del SIDA en individuos hemoflicos japoneses infectados por HIV-1

[175].

Respecto a la infeccin por M. tuberculosis, las variantes DC-SIGN-336A y -871G se asocian a

una proteccin frente a la infeccin en una poblacin en el sur de frica [176], mientras que en la

poblacin sub-Sahariana el alelo -336G est asociado a una mayor proteccin [177]. Sin embargo,

otros trabajos posteriores en pacientes colombianos [178], tunecinos [179] y africanos [180], no han

observado asociacin entre los polimorfismos en la posicin DC-SIGN-336 y la susceptibilidad atuberculosis. Recientemente se ha analizado la frecuencia de la variante DC-SIGN-336G en

individuos de India infectados con HIV-1 y/o tuberculosis. Al ser menos frecuente en individuos

infectados por HIV-1, se especula que la presencia de esta variante protege frente a la infeccin por

HIV-1 y, sin embargo, aumenta la susceptibilidad a tuberculosis [181].

La presencia de polimorfismos en la regin promotora de DC-SIGN tambin se ha asociado con

susceptibilidad alterada frente a otras infecciones y patologas. De hecho, la variante DC-SIGN-

336G est asociada con mayor proteccin frente a la fiebre del Dengue, pero no frente a la fiebre

hemorrgica del Dengue en individuos de Tailandia [182]. Por otro lado, no se ha encontrado

+ 46 206 981 1052 1994 2420 2571 3293 3405 42721425 4470

(425)(774)(100) (372) (721) (866)

Ia Ic II III IV V VIIb I II III IV V

1 2 3 4 5 6 7 8

27

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33/146

Introduccin

asociacin entre la variante DC-SIGN-336A/G y la susceptibilidad a la enfermedad celiaca, aunque

la variante DC-SIGN-336G s est asociada a dicha enfermedad dentro del grupo de pacientes HLA-

DQ2(-) [183]. La enorme variabilidad en el gen de DC-SIGN se puso de manifiesto en un estudio que

analiz la presencia de variantes en las posiciones -336, -332, -201 y -139 en cuatro grupos tnicos

de Brasil, y su posible correlacin con la infeccin por HTLV-1 [184]. Segn este estudio, las

variantes -336A y -139A son ms comunes en individuos asiticos, y la variante -201T no se

observa en caucsicos, asiticos ni amerindios. Por otro lado, la variante -336A es ms frecuente en

pacientes infectados por HTLV-1 y el alelo -139A est asociado con la proteccin frente a la

infeccin por este virus.

De todos estos estudios se concluye que DC-SIGN puede contribuir a la

susceptibilidad/transmisibilidad de las infecciones provocadas por numerosos patgenos. Adems

de estas variantes en la regin reguladora, existen polimorfismos en la regin codificante que selocalizan principalmente en el exn 3 que codifica el cuello de DC-SIGN. De ellos y de las

discrepancias sobre su posible asociacin con susceptibilidad a infecciones en diferentes grupos

tnicos, se profundizar en el apartado de Discusin.

5.4 Funcin y sealizacin

DC-SIGN es, probablemente, la lectina con el mayor rango de ligandos descrito, siendo capaz

de actuar como receptor de adhesin celular y de reconocer estructuras de carbohidratos presentes

en antgenos propios y en patgenos (Tabla 3). DC-SIGN presenta una alta afinidad por

carbohidratos con dimanosas terminales y estructuras internas de manosas ramificadas

(manotriosas 13, 16) [185, 186], y por carbohidratos que contienen fucosa, en concreto por

los trisacridos que constituyen los antgenos de los grupos sanguneos de Lewis (Le x, Ley, Lea, Leb)

[187-189].

Como receptor de patgenos, DC-SIGN interacciona con sus PAMP y el complejo DC-SIGN-patgeno se internaliza, promoviendo el procesamiento y la posterior presentacin de antgenos a

los linfocitos T, para acabar induciendo respuestas inmunitarias frente a dichos microorganismos

[167, 190]. Dentro del amplio rango de patgenos reconocidos por DC-SIGN [191], se encuentran

bacterias [192-194], hongos [195, 196], parsitos [197] y virus [149, 198, 199]. Recientemente

incluso se ha descrito la interaccin de DC-SIGN con alrgenos comunes [200] (Tabla 3).

28

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Introduccin

Patgeno Ligando de DC-SIGN

Virus HIV-1 gp120

CMV gB

bola GP de la envuelta

Margburg GP de la envuelta

Dengue gE

HCV gE1/gE2

SARS protena S

Herpesvirushumano ?

H5N1 (cepa del virus de la gripe aviar) ?

Bacterias cepas patognicas deMycobacterium ManLAM

Helicobacter pilori LPS

Klebsiella pneumonia LPS

Neisseria meningitidis LPS

Neisseria gonorrhoeae LPS

Lactobacillus acidophilusNCFM SlpA

Parsitos Leishmania LPG?

Schistosoma mansoni SEA

Hongos Candida albicans ?

Aspergillus fumigatus GalactomananoTabla 3.- Patgenos y ligandos que se unen a DC-SIGN. HIV: virus de la inmunodeficiencia humana; CMV:

citomegalovirus; HCV: virus de la hepatitis C; SARS: sndrome respiratorio agudo severo; gB, gE, gE1, gE2:

glicoprotenas B, E, E1, E2; GP: glicoprotena; LPG: lipofosfoglicano; LPS: lipopolisacrido; ManLAM:

lipoarabinomanano recubierto de manosas; SEA: antgeno soluble de los huevos; SlpA: protena A de la capa

superficial; Lex: Lewisx; Ley: Lewisy.

Por su capacidad de reconocer ligandos endgenos, DC-SIGN tambin puede mediar procesos

de adhesin intercelular (Figura 10). As, DC-SIGN podra intervenir en la migracin transendotelial

de DC gracias a la interaccin con ICAM-2 presente en clulas endoteliales [153]. La unin de DC aneutrfilos tiene lugar a travs del reconocimiento por DC-SIGN de los carbohidratos ricos en Lexde

la integrina Mac-1 (CD11b/CD18) [201, 202] y de CEACAM-1 [202-204]. DC-SIGN tambin reconoce

el antgeno carcinoembrionario (CEA) de clulas de cncer colorrectal, caracterizadopor una mayor

presencia de Lexy Ley[191]. Otro de los ligandos endgenos propuestos para DC-SIGN es ICAM-3.

Aunque en un principio se propuso que la adhesin inicial entre DC y linfocitos T vrgenes estaba

mediada por la interaccin DC-SIGN/ICAM-3 [150], esta hiptesis no ha podido ser corroborada por

otros autores [151, 205, 206].

29

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Introduccin

30

Clula endotelial

ICAM-2

ICAM-3

CE

Figura 10.- Ligandos endgenos de DC-SIGN. Representacin esquemtica de las interacciones de DC-

SIGN con sus ligandos endgenos: ICAM-2 de clulas endoteliales, ICAM-3 de clulas T, CEA de clulas

tumorales, y las molculas CEACAM-1 y Mac-1 en neutrfilos.

Como se ha comentado anteriormente, DC-SIGN es capaz de transmitir seales intracelulares

especficas tras su interaccin con carbohidratos presentes en patgenos, seales que a su vez se

interrelacionan con las seales procedentes de TLR [160]. En funcin de la naturaleza del

carbohidrato reconocido por DC-SIGN, las MDDC secretan un patrn diferente de citoquinas [207].

As, la unin de patgenos que expresan manosas en su superficie, como M. tuberculosiso HIV-1,

conduce a un aumento en la produccin de IL-10, IL12 e IL-6 de forma dependiente de Raf-1 [207].

Sin embargo, la unin de ligandos que contienen fucosa, como Ley de H. pilori, disminuye la

secrecin de IL-12 e IL-6 de manera dependiente de Raf-1 mientras que se incrementa la

produccin de IL-10 de forma independiente de Raf-1. El mecanismo molecular responsable del

aumento en la produccin de IL-10 de forma Raf-1-dependiente implica la posterior acetilacin de

p65 de NFB, que conlleva a un incremento en la actividad transcripcional de IL-10 [208]. Por otrolado, la activacin de ERK en la ruta de sealizacin de DC-SIGN parece ser dependiente del

ligando involucrado. As, la activacin de DC-SIGN con anticuerpos especficos frente al CRD, la

unin de gp120 de HIV-1, o la unin del alergeno Ara h1, induce fosforilacin de ERK1/2 [160, 209,

210]. Sin embargo, otros estudios han demostrado que la unin de ligandos patognicos a DC-

SIGN, como ManLAM de M. tuberculosis o la protena Salp15 de Ixodes scapularis, no provoca

activacin de ERK [208, 211]. En consecuencia, DC-SIGN es considerado un modulador de la

respuesta inmune al ser capaz de alterar el balance Th1/Th2 y de modificar las seales procedentes

de otros PRR como TLR4 [212].

A

Clula tumoral

Clula T

Mac-1

CEACAM-1

Neutrfilo

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Objetivos

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Objetivos

El objetivo general de esta Tesis Doctoral consis ti en la identificacin y caracterizacin

de marcadores de macrfagos activados con un fenotipo anti-inflamatorio/alternativo, y en

concreto el estudio de dos esos marcadores, el receptor de folato (FR) y DC-SIGN:

1. Anlisis de la expresin del FR en macrfagos anti-inflamatorios M2 y macrfagos

asociados a tumores.

2. Bsqueda de factores que regulan la expresin y funcin del FRen macrfagos M2.

3. Caracterizacin estructural y funcional de isoformas y polimorfismos de DC-SIGN en clulas

dendrticas derivadas de monocitos.

4. Identificacin de eptopos estructurales y funcionales en la molcula de DC-SIGN mediante el

empleo de anticuerpos monoclonales.

33

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Resultados

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Resultados

Esta Tesis Doctoral se presenta en formato de artculos publicados. La seccin de

resultados incluye los artculos que dan respuesta a los objetivos planteados:

1. Los resultados del anlisis de la expresin del FR en macrfagos anti-inflamatorios y

macrfagos asociados a tumores se presentan en el siguiente artculo:

Sierra-Filardi E, et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages

and const itutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages.Cancer Res,

2009 Dec 15;69(24):9395-403.

2. Los resultados obtenidos de la bsqueda de factores que regulan la expresin y funcin del

FRen macrfagos M2 se recogen en el siguiente artculo:

Sierra-Filardi E, et al.Activin prevents the acquisi tion of M2/anti-inf lammatory markers and

skews the macrophage cytokine profile.Manuscrito en preparacin.

3. Los resultados generados tras la caracterizacin de isoformas y polimorfismos de DC-SIGN

se publicaron en el artculo:

Sierra-Filardi E, et al. Structural requirements for mult imerization of the pathogen receptor

DC-SIGN (CD209) on the cell surface.J Biol Chem, 2008 Feb 15;283(7):3889-903.

4. Los resultados obtenidos tras el anlisis estructural de la molcula de DC-SIGN se recogen

en el siguiente artculo:

Sierra-Filardi E, et al. Epitope mapping on the dendritic cell-specific ICAM3-grabbing non-

integrin (DC-SIGN) pathogen-attachment factor. Mol Immunol,2010 Jan;47(4):840-848.

37

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Resultados

1. El receptor de folato se expresa en macrfagos asociados a tumores y

const ituye un marcador de macrfagos anti-inflamatorios/reguladores M2

La activacin de macrfagos comprende un amplio espectro de estados funcionales

dependientes del microambiente de citoquinas. Los macrfagos activados se han agrupado

funcionalmente segn su respuesta a estmulos pro-Th1/pro-inflamatorios (LPS, IFN, GM-CSF) (M1)

o pro-Th2/anti-inflamatorios (IL-4, IL-10, M-CSF) (M2). En el presente manuscrito demostramos que

el receptor de folato (FR), codificado por el gene FOLR2, es un marcador de macrfagos

generados en presencia de M-CSF (M2), pero no de GM-CSF (M1), y que su expresin se

correlaciona con un aumento de la captacin de folato. La capacidad de captar folato por los

macrfagos es promovida por M-CSF, mantenida por IL-4, prevenida por GM-CSF y reducida por

IFN, lo que indica una relacin entre la expresin del FRy la polarizacin M2. De acuerdo con los

datos in vitro, la expresin del FR se detecta en macrfagos asociados a tumores (TAM), que

exhiben un perfil funcional de tipo M2 y ejercen potentes funciones inmunosupresoras dentro del

ambiente tumoral. El FRse expresa y media la captacin de folato por TAM CD163+CD14

+IL-10

+,

y su expresin es inducida de una manera dependiente de M-CSF por lquido asctico tumoral y por

el medio condicionado de fibroblastos y lneas tumorales. Estos resultados definen al FRcomo un

marcador de la polarizacin M2 de macrfagos, e indican que los conjugados de folato con drogas

teraputicas son una potente herramienta en inmunoterapia frente a los TAM.

39

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Immunology

Folate Receptor Is Expressed by Tumor-Associated Macrophages

and Constitutes a Marker for M2 Anti-inflammatory/

Regulatory Macrophages

Amaya Puig-Krger,1,2 Elena Sierra-Filardi,1 Angeles Domnguez-Soto,1 Rafael Samaniego,3

Mara Teresa Corcuera,4 Fernando Gmez-Aguado,4 Manohar Ratnam,5

Paloma Snchez-Mateos,2 and Angel L. Corb1

1Centro de Investigaciones Biolgicas, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas; 2Unidad de Inmuno-Oncologa and 3Unidad deMicroscopa Confocal, Hospital General Universitario Gregorio Maran; 4Servicio de Anatoma Patolgica, Hospital Carlos III, Madrid,Spain; and 5University of Toledo College of Medicine, Toledo, Ohio

Abstract

Macrophage activation comprises a continuum of functionalstates critically determined by cytokine microenvironment.

Act ivate d macro pha ge s hav e been funct ional ly gro upe d

according to their response to pro-Th1/proinflammatorystimuli [lipopolysaccharide, IFN, granulocyte macrophage

colony-stimulating factor (GM-CSF); M1] or pro-Th2/anti-inflammatory stimuli [interleukin (IL)-4, IL-10, M-CSF; M2].

We report that folate receptor (FR), encoded by the FOLR2gene, is a marker for macrophages generated in the presence

of M-CSF (M2), but not GM-CSF (M1), and whose expression

correlates with increased folate uptake ability. The acquisitionof folate uptake ability by macrophages is promoted by M-CSF,

maintained by IL-4, prevented by GM-CSF, and reduced by

IFN, indicating a link between FRexpression and M2 polar-

ization. In agreement with in vitro data, FR expression isdetected in tumor-associated macrophages (TAM), which

exhibit an M2-like functional profile and exert potent immuno-

suppressive functions within the tumor environment. FR isexpressed, and mediates folate uptake, by CD163+ CD68+ CD14+

IL-10producing TAM, and its expression is induced by tumor-

derived ascitic fluid and conditioned medium from fibroblastsand tumor cell lines in an M-CSFdependent manner. These

results establish FR as a marker for M2 regulatory macro-

phage pol arizati on and indi cate that fol ate conjugates of

therapeutic drugs are a potential immunotherapy tool totarget TAM.[Cancer Res 2009;69(24):9395403]

Introduction

Macrophages exhibit a continuum of functional activation

states under homeostatic and pathologic conditions (1, 2). De-

pending on the stimulus, activated macrophages acquire micro-

bicidal, pro-inflammatory, and antitumor activities, but might

also contribute to tissue repair, resolution of inflammation,and tumor cell growth and metastasis (1). These two extremes

of the spectrum of macrophage activation have been coined as

classic/M1 and alternative/M2 (3) and play opposing roles

during immune and inflammatory responses. Although granulo-

cyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and M-CSFcontribute to macrophage differentiation, each cytokine promotes

the acquisition of distinct pathogen susceptibility (4) and inflamma-

tory functions (58). GM-CSFderived macrophages (M1) are proin-

flammatory and potentiate Th1 responses, whereas M-CSFdrivenmacrophages (M2) secrete IL-10 in response to pathogens and do

not activate Th1 responses (8).

Tumor-associated macrophages (TAM) are abundant immuno-

suppressive cells recruited into the tumor microenvironment bycytokines such as M-CSF and CCL2 (9). The relevance of M-CSF

and TAM in tumor progression and metastasis is now well estab-

lished (10, 11). TAM represent a unique type of M2-polarizedmacrophages, as they promote angiogenesis, tissue remodeling,

and repair (2, 12). In fact, clinical studies have revealed a correla-

tion between high tumor macrophage content and poor patient

prognosis. Because TAM are potential targets for anticancer ther-apy (13, 14), identification of TAM-specific markers constitutes a

very active area of research.The folate receptor gene family includes four members (FRor

FOLR1, FR orFOLR2, FR orFOLR3, and FR orFOLR4), whose en-

coded products bind folic acid with high affinity (15). FOLR1 and

FOLR2encode glycosyl phosphatidylinositolanchored endocytic re-

ceptors expressed in certain epithelial tissues and various tumors(FOLR1; refs. 16, 17) or in normal myeloid cells and acute myeloge-

nous leukemias (FOLR2; refs. 1820). Within the myeloid lineage, fo-

late receptor (FR) is expressed in a nonfunctional state in CD34+

bone marrow cells (21, 22) and neutrophils (18), whereas it mediates

folate binding in activated synovial macrophages from rheumatoid

arthritis (23) and in ovarian cancerassociated murine macrophages(24). The high affinity of FR and FR for folate binding, their endo-

cytic capacity, and their restricted expression have prompted the

evaluation of the potential therapeutic value of folate-drug conju-gates in cancer and inflammatory pathologies (25, 26).

In the present article, we describe that functional FRis specif-

ically expressed by M-CSFpolarized (M2) macrophages as well as

byex vivoisolated TAM, and that tumors induce its expression in anM-CSFdependent manner, thus supporting folate-drug conjugates

as valuable tools to target TAM in tumor immunotherapy protocols.

Materials and Methods

Cell culture and treatments. Human monocytes were purified by mag-

netic cell sorting using CD14 microbeads (Miltenyi Biotech) as described (27).

Note:Supplementary data for this article are available at Cancer Research Online(http://cancerres.aacrjournals.org/).

A. Puig-Krger and E. Sierra-Filardi are co-first authors. P. Snchez-Mateos andA.L. Corb contributed equally to this wo rk. The order of authors should be consideredarbitrary.

Requests for reprints: Amaya Puig-Krger, Laboratorio de Inmuno-Oncologa,Hospital General Universitario Gregorio Maran, Doctor Esquerdo 46, 28007Madrid, Spain. Phone: 34-91-5868750; Fax: 34-91-5868052; E-mail: apuig.hgugm@salud.madrid.org.

2009 American Association for Cancer Research.doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-2050

9395 Cancer Res 2009; 69: (24). December 15, 2009www.aacrjournals.org

41

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M1 or M2 monocyte-derived macrophages were generated in the presence of

GM-CSF (1,000 units/mL, ImmunoTools GmbH) or M-CSF (10 ng/mL),

respectively. When indicated, macrophages were treated for 72 h with IL-6

or IL-10 (50 ng/mL), and anti-M-CSF blocking monoclonal antibody

(Abingdon) was used at 0.5 g/mL. For activation, macrophages were trea-

ted with IL-4 (1,000 units/mL), IL-10 (50 ng/mL), IFN (500 units/mL), or

lipopolysaccharide (LPS; 50 ng/mL; E. coli055:B5, Sigma) for 48 h. Human

tumor cell lines (JAR, JEG-3, NIH-OVCAR-3, and Colo320) were cultured in

DMEM containing 10% FCS. Cultures of tumor-associated fibroblasts were

established from primary melanoma according to standard procedures.

Human TAM were obtained from melanoma and breast adenocarcino-

ma patients after obtaining written informed consent and following Med-

ical Ethics committee procedures (Hospital General Universitario Gregorio

Maran). Histopathologic diagnosis was confirmed for each specimen.TAM were isolated by Ficoll gradient cell separation and subsequent mag-

netic cell sorting using CD14 microbeads. Phenotypic analysis was carried

out by indirect immunofluorescence (28) using rabbit polyclonal antisera

anti-human FR (18). Folate-FITC binding and endocytosis assays were

done as reported (26). Flow cytometry on permeabilized ex vivo isolated

TAM was done using phycoerythrin (PE)-labeled anti-CD68 monoclonal an-

tibody (clone Y1/82A, Biolegend), Alexa Fluor 647labeled anti-CD163

monoclonal antibody (clone RM3/1, Biolegend), and a polyclonal antiserum

against human FR followed by incubation with FITC-labeled goat anti-

rabbit affinity-purified antibody. The presence of Tie2-positive FR-positive

macrophages was evaluated using a PE-labeled anti-Tie2 monoclonal anti-

body (clone 33.1, Biolegend). Isotype-matched monoclonal antibodies (PE-

Control, Alexa 647-Control) and a preimmune rabbit antiserum (29) were

used as negative controls.

Western blot.Western blot was carried out with 10 g of lysates from

crude plasma membranes (30). Protein detection was done with a polyclon-

al antisera against FR (18) or a monoclonal antibody against CD29. For

control purposes, a previously described rabbit pre-immune antiserum was

used (29).

PCR. Total RNA from solid tumor tissue and TAM was extracted

(RNAeasy kit, Qiagen), retrotranscribed, and amplified using standard pro-

cedures. Oligonucleotides specific forFOLR2, MAFB, IL10, ESR1, MAGEA3,

and GAPDHwere as follows: FRBs, 5-AGAAAGACATGGTCTGGAAATG-

GATG-3, and FRBas, 5-GACTGAACTCAGCCAAGGAGCCAGAGTT-3

(21); Maf-Bs, 5-CCCGGCTGGCCCGCGAGAGAC-3 , and Maf-Bas, 5-CTAG-

GAGGCGGCGCTGGCGT-3(31); IL10s, 5

-ATGCCCCAAGCTGAGAACCAA-

GACCCA-3, and IL10as, 5-TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA-3;

ESR1s, 5-TCAGATAATCGACGCCAGG-3, and ESR1as, 5-GGCTCAGCATC-

CAACAAGG-3; MAGEA3s, 5-GAAGCCGGCCCAGGCTCG-3, and MA-

G E A 3 a s , 5 -GGAGTCCTCATAGGATTGGCTCC-3 ; a n d G A P D H s ,

5-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCA-3, and GAPDHas, 5-CGGCCAT-

CACGCCACAGTTTC-3. Amplified fragments (783 bp for FOLR2, 347 bp

for MAFB, 352 bp for IL10, 511 bp for ESR1, 457 bp for GAPDH, and 423

bp for MAGEA3) were resolved by agarose gel electrophoresis. For quanti-

tative reverse transcription-PCR (RT-PCR), oligonucleotides for FOLR1,

FOLR2, FOLR3, JDP2, NRAMP1, and IL10 were designed according to the

Roche software for quantitative real-time PCR, and RNA was amplified us-

ing the Universal Human Probe Roche library (Roche Diagnostics). Assays

Figure 1. FOLR2 mRNA and FR protein expression and function in M1 and M2 macrophages. A, FOLR2, JDP2, SLC11A1, and IL10are differentially expressedin M1 and M2 macrophages, as determined by microarray DNA analysis and quantitative RT-PCR. B, right,FRexpression in cell membrane extracts, as determinedby Western blot using an antihuman FR polyclonal antiserum (18). As a control, CD29 expression levels were determined in parallel. Left,cell surface expressionof FRon M1 and M2 macrophages, determined by flow cytometry using a polyclonal antiserum against human FR (ref. 18;empty histogram). As a control(filled histogram), a previously described rabbit preimmune antiserum (29) was used. C, FR function in M1 and M2 macrophages, as shown by binding (4C) anduptake (37C) of folate-FITC (empty histogram, black line). Transferrin-FITC internalization (empty histogram, gray line) was determined in parallel on both macrophagetypes. Each experiment was done three times, and a representative experiment is shown. D, binding (4C) and internalization (37C) of folate-FITC by M2macrophages, in the absence (empty histograms, black line) or the presence (empty histograms, gray line) of a 100 mol/L excess of folic acid. The experiment wasdone four times, and one of the experiments is shown. Representative confocal sections of M2 macrophages incubated with folate FITC for 1 h at 37C, and theircorresponding differential interference contrast images, are shown. The percentage of marker-positive cells and the mean fluorescence intensity (in parentheses)are indicated in flow cytometry experiments (BD), and filled histograms indicate cell autofluorescence (Cand D).

Cancer Research

9396Cancer Res 2009; 69: (24). December 15, 2009 www.aacrjournals.org

42

8/12/2019 TESIS292690[1]

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were made in triplicates and results normalized according to the expres-

sion levels of 18S RNA and GAPDH. Results were obtained using the CT

method for quantitation and expressed as normalized fold expression.

Confocal microscopy and immunohistochemistry.Human melano-

ma tissues (subcutaneous tissue, lymph node, and lung metastasis) were

obtained from patients with primary and metastatic lesions undergoing

surgical treatment. Thick sections (4m in depth) of cryopreserved tissue

were first blocked for 10 min with 1% human immunoglobulins and then

incubated for 1 h with a rabbit polyclonal antiserum against human FR(18), anti-CD163 or HMB-45 monoclonal antibodies, or isotype-matched

control antibodies. All primary antibodies were used at 1 to 5 g/mL, fol-

lowed by incubation with FITC-labeled antimouse and Texas redlabeled

antirabbit secondary antibodies. Samples were imaged using a confocal

scanning inverted AOBS/SP2 microscope (Leica Microsystems) with a

63 PL-APO NA 1.3 immersion objective. Image processing and colocaliza-

tion analyses (scatter plots) were assessed with the Leica Confocal Software

LCS-15.37. Tissue microarrays (TMAH-MTC-01, RayBiotech) were pro-

cessed according to the manufacturer's recommendations.

Results

FRis expressed in macrophages generated in the presence

of M-CSF.Gene expression profiling on macrophages generated in

the presence of GM-CSF (M1) or M-CSF (M2) resulted in the iden-tification of more than 250 differentially expressed genes (>2-folddifferences,P< 0.05; data not shown). Among them, FOLR2, whichcodes for FR, was preferentially expressed in M2 macrophages(P= 1.3 107; Fig. 1A). The JDP2gene, which encodes an activatorprotein-1 repressor, also showed higher expression in M2 macro-phages (P= 0.02), whereas SLC11A1, which encodes the NRAMP1protein associated with classic macrophage activation, was ex-pressed at higher levels in M1 macrophages (P= 0.029; Fig. 1A).Interestingly, and in agreement with their anti-inflammatory activ-ity, the expression of IL10was considerably higher in M-CSFprimed macrophages (P= 1.2 104). The differential expressionof FOLR2, JDP2, SLC11A1, and IL10 in both types of macrophageswas confirmed by real-time RT-PCR on mRNA from independent

donors (Fig. 1A). Besides, FRexpression was exclusively detected

in membrane lysates and on the cell surface of M2 macrophages

(Fig. 1B), thus validating the transcriptome data.Because FRbinds folic acid and folate conjugates (32), the abil-

ity of FRto mediate folate-FITC uptake by M2 macrophages was

assessed. Whereas both macrophage types endocytosed transferrin-FITC, M-CSFpolarized macrophages displayed folate binding andinternalization ability, and GM-CSFinduced macrophages showed

no folate uptake capacity, in agreement with their lack of FRex-pression (Fig. 1C). Folate binding and uptake by M-CSF macro-pha ges wer e spe cif ic, as both wer e inhibited by a 100 mol/Lexcess of folic acid (Fig. 1D). Moreover, folate conjugates enteredcells by endocytosis because most of the folate-FITC fluorescencecould not be stripped from the cell surface by an acid wash step(Supplementary Fig. S1). Considering that neither FOLR1 nor

FOLR3was expressed by M-CSF macrophages (SupplementaryFig. S2), FOLR2-encoded FR protein must be responsible forthe folate binding ability of M2 macrophages. Kinetic studies re-vealed that FOLR2mRNA and FRprotein are initially detected 48to 72 hours after M-CSF addition, and that their levels dramatical-ly increase at later incubation times (Fig. 2Aand B). Acquisition offolate uptake ability correlated with protein expression at all time

points and showed its highest level at the end of the culture period(Fig. 2C). Therefore, M-CSF promotes the expression of a func-tional FRprotein, which constitutes a marker of M-CSFpolarizedM2 macrophages.

Expression of FR in TAM. TAM are an M2-skewed macro-phage population that exhibits immunosuppressive activity withinthe tumor microenvironment, and whose recruitment and differ-entiation is influenced by M-CSF (9). Given the preferential expres-sion of FR in M-CSFpolarized M2 macrophages, its presencewas evaluated in TAM. Immunohistochemistry revealed that FRis frequently coexpressed with CD163 in TAM from primary andmetastatic melanoma (Figs. 3A and 4A) but is absent from mela-noma HMB-45+ cells (Figs. 3Aand 4A). In fact, FOLR2mRNA couldbe detected in three melanoma samples (Fig. 3B). Ex vivo isolated

CD14+ TAM from the pleural fluid of a metastatic melanoma

Figure 2. Acquisition of FR expressionon monocyte treatment with M-CSF.A, FOLR2mRNA expression levelsalong M-CSFinduced polarization ofmacrophages, as determined byquantitative RT-PCR. Columns, meannormalized fold expression (relative to 18SrRNA levels) from triplicate determinations;bars,SD. B, FR expression along M1and M2 macrophage polarization, asdetermined by Western blot at the indicatedtime points. As a control, CD29expression levels were also determined.C, internalization of folate-FITC duringM-CSFinduced macrophage polarization(empty histograms), as determined by flowcytometry at the indicated time points.Filled histograms, cell autofluorescence.The percentage of marker-positive cellsand the mean fluorescence intensity(in parentheses) are indicated in eachcase.

Folate Receptor Is an M2 Macrophage Marker

9397 Cancer Res 2009; 69: (24). December 15, 2009www.aacrjournals.org

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expressed mRNA for FOLR2, IL10, and the macrophage-specificMAFB (31), whereas they lacked expression of the melanoma-specific marker MAGEA3 mRNA (Fig. 3B, lanes 4) and were de-

voi d of FOLR1 and FOLR3 mRNA (Supplementary Fig. S3).Three-color analysis on isolated melanoma TAM indicated thatall FR+ macrophages are CD68+, and that the percentage ofFR+ CD163+ macrophages (87%) is similar to that of CD163+

CD68+ cells (88%; Fig. 3C). Thus