UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC FACULTAD DE INGENIERA ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL DETERMINACIN DE PARMETROS PTIMOS DE EXTRACCIN ALCALINA PARA LA OBTENCIN DE AISLADO PROTEICO A PARTIR DE TARWI (Lupinus mutabilis) TESIS PARA OPTAR EL TTULO DE INGENIERO AGROINDUSTRIAL WILSON URRUTIA GUTIRREZ Abancay, Diciembre del 2010 P E R U DETERMINACIN DE PARMETROS PTIMOS DE EXTRACCIN ALCALINA PARA LA OBTENCIN DE AISLADO PROTEICO A PARTIR DE TARWI (Lupinus mutabilis) UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURMAC FACULTAD DE INGENIERA ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL Jurado calificador integrado por: .. Ing. David Fernando Palomino Quispe Presidente .. Ing. Alfredo Fernndez Ayma Ing. Rogelio Sillo Sillo JuradoJurado Ing. Luis Ricardo Paredes Quiroz Asesor DEDICATORIA Dedico este trabajo a toda mi familia, enespecialamiqueridamadre VisitacinGutirrezAndaymis queridos hermanos Germn.Pascual, Charles,Zunilda,FreddyyJavier, quienesmebrindaronapoyo incondicionaldurantetodami formacin profesional. AGRADECIMIENTOS Agradezco en primerlugar a Dios por darme oportunidades enla vida,a laUniversidadNacionalMicaelaBastidasdeApurmac(UNAMBA)por brindarme los medios necesarios para llevar a cabo esta investigacin. AtodoslosjefesyencargadosdelaboratoriodelaEscuelaAcadmico Profesional de Ingeniera Agroindustrial de la UNAMBA, por haberme brindado lasfacilidadesylosmediosnecesariosparalosexperimentosyanlisis requeridos durante la investigacin. ExpresomisincerosagradecimientosalIng.LuisRicardoParedes Quiroz,asesordeestainvestigacin,deigualmodoalIng.FernandoPalomino Quispe,Ing.AlfredoFernndezAymayalIng.RogelioSilloSillo,miembros del jurado calificador, por sus valiosas observaciones y aportes. AgradezcoalaDoctoraDagnithLizBejaranoLujnporsuconstante apoyoyorientacineneldesarrollodeestainvestigacin,rescatosu identificacin con quienes hacen investigacin. AlaDoctoraMabelVenturaChuquiere,porbrindarmedetallesypautas muyvaliososparalainvestigacin,queapesardeladistanciafueron imprescindibles para encaminar la ejecucin del proyecto. NDICE DEL CONTENIDO SeccinPgina RESUMEN1 ABSTRACT2 I.INTRODUCCIN3 II. MARCO TERICO5 2.1. ASPECTOS AGROBOTANICOS DEL TARWI 5 2.1.1.Descripcin botnica5 2.1.2.Composicin qumica y valor nutricional8 2.1.3.Aminocidos9 2.1.4.cidos grasos 12 2.1.5.Alcaloides del tarwi14 2.1.5.1. Mtodos de deslupinizado 17 2.2. AISLADO DE PROTENA20 2.2.1.Las protenas 20 A.Definicin20 B.Estructura de las protenas22 C.Clasificacin de las protenas24 D.Propiedades funcionales 27 2.2.2.Importancia del lupino en la produccin de protenas28 2.2.3.Aislamiento de protenas29 2.2.3.1. Mtodos de obtencin de aislado proteico32 2.2.4.Parmetros de obtencin de aislado proteico 41 A.PH de solubilizacin42 B.Temperatura43 C.Relacin harina: solvente45 D.Efecto de la polaridad 46 E.Fuerza inica47 2.2.5.Aplicaciones de aislados proteicos49 III.PARTE EXPERIMENTAL52 3.1. Tiempo y espacio52 3.2. Materia prima52 3.3. Materiales y reactivos53 3.4. Mtodos de anlisis55 3.5. Deslupinizacin y obtencin de harina57 3.6. Optimizacin de la extraccin alcalina 60 3.6.1. Screening60 3.6.2. Escalamiento62 3.6.3. Optimizacin final62 3.7.Obtencin del aislado proteico 65 3.8. Anlisis proximal del aislado proteico67 3.9. Caracterizacin funcional del aislado67 3.10. Anlisis estadstico69 IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES70 4.1.Anlisis proximal del tarwi70 4.2.Anlisis proximal de la harina de tarwi71 4.3.Optimizacin en la extraccin alcalina 72 4.3.1. Screening72 4.3.2. Escalamiento78 4.3.3. Optimizacin de los parmetros de extraccin alcalina78 4.4.Anlisis proximal del aislado 86 4.5.Propiedades funcionales del aislado proteico89 4.6.Rendimiento91 V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES93 5.1.CONCLUSIONES93 5.2.RECOMENDACIONES94 VI. BIBLIOGRAFA95 ANEXOS Y APNDICES103 NDICE DE CUADROS CuadroDescripcinPgina 1Clasificacin taxonmica del tarwi6 2Composicin qumica del tarwi, soya y frijol 8 3 Cmputo de aminocidos de Lupinus mutabilis (variedad semidulce) y Lupinus albus (variedad astra)10 4 Evaluacin biolgica de la calidad de la protena de tarwi (Lupinus mutabilis)11 5 Efecto complementario de la protena del tarwi con diferentes protenas vegetales12 6 Composicin de cidos grasos del aceite de L. mutabilis amargo y semidulce y del L. albus, biovar astra 13 7 Nombres de los principales alcaloides del lupino, formulacin qumica y fuente de origen.15 8 Contenido de alcaloides en lupinos dulces y amargos (%) 15 9 Dosis Mnima Letal (DML) para los alcaloides de lupino multolupa sin tratar16 10Evaluacin de los mtodos de desamargado del tarwi18 11 Prdida de alcaloides y nutrientes durante el deslupinizado por varios mtodos19 12 Papeles funcionales de las protenas alimentarias en los sistemas alimenticios27 13Produccin de protenas por hectrea29 14 Rendimiento y pureza de aislados de soya obtenidos por diferentes mtodos37 15Composicin proximal de los granos de tarwi70 16 Anlisis proximal de la harina deslupinizado y semi-desgrasada de tarwi71 17Efecto del pH de extraccin (PE) en la solubilidad proteica73 18ANOVA del pH de extraccin (PE)73 19 Influencia de la relacin harina: solvente (CH) en la solubilidad75 20ANOVA de la relacin harina: solvente (CH)75 21 Efecto de temperatura de extraccin (TE) en la solubilidad proteica76 22ANOVA de la temperatura de extraccin (TE)77 23 Niveles que fueron evaluados en la optimizacin mediante superficie de respuestas78 24 Plan de experimentos generado para la optimizacin y el resultado de cada corrida79 25 ANOVA de protenas en el aislado para un nivel de confianza del 95%.80 26Valores ptimos de los factores evaluados85 27Anlisis proximal del aislado proteico de tarwi87 28Capacidad de formacin y estabilidad de espuma89 29 Propiedades funcionales del aislado proteico comparado con otros asilados proteicos, expresados en %.90 NDICE DE FIGURAS FiguraDescripcinPgina 1Partes de semilla de lupino 7 2Estructuras de las protenas y aminocido26 3Propiedades funcionales de las protenas28 4Proceso de obtencin de aislado de soja35 5Microscopia electrnica de aislados de soya38 6 Influencia del pH en la extraccin de protenas en el nuez de maran42 7 Influencia de la temperatura en la extraccin de protenas en el nuez de maran44 8 Influencia de la relacin harina: solvente en el porcentaje de solubilizacin proteica de nuez de maran46 9 Influencia del pH en la precipitacin isoelctrica para la recuperacin del aislado proteico de nuez de maran48 10Usos de los concentrados y aislados proteicos51 11Diagrama de flujo de deslupinizado del tarwi58 12Diagrama de flujopara la obtencin de aislado proteico66 13Composicin del tarwi70 14Anlisis proximal de la harina de tarwi72 15 Curva de solubilidad, efecto del pH (Evaluadas a 50 C, harina: Solvente=1:20, tiempo de agitacin=30 min.)73 16 Curvadesolubilidad,efectodelarelacinharina:solvente (Evaluadas a 50 C, pH=9, tiempo de agitacin=30 min.)75 17 Curva de solubilidad, efecto de la temperatura (Evaluadas a pH=9, harina: Solvente=1:30, tiempo de agitacin=30 min.)76 18Grfica de efectos principales80 19Superficie de respuesta tridimensional, CH vs PE81 20Superficie de respuesta, vista superior, CH vs PE81 21Superficie de respuesta tridimensional TE vs PE82 22Superficie de respuesta, vista superior TE vs PE82 23Superficie de respuesta tridimensional TE vs CH83 24Superficie de respuesta, vista superior TE vs CH83 25Diagrama de Pareto de las variables estudiadas84 26Anlisis proximal del aislado proteico87 27Capacidad y estabilidad de espuma del aislado89 1 RESUMEN Enelpresentetrabajodeinvestigacinsehanoptimizadolosparmetrosde extraccinproteicaenmedioalcalino,usandocomomateriaprimalaharina deslupinizada y parcialmente desgrasada de tarwi (Lupinus mutabilis), aprovechando aselaltocontenidoproteicodelaleguminosa.Paraestefinsehausadola metodologadeSuperficiedeRespuestas(SR),bajoelDiseoCompuestoCentral Rotable (DCCR) para la optimizacin. Enlaprimeraetapadelaoptimizacin(Screening)sehandeterminadoque son tres los factores msinfluyentes, el pH (PE), la relacinharina: solvente (CH)y latemperaturadeextraccin(TE),posteriormenteenlaetapadeEscalamientose observqueelefectocurvaturaencontradaenlaetapadeScreeningesmuy significativaporloquesepasdirectamentealasiguienteetapa.Enlaetapade optimizacinsehanencontradolasregionesptimasparacadafactor,siendostas del PE de 8,5 a 10,5; CH abarca de 1:23 y 1:33, mientras la temperatura de extraccin(TE)de36a48C.Sinembargosehanencontradolosvaloresptimosparacada factor(PE=9,3;CH=1:28;TE=43C)conloscualessehaobtenidounaislado proteico rico en protenas. El anlisis proximal de la materia prima indica que sobresale el contenido de protenasylpidos 43,31y 16,83%, mientras que en laharina deslupinizaday semi-desgrasada los resultados fueron 49,87 y 3,23% respectivamente. El aislado obtenido en base a sus parmetros ptimos mostr el siguiente anlisis proximal dehumedad, grasa, protena, ceniza, fibra y carbohidratos de 4,87; 0,61; 92,83; 1,48; 0,39 y 1,12% respectivamente,siendoevidenteelaltocontenidodeprotenas.Laspropiedades funcionalesbsicasdelaisladoobtenido,talescomolacapacidaddeabsorcinde agua,capacidaddeabsorcindeaceiteylacapacidadespumantefueron98,160y 78% respectivamente. En cuanto al rendimiento se ha obtenido valores relativamente bajos(35%),debidosposiblementealascondicionesdeextraccinyrecuperacin proteica.Laconclusinalaquesehallegadoesquelaoptimizacindelos parmetrosdeextraccinalcalina,permitelaobtencindeunaisladoconmsde 92% de protenas y buenas cualidades funcionales. 2 ABSTRACT Inthisresearchworkhavebeenoptimizedtheparametersofprotein extractioninalkalinemedium,usingflourasrawmaterialandpartiallydefatted deslupinizadatarwi(Lupinusmutabilis),takingadvantageofthehighprotein contentofthelegume.TothisendwehaveusedtheResponseSurface Methodology(SR)undertheCentralCompositeRotatableDesign(DCCR)for optimization. Inthefirststageofoptimization(Screening)havedeterminedthatthree factorsaremoreinfluential,thepH(PE),theratioflour:solvent(CH)andthe extraction temperature (TE), later in the process of scaling was observed that the curvature effect found in the screening stage is very significant as it went straight tothenextstage.Intheoptimizationstagehasbeenfoundoptimalregionsfor each factor, these being the PE of 8.5 to 10.5, CH runs from 1:23 and 1:33, while the extraction temperature (TE) of 36 to 48 C. But you havefound the optimal valuesforeachfactor(PE=9.3,CH=1:28;TE =43C)withwhichwehave obtained a protein isolate rich in protein. Proximate analysis of raw materials indicates that excels in protein and fat 43.31and 16.83%, whilein theflourand semi-defatted deslupinizada the results were49.87and3.23%respectively.Theisolateobtainedbasedonoptimal parameters showed the following proximate analysis of moisture, fat, protein, ash, fiber and carbohydrates of 4.87, 0.61, 92.83, 1.48,0.39and 1.12% respectively, evidencing the high protein content. The basic functional properties of the isolate obtained,such as water absorption capacity,oil absorption capacity andfoaming capacitywere98,160and78%respectively.Intermsofperformancehasbeen obtained relatively low values (35%), possibly due to the conditions of extraction and protein recovery.The conclusion reachedis that the optimization of alkaline extractionparameters,allowsobtaininganisolatewithmorethan92%protein and good functional qualities. 3 I.INTRODUCCIN El tarwi (Lupinus mutabilis), es una leguminosa utilizada como alimentos desdelostiemposincaicos,secaracterizaporconteneraltosporcentajesde protenaygrasa,fijarnitrgenoatmosfricoenelsuelo,tenersaboramargo debidoalcontenidodealcaloidesyseradaptableadiversidadesclimticascon mnimas exigencias del suelo. Sinembargoelusodeltarwicomoalimentoestendecadencia, desconocindoselas potencialidadesy posibilidades tecnolgicas que ofrece esta leguminosa.Estopeseaqueenlaactualidadexistenmuchosproblemasde desnutricinymalnutricin,deficienciaproteicaenlosalimentos,elevado crecimiento demogrfico, la escasez y alto costo de las fuentes proteicas de origen animal.Estaproblemticademandaproducirfuentesproteicasdeorigenvegetal queseaneconmicasyaccesibles,unaalternativaeslaproduccindeaislado proteico a partir de tarwi, para lo cual se requiere conocer los parmetros.Elobjetivoprincipaldeestainvestigacinfuedeterminarlosniveles ptimosdelosparmetrosdeextraccinalcalinaquepermitaobteneraislados proteicosricosenprotena,paraellosehaespecificadoelestudioendeterminar losnivelesdelosfactoresenlaquelasolubilidadproteicaesmayor,evaluando los efectos individuales y las interacciones; ubicar las regiones ptimas para cada factor que permita solubilizary recuperar la mayora de las protenas; finalmente realizarelanlisisqumicoproximalyevaluarlaspropiedadesfuncionalesdel aislado obtenido bajo los parmetros ptimos. Lametodologaconsistienlaextraccinalcalinadelaharinasemi-desgrasadaydeslupinizadadetarwi,elcualfuesometidaaagitacinbajouna 4 temperatura,pHyrelacinharina:solventecontrolados(porcadafactorseha evaluado5nivelesmediantediseocompletoalazar),seselecciondosniveles (puntosenlaquelasolubilidadproteicafueronmayores)porcadafactorparala optimizacinmedianteelDiseoCompuestoCentralRotable(DCCR)aplicando superficiederespuestayobtenerlospuntosptimos,laproduccinfinaldel aislado se realiz en base a los parmetros ptimos, el cual fue sometida a anlisis proximal y evaluacin de sus propiedades funcionales. Ellogro de sta optimizacin permitela produccin de aislados proteicos ricos en protena, incluyndose en el mercado un producto con alto valor proteico queayudaasuprimirladesnutricinylamalnutricinenelcamposocial.Enel campo tecnolgico, los aislados se usan para aclarar el color, mejorar la textura de carnedeshuesadadeaves,paraunirpiezasintactasdemsculos,proporcionar texturaalassalchichas,mejoranlafuncionalidaddepatesylatexturadelos productos de panadera, pastas e incluso en tecnologa de quesos, as mismo es un insumo potencial para la formulacin de alimentos. Los antecedentes indican que es posible obtener aislados proteicos a partir deleguminosasycereales,elmtodomsusadoeslasolubilizacinalcalinay precipitacin isoelctrica, usndose la extraccin alcalina a pH comprendido entre 8y12,temperaturasentre25y50Cytiempodeagitacinentre20y60 minutos. Los resultados en cuanto al contenido proteico en porcentaje vara entre 85 a 95% y una digestibilidad de 80 a 90%, esto dependiendo de la materia prima y las condiciones del proceso. 5 II.MARCO TERICO 2.1. ASPECTOS AGROBOTNICOS DEL TARWI El tarwi (Lupinus mutabilis) es una leguminosa almidonosa, sus granos se utilizaenlaalimentacinhumana,conocidocomochochoenelnortede Pery Ecuador, tarwi en el centro del Pery tauri en el sur del Pery Bolivia (chuchus enCochabamba,Bolivia).Estaespecieesparientedeloslupinosoaltramuces originarios delviejomundo que an hoy son cultivados en Europa mediterrnea, especialmenteenEspaaeItalia,peroquetienenunnmerocromosmico diferente. El grano de tarwi es rico en protenas y grasas, su contenido proteico es inclusosuperioraldelasoyaysucontenidoengrasasydemscomponenteses similar (Morn, 2005).Elcultivodeltarwienlasierraselocalizaentrelos2800a3900msnm. Correspondiendoaproximadamenteel20%delreasembradaenlasierranorte entrelosdepartamentosdeCajamarca,LalibertadyAmazonas;el41%dela sierracentralentrelosdepartamentosdeAncash,Hunuco,yunmnimo porcentajeenJunnyel39%enlasierrasur,enlosdepartamentosdeCusco, Puno y Apurmac (Palacios et al., 2004).2.1.1.Descripcin botnica Lashojastienenformaalargada,generalmentecompuestaporocho fololosquevaranentreovaladosalanceolados.Sediferenciadeotrasespecies de Lupinus en que las hojas tienen menos vellosidades. Referentelas semillas de tarwi,estn incluidas en nmero variable en una vaina de 5 a 12 cmy varan de forma (redonda, ovalada a casi cuadrangular), miden entre 0,5 a 1,5 cm.6 Unkilogramotiene3500a5000semillas,dependiendodeltamaoyel peso de las semillas. La variacin en tamao depende tanto de las condiciones de crecimientocomodelecotipoovariedad.Lasemillaestrecubiertaporun tegumento endurecido (Ver figura 01) que puede constituir hasta el 10% del peso total(Palaciosetal.,2004).Losnivelesdefloracinypartesdelasemilladel tarwi se muestran en la figura 01.Cuadro 01: Clasificacin taxonmica del tarwi Nombre ComnTarwi, Chocho, tauri Nombre CientficoLupinus Mutabilis DivisinEspermatofitos ClaseDicotiledneas OrdenRosales FamiliaPapilionoideas GneroLupinus EspecieLupinus Mutbilis Fuente: Palacios et al., (2004). Porotrolado,sehademostradoqueeltarwiesunaleguminosaquefija nitrgenoatmosfricoencantidadesapreciablesde100kg/haaproximadamente, restituyendolafertilidaddelsuelocultivada(MujicaySven,2006).Usado tambincomoabonoverde,contribuyendoamejorarlaestructuradelsueloe incrementando los contenidos de materia orgnica, nitrgeno y fsforo que hacen del suelo cultivado rico en nutrientes (Acua, 2001). 7 Figura1: A)Niveles de ramificaciny floracin dellupino blanco.B) Partes de la semilla de lupino (Palacios et al., 2004). 8 Losrendimientosdeltarwialcanzan3200-4800kg/ha,cuandoelcultivo es conducido en forma adecuaday sele proporciona todos sus requerimientos en forma oportuna. Tambin tiene potencial produccin de alcaloides para uso como biocidas o repelentes de las principales plagas que afectan los cultivos de la zona andina (Acua, 2001). 2.1.2. Composicin qumica y valor nutricional El grano de tarwi (Lupinus mutabilis)es rico en protenasy grasas, razn por la cual debera ser utilizado en la alimentacin humana con mayor frecuencia, sucontenidoproteicoessuperioraldelasoyaporloquesonexcepcionalmente nutritivas.Lasprotenasyaceitesconstituyenmsdelamitaddesupeso, estudiosrealizadosenmsde300diferentesgenotiposmuestranquelaprotena varade41-51%yelaceitede14-24%(Grossetal.,1988).Existeuna correlacinpositivaentreprotenasyalcaloides,mientrasqueesnegativaentre protenayaceite,significaquecuantasmsprotenastenga,mayorserla cantidad de alcaloide, esto no ocurre con la grasa (Mujica ySven, 2006). Cuadro02: Composicin qumica del tarwi, soya y frijol (g/100g) Componentes (%) Tarwi Tarwi** SoyaFrijolSemillaCotiledn (88,97%) Tegumento (11,03%) Protena44,344,8749,229,3933,422 Grasa16,513,9115,382,2016,41,6 Carbohidrato28,227,1227,0827,535,560,8 Fibra7,18,582,4258,355,74,3 Ceniza3,35,525,892,555,53,6 Humedad7,79,639,6710,799,212 Fuente: Mujica ySven, (2006); Morn, (2005). ** Ortega et al., (2009). 9 Sin embargo algunos estudios determinaron que el contenido de protenas es aun ms elevado que los valores mencionado en anteriores citas, obtenindose hasta47,7%deprotenaenelanlisisqumicoproximal,ytambinla evaluacin de la digestibilidad se aproxima a la de la casena siempre y cuando se haya aplicado un proceso de desamargado y un tratamiento tecnolgico adecuado que no impliqueprdida de nutrientes (Schoeneberger y Gross, 1983). Ortegaetal.,(2009),encontraronquelassemillasdelupinocontienen 7,35% de nitrgeno total, 55,95% de carbono y 9,83% de hidrgeno. Con base en el contenido de cenizas (5,52%) se estima que el contenido de oxgeno equivale a 21,35%.Lafraccinfibrosadelasemillaestcontenidaprincipalmenteenel tegumento,representandoel11,03%delasemillaytieneunaltocontenidode fibraycarbohidratos,esespecialmentericoencelulosayhemicelulosa,porlo que es una alternativa para la alimentacin de bovinos. 2.1.3.Aminocidos Losaminocidossonsustanciasorgnicasqueposeenalmenosuna funcinamnicaNH2(bsico)yunafuncincida.Lafuncinacidaenlos aminocidosnaturalesestsiempreconstituidaporunafuncincarboxlicaCOOH (Badui, 1990). En caso del tarwila presencia de aminocidos es de suma importancia, puesto que afecta sus propiedades funcionales e influye en la calidad proteica,dichosvaloressemuestranenelcuadro03.Todaslasprotenasestn bsicamenteconstituidasporaminocidos,comprendiendoentrelos20 aminocidos,sinembargo,algunasprotenaspuedencarecerdeunoovarios aminocidos. Las diferencias estructurales y funcionales de los miles de protenas sedebenasucomposicinaminoacdicadelasmismas.Unodelosprincipales 10 factoresqueafectanalaspropiedadesfsico-qumicas,comolaestructura,la solubilidad,fijacin de grasa, etc., de protenas y pptidos es la hidrofobia de sus aminocidos constitutivos (Fennema, 2000). Cuadro 03: Cmputo de aminocidos de Lupinus mutabilis (variedad semidulce) y Lupinus albus (variedad Astra) (mg de aminocidos/g de protena). Aminocidos Patrn de aminocidos * (mg/g protenas) Composicin de aminocidos Cmputo de aminocidos (**) LupinusmutabilisLupinusalbusLupinusmutabilisLupinusalbusIsoleucina 284041 Leucina 66706497 Lisina 5857459878 Metionina+cistina 25232592 Fenilalanina+tirosina 637593 Treonina 34373397 Triptfano 1191182 Valina 353837 Histidina 19 (*) FAO/OMS, (1985). (**) Se indican slo los aminocidos limitantes, cmputo en % Fuente: Morn, (2005); Tapia et al., (2006). Unhechointeresanteesqueencadavariedadelprimerlimitantees diferente:EnLupinusmutabilisellimitanteestriptfano(cmputo82%), mientras que en Lupinus albus es la lisina (cmputo 78%). Es necesario resaltar el elevado aporte de aminocidos azufrados de la semilla de tarwi, en comparacin a otras leguminosas de Sudamrica (Morn, 2005). En caso de la protenas aisladas desoyalosaminocidosazufradossongeneralmentelosaminocidoslimitantes(De Luna, 2008). Lapresenciadelasconcentracionesdelosaminocidosazufrados (metionina+cistena) es una caracterstica de sta leguminosa. Estudios realizados 11 demuestranquealsuplir2%demetioninaaltarwiseincrementalaRelacinde EficienciadeProtena(PER),laUtilizacinProteicaNeta(UPN)yelValor Biolgico(VB)enratasyennios(Ayala,2006).Sinembargolasprotenasde loscerealesydelasleguminosassuelenserdeficientesenalmenosunodelos aminocidosesenciales,loscerealestienebajaproporcindelisinaperobuena proporcindemetionina,encasodelaleguminosasocurrelocontrario demandandolamezcladecerealesyleguminosasparaincrementarlacalidad proteica del producto (Linden y Lorient, 1994). Cuadro04:Evaluacinbiolgicadelacalidadproteicadetarwi(Lupinus mutabilis) expresado en %. Producto RatasNios PERUPNVBVB Tarwi 49,651,151,961,3 Tarwi + 0,2% Metionina 87,284,689,684,8 Casena 100100100100 PER: Relacin de eficiencia de protena UPN: Utilizacin proteica neta VB: Valor biolgico Fuente: Ayala, (2006). Almezclar el tarwi con cereales selogra una excelente complementacin deaminocidos,puestoquecadamateriaprimaconfieredistintacomposiciny proporcinaminoacdica,porloquelarelacindeeficienciaproteicasealtera significativamente, se destaca en particular el efecto complementario de la quinua (Moron,2005).Esteaspectoseaprovechaparamezclarestegrupodealimentos, demodoqueseobtieneresultadosfavorablesparalaalimentacinhumanaen todos los grupos etarios. 12 Cuadro05:Efectocomplementariodelaprotenadeltarwicondiferentes protenas vegetales. Fuente proteicaPER (% casena)Tarwi crudo 37,1 Tarwi autoclavado 48,2 Tarwi-quinua (33:66) 95,2 Tarwi-avena (50:50) 86,4 Tarwi-maz (50:50) 84,8 Tarwi-arroz (50:50) 83,2 Tarwi-trigo (33:66)81,2 Tarwi-cebada (50:50)80 Tarwi-quinua-maz (33:33:33)96,8 Tarwi-maz-avena (33:33:33)89,2 Casena100 Fuente: Tapia et al., (2006). 2.1.4.cidos grasos Encuantoaloscontenidosdecidosgrasosdeltarwi,elcuadro06 muestra la composicin de cidos grasos en el aceite de los Lupinus, se destaca la presenciadecidosgrasospoliinsaturadoscomoelcidoalfalinolnico(18:3, Omega3),cidolinolico(18:2,Omega6)yeloleico(18:1,Omega9)en cantidades significativas (Ayala, 2006). La interpretacin por ejemplo del trmino (18:3,Omega3)sebasaensuqumica,enestecasosepresentaelacidoalfa linolnicode18carbonosy3doblesenlaces,enlaqueelprimerdobleenlace estenelcarbono3,porelloelnombredeomega3.Losomegas3y6noson producidasenelorganismo,porloqueseconsideranesencialesquesedebe ingeriren los alimentos (Valenzuela y Nieto, 2003). 13 Cuadro06:ComposicindecidosgrasosdelaceitedeL.mutabilisamargoy semidulce y del L. albus, biovar astra (g/100 g). Acidos grasos L. mutabilisL. albus amargosemi-dulceBiovar astra Mirstico 0,60,30,2 Palmtico 13,49,87,2 Palmitoleico 0,20,40,4 Esterico 5,77,82,1 Oleico 40,453,957,3 Linoleico 37,125,921,3 Linolnico 2,92,68,2 Araqudico 0,20,61,3 Behnico 0,20,51,0 Ercico ----0,9 Poliisaturados/Saturados 2,01,52,5 Fuente: Mujica ySven, (2006); Ayala, (2006).El mayor porcentaje de cidos grasos presentes en el lupino corresponde a losmonoinsaturados,siendoelcidooleicoelmsimportante.Losvaloresde estecidograsovarandeacuerdoalaespecie,encontrndoseenL.albusun 49%,enL.angustifoliusun33,5%yenL.luteusun20,3%.Enrelacinala composicindecidosgrasospoliinsaturados,lasemilladelupinocontiene cantidades apreciables de cido linolico, entre un 17,2% en L. albus y un 47,3% en L. luteus. Adems existen niveles importantes del cido linolnico, siendo ms abundantes en L. albus (9,5%), las otras especiespresentan porcentajesmenores, aunquebastantesuperioresaotrasleguminosas(MassonyMella,1985;Citado por Borquez, 2008). 14 2.1.5.Alcaloides del tarwi El contenido de alcaloide del tarwi (Lupinus mutabilis), representa uno de losproblemasparalaobtencinyrendimientodeconcentradosyaislados proteicos,porelloesnecesariorealizarunabuenaeleccindelmtodode desamargado para minimizar las prdidas de protenas y dems componentes. El grano de tarwi crudo es amargo (alto contenido de lupinina, lupanidina, espartenayotros),porlotantoesinconsumible,noesapetecidoporaves, rumiantes niinsectos; porello para consumirlosgranos de tarwi, el primer paso es el desamargado (Mujica ySven, 2006). Esnaturallapresenciadealcaloideseneltarwi,sontxicosydanun sabor amargo a la semilla, es la razn por la que se ha priorizado el desarrollo de unprocesodedesamargadoenmuchasinvestigaciones.Unanlisisbastante completo de alcaloides de tarwi ha sido realizado por Hatzold (1981), Citado por Tapiaetal.,(2006),elcualmuestragranvariedaddealcaloidespresentessegn lavariedadestudiadodelupino,destacndoselapresenciadelipininacomoel alcaloide ms comn. El contenido de alcaloides en el tarwi vara de 0,02 a 4,45% y en el follaje de0,1a0,4%;losalcaloidesreportadossonlosquinolizidinicostalescomo: lupina,espartena,13-hidroxilupanina,4-hidroxilupanina,isolupaninaentre otros.Entre todos losindicados,los que se representan enmayorproporcin son laslupininas(27-74%),estosalcaloidesquinolizidinicosamargosenlasemilla deltarwisonsustanciasantinutritivas,quehastaelmomentohansidomayor obstculo para su utilizacin enla alimentacin humanay animal,se reporta que 15 lasvariedadesmejoradasdenominadasdulcestienenuncontenidodealcaloides menor al 1,16% (Mori et al., 2008). Cuadro07:Nombresdelosprincipalesalcaloidesdellupino,formulacin qumica y fuente de origen. Nombre Formula qumica Fuentes AnagirinaC15H20N2O Baptisia sp., Cytisus sp., Sophora sp.y Lupinus sp. CitisinaC15H14N2OBaptisia sp., Cytisus sp., Sophora sp., Lupinus sp. LupaninaC15H24N2OCytisus sp., Lupinus sp., Posalyria sp. LupininaC10H19NOAnabasis sp., Lupinus sp. EsparteinaC15H16NOAmmothamus sp., Baptisia sp., Cytisus sp., Lupinus sp., Retama sp. Fuente: Fundacin Chile, (1978) Citado por Acua, (2001). Mediante elmejoramiento gentico se han obtenido lupinos denominados dulces, que corresponden a aquellos en que el contenido de alcaloides es menor a 0,05%; los tipos amargos presentan de 1 a 4% de alcaloides. Los alcaloides como gruposontxicos,peroindividualmenteseleshaencontradoaplicacionesenel campo delaveterinariay enla preparacin deinsecticidas para uso domsticoy agrcola.Caracterizafundamentalmentealgrupodelosalcaloidesdellupinoel anillo estructural denominado quinolizidina (Acua, 2001). Cuadro 08: Contenido de alcaloides en lupinos dulces y amargos (%). EspecieTipoMnimoMximoPromedio Lupinus LuteusAmargo0,3501,5500,896 Dulce0,0000,0900,045 Lupinus AlbusAmargo0,3503,2501,668 Dulce0,0010,0610,030 Lupinus AngostifoliusAmargo0,2502,0501,150 Dulce0,0010,1000,055 Fuente:LaboratoriodeBioingeniera-UniversidaddeConcepcin.Citadopor (Acua, 2001). 16 Ademsdelosalcaloidesexistenenmuchasleguminosasotros componentestxicosollamadosprincipiosantinutritivos,comolosinhibidores deproteasasyelcidoprsico(HCN).Sinembargo,nosehanencontrado presentes en cantidades significativas en el tarwi, o son eliminados en el proceso dedesamargado.Seconsideraqueuncontenidode0,02%dealcaloides remanentesdespusdeldesamargadoesellmitequesepuedeaceptarcomo seguroparaelconsumohumanosinningnriesgo.Porotroladoelsentidodel gusto humano puede identificar una concentracin de 0,1% de sabor amargo en la semilla,loqueevitaelconsumoyprotegedeunaposibleintoxicacin.Las cantidadesquequedandespusdeldesamargadosoneliminadasporhecesy orina.Endiferentesensayossehaprobadoqueandespusdeunconsumo prolongadopor4semanas,noseobservaronefectosnocivosenanimalesde experimentacin (Tapia et al., 2006). Cuadro09:Dosismnimaletal(DML)paralosalcaloidesdelupino multolupasintratar, 0,07% de alcaloides. GrupoPeso corporal (kg) DML (mg de alcaloides) Lupino diario (kg) Adulto6018750 Nio247,2300 Nia 123,6150 Fuente: Hebbel, (1952). Citado por Acua, (2001). Lasplantassintetizanmetabolitossecundariosqueusancomodefensa contraelataquedeplagasyanimales,losalcaloidescumplenesafuncin protectora, por otro lado es posible su utilizacin con finesms especficos, tales comounagenteconservadoroinhibidor.Laaccinantifngicadelextractode lupinusmexicanus(Variedadmuysimilaralupinusmutabilis)estcomprobado, 17 puestoqueescapazdeinhibirsignificativamenteelcrecimientomicelialdelos hongosfitopatgenosSclerotiumrolfsii,RhizoctoniasolaniyFusarium oxysporum (Zamora, 2007). 2.1.5.1. Mtodos de deslupinizacin Existen varios mtodos de deslupinizado, cada una difiere en cuanto a sus resultadosenbaseelcontenidodealcaloideresidual,paraelcontroldelproceso dedesamargado,seprestasobretodoelmtododedeterminacindelos alcaloidestotalesportitulacinoporfotometra.Siserequierelaseparacinde losalcaloides,serecomiendalacromatografa,enocasionesseutilizaacido tricloroacticoal5%paraelanlisis(Zamora,2007).Losprincipalesmtodos aplicados para el desamargado del tarwi son: A.Deslupinizado tradicional Comprendeunaextraccinconagua,hacindolohervirduranteunahora aproximadamente,colocndolo luego en bolsas de tela permeabley dejndolo en aguacorriente(ro)porhasta10das.Conestemtodosepierdeun45%dela materia seca de las semillas lo que incluye un alto porcentaje de protena, hidratos decarbonoyaceite(Tapiaetal.,2005).Por otroladodifieresignificativamente con losmtodos propuestos por otros investigadores, quienes afirmanllegar a un mejordeslupinizadorealizandounaseleccindelgranoportamao,remojarel grano durante un da en agua, cocer el grano en agua durante una hora, colocar en un recipiente apropiado (costalillo o canasta) y poner en agua corriente durante 4-5 das. Para estimar manualmente el contenido de alcaloide se acostumbra probar elgrano,siyanoespercibidoelsaboramargo,esposiblesuponerqueyaest listo para ser consumido (Mujica ySven, 2006). 18 B.Extraccin por medio de alcohol Seutilizametanol,etanoleisopropanolaescaladelaboratorioparael deslupinizado.Y a nivel de planta piloto se utilizalasmezclas etanol-agua (1:3). Delosmtodosempleadosparaestefin,sepuedeconcluirqueelmtodo tradicional de desamargado con agua es elms eficiente en cuanto a eliminacin dealcaloidesyelnicoqueseacercaallmitede0,02%.Elproblemadela contaminacin del agua puede ser solucionado en parte, desamargando en pozas y utilizandoelconcentradodealcaloidesparabaossanitariosdelganadoy elaboracin de piojicidas. Cuadro 10: Evaluacin de los mtodos para el desamargado del tarwi AspectosAgua Etanol-aguaGrado de dificultad tecnolgica Bajo MedianoRecuperacin de sustancias solubles Muy complicado Algo complicadoGastos de inversin Bajos MedianosContaminacin Alta BajaAplicacin

Escala reducida Gran escalaConsumo humano Consumo humanoContenido de alcaloides en producto procesado

0,02%

0,27% Fuente: (Bacigalupo y Tapia. 2005). Para la deslupinizacin es requisito la hidratacin, la cual se inicia de 3 a 4 horasdespusdelremojoysetienelamximaabsorcindeaguaalas21horas incrementndose en 240% el peso inicial de la semilla, Posteriormente se procede alacoccinenolladepresin(BacigalupoyTapia,2005).Sehaprobadoel tiempodecoccin,elusodeaditivoscomosal,cenizadehornoycal,para acelerarelprocesodedesamargado,sehaevaluadoademslaprdidade nutrientes en cada uno de los procesos. Experimentalmente se comprob que con 19 dosperodosdecoccinde40minutoscadaunoyconuncambiodeaguase reduce notablemente el porcentaje de alcaloides. EnelmtodollamadoProcesoCusco,lasemillaremojadasesometea unprocesodecoccinenolladepresinconagua.Laprdidadenutrientesen esteprocesoansepuededisminuir,sinembargoyaes50%menorqueenel procesotradicional;siendolaprdidadeprotenas16,8%.Lacoccinpuede efectuarsetambinenhornossencillos,usandolostallosyramasdelasplantas secas de tarwi como combustible (Bacigalupo y Tapia. 2005). Cuadro 11: Prdidas de alcaloides y nutrientes en los diferentes procesos con uso de coadyuvantes del Proceso Cusco, expresados en porcentajes en base seca. Proceso HidratacinCoccin 1 Coccin 2 LavadoTestigo(Solo agua) Materia seca 3,5610,9718,1722,97 Protena 1,549,1413,8216,78 Aceite 1,011,844,9611,83 Alcaloides 13,7166,1483,1699,89 Con sal Materia seca 3,5612,7118,7523,24 Protena 1,548,8912,8217,86 Aceite 1,012,54,579,78 Alcaloides 13,7166,3784,4499,94 Con ceniza Materia seca 3,5612,1419,3824,25 Protena 1,5410,2514,5918,91 Aceite 1,013,173,911,31 Alcaloides 13,7160,8580,9699,81 Con cal Materia seca 3,5613,8322,2728,64 Protena 1,5413,9120,1224,73 Aceite 1,014,537,2611,7 Alcaloides 13,7172,6380,3699,75 Fuente: Bacigalupo y Tapia. (2005). 20 Evidentementeenelcuadroanteriorseapreciaqueelprocesode desamargadoenlaquehaymenorprdidadeprotenahastalaoperacinde lavado,es el proceso sin uso de coadyuvantes comola sal,cenizaycal.Adems de ello se logra menor contenido de alcaloide residual.Porotrolado,Morietal.,(2008),desarrollaronotromtodode desamargado mediante la extraccin slido- lquido utilizando agua a diversos pH (4,5y7,5,siendoadecuadounpHde4,5)comosolventeenproporciones mayores a 1:35 empleando tiempos de remojo mayorde 24 horas. Asmismo,el tarwi desamargado obtenido presenta un anlisis proximal expresado en base seca de: humedad 12,02 %; cenizas 2,78 %; materia grasa 27,35 %; protenas 58,48 %; fibra5,13%;carbohidratos10,71%,alcaloides0,037%.Conestemtodose reducesignificativamentelasprdidasdeprotena(44,38%inicialmentey27,35 luegodeldeslupinizado),sinembargoencuantoacostosdelprocesoes relativamente alto segn a la cantidadde lupino a procesar. 2.2. AISLADO DE PROTENA 2.2.1.Las protenas A.Definicin Lasprotenassonbiomolculasformadasbsicamenteporcarbono, hidrgeno,oxgenoynitrgeno.Puedenademscontenerazufreyenalgunos tipos de protenas, fsforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos, Estn formadosporaminocidosunidosmediantepuentespeptdicos.Anivel elemental,lasprotenasestncompuestaspor50-55%decarbono,6-7%de hidrogeno,20-23%deoxigeno,12-19%denitrgenoy0,2-3%deazufre,la sntesis de las protenas tiene lugar en los ribosomas. (Fennema, 2000). 21 Las protenas son molculas complejas (agregaciones de los aminocidos). Con la posibilidad de que los 20 aminocidos diferentes puedan ser agrupados en cualquierordenparaconformarpolipptidosdecientosdeaminocidos,que tienen el extraordinario potencial de producir una gran cantidad de variantes en su conformacin.Los20aminocidosdifierenconsiderablementeensus propiedadesfisicoqumicasascomoensupolaridad,acidez,basicidad, aromaticidad, volumen, flexibilidad conformacional, en su habilidad para realizar entrecruzamientos para formar puentes de hidrgeno y reactividad qumica. Estas mltiplescaractersticas,muchasdelascualesestninterrelacionadas,sonlas responsables de la gran variedad de funciones, estructuras y dems caractersticas de las protenas (Acua, 2001). Losaminocidossonlasunidadesbsicasqueformanlasprotenas.Su denominacinrespondealacomposicinqumicageneralquepresentan,enla queungrupoamino(-NH2)yotrocarboxiloocido(-COOH)seunenaun carbono.Lasotrasdosvalenciasdeesecarbono quedansaturadasconuntomo dehidrgeno(-H)yconungrupoqumicovariablealquegeneralmentese denominaradical(-R),elcualestdisponibleparaquepuedaunirseotro elementos o grupo qumico (Badui, 1990). Ladesnaturalizacinproteicaeslaprdidadelaestructuraterciaria,por romperselospuentesqueformandichaestructura.Todaslasprotenas desnaturalizadastienenlamismaconformacin,muyabiertayconuna interaccinmximaconeldisolvente,porloqueunaprotenasolubleenagua cuando se desnaturaliza se hace insoluble en agua y precipita (Fennema, 2000). 22 Ladesnaturalizacinsepuedeproducirporcambiosdetemperatura, (huevococidoofrito),variacionesdelpH,etc.Enalgunoscasos,silas condicionesserestablecen,unaprotenadesnaturalizadapuedevolverasu anteriorplegamientooconformacin,procesoquesedenominarenaturalizacin (Luque, 2009). B.Estructura de las protenas Todaslasprotenasposeenunamismaestructuraqumicacentral,que consiste en una cadena lineal de aminocidos. Lo que hace distinta a una protena deotraeslasecuenciadeaminocidosdequeesthecha,atalsecuenciase conocecomoestructuraprimariadelaprotena.Laestructuraprimariadeuna protenaesdeterminanteenlafuncinquecumplirdespus,aslasprotenas estructurales (como aquellas que forman los tendones y cartlagos) poseen mayor cantidaddeaminocidosrgidosyqueestablecenenlacesqumicosfuertesunos con otros para dar dureza a la estructura que forman. Laestructuradelasprotenas,aligualquesuspropiedadesfuncionales estn en base a su composicin aminoacdica, puesto que cada tipo de aminocido queestcomponiendolaestructuraproteica,cumplenfuncionesespecficas (Luque,2009).Lasecuenciadeaminocidosdeunacadenapolipeptdica determinaeltipodeinteraccioneselectrnicasqueseproducirn(tantoentrela mismaprotenaysuentorno)yelgradodelibertaddeadoptardiferentes conformacionesestablesaunatemperaturafisiolgica(Fennema,2000).Los pptidossonuntipodemolculasformadasporlaunindevariosaminocidos medianteenlacespeptdicos,elcualeselenlacecovalenteentreelgrupoamino (NH2) de un aminocido y el grupo carboxilo (OOH) de otro aminocido en la 23 queseproduceunaamidayunamolculadeagua,resultandounasustancia llamado dipptido (Murray, 2005). B.1. Estructura primaria Laestructuraprimariaesunasecuenciadeaminocidosdelaprotena. Nos indica qu aminocidos componenla cadena polipeptdicay el orden en que dichosaminocidosseencuentran.Lafuncindeunaprotenadependedesu secuencia y de la forma que sta adopte, (Ver figura 2). B.2. Estructura secundaria La estructura secundaria esla disposicin dela secuencia de aminocidos enelespacio.Losaminocidos,amedidaquevansiendoenlazadosdurantela sntesis de protenas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposicinespacialestable,permitiendoqueexistadostiposdeestructuras secundarias (-hlice y la -laminar) los cuales resultan de la unin de cadenas de aminocidosmediantepuentesdehidrogeno,generandounaestructura tridimensional (Murray, 2005; Vieira, 2003). B.3. Estructura terciaria Laestructuraterciariainformasobreladisposicindelaestructura secundariadeunpolipptidoalplegarsesobresmismaoriginandouna conformacin globular, la estructura terciaria esla estructura plegaday completa entresdimensionesdecadenapolipeptdica(Murray,2005). Endefinitiva,esla estructuraprimarialaquedeterminaculserlasecundariayportantola terciaria.Estaconformacinglobularfacilitalasolubilidadenaguadelas protenas (Fennema, 2000). 24 B.4. Estructura cuaternaria Estaestructuraresultadelaunin,medianteenlacesdbiles(no covalentes)devariascadenaspolipeptdicascon estructura terciaria,paraformar uncomplejoproteico.Cadaunadeestascadenaspolipetdicasrecibeelnombre deprotmero(Luque,2009).Lafigura02muestratodaslasestructurasdelas protenas. C.Clasificacin de las protenas Lasprotenassepuedenclasificaratendiendoadiversoscriterios,su composicinqumica,suestructuraysensibilidad,susolubilidad,etc.Sin embargo una clasificacin que engloba todos los aspectos es como sigue:C.1. Holoprotenas o protenas simples Son protenas formadas nicamente por aminocidos, por lo que cuando se hidrolizan proporcionan nicamente aminocidos. Globulares:Secaracterizanpordoblarsuscadenasenunaformaesfrica apretadaocompactadejandogruposhidrfoboshaciaadentrodelaprotenay gruposhidrfiloshaciaafuera,loquehacequeseansolublesendisolventes polares como el agua. La mayora de las enzimas, anticuerpos, algunas hormonas y protenas de transporte, son protenas globulares (Luque, 2009). Fibrosas:Lasprotenasfibrosaspresentancadenaspolipeptdicaslargasyuna estructurasecundariaatpica,soninsolublesenaguayendisolucionesacuosas. Seencuentranenlasestructurasrgidasdelosanimales,ejemplodeeste tipode protenas son los colgenos, queratinas y elastinas (Murray, 2005). 25 C.2. Heteroprotenas o protenas conjugadas Lasheteroprotenasestnformadasporunafraccinprotenicayporun grupo no protenico, que se denomina grupo prosttico. Glucoprotenas:Sonmolculasformadasporunafraccinglucdica(del5al 40%)yunafraccinproteicaunidasporenlacescovalentes.Lasprincipalesson las glucoproteinas de la sangre y de las membranas celulares (Vieira, 2003). Lipoprotenas:Soncomplejosmacromolecularesesfricosformadosporun ncleoquecontienelpidosapolaresyunacapaexternapolarformadapor fosfolpidos,colesterollibreyprotenas.Sufuncinprincipalestransportar triglicridos,colesterolyotroslpidosentrelostejidosatravsdelasangre.Se clasificansegnsudensidad(relacindemasayvolumen)enlipoprotenasde alta, mediana y baja densidad (Luque, 2009).Nucleoprotenas:Sonprotenasestructuralmenteasociadasconuncido nucleico(quepuedeserARNoADN).Sucaractersticafundamentalesque formancomplejosestablesconloscidosnucleicos,adiferenciadeotras protenas que slo se unen a stos de manera transitoria, como las que intervienen en la regulacin, sntesis y degradacin del ADN (Vieira, 2003). Cromoprotenas:Lascromoprotenasposeencomogrupoprostticouna sustancia coloreada, por lo que reciben tambin el nombre de pigmentos. Segn la naturalezadelgrupoprosttico,puedenserpigmentoscomolahemoglobina encargadadetransportareloxgenoenlasangreocomolahemocianina,un pigmentorespiratorioquecontienecobreyapareceencrustceosymoluscos (Luque, 2009). 26 Figura 2: A) Estructuras de las protenas, B) Estructura de un aminocido Acua, (2001); Luque, (2009). 27 D.Funcionalidad de las protenas en alimentos Las propiedades funcionales de las protenas influyen enormemente en las cualidadessensorialesdelosproductosenlascualesseutilizan,encasodelos productoshorneadosinfluyeenlaspropiedadesviscoelsticas,propiedades texturalesysuculentasencasodecarnes.Deigualmodosonmuchaslas propiedadesquesepuedenmejorarconusodelasprotenas,enespeciallos aisladosproteicos(Fennema,2000).Enelcuadrosiguienteseresumelas propiedades funcionales que ejercen las protenas en los sistemas alimenticios. Cuadro 12: Papeles funcionales de las protenas alimentarias en los alimentos FuncionesMecanismoAlimentoTipo de protena Solubilidadhidrofiliabebidas protenas de suero lcteo (lactoalbminas) Viscosidad fijacin de agua, tamao y forma hidrodinmica Sopas, caldos, aderezos para ensalada, postres Gelatina (Hidrocoloides) Fijacin de agua puentes de hidrogeno, hidratacin inica salchichas, bizcochos y pan protenas del musculo (mioglobina), protenas del huevo (albminas) Gelificacin agrupamiento e inmovilizacin del agua, formacin de una red tridimensional carnes, quesos, bizcochos y geles protenas musculares, del huevo y protenas lcteas Elasticidad interacciones hidrofbicas, puentes disulfuro carnes, productos horneados protenas musculares y decereales Emulsin adsorcin y formacin de pelcula en la interfase salchichas, sopas, bizcochos y aderezos protenas del musculo, leche y huevos Formacin de espumas adsorcin en la interfase y formacin de pelcula batidos ornamentales, helados, bizcochos y postres protenas lcticas y del huevo Fijacin de grasa y flavores interacciones hidrofbicas, atrapamiento productos horneados pobres en grasa, buuelos protenas lcteas, del huevo y de los cereales Fuente: Fennema, (2000). 28 Lasolubilidaddeunaprotenaestinfluenciadaporlossiguientes factores:Sucomposicinenaminocidos(unaprotenaricaenaminocidos polares es en generalms soluble que una rica en aminocidos hidrofbicos); Su estructuratridimensional(lasprotenasfibrosassonengeneralmenossolubles quelasglobulares)yelentornodelapropiaprotena.Losprincipalesfactores ambientalesqueinfluyenenlasolubilidaddeunaprotenasonlossiguientes:la temperatura;laconstantedielctricadelmedio,elpHdelmismo,ylafuerza inica (Fennema, 2000). Larepresentacinesquemticadelaspropiedadesfuncionalesdelas protenas se muestra en la siguiente grfica: Figura 03: Propiedades funcionales de las protenas 2.2.2.Importancia del lupino en la produccin de protenas vegetales Ellupino,tantoporsualtaproduccinporhectrea,comoporelalto contenidodeprotenas,aparececomounodelosmejoresproveedoresde protenas.Enelcuadro13semuestralaproduccinobtenidaenunterrenode Hidrodinmicas >Adsorcin de agua >Absorcin de agua >Hinchamiento >Retencin de agua >Solubilidad >Dispersabilidad Superficiales >Formacin y estabilizacin de espuma >Formacin y estabilidad de emulsin >Fijacin de aromas Texturales y reolgicas >Precipitacin >Floculacin >Coagulacin >Gelificacin >Texturizacin 29 buenacalidad,paradiferentesalternativasyloskilosdeprotenasporha-ao. Este cuadro demuestra la gran cantidad de kilos de protena que se puede obtener de una hectrea de lupino Albus Acua, (2001). Cuadro 13: Produccin de protenas por hectrea ProductoProduccin (kg/ha) Contenido de protenas (%) Protenas (kg/ha-ao) Carne de vacuno333 (a)18,720,5 Arroz pulido2800 (c)6,4116 Leche de vaca4380 (b)3,2140 Lenteja60024144 Poroto comn130020,6268 Trigo30009,3279 Arveja de grano140022308 Quinua200018360 Maz350010,6371 Poroto de soya180038685 Lupino Multolupa4000441760 (a)Seconsideraqueporcadanovillode500kglistoparalamatanzasenecesitantres unidadesdevacuno(UV)parallegaradichaedad;ycadahadeterrenoresiste2UV. Rendimiento en canal 55% y carne limpia comestible 60% del anterior. (b) 2 UV por cada vaca en leche y 2 UV por ha. 12 litros de leche por vaca y por da. (c) 65% de extraccin. Fuente: Junge, (1975),Citado por Acua, (2001). 2.2.3.AISLAMIENTO DE PROTENAS Sehaempleadoaisladosproteicosdesdehacemuchosaos,sinembargo en los ltimos aos se est desarrollando el uso de fuentes alternativas de protena deorigenvegetal,talescomogirasol,colza,garbanzo,lupinus,etc.Dichos aisladosonusadoscomoinsumoenlaelaboracindemuchosproductosenla industria de alimentos y la farmacutica (Villanueva et al., 2001). Seconsideraconcentradoproteicoaquelcuyocontenidodeprotenases mayoral70%,dichoproductoes obtenidopormediosfsicosyqumicosconla 30 finalidad de reducirlos otros componentes e incrementar la cantidad de protena, conlaconsiguienteeliminacindeloscompuestonoproteicosdemodoquese incrementa el nivel porcentual de las protenas (Rivera, 2006). PorotroladoBadui,(1990),mencionaqueelaisladoesunproducto obtenidodelasoyaquecontienemsde90%deprotenasenbaseseca,yel concentrado es el producto derivado de la soya con un contenido de ms de 70% deprotenasenbaseseca.Ambasseobtienenapartirdeharinadesoya desgrasada,alaqueseleeliminapartedesuscarbohidratospormediodeuna extraccin acuosa. Lasprotenassonsolublesenaguacuandoadoptanunaconformacin globular.Lasolubilidadesdebidaalosradicales(-R)libresdelosaminocidos que,alionizarse,establecenenlacesdbiles(puentesdehidrgeno)conlas molculas de agua. As, cuando una protena se solubiliza queda recubierta de una capa demolculas de agua (capa de solvatacin)queimpide que se pueda unira otrasprotenaslocualprovocarasuprecipitacin(insolubilizacin).Esta propiedad es la que hace posible la hidratacin de los tejidos de los seres vivos. Lasprotenasrepresentanunodeloscomponentesprincipalesdelos alimentos, tanto desde un punto de vista funcional como nutricional. Por ejemplo, determinanlas propiedadesfsicasy organolpticas de muchos alimentos. As,la consistenciaytexturadelacarne,quesoopan,dependenengranmedidadela naturalezadelasprotenasquelosconstituyen.Perotambin,enalimentos elaboradosconpresenciamenordeprotenas,puedenjugarunpapelmuy importante,influyendoencaractersticasfuncionales,comolaformacinde emulsiones, geles, espumas y la absorcin de agua o aceite. Adems las protenas 31 tambinconstituyenunaportenutricionalimportante,representandounafuente deenerga,nitrgenoyaminocidosesenciales(VioqueyMilln2006,Citado por Silva 2006). Lasprotenassonmacronutrientesesencialesparalanutricinhumanay animalquehabitualmenteformanpartedelospropiosalimentosensuforma natural.Ademsdesupapelbsicoenlanutricin,lasprotenasposeen propiedadesfisicoqumicasqueotorganunaspropiedadesfuncionalesmuy especficasalseradicionadasaciertosalimentos.Porestarazneldesarrollo tecnolgicodelaindustriaalimentariaharecurridoenformahabitualala utilizacindeproductosproteicosconfinesfuncionales-tecnolgicos, encaminadosadotardepropiedadesfisicoqumicasyorganolpticasalos alimentos donde son incorporadas (Silva, 2006). Cortezetal.,(2005),Estudiaronlametodologadeextraccindeaislado proteico a partir de alfalfa (Medicago sativa), concluyendo que en la mayor parte delosmtodosseobtieneun%derecuperacindeprotenade40%oms.Se observaunincrementoenlarecuperacindeprotenaporarribadel90%enlos concentradosobtenidoapartirdeljugodealfalfayporlaaplicacinde tratamientotrmicoyajustedepH.Estosepuederelacionarconeltratamiento combinadodeambosmtodosprovocandounamayorprecipitacinproteica.En losmtodosenqueseobtuvounarecuperacinentre90%y50%,sepueden mejorar aplicando una segunda o tercera extraccin. Porotrolado,esposibleobteneraisladoproteicoapartirdeharinas desgrasadas con solvente, en este caso de harina de soya desengrasada con ter de petrleoenunequipoSoxhlet.Laextraccindelasprotenasserealizaconuna 32 solucindeNaCl1M(1:10p/v),ajustandoelpHa7,elcualsesometea agitacinpor1hora.Inmediatamentedespussesometeaunacentrifugacin (5000rpm/30min).Estaextraccinserealizatresveces,conlanicadiferencia que enla tercera extraccinla relacinmuestra solucin extractora es de 1:5. Se juntanlossobrenadantescolectados,semideelvolumenysediluyea50%, ajustandoelpHa4,5conHCl0,1N.Sedejaenreposopor12horasa4Cyse centrifugaa5000rpm/30min.Elprecipitadoescolectadoyliofilizadopara determinar las protenas por el mtodo de Kjeldalh (Chavarria et al., 2005). Santosetal.,(1997)fraccionaronlasprotenasdedosespeciesde leguminosasdelgnerolupinus(L.mutabilisyL.albus),reportandoquelas protenasms abundantes de estas leguminosas sonlas glubulinas (43% y 31,7% para las dos especies respectivamente) seguidas de las albuminas (8,7% y 16,9%). 2.2.3.1.Mtodos de obtencin de aislado proteico A.Procedimientos de separacin basados en diferencia de solubilidad Lasprotenasendisolucinmuestrancambiossignificativosdesu solubilidadenfuncindelpH,fuerzainica,propiedadesdielctricasdel disolventeylatemperatura. Estasvariablesquesonreflejodelhechodequelas protenassonelectrolitosdepesomolecularmuygrande,puedenutilizarsepara separarmezclasdeprotenas,yaquecadaprotenaposeeunacomposicinen aminocidoscaractersticaquedeterminasucomportamientocomoelectrolitoy propiedades. 33 A.1. Obtencin de aislados a pH alcalino y precipitacin isoelctrica Estemtodoconsisteenelusodeunabasepara solubilizarlasprotenas, comnmenteseutilizahidrxidodesodioNaOHparalaextraccinalcalina, posteriormenteseprocedealaprecipitacinisoelctrica(Solubilidadmnimade lasprotenasapHalrededorde4,5).Generalmenteelprocedimientoconsisteen mezclar harina con agua destilada en relacin de 1:10, ajustando el pH con NaOH 0,1Na9,0.Laextraccinserealizaagitandolasuspensinpor45minutosa temperatura ambiente. Para separar la protena extrada del residuo, el extracto se centrifugaa10000rpm.Laprecipitacindelasprotenasaisladasserealiza ajustandoelpHconHCl0,1N.Elaisladoproteicoprecipitadoserecuperapor centrifugacina10000rpm(30min,4C)posteriormenteseprocedealavar preferentemente dos veces con agua destilada (Ramrez, et al., 2007). Lasolubilidaddelamayorpartedelasprotenasglobularessehalla profundamente influida por el pH del sistema. Por ejemplo la solubilidad de la b-lactoglobulina,unaprotenadelalecheseencuentraentre5,2y5,3, independientemente de la concentracin del cloruro sdico presente.A cada lado de este valor critico del pH, la solubilidad experimenta un incremento muy agudo. Lamayoradelasprotenasglobularesmuestranunmnimosolubilidad,aunque ello depende del pH y del tipo de protena (Nelson y Cox, 2001). Sehadiseadounprocesodeobtencindeaisladosproteicosapartirde harina de colza desengrasada mediante extracciones sucesivas. El mtodo incluye laextraccinbsicadelasprotenassolublesseguidodeunaprecipitacinacida enelpuntoisoelctrico.Elprecipitadoeslavadoconagua(pH4,5),etanoly acetona, obtenindose un aislado proteico con un 86% de protena y reducindose 34 elcontenidodeazcaressolublesenmsdeun90%respectoalaharina desengrasada.Elaisladoproteicofinaltieneunariquezaenprotenasdel86%, una digestibilidad in vitro del 91,6% y unos valores de absorcin de agua y aceite queproporcionanunproductodeseableparasuusoenalimentacin,pudiendo utilizarsecomomateriaprimaparalaobtencindehidrolizadosproteicos (Gonalves et al., 1997).Partculas pequeas de harina de soja con elevado ndice de solubilidad de nitrgeno (NSI) es el material de inicio y se contacta con un medio alcalino a pH < 9 para prevenir la hidrlisis de la protena. El proceso de aislado es efectivo por lascaractersticassolublesdelaprotenadesoja.Cuandolaprotenahasido disuelta,elbarroescentrifugadoparasepararoaislarlaprotenadelos carbohidratos.Ellicor,conteniendolafraccinproteica,esluegoacidificado hasta un pH cercano al punto isoelctrico de 4,3 con cido clorhdrico,sulfrico, fosfricooactico,queocasionaquelaprotenaprecipite.Lacuajadacidaes centrifugadaparasepararladelsuero,lavada(apH4,3)ynuevamente centrifugada.Laformamscomndeaislado,elproteinatodesodio,seforma por neutralizacin de la cuajada con hidrxido de sodio seguido por secado spray (Genta y Alvarez, 2006). La Figura siguiente explica el proceso mencionado. 35 Figura 04: Proceso de obtencin de aislado de soja, Genta y lvarez, (2006). A.2. Solubilizacin y precipitacin por salado de las protenas Lassalesneutrasejercenefectospronunciadossobrelasolubilidaddelas protenasglobulares.Abajaconcentracin,lassalesincrementanlasolubilidad demuchasprotenas,fenmenoquerecibeelnombredesolubilizacinpor salado.LassalesdeionesdivalentestalescomoelMgCl2yel(NH4)2SO4,son muchomseficacesenlasolubilizacindelasprotenasquelassalesdeiones monovalentestalescomoelNaCl,elKClyelNH4Cl.Lascapacidadesdelas salesneutrasparainfluirenlasolubilidaddelasprotenasestenfuncindesu fuerzainicaqueconstituyeunamedidatantodelaconcentracincomodel nmero de las cargas elctricas existentes en los cationes y aniones aportados por 36 lasal.Elefectodelasolubilidadporsaladoestacausadoporcambiosde tendencia a la ionizacin de los grupos -R disociables de la protena. Por otra parte a medida que aumenta la fuerza inica, la solubilidad de una protenacomienzaadisminuir,aunafuerzainicasuficientementeelevada,una protenapuedesercasicompletamenteprecipitadadesudisolucin,efecto llamadoinsolubilizacin porsalado. La basefisicoqumica delainsolubilizacin porsaladoesmuycompleja;unodelosfactores queconcurrenenellaesquela concentracinelevadadelasalpuedeeliminarelaguadehidratacindelas molculas de protena reduciendo la solubilidad (Nelson y Cox, 2001). A.3. Fraccionamiento con disolventes Laadicindedisolventesorgnicosneutrosmisciblesconelagua, particularmenteetanolyacetona,disminuyelasolubilidaddelamayoradelas protenas globulares en el agua, de tal manera que precipitan de su disolucin. El estudiocuantitativodesteefectomuestraquelasolubilidaddelaprotenaaun pH y fuerza inica determinados est en funcin de las constantes dielctricas del medio.Puestoqueeletanolposeeunaconstantedielctricamenorqueladel agua,suadicinaunadisolucinacuosadeprotenaincrementalafuerzade atraccinentrelascargasopuestas,disminuyendodeestemodoelgradode ionizacindelosgrupos-Rdelaprotena.Comoresultadolasmolculasde protenatiendenaagregarseyprecipitan.Lasmezclasdeprotenaspueden separarsebasndose enlas diferencias cuantitativas de su solubilidad enmezclas frasdeetanol-aguaydeacetona-agua.Unadesventajadeestemtodoesqueal poder estos solventes desnaturalizar a las protenas a temperaturas superiores, las temperaturas de trabajo deben mantenerse bajas (Nelson y Cox, 2001). 37 A.4. Extraccin con cloruro de sodio y precipitacin por micelizacin En este mtodo se utiliza una sal para la solubilizacin proteica, utilizando solucindeNaCl0,8MapH7,enunaproporcinharina:solventede1:10. Despusdelaextraccin,lasuspensinsecentrifugaa10000rpmdurante30 min.Paralograrlamicelizacindelasprotenaselextractoprotenicosediluye conaguadestiladafra(4C)yposteriormenteseprecipitaapH4,5,luegose procede a lavar dos veces con agua destilada (Robles y Mora, 2007). Cuadro14:Rendimiento y pureza de aislados de soya obtenidos por diferentes mtodos. Mtodo Mtodo Estndar (a)Micelizacin (b) RPRP Desgrasado con hexano 58,3290,0935,0995,90 Desgrasado con etanol 95%70,8391,3231,2087,69 R: Rendimiento (% de recuperacin de protena)P: Pureza (% de protena en base seca) a: Extraccin a pH 9,0 y precipitacin a pH 4,5 b: Extraccin con NaCl 0,8 M, dilucin y precipitacin a pH 4,5 Losaisladosobtenidosporlosdiferentesprocesosdedesgrasadoy extraccindeprotenamuestranperfileselectroforticossemejantes(Figura 05).Exist eunamarcadadisminucinenlafraccindeprotenaconpeso molecularaproximadode95kDenlosaisladosobtenidostantoporel mtodoestndarcomopormicelizacinapartirdeharinadesgrasadacon etanolal95%.Lamejorcombinacindeprocesosencuanto arendimientoypurezafueladelaisladoobtenidopormtodoestndarapartirdeharina desgrasadaconetanolal95%,ademselmtododemicelizacinda rendimientosbajosconcualquieradelosdosmtodosdedesgrasado(Roblesy Mora, 2007). 38 Las siguientes imgenes muestran las estructuras obtenidas de microscopia electrnicodebarridodelasiladoproteicodesoyaobtenidopordosmtodosde aislamiento. HE HM EEEM Figura05:Microscopaelectrnicadebarridodeaisladosdesoya obtenidospordiferentesmtodos(Extraccinalcalinayprecipitacin isoelctrica, extraccin por salado y micelizacin). HE: Harina desgrasada conhexanoy protena extrada a pH9,0 HM:Harina desgrasada conhexanoy protena extrada conNaCl 0,8M EE: Harina desgrasada conetanol y protena extrada a pH9,0 EM:Harina desgrasada conetanol y protena extrada conNaCl 0,8M Fuente: (Roblesy Mora, 2007). 39 B.Extraccindecompuestosnoproteicosmedianteelusodeagua ajustada al punto isoelctrico de las protenas Este mtodo, patentado por Sair(1959), Citado por Vioque et al., (2001), permitelaeliminacindelamayorpartedeloscompuestosantinutricionales, parte de las sales y de los compuestos nitrogenados no proteicos, aunque tambin sonsolubilizadasunafraccindelasprotenas,principalmentealbminas.El mtodoconsisteensucesivasextraccionesconaguaycentrifugacionespara separarlamateriainsolubledelsobrenadanteenelquevandisueltoslos compuestosquesequiereneliminar.LaextraccinacuosaapHcontroladoes poco desnaturalizante para las protenas, lo cual permite mantener las propiedades funcionalesdelproducto,aunquealgunoscompuestosresponsablesdeoloresy sabores desagradables no son eliminados completamente. C.Extraccindecompuestosnoproteicosconaguatrastratamiento trmico Previo a la extraccin con agua de los compuestos no proteicos, se efecta una insolubilizacin de las protenas tratando la harina desengrasada con vapor de aguaapresinatmosfrica.Elvaporademsvaapermitirelarrastrede componentesvoltilesresponsablesdeoloresysaboresdesagradablescomoson loscidosgrasosdecadenacortaysusderivadosoxidados.Sinembargo,se produceunaintensadisminucindelaspropiedadesinterfacialesacuoso-oleosas yagua-aire,ytambindelasolubilidad.Elcalorprolongado tambinpuededar lugaraldesarrollodecoloresoscurosysaboresamargoscomoresultadode reaccionesdeMaillard.Lastcnicasdeextraccinsonidnticasalasusadas anteriormente (Vioque et al., 2001). 40 D.Extraccindecompuestosnoproteicosmediantesoluciones hidroalcohlicas Elhexanousadoeneldesengrasadonielaguasoneficacesenla eliminacin de ciertos compuestos que pueden ser responsables de malos olores y saboresdelproducto.Entreestosdosdisolventesdepolaridadestandisparesse encuentranlasmezclashidroalcohlicas,quepermitenunaadecuadaextraccin de compuestos tales como lpidos polares y sus productos de oxidacin. Adems, las protenas son generalmente poco solubles en mezclas agua- alcohol sobre todo sielalcoholrepresentamsdel40%v/v(envolumen),enestesentido,la utilizacindemezclashidroalcohlicasconllevaunadisminucindela solubilidad de las protenas respecto a la utilizacin del agua e incluso del alcohol puro (Vioque et al., 2001). Eletanolesgeneralmenteelalcoholdeeleccinenlapreparacinde concentrados mediante mezclas hidroalcohlicas. La tcnica consiste en extraer a contracorrientelaharinaconmezclasdeetanolal50-70%v/vysecar posteriormenteelproducto.Elextractopuedeserdestilado,pararecuperarel alcohol que podra serreutilizado disminuyendo aslos costes. El alcohol esms difcilderecuperarpordestilacinyelsecadodelconcentradosehacems complicado.Porelcontrario,conporcentajesmuyelevadosdeetanolla extraccin de azucares es insuficiente. La principal diferencia entre estos mtodos radica en la marcada insolubilizacin de las protenas que se produce en estos dos ltimos procesos. Los menores contenidos en oligosacridos se consiguen conla extraccinisoelctrica,mientrasquelosporcentajesmsbajosenlpidosse obtienen extrayendo con mezclas hidroalcohlicas. 41 Sin embargo, las mejoras ms recientes en la preparacin de concentrados proteicos son las que conciernen a la mejora de sus caractersticas organolpticas medianteelprocedimientodeltripledisolvente,consistenteenextraerlaharina con hexano, hexano-etanol y etanol-agua (Vioque et al., 2001). 2.2.4.PARMETROS DE OBTENCIN DE AISLADO PROTEICO Paracadaproceso,existenparmetrosqueinfluyenenlosresultadosdel proceso,elentendimientoylabuenamanipulacindedichosparmetros garantizan la idoneidad de los resultados. En este caso, existen varios parmetros que gobiernala obtencin delos aislados proteicos, sin embargo solo algunas de ellassonmuyinfluyentesenlosresultados,siendostaselpHdeextraccin, relacinharina:solventeytemperaturadeextraccin.Sinembargotambin influye el tiempo de agitacin, nmero de extracciones entre otros factores. Losparmetrosadecuadosdeobtencindeaisladoproteicodecolza (Brassicanapus),sonpH12,temperaturade40Cyproporcindeharinay solvente de 1:20 Pedroche et al., (2004). El aislado muestra tener ms de 95% de protenas posterior a su insolubilizacin a pH 4,3 y operaciones de obtencin. Por otrolado,esposiblelaobtencindeaisladoproteicoapartirdeamaranto, logrndoseobtenerunproductodehasta85,5%deprotenas(Avanzaetal., 2000). La obtencin de aislado proteico a partir de cacahuate (Arachis hypogaea) variedadamayucaserealizaencondicionessimilares,conelloseobtieneun concentrado con 83,66 % (N x 5,46) de proteinas, 23,17% de protenas solubles y un ndice de solubilidad de 27,69% (Duque et al., 2001). Ladigestibilidadparaaisladosproteicosdetarwiesde88,5%,elcuales superiorencomparacinaladigestibilidaddelaharina(76,4%).Esteresultado 42 puedeexplicarse,debidoaqueelprocesoalquesesometilasemillapermite desnaturalizarmacromolculasdeprotenas,porotrolado,podradeberseala disminucindealgunosfactoresnonutricionalesquepudieronestarpresentes (JimnezyDvila,2006).SinembargoDelRefugio,(1997),extrajoun concentrado proteico de garbanzo con una digestibilidad in vitro de 82,62%. A.PH de solubilizacin Las protenas generalmente tiene carga neta negativa, por lo que cuando se incrementaelpH,losionesOH- sonincorporadosalsistemahaciendoquela carga neta sea aun ms negativa, este fenmeno ocasiona que las molculas de las protenasserepelenysesolubilicen,paralelamentelasmolculasdeaguason incorporados mediante puentes de hidrogeno incrementado la solubilidad. Lasolubilidaddelasprotenasdenuezdemaran(Anacardium occidentaleL)porejemplo,puedeserincrementadaporaumentodelpHpor encimade7,0;noobstanteporencimadepH11,lasolubilidaddelasprotenas noessignificativamenteafectada.seobservaquelasolubilidaddelasprotenas de maran aumenta cuando se incrementa el pH, alcanzando un mximo a pH 11 correspondiente a 91,66% (Ventura et al., 2005). Figura 06: Influencia del pH en la extraccin de protenas en el nuez de maran Ventura et al., (2005). 204060801005 7 9 11 13Proteinas extraidas (%)pH43 Lostratamientosalcalinosaltos(pH>9)afectannegativamentealos aminocidosazufradosyaotrosesencialestalescomolisinagenerandolisino-alaninaademsdecausardesnaturalizacinehidrlisisdelasprotenas, incrementodelareaccindeMaillardconeloscurecimientodelasprotenase incremento de la extraccin de componentes no proteicos, los cuales coprecipitan conlasprotenas,bajandoaslacalidaddelaisladoproteico.Porestasrazones tcnicas se opta por trabajar en un rango de pH 8,0 8,9 que permite obtener una cantidadapreciabledeprotena(CallisayayAlvarado,2009).Sinembargoestos valores varan significativamente segn la materia prima. Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero adems de afectar a la envoltura acuosa de las protenas tambin afectan ala carga elctrica delosgruposcidosybsicosdelascadenaslateralesdelosaminocidos.Esta alteracindelacargasuperficialdelasprotenaseliminalasinteracciones electrostticasqueestabilizanlaestructuraterciariayprovocasuprecipitacin. Lasolubilidaddeunaprotenaesmnimaensupuntoisoelctrico,yaquesu carganetaesceroydesaparececualquierfuerzaderepulsinelectrostticaque pudiera dificultar la formacin de agregados (Nelson y Cox, 2001). B.Temperatura Encasodelatemperatura,Meyer(1966)citadoporVenturaetal., (2005), refiere que la solubilidad de las protenas aumenta cuando la temperatura seelevade0a50C.Porencimade50Celmovimientodelasmolculases suficientepararomperlosenlacesimplicadosenlaestabilizacindelas estructuras secundarias y terciarias. 44 Figura07:Influenciadelatemperaturaenlaextraccindeprotenasenelnuez de maran. Fuente: Ventura et al., 2005. Las protenas entran en disolucin, cuando se calientan por encima de una determinada temperatura crtica,manifiestanimportantes cambios estructuralesy cuandoposteriormenteseenfranproducenungelviscosoyblandoycogulos opacosogelesviscoelsticosclaros,dependiendodeltipodeprotenay aminocidosqueloconforman,delavelocidaddecalentamientoydelas condicionesdelmedioacuoso,especialmentedelpHydelapresenciadeiones Ca++ (Rodrguez et al., 2002) Chefteletal.,(1989),mencionaqueladesnaturalizacinvaseguida, frecuentementedeunaagregacinylasolubilizacindelaprotena desnaturalizada llega a serinferior a la de la protena natural. En caso de nuez de maran(AnacardiumoccidentaleL),sepuedeapreciarquelamxima extraccindeprotenasdenuezdemaran(84,22%)esa50C,yelmayor volumen recuperado se manifiesta a 40C. Este resultado difiere del reportado por Sathe (1994) citado porVentura et al., (2005), quien con harina desengrasada de lanuezdemaranobtuvounamayorextraccindeprotenasa25C.Esto 81,4483,0684,2488,4380,29788082848688900 10 20 30 40 50 60 70% solubilidadTemperatura de extraccin (oC)45 posiblemente se deba al contenido grasa que pudieranformar emulsiones con las protenas presentes, por lo que el calentamiento origina la desnaturalizacin de las protenasconlaconsiguienterupturadelaemulsin,facilitandoportantola extraccin de estas protenas. Lasetapasinicialesdelacoagulacinporelcalordeunadisolucin acuosadeprotenason:(a)ladisociacinreversibledelaestructuracuaternaria ensub-unidadesy(b)ladesnaturalizacinirreversibledelasestructuras secundarias y terciarias (Rodrguez et al., 2002). Cuandolatemperaturaeselevadaaumentalaenergacinticadelas molculasconloquesedesorganizalaenvolturaacuosadelasprotenas,yse desnaturalizan.Asimismo,unaumentodelatemperaturadestruyelas interaccionesdbilesydesorganizalaestructura delaprotena,deformaqueel interiorhidrofbicointeracciona con elmedio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de laprotena desnaturalizada (Nelson y Cox, 2001). C.Relacin harina: solvente La cantidad de harinaa solubilizar en el sistema harina y solvente, influye significativamenteenlacomposicinycantidadporcentualdelaprotena recuperadaenlaprecipitacinisoelctrica,sinembargoelsolvente(solucin extraentequeesajustadaapHdeextraccin)debeseradecuadaparaquenose satureloscomponentessolubilizados,loqueindicaqueesdevitalimportancia determinarlarelacinapropiadaparaqueseaadecuadoentrelacantidadde disolvente y la cantidad de protenas a solubilizar. 46 Las relacionesharina: solvente para la extraccin de protenas de nuez de maran(AnacardiumoccidentaleL)semuestranacontinuacin,losresultados muestranqueessignificativolasproporcionesaconsiderar,porloqueniveles prximos a 1:15 resultan siendo adecuadas (Ventura et al., 2005). Sin embargo en lasrelacionesusadasenlaharinadesoyaesde1:10conlaqueseobtiene aislados con alta concentracin proteica (Ramrez, et al., 2007). Figura 08: Influencia de la relacin harina: solvente en el porcentaje de protenas extradas en nuez de maran. Fuente: Ventura et al., (2005). D.Efecto de la polaridad del disolvente La polaridad (hidrofobicidadfrente a un soluto)del disolvente disminuye cuandoseleaadensustanciasmenospolaresqueelaguacomoeletanolola acetona.Conellodisminuyeelgradodehidratacindelosgruposinicos superficialesdelamolculaproteica,provocandolaagregacinyprecipitacin. Losdisolventesorgnicosinteraccionanconelinteriorhidrofbicodelas protenasydesorganizanlaestructura terciaria,provocandosudesnaturalizacin yprecipitacin.Laaccindelosdetergentesessimilaraladelosdisolventes orgnicos (Nelson y Cox, 2001). 77,8478,4380,6182,4788,8870758085901:15 1:20 1:25 1:30 1:35% solubilidadRelacin harina: solvente(p/v)47 E.Fuerza inica Unaumentodelafuerzainicadelmedio(poradicindesulfato amnico,ureaohidroclorurodeguanidinio,porejemplo)tambinprovocauna disminucinenelgradodehidratacindelosgruposinicossuperficialesdelaprotena,yaqueestossolutoscompitenporelaguayrompenlospuentesde hidrgeno o las interacciones electrostticas, de forma que las molculas proteicas seagreganyprecipitan.Enmuchoscasos,laprecipitacinprovocadaporel aumento de lafuerzainica es reversible.Mediante una simple dilisis se puede eliminarelexcesodesolutoyrecuperartantolaestructuracomolafuncin original.Avecesesunadisminucinenlafuerzainicalaqueprovocala precipitacin.As,lasprotenasquesedisuelvenenmediossalinospueden desnaturalizarse al dializarlas frente a agua destilada, y se renaturalizan cuando se restaura lafuerza inica original (Nelson y Cox, 2001). F.Recuperacin de las protenas por precipitacin Encuantoalarecuperacindelaprotenasolubilizadamediantela precipitacinisolectrica,indicaqueelpHinfluyesignificativamenteenla recuperacindelasprotenas.EstadsticamenteseindicaqueelpHdemnima solubilidadproteicaes4,5,noexistiendodiferenciassignificativasapH4,7que corresponderaalpuntoisoelctricoaparentedelamayoradelasprotenas.Al respecto,Sathe (1994) citado por Ventura et al., (2005) determin que el pH de mnimasolubilidaddelasprotenasdenuezdemaranes5,sinembargoeste valor vara de acuerdo a tipo de producto. 48 Figura 09: Influencia del pH en la precipitacin isoelctrica para la recuperacin del aislado proteico de nuez de maran. Fuente: Ventura et al., (2005). Fennema (2000), indica que el mnimo de solubilidad en las proximidades delpuntoisoelctricosedebefundamentalmentealaausenciaderepulsin electrostticaentrelasprotenas,loquepromuevelaagregacinyprecipitacin vainteracciones hidrofbicas. La acidificacin del extracto proteico al pI(Punto isoelctrica)aparenteprecipitalamayorfraccinproteica,pudindoseperderen ellquidosobrenadantealgunasprotenastipoalbminaricasenazufrequeson solubles en el punto isoelctrico (Ventura et al., 2005). Porotrolado,encasodelarroz,sedeterminaqueefectivamentela solubilizacin de la protena se debe llevar a cabo en un pH alcalino, siendo el pH enestecasode12,ylarecuperacindelaprotenaporprecipitacinacidaesa pH 6. Esto puede deberse a las diferencias en la composicin de la materia prima delqueseextraeelaisladoproteico(Pincirolietal.,2006).Delmismomodo, Cornejo,etal.,(2001)obtuvieronunaisladoproteicoaparirdeajonjol (Sesamumindicum),obteniendoun80%deprotenaenelconcentradoproteico, 010203040506070801 2 3 4 5 6 7Protenas en solucin (%)pH49 elcualfuerecuperadaaunpHde6.Sinembargosedemuestraquemediante procesosqueimplicatratamientosenzimticos,seobtieneaisladosproteicos provenientes de salvado de arroz de hasta 92% de protenas (Wang et al., 1999). Encasodelasoya,elaisladodeprotenaseproduceconlaextraccin alcalina dela harina,a un rango de pH de 8 a 9. Los polisacridosinsolublesen aguayprotenasresidualessonseparadosportamizado,filtracino centrifugacin. El extracto acuoso se acidifica a pH 4,5 con una disolucin cida, locualprovocalaprecipitacindelasprotenasensupuntoisoelctrico.Este cuajo de protenas se filtra o se centrifuga, se lava con agua en abundancia y se secaporaspersinparaobtenerlaformaisoelctricadelaprotena,quees insolubleenaguayprcticamentenotienepropiedadesfuncionales.Esms comnredisolverelcuajo,neutralizandoaunpHde7,0;paraobteneruna disolucin concentrada de proteinatos de sodio. Posteriormente, esta disolucin es secada poraspersin,para producirunaforma proteicafcilmente dispersable en agua (Liu, 1999, Miller et al., 2001), Citado por (Munive, 2009). 2.2.5.Aplicaciones de aislados proteicos Lasprotenasdeorigenvegetal,principalmenteporsumenorcostode produccin comparado conla protena de origen animal,constituye,enforma de hidrolizadounexcelentesustitutodeestaltima,comosaborizantesdesopas, salsas,caldos,etc.Esprecisodestacarqueentrelacomposicindelosextractos acuosos de carne y de los hidrolizados de protena vegetal hay una gran similitud. La carne tiene una cierta cantidad de aminocidos libres, de bajo peso molecular, todosellossolublesenagua,similaresalosformadosporhidrlisiscidade protenas vegetales (Acua, 2001) 50 Actualmente los aislados proteicos ms extendidos son los de soja, ya que ofrecenventajaseconmicas,nutricionalesyfuncionalesmanteniendolas cualidades sensoriales deseables necesarias para la aceptacin por el consumidor. Lamayoradelasaplicacionestienenlugarenalimentostradicionalesqueya tienenestablecidosunaseriedeparmetrosdeutilizacinycalidad.Paratener xitoenestosproductos,losaisladosdebenmantenerestacalidad,estoquiere decirigualosimilarcolor,sabor,aroma,texturaycomposicinqumicay nutricional, estos requerimientos exigidos por el consumidor determinan el grado de sustitucin proteica. La mejora de la nutricin es la razn primera para el uso de los aislados en carnesmagras,frmulasinfantiles,bebidas nutritivas para adultos y suplementos proteicos.As,enproductosdecarnemagraproporcionanbeneficiosapersonas conunaltoniveldecolesterolytriglicridosensangre,yaque,ademsde disminuirelcontenidoengrasasdelproducto,lasprotenasvegetalestienen efectosbeneficiososenlareduccindelosnivelesdecolesterol(Sautieretal., 1986citadoporVioqueetal.,2001).Lasfrmulasinfantilesbasadasenlos aisladosseelaboranparaproporcionarunanutricincompletaylascaloras especificadas a los nios alrgicos o que no pueden tomar leche de vaca, as como alrestodelosnios.Lasprincipalesventajasenlasbebidasnutritivaspara adultos sonlaflexibilidad deformulacinylos efectos hipolipidmicos. Pero en cualquier caso, igual que con los alimentos tradicionales, los beneficios nutritivos tienenqueiracompaadosconunacalidadfuncionaladecuadaparaquesean aceptados por el consumidor. 51 Ladisponibilidadengrandescantidadesdefuentesproteicasvegetales comolaharinadesengrasadadeoleaginosas,juntoconlatendenciaareducirla ingestadeprotenasanimales,hacequeenlosltimosaosseestproduciendo ungrandesarrolloenlosprocesosdeextraccinymejoradeestasprotenas vegetalesparasuusoenalimentacinhumana(Vioqueetal.,2001).Eneste sentido, en los prximos aos se va a producir un incremento en la disponibilidad denuevasfuentesproteicasvegetalesyenlatransformacindeestasparasu aplicacinconfinesalimenticiosmuyconcretosconformesalasdemandasdel mercado en alimentacin especializada (infantil o tratamiento clnico), del mismo modoesfactiblesuusoenlatecnologadelcticos,crnicosypanaderaconla finalidad de proporcionar o mejorarlas cualidadesfuncionalesy tambin reducir los costos (Mondor et al., 2004). Figura 10: Usos de los concentrados y aislados proteicos Fuente: (Mondor et al., 2004). 52 III.PARTE EXPERIMENTAL 3.1. TIEMPO Y ESPACIO Elpresentetrabajodeinvestigacinserealizenloslaboratoriosde Qumica,OperacionesunitariasyMicrobiologadelaEscuelaAcadmicoProfesionaldeIngenieraAgroindustrialdelaUniversidadNacional Micaela Bastidas de Apurmac, realizadas entre los meses de marzo y octubre del 2010.Porotroladosehanrealizadoanlisisproximalesdelaharinadetarwi, soluciones muestreadas de la extraccin alcalina y el aislado proteico final en los laboratoriosdelaFacultaddeCienciasQumicas,FsicasyMatemticasdela Universidad Nacional San Antonio Abad de Cusco. 3.2.MATERIA PRIMA Las muestras de tarwi (Lupinus mutabilis), utilizadas para la investigacin fueron recolectadas del centro poblado de Chaupiorcco del distrito de Santa Mara deChicmodelaprovinciadeAndahuaylas,lascualesfueronobtenidasbajoel criteriodemuestreoalazardecultivosrealizadosenlafechacronolgicade siembra(octubre,noviembre),permitiendoquelamuestraseahomogneoen cuantoasuscaractersticasfisicoqumicas.Lavariedadmuestreadaesellupino blanco(Tarwiblanco)portenerbajocontenidoenalcaloide,talcomoafirma Acua, (2001). 53 3.3.MATERIALES Y REACTIVOS 3.3.1.Materiales y utensilios Termmetro con rango de medicin -10 C hasta 150 C Vasos precipitados de 50; 100; 250 y 1000 mL Placas petri Pipetas graduadas de2 y5 y 10 ml Probetas volumtricas de 10; 50 y 100 mL Matraces Erlenmeyer de 150; 250 y 500 mL Fiolas de 50; 250 y 500 ml. Matraces de Kitasato de 1000 mL Baguetas, pinzas Crisoles de calcinacin Desecador de muestras Balones de Kjeldahl de 100 mL Embudos de vidrio de vstago largo Embudo Buchner Tubos de ensayo de 5 y 10 mL Pendones cnicos de 15 mL (tubos para centrfuga) Recipientes de almacenamiento (tinas) Ollas de acero inoxidable Jarra de 2 litros 3.3.2.Reactivos cido sulfrico (H2SO4) p.a Sulfato cprico pentahidratado (CuSO4.5H2O) p.a Sulfato de potasio (K2SO4) p.a 54 Hidrxido de sodio (NaOH) p.a Indicador fenoftaleina (C2OH14O4) p.a Indicador rojo de metilo Solucin de cido sulfrico 0,1 N Solucin Acido clorhdrico 0,1 N Solucin Hidrxido de sodio 0,1 N Etanol Agua destilada 3.3.3.Equipos Kjeldahl, marca: Velp Scientifica, modelo: UDK126D Mufla,marca:BarnsteadThermolyne,modelo:FB1410M,rangode temperatura de 0 1100 C Estufa, marca: Memmert, modelo: 200-800, rango de 30 250 C Balanzaanaltica,marca Ohaus,consensibilidadde0,0001 g. Potencimetro, marca: SCHOTT, modelo: Postfach 2480.DBureta semiautomtica Bomba de filtracin al vacioBalanza elctrica capacidad de 200 g Bao mara marca PRECISDIG Centrifuga, marca LW SCIENTIFIC 3.3.4.Maquinarias Molino demartillo,Dynamic; capacidad: 500 kg/h; velocidad: 3700 rpm; potencia: 8,5 hp 55 3.4. MTODOS DE ANLISIS La determinacin de los componentes de la materia prima, se realizaron en basealasnormasAOAC199816thedition4threvisin(Asociacindeanlisis qumico),enalgunoscasossehanrealizadoalgunasmodificacionessegnlo requerido.Enlascualessemencionanlosprocedimientosaseguirsegnel componenteaserdeterminado.ParamsdetallesvaseelApndiceI(mtodos de anlisis). A.Determinacin de humedad MtododelaAOAC.925.10,basadaenlaprdidadepesoquesufrelamuestra por calentamiento hasta obtener peso constante. La frmula para el clculo es: Humedad (%) =(Mm)1M En la que: M = Peso inicial en gramos de la muestra. m = Peso en gramos del producto seco. B.Determinacin de Grasa MtododelaAOAC.945.16,Extraccindelagrasaconunsolventeorgnico (ter de petrleo) en un equipo Soxhlet. %6 =1 (P1 P2)P En la que: P1 = Peso en gramos del matraz con el extracto etreo. P2 = Peso en gramos del matraz vaco. P = Peso en gramos de la muestra empleada. 56 C.Determinacin de protenas Lametodologaempleadafueelmtodoindirecto,Elcualconsisteenla destruccin orgnica por accin del acido sulfrico, obtenindose como resultado sulfatodeamonio,elcualdespusesdestiladoaamoniaco.Losclculosse realizanenbaseaunpatrn(muestraenblanco)ysecuantificaladiferencia gastadadetitulanteenlamuestra(ReferenciamtodoAOAC.960.52-Micro- Kjeldahl). La frmula utilizada fue: %P =(6h 6). N. , 14. J. 1m Donde: Gb: Gasto en la muestra en blanco G: Gasto en la muestra analizada f: Factor de conversin (6,25) N: Normalidad del hidrxido de titulacin D.Determinacin de ceniza MtododelaAOAC923.03,incineracindelamuestraa600Cparaquemar todo el material orgnico, al material inorgnico no destruido se le llama ceniza. %C =1 (P1P2)P En la que: P = Peso en g de la cpsula con la muestra. P1 = Peso en g de la cpsula con las cenizas. P2 = Peso en g de la cpsula vaca. E.Determinacin de fibra SeaplicoelmtododelaAOAC.962.09,consistenteenladeterminacindel remanenteluego dela eliminacin delos carbohidratos solublesporhidrlisisa 57 compuestosmssimples(azucares)mediantelaaccindeloscidosylcalis dbiles en caliente. %F =1 (P1 P2)P Siendo: P= Peso inicial de la muestra. P1 = Peso del crisol conteniendo la muestra desecada. P2 = Peso del crisol conteniendo la muestra calcinada. F.Determinacin de Carbohidratos Ladeterminacindecarbohidratos(C)fueobtenidapordiferenciaentrelos dems componentes mediante la siguiente frmula: C=100-(Protena+Grasa+Ceniza+Fibra+Agua),todosloscomponentes expresados en %. Sin embargo cabe recomendar el uso de mtodos analticos para su cuantificacin. 3.5. DESLUPINIZACIN Y OBTENCIN DE HARINA 3.5.1.Deslupinizacin Unodelosprincipalesproblemasqueafrontaelconsumodeltarwiesla presenciadealcaloidesqueledaesesaboramargo.Losalcaloidespuedenser txicos cuando es ingerido en exceso, por ello es de vitalimportancia realizar un desamargado para eliminar stos componentes (Tapia et al., 2006).Laeliminacindeestassustanciasesdevitalimportancia,puescaso contrarioelproductoquesepretendeobtener tendracontenidosdealcaloide,el cualesconsideradotoxicoanivelesaltosparaconsumohumano.Elmtodo 58 empleado para esta operacin fue los procedimientos de deslupinizado propuestos por Mujica ySven, (2006). Consistente en la aplicacin del mtodo denominado CuscoMejoradoconmodificacionesmnimas,conestemtodoselogralas menoresperdidasdeprotena.Eldiagramadeflujocomprendelassiguientes operaciones: 1 da 1 hora en ebullicin 5 das en agua Figura 11: Diagrama de flujo de deslupinizado del tarwi. 3.5.1.1.Descripcin del proceso de deslupinizado Remojo: El tarwi muestreado, se procedi a remojar en agua por un periodo de 1 da, con la finalidad de ablandar la estructura del grano y facilitar la transferencia de calor en la coccin. Coccin: En esta parte los granos de tarwi fueron sometidos a ebullicin, por un periododetiempode1hora(60minutos),talcomoserecomienda.Esta operacinpermitelarupturadelasestructurasfacilitandoladifusindelos alcaloidesporladesnaturalizacinparcialdelasprotenas(roturadelas estructuras complejas de la protena) a las que estn unidas.Lavado: Una vez ya coccionado los granos de tarwi se procedi a lavarlos en un tanque con sustituciones sucesivas de agua, esto fue realizado por un periodo de 5 das, esto en funcin al amargor. 3.5.2.Secado Comprendeladeshidratacindeltarwidesamargado,parasuposterior transformacinenharina,lacualeslamateriaprimaparalaextraccindelas Materia PrimaRemojoCoccinLavado-Extraccin 59 protenasenmedioalcalino.Ladeshidratacinserealizenunsecadorde bandejas hasta una humedad prximo al 10% que permita la obtencin de harina. 3.5.3.Molienda Posteriormenteseprocedialamolienda,utilizandounmolinode martillos, cuya finalidad es facilitar el proceso de extraccin proteica y separacin de componentes no proteicos, por tanto incrementar el contenido de protenas. La harina obtenida ingres posteriormente a la etapa de desgrasado. 3.5.4.Desgrasado Para la extraccin alcalina es necesario que el producto a solubilizar tenga bajo contenido de grasas, motivo por el cual esta etapa comprende el desgrasado. Laoperacininiciinmediatamenteunavezdesamargado,secadoyrealizadola molienda, la harina se disolvi con una solucin de etanol al 95% en una relacin de harina: solucin de 1:3 con tres extracciones consecutivos durante 5 horas cada una,finalmentela harina semi-desgrasada se volvi a moler segn sea necesario. Aunqueesrecomendableutilizarunaprensaparaextraerelaceitedeltarwi inmediatamentedespusdeldesamargado,conlafinalidaddereducircostosy posibles alteraciones qumicas. 3.5.5.Anlisis proximal de la harina de tarwi Elanlisisproximal,seharealizadosegnlosmtodosdelaAOAC,tal como se ha realizado en el anlisis proximal de la materia prima (Ver el punto de mtodos de anlisis 3.4). 60 3.6.OPTIMIZACIN DE LA EXTRACIN ALCALINA La optimizacin consta de tres etapas, los cuales comprende el Screening (eliminacin de las variables poco significativas), escalamiento (consistente en el acercamientohacialareginoptima)yfinalmentelaoptimizacinfinal (obtencin de la regin ptima y los puntos ptimos), (Ayala y Pardo, 1995). Unadelastcnicasmseficientesparalaoptimizacindeprocesosesla MetodologadeSuperficiedeRespuesta(MSR),lacualtienecomoobjetivo principaldeterminarlascondicionesdeoperacinptimaparaunsistema,o determinarlaregindelespaciodelosfactoresenlaquesesatisfacenlas condiciones de operacin (Dreyer, Coello y Montiel, 2000). Para este fin se sigui los procedimientos de optimizacin. 3.6.1.SCREENING El criterio de optimizacin usado fue maximizar el porcentaje de protenas en la etapa de extraccin alcalina. En esta etapa se identificaron las variables que sonsignificativasenlasolubilidadproteicayeltenorproteicodelaislado proteico,paraluegoseleccionardosnivelesporcadafactorysometera optimizacin mediante superficie de respuestas (Diseo compuesto central).Sehapriorizadoelestudiodelosefectosindividualesdelosfactores estudiadosbajoeldiseocompletoalazar,seevaluvariosnivelesporcada factorconlasquesebuscacomprendersucomportamientoparaposteriormente evaluar las interacciones mediante un diseo factorial. El mtodo aplicado fue tal comoproponeGuerreo(1986),CitadoporVenturaetal.,(2005).Dichas operaciones se muestran en el diagrama de flujo de la figura 12. La determinacin 61 laprotenasolubilizadaenbasealosparmetrosevaluados,seharealizadoen base ala metodologa de la AOAC. 960.52, Micro- Kjeldahl. pHdeextraccin(PE):Debidoaquelasolubilizacindeprotenases superiorapHalcalino(LindenyLorient,1996),seajustelpHdelasolucin segnlorecomendadoporGuerrero (1989)avaloresde3,5,7,9y11conHCl 0,1NyNaOH0,1Nsegnlorequerido.Semantuvieronconstanteslarelacin harina:solvente(1:20);temperatura50C(Chefteletal.,1989),paraelloseha empleado un equipo de baomarayse agit continuamentelasolucin durante 30 minutos, segn lo recomendado por Mustakas y Sohns (1976), quienes sealan queenesteintervalodetiempoelnitrgenoextradoaumentaconstantemente. Luegolasolucinsecentrifuga4000rpmdurante20min,elnitrgeno solubilizado fue determinado por el mtodo micro-Kjeldahl, tomando alcuotas de 2mLdelsobrenadante(portriplicado).Seelaborunacurvaconlosdatos obtenidos, relacionandola cantidad denitrgeno extrado, expresado como %de solubilidadenfuncindelpH.ElpHquepermitilamayorsolubilidadde protenas se uso para el proceso de optimizacin, sin embargo el uso de altos pHs puedenafectarlaspropiedadesfuncionalesdelasprotenas,inclusolaestructura misma imposibilitando la renaturalizacin proteica (Linden y Lorient, 1996). Relacinharinaysolvente(CH):SetrabajconelpHdefinidoenla seccinanterior(pH=9),temperaturade50Cyuntiempodeextraccinde30 min.Lasrelacionesharina:solventeanalizadasfueron:1:15,1:20,1:25,1:30y 1:35 segn lo recomendado por Guerrero (1989); Ventura et al., (2005). Temperaturadeextraccin(TE):Paradeterminarelefectodela temperaturasobrelacantidaddeprotenaextrada,setrabajsegnlo 62 recomendadoporGuerrero(1989);Venturaetal.,(2005),contemperaturasde 20,30, 40, 50 y 60 C,mantenindose constante el pH delasolucin del primer ensayo(pH=9),larelacinharina:solvente(determinadaenelensayoanterior, CH=1:30) y el tiempo de extraccin (30 minutos). Todaslassolucionesfueroncentrifugadasa4000rpmpor20min.El nitrgeno solubilizado fue determinado por el mtodo micro-Kjeldahl, tomndose alcuotasde2mLdelsobrenadante(portriplicado),expresndosecomo%de solubilidad(Venturaetal.,2005).Losdosnivelesdelosfactoresque permitieron la mayor solubilidad fueron seleccionadas para el diseo factorial (2k) de la primera etapa de optimizacin. 3.6.2.ESCALAMIENTO Medianteladeterminacindelasignificanciadelacurvaturaenlaetapa deScreeningseevalusiserequiererealizarlaetapadeescalamiento,que consisteenescalarsucesivamentehacialareginptima(mediantependientes ascendentes),hastallegaraubicarelrangodenivelesqueencierradicharegin (Ayala y Pardo, 1995). 3.6.3.OPTIMIZACIN FINAL El arreglo del experimento bajo el diseo compuesto central rotable, fue generadoenSTATISTICAV8.0tomandodosniveles(inferiorysuperior)por cadafactorseleccionado enla etapa de Screening.Este tipo de experimento para optimizacinempiezaconundiseofactorialestndarcondosnivelesyse agregadoscorridasadicionalesparacadafactor.Lascorridasadicionales, llamadaspuntosestrella,sonlocalizadasendistanciaspequeasigualespor debajo y encima del punto central, esto permite la estimacin de la curvatura con 63 respectoatalfactor.Mientrascadafactorseempiezavarindose,losotros factores son fijados en sus valores centrales (Ayala y pardo, 1995). Dicho arreglo fuealeatorizadoconlafinalidaddereducirelefectodevariablesocultascomo tendenciassobreeltiempoentreotrosygarantizarlavalidezestadsticadelos resultados,considerandounaprobabilidaddeerrortipoIde0,05(Muoz, Camargo y Gallego, 2008). El diseo tiene las caractersticas de ser rotable ya que lavarianzadelarespuestapredichaencualquierpuntodependesolodela distanciadelpuntoalcentrodeldiseoynodeladireccin,teniendolamisma precisin de estimacin en todas las direcciones (Fernndez y Pieiro, 2002). Elarreglodeexperimentosgeneradosporelprograma,representala secuenciadeexperimentosaejecutarbajolosvaloresmostrados.Elnmerode corridas se ha calculado con la siguiente frmula: N = 2k + 2k + n0 Donde: k es numero de factores, n0 nmero de puntos centrales y N es el nmero de corridas. Undiseocompuestocentralconstadepuntosfactoriales2kcompletoo fraccional, en el que los niveles estn en forma codificada (1) o en forma natural (tomandoelnivelinferiorysuperiordelfactor);n0 (1)puntoscentrales(que sonnecesariosparahallarlavarianciadelerrorexperimental)ylospuntos axiales, dos puntos axiales en los ejes correspondientes a cada uno de los factores, situadosaunadistancia=(2k)1/4delcentrodeldiseo,elcualesimportante paraasegurarlarotabilidaddediseoymostrarlasuperficiederespuestas (Fernndez y Pieiro, 2002; Montgomery, 2005). 64 Laoptimizacinporeldiseocompuestocentralpermitelaobtencinde un modelo matemtico emprico que explica el fenmeno, dicho modelo depende