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Análisis de interacciones reguladoras en transducción... Paloma Salinas Berná
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad d'Alacant. 2003
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Análisis de interacciones reguladoras en transducción
de señales de nitrógeno mediante el sistema del doble
híbrido de levaduras
Trabajo realizado en la División de Genética del Departamento
de Fisiología, Genética y Microbiología de la Universidad de
Alicante, para optar al grado de Doctor en Biología por la
Licenciada Paloma Salinas Berna
Alicante, 2003
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Análisis de interacciones reguladoras en transducción... Paloma Salinas Berná
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ASUNCIÓN CONTRERAS DE VERA, Profesora Titular de
Genética de la Universidad de Alicante
HAGO CONSTAR:
Que el presente trabajo ha sido realizado bajo mi dirección y
recoge fielmente la labor desarrollada por la Licenciada Paloma
Salinas Berna para optar al Grado de Doctor en Biología.
Alicante, Noviembre de 2003
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Agradecí mientos
A Asunción Contreras, por confiar en mí capacidad para llevar a cabo este
trabajo. Por su dedicación y entusiasmo por este proyecto desde el primer al
último momento.
A Rafael Maldonado, José Martín Nieto e Ignacio Luque, por permitirme
aprender de su amplia experiencia. Por su ayuda durante los años de
laboratorio y por soportar pacientemente mis largas discusiones y "comeduras
de coco".
A Isabel Martínez y María Luisa Cayuela, por su constante apoyo dentro del
laboratorio y por todos los momentos compartidos fuera de el. Gracias a
vosotras, las horas de laboratorio se hicieron más amenas. Me habéis ayudado
a aprender muchas cosas, tanto a nivel profesional y científico como a nivel
personal.
A Inma Fuentes por su inestimable ayuda técnica y por su entusiasmo
constante por el trabajo (¡incluso el rutinario y aburrido!). Sin las largas
charlas que hemos compartido y las sesiones de "despeje" (a costa de nuestros
pobres bolsillos) los últimos años no habrían estado tan llenos de buenos
recuerdos. ¡No cambies nunca!
A mís compañeros y vecinos del laboratorio de al lado. Por compartir penas,
quejas, malos ratos, experimentos fallidos, algún que otro reactivo y,
sobretodo, buenos cafés y buena música. A Fernando y Arantxa, porque sois
únicos. ¡Sé que vais a llegar lejos!!!
A Elena, por compartir los últimos cinco años de trabajo, charlas, y buenos
recuerdos. Empezamos siendo sólo dos en el laboratorio y ¡mira cuanta gente
hay ahora! Por haber estado siempre ahí para escuchar mis largos rollos
delante de un café. Se que conseguirás todo lo que te propongas.
Al Dr. Martin Drummond y a su grupo en el John Innes Centre (Norwich), por
acogerme durante una brevísima estancia en su laboratorio. Por su paciencia,
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entusiasmo y apoyo en el trabajo que realicé allí. Fue una experiencia
enriquecedora a nivel científico y personal.
A mis amigos de siempre. Junto a vosotros empecé mi andadura universitaria.
Porque se que a pesar de que nuestros caminos hayan tomado rumbos
diferentes siempre estáis al otro lado del teléfono o del correo electrónico, sea
la hora que sea y pase lo que pase. Entonces ya erais, y seguís siéndolo, como
el viento que ayuda a sostener mis alas.
A mi familia, por su apoyo incondicional y su cariño.
A mis hermanos, porque se que siempre están ahí, (aunque a veces no lo
parezca o yo no sepa verlo). Espero que sigáis poco a poco encontrando
vuestro sitio en este mundo (¡creo que empezáis a ir por buen camino!).
A mis padres, porque me han enseñado casi todo lo que se. Por haberme
inculcado el afán por conseguir todo con mi propio esfuerzo. Y por haberme
dado, con su educación y ejemplo, los dos mejores regalos que puede tener
una persona: unas sólidas raíces sobre las que basarme y unas fuertes alas
para poder volar.
A José. Llegaste en el momento más complicado, cuando todo era un remolino
en mi cabeza que no sabía deshacer. Me diste la paz y la serenidad necesarias
para saber encajar todas las piezas en su sitio y llevar este barco a buen
puerto. No se que me depara el camino que ahora se abre ante mi. Pero se
que, me lleve a donde me lleve, quiero andarlo contigo.
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-Hijo mío -dijo el padre-. Para volar, hay que
crear el espacio de aire libre necesario para
que las alas se desplieguen. Es como tirarse en
paracaídas: necesitas cierta altura antes de
saltar.
Para volar hay que empezar asumiendo
riesgos. Si no quieres, lo mejor quizás sea
resignarse y seguir caminando para siempre.
Jorge Bucay
Déjame que te cuente...
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índice
Introducción
1. Transducción de señales y sistemas de dos componentes.
1.1. Los sistemas de dos componentes en la era genómica
1.2. Regulación.
1.3. Organización y mecanismo.
1.4. Relación estructura-función en histidina quinasas.
1.5. Relación estructura-función en reguladores de respuesta.
2. Regulación de la asimilación del nitrógeno.
2.1. El sistema Ntr de enterobacterias.
2.2. Relación estructura-función en el sistema de dos componentes
NtrB/NtrC.
2.3. Los sistemas de dos componentes NifL/NifA en Klebiella
pneumoniae y Azotobacter vinelandit
3. El sistema del doble híbrido de levaduras y transducción de señales en
bacterias.
3.1. El problema biológico: Interacciones entre proteínas.
3.2. El sistema del doble híbrido de levaduras. Variantes y
secuelas
3.3. Contribución de las herramientas doble-híbrido al estudio de
la transducción de señales en bacterias
3.4. Ensayos doble híbrido: Consideraciones generales.
Objetivos
Materiales y Métodos
1. Estirpes y plásmidos.
2. Medios y condiciones de cultivo.
2.1.Cultivo de bacterias.
2.2. Cultivo de levaduras.
3. Procedimientos de obtención, manipulación, clonación y selección de
moléculas de DNA recornbinante.
3.1. Aislamiento de DNA de microorganismos.
3.1.1. Obtención de DNA genómico de Azotobacter vinelandü.
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índice
3.1.2. Obtención de minipreparaciones de DNA de S. cerevisiae.
3.2. Fragmentación de DNA genómico medíante sonicación.
3.3. Tratamiento enzimático de DNA.
3.3.1. Tratamiento con enzimas de corte y modificación del DNA.
3.3.2. Reparación de extremos de DNA.
3.3.3. Comprobación por PCR de fragmentos clonados.
3.4. Construcción de fusiones a dominios de GAL4 de AnfA y VnfA de A.
vinelandii.
3.5. Construcción de un plásmido para la sobreexpresión de AspA91-312
4. Obtención y conservación de genotecas doble híbrido en S. cerevisiae
PJ696.
Resultados y Discusión
1. Interacciones moleculares mediadas por NtrB, NtrC y sus dominios.
1.1. Diseño de proteínas de fusión y análisis doble híbrido.
1.2. Interacciones NtrC-NtrC.
1.3. Interacciones NtrB-NtrB.
1.4. Interacciones NtrB-NtrC.
1.5. Interacciones NtrB-GlnB.
Anexo I
Anexo II
2. Interacciones entre los activadores parálogos NífA, AnfA y VnfA de A.
vinelandii.
3. Identificación de proteínas implicadas en transducción de señales de
nitrógeno.
3.1. Fragmentación del genoma de A. vinelandii por sonicación.
3.2. Construcción genotecas >Sau3AI de E. coli.
3.3. Escrutinios de genotecas Sau3AI de E. coli con NtrB como cebo.
3.3.1. Interacciones NtrB-GlnK.
3.3.2. Interacciones NtrB-AspA.
3.4. Escrutinios de genotecas Sau3AI E. coli con GlnB como cebo.
3.5. Construcción de genotecas Tsp5091 de E. coli
3.6. Construcción de genotecas Sau3AI y Tsp509I de K. pneumoniae.
3.7. Escrutinios doble híbrido por conjugación.
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índice
Anexo III
Conclusiones
Bibliografía
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Introducción
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introducción
1, Transducción de señales y sistemas de dos
componentes.
1.1. Los sistemas de dos componentes en la era
genómica.
Con la aparición de los programas de análisis de secuencias, se puso de
manifiesto una sorprendente relación entre proteínas bacterianas
aparentemente no relacionadas (Drummond et al, 19S6; Kofoid & Parkinson,
1988; Nixon et al, 1986). Estas proteínas estaban implicadas en el control de
procesos como el metabolismo del nitrógeno en enterobacterias, la quimiotaxis
en E. coli y la esporulación en B, subtilis. Se clasificaron en dos grandes
familias: sensores y reguladores, entre las que la transmisión de la señal se
realiza a través de un mecanismo conservado de transferencia de grupos
fosfato. A diferencia de los entonces mucho mejor conocidos sistemas
eucarióticos, la fosforilación implicaba residuos His y Asp, en lugar de Ser/Thr
o Tyr. El término "sistema de dos componentes" se acuñó entonces para
referirse a este nuevo tipo de sistemas de regulación, en los que cada pareja de
sensor y regulador {más tarde denominado regulador de respuesta) constituye
la unidad básica del sistema de regulación (Gross et al, 1989; Stock et al,
1989; Stock et al., 1990). La secuenciación de genomas completos y su
posterior análisis han aportado una gran cantidad de información en cuanto a
diversidad y distribución biológica de estos sistemas de transducción de
señales, que, aunque presentes en los tres dominios, son mucho más
abundantes en Eubacteria que en Arehaea y Eukarya.
En bacterias, donde más importancia relativa adquieren estos sistemas,
su número puede variar considerablemente y refleja en buena medida la
necesidad de responder a ambientes cambiantes, y por tanto su capacidad de
adaptación. Así, en Escherichia coli se han identificado 62 proteínas
pertenecientes a estos sistemas (Mizuno, 1997), 27 en Streptococcus (Throup
et al, 2000) 70 en B. subtilis (Fabret et al, 1999), 80 en Synechocystis (Mizuno
et al, 1996} y ninguna en organismos como Micoplasma genitalium o
Methanoccoccus jannaschii (Mizuno, 1998). Recientemente, se ha creado una
base de datos, que incluye todas las proteínas pertenecientes a sistemas de
dos componentes identificadas en los distintos organismos (Maltsev et al,
2002). Los procesos celulares que regulan estos sistemas incluyen adaptación
metabólica a cambios en las fuentes de carbono (Island et al, 1992), nitrógeno
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Introducción
{Keener & Kustu, 1988), aceptares de electrones (Lin & Iuchi, 1991) o fosfato
{Wanner & Wilmes-Riesenberg, 1992); respuestas a cambios en la osmolaridad
{Mizuno, 1991), temperatura o pH; quimiotaxis (Stock et al, 2002);
diferenciación (Shapiro & Losick, 1997; Ward & Zusman, 1997) y esporulación
(Hoch, 1993; Perego, 1998). También actúan regulando procesos de especial
interés sanitario o medioambiental como los relacionados con patogénesis
(Groisman & Heffron, 1995), resistencia a antibióticos (Matsushita & Janda,
2002) o establecimiento de simbiosis {Gottfert et al, 1990).
En eucariotas, donde la presencia de estos sistemas de dos componentes
se restringe a levaduras, hongos, protozoos y plantas, los sistemas de dos
componentes identificados están implicados en osmorregulación, estrés y
procesos de desarrollo mediados por hormonas (Thomason & Kay, 2000).
Merece la pena destacar la ausencia de este tipo de sistemas en animales, no
habiéndose encontrado los correspondientes genes en ninguno de los genomas
completos analizados hasta la fecha (1998; Adams et al, 2000; Lander et al,
2001).
1.2. Regulación.
Con frecuencia el componente regulador de un sistema de dos
componentes está sometido a autorregulación, actuando la forma fosforilada
del regulador como activador o represor de su propio operón (Birkey et al.,
1994; Soncini et al, 1995; Ueno-Nishio et al, 1984; Wanner & Chang, 1987).
Por otra parte, dependiendo del tipo de ruta o proceso que controlan, algunos
sistemas de dos componentes producen una respuesta del tipo todo o nada,
como el sistema Spo que controla la esporulación en B. subtilis (Hoch, 1995),
mientras que otros median respuestas más graduales (Pratt & Silhavy, 1995).
En cualquier caso, las respuestas producidas son dependientes del nivel de
acumulación del componente regulador fosforilado, que a su vez puede
depender de diversas señales y componentes, que permiten optimizar la
respuesta en función de las necesidades de cada sistema concreto. Esta
multiplicidad de mecanismos de regulación permite la integración de distintas
señales metabóücas, proporcionando una importante flexibilidad.
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1.3. Organización y mecanismo. El único mecanismo demostrado de comunicación entre proteínas de los
sistemas de dos componentes (Bourret eí al., 1991) implica reacciones de
fosforilación y desfosforilación entre módulos altamente conservados. En el
sistema prototipo, cada componente esta formado por dos módulos
funcionales, aunque estos módulos pueden hallarse en solitario, es decir
constituir el único dominio de la proteína, o en combinación con otros
módulos de transferencia de fosfatos, dando lugar a las denominadas histidina
quinasas híbridas (Grebe & Stock, 1999; Wolanin eí al, 2002). Esto último
ocurre en la mayoría de los sistemas eucarióticos analizados.
Independientemente de su asociación con otros, los módulos conservados se
denominan transmisor y receptor, y se localizan, respectivamente, en la región
C-terminal de las histidina quinasas y N-termínal de los reguladores de
respuesta "clásicos". Dentro de cada componente, estos dominios conservados
se asocian a otros dominios no relacionados que funcionan como elementos de
entrada (dominio sensor o input} o de salida (dominio efector, regulador u
outpuf¡, respectivamente. El dominio input del componente sensor,
generalmente asociado a membrana, actúa detectando la señal específica del
sistema y regulando la actividad del módulo transmisor conservado, que a su
vez controla la fosforilación del dominio receptor del regulador de respuesta.
Esta fosforilación repercute drásticamente en la conformación de la proteína,
alterando la actividad del correspondiente módulo efector.
El módulo transmisor del componente sensor posee actividad auto-
quinasa, lo que le permite catalizar la incorporación de grupos fosfato desde el
ATP a residuos conservados de histidina presentes en este mismo módulo. Por
este motivo, los componentes sensores de los sistemas de dos componentes
reciben también el nombre de histidina quinasas. El residuo de fosfohistidina
es el sustrato para la transferencia del fosfato al dominio receptor del
regulador en una reacción que parece catalizada por el propio dominio
receptor, al igual que la desfosforilación (Hess eí al, 1988; Lukat eí al,, 1992).
En otros casos, la histidina quinasa promueve la rápida desfosforilación del
dominio receptor en respuesta a señales ambientales (Aiba eí al, 1989; Keener
8s Kustu, 1988; Lois eí al., 1993). Esta actividad recibe el nombre de actividad
fosfatasa regulada, aunque no está claro si implica una actividad catalítica
propia del módulo transmisor o una activación alostérica de la actividad
autofosfatasa del dominio receptor (Parkinson, 1993). Análisis genéticos y
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Introducción
bioquímicos en diversos sistemas indican que esta actividad juega un papel
central en la regulación de la actividad del componente regulador (Stock et al.,
2000). En otros sistemas, la desfosforilación del componente receptor está
mediada por proteínas no relacionadas con las histidina quinasas (Blat &
Eisenbach, 1994; Blat & Eisenbach, 1996; Ohlsen et al, 1994; Perego et al,
1994).
Así, pues, las actividades quinasa y fosfatasa de los sensores y
reguladores de respuesta constituyen la base bioquímica de la transducción
de la señal en los sistemas de dos componentes. A pesar de la gran cantidad
de análisis que se han llevado a cabo en algunas de estas proteínas, los
mecanismos moleculares operativos en la comunicación entre los distintos
módulos, y entre éstos y las señales de entrada y salida del sistema continúan
siendo en muchos casos desconocidos.
1.4. Relación estructura-función en histidina quinasas.
El módulo transmisor, de unos 250 aminoácidos, presenta una serie de
motivos altamente conservados en la superfamilia de las histidina quinasas. El
sitio de fosforilación, incluido en la región H, se localiza en posición N-terminal
respecto del resto de las secuencias conservadas que constituyen las regiones
N, G l , F y G2, denominadas asi por el residuo conservado que define al
corespondíente bloque de secuencias (Alex & Simón, 1994; Parkinson &
Kofoíd, 1992). En todos los casos estudiados, la autofosforilación tiene lugar
mediante un mecanismo de transfosforilación entre las unidades que
constituyen el dímero (Ninfa et al, 1993; Pan et al, 1993; Surette et al, 1996;
Swanson et al., 1993; Wolfe & Stewart, 1993). Los alineamientos de una gran
cantidad secuencias han permitido la clasificación de las histidina quinasas
en 11 subfamilias diferentes (Grebe & Stock, 1999).
Las estructuras tridimensionales de las histidina quinasas EnvZ y CheA,
indican la presencia de dos dominios diferenciados en el módulo transmisor
(Bilwes et al, 1999; Park et al, 1998). En EnvZ, el dominio fosfotranferasa,
central o de dimerización comprende las regiones H y N y forma una
estructura de cuatro hélices {four-helix bundle), a la que cada monómero
contribuye con dos hélices (Tomomori et al, 1999). Por el contrario en CheA,
una histidina quinasa atípica, la misma estructura de 4 hélices es
monomérica, y cada dímero CheA contiene dos de estas estructuras con sus
correspondientes histidinas fosforilables (Zhou et al, 1995).
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Introducción
El segundo dominio del módulo transmisor es el dominio quinasa o
catalítico, localizado en posición C-terminal. Las estructuras determinadas
para este dominio en EnvZ y CheA muestran una elevada homología con la
familia GHKL de ATPasas, a la que pertenecen las proteínas DNA girasa B,
Hsp90 y MutL (Bilwes et al, 1999; Tanaka et al, 1998). Esta similitud había
sido previamente observada a nivel de secuencia, fundamentalmente en los
motivos N, Gl , F y G2, que conforman el sitio de unión a ATP (Mushegían et
al, 1997).
La organización de ambos dominios, fosfotranferasa y catalítico, dentro
de la proteína y del dímero implican movimientos de estos dominios uno sobre
el otro para llevar a cabo la autofosforilación. Algunas evidencias sugieren que
las regiones entre dominios pueden ser importantes para permitir esta
flexibilidad de movimientos.
Las histidína quinasas pueden llevar asociados diferentes tipos de
dominios sensores, que pueden ser extracelulares o citoplasmáticos,
diseñados para interacciones específicas con sus ligandos o estímulos (Dutta
et al, 1999; Galperin et al, 2001; Stock et al, 2000). Esta enorme variedad se
refleja en una muy baja similitud de secuencia y tamaño existente entre los
sensores pertenecientes a distintas histidína quinasas. Los sensores
extracelulares se encuentran conectados al citoplasma y al módulo transmisor
a través de una o más regiones transmembrana. Entre los dominios sensores
citoplasmáticos, se han identificado en muchos casos la presencia de dominios
tipo PAS o GAF. Estos dominios actúan como módulos de detección de
diferentes tipos de señales {luz, potencial redox, etc..) y su función suele estar
asociada a la unión de un cofactor o a interacciones proteína-proteína (Taylor
&Zrrulin, 1999).
La mayoría de las histidína quinasas contienen una región de unos 50
amino ácidos con dos segmentos en hélice separados por una corta región más
compacta, denominada "linker" (o HAMP), que precede a la región H y que
parece jugar un papel importante en la transducción de señales (Appleman et
al, 2003; Aravind & Ponting, 1999; Hsing et al, 1998). Diversos análisis
mutacionales sugieren su implicación en un correcto alineamiento de los
monómeros (Appleman & Stewart, 2003; Hsíng et al, 1998; Raivio & Silhavy,
1997). En base a la naturaleza dinámica de estas estructuras, se ha propuesto
un posible papel en la detección de cambios conformacionales producidos en
el dominio sensor y su transmisión al módulo transmisor (Park & Inouye,
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1997). La localización de la histidina fosforilable cerca del extremo de una
estructura de este tipo sugiere que un cambio en la conformación de dicha
estructura podría controlar la accesibilidad de esta histidina al dominio
quinasa, permitiendo la fosforilación (Hsing eí al, 1998).
1.5. Relación estructura-función en reguladores de
respuesta.
El dominio que caracteriza a un regulador de respuesta es el dominio
receptor, que suele tener unos 125 residuos y presenta homología con las
GTPasas eucarióticas (Artymiuk eí al, 1990; Chen eí al, 1990; Stock eí al,
1991). La mayoría de los reguladores de respuesta contienen dos dominios: el
dominio receptor conservado en su extremo N-terminal, y un dominio efector
en su extremo C-terminal. Estos últimos están generalmente implicados en
regulación transcripcional, aunque también se conocen algunos ejemplos de
dominios efectores con actividad enzímática, como es el caso de CheB (Simms
eí al, 1985).
Los reguladores de respuesta que actúan como reguladores
transcripcionales pueden clasificarse en tres subfamilias en función de la
homología que presentan en su dominio efector C-terminal. Estas subfamilias
reciben el nombre del regulador representativo de la subfamilia: OmpR, NarL y
NtrC (Gross eí al, 1989). Aunque todos ellos contienen motivos de unión a
DNA del tipo hélice-vuelta-hélice, la estructura del dominio que lo contiene es
diferente. Las interacciones que cada regulador de respuesta presenta con la
maquinaria de transcripción y el mecanismo de activación de la transcripción
varían entre componentes de una misma subfamilia.
La primera estructura tridimensional obtenida para un dominio receptor
fue la de la proteína CheY, implicada en el control de la quimiotaxis en E. coli,
y que no contiene dominios efectores asociados (Stock eí al, 1990; Volz,
1993). Todos los dominios receptores cuya estructura ha sido resuelta desde
entonces, y que incluyen a NtrC (Volkman eí al, 1995), PhoB (Sola eí al,
1999) ó CheB (Djordjevic eí al, 1998), tienen una estructura similar a la
determinada para CheY.
Los dominios receptores catalizan la transferencia del grupo fosfato
desde la correspondiente histidina quinasa a su propio residuo de Asp. Esta
autofosforilación del dominio receptor también puede llevarse a cabo
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introducción
utilizando como sustrato pequeñas moléculas donadoras como el acetilfosfato
(Lukat et al, 1992) o, a menos in vitro, a los residuos de fosfohistidina de
histidina quinasas pertenecientes a otros sistemas. Las tasas de fosforilación
en ambos casos son mucho menores que las obtenidas utilizando como
sustrato su correspondiente histidina quinasa (Fisher et al, 1996; McCleary,
1996).
En la mayoría de los casos, los dominios receptores catalizan su propia
desfosforilación con eficiencias que difieren considerablemente de un
regulador a otro, con oscilaciones en el tiempo de vida medio de la forma
fosforilada de entre segundos y horas. Estas diferencias reflejarían las
necesidades propias de cada sistema.
Los estudios genéticos, bioquímicos y biofisicos llevados a cabo con
diferentes reguladores ha permitido elaborar hipótesis para explicar la
transducción de las señales intramoleculares. Los reguladores de respuesta se
encontrarían en equilibrio entre dos estados conformacionales alternativos:
inactivo y activo. La fosforilación del dominio receptor provocaría un cambio
conformacional que desplaza este equilibrio hacia la forma activa (Birck et al.,
1999; Halkides et al, 2000; Kern et al, 1999; Lewis et al, 1999; Nohaile et al,
1997; Zhu et al, 1997). Las regiones alteradas tras la fosforilación coinciden
con las superficies previamente identificadas por su implicación en
interacciones proteína-proteína y difieren de un regulador a otro. Las
consecuencias de estas interacciones intramoleculares también pueden ser
muy diferentes. En algunos casos se modifican regiones implicadas en la
interacción con sus correspondientes histidina quinasas u otras proteínas
auxiliares que controlan la actividad de los reguladores de respuesta. En otros
casos, la fosforilación promueve la dimerización u oligomerización de la
proteína, requerida para alguna de sus actividades, la liberación de
interacciones inhibitorias o la regulación de la actividad enzimática.
2. Regulación de la asimilación de nitrógeno.
2.1. El sistema Ntr de enterobacterias.
En enterobacterias, la actividad de la glutamina sintetasa {GS) y de otros
enzimas importantes en la asimilación de nitrógeno está regulada de acuerdo
con la disponibilidad de fuentes de nitrógeno, entre las cuales el amonio es la
que permite la mayor velocidad de crecimiento. La GS y en general las
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introducción
proteínas implicadas en el transporte y catabolismo de fuentes alternativas de
nitrógeno se sintetizan a bajos niveles cuando dicho nutriente es abundante, y
a altos niveles en ausencia o escasez de amonio (Kustu et al, 1979; Merrick &
Edwards, 1995; Neidhardt & Magasanik, 1957; Pahel, Rothstein & Magasanik,
1982; Prival & Magasanik, 1971).
Los genes implicados en la asimilación de fuentes alternativas de
nitrógeno se agrupan en varios operones ntr (de nitrogen regulation), que en
conjunto se conocen como el reguión Ntr. Este reguión incluye sistemas de
movilización y transporte de aminoácidos como glutamina (glnHPQ), arginina
(argT) o histidina (hisJQMP), genes implicados en la asimilación de nitrato y
nitrito (nasFEDCBA) y, en K. pneumoniae, los genes reguladores de la fijación
de nitrógeno atmosférico (nifLA) (Ninfa et al, 2000; Reitzer, 2003). La
expresión de estos operones está regulada por el sistema de dos componentes
NtrB/NtrC. La histidina quinasa NtrB (también llamada NRII) está codificada
por el gen ntrB (glnL) y el regulador de respuesta NtrC (NRI) por el gen ntrC
(glnQ.
En condiciones limitantes de amonio, NtrB fosforíla al regulador
transcripcional NtrC, mientras que en condiciones de exceso de nitrógeno
promueve su desfosforilación. La proteína activa (NtrC-P) regula positivamente
al conjunto de promotores ntr, que tienen en común la presencia de
secuencias UAS (de Upstream Activator sequence), también llamadas
intensificadoras o enhancers, localizadas a cierta distancia del inicio de la
transcripción. Estos promotores dependen para su actividad de NtrC-P, que
reconoce una secuencia consenso centrada a 100-150 pb aguas arriba del
inicio de la transcripción, y de la RNA polimerasa cargada con el factor sigma
alternativo a54 (Ea54) (Hirschman et al, 1985; Ninfa, Reitzer & Magasanik,
1987; Reitzer & Magasanik, 1986; Reitzer, Movsas & Magasanik, 1989). Los
promotores dependientes de Ea54 presentan secuencias consenso centradas a
-12 y -24 con respecto al inicio de la transcripción en +1, mientras que la
inmensa mayoría de los promotores de enterobacterias están definidos por
secuencias consenso a -10 y -35 (Merrick, 1993).
Los genes ntrB y ntrC comparten operón con glnA, el gen estructural de
la glutamina sintetasa, y enzima clave en la asimilación de nitrógeno. Estos
tres genes se transcriben en el orden glnA, ntrB, ntrC (Esphi et al, 1982) a
partir de tres promotores distintos: glnApl, glnAp2 y ntrB (Pahel et al, 1982).
Las dos primeros están situados aguas arriba del gen glnA y el tercero se
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Introducción
encuentra entre los genes glnA y ntrB. En condiciones de exceso de amonio,
tiene lugar una expresión basal del operón a partir de los promotores glnApl y
ntrB. Estos son promotores típicos, dependientes del factor de iniciación
transcripcional 070 (Reítzer & Magasanik, 1985) y están negativamente
regulados por NtrC (Ueno-Nishio et al, 1984). En condiciones de carencia de
amonio, la transcripción se realiza a partir del promotor glnAp2, dependiente
de cr54 y NtrC, lo que permitte la amplificación de la señal correspondiente
(Hunt & Magasanik, 1985; Reitzer & Magasanik, 1985).
A diferencia de otros sistemas de dos componentes, la histidina quinasa
NtrB no detecta directamente la señal, sino que le es comunicada por las
proteínas triméricas PII, codificadas por los genes parálogos glnBy glnK. Tanto
GlnB como GlnK son modificados por la enzima UTasa/UR, producto del gen
glnD, en función de la concentración intracelular de glutamina. En
condiciones de escasez de nitrógeno (baja concentración de glutamina), la
UTasa uridilila a GlnB y GlnK, mientras que en condiciones de exceso de
nitrógeno cataliza la reacción contraria (Arcondeguy et al, 2001). Las formas
no uridililadas de las proteínas PII inhiben ligeramente la actividad
autoquinasa e inducen la actividad fosfatasa de NtrB (Atkinson & Ninfa, 1999;
Jiang & Ninfa, 1999; Jiang et al, 2000). Este efecto resulta en la rápida
desfosforilación de NtrC-P {Kamberov et al, 1995). En ausencia de proteínas
PII, o en presencia de sus formas modificadas (GlnB-UMP y/o GlnK-UMP),
prevalece la actividad quinasa de NtrB (Jiang eí al, 2000). A pesar de sus
funciones comunes, el papel fisiológico de las proteínas GlnB y glnK difiere
debido a sus diferentes patrones de expresión (Atkinson et al, 2002). Por otra
parte, las proteínas PII forman heterotrímeros estables, aunque con
propiedades distintas de los homotrímeros, que han sido puestas de
manifiesto tanto in vitro como in vivo {Forchhammer et al, 1999; van Heeswijk
et al, 2000 y datos sin publicar). La formación de heterotrímeros añade por
tanto nuevas sutilezas a la regulación dependiente de nitrógeno (van Heeswijk
et al, 2000).
Además de en el control transcripcional del reguión Ntr, las proteínas PII
juegan un papel clave en el control de la actividad glutamina sintetasa (GS).
Esta regulación la ejercen a través de la ATasa o
adeniltransferasa/adenilremovasa, codificada por glnE. Las actividades de la
ATasa son reguladas en función del grado de uridililación de las proteínas PII
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Introducción
(Jaggi et al, 1997). La adenilación de la GS resulta en una rápida inactivación
del enzima (Rhee et al, 1985; Rhee et al, 1989).
Las interacciones clave en las que participan los componentes
reguladores de la asimilación de nitrógeno en enterobacterias se resumen
esquemáticamente en la Figura 2
ATasa glutamina
0 i! GlnB
U T a s a \ \ PII / 1 NtrB(P)l— NtrC(P) GlnK
oxoglutarato S^ / Qenes ntr * aen
nifA
Figura 2. Regulación de la asimilación de nitrógeno en K.
pneumoniae. Los detalles se describen en el texto.
2.2. Relación estructura función en el sistema de dos
componentes NtrB/NtrC.
NtrB es una proteína de 369 aminoácidos, cuya organización modular se
representa esquemáticamente en la Figura 3. La región N-terminal de NtrB,
bastante diferente a las de la mayoría de las histidina quinasas, es esencial en
la regulación de las actividades quinasa y fosfatasa de NtrB. En esta región, y
en particular en el linker que precede al sitio de fosforilación, se localizan la
mayoría de las mutaciones reguladoras (Ninfa et al, 1995; Pioszak & Ninfa,
2003a). En el extremo N-terminal se localiza una región con homología a los
recientemente identificados dominios PAS, implicados en la unión de ligandos
reguladores y en interacciones proteína-proteína.
El módulo transmisor conservado presenta una organización típica,
estando compuesto por dos dominios estructurales y funcionales. El dominio
central o fosfotransferasa contiene el sitio de autofosforilación His-139 y el
dominio C-terminal, quinasa o catalítico contiene el resto de los motivos de
secuencia conservados (Kramer 85 Weiss, 1999; Jiang et al, 2000; Kramer &
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iniroclucx-io::
Vv'eiss. i999). La autofosforilación de NtrB implica transfosforilación entre
subun idades (Ninfa et ai. 1993). En condiciones de deficiencia de nitrógeno.
NtrB promueve la transferencia del grupo fosfato desde su residuo de his t icma
al residuo Asp54 del domino receptor de NtrC. mientras que en suficiencia de
nitrógeno promueve la desfosforilación de NtrC a través de su actividad
fosfatasa. Ensayos con derivados t runcados indican que esta actividad reside
en el dominio central y sugieren que es necesaria u n a determinada
conformación ce dicho dominio para inducirla. La actividad fosfatasa cíe NtrB.
que rx es una reversión de la reacción de transferencia, de fosfato es el blanco
principal cic las proteínas PII (Jiang et ai. 2000: Pioszak & Ninfa. 2003a:
Pioszak & Ninfa. 2003b).
El reguiador de respues ta NtrC pertenece a la subfamilia de activadores
trar.scripcicnales dependientes de a5 : (Kustu et ai. 1989:. Se t ra ta ele u n a
proteir.a cimérica en la que se distinguen tres dominios es t ructurales v
funcionales Figura. 3: ;Drummond et ai. 1986). El dominio N-termmal de 123
aminoácidos es el módulo receptor conservado, fosforilado por NtrB en Asp-5-1-
El dominio centra.! interacciona con el complejo transcripeior.al E~ : _•
contiene un motivo de unión a ATP (Morctt & Segovia. 1993: Osuna. Soberon
& Morett. 1997.. El dominio C-tcrminal contiene un motive H-'i'-i: -cíe E'exv
T:.¿n:-Iielix o hélice-giro-hélice necesario para la unión a ENA Ccntrerax &
Drummonci. 19SS• y es también necesario para la dimenzación de NtrC Portcr
et ai. 1993: Shiau. Chcn & Reitzer. 1993).
La fosforilación de NtrC aumen ta la coopcratividac en su tmiór. al
enhancer en el DNA ;Chen & Reitzer. 1995: Portcr et ai. 1993' Wciss ?:, ai.
1991 ' . estimula la actividad ATPasa e induce la formación de oiigómercs sobre
los sitios de unión a 1DNA (Hwang et ai. 1999: VVeiss et ai.. 1992: IVyman et
ai. 1997'. Mientras que la capacidad de represión reside en el dominio ele
unión a ENE iContreras & Drummonci. 1988: Erummonci et ai. 199C:. la
función activacora requiere los tres dominios de la proteína Erummonxl el ai.
1990, y es notablemente más compleja. Únicamente la forma fosfonlaxla de
NtrC es capaz de activar la transcripción (Ninfa & Magasanik. 1986:.
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Introducción
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2.3. Los sistemas de dos componentes NifL/NifA en
Klebsiella pneumoniae y Azotobacter uinelandii.
La capacidad de fijar nitrógeno atmosférico supone un alio coste
energético, que unido a la sensibilidad de la enzima ni t rogenasa al oxigene,
obliga a un estricto control de los genes correspondientes (genes nifl. La
regulación ele estos procesos ha sido ampliamente estudiada en varíes
organismos modelo, entre ellos K. pneumoniae, enterobacteria que fija
nitrógeno en anaerobiosis. y A. uinelandii, u n aerobio estricto.
Tanto en K. pneumoniae como en A. uinelandii, la expresión de los genes
.".;/" es dependiente del regulador transcripcional NifA. codificado por nifA. que
comparte operon con el gen nifL. En condiciones de exceso de nitrógeno y
presencia de oxígeno. NifL forma un complejo proteico con NifA inhibiendo su
actividad. La formación de este complejo NifLA está modulada por cambios
redox e interacción con ligandos y otras proteínas reguladoras (Schmitz el al..
2002:.
Las proteínas NifL presentan uno o dos dominios PAS en su región X-
tcrmina'. en K. pneumoniae o .4. uinelandii. respectivamente.. irr.pLca.doiS en
la detección del estado redox mediante la unión a un cofactor LAD HL1 ez al.
1996: Schrnnz. 1997). Los dominios C-terminal de las proteínas Nifl..
comparten homología con histidina quinasas , a u n q u e no están implicados en
transferencia de fosfato (Blanco et al, 1993; Drummond & Wootton. 1987) El
dominio C-terminal de NifL de A. uinelandii es capaz de unir nucleótidos
(Soderback et al. 1998). mient ras que no se h a demostrado ic mismo en el
caso de NifL ele K. pneumoniae (Klopprogge et al, 2002).
Las proteínas NifA comparten homología en sus dominios centra, y C-
ternninal con reguladores transcripcionales dependientes ce factor stgma 5 -
ceme XtrC Lvíoreit & Buck. 1988; Morett et al. 1988: Studholme & Dixon.
20031. En su región N-terminal presentan un dominio GAF. que ha sido
relacionado con la regulación de NifA en respues ta a oxígeno.
La regulación de la activación de NifA en función de ia disponibiiciaá de
nitrógeno se realiza a través de la proteína GlnK; aunque el mecanismo difiere
en Celda organismo. En K. pneumoniae. een condiciones ce ausencia de
nitrógeno. NtrC-? activa la expresión de GlnK. La interacción de Glr.X con el
complejo XifLA promueve su disociación, permitiendo la activación de XifA 1-1 c
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http://irr.pLca.doiS
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Introducción
et ai, 1998; Jack et al, 1999). En el caso de A. vinelandii, donde la expresión
de GlnK es constitutiva (Colnaghi et ai, 2001; Meletzus et al, 1998), la forma
no modificada de GlnK promueve la formación de un complejo ternario
inhibitorio de la actividad de NifA. En condiciones de falta de nitrógeno, la
modificación de GlnK promueve la liberación del complejo y la activación de
NifA.
En A. vinelandii, existen tres nitrogenasas alternativas que contienen
diferentes cofactores. La expresión de los genes correspondientes requiere
activadores específicos. Asi, NifA activa la expresión de la nitrogenasa de
hierro y molibdeno, mientras que sus parálogos VnfA y AnfA activan la síntesis
de las nitrogenasas de hierro y vanadio y hierro solo, respectivamente (Joerger
et ai, 1989}. Algunos genes nif pueden ser activados transcripcionalmente por
cualquiera de los tres reguladores. La presencia en dichos promotores de sitios
de unión solapados para los tres reguladores puede implicar la existencia de
interacciones moleculares entre ellos, que jugarían un papel en el control de
estos genes en las distintas situaciones fisiológicas (Drummond et ai, 1996).
3. El sistema del doble híbrido de levaduras y
transducción de señales en bacterias.
3.1. El problema biológico: Interacciones entre proteínas.
Las interacciones pro teína-pro teína y su especificidad son fundamentales
en los más variados procesos biológicos, incluyendo la formación de
estructuras celulares, complejos enzimáticos y otras asociaciones más
transitorias y no exentas de complejidad, como las que pueden tener lugar
entre proteínas implicadas en transducción de señales. Puesto que la
supervivencia de las bacterias depende en buena medida de la capacidad de
detectar e integrar estímulos ambientales para producir una respuesta celular
apropiada, el estudio de las interacciones que tienen lugar entre componentes
de las rutas de transducción de señales es fundamental para entender las
estrategias de adaptación de los microorganismos.
La complejidad de los procesos de transducción de señales se sustenta,
en gran parte, en la multifuncionalidad de las proteínas implicadas en estos
procesos. Esta multifuncionalidad puede ser un reflejo de las actividades de
los diferentes dominios de la proteína, pero también de la interacción un
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Introducción
mismo dominio con diferentes componentes celulares. Esto explicaría el efecto
pleiotrópico de muchas mutaciones en este tipo de genes. La existencia de
redundancia de funciones, a su vez, complicaría la correspondiente
adscripción fenotípica de los mutantes (Schaechter, 2001). La visión "lineal",
en la que la amplificación de una señal a través de actividades catalíticas
sucesivas conduce a una respuesta celular, ha dado paso a una visión más
interactiva en la que las proteínas reguladoras de una ruta modulan su
actividad en función de interacciones con otros reguladores y componentes
celulares. Diferentes señales pueden así converger en elementos comunes o
ser anuladas o amplificadas, en función de la actividad de los distintos
componentes celulares, permitiendo una regulación coordinada y flexible en
función de las condiciones ambientales. Por todo ello, más que de rutas habría
que hablar de redes de transducción de señales.
3.2, El sistema del doble híbrido de levaduras. Variantes
y secuelas.
En la década de los ochenta se describió la organización modular de los
reguladores transcripcionales eucarióticos, constituidos por dominios de
activación (AD, de Activation Domain) y dominios de unión a DNA (BD, de
Binding Domain)(Keegan, GUI & Ptashne, 1986; Ma & Ptashne, 1987a; Ma &
Ptashne, 1987b). Esta separación de funciones fue elegantemente demostrada
en experimentos de intercambio entre el dominio de activación de la proteína
GAL4 de S. cerevisiae y el represor de LexA de E. coli, compuesto por un solo
dominio de unión a DNA (Brent & Ptashne, 1985) y posteriormente confirmada
con ejemplos en los que los módulos AD y BD son proporcionados por
proteínas diferentes (Ptashne, 1988; Triezenberg, Kingsbury & McKnight,
1988a; Triezenberg, LaMarco & McKnight, 1988b). Estos experimentos fueron
la base para el desarrollo de una nueva metodología en el estudio de las
interacciones proteína-proteína in vivo: el sistema del doble híbrido de
levaduras (Fields & Song, 1989). En este sistema, los módulos AD y BD son
acercados mediante la interacción entre las proteínas a las que han sido
fusionados (Figura 4). Esta interacción da lugar a la activación de genes
testigos, en los que promotores dependientes del dominio BD utilizado han
sido fusionados a genes cuya actividad es fácilmente detectable. Según el tipo
de genes testigo presentes en las cepas de levaduras empleadas (típicamente
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Introducción
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b)
UASf
©
• »
*** r Gar//
c)
d)
• • • • • " • • • • . . .
•
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Figura 4. Detección de interacciones moleculares mediante el sistema del doble hibrido. a) La activación del promotor gall por la proteína modular Gal4 requiere la unión a DNA del dominio BD y la interacción con la RNA Polimerasa II medíate el dominio AD. b) La fusión del dominio BD a la proteína de interés X no activa la transcripción, c) La fusión entre el dominio AD y la proteína Y tampoco activa la transcripción, d) La expresión simultanea de ambas proteínas de fusión reconstituye la actividad transcripcional si las proteínas X e Y interaccionan entre sí.
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[ni roduccióii
un marcador nutricional como HIS3 o el gen lacZ de E. coh). la interacción
puede visualizarse directamente en medios específicos o cuamiñearse
mediante determinación de actividades enzimáticas.
Ademas del ya clásico s is tema del doble híbrido basado en GAL4, se han
desarrollado otros, como los basados en LexA y la protcina VP16 del virus del
herpes ¡Vojtek et al.. 1997) o en LexA y B42 de E. coli (Goicmis & Bren;.. 1997i.
En los años siguientes a la descripción de la técnica, la simplicidad del ensayo
hizo crecer" rápidamente sus aplicaciones. Las variantes de uno o tres híbridos
permiten, respectivamente, el estudio de interacciones DXA-pro:eína Li &
Fieles. 1993. Wang & Stillman, 1993) o RNA-proteína (Putz. Skehe". & Kuhl.
1996 . Las vanan tes '"reversas" permiten la identificación y el estudio de
mutaciones y moléculas que destruyen interacciones proteína-proteína o DXA-
proteítia Lcanna & í lannink. 1996; Vidal et al. 1996¡. Una de las aplicaciones
más potentes es. sin duda, la identificación de proteínas capaces de
interaccionar con otra de interés, mediante el escrutinio de genotecas cíe
expresión.
Más recientemente, se han desarrollado u n a serie ce s is temas doble
híbrido bacterianos. Algunos de estos s is temas están basados , de manera
homologa a ios s is temas de levaduras, en la obtención de reguladores
t ranscnpcionales híbridos, tanto represores (Hu et al. 1990: Kornacker el a'..
1998: Oer:el-Buchheit et al.. 1993) como activadores Dove et al. 1997:
Jappelli & Brer.r.er. 1998: Kolmar et al. 1995). El s is tema más conocido, sin
embargo, se basa en la reconstitución, en u n a estirpe cya deficiente en
adenilatc ciclasa, de E. coh de la actividad de la enzima aderulato ciclasa ce
Borceteila per tussis (Karimova et al. 1998). A pesar de que estos s is temas
han sido aplicados con éxito en diversos estudios, su uso no ha sido todavía
generalizado y no se han publicado, has ta donde sabemos, resultados
procedentes de escrutinios de genotecas. con lo que. para. a lgunas
aplicaciones, los sisteman bacterianos son todavía estrategias "de nesgo" Hu
et al. 2000: Ladant & Karimova. 2000).
3.3. Contribución de las herramientas doble-híbrido al
estudio de la transdueción de señales en bacterias. La concentración de recursos en la investigación de s is temas de
t ransdueción de señales relacionada con procesos de desarrollo y cáncer, ha
.Í2
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Introducción
influido en el éxito espectacular de las estrategias doble híbrido. Esta
circunstancia, ha hecho que sepamos hoy en día más sobre las interacciones
proteína-proteína en las complejas rutas de transducción de señales
eucaríóticas que en las mediadas por sistemas de dos componentes en
bacterias.
En investigación científica es común la utilización de sistemas simples
para el estudio de sistemas más complejos. Así, durante décadas, una buena
parte de los conocimientos sobre el funcionamiento de los seres vivos a nivel
molecular han sido obtenidos en E. coli. Esta bacteria y en menor medida la
levadura Saccharomyces cerevisiae, son utilizadas de forma rutinaria, en
laboratorios de todo el mundo, como herramientas en el análisis y
manipulación de genes y genomas de organismos pluricelulares. En el marco
de la Genética clásica ambos microorganismos han compartido protagonismo
con otros sistemas modelo como Drosophüa melanogaster, sometidos a análisis
genéticos cada vez más sofisticados. Quizás esta lógica, que implica en
muchos casos trabajar con organismos simples para intentar extrapolar a
otros más complejos, explique el retraso en la aplicación del sistema del doble
híbrido al estudio de interacciones proteicas en procariotas. Es hecho es que,
tras una cierta resistencia a la utilización de herramientas genéticas
eucaríóticas para estudiar procesos biológicos bacterianos, este tipo de
aproximación se ha consolidado en la literatura científica {Bartel et al., 1996;
Lei et al., 1999; Rain et al., 2001). Es este contexto, la menor complejidad de
los genomas bacterianos y su distancia evolutiva a levaduras implican, al
menos en teoría, que el ruido de fondo debido a interacciones con
componentes endógenos sea menor que con proteínas eucariotas. Basándose
en esta premisa, algunos autores sugieren que el uso del sistema de levaduras
sería preferible en el estudio de proteínas procariotas, mientras que el sistema
bacteriano sería el ambiente apropiado para el estudio de proteína de origen
eucariótico (Hu et al., 2000).
La secuencia genómica de B. coli revela que una importante fracción de
sus hipotéticos productos génicos son todavía de función desconocida. Los
sistemas doble híbrido permiten obtener información sobre estas proteínas, a
partir de la identificación y análisis de las interacciones en las que participan.
Proporcionan por tanto, herramientas fundamentales en "genómica funcional",
que complementan las aproximaciones genéticas y bioquímicas clásicas. En el
contexto concreto de la transducción de señales de nitrógeno en
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Análisis de interacciones reguladoras en transducción... Paloma Salinas Berná
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Introducción.
enterobacferias, intensamente estudiada, el sistema del doble híbrido de
levaduras, al estar basado en una premisa distinta (la detección de
interacciones proteína-proteína), nos permite abordar aspectos como la
identificación nuevos elementos, de función conocida o no, en las redes de
transducción de señales, así como obtener información relevante sobre los
dominios y motivos proteicos implicados en las interacciones detectadas.
3.4. Ensayos doble híbrido: Consideraciones generales.
Actualmente existe una gran variedad de vectores y estirpes que
permiten "personalizar" el sistema del doble híbrido para adecuarlo a objetivos
experimentales concretos (Bartel & Fields, 1997; Zhu & Hannon, 2000),
aunque el sistema más utilizado sigue siendo el basado en el regulador GAL4.
A los componentes básicos de todos los vectores pueden añadirse elementos
adicionales, que facilitan la detección y posteriores estudios de las proteínas
de fusión. Estas secuencias, sin embargo, pueden aumentar la probabilidad
de recombinaciones entre los plásmidos en el interior de la levadura, lo que
puede dificultar la detección de algunos clones interesantes (falsos negativos),
o generar fusiones capaces de activación independiente del cebo (falsos
positivos) (Fromont-Racine et al, 1997).
Los distintos tipos de vector permiten diferencias en el nivel de expresión
de las proteínas de fusión, en las dianas de restricción del MCS (sitio de
clonación múltiple) y en el marcador de selección para levaduras. Así por
ejemplo, un elevado nivel de expresión de las proteínas de fusión puede
favorecer la detección de interacciones débiles, pero aumenta la probabilidad
de que la proteína de fusión expresada resulte tóxica para la célula. Este
fenómeno, particularmente si afecta a la fusión a utilizar como cebo en los
correspondientes escrutinios, repercute negativamente en el número de clones
detectado. La utilización los vectores AD y BD con el mismo MCS facilita la
construcción de los dos tipos de fusiones necesarias para la realización de
ensayos recíprocos, en los que se intercambian los módulos de GAL4
fusionados a una pareja concreta de proteínas. La disponibilidad de variantes
que difieran en la pauta de lectura del MCS, a su vez, resulta particularmente
importante en la construcción de genotecas por fragmentación enzimática. Por
último, los marcadores de selección de levaduras presentes de los vectores
suelen ser de tipo nutricional, y la única característica a tener en cuenta es
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Introducción
que sean compatibles con la estirpe de levadura seleccionada para realizar los
ensayos.
Los genes testigo más utilizados en análisis doble híbrido son aquellos
que permiten una selección nutricional (ADB2 ó HIS3), debido a su facilidad de
ensayo. El marcador lacZ es también ampliamente utilizado, tanto en ensayos
líquidos (actividad (5-galactosidasa), que producen resultados cuantitativos,
como en placa (X-gal). Las características del promotor {tipo y repeticiones de
las secuencias UAS) al que se encuentra fusionado el gen testigo permiten
detectar y /o discriminar interacciones más o menos débiles.
La presencia en una misma estirpe de varios marcadores de selección
bajo el control de diferentes promotores facilita la discriminación de señales
no derivadas de la interacción entre las fusiones ensayadas {falsos positivos).
Aunque las causas de la aparición de este tipo de clones son diveras y no
siempre pueden establecerse (Bai & Elledge, 1997), suelen asociarse a
mutaciones genómicas o a la capacidad de algunas fusiones GAL4AD de
unirse de manera específica a promotores concretos.
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Objetivos
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Objetivos
El objetivo fundamental de este proyecto de investigación es contribuir
a la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en transducción
de señales de nitrógeno en bacterias mediante la utilización del sistema del
doble híbrido de levaduras. El reto estaba en demostrar que una herramienta
genética eucariótica podía utilizarse para aportar información en sistemas de
transducción de señales procarióticos y, en particular, en el paradigmático
sistema de dos componentes NtrBC.
Los objetivos concretos de este trabajo son los siguientes:
1. Investigar la utilidad del sistema del doble híbrido de levaduras en el
estudio de interacciones moleculares mediadas por proteínas
pertenecientes a los sistemas de dos componentes.
2. Explorar el potencial del sistema del doble híbrido para abordar el
problema de la especificidad y posible comunicación cruzada entre
histidina quinasas y reguladores de respuesta.
3. Analizar interacciones intra e intermoleculares en el sistema de dos
componentes NtrB/NtrC.
4. Analizar interacciones entre NtrB y las proteínas que actúan aguas arriba
en la ruta de transducción de señales de nitrógeno (proteínas PH).
5. Construir y analizar genotecas doble híbrido encaminadas a la
identificación de nuevos componentes de las rutas de transducción de
señales de nitrógeno.
6. Contribuir a la construcción de un "ínteractoma del nitrógeno" en
enterobacterias.
7. Caracterizar las posibles nuevas interacciones identificadas.
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Una gran parte de ios resultados obtenidos en esta Tesis Doctora.! han sido
publicados en los tres artículos que se incluyen como anexos. Con el fin de
evitar duplicaciones innecesarias, en la Tesis se hace referencia a las figuras y
tablas de las publicaciones f a la vez que se presenta un resumen de los
resultados y discusión correspondientes. Por el contrario, se detalla en mayor
profundidad lo relativo a los resultados que, por diversas razones, no han sido
publicados.
Anexo I: Two-hybrid analysis of domain interactions involving NtrB and
NtrC two-component regulators. Martínez-Argudo, L, Martin-Nieto, J., Salinas,
P., Maldonado, R., Drummond, M. y Contreras, A. Molecular Microbiology
40(1):169-178. 2001.
Anexo II: Domain interactions on the ntr signal transduction pathway:
two-hybrid analysis of mutant and truncated derivatives of histidine kinase
NtrB. Martínez-Argudo, I., Salinas, P., Maldonado, R., y Contreras, A. Journal
of Bacteriology 184(1): 200-206. 2002.
Anexo III: Identification and analysis of Bscheríchia coli proteins that
interact with the histidine kinase NtrB in a yeast two-hybrid system. Salinas,
P. y Contreras, A. Molecular Genetics and Genomics 269:574-581. 2003.
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Materiales y Métodos
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Materiales y Métodos
La mayoría de los procedimientos utilizados en la presente Tesis Doctoral
se hayan descritos con detalle en las publicaciones incluidas como anexos. En
esta sección se detallan tan sólo aquellos procedimientos, estirpes y plásmidos
que no se mencionan en dichos anexos.
1. Estirpes y plásmidos
Estirpe Genotipo Referencia/ procedencia
A. vinelandii UW136 Derivado RiP de UW (ATCC
13705) (Bishop & Brill, 1977)
K.(pneumoniae) oxytoca M5a l Silvestre J o h n Innes Centre
E. coli ET8000
E. coli FT8000
rbs lacZy.lSl gyrA hut&K
(silvestre)
rbs lacZ::lSl gyrA hutCPK
AglnBl ÜGm' AglnKl
(MacNeil eí al, 1982)
(Reyes-Ramirez eí al, 2001)
Tabla 1. Estirpes.
Plásmido Caracterís t icas Referencia/procedencia
pTM13 vn#lenpT7.7 John Innes Centre
pTM 14 anfA en pT7.7 John Innes Centre
pTRC99a Vector expresión inducible por IPTG (Amann eí al, 1988)
Tabla 2. Plásmidos.
2. Medios y condiciones de cultivo
2.1. Cultivo de bacterias.
El cultivo de K. pneumoniae se realizó en medio Luria-Bertani (LB,
(Miller, 1972) a 37° C y con agitación orbital {220 r.p.m.) en el caso de cultivo
líquido.
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Materiales y Métodos
Para analizar el efecto de ía sobreexpresión de AspA91312 en estirpes de E.
coli se utilizó el medio WN. Las soluciones A y B se prepararon y autoclavaron
por separado. La solución A contiene (por litro) 120 g Tris, 75 mi de HCl
concentrado, 20 g KC1, 6,54 g Na2HPC>4 anhidro y 3,5 g Na2S04. La solución B
se preparó disolviendo 5 g de MgCb'óLbO en 100 mi de agua destilada. Para
preparar 100 mi de placas de medio sólido, se mezclaron 90 mi de agua
destilada, 9 mi de solución A y 1 mi de solución B, se suplemento con 1,5 g de
agar bacteriológico y se esterilizó mediante autoclavado. Tras enfriar a 50 °C,
se añadió glucosa (20 mg/ml), sulfato amónico {1 mg/ml), glutamina (25
ug/ml), prolina (2 mM), tiamina (0,05 mM), 30 uM IPTG y los antibióticos
correspondientes, en su caso.
El cultivo de A. vinelctndü se realizó en medio BS (Guerrero et al, 1973).
2.2. Cultivo de levaduras .
El cultivo de S. cerevisiae se realizó a 30 °C, con agitación orbital (220
r.p.m.) en el caso de los cultivos líquidos, en medio rico YPD o en medio
mínimo YNB con los suplementos necesarios según el caso (20 mg/1 de
adenina, 20 mg/1 de histidina, 20 mg/1 de triptófano y/o 100 mg/1 leucina).
En la estirpe PJ696, los ensayos de interacción entre proteínas se realizaron
en medio YNB -Ade e YNB -His con lmM y 5mM de 3-AT.
3. Procedimientos de obtención, manipulación,
clonación y selección de moléculas de DNA
recombinante.
3 .1 . Aislamiento de DNA de microorganismos.
3.1.1. Obtención de DNA genómico de Azotobacter vinelandii.
Las células contenidas en 20 mi de un cultivo de A. vinelandii (DOs40nm
entre 0,6-1) fueron recogidas por centrifugación a 4.000 r.p.m. durante 4 min.
El precipitado se lavó con un volumen equivalente de NaCl 3%, se volvió a
centrifugar y se resuspendió en 10 mi de tampón TES (2 mM Tris, 90 mM
EDTA pH 8,0, 150 mM NaCl). Las células se Usaron mediante adición de 1,6
mi de SDS 10% e incubación a 37 °C durante 15 min. El DNA presente en el
lisado fue precipitado mediante la adición de una mezcla de 10 mi de etanol
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Materiales y Métodos
absoluto y 1,2 mi de acetato de sodio 3 M. Las hebras de DNA que se formaron
fueron extraídas de la solución utilizando una pipeta Pasteur de vidrio sellada
a la llama. El DNA recogido en la pipeta se dejó secar al aire y se resuspendió
en 3 mi de 0,1 x SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM citrato sódico). Posteriormente, se
añadieron 10 ug/ml de RNAsa y se incubó durante 30 min a 37 °C. Tras la
adición de 500 ug/ml de proteasa K se incubó a 37 °C durante 12-16 horas.
La solución de DNA fue entonces extraída dos veces con un volumen
equivalente de fenol:cloroformo, y el DNA precipitado mediante al adición de
150 ul de acetato de sodio 3 M y 2 mi de etanol absoluto frío. Tras recoger el
precipitado del modo descrito anteriormente, se dejó secar y se resuspendió en
100-500 ul de 0,1 x TESL.
3.1.2. Obtención de minipreparaciones de DNA de S.
cerevisiae.
Tras centrifugar un volumen de cultivo de S. cerevisiae equivalente a 2 U
de DOeoonm, las células se resuspendieron en 200 ul de buffer YLS (300 mM
NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0 y 0,1 % SDS) y transferidas a un tubo
de 1,7 mi con tapón de rosca (Sorenson). Tras la adición de 200 ul de bolas de
vidrio de 0,5 mm de diámetro (Sigma) y 200 ul de
fenol:cloroformo:isoamilalcohol (25:24:1), la suspensión celular fue sometida a
homogenización durante 30 seg en un Mini-BeadBeater (Biospec). Tras
centrifugación a 5.000 r.p.m. durante 10 min, la fase acuosa fue transferida a
un tubo eppendorf. El DNA presente en esta solución fue precipitado mediante
la adición de 500 ul de etanol absoluto y centrifugación a 13.000 r.p.m.
durante 20 min a temperatura ambiente. Tras lavar con etanol 70% y dejar
secar al aire, el DNA fue resuspendido en 30 ul de agua ultrapura.
3.2. Fragmentación de DNA genómico mediante
sonicación.
El DNA genómico de A. vinelandii se fragmentó utilizando un sonicador
Soniprep 150 (Sanyo). Muestras de 20 ug de DNA se llevaron a un volumen de
2 mi mediante al adición de HoO ultrapura estéril, y se sometieron a uno o
varios pulsos de diferente duración a una amplitud de onda de 10 um. Tras
cada pulso, la muestra se introdujo en un baño de agua-hielo para evitar el
sobrecalentamiento. Tras la aplicación de los pulsos, una alícuota de 100 ul se
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Materiales y Métodos
precipitó con etanol absoluto y acetato potásico, se dejó secar, y se
resuspendió en 10 pil de agua ultrapura estéril. Esta alícuota se analizó por
electroforesis para determinar el rango de tamaño de los fragmentos
producidos y, tras comprobar que el rango de tamaño de los fragmentos era el
deseado, el resto de la muestra fue precipitada con etanol absoluto y acetato
potásico. El DNA precipitado se dejó secar, se resuspendió en 200 ul de agua
ultrapura estéril, y se cargó en un gel de agarosa para su fraccionamiento por
tamaños.
3.3. Tratamiento enzimático de DNA.
3.3.1. Tratamiento con enzimas de corte y modificación del
DNA.
El tratamiento del DNA con enzimas de restricción y modificación
(fosfatasa alcalina, quinasa, ligasa, etc..) se realizó siempre siguiendo las
condiciones y tiempos de incubación indicados por el fabricante, o siguiendo
protocolos estándares (Ausubel et al, 1999; Sambrook eí al., 1989)
3 . 3 . 2 . R e p a r a c i ó n d e e x t r e m o s d e DNA.
En la reparación de extremos de los fragmentos de DNA obtenidos tras la
sonicación se utilizaron tres protocolos diferentes que variaban en los tiempos
y condiciones de incubación, así como en el tipo y cantidad de enzimas
utilizadas.
Protocolo 1; 2 pg de producto de sonicación se incubaron durante 3
horas a 15 °C en un volumen final de 35 ul que contenía 2 ul de dNTPs 0,25
mM, 3 ul de tampón TM {100 mM Tris pH 8,0 y 100 mM MgCl2) y 20 U de DNA
polimerasa de T4 (Invitrogen).
Protocolo 2: 3 ug de producto de sonicación se incubaron durante 30 ó
60 min a 37 °C en un volumen final de 40 ul que contenía 50 mM de acetato
potásico, 20 mM de Tris acetato, 10 mM de ditiotreitol, 1 mM ZnSCU y 120 U
de nucleasa Mung Bean (Amersham Pharmacia Biotech).
Protocolo 3: 3 ug de producto de sonicación se incubaron durante 30 min
a 37 °C en un volumen final de 40 ul que contenía tampón de polimerasa de
T4 (Invitrogen), 2,5 mM dNTPs, 10 U de polimerasa de T4 (Invitrogen) y 10 U
de polimerasa Klenow (Invitrogen).
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Materiales y Métodos
Tras cualquiera de estos t ra tamientos , el DNA fue extraído dos veces con
fenol :cloroformo, precipitado con etanol y acetato de sodio, secado y
resuspendido en agua u l t r apura estéril.
3.3.3. Comprobación por PCR de fragmentos clonados.
La amplificación de fragmentos clonados en los vectores pGAD424 y
derivados a part i r de biomasa de colonias de E. colí se realizó en u n a mezcla
de PCR que contenía 200 uM de cada dNTP, 0,4 uM de los cebadores ACT-A
(Anexo I) y ACT-B (5'-CAGTATCTACGATTAATAG-3') y 1 U de la enzima Taq
Polimerasa NEED, en el t ampón de reacción suminis t rado por el fabricante y
en u n volumen final de 50 ul. Se u sa ron p u n t a s de plástico estéril p a r a
transferir b iomasa de los distintos clones (colonias) a analizar a la mezcla de
PCR descrita. Las m u e s t r a s se introdujeron en u n termociclador programado
para realizar 30 ciclos con las siguientes fases: desnatural ización, incubación
1 min a 95° C; alineamiento, incubación 1 min a 50° C, y polimerización,
incubación 2 min a 72° C. Estos ciclos iban precedidos de u n a incubación
inicial de 4 min a 95° C, y finalizaban con u n a incubación adicional de 5 min
a 72° C, pa sando luego a permanecer a 4 o C por t iempo indefinido. Los
productos de PCR obtenidos fueron analizados mediante electroforesis en geles
de agarosa.
3.4. Construcción de fusiones a dominios de GAL4 de
AnfA y VnfA de A. vinelandii
Los fragmentos Ndel-BamHÍ de los plásmidos pTM13 y pTM14 (Tabla 2),
se clonaron en los vectores pGAD424-NdeI y pGBT9-NdeI (Anexo II), dando
lugar a los vectores pSBOl (GAL4AD:AnfA), pSB02 (GAL4BD:AnfA), p S B l l
(GAL4AD:VnfA) y pSB12 (GAL4BD:VnfA). Estos plásmidos fueron verificados
por análisis de restricción con varias enzimas.
3.5. Construcción de u n plásmido p a r a la sobreexpresión
de AspA91-312
El fragmento SmaifSañ del pUAGSl l (Anexo IÍI} se clonó en el vector
pTRC99a digerido con los mismos enzimas. El plásmido p U A G S H E obtenido,
que permite la expresión del polipéptido AspA91-312 bajo el control de u n
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Materiales y Métodos
promotor inducíble por IPTG, se verificó mediante análisis de restricción con
varias enzimas.
4. Obtención y conservación de genotecas doble
híbrido en S, cerevisiae PJ696. 50 ug de DNA plasmídico de la /s genoteca/s correspondiente/s se utilizó
para transformar S. cerevisiae PJ696 mediante un protocolo de
transformación a gran escala, tal como se describe detalladamente en el
"MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3 & Librarles User Manual" de
Clontech. Varias diluciones de la mezcla de transformación obtenida se
sembraron en placas de YNB -Leu y se incubaron a 30 C durante 3 días. Las
colonias resultantes se utilizaron para calcular el número total de
transformantes totales.
Para amplificar la genoteca obtenida en levaduras, el resto de la mezcla
de transformación se sembró en placas de medio YNB -Leu y se incubó a 30
°C durante 3 días, tras los cuales se añadieron 3 mi de TE estéril a cada placa,
se resuspendieron las colonias con ayuda de un asa de vidrio estéril y la
suspensión celular se traspasó a un matraz estéril. Este procedimiento se
repitió con cada una de las placas sembradas y por duplicado, hasta recoger
toda la biomasa obtenida en la amplificación de la genoteca. Tras centrifugar a
5000 r.p.m. durante 10 min, las células fueron lavadas en TE estéril. Tras
centrifugar de nuevo, las células se resuspendieron en un volumen
equivalente de una solución de glicerol al 65% y 25 mM Tris pH 7,5, se
distribuyeron en alícuotas de 500 ul y los crioviales se almacenaron a -80 °C.
Para titular las genotecas congeladas, se descongeló u n a alícuota y se
prepararon diluciones seriadas en agua destilada estéril. 100 ul de las
diluciones 10-5, 10"6 y 10 7 se sembraron en medio YNB -Leu y se incubaron
durante 3 días a 30 °C. Las colonias resultantes se contaron para determinar
el número de unidades formadoras de colonias por unidad de volumen de
células congeladas (ufe/100 ul).
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Resultados y Discusión
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xcsU -tcjs ••.• .):sr„s:6n
1. Interacciones moleculares mediadas por í\trB,
NtrC y sus dominios.
1.1. Diseño de proteínas de fusión \ análisis doble
híbrido.
Con el objetivo de investigar las posibilidades del s is tema del doble
híbrido de levaduras en el estudio de las interacciones moleculares mediadas
por proteinas de los s is temas de dos componentes , generamos diversas
fusiones proteicas entre los dominios de GAL4 y las proteinas NtrB y NtrC :y
diversas variantes t runcadas) de K. pneumoniae. En el contexto ele esta tesis
se generaron u n a buena p a n e de los plásmicos que codifican fusiones a
polipeptidos derivados de NtrB. que se indican esquemát icamente , jun to con
los derivados de NtrC utilizados en este trabajo, en la Figura 1. Es tas
variantes t runcadas se diseñaron de acuerdo con la información disponible en
su momento sobre la es t ruc tura y función de ios co r re sponden te s módulos y
dominios ÍKramer & Weiss. 1999: Porter et al. 1993' . En la Figura 2 se
mues t ran , sobre la secuencia de ntrB, las posiciones de los distintos
oligonucleótidos utilizados como cebadores pa ra las construcciones
correspondientes. Para el estudio de las interacciones entre NtrB y GinB. se
utilizaron fusiones a dominios de GAL4 de GlnB de K. pneumoniae. Para
analizar la especificidad de las interacciones, se utilizaron como controles
fusiones a dominios de GAL4 de otras proteínas come CheA _•. F:r.Z-"::'-: de E.
CGÍÍ. \ PhoP de Saímonella typhirnurium. La secuencia de ios otigonücleóudos y
la construcción de ios plásmidos correspondientes se desenoe c>~al"adamentc
en ios anexos 1 y 11.
Para determinar la capacidad de dos polipeptidos cualesquiera de
interaccionar, se ensayó, en todos los casos, la expresión de los genes testigo
GAL AlacZ y GAL1:H!S3 en estirpes de S. cereuisiae Y190 mediante ensayos 8-
gaíactosidasa y crecimiento en medio sin histidina, respectivamente. El grado
de crecimiento en medio selectivo se clasificó en cuatro categorías Figura 2-
Al,. Cada pareja de fusiones proteicas a estudio se nombró siempre en el
orden GAE-ALYX GAE-3D:Y. abreviado X/V. donde X e Y son cualquier
poiipéptido fusionado a GAL4AD ó GAL4BD, respectivamente. Ninguna de las
construcciones derivadas cíe NtrB o NtrC activó a ios genes testigo por sí
misma, por le que se excluyó la posibilidad de eye a lguna de las
construcciones "autoactivara".
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Resultados y Discusión
Plásmidos Proteína de fusión a Dominios Aas.
pUAGll
pUAG31
pUAGól
pUAG21
pUAG211
pUAG261
pUAG281
pUAG251
pUAG221
pUAG291
pUAG301
pUAG331
pUAG311
pUAG12
pUAG32
pUAG62
pUAG22
pUAG212
pUAG262
pUAG282
pUAG252
PUAG222
pUAG292
pUAG302
pUAG332
pUAG312
> • > • X L D
ü
4L
1 lili
1
lili
NtrC 1-469
NtrCR 1-130
NtrC0 127-381
NtrCD
NtrB
N t r B S H N
NtrBSH
NtrB s
N t r B H N G
NtrBH
NtrBHN
NtrBNG
380-469
1-349
1-269
1-221
1-115
110-349
110-221
110-269
221-349
NtrBG 269-349
Figura 1. Representación esquemática de las proteínas de fusión a NtrB y NtrC codificadas por los plásmidos utilizados en este estudio. Siguiendo el código de colores previamente utilizado, los dominios de NtrB se representan en verde y los de NtrC en rojo. S: dominio "sensor"; H, N y G: motivos del módulo transmisor; R: dominio receptor; C: dominio central; D: dominio de unión a DNA. Los plásmidos impares codifican fusiones a GAL4AD, los pares codifican fusiones a GAL4BD. Los números de la última columna hacen referencia a los aminoácidos de NtrB y NtrC presentes en las proteínas de fusión.
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Resultados y Discusión
NTRB-2R NTRB--1R NTRB-5R NTKU-1R
alnA ntrB ntrC ~