tesis208.pdf

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTFICAS

INSTITUTO DE AGROQUMICA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS

EFECTO DEL POLVO DE CACAO Y LOS PULSOS ELCTRICOS DE

ALTA INTENSIDAD (PEF) EN LA INACTIVACIN DE CLULAS

VEGETATIVAS DE Bacillus cereus EN UNA BEBIDA MEZCLA DE

HUEVO LQUIDO Y LECHE.

ANGELA BIBIANA SILVA ANGULO

TRABAJO DE GRADO

Presentando como requisito parcial

para optar al ttulo de

Microbiloga Industrial

ANTONIO MARTNEZ LPEZ, DIRECTOR.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

Bogota, D.C

2 de febrero de 2009

NOTA DE ADVERTENCIA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario

al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan ataques personales

contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la

justicia.




HUEVO

LQUIDO Y LECHE.


APROBADO

Antonio Martnez Lpez, PhD

Director

Mara Pina Prez, Ingeniera Agrnoma Marcela Franco, PhD

Coodirectora Asesora

Fernando Sampedro, PhD Aurora Marco,

PhD

Jurado Jurado

Dinoraz Velez, PhD Vicenta Deveza, PhD

Jurado Jurado

Mara Rodrigo, PhD Pablo Fernndez, PhD



Jurado Responsable Convenio UPC-PUJ






HUEVO LQUIDO Y LECHE.


APROBADO

Angela Umaa Muoz, MPhil Janeth Arias Palacios, M.sC-M. Ed

Decana Acadmica Director de Carrera

DEDICATORIA

A mis padres y hermano.

AGRADECIMIENTOS

Quisiera agradecer especialmente al Doctor Antonio Martnez y la Doctora Mara

Dolores Rodrigo, por permitirme estar en su grupo de trabajo e investigacin;

ensearme este mundo mgico de la investigacin y guiarme cuando lo necesite.

Tambin quisiera agradecer al Doctor Pablo Fernndez por aceptarme para

emprender este viaje.

A Chelo, por ayudarme, por ser una excelente gua en el desarrollo de mi trabajo

final de carrera y por su paciencia.

A todos mis compaeros del IATA; a Carmen por estar siempre dispuesta a

ayudarme y su alegra, a Daniela por sus consejos, a Aurora por estar siempre

dispuesta a colaborarme, a Fernando por ser como mi hermano y a su familia

porque se han convertido en mi familia Espaola.

A mis compaeros de piso: Manu, por ser un gran amigo, a Pili y a Bego.

A la Doctora Marcela Franco por su apoyo y su gran amistad.

A mis profesores, y especialmente a la Doctora Janeth Arias, por ensearme a no

rendirme y a luchar por lo que quiero y por su gua.

A mis amigos, que aunque estando lejos siguen apoyndome y estando conmigo

cuando ms los he necesitado.

Por ltimo, a mi familia, sin ellos no hubiese podido emprender este viaje y no

habra sido posible la realizacin de este trabajo final de carrera.

2 de febrero de 2009

vi

TABLA DE CONTENIDOS

Pgs 1. INTRODUCCIN 1

2. MARCO TERICO 2

2.1. NUEVAS TECNOLOGAS 4

2.1.1. Pulsos elctricos de alta intensidad (PEF) 4

2.1.1.1. Sistemas de tratamiento por PEF 5

2.1.1.2. Cmaras de tratamiento 6

2.1.1.3. Factores relacionados con la tecnologa de PEF 7

2.1.1.3.1. Factores del proceso 7

2.1.1.3.1.1. Intensidad de campo elctrico 8

2.1.1.3.1.2. Forma del pulso elctrico 8

2.1.13.2. Temperatura 10

2.1.1.3.3. Tiempo de tratamiento 11

2.1.1.3.4. Amplitud de pulso 11

2.1.1.4. Factores relacionados con las caractersticas fsico-

qumicas del producto 12

2.1.1.4.1. Conductividad, pH, antimicrobianos, fuerza inica y

tamao de partcula 12

2.1.1.5. Factores del microorganismo 14

2.1.1.5.1. Tipo de microorganismo 14

2.1.1.5.2. Tamao del inculo 14

2.1.1.5.3. Fase de crecimiento 15

2.1.1.6. Mecanismo de inactivacin microbiana por PEF 15

2.1.1.7. Mecanismo de inactivacin enzimtica por PEF 17

2.1.1.8. Ventajas y desventajas de la tecnologa de PEF 18

2.1.1.8.1. Ventajas de los PEF 18

2.1.1.8.2. Desventajas de los PEF 18

2.2. ANTIMICROBIANOS NATURALES 19

2.2.1. Cacao 20

2.2.2. Composicin de los antimicrobianos naturales 20

vii

2.2.3. Mecanismo de inactivacin microbiana y enzimtica por

antimicrobianos naturales 21

2.2.4. Efecto sinrgico de los antimicrobianos naturales y nuevas

tecnologas de conservacin alimentaria 23

2.2.5. Efecto de la adicin de antimicrobianos naturales en los

alimentos 23

2.2.6. Ventajas y desventajas de los antimicrobianos naturales 24

2.2.6.1. Ventajas de los antimicrobianos naturales 24

2.2.6.2. Desventajas de los antimicrobianos naturales 25

2.3. BEBIDA MEZCLA DE LECHE Y HUEVO 25

2.3.1. Huevo lquido 25

2.3.1.1. Microorganismos alteradores y patgenos del huevo lquido 30

2.3.2. Leche 30

2.3.2.1. Microorganismos alteradores y patgenos de la leche 32

2.4. Bacillus cereus 32

2.5. MODELOS MATEMTICOS PREDICTIVOS 34

2.5.1. Modelo de Bigelow 34

2.5.2. Modelo de Weibull 36

2.5.3. Modelo de Baranyi 37

2.6. BONDAD DEL AJUSTE 39

2.7. CLCULO DE LA ENERGA SUMINISTRADA EN EL

PROCESO 39

3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN 40

3.1. FORMULACIN DEL PROBLEMA 40

3.2. PREGUNTAS DE INVESTIGACIN 40

3.3. JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN 40

4. OBJETIVOS 42

4.1. OBJETIVO GENERAL 42

4.2. OBJETIVOS ESPECFICOS 42

5. MATERIALES Y MTODOS 43

viii

5.1. PROTOCOLO DE PREPARACIN DE LA BEBIDA

MEZCLA DE HUEVO LQUIDO (PASTEURIZADO) Y

LECHE DESNATADA (UHT) 43

5.1.1. Materiales 43

5.1.2. Composicin de la bebida 43

5.1.3. Metodologa 43

5.2. PROTOCOLO DE PREPARACIN DE LA BEBIDA

MEZCLA DE HUEVO LQUIDO (PASTEURIZADO),

LECHE DESNATADA (UHT) Y POLVO DE CACAO

(CocoanOX 12%) 44


5.2.2. Composicin de la bebida 44


5.3. CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DE LAS

BEBIDAS 45

5.3.1. pH 45

5.3.1.1. Materiales 45

5.3.1.2. Metodologa 46

5.3.2. Conductividad elctrica 46



5.4. RECUPERACIN Y CRECIMIENTO DE Bacillus

cereus HASTA LA FASE ESTACIONARIA DE

CRECIMIENTO 47



5.5. TRATAMIENTO POR PEF 49

5.5.1. Tratamiento de la bebida mezcla de huevo lquido

pasteurizado, leche desnatada uht y CocoanOX 12% por

PEF 49


5.5.1.2. Descripcin del equipo de PEF (OSU-4D) 49

ix

5.5.1.3. Funcionamiento del sistema 50


5.5.1.4.1. Parmetros 51

5.5.1.4.2. Tratamientos de inactivacin por PEF 51

5.5.2. Consideraciones a tener en cuenta para el uso del equipo

de PEF 51

5.5.3. Etapas del tratamiento por PEF 52

5.6. RECUENTO DE Bacillus cereus 52



6. RESULTADOS Y DISCUSIN 54

6.1. CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DE UNA

NUEVA BEBIDA MEZCLA DE LECHE DESNATADA,

HUEVO LQUIDO Y CocoanOX 12% 54

6.2. CURVAS DE CRECIMIENTO DE Bacillus cereus EN LAS

BEBIDAS DE ESTUDIO 57

6.3. CINTICAS DE INACTIVACIN POR PEF DE

Bacillus cereus EN LA BEBIDA MEZCLA DE LECHE

DESNATADA Y HUEVO LQUIDO, CON Y SIN

CocoanOX 12% 64

6.3.1. Efecto del tiempo de tratamiento e intensidad de campo

elctrico 65

6.3.2. Efecto sinrgico del CocoanOX 12% con los tratamientos

de PEF 68

6.3.3. Ajuste de los datos experimentales a modelos matemticos

predictivos 75

6.3.3.1. Modelo de Bigelow 77

6.3.3.2. Modelo de Weibull 78

6.3.3.3. Ecuacin modificada de Gompertz 80

6.3.3.4. Modelo Log-Logistic 81

6.4. ALMACENAMIENTO 86

7. CONCLUSIONES 94

x

8. RECOMENDACIONES 96

9. REFERENCIAS 98

TABLAS

5.1. Bebidas obtenidas y su composicin 45

5.2. Temperatura de tratamiento, campo elctrico y tiempo de

tratamiento por PEF a las bebidas 51

6.1. Diferentes formulaciones de la bebida, analizadas para el

tratamiento con PEF 55

6.2a. Variaciones del pH y la conductividad elctrica en funcin de la

temperatura de las bebidas analizadas 56

6.2b. Variacin del pH y la conductividad elctrica en funcin de la

temperatura de las bebidas analizadas 56

6.3. Condiciones para el tratamiento con PEF, intensidad de

campo elctrico (E) y tiempos de tratamiento para B1 y B3

en la inactivacin de B.cereus 65

6.4a. Parmetros cinticos de los cuatro modelos aplicados para la

inactivacin de B.cereus en las cuatro bebidas analizadas 76

6.4b. Parmetros cinticos de los cuatro modelos aplicados para la


6.5. Parmetros modelo de Bigelow para la inactivacin de

B.cereus en las cuatro bebidas analizadas 78

6.6. Parmetros cinticos del modelo de Weibull para la


6.7. Parmetros cinticos de la ecuacin modificada de

Gompertz para la inactivacin de B.cereus en las cuatro

bebidas analizadas 81

6.8. Parmetros cinticos del modelo Log-Logistic simplificado 86

xi

FIGURAS

2.1. Cmaras de tratamiento 7

2.2. Componentes de las cmaras de tratamiento tipo co-field 7

2.3. Onda de cada exponencial 9

2.4. Onda cuadrada 9

2.5. Onda cuadrada bipolar 10

2.6. Estructura de la membrana bacteriana expuesta a altas

temperaturas 11

2.7. Onda cuadrada bipolar. Amplitud del pulso (w) 12

2.8. Comparacin de tamaos celulares 14

2.9. Induccin de un potencial transmembrana en una clula

expuesta a PEF 16

2.10. Mecanismo de inactivacin celular por PEF 17

2.11. Brotes de enfermedades transmitidas por el huevo y sus

derivados. Espaa (1998-2001) 26

2.12. Relacin de brotes de enfermedades transmitidas por

alimentos y alimentos implicados en Espaa (1994-2003) 29

2.13. Curva de supervivencia de esporas de B.stearothermophilus a

temperatura constante (115C) 35

2.14. Ejemplos de curvas de supervivencia no lineales 36

5.1. pH-metro y conductmetro 46

5.2. Grfico del equipo de pulsos elctricos 50

6.1. Curva de crecimiento de B.cereus a 4C en B1 58

6.1A. Curva de crecimiento de B.cereus a 4C en B2 58

6.2. Comparacin del crecimiento de B.cereus en B1 y B2 a 4C 59







6.7. Valores de mx de Gompertz para B.cereus a las tres diferentes

xii

temperaturas de crecimiento para B1 y B2 64

6.8. Curvas de inactivacin de B.cereus en la bebida B1 en las

diferentes condiciones de tratamiento con PEF 67

6.9. Curvas de inactivacin de B.cereus en la bebida B3 en las


6.10. Curvas de inactivacin de B.cereus en B2 en las diferentes

condiciones de tratamiento con PEF 70

6.10A. Curvas de inactivacin de B.cereus en B4 en las


6.11. Inactivacin de B.cereus a 15kV/cm en las bebidas B1 y B2 72

6.11A. Inactivacin de B.cereus a 25kV/cm en las bebidas y B2 72


6.12A. Inactivacin de B.cereus a 15kV/cm en las bebidas B3 y B4 73


6.13A. Inactivacin de B.cereus a 35kV/cm en las bebidas B3 y B4 74

6.14. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los

cuatro modelos analizados para B1 a 15kV/cm 83

6.15. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los cuatro

modelos analizados Para B2 a 15kV/cm 84

6.15A. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los


6.16. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los


6.17. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura

de refrigeracin (5C), posterior al tratamiento de PEF (15kV/cm)

en B3 88


de refrigeracin (5C), posterior al tratamiento con PEF (25kV/cm)

en B3 89

6.18A. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura


en B3 89

xiii



en B4 92



en B4 93

6.20A. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura


en B4 93

xiv

RESUMEN

Con el objetivo de conocer el efecto del polvo de cacao (CocoanOX 12%) y los

pulsos elctricos de alta intensidad (PEF) en el control e inactivacin de clulas

vegetativas de Bacillus cereus, en cuatro bebidas: leche semi-desnatada (B1),

leche semi-desnatada con CocoanOX 12% (B2), leche semi-desnatada y huevo

lquido (B3) y leche semi-desnatada, huevo lquido y CocoanOX 12% (B4), se

realizo el presente estudio.

La concentracin de CocoanOX 12% fue de 2.5% (p/v), ya que se conoce que es

la mnima concentracin de cacao que ejerce un efecto letal en clulas vegetativas

bacterianas. Posteriormente al tratamiento con PEF, las bebidas se almacenaron en

refrigeracin durante 15 das para as analizar el comportamiento de B.cereus

despus del tratamiento con PEF y el efecto del CocoanOX 12%. Los resultados

obtenidos fueron analizados mediante cuatro modelos matemticos predictivos;

modelo de Bigelow, Weibull, la ecuacin modificada de Gompertz y Log-logistic.

En B1 el mximo nivel de inactivacin fue de 3Log10 ciclos logartmicos de

reduccin para 35kV/cm, 300s a 15C; estos mismos resultados se obtuvieron

para B3. En las bebidas suplementadas con CocoanOX 12% el nivel de

inactivacin incremento hasta 3.30Log10 ciclos de reduccin. El modelo que

mejor se ajusto a los datos obtenidos experimentalmente para las cuatro bebidas,

fue el Log-logistic.

Durante el almacenamiento, el CocoanOX 12% ejerci un efecto bactericida en el

control de B.cereus, dando como resultado una reduccin de cuatro ciclos

logartmicos a los 15 das de almacenamiento a 5C en B2 y B4, con respecto a las

bebidas que no contenan el CocoanOX 12%. Estos resultados ponen de

manifiesto el efecto bacteriosttico del CocoanOX 12% as como el efecto

sinrgico de este producto y los PEF en el control de Bacillus cereus.

El presente estudio abre camino hacia la realizacin y propuesta de una nueva

bebida rica en nutrientes esenciales.

1. INTRODUCCIN

Gracias a los cambios en la dieta de los consumidores, debido a una mayor

concienciacin por proteger la salud y bienestar, as como tambin la falta de

tiempo, las industrias estn tratando de desarrollar alimentos procesados listos

para el consumo, ricos en nutrientes; con mnimos tratamientos de conservacin,

as como tambin alimentos orgnicos verdes los cuales carecen de

conservantes qumicos en los mismos.

Estos cambios en los hbitos de consumo, estn llevando a la industria agro-

alimentara a utilizar nuevas tecnologas de conservacin no trmicas. Dentro de

las ms prometedoras se encuentran la tecnologa de Altas Presiones Hidrostticas

(HHP) y ms recientemente se est trabajando a nivel de laboratorio y de planta

piloto en la posibilidad de aplicar el tratamiento por Pulsos Elctricos de Alta

Intensidad (PEAI). Ambas tecnologas se pueden aplicar solas o combinadas con

antimicrobianos naturales como sustitutos de conservantes qumicos, lo que se

denomina un tratamiento por barreras o efecto hudle. Al tratarse de tecnologas

no trmicas, permiten conservar, en mayor medida que los tratamientos trmicos,

la calidad (sabor, aroma, color y vitaminas) de determinados alimentos listos para

el consumo e inactivar microorganismos patgenos, alteradores y enzimas,

incrementando su vida til en refrigeracin y facilitando su comercializacin.

Dentro de este entorno tecnolgico y de nuevos productos, en el presente trabajo

se pretende desarrollar una nueva bebida mezcla de huevo lquido pasteurizado,

leche desnatada y antimicrobianos naturales la cual cumple con caractersticas

ideales para un pblico cada vez ms exigente.

Para conseguir la inocuidad del producto desarrollado frente a clulas vegetativas

de un microorganismo patgeno que est presente en las materias primas

utilizadas y para mantener en lo posible sus caractersticas nutricionales y

sensoriales, se evaluar la capacidad de dos tecnologas no trmicas (Altas

1

Presiones Hidrostticas y Pulsos Elctricos de Alta Intensidad) solas o

combinadas con diferentes antimicrobianos naturales.

2. MARCO TERICO

Tradicionalmente los alimentos han sido preservados usando calor (esterilizacin

comercial, pasteurizacin y escaldado), preservativos (antimicrobianos), o

cambios en las condiciones del medio para los microorganismos como en el pH

(fermentacin), actividad de agua (deshidratacin), la temperatura (refrigeracin

y/ congelacin) (Barbosa et al, 2001).

A pesar de la eficacia de las tecnologas tradicionales desde el punto de vista de

seguridad microbiolgica, estas tambin causan un deterioro nutricional, sensorial

y funcional en los alimentos procesados (Barbosa et al, 2001).

La creciente demanda de alimentos frescos, mnimamente procesados a la vez que

seguros y que conserven sus cualidades nutricionales y organolpticas por parte

de los consumidores ha llevado a un gran esfuerzo de investigacin en los ltimos

veinte aos con el fin de desarrollar nuevos mtodos de conservacin capaces de

inactivar microorganismos patgenos transmitidos por alimentos, as como

tambin conservar sus valores nutricionales y sensoriales (Maas et al, 2005;

Herrero et al, 2006; Barbosa et al, 2001; Devlieghere et al, 2004).

El desarrollo de nuevas tecnologas en la Industria Alimentara est permitiendo

alargar la vida til de muchos productos y satisfacer los gustos del consumidor.

Son productos que presentan un valor aadido y una alta calidad nutritiva y

sensorial, que generalmente se consumen crudos o con un tratamiento trmico

suave. Por este motivo, resulta imprescindible conocer el efecto de las distintas

tecnologas de conservacin en su calidad (Herrero et al, 2006).

Los mayores avances en este campo se han conseguido con el desarrollo de

sistemas fsicos, que afectan la viabilidad de los microorganismos, sin un

incremento sustancial de la temperatura del alimento (Barbosa et al, 2001;

Herrero et al, 2006).

2

Entre las tecnologas de esta naturaleza se encuentran las altas presiones

hidrostticas (HHP), ultrasonidos, irradiacin, pulsos elctricos de alta intensidad

(PEF), campos magnticos oscilantes y luz blanca de alta intensidad (Herrero et

al, 2006; Maas et al, 2005). El proceso de irradiacin ionizante (IR) envuelve la

aplicacin de ondas electromagnticas electrones a los alimentos. Las fuentes de

radiacin incluyen rayos gamma de cobalto-60, rayos X, la cantidad de irradiacin

absorbida por el alimento es medida en kGy (1Gy = 1J/kg). La aplicacin

comercial del tratamiento por irradiacin ionizante en alimentos empez en 1980,

pero su xito ha sido poco debido a las preocupaciones en cuanto al tratamiento

por parte de los consumidores. Hoy en da, la percepcin de la sociedad en cuanto

a la IR esta cambiando y se esta reexaminando esta tecnologa (Maas et al,

2005).

El ultrasonido es definido como ondas de sonido con frecuencias por encima del

umbral de audicin humana (>16kHz). Aunque el ultrasonido fue inicialmente

descartado como un mtodo para la preservacin de alimentos debido a la

debilidad de su accin letal frente a los microorganismos, la aplicacin de una

presin hidrosttica externa de hasta 600MPa (Manosonicacin (MS)) incrementa

la letalidad del tratamiento. Adicionalmente, la combinacin de MS con

temperatura (Manotermosonicacin (MTS)) ha sido propuesta.

Las HHP envuelven la aplicacin de presiones desde 100 a 1000MPa. El primer

estudio del efecto letal de las HHP fue realizado a finales del siglo 19, pero solo

hasta aos recientes se ha empezado a aplicar comercialmente (Maas et al,

2005).

La tecnologa por PEF consiste en la aplicacin de pulsos elctricos (10-

50kV/cm) de corta duracin (1-100s) a un alimento puesto entre dos electrodos.

Numerosos estudios han comprobado la efectividad de los pulsos elctricos de

alta intensidad en la destruccin de microorganismos y enzimas de sistemas de

alimentos (Maas et al, 2005).

3

La optimizacin del empleo de estos mtodos de conservacin pasa por el diseo

de procesos combinados, en los que la asociacin o aplicacin simultnea de

varios procedimientos permita potenciar el efecto, de cada uno de ellos, en los

microorganismos patgenos y alteradores y reducir el impacto adverso en las

caractersticas de los alimentos tratados (Herrero et al, 2006).

2.1 NUEVAS TECNOLOGAS

Se ha comprobado que estas tecnologas alargan la vida de diversos productos

alimenticios y podrn en un corto o mediano plazo reemplazar parcialmente los

tratamientos trmicos convencionales existentes utilizados industrialmente para

pasteurizar y/o esterilizar los alimentos (Barbosa et al, 2001).

2.1.1 PULSOS ELECTICOS DE ALTA INTENSIDAD (PEF)

Los PEF se basan en la aplicacin de pulsos cortos de alto voltaje sobre el

alimento (tpicamente de 20 a 80kV/cm) con una duracin entre 1 y 10 ms (hasta

300s) y se ajusta teniendo en cuenta diversos factores del alimento y de la

microbiota contaminante; el alimento producto se pone entre dos electrodos

dentro de una cmara. Es un proceso no trmico, ya que los alimentos tratados se

mantienen a temperatura ambiente o por debajo de la misma por algunos

microsegundos, minimizando la energa prdida causada por el calentamiento.

Esta tecnologa es considerada superior al tratamiento calrico convencional

debido a que reduce grandemente los cambios que ocurren en las propiedades

sensoriales (sabor, color) y fsicas (textura, viscosidad) de los alimentos. Adems

de conservar los atributos sensoriales de los alimentos, los PEF no introducen

cambios qumicos significativos en los alimentos (Barbosa et al, 2001; Herrero et

al, 2006; Devlieghere et al, 2004).

Los resultados de estudios experimentales han demostrado la eficacia y validacin

de estos mtodos en la preservacin y extensin de la vida de productos

alimenticios como la leche, huevos lquidos, jugos de manzana, naranja y yogurt

4

entre otros. Los pulsos elctricos de alta intensidad y los pulsos de luz son las dos

tecnologas ms estudiadas y que parecen estar listas para su aplicacin industrial

como se ha demostrado en pruebas a nivel de laboratorio y de planta piloto

(Barbosa, 2000).

2.1.1.1 SISTEMAS DE TRATAMIENTO POR PEF

Los aspectos mas importantes de esta tecnologa son la generacin de pulsos

elctricos de alta intensidad, el diseo de cmaras para el tratamiento del alimento

de tal manera que ste reciba un tratamiento uniforme con un mnimo de

incremento de la temperatura y el buen diseo de electrodos para minimizar la

electrolisis.

Los diferentes componentes con los que cuenta el equipo de tratamiento por PEF

son los siguientes (Grahl et al, 1996):

Generador de alto voltaje Interruptor de alto voltaje Cmaras de tratamiento Transformador Sondas de temperatura, voltaje e intensidad de corriente Osciloscopio Sistema de refrigeracin

El osciloscopio se utiliza para comprobar el voltaje y la intensidad de corriente

aplicada durante el tratamiento. La energa es suministrada por una fuente de alto

voltaje y sta se almacena en uno o varios condensadores y se descarga a los

alimentos a tratar en forma de pulsos y as obtener un campo elctrico. La energa

contenida en los condensadores puede ser descargada casi instantneamente en

una millonsima de segundo. Esto se produce en una cmara de tratamiento donde

el alimento circula a travs de un conducto cilndrico pequeo. Cuando una seal

de activacin se genera, un interruptor de alta tensin se cierra y la carga

5

almacenada en el condensador pasa a travs de las cmaras de tratamiento que

contienen el alimento (Barbosa et al, 2001).

Un factor limitante a tener en cuenta en el tratamiento por PEF es el fenmeno de

la ruptura dielctrica. El fenmeno de la ruptura dielctrica consiste en un cambio

brusco de la conductividad elctrica en el interior de la cmara de tratamiento que

produce a su vez un aumento brusco de la intensidad de corriente provocando la

interrupcin del tratamiento. Este cambio brusco puede ser debido a una excesiva

intensidad del tratamiento, valor alto de conductividad elctrica del producto o a

la presencia de burbujas de aire. Durante el fenmeno se observa la formacin de

una chispa en el interior de la cmara de tratamiento, por lo que el fenmeno se

conoce tambin como arqueo o chispa.

2.1.1.2 CMARAS DE TRATAMIENTO

Las cmaras de tratamiento consisten en dos electrodos separados por un material

aislante resistente al alto voltaje en los cuales se aloja el alimento lquido a tratar.

Existen distintos tipos de cmaras segn el volumen almacenado, distribucin y

geometra. Dependiendo del tipo de estudio a realizar, podemos encontrar cmaras

estticas utilizadas para estudios preliminares de laboratorio y cmaras en

continuo utilizadas para estudios en planta piloto y escala industrial por ser ms

econmicas y eficientes. (Barbosa et al, 1999).

Los tipos de cmaras ms importantes son:

- Cmara co-field: Son cmaras continuas, donde la direccin del campo

elctrico generado es paralela al flujo del alimento.

- Cmara coaxial: Son cmaras continuas, constituidas por dos electrodos

cilndricos concntricos, donde el alimento fluye entre ellos recibiendo el

tratamiento.

- Cmara de placas paralelas: Son cmaras estticas, constituidas por dos

electrodos con una distancia menor que la superficie de los mismos.

6

CONTINAS ESTTICA

Co-field Coaxial Placas Paralelas

Figura 2.1. Cmaras de tratamiento. (Barbosa et al., 1998)

1. Figura 2.2. Componentes de las cmaras de tratamiento tipo co-field (IATA-

CSIC, 2008)

Las cmaras deben estar diseadas de tal modo que consigan distribuir

uniformemente la intensidad de campo elctrico y as conseguir una mayor

efectividad en el tratamiento, evitando las variaciones de campo que podran

aumentar las probabilidades de ruptura dielctrica (Barbosa et al, 1999).

2.1.1.3 FACTORES RELACIONADOS CON LA TECNOLOGIA DE PEF

2.1.1.3.1 FACTORES DEL PROCESO

7

2.1.1.3.1.1 INTENSIDAD DE CAMPO ELCTRICO

La intensidad de campo elctrico se produce en el interior de las cmaras y se

define como la diferencia de potencial aplicada a los dos electrodos por la

distancia entre ellos. Segn la ley de Gauss, el campo elctrico en geometra plana

se puede definir como:

dVE = Ecuacin 2.1

donde E es la intensidad de campo elctrico (kV/cm), V diferencia de potencial

(Voltios) y d es la distancia entre electrodos (cm) (Barbosa et al, 1999).

Es uno de los factores ms importantes en la inactivacin de microorganismos por

PEF, ya que para producir la ruptura de la membrana y posterior muerte del

microorganismo es necesario superar el denominado potencial crtico

transmembrana o intensidad de campo elctrico crtica (Ec) que suele situarse en

un valor de 5 kV/cm (Hlsheger et al., 1980; Qin et al., 1998).

2.1.1.3.1.2 FORMA DEL PULSO ELCTRICO

La forma del pulso interviene directamente en la inactivacin de microorganismos

por PEF. Existen diversos tipos de onda que forman el pulso, entre los cuales

podemos destacar:

Onda de cada exponencial: Este tipo de onda presenta un pico con corto tiempo en el mximo voltaje y una larga cola con un bajo campo

elctrico, hasta llegar a su valor inicial (0kV/cm); en donde el exceso de

calor generado en el alimento no produce un efecto letal en los

microorganismos (Barbosa et al, 1999; Barbosa et al, 2001) (Figura 2.3).

8

Figura 2.3. Onda de cada exponencial (Barbosa et al., 1999)

Onda cuadrada: Este tipo de onda se basa en alcanzar rpidamente el valor de voltaje aplicado, mantenindose durante cierto periodo de tiempo y

descendiendo rpidamente hasta su valor inicial. Existen diversos estudios

que han observado que la onda cuadrada es ms eficaz en la inactivacin

de microorganismos gracias a que mantienen el voltaje mximo dado por

un periodo de tiempo largo utilizando a su vez menos energa que la onda

de cada exponencial (Rodrigo et al., 2003;Barbosa et al, 2001 ) (Figura

2.4).

Figura 2.4. Onda cuadrada (Barbosa et al., 1999).

Dependiendo de la polaridad de los pulsos de onda cuadrada estos pueden tener

caractersticas monopolares o bipolares. Los pulsos bipolares son aquellos que

aplican un pulso de onda positiva seguido de un pulso de onda negativa (Figura

2.5). La aplicacin de pulso bipolar produce cambios en la orientacin de las

molculas cargadas de las clulas provocando un estrs aadido en la membrana

celular, facilitando su ruptura (Ho et al., 1995). En el caso de los pulsos

9

monopolares (Figura 2.4) se mantienen las polaridades, por lo que parecen ser

menos efectivos, produciendo adems una mayor electrolisis y aumento de los

slidos adheridos a los electrodos (Barbosa et al, 1999).

Figura 2.5. Onda cuadrada bipolar (Barbosa et al., 1999).

2.1.1.3.2 TEMPERATURA

La temperatura es otro de los factores importantes en el tratamiento por PEF.

Durante el tratamiento por PEF se produce un aumento de la temperatura que

depender, principalmente, del campo elctrico aplicado y del tiempo de

tratamiento. Un aumento de la intensidad del tratamiento por PEF provocar un

mayor aumento de la temperatura. El incremento de la temperatura inicial del

tratamiento favorecer, en general, la inactivacin tanto de enzimas como de

microorganismos, producindose un efecto sinrgico (pulsos-temperatura) a

temperaturas comprendidas entre 35-60 C. Esto es debido a cambios en la

permeabilidad y fluidez de la membrana y conductividad elctrica del alimento,

aumentando as las probabilidades de ruptura de la membrana (Figura 2.6)

(Jayaram et al., 1992; Rodrigo et al., 2002, Sampedro et al., 2006; Barbosa et al,

2001).

Algunos autores han demostrado que un aumento moderado de la temperatura de

tratamiento disminuye tambin la cantidad de energa necesaria para lograr un

mismo grado de inactivacin microbiana, debido a los cambios en los

componentes de la membrana inducidos por la temperatura (Wouters et al, 1999;

Heinz et al., 2003; Barbosa et al, 2001).

10

Baja temperatura Alta temperatura

Figura 2.6. Estructura de la membrana bacteriana expuesta ha altas temperaturas

(Amiali, 2005)

2.1.1.3.3 TIEMPO DE TRATAMIENTO

El tiempo de tratamiento (t) es otro de los parmetros directamente relacionados

con la inactivacin de microorganismos por PEF y se define como:

wnt = Ecuacin 2.2

donde t es el tiempo de tratamiento (s), n es el nmero de pulsos aplicados y w

es la amplitud o duracin del pulso (s). En general, un incremento del tiempo de tratamiento produce un incremento de la temperatura y una mayor inactivacin

pero varios estudios han demostrado que se consigue una mayor inactivacin

microbiana aplicando tiempos de tratamiento cortos e intensidades de campo altas

(Sampedro et al., 2006). La aplicacin de tiempos de tratamientos largos y por

tanto de un aumento del gasto energtico no produce un aumento significativo de

la inactivacin (Raso et al., 2000, Aronsson et al., 2001).

2.1.1.3.4 AMPLITUD DE PULSO

La amplitud del pulso (w), se define como el tiempo o duracin de un pulso en

microsegundos y depende de la forma del mismo (Figura 2.7). En general, si se

aplica una amplitud de pulso excesiva y un tiempo largo de tratamiento se puede

producir un incremento excesivo de la temperatura y alterar la conductividad del

alimento, con la consiguiente reduccin en la efectividad del tratamiento por PEF.

Es fundamental combinar de forma adecuada esta variable para optimizar el

tratamiento, logrando una mayor inactivacin con un menor incremento de

temperatura. Diversos autores han tratado de optimizar la amplitud del pulso

11

basndose en la inactivacin microbiana conseguida. Se ha comprobado que un

valor cercano a los dos microsegundos logra una mayor reduccin microbiana. Un

aumento de la amplitud del pulso no logra en muchos casos un aumento de la

inactivacin.

Figura 2.7. Onda cuadrada bipolar. Amplitud de pulso (w).

2.1.1.4 FACTORES RELACIONADOS CON LAS CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS DEL PRODUCTO

Es necesario conocer las caractersticas fsico-qumicas de los productos

susceptibles de ser tratados por PEF ya que estas afectan directamente a la

efectividad del tratamiento. Las principales son: la conductividad elctrica, fuerza

inica, pH, actividad de agua (aw), presencia de burbujas, antimicrobianos y

tamao de partcula. ltimamente se ha comprobado que la composicin del

alimento es tambin un factor importante a tener en cuenta. La efectividad del

tratamiento con PEF se reduce cuanto ms compleja es la composicin de un

alimento (Sampedro et al., 2006; Barbosa et al, 1999).

2.1.1.4.1 CONDUCTIVIDAD, pH, ANTIMICROBIANOS, FUERZA

INICA Y TAMAO DE PARTICULA

La conductividad esta relacionada con la transferencia de energa, cuando hay una

baja conductividad esto conduce a una mayor eficacia en el tratamiento de PEF;

los alimentos que actan como buenos conductores presentan dificultades para ser

tratados con PEF debido a que se genera un pequeo pico del pulso elctrico en

las cmaras de tratamiento. Por lo tanto, es conveniente que la conductividad del

12

alimento sea baja para obtener un buen grado de inactivacin. Un incremento en

la conductividad incrementa la fuerza inica de los lquidos, por lo tanto un

incremento de la fuerza inica del alimento genera la disminucin en la taza de

inactivacin. La conductividad y la fuerza inica estn estrechamente

relacionadas. La presencia de iones en el alimento produce efectos variados en los

patrones de inactivacin. Iones como Ca2+, Na+, K+ y Mg2+ actan sobre la

membrana y alteran las funciones celulares de est; sin embrago, iones como

Ca2+ y Mg2+ ejercen un efecto protector al tratamiento con PEF (Barbosa et al,

1999).

Factores adicionales que intervienen en el tratamiento con PEF son el pH del

alimento producto y la presencia de antimicrobianos, estos pueden actuar

sinrgicamente con el tratamiento para la destruccin de microorganismos; el pH

del medio juega un papel importante en las cinticas de inactivacin en el

tratamiento con PEF. El efecto sinrgico entre el pH y los PEF es atribuido a una

posible disminucin del pH citoplasmtico por un incremento en la taza de

transferencia de protones a travs de la membrana cuando sta es electroporada.

La presencia de antimicrobianos en el alimento producto, como nisina

lisozima, reduce la viabilidad de microorganismos patgenos, lo que a su vez

aumenta la efectividad del tratamiento con PEF. Cada uno de estos factores genera

un estrs adicional a los microorganismos, y el resultado es un incremento en la

inactivacin total (Barbosa et al, 1999; Barbosa et al, 2001).

La presencia de partculas suspendidas y de burbujas en el alimento lquido

semislido representan un desafi extra al tratamiento con PEF; las partculas

suspendidas impiden una distribucin homognea del campo elctrico aplicado y

las burbujas de aire, causan una ruptura dielctrica, arcos elctricos chispas, as

como tambin cuasar daos en las cmaras electrodos. Diferentes estudios han

determinado que alimentos lquidos con partculas de mayor tamao son menos

susceptibles a ser tratados por PEF debido a que el fenmeno de ruptura

dielctrica o arqueo se produce de forma ms repetida (Barbosa et al, 1999).

13

2.1.1.5 FACTORES DEL MICROORGANISMO

El tipo de microorganismo (bacterias Gram positivas, Gram negativas, levaduras

esporas), caractersticas especficas, como el dimetro de los microorganismos, la

estructura de la membrana intervienen para escoger las condiciones de

tratamiento. As como tambin, la fase de crecimiento y la concentracin de

microorganismos (Barbosa et al, 1999).

2.1.1.5.1 TIPO DE MICROORGANISMO

La sensibilidad de los microorganismos al tratamiento con PEF vara con cada

tipo de microorganismo; las clulas vegetativas son ms sensibles que las esporas.

Sin embargo, dependiendo de las condiciones experimentales, se puede lograr una

inactivacin irreversible de esporas bacterianas despus del tratamiento con PEF

(Marquez et al 1997). El tamao de los microorganismos tambin influye en la

eficacia de la inactivacin microbiana producida por PEF (Figura 2.8). Las

grandes clulas de las levaduras son ms fciles de inactivar que las clulas

bacterianas. Las bacterias Gram positivas son ms resistentes al tratamiento con

PEF que las Gram negativas, y las clulas que se encuentran en fase logartmica

son ms sensibles que las que estn en la fase estacionaria (Barbosa et al, 2001;

Barbosa et al, 1999).

Figura 2.8. Comparacin de tamaos celulares (Qin et al., 1998)

2.1.1.5.2 TAMAO DEL INCULO

La eficiencia de la inactivacin con PEF se ve afectada por la concentracin

inicial de microorganismos en el alimento a tratar. Jeantet et al (1999), reportaron

14

que cuando el tamao del inculo es grande se reduce el efecto letal del

tratamiento por PEF (Amiali, 2005).Sin embrago, se comprob que el aumento de

poblacin de E. coli (103-108 UFC/mL) en leche ultrafiltrada, no afect a la

efectividad del tratamiento (Barbosa et al., 1999). En conclusin parece que la

influencia de este parmetro sobre la efectividad de los pulsos se ve afectado por

el tipo de microorganismo y las condiciones de tratamiento estudiadas (Torres,

2006).

2.1.1.5.3 FASE DE CRECIMIENTO

Las caractersticas de la clula y en especial su membrana son diferentes en cada

etapa de desarrollo del microorganismo. En la fase logartmica las clulas son ms

sensibles a un factor externo como los pulsos elctricos, que en la fase

estacionaria; ya que las clulas se encuentran en divisin y por tanto la

membrana celular es ms susceptible a los cambios externos (Barbosa et al, 2001;

Barbosa et al, 1999; Amiali, 2005). Gskov et al (1996), reporto que la

inactivacin con PEF en la fase logartmica es del 30% mayor que en la fase

estacionaria (Amiali, 2005). Por lo tanto, en estudios de inactivacin microbiana

por PEAI se debera recoger las clulas en fase estacionaria consiguiendo las

condiciones ms desfavorables (Torres, 2006)

2.1.1.6 MECANISMO DE INACTIVACIN MICROBIANA POR PEF

Durante la fase de desarrollo de una nueva tecnologa de conservacin de

alimentos es necesario conocer al mximo los mecanismos por los cuales se

inactivan los microorganismos. Varias teoras han sido propuestas para estudiar la

inactivacin de los microorganismos con PEF. Las ms estudiadas son la ruptura

dielctrica y la electroporacin (Torres, 2006).

La electroporacin es la teora ms aceptada, sta describe el fenmeno que ocurre

en la membrana celular cuando se aplica una intensidad de campo elctrico que da

lugar a una diferencia de potencial entre ambos lados de la membrana (potencial

15

transmembrana) resulta del hecho de que la membrana tiene una constante

dielctrica mucho ms baja que la mayora de los alimentos, por lo tanto, la

aplicacin de los pulsos elctricos induce a la acumulacin de cargas negativas y

positivas dentro de la clula (Figura 2.9), este campo elctrico aplicado

desestabiliza temporalmente la capa lpidica y las protenas de la membrana

celular; el plasma de las membranas celulares se hace permeable a pequeas

molculas y la permeabilidad causa hinchazn y una eventual ruptura de la

membrana celular. Cuando esta diferencia de potencial alcanza un valor crtico de

1 voltio la repulsin entre las cargas lleva a cabo el movimiento de las molculas,

que vara en funcin del tipo de microorganismo, el dimetro del mismo, y sus

condiciones de crecimiento, para Eschericia coli corresponde a un campo

elctrico externo de aproximadamente 10kV/cm, y se origina la formacin de

poros irreversibles en la membrana celular (electroporacin) y en consecuencia la

prdida de su integridad, incremento de la permeabilidad y finalmente destruccin

de la clula afectada (Barbosa et al, 2001; Herrero et al, 2006).

Figura 2.9. Induccin de un potencial transmembrana en una clula expuesta a

PEF (Grahl, 1996)

La ruptura elctrica es la teora en la cual la membrana puede ser considerada

como un capacitador lleno con circuito elctrico. El potencial elctrico normal en

ambos lados de la membrana es de aproximadamente 10mV. La exposicin de la

membrana a un campo elctrico conduce al desarrollo en sta de un potencial

diferencial promovido por la separacin de cargas elctricas a travs de la

membrana celular. El aumento del potencial elctrico de la membrana conlleva a

una reduccin del espesor de la membrana celular. La ruptura de la membrana

16

celular ocurre si el voltaje de ruptura crtico Vc (~1V) es alcanzado por un

incremento adicional del campo elctrico externo. Se asume que la ruptura es

causada por la formacin de poros transmembrnicos, lo cual conduce a una

descarga inmediata de la membrana y a la descomposicin de esta (Barbosa,

2000)

Hamilton y Sale (1967), concluyeron que los pulsos elctricos posiblemente

causan una perdida irreversible en la funcin de la membrana como barrera semi-

permeable entre las clulas y su entorno (Figura 2.10) (Barbosa et al, 2001).

Figura 2.10. Mecanismo de inactivacin celular por PEF (Mercado, 1997)

2.1.1.7 MECANISMO DE INACTIVACIN ENZIMATICA POR PEF

Diversos estudios han observado el mecanismo de inactivacin de enzimas por

PEF; estos pueden causar la desnaturalizacin de las enzimas, afectar las

interacciones hidrofobicas, puentes de hidrogeno, interacciones de van der Waal,

fuerzas electrostticas (Barbosa et al, 1999).

Adems, los PEF influyen en el estado conformacional de las protenas. Las

cargas de los grupos y sus estructuras son altamente susceptibles a cambios

externos, en este caso a la aplicacin de los PEF. Asociaciones y disociaciones de

grupos ionizables, movimientos de las cargas de las cadenas, cambios en la

alineacin de las hlices, y la forma de una protena pueden ser inducidos por el

tratamiento con PEF (Barbosa et al, 1999).

17

Gracias a que los PEF afectan la estructura proteica y enzimtica, estos se pueden

utilizar para prevenir reacciones no favorables en los alimentos como: reacciones

de oxidacin, cambio del sabor y cambio del color de los alimentos (Barbosa et al,

1999)

2.1.1.8 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA TECNOLOGA DE PEF

2.1.1.8.1 VENTAJAS DE LOS PEF

9 Los PEF son efectivos en la inactivacin de microorganismos patgenos y alteradores en los alimentos.

9 El proceso de tratamiento con PEF extiende la vida til de zumos de fruta, productos lcteos, huevo lquido, y cremas de vegetales.

9 Mantiene las caractersticas organolpticas, sensoriales (olor, sabor y aroma) y nutritivas (vitaminas, minerales), de los alimentos productos

tratados.

9 Los PEF, son una alternativa a la pasteurizacin y esterilizacin sin calor de alimentos lquidos en la industria agroalimentaria.

9 Los PEF actan sinrgicamente con otras tecnologas ya existentes como el tratamiento por calor, o nuevas tecnologas como la adicin de

antimicrobianos naturales y HHP para as obtener una mayor inactivacin

microbiolgica con menores tiempos de exposicin y tratamientos

moderados.

2.1.1.8.2 DESVENTAJAS DE LOS PEF

8 Tecnologa limitada a alimentos productos lquidos, sin partculas en suspensin.

18

8 Es aplicable nicamente a alimentos productos que tengan una baja conductividad, ya que productos con alta conductividad reducen la eficacia

del tratamiento, favoreciendo la ruptura dielctrica.

8 Si la composicin del alimento es compleja limita su potencial de inhibicin.

8 Solo logra inhibir las esporas bacterianas si se mezcla con otro tratamiento de inactivacin.

8 El gasto energtico es mayor que en el tratamiento trmico convencional con lo que se incrementar el coste de produccin y venta.

2.2 ANTIMICROBIANOS NATURALES

El creciente inters en la sustitucin de conservantes alimentarios qumicos y

productos con bajo impacto al medio ambiente, ha fomentado la investigacin

sobre la seleccin de materiales vegetales con el fin de identificar nuevos

compuestos, antimicrobianos as como tambin antioxidantes. Los productos

naturales y los compuestos derivados de los mismos, tienen aplicaciones en el

control de microorganismos patgenos. Por lo tanto, existen buenas perspectivas

para nuevos mtodos de procesamiento y control de alimentos (Valero et al, 2003;

Burt, 2004).

Los compuestos fenlicos de los antimicrobianos naturales, son los responsables

de su actividad antibacteriana. Existen pruebas que revelan que los componentes

traza juegan una parte fundamental en cuanto a la actividad antibacterial de los

extractos de plantas posiblemente mediante un efecto sinrgico con otros

componentes presentes (Burt, 2004).

Los antimicrobianos naturales actan sinrgicamente con un gran nmero de

mtodos de preservacin: pH bajo, baja actividad de agua del alimento, presencia

19

de agentes quelantes, calor leve, presiones moderadas, pulsos elctricos aunque

no todos se han investigado en productos alimenticios (Burt, 2004).

Posiblemente el rea de aplicacin ms interesante de los antimicrobianos

naturales como antibacterianos es en la reduccin e inhibicin del crecimiento de

microorganismos patgenos como E.coli Salmonella, B.cereus y L.monocytogenes

(Burt, 2004).

El uso de los antimicrobianos naturales por parte de los consumidores se espera

que incremente en el futuro gracias al aumento de los consumidores verdes los

cuales estimulan el uso y desarrollo de productos derivados de plantas, as como

tambin la medicina es cada vez ms receptiva al uso de antimicrobianos y otros

frmacos derivados de las plantas (Burt, 2004; Cowan, 1999).

2.2.1 CACAO

Cacao (Theobroma cacao) tiene varios usos en la industria, siendo el mayor de

estos la produccin de chocolate, y con menor impacto el uso como aromatizante.

Los componentes con accin antibacteriana ms importantes del cacao son las

antocianinas y flavonoides, estos ltimos han demostrado tener propiedades

antioxidantes (Busta et al, 1968). Los flavonoides aportan varios beneficios a la

salud como, baja tasa de mortalidad cardiovascular, papel protector contra

enfermedades coronarias, eliminacin de radicales libres derivados del oxigeno y

de nitrgeno, quelacin de metales de transicin (hierro, cobre), estudios in Vitro

han demostrado que tambin poseen propiedades antiinflamatorias, antialrgicas,

antivirales, anticancergenas (Keen et al, 2005; Nijveldt, 2001). El CocoanOX

12% (CCX) es cacao en polvo; es un compuesto de alta biodisponibilidad y

garantiza contener al menos 12% de polifenoles en su composicin.

2.2.2 COMPOSICIN DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES

20

Las plantas tienen una capacidad casi ilimitada para sintetizar sustancias

aromticas, la mayora de las cuales son fenoles sus derivados. La mayora son

metabolitos secundarios, en muchos casos estos sirven como mecanismo de

defensa vegetal contra la depredacin por microorganismos, insectos y

herbvoros; algunos de ellos como terpenoides (dan el olor a la planta), quinonas y

taninos (pigmentacin de las plantas). Muchos de los compuestos son

responsables del sabor de la planta, y algunas de estas son utilizadas por el

hombre para dar sabor y aroma. Algunos de los compuestos ms simples constan

de un sustituto del anillo fenlico (Cowan, 1999).

Los componentes mayoritarios de algunos antimicrobianos naturales son: aldehdo

cinnamic y eugenol en canela (Valero et al, 2003), antocianinas y otros

componentes en el cacao (Busta et al, 1968), el ans consta de 85% de anothole

como ingrediente activo, as como tambin de eugenol, metilchavicol,

anisaldehyde y estragol (Ciftic et al, 2005), la vainilla tiene como componente

ms abundante a la vainillina, as como tambin sustancias voltiles que son las

responsables de su aroma, phydroxybenzoic, cido p-hidroxibenzladehido, cido

vainillic, alcohol p-hydroxybenzyl y alcohol vanillyl (Mao et al, 2002).

2.2.3 MECANISMO DE INACTIVACIN MICROBIANA Y ENZIMATICA POR ANTIMICROBIANOS NATURALES

Los antimicrobianos naturales estn compuestos por diferentes grupos qumicos,

lo ms probable es que sus propiedades antibacterianas no se deban a un solo

mecanismo sino a la mezcla de varios de los mismos los cuales tienen diferentes

sitios de actuacin en la clula bacteriana. Se conoce que los antimicrobianos

naturales poseen fenoles y estos la presencia de grupos hidroxilo; estos

componentes a su vez poseen fuertes propiedades antibacteriales contra

microorganismos patgenos. La posicin del grupo hidroxilo en los anillos

fenlicos no afecta su actividad antibacterial. Algunos autores han encontrado que

los fenoles con estado de oxidacin ms alto aumentan su poder antibacterial

(Cowan; 1999; Burt, 2004).

21

El modo de accin de los antimicrobianos naturales es similar al de otros

compuestos fenlicos; los sitios de accin de estos en la clula bacteriana son:

degradacin de la pared celular dao en la membrana citoplasmtica,

permeabilizacin de la membrana celular, dao en las protenas de membrana,

perdida del contenido intercelular al exterior, coagulacin del citoplasma y

perdida de la fuerza motriz de protones. Todos estos mecanismos de inactivacin

no actan independientemente; algunos afectan a la clula bacteriana como

consecuencia del dao anteriormente producido por otro mecanismo de

inhibicin. La estructura qumica de cada antimicrobiano natural afecta en su

modo de accin y actividad antibacteriana (Burt, 2004).

Los diferentes componentes de los antimicrobianos naturales tambin parecen

tener accin sobre las protenas presentes en el citoplasma, las enzimas envueltas

en la regulacin de la energa y en la sntesis de compuestos estructurales;

afectando tambin la unin de las protenas, logrando tambin la inhibicin de

enzimas por la oxidacin de compuestos, posiblemente a travs de la reaccin con

los grupos sulfhdrilo por medio de interacciones no especificas con las

protenas. Enzimas como la ATPasa se localiza en el citoplasma de la membrana

celular y en el borde de las molculas lipidias, por lo cual se ve inhibida por la

accin de los antimicrobianos naturales (Cowan; 1999; Burt, 2004).

La actividad antibacterial de los antimicrobianos naturales vara de acuerdo con el

tipo de microorganismo y se ve influenciada por la temperatura de

almacenamiento del alimento. Las bacterias Gram positivas son generalmente ms

sensibles a los antimicrobianos naturales que las Gram negativas. Se ha reportado

que altas concentraciones de antimicrobianos naturales prolongan

considerablemente la fase exponencial de los microorganismos como B.cereus

logran su inhibicin. Se ha encontrado que el aceite de canela, es efectivo en la

inhibicin de B.cereus (Valero et al, 2003; Burt, 2004).

Dependiendo del tipo de material vegetal utilizado, en trminos de su naturaleza

(especias, extracto aceite esencial), el origen (pas de origen, altitud a la que

22

crece, temporada de cosecha), el proceso de produccin, grado de pureza y su

conservacin, ayudan a determinar la presencia y concentracin de sustancias

antimicrobianas en el producto final (Valero et al, 2003).

2.2.4 EFECTO SINERGICO DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES Y NUEVAS TECNOLOGAS DE CONSERVACIN

ALIMENTARIA

El uso de antimicrobianos naturales con otra tcnica de conservacin de alimentos

da grandes beneficios de cada tcnica reduciendo el tiempo y la cantidad de cada

uno. Por esta razn, la aplicacin de temperaturas moderadas, tratamiento con

HHP y PEF y/ la preservacin de los productos alimenticios en fri juegan un

papel importante en la inhibicin de microorganismos (Valero et al, 2003).

Desde que se conoce que las HHP causan dao en la membrana celular, se sugiere

que esta tecnologa y la adicin de antimicrobianos naturales tienen el mismo

rgano blanco en las clulas bacterias, obtenindose as un efecto sinrgico. El

timol y el carvacol muestran un efecto sinrgico con el tratamiento de altas

presiones. Obtenindose reducciones de L.monocytogenes con 300MPa y

3mmol/L de timol carvacol (Burt, 2004).

La presencia de cacao y calor en el medio aumentan su efecto de inactivacin

(sinergismo), pero la presencia de calor no es esencial para el efecto letal del

cacao (Busta et al, 1968).

El efecto sinrgico puede ser explotado para maximizar la actividad antibacterial

de los antimicrobianos naturales y minimizar de esta manera su concentracin

(Burt, 2004).

2.2.5 EFECTO DE LA ADICIN DE ANTIMICROBIANOS NATURALES EN LOS ALIMENTOS

23

Generalmente se asume que altas concentraciones de lpidos y/ protenas en los

alimentos protegen a las bacterias de la accin antibacterial de los antimicrobianos

naturales, contrariamente una concentracin alta de agua y/ sal facilita la accin

antibacteriana. La estructura fsica del alimento puede limitar la accin

antibacterial de los antimicrobianos naturales. Se ha comprobado que se requieren

concentraciones mayores de los antimicrobianos naturales cuando se adicionan a

los alimentos, para generar el mismo efecto antimicrobiano que en ensayos in

vitro. Por ejemplo, para lograr el efecto antimicrobiano en leche semi desnatada se

requiere el doble de concentracin que en ensayos in vitro. Este efecto puede ser

debido a que los alimentos poseen ms nutrientes que el medio de cultivo y por tal

razn permite que las clulas bacterianas daadas reparen su dao en menos

tiempo; pero no nicamente actan las propiedades intrnsecas (contenido de

grasas, protenas, concentracin de agua, antioxidantes, preservativos, pH, sal y

otros aditivos) del alimento en la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos

naturales, las caractersticas extrnsecas (temperatura, empaque y las

caractersticas del microorganismo) son determinantes (Burt, 2004).

Generalmente, la susceptibilidad de las bacterias al efecto antibacteriano de los

antimicrobianos naturales se incrementa con un pH bajo del alimento, temperatura

de almacenamiento y la concentracin de oxigeno presente (Burt, 2004).

Los efectos organolpticos se pueden limitar, seleccionando el tipo de

antimicrobiano natural de acuerdo con el tipo de alimento, para as no cambiar el

aroma sabor original del mismo (Burt, 2004).

2.2.6 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES

2.2.6.1 VENTAJAS DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES

9 La adicin de antimicrobianos naturales prolonga la fase exponencial de muchos microorganismos patgenos y alteradores.

24

9 Los antimicrobianos naturales pueden realzar el aroma de los alimentos.

9 El tratamiento con antimicrobianos naturales acta sinrgicamente con otras tecnologas ya existentes como el tratamiento por calor, o nuevas

tecnologas como PEF y HHP, para obtener una mayor inactivacin

microbiolgica con menores concentraciones y tiempos de tratamiento.

2.2.6.2 DESVENTAJAS DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES

8 Su modo de accin aun no esta completamente claro.

8 Si la composicin del alimento es compleja se limitara su poder antimicrobiano.

8 En algunos casos, se aumenta la concentracin de antimicrobianos naturales en los alimentos para lograr la misma inhibicin que en ensayos

in vitro.

2.3 BEBIDA MEZCLA DE LECHE Y HUEVO

2.3.1 HUEVO LQUIDO

El huevo es un alimento de gran valor nutritivo que de forma natural se encuentra

protegido de la contaminacin exterior gracias a su cscara (Instituto Estudios del

Huevo, 2004). A pesar de ello en ocasiones se ve involucrado en las

toxiinfecciones alimentaras las cuales presentan una incidencia preocupante en

cuanto a su repercusin global sobre la salud pblica. Los datos epidemiolgicos

relativos a los brotes de toxiinfecciones alimentaras registrados durante los

ltimos aos ponen de relieve una elevada frecuencia de los originados por la

ingestin de alimentos de consumo inmediato que contienen huevo (Instituto

Estudios del Huevo, 2004).

25

Segn el informe elaborado por el Centro Nacional de Epidemiologa entre los

aos 1998 al 2001, el 38.5% de los brotes alimentarios se relacionan con el

consumo de huevo y sus derivados, de los cuales el 85.5% se asociaron con la

salmonelosis. El principal factor que contribuye a estos brotes es la inadecuada

temperatura de conservacin de los alimentos, entre otros factores se destacan, el

consumo de alimentos crudos y la preparacin con antelacin. El hogar con una

frecuencia superior al 59% es el lugar donde ocurren la mayora de los brotes

(Figura 2.11) (Instituto Estudios del Huevo, 2004)

Figura 2.11. Brotes de enfermedades transmitidas por el huevo y sus

derivados. Espaa (1998-2001) (Instituto Estudios del Huevo, 2004)

El huevo cuenta con barreras fsicas y qumicas que lo protegen de la

contaminacin por microorganismos:

26

La cutcula es la capa compuesta de queratina que recubre la cscara de acta a modo de tapn sellante de sus poros. Es una excelente barrera frente a la

prdida de humedad del huevo y frente a la entrada de microorganismos.

(Instituto Estudios del Huevo, 2004)

La cscara est compuesta por sales de carbonato clcico, fosfato clcico y protenas. Sus miles de poros permiten el intercambio gaseoso con el exterior.

(Instituto Estudios del Huevo, 2004)

El albumen o clara formada por protenas capaces de impedir la multiplicacin de los microorganismos invasores mediante diferentes mecanismos de accin,

adems su viscosidad dificulta el movimiento de las bacterias. La clara

contiene, ovoalbmina (55% de la protena de la clara), lecitina, lisozima, la

cual es un conservante natural por su actividad antimicrobiana; es importante

resaltar que el efecto antimicrobiano de la lisozima y de la ovoalbmina

desaparece cuando la clara se mezcla con la yema del huevo(Instituto Estudios

del Huevo, 2004)

Un gran nmero de industrias utilizan el huevo para elaborar sus productos en el

sector de alimentacin humana. El huevo aporta adems de su valor nutritivo, una

amplia gama de propiedades funcionales que son necesarias para los procesos de

fabricacin de muchos alimentos (Lee et al, 1999; Instituto Estudios del Huevo,

2004).La produccin y comercializacin de productos derivados del huevo ha

progresado de forma importante en los ltimos aos. Las razones de este

desarrollo son variadas, por un lado, la evolucin de la industria alimentaria, para

responder al creciente consumo de platos precocinados, que cada vez demanda

materias primas ms fciles de manipular y adecuadas a su proceso productivo,

evitando las complicaciones de manejar las cscaras y el huevo crudo. Por otra

parte, este desarrollo tambin se ha debido a la prohibicin del uso de huevo

fresco en la restauracin colectiva, para cualquier alimento cocinado a una

temperatura inferior a 75C (Instituto Estudios del Huevo, 2004).

Para la industria alimentaria los ovoproductos ofrecen algunas ventajas frente al

huevo en cscara:

27

Mayor versatilidad Fcil empleo y dosificacin Eliminacin de los residuos que supondran las cscaras Mayor seguridad bacteriolgica Manipulacin ms sencilla: fcil almacenamiento, ahorro de tiempo y

de mano de obra

Facilita la distribucin y el comercio internacional

El ovoproducto que ms se utiliza en la hostelera, restauracin colectiva y en la

industria alimentaria es el huevo lquido pasteurizado. Aproximadamente el 85%

de la produccin de huevos en Espaa se dirige al consumo humano directo como

huevo fresco, y el 15% restante est destinado a la industria de fabricacin de

ovoproductos, sobre todo industrias alimentarias (Instituto Estudios del Huevo,

2004).

El huevo lquido se pasteuriza a 60C por 3 minutos para obtener un producto

estable y libre de microorganismos. La pasteurizacin por calor es efectiva frente

a casi todos los microorganismos pero no frente a microorganismos termfilos

esporulados; adems esta tiene efectos negativos frente a la calidad y cantidad del

alimento tratado, en este caso huevo lquido. La pasteurizacin del huevo lquido

genera un descenso en la viscosidad (Miranda, 1999; Lee et al, 2001; Lee et al,

1999). Someter el huevo lquido a altas temperaturas (60-68C) reduce la

capacidad espumante del huevo. Varios mtodo alternativos a la pasteurizacin

por calor se estn estudiando como el uso de pulsos elctricos de alta intensidad

(PEF), el cual inactiva a los microorganismos patgenos y alteradores, as como

tambin el uso de ultrasonido, uso de agentes antimicrobianos y las HHP, estas

ltimas dan un tratamiento homogneo a todo el alimento en su envase

inactivando a los microorganismos sin generar cambios fsicos del alimento

(Miranda et al, 1999; Lee et al, 2001; Lee et al, 1999). El huevo lquido acta

como un importante factor para determinar el proceso de tratamiento debido a su

fcil desnaturalizacin de protenas y puede enmascarar a los microorganismos, de

esta manera hacer ms difcil su inactivacin (Lee et al, 2001).

28

La vida til del huevo lquido esta determinada por los microorganismos

alteradores que contiene: Micrococcus, Staphylococcus, Arthrobacter, Bacillus,

Pseudomonas spp y coliformes. En el huevo lquido pueden crecer

microorganismos patgenos como: Salmonellae spp y Listeria monocytogenes, as

como tambin algunos gneros resistentes a la pasteurizacin como: Alcaligenes,

Bacillus, Proteus, Escherichia, Pseudomonas y cocos Gram positivos (Miranda et

al, 1999; Lee et al, 2001; Lee et al, 1999). La presencia de coliformes en el huevo

lquido es un indicador de malas condiciones del proceso de produccin del

mismo y tambin indica una alta probabilidad de la presencia de Salmonella

(Nieto, 2003).

Las caractersticas intrnsecas del alimento son determinantes en el desarrollo de

las contaminaciones por la proliferacin de bacterias. Los alimentos de alto

contenido proteico, como la carne, el pescado, los huevos, la leche y derivados,

son alimentos considerados de alto riesgo (Figura 2.12).

Figura 2.12. Relacin de brotes de enfermedades transmitidas por alimentos y

alimentos implicados en Espaa (1994-2003)

29

Es interesante sealar, en relacin con la evolucin del consumo de huevos en los

pases desarrollados, el auge de la alimentacin fcil como resultado de

determinadas tendencias sociales. Como resultado de ello, los ovoproductos estn

sustituyendo cada vez ms a los huevos con cscara, tanto en los hogares como en

la restauracin colectiva (Instituto Estudios del Huevo, 2004).

2.3.1.1 MICROORGANISMOS ALTERADORES Y PATGENOS DEL HUEVO LQUIDO

La flora del huevo lquido est constituida por muchos tipos de bacterias Gram

positivas y Gram negativas que provienen principalmente de cscaras

contaminadas con heces y otros materiales, de la existencia en el lote en cuestin

de huevos contaminados del estado de limpieza, de la maquinaria y utensilios

empleados as como de las conducciones, bombas, filtros, recipientes, batidoras o

tanques de almacenamiento (Instituto Estudios del Huevo, 2004).

La simple presencia de un huevo deteriorado puede contaminar la instalacin de

rotura y aadir millones de bacterias al huevo lquido. La utilizacin para la

elaboracin de huevo lquido de huevos con la cscara rota incrementa el grado de

contaminacin por Salmonellas, otros microorganismos patgenos y

microorganismos causantes de alteracin (Instituto Estudios del Huevo, 2004;

Amiali, 2005).

Janssen y Mulder (1971), hallaron que el huevo lquido elaborado a partir de

huevos rechazados de incubacin, contena una gran variedad de microorganismos

pertenecientes a la familia Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae,

Micrococcaceae y Pseudomonadaceae (Instituto Estudios del Huevo, 2004;

Amiali, 2005).

2.3.2 LECHE

La leche es un lquido de composicin y estructura compleja con un pH cercano a

la neutralidad. La materia grasa se encuentra en emulsin, las protenas

constituyen una suspensin, mientras que los restantes componentes (lactosa,

30

otras sustancias nitrogenadas, minerales, entre otros) estn disueltos (Taverna et

al, 2001).

La leche es un excelente medio de cultivo para muchos microorganismos, cuyo

desarrollo ocasiona una prdida de calidad pudiendo incluso llegar a niveles que

la inutilicen para su consumo transformacin. El objetivo principal de la

pasteurizacin de la leche es la eliminacin de microorganismos patgenos que

sta pudiese contener, un propsito secundario es la destruccin de otros

microorganismos alteradores para salvaguardar la calidad del producto (Buffa,

2003).

El tratamiento de pasteurizacin que se utiliza con mayor frecuencia en la

industria consiste en un calentamiento de la leche a 72C durante 15s, denominada

por sus siglas en ingls HTST (High temperatura short time) (Buffa, 2003).

La leche contiene ms de sesenta enzimas endgenas, algunas de las cuales tienen

importantes aplicaciones tecnolgicas relacionadas con el flavor, la textura y la

estabilidad de los productos lcteos (Buffa, 2003). La mayora de la grasa de la

leche (98%) est constituida por triglicridos. La fraccin nitrogenada de la leche

est compuesta por dos grandes grupos: las protenas y el nitrgeno no proteico.

La lactosa es un disacrido compuesto por glucosa y galactosa. Los minerales

representan una pequea fraccin de los slidos de la leche. Su concentracin es

de alrededor 0,7% de la materia seca de la leche (Taverna et al, 2001).

La leche contiene una gran cantidad de componentes en muy pequeas

concentraciones (gases disueltos, enzimas, entre otros) muchos de los cuales

tienen relevancia nutricional, en los procesos de transformacin y/o de

degradacin de propiedades qumicas y organolpticas de la leche y productos.

La leche es una fuente importante de vitaminas para el hombre. Las hidrosolubles

(vitaminas del grupo B y C) estn presentes en la fase acuosa. La concentracin es

poco variable ya que provienen de la biosntesis de las bacterias del rumen. En

31

cuanto a las liposolubles (A,E y D) estn asociadas a la materia grasa y varan,

entre otros aspectos, segn el tipo de alimentacin (Taverna et al, 2001).

2.3.2.1 MICROORGANISMOS ALTERADORES Y PATGENOS DE LA

LECHE

En el proceso de pasteurizacin de la leche los microorganismos patgenos, los

coliformes y la mayora de los psicrfilos son destruidos, no as un gran grupo de

mesfilos termorresistentes, conocidos todos ellos como termodricos. Los ms

frecuentes en la leche pertenecen a especies del gnero Micrococcus sp, algunos

enterococcos, aerobios formadores de esporas (Bacillus subtilis y Bacillus

cereus) y algunos lactobacilos (Lactobacillus casei, entre otros). Es importante

resaltar que la pasteurizacin no elimina totalmente la microbiota endgena de la

leche y est puede desarrollarse posteriormente (Buffa, 2003).

Bacillus cereus es uno de los microorganismos ms importantes encontrado en la

leche pasteurizada y los productos derivados de la leche (Pirttijrvi et al, 1998).

2.4 Bacillus cereus

Los datos epidemiolgicos muestran como Clostridium botulinum, Clostridium

perfringens, Staphilococcus aureus, Salmonella spp, Bacillus cereus y

Escherichia coli entre otros, se convierten en la causa de la gran mayora de las

infecciones e intoxicaciones que se producen por la ingesta de alimentos.

Las especies de Bacillus se encuentran comnmente deteriorando una amplia

gama de productos, dentro de los cuales se encuentran la leche y sus derivados,

productos crnicos, productos de panadera, purs de vegetales, productos de

pasta, pur de papas, ovoproductos, hiervas y especias (Abdou, 2007).

Bacillus cereus, pertenece a la familia Bacillacea, la cual contiene una diversidad

de bacterias formadoras de esporas, incluyendo desde aerobios estrictos hasta

anaerobios obligados, cocos y bacilos, tanto psicrfilos como termfilos. Es un

microorganismo Gram positivo mvil en los cultivos jvenes y a medida que

32

envejece puede verse como Gram variable o Gram negativo. Las esporas pueden

estar dentro de la pared bacteriana o pueden deformar la pared, estas son aerobias,

son altamente resistentes al tratamiento con temperatura. La termoresistencia de

los microorganismos esporoformadores y las propiedades sicotroficas de las

especies de Bacillus son factores determinantes para los procesos de produccin y

para determinan el tiempo de vida til de los alimentos, el cual acortan (Abdou,

2007).

Su temperatura de crecimiento mnima esta entre 15 a 20C y la mxima es entre

40 a 45C con un ptimo de 37C.

Son saprofitos ampliamente distribuidos en el ambiente natural en suelos de todo

tipo, y puede ser encontrado en el polvo y en el aire, por lo tanto tiene

considerable oportunidad para estar presente en o sobre los alimentos. En la

industria alimentara, la contaminacin producida por Bacillus se genera

principalmente desde el suelo, y los procesos en los que interviene el agua

(Abdou, 2007). Las esporas fcilmente sobreviven la distribucin en polvos y

aerosoles siendo vehiculizadas desde estos lugares a otros hbitats. Los alimentos

secos como condimentos, leche en polvo y harinas pueden estar contaminados con

esporas.

Este microorganismo produce dos enterotoxinas durante su crecimiento

exponencial:

1. Toxina diarreica. El sndrome diarreico por el contrario, est producido por la

ingestin de alimentos inadecuadamente refrigerados. Resulta de la esporulacin

del organismo in vivo y de la produccin de una enterotoxina preformada y

termolbil (Pirttijrvi et al, 1998; Granum et al, 1997).

2. Toxina Emtica. El sndrome emtico est producido por una toxina

preformada y termoestable. Se asocia frecuentemente con arroz frito (Pirttijrvi et

al, 1998; Granum et al, 1997).

33

Los sntomas de la toxiinfeccin tienen dos formas de presentacin con presencia

de diarrea, dolores abdominales y vmitos. Su periodo de incubacin vara de 4 a

16 horas luego de la ingesta del alimento contaminado (Granum et al, 1997).

2.5 MODELOS MATEMTICOS PREDICTIVOS

Habitualmente, para el estudio de la resistencia microbiana a distintos agentes

letales se utilizan las denominadas curvas de supervivencia en las que se

representa el logaritmo decimal del nmero de supervivientes frente al tiempo de

tratamiento. Estas grficas se suelen describir mediante distintos modelos

matemticos a partir de los cuales se obtienen diferentes parmetros que permiten

cuantificar y predecir la resistencia bacteriana.

La obtencin de modelos y parmetros cinticos son bsicos para el desarrollo de

nuevos procesos de conservacin de alimentos. Su aplicacin directa en la

industria se aprovecha para optimizar procesos y mejorar la seguridad

microbiolgica de los alimentos, as como para implementar planes de anlisis de

peligros y puntos de control crticos (APPCC).

2.5.1 MODELO DE BIGELOW

Los modelos cinticos clsicos asumen una relacin de primer orden entre la

poblacin microbiana y la intensidad de tratamiento. El modelo desarrollado por

Bigelow, Ball y Stumbo (Stumbo, 1973) (Ecuacin 2.4) se ha usado

principalmente para explicar las curvas de supervivencia debidas al tratamiento

trmico:

Log S = Dt Ecuacin 2.4

donde S es la fraccin de supervivientes calculada como la fraccin entre el

nmero de microorganismos vivos tras un tratamiento especifico y el numero

34

inicial de microorganismos; D es el tiempo de reduccin decimal definido como

el tiempo requerido para reducir un ciclo logartmico la concentracin de

microorganismos (s) (Figura 2.13); y t es el tiempo de tratamiento (s). El valor de

D o tiempo de reduccin decimal se calcula a partir de la pendiente de la recta.

Figura 2.13. Curva de supervivencia de esporas de B. stearothermophilus a

temperatura constante (115 C).

En el caso del tratamiento por PEF existe la evidencia de la aparicin de varios

tipos de desviacin del modelo tradicional (Figura 2.14), con la aparicin de

hombros y colas en las curvas de supervivencia. Por lo tanto se debera evaluar la

validez del modelo de Bigelow para interpretar datos cinticos de inactivacin por

PEF.

35

Figura 2.14. Ejemplos de curvas de supervivencia no lineales.

2.5.2 MODELO DE WEIBULL

La distribucin de Weibull se ha aplicado en la industria mecnica para inquirir el

tiempo de fallo de un determinado componente. Este modelo consiste en una

distribucin de frecuencias que considera al microorganismo como una poblacin,

donde cada individuo tiene una resistencia al tratamiento, por lo tanto las curvas

de inactivacin representan la distribucin de la resistencia del conjunto de la

poblacin al tratamiento. Bajo esta perspectiva es ms fcil explicar que no exista

una relacin lineal entre el tiempo de tratamiento y la muerte del microorganismo.

Aparte de su sencillez, puede interpretar curvas con hombros y colas, y lneas

rectas. Esta distribucin ha servido para describir curvas de inactivacin por calor

y por PEF (Rodrigo et al., 2003, Sampedro et al., 2006) (Ecuacin 2.5).

( )

=

n

attS exp Ecuacin 2.5

36

donde S es la fraccin de supervivientes, t es el tiempo de tratamiento expresado

en s, a es el parmetro de escala expresado en s relacionado con la intensidad del tratamiento y n es el parmetro de forma, cuyo valor depende de la forma de la

curva de supervivencia. Cuando el valor de n1, las

curvas de supervivencia presentan hombros indicando que durante las primeras

condiciones del tratamiento las clulas son resistentes al tratamiento y conforme

aumentamos la intensidad del tratamiento se produce un aumento de la

inactivacin. En el caso que el valor de n=1 la probabilidad que el

microorganismo muera no depende del tiempo de tratamiento, en otras palabras,

cada clula es igual de sensible al tratamiento sin importar lo que dure el mismo.

Otro de los parmetros utilizados en el modelo de Weibull es el tiempo crtico

)(tcw que se puede definir como el tiempo donde se produce la mayor muerte del

microorganismo tras el tratamiento y se puede expresar con la siguiente ecuacin:

)1(* 1+= batcw Ecuacin 2.6 donde a y b son los parmetros de la ecuacin 1.4 y es la funcin gamma.

2.5.3 MODELO DE BARANYI

El modelo de Baranyi fue desarrollado originalmente para curvas de crecimiento

microbiano (Baranyi et al., 1993; Baranyi et al., 1994), sin embargo Xiong et al.,

1999 adaptaron el modelo a las curvas de supervivencia, obteniendo la siguiente

ecuacin:

))1(log(log ))((0

max tBtkBB eqqN

N += Ecuacin 2.7

siendo

37

)3

1arctan33

2arctan3)(ln21(

3)( 22

2

++++=

rrt

trtrtrrtB Ecuacin 2.8

Este modelo se adapta bien a curvas de supervivencia sigmoidales, donde qB

puede ser usado como indicador de la existencia de colas en las curvas de

supervivencia. El parmetro k

B

max es el ndice de muerte mximo y puede ser

considerado como una constante en la fase lineal de la curva de supervivencia.

B(t) es una funcin que explica la fase lag (hombro) de la curva y viene definida

por el parmetro r.

Este modelo tambin se adapta a curvas de supervivencia no sigmoidales. En caso

de la no existencia de colas en las curvas (qB=0), la Ecuacin 1.8 se transformara

en:

B

min0

)()log(D

tBtNN = Ecuacin 2.9

donde Dmin=2.303/kmax., siendo Dmin el tiempo de reduccin decimal. Como kmax

se puede considerar como una aproximacin del ndice de muerte para la fase

lineal de la curva, Dmin se define como el tiempo mnimo requerido para disminuir

un ciclo logartmico la poblacin de microorganismos a una temperatura de

referencia. En caso de no presentar la curva fase lag, entonces el modelo se puede

simplificar a un modelo cintico lineal de primer orden:

Dt

NN =)log(

0

Ecuacin 2.10

donde D es el tiempo de reduccin decimal.

38

2.6 BONDAD DEL AJUSTE

Los modelos se validan por medio de tres replicas usando el parmetro Accuracy

factor (Af). Este parmetro nos da una idea del ajuste del modelo a la curva de

supervivencia del microorganismo y se define como:

nobservadopredichoLog

Af = )/(10 Ecuacin 2.11 donde n es el nmero de valores observados, los valores predicho y observado

hacen referencia a la fraccin de supervivientes. Los valores de Af cercanos a 1

nos indican un mejor ajuste del modelo a los valores experimentales.

El Mean Square Error (MSE) se calcul utilizando la siguiente ecuacin:

pnobservadopredicho

MSE = 2)( Ecuacin 2.12

donde n es el nmero de valores observados, los valores predicho y observado

hacen referencia a la fraccin de supervivientes y p es el numero de parmetros

estimados por el modelo. Los valores de MSE cercanos a 0 nos indican un mejor

ajuste del modelo a los valores experimentales.

2.7 CLCULO DE LA ENERGA SUMINISTRADA EN EL PROCESO

Es necesario estudiar la energa consumida en cada uno de los tratamientos, para

determinar el efecto directo sobre microorganismos y enzimas en cada uno de los

casos mediante la siguiente ecuacin:

2)/( EmlJQ = t Ecuacin 2.13

donde E es la intensidad de campo elctrico (kV/cm), es la conductividad

elctrica del producto para cada una de las temperaturas de proceso (mS/cm) y t es

el tiempo de tratamiento (s).

39

3 FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN

3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA

Debido al alto contenido de nutrientes en la nueva bebida, el desarrollo de

microorganismos patgenos es alto generando as un problema evidente de

salud pblica. Por esta razn es de suma importancia conocer el nivel de

inactivacin y el control durante el almacenamiento de un microorganismo

patgeno, presente en las dos materias primas con las que se realiza la nueva

bebida, como consecuencia del uso combinado de tecnologas emergentes, como

lo son los PEF y los antimicrobianos naturales para su control.

3.2 PREGUNTAS DE INVESTIGACIN

Evaluacin de la capacidad de los procesos no trmicos solos o combinados con

antimicrobianos naturales, para conseguir la inocuidad alimentaria de una bebida a

base de leche y huevo lquido.

Las preguntas a responder seran:

1) Cunto microorganismo se puede inactivar en las condiciones que permita

el alimento.

2) Cul es la cintica de inactivacin del microorganismo

3) Si existe un efecto sinrgico entre las tecnologas no trmicas y el

antimicrobiano natural

4) Cul sera la vida til de dicho alimento

3.3 JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN

Tradicionalmente los alimentos han sido preservados por calor, estos mtodos son

efectivos en la inactivacin de microorganismos patgenos y alteradores, pero

producen un gran impacto sobre las caractersticas nutricionales y organolpticas

de los alimentos tratados; lo que ha generado una inquietud en la industria

40

agroalimentaria que la ha llevado a explorar nuevas tecnologas de conservacin

no trmicas que permitan armonizar inocuidad alimentaria y calidad nutricional

de los alimentos elaborados.

Los Pulsos Elctricos de Alta Intensidad (PEF) solos o combinados con

antimicrobianos naturales, son tecnologas de conservacin no trmicas que

podran aunar ambos requisitos, inocuidad y calidad nutricional.

En el mercado, existen distintos tipos de bebidas que pretenden proporcionar al

consumidor unos niveles de nutrientes adecuados mientras que mantienen la

inocuidad. Las bebidas de este tipo suelen ser combinaciones de leche con zumo,

huevo con zumo, partiendo de productos tratados por calor. En estos casos las

tecnologas no trmicas que se proponen podran jugar un papel importante puesto

que al ser no trmicas daran valor aadido al producto final ya que permitiran

una mayor retencin de los nutrientes que se encuentran en las materias primas

frescas. Un buen candidato para este tipo de estudios seria la mezcla de leche y

huevo, junto con algn tipo de antimicrobiano natural que permita el control de

los microorganismos patgenos que sobrevivan a los tratamientos proporcionados

mediante ambas tecnologas emergentes.

Los resultados del estudio, son de un elevado nivel cientfico-tecnolgico, ya que

adems de proponer una bebida con un elevado valor nutritivo, partiendo de

materias primas de primera necesidad, se obtendrn datos del potencial de estas

tecnologas emergentes para conseguir la esta

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