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UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR

DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACIÓN DE POSTGRADO EN CIENCIA DE LOS

ALIMENTOS Y NUTRICIÓN DOCTORADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS

TESIS DOCTORAL

AISLAMIENTO Y APLICACIÓN DE PÉPTIDOS BIOACTIVOS DEL LACTOSUERO EN UN YOGURT FUNCIONAL

POR

CARLOS ENRIQUE ALVARADO CARRASCO

MAYO, 2012

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR

DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACIÓN DE POSTGRADO EN CIENCIA DE LOS

ALIMENTOS Y NUTRICIÓN DOCTORADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS


Tesis Doctoral presentada a la Universidad Simón Bolívar por

CARLOS ENRIQUE ALVARADO CARRASCO

como requisito parcial para optar al grado académico de

Doctor en Ciencia de los Alimentos

Con la asesoría de la Prof.

MARISA GUERRA

MAYO, 2012

iv

DEDICATORIA

Para Thais, Alejandra, Aída y Francisco, razones suficientes para seguir adelante.

v

AGRADECIMIENTOS A mi familia por su constante apoyo, cariño e inspiración.

A mi tutora, por haberme aceptado como tesista y guiado, con mano firme y

respetuosa, durante todo el trayecto del postgrado.

A todo el personal de la Cátedra de Industria de la Leche y de la Carne, por la

colaboración prestada en el desarrollo de la parte experimental de la tesis: Matilde,

Mónica, María, Tony, Javier, José, Wilfred, Aroldo, Bernavé, Olymar, Rina, José,

Laura. A la Cátedra de Fisiología FCV-UCV, por todo el apoyo prestado: Ana Zuley,

Héctor, Jesús, Tatiana, Andrés, Simón. A Milagro y María Virginina del Centro de

Bioquímica Nutricional FCV-UCV.

A las Profesoras Marisa Gonzatti y Alexia Torres, por haberme permitido trabajar en

los laboratorios que dirigen. A la Dra Nardy Diez y su grupo de trabajo en la

Fundación IDEA por su colaboración y apoyo.

A los investigadores del Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación

(CIAL), que me aceptaron rápidamente como compañero de trabajo y prestaron su

apoyo desinteresado durante mi estancia en España: Marisi, José Ángel, Paquita,

Dani, David, Mar, Gustavo, Wilman, Tania, Mercedes, Lourdes, Constanza. A mis

cordiales anfitriones Manuel, Elymar y Carolina.

A Lesbia, Jenny y Adriana, por su apoyo con el estudio clínico.

Al CDCH-UCV, Postgrado de Medicina Veterinaria y Fundacite Aragua, por los

financiamientos otorgados para el desarrollo de este trabajo.

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UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

COORDINACIÓN DE POSTGRADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y NUTRICIÓN

DOCTORADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS


Por: ALVARADO CARRASCO, CARLOS ENRIQUE

Carnet No.: 8474473 Tutor: MARISA GUERRA

MAYO 09, 2012

RESUMEN El lactosuero desechado de la producción quesera nacional constituye una importante fuente de nutrientes de alto valor biológico. El objetivo del presente trabajo fue aprovecharlo como fuente de péptidos bioactivos aplicables en el desarrollo de un yogurt funcional mediante un proceso tecnológico accesible a pequeños y medianos productores nacionales. La metodología de trabajo se fundamentó en cinco etapas: 1) desarrollo del ingrediente funcional mediante la concentración e hidrólisis de proteínas lactoséricas bovinas y caprinas, evaluación de la actividad antihipertensiva in vitro y el escalado del proceso en planta piloto, 2) incorporación de ese ingrediente en la formulación de un yogurt funcional, 3) incremento de la capacidad antioxidante mediante adición de fruta no tradicional, 4) determinación de la vida útil y 5) comprobación de actividad antihipertensiva mediante estudio clínico doble-ciego con 39 pacientes hipertensos. El ingrediente funcional desarrollado demostró buena actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina in vitro (IC50=10,54 g/mL), identificándose 7 péptidos de la -LG, pero con baja capacidad antioxidante (ORAC=0,265 Moles Trolox/mg). Al incorporarlo en la formulación de un yogurt natural de leche de cabra (Capra hiricus) se obtuvo una aceptabilidad del 51%. Al agregarle 25% de mermelada elaborada con tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) se mejoró hasta 71%, la aceptabilidad y se aumentó la capacidad antioxidante (ORAC=0,500 Moles Trolox/mg). En el estudio clínico el consumo del yogurt desarrollado redujo la presión arterial sistólica en ambos grupos “tratamiento” y “placebo”, en 6 y 9 mmHg respectivamente, pero sin diferencia significativa entre ellos (p>0,05); por lo cual, el efecto benéfico se atribuyó a propiedades intrínsecas del yogurt de leche de cabra y no al ingrediente funcional en la dosis aplicada (224 mg/día). Se concluye que el consumo de yogurt de leche de cabra tiene efecto antihipertensivo per se, independientemente de la incorporación de péptidos bioactivos. Palabras clave: yogurt funcional, péptido bioactivo, lactosuero, ingrediente funcional.

vii

ÍNDICE GENERAL APROBACIÓN DEL JURADO ..................................................................................... ii VEREDICTO .............................................................................................................. iii DEDICATORIA ............................................................................................................ iv AGRADECIMIENTOS .................................................................................................. v RESUMEN .................................................................................................................. vi ÍNDICE GENERAL ..................................................................................................... vii ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................... x ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................... xiv INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1 CAPÍTULO I ................................................................................................................ 7 MARCO TEÓRICO ...................................................................................................... 7

1.1. Lactosuero ........................................................................................................ 7

1.1.1. Tipo de lactosuero según método de fabricación ....................................... 8

1.1.2. Composición del lactosuero ...................................................................... 10

1.1.3. Secuencia teórica de aminoácidos de las proteínas del lactosuero .......... 13

1.2. Recuperación de las proteínas del lactosuero ................................................ 15

1.3. Liberación de péptidos del lactosuero ............................................................. 17

1.3.1. Proteasa de Aspergillus oryzae ................................................................ 22

1.4. Actividad biológica de los péptidos del lactosuero .......................................... 23

1.4.1. Actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina (IECA) 24

1.4.2. Actividad Antioxidante ............................................................................... 29

1.5. Identificación de la secuencia de aminoácidos en péptidos bioactivos ........... 34

1.6. Desarrollo de alimentos funcionales ............................................................... 37

CAPÍTULO II ............................................................................................................. 42 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 42

2.1. Desarrollo del ingrediente funcional ................................................................ 42

2.1.1. Procesamiento de la leche y obtención del lactosuero ............................. 43

2.1.2. Caracterización física y química de las muestras de leche y suero .......... 45

2.1.3. Descremado ............................................................................................. 45

2.1.4. Electroforesis ............................................................................................ 45

2.1.5. Concentración de proteínas del lactosuero ............................................... 47

viii

2.1.6. Hidrólisis del lactosuero ............................................................................ 49

2.1.7. Actividad biológica de los hidrolizados ...................................................... 53

2.1.8. Identificación de péptidos bioactivos por HPLC-MS-MS ........................... 56

2.1.9. Producción el ingrediente funcional a nivel de Planta Piloto (Escalado) ... 57

2.1.10. Caracterización del ingrediente funcional ............................................... 60

2.2. Desarrollo de yogurt natural funcional ............................................................. 60

2.2.1. Exploración inicial para la formulación ...................................................... 60

2.2.2. Escalado de producción del yogurt funcional ............................................ 61

2.2.3. Evaluación sensorial del yogurt natural .................................................... 61

2.2.4. Caracterización del yogurt natural funcional ............................................. 62

2.3. Desarrollo del yogurt saborizado..................................................................... 62

2.3.1. Evaluación del Concepto .......................................................................... 63

2.3.2. Criterios de formulación y tamaño de la ración ......................................... 63

2.3.3. Elaboración de la mermelada de fruta ...................................................... 63

2.3.4. Elaboración del Yogurt de cabra saborizado ............................................ 64

2.3.5. Caracterización del yogurt saborizado ...................................................... 65

2.3.6. Actividad antioxidante del yogurt saborizado ............................................ 65

2.3.7. Contenido de polifenoles .......................................................................... 65

2.3.8. Evaluación sensorial ................................................................................. 66

2.4. Vida útil del yogurt funcional ........................................................................... 67

2.5. Protocolo del estudio clínico ........................................................................... 68

2.6. Análisis estadístico .......................................................................................... 70

CAPÍTULO III ............................................................................................................ 72 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 72

3.1. Desarrollo del ingrediente funcional ................................................................ 72

3.1.1. Caracterización de los lotes de leche ....................................................... 72

3.1.2. Caracterización de los lotes de lactosuero ............................................... 76

3.1.3. Caracterización de los lotes de suero descremado .................................. 78

3.1.4. Perfil electroforético de los lactosueros de cabra y vaca .......................... 80

3.1.5. Concentración del lactosuero ................................................................... 83

3.1.6. Hidrólisis del lactosuero ............................................................................ 87

ix

3.1.7. Actividad biológica de los hidrolizados .................................................... 100

3.1.8. Identificación de péptidos bioactivos por HPLC-MS-MS ......................... 106

3.1.9. Obtención del hidrolizado a nivel de Planta Piloto .................................. 110

3.1.10. Caracterización del ingrediente funcional (fórmula final) ...................... 112

3.2. Desarrollo del yogurt natural batido funcional ............................................... 114

3.2.1. Perfil descriptivo del yogurt ..................................................................... 115

3.2.2. Evaluación sensorial del yogurt natural con hidrolizado ......................... 119

3.2.3. Caracterización del yogurt natural funcional ........................................... 120

3.3. Desarrollo del yogurt saborizado................................................................... 121

3.3.1. Evaluación exploratoria inicial ................................................................. 121

3.3.2. Fórmula prototipo .................................................................................... 122

3.3.3. Actividad antioxidante ............................................................................. 124

3.3.4. Prueba de aceptabilidad ......................................................................... 126

3.4. Vida útil yogurt .............................................................................................. 127

3.5. Estudio clínico ............................................................................................... 132

CAPÍTULO IV .......................................................................................................... 139 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .......................................................... 139

4.1. Conclusiones................................................................................................. 139

4.2. Recomendaciones ........................................................................................ 140

REFERENCIAS ....................................................................................................... 141

x

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1 – Composición de lactosuero bovino. Tomado de Yang y Silva (1995).......... 9

Tabla 2 – Contenido promedio de sólidos totales, proteínas, lactosa, grasa y cenizas de lactosueros derivados de la fabricación de tres tipos de quesos elaborados con leche de vaca en el Estado Zulia, Venezuela. Modificado de Faría et al. (2002). ............................................................................................ 10

Tabla 3 - Propiedades básicas de las principales proteínas del lactosuero bovino. Modificados de Madureira et al. (2007) y Ounis et al. (2008) ........................... 11

Tabla 4 – valores de los niveles de los factores seleccionados en el diseño central compuesto 24 ........................................................................................ 50

Tabla 5 – Identificación de los Tratamiento de acuerdo a las variables: origen, proceso de concentración y tipo de hidrólisis. .................................................. 52

Tabla 6 – Distribución (en L) de los diferentes componentes de la reacción en el ensayo para determinar la actividad de inhibición de la enzima ECA. .............. 54

Tabla 7 – Distribución (en L) de los diferentes componentes de reacción en cada pozo del ensayo por fluorescencia de la actividad ORAC. ....................... 55

Tabla 8 – Gradiente de elución empleado en la corrida HPLC-MS-MS. ................... 57

Tabla 9 – Análisis físicos y químicos de la leche de vaca utilizada en la elaboración de tres lotes de queso blanco pasteurizado y su rendimiento quesero. ............................................................................................................ 73

Tabla 10 – Análisis físicos y químicos de la leche de cabra utilizada en la elaboración de tres lotes de queso pasteurizado y su rendimiento quesero. .... 74

Tabla 11 – Análisis físico y químico de los lactosueros obtenidos de la Planta Piloto de la FCV-UCV (expresados en base húmeda). ..................................... 77

Tabla 12 – Análisis físico y químico de los lactosueros obtenidos de la Planta Piloto de la FCV-UCV (expresados en base seca). .......................................... 78

Tabla 13 – Análisis físicos y químico de lactosueros descremados (expresados en base húmeda) .............................................................................................. 79

Tabla 14 – Análisis físico-químico de lactosueros descremados (expresados en base seca) ........................................................................................................ 79

Tabla 15 – Peso molecular promedio (kDa) y la proporción relativa (%), estimado a partir de las bandas obtenidas en el gel SDS-PAGE, con el programa digital ImageJ 1.42q (NIH, EE.UU.). ................................................................. 82

xi

Tabla 16 – Pesos moleculares promedio (kDa) de las proteínas del lactosuero, reportados por otros autores. ............................................................................ 83

Tabla 17 – Contenido promedio de proteínas y sólidos totales del retenido y permeado resultantes de la ultrafiltración de las muestras de lactosuero descremado. ..................................................................................................... 85

Tabla 18 – Contenido promedio de proteínas (base húmeda y base seca) y sólidos totales (base húmeda) de la solución de “ricotta”, obtenida por termocoagulación de las muestras del lactosuero descremado........................ 86

Tabla 19 – Grado de hidrólisis (GH) final alcanzado luego de 150 minutos de incubación a 42°C, de acuerdo a las características de cada tratamiento (concentración-especie) utilizando proteasa de Aspergillus oryzae. ................. 91

Tabla 20 – Grado de hidrólisis (GH) final alcanzado de acuerdo a las características de cada tratamientos (concentración-especie) utilizando una mezcla de proteasa de A. oryzae y cepa ácido-láctica. .................................... 92

Tabla 21 – Contenido de proteínas (% p/p) de los extractos solubles menores de 3 kDa secados por liofilización (promedio ± desviación estándar). ................... 96

Tabla 22 – Listado de péptidos (por peso molecular, Da) presentes en los extractos solubles menores de 3 kDa, determinadas por espectrometría MALDI-TOF, en orden de mayor a menor “abundancia”, de los hidrolizados de lactosuero caprino tomados a tres tiempos diferentes de incubación de la hidrólisis enzimática con proteasa de A. oryzae. .......................................... 98

Tabla 23 - Identificación de la secuencia de los péptidos presentes en los hidrolizados de lactosuero caprino, utilizando los valores de los pesos moleculares determinados por MALDI-TOF para la búsqueda en la base de datos UniPtrotKB/Swiss-Prot, en línea. ............................................................. 99

Tabla 24 – Actividad inhibidora de la enzima ECA de extractos solubles menor a 3kDa de los hidrolizados de lactosueros bovinos y caprinos bajo cuatro tratamientos diferentes (resultados expresados como IC50 en g/mL) ........... 102

Tabla 25 – Factores y niveles utilizados en el análisis estadístico de los resultados de la actividad inhibidora de la enzima ECA. ................................ 102

Tabla 26 - Valores promedio de la actividad antioxidantes (ORACFL, Moles Trolox/mg sólidos solubles) de extractos solubles menor a 3kDa de los hidrolizados de lactosueros bovinos y caprinos bajo cuatro tratamientos diferentes (promedio ± desviación estándar). ................................................. 104

Tabla 27 – Masas moleculares observadas en espectros HPLC-MS-MS de los ocho tratamientos, agrupados por tipo de lactosuero. .................................... 106

xii

Tabla 28 – Secuencias de péptidos identificados por HPLC-MS-MS, en el extracto soluble <3kDa del Tratamiento 1 (lactosuero de cabra termocoagulado hidrolizado con proteasa + BAL) .......................................... 107

Tabla 29– Secuencias de péptidos identificados por HPLC-MS-MS, en el extracto soluble <3kDa del Tratamiento 4 (lactosuero de vaca termocoagulado hidrolizado con proteasa + BAL) .......................................... 109

Tabla 30 – Recuperación promedio de la proteína en la elaboración de las soluciones de ricotta en planta (promedio ± desviación estándar). ................. 111

Tabla 31 – Composición promedio de los cuatro lotes de solución ricotta elaborados a nivel de escalado en planta piloto (promedio ± desviación estándar). ........................................................................................................ 112

Tabla 32 - Composición promedio de los siete lotes de hidrolizado, elaborados a nivel de escalado en planta piloto (promedio ± desviación estándar). ............ 113

Tabla 33 – Actividad IECA (g/mL) y contenido total de proteínas (g) en el extracto menor a 3 kDa (promedio ± desviación estándar), de los siete lotes preparados de hidrolizado de la solución de ricotta (“ingrediente funcional”) . 113

Tabla 34 – Resumen de los descriptores propuestos para el perfil descriptivo del yogurt. ............................................................................................................. 115

Tabla 35 – Valores de pH, acidez y consistencia de cada yogurt base elaborado con diferentes fermentos Yo-Flex® (promedio ± desviación estándar). .......... 117

Tabla 36 – Puntaje promedio (expresada en cm) correspondiente a cada formulación evaluada por un panel semi-entrenado (promedio ± desviación estándar). ........................................................................................................ 118

Tabla 37 – Análisis microbiológicos realizados en la muestra de la fórmula prototipo. ......................................................................................................... 118

Tabla 38 – Composición porcentual del yogurt natural sin hidrolizado y del yogurt natural funcional (promedio ± desviación estándar). ....................................... 121

Tabla 39 – Prueba no-paramétrica de Friedman (95 % de confianza), aplicada a los valores obtenidos del panel de consumidores con los que se efectuó la evaluación sensorial de diferentes formulaciones de yogurt. .......................... 122

Tabla 40 – Comparación de los análisis químicos (promedio ± desviación estándar) aplicados a la leche cruda de cabra en el presente trabajo (2010) con los obtenidos por Salvador et al. (2006). .................................................. 123

Tabla 41 – Composición de la fórmula prototipo con la proporción ajustada a 75 % yogurt: 25 % mermelada. ............................................................................ 123

xiii

Tabla 42 – Contenido de Polifenoles y actividad ORAC de la pulpa de tomate de árbol antes y después del procesamiento (promedio ± desviación estándar). 124

Tabla 43 – Actividad ORACFL del yogurt base y del yogurt batido con mermelada de tomate de árbol (promedio ± desviación estándar) .................................... 125

Tabla 44 – Distribución aleatoria de los participantes en el estudio clínico sobre el efecto antihipertensivo de un yogurt funcional de leche de cabra ............... 132

Tabla 45 – Variación neta entre la presión arterial sistólica y diastólica de cada participante al inicio y al final del estudio clínico. ............................................ 134

Tabla 46 – Prueba de t-student para la comparación de los valores promedio de presión arterial sistólica entre los dos grupos del estudio clínico. ................... 134

Tabla 47 – Prueba de t-student de la comparación, dentro de cada grupo, de la presión arterial sistólica al inicio del estudio con respecto a la última toma de presión arterial. .......................................................................................... 135

Tabla 48 – Prueba de t-student de la comparación de los valores promedio de la presión arterial diastólica entre los dos grupos del estudio clínico. ................ 135

Tabla 49 – Prueba de t-student de la comparación, dentro de cada grupo, de la presión arterial diastólica al inicio del estudio con respecto al final. ............... 136

Tabla 50 – PAS y PAD promedio de los 29 participantes en el estudio clínico, al inicio y final ..................................................................................................... 137

xiv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – SDS-PAGE, en condiciones reductoras, de las proteínas de lactosuero bovino comparado con estándares de -LA, -LG, IgG y BSA. Tomado de Lin et al.(2010). .............................................................................. 12

Figura 2 – SDS-PAGE, en condiciones reductoras, de lactosuero de cabra (bandas 3-6) comparadas con mezclas de estándares de las cuatro proteínas de referencia-LA, -LG, IgG y SA a diferentes concentraciones (4,16 y 2 g en las bandas 2,7 y 8, respectivamente). Tomado de Casper et al. (1998). .......................................................................................................... 13

Figura 3 – Secuencia de la -lactoglobulina de ambas especies, tomadas de ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/). Se subraya los aa diferentes en la de origen caprino. .................................................................................... 14

Figura 4 – Secuencia de la -Lactalbúmina de ambas especies, tomadas de ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/). Se subraya los aa diferentes en la de origen caprino. .................................................................................... 14

Figura 5 – (A) Separación del producto de la digestión péptica de la S2-CN ovina por cromatografía de intercambio iónico; (B y C) fraccionamiento por RP-HPLC a escala semipreparativa de las fracciones C y D, respectivamente; (D) espectro MS/MS del ión m/z 1119,3 derivado de la fracción D obtenido por acoplamiento HPLC-ESI-IT-MS. La interpretación de la secuencia sobre la base de los iones observados identificaron al péptido como fragmento 181-208 de la S2-CN ovina (tomado de Contreras et al., 2008) ....................................................................................................... 36

Figura 6 – Procesamiento de los lotes de leche para obtener lactosuero, y sus subsecuentes tratamientos para seleccionar las condiciones de hidrólisis óptimas. ............................................................................................................ 44

Figura 7 – a) Motor compresor del equipo de ultrafiltración DDS; b) Columna de equipo de ultrafiltración DDS ensamblado con 12 membranas; c) Marco separador de membranas; d) Soporte de membrana con salida para permeado; e) Lámina de papel de filtro; f) Membrana semipermeable de acetato de celulosa. .......................................................................................... 48

Figura 8 – Diagrama esquemático de la producción de “queso de suero” (modificado de Madureira et al., 2009). ............................................................ 58

Figura 9 – Diagrama esquemático de la hidrólisis de la solución de ricotta. ........... 59

Figura 10 – Diagrama esquemático de la elaboración de yogurt incorporando el hidrolizado de lactosuero y cepa BAL (modificado de Güler-Akin y Akin, 2007). ................................................................................................................ 61

xv

Figura 11 – Diagrama esquemático de la elaboración de yogurt saborizado con mermelada de tomate de árbol (modificado de Güler-Akin y Akin, 2007). ........ 64

Figura 12 - Gel de SDS-PAGE de los lactosueros descremados. Columna 1: Marcadores de peso molecular (miosina 215k, fosforilasa B 120k, BSA 84k, ovoalbúmina 60k, anhidrasa carbónica 39,2k, inhibidor de tripsina 28k y lisozima 18,3k); Columnas 2-3-5-6: bovino (lactosuero de la 5 fue diluído 1:10); Columnas 4-7: caprino. .......................................................................... 81

Figura 13 - Muestras recolectadas del retenido y permeado del lactosuero de vaca después de aplicar proceso de ultrafiltración. .......................................... 84

Figura 14 – Perfil de valores predichos y deseabilidad de los valores óptimos para las cuatro variables incluidas en el modelo de superficie de respuesta para la hidrólisis enzimática de lactosuero caprino con proteasa de Aspergillus oryzae. ............................................................................................ 90

Figura 15- Efecto del tiempo de incubación sobre el grado de hidrólisis del lactosuero de cabra termocoagulado (tratamiento 6), hidrolizado por proteasa de A. oryzae. ...................................................................................... 91

Figura 16- Efecto del tiempo de incubación sobre el grado de hidrólisis del lactosuero de cabra termocoagulado, hidrolizado con la mezcla de proteasa de A. oryzae y cepa ácido-láctica ...................................................... 93

Figura 17 – Porción del gel PAGE-SDS (15% T; 6M úrea), correspondientes a: 1) suero de cabra sin hidrólisis, 2) suero con E/S 3,0% a los 60 minutos, 3) suero con E/S 3,0% a los 120 minutos, y 4) suero con E/S 3,0% a los 150 minutos. ............................................................................................................ 94

Figura 18 – Progreso de la hidrólisis de las principales proteínas del lactosuero por la acción de la proteasa de Aspergillus oryzae bajo las condiciones seleccionadas: T= 42°C, E/S= 3% y pH= 7 (Intensidad relativa (sin unidades) vs tiempo en minutos) ...................................................................... 95

Figura 19 – Distribución de masas MALDI-TOF de los péptidos presentes en los extractos solubles menores de 3 kDa de lactosuero caprino hidrolizado por 30, 90 y 150 minutos con proteasa de A. oryzae. ............................................. 98

Figura 20 – Secuencia P02756 (UniProtKB/Swiss-Prot) de la Lactoglobulina de lactosuero de cabra (Capra hiricus). Se resaltan las secuencias identificadas en la Tabla 23. ............................................................................. 99

Figura 21 – Curva de inhibición de la enzima ECA obtenida para diferentes concentraciones (g/mL) de la Muestra 1 (extracto soluble menor de 3 kDa de lactosuero de cabra). ................................................................................. 101

xvi

Figura 22 - Efecto de la interacción de tres factores, sobre la actividad IECA, determinado por análisis factorial 23: factor T1 (método de concentración: 1-Ultrafiltración, 2-Termocoagulación), factor T2 (origen del lactosuero: 1- caprino, 2-bovino) y factor T3 (tipo de hidrólisis: 1-enzimático, 2-enzima mas BAL). ....................................................................................................... 103

Figura 23 – Análisis gráfico de la interacción entre el método de concentración (T1:1-Ultrafiltración, T1:2-Termocoagulación) y: a) el origen del lactosuero (T2:1- caprino, T2:2-bovino); b) el tipo de hidrólisis (T3:1-enzimático, T3:2-enzima mas BAL). ........................................................................................... 105

Figura 24- Perfil descriptivo de un yogur de cabra y uno de vaca. .......................... 116

Figura 25- Resultados de la prueba triangular, con 12 panelistas, para determinar si el consumidor puede detectar diferencia entre dos yogurts de leche de cabra distinguidos por la incorporación o no de hidrolizado de lactosuero. ...................................................................................................... 119

Figura 26 – Diagrama de torta de la frecuencia de la aceptabilidad determinada mediante escala no-estructurada de 15 cm con 100 consumidores. .............. 120

Figura 27 - Diagrama de torta de la frecuencia de los resultados de la aceptabilidad determinada mediante escala no-estructurada de 15 cm con 100 consumidores. .......................................................................................... 127

Figura 28 – Evolución del pH en muestras de yogurt de leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C ....................................................................... 128

Figura 29 – Crecimiento de coliformes, hongos y levaduras en muestras de yogurt de leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C .............. 129

Figura 30 – Recuento de bacterias ácido-lácticas (BAL) en muestras de yogurt de leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C ......................... 129

Figura 31 – Evolución de la actividad ORAC en muestras de yogurt de leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C ............................................. 130

Figura 32 – Evaluación sensorial mediante escala no estructurada de 15 cm (“Me disgusta mucho”=0 a “Me gusta mucho”=15) del yogurt natural con hidrolizado de lactosuero. Total evaluadores por día=25................................ 131

Figura 33 – Evaluación sensorial mediante escala no estructurada de 15 cm (“Me disgusta mucho”=0 a “Me gusta mucho”=15) del yogurt saborizado con tomate de árbol. Total evaluadores por día=25. ............................................. 131

1

INTRODUCCIÓN La tendencia a reducir grasas y calorías en los productos lácteos está siendo

reemplazada por la incorporación de funcionalidad como la principal ruta para el

posicionamiento dentro del creciente segmento de “salud y bienestar” del sector de

alimentos. Los ingredientes funcionales se han convertido en la vía principal para

introducir nuevos productos bajo una creciente tendencia a enfocarse en beneficios

específicos para la salud, especialmente en segmentos del sector lácteo como el de

yogurt y leches fermentadas (Brockman y Beeren, 2011). Y en este sentido, la

industria trata de aprovechar muchos de los “desechos” de su producción para la

obtención de ingredientes funcionales, que puedan luego ser incorporados en un

alimento “convencional” y convertirlo en funcional.

La industria quesera nacional desecha anualmente grandes volúmenes de

lactosuero, subproducto obtenido luego de separar la caseína coagulada durante la

elaboración de quesos. En el lactosuero se retienen alrededor del 55% de los

nutrientes originales de la leche, aproximadamente 6,3 g/L de leche si partimos de

una leche cruda con 12% de sólidos totales (Walstra et al., 2001). Históricamente

considerado un producto de desecho, el lactosuero es descartado de la forma más

económica posible y solo una pequeña proporción es procesada como lactosuero en

polvo o concentrado (WPC) o aislado de proteínas (WPI) (Chatterton et al., 2006).

Estos dos últimos no se producen comercialmente en el país, y son de elevado costo

para la pequeña y mediana industria.

A partir de los datos presentados en el informe de CAVILAC (2008) sobre la

producción lechera nacional, se puede deducir que para ese año, en Venezuela, se

produjeron alrededor de 750 millones de litros de lactosuero como resultado de la

actividad quesera nacional, que abarca los sectores de quesos industriales, semi-

2

industriales y artesanales. Esto representa cerca de 650 mil kilogramos de

proteínas. Históricamente, según Faría et al. (2002) sólo una cuarta parte del

volumen de lactosuero producido anualmente en el país, es utilizada en la

alimentación humana y/o animal; el resto se desecha directamente a los cuerpos de

agua, con los consecuentes problemas de contaminación. Actualmente, en el país,

solo un muy reducido número de plantas procesadoras elaboran productos derivados

del lactosuero: ricotta, requesón y suero completo en polvo. Esto contrasta con el

esfuerzo dedicado, tanto por la empresa privada como por instituciones de

investigación láctea, en Estados Unidos, Australia, Nueva Zelanda y Europa, para

entender los efectos del calor y procesamiento sobre la funcionalidad de las

proteínas, variaciones en la composición y el comportamiento físico y químico de los

principales componentes funcionales del lactosuero (Smithers, 2008); lo cual ha

llevado a la comercialización de una gran variedad de productos derivados del

lactosuero para satisfacer las diversas necesidades del mercado industrial.

Esta cantidad de lactosuero se deriva principalmente de leche de origen bovino,

seguida por la caprina. En todo caso, el perfil de proteínas lactoséricas es muy

similar en estas especies lecheras y pueden, por tanto, presentar funcionalidades

equivalentes, gran parte de ellas debido a secuencias particulares de aminoácidos

presentes en la estructura primaria de estas proteínas, que una vez “liberadas”, dan

origen a diferentes péptidos bioactivos que influyen directamente sobre numerosos

procesos biológicos responsables de diversas respuestas humorales,

gastrointestinales, hormonales, inmunológicas, neurológicas y nutricionales (Clare y

Swaisgood, 2000). Trabajando con lactosuero, varios autores han reportado la

identificación de péptidos con actividad antihipertensiva (Murakami et al., 2004;

Hernández-Ledesma et al., 2006; Otte et al., 2007a); antioxidante (Peña-Ramos y

Xiong, 2001; Bayram et al., 2008; Peng et al., 2009); opioide (Sipola et al., 2002; Ijäs

et al., 2004); antimicrobianos (Clare y Swaisgood, 2000; Rizzello et al., 2005;

Chatterton et al., 2006; López-Expósito y Recio, 2006); antitrombóticos (Clare y

Swaisgood, 2000; Thomä-Worringer et al., 2006); e inmunomoduladores (Mercier et

al., 2004; Saint-Sauveur et al., 2008).

3

En años recientes se han unificado esfuerzos de investigación para aprovechar el

lactosuero como valioso recurso por sus propiedades funcionales (Raynal-Ljutovac et

al. 2008). El principal problema en el desarrollo de estos trabajos, es el alto grado de

dilución que caracteriza al lactosuero, mas del 90% de agua, lo cual impone la

necesidad de concentrar las proteínas antes de su utilización. Para esto se han

empleado a nivel industrial técnicas de filtración con membranas como la

ultrafiltración, tecnologías estas que representan una elevada inversión para las

queseras semi-industriales y artesanales, generadoras también de un volumen

considerable de lactosuero. Sin embargo, estas queseras pueden recurrir a

procesos alternativos mas económicos, como la termocoagulación, para precipitar las

proteínas y separarlas del suero desproteinizado (Faría et al., 2003; Monsalve y

González, 2005).

Una vez concentrada la proteína del lactosuero, el procedimiento de obtener, aislar e

identificar péptidos con actividad biológica es muy similar entre los distintos trabajos

revisados: en primer lugar a la solución de proteínas se le adiciona una enzima

específica y se incuba por un tiempo determinado para obtener el grado de hidrólisis

deseado. Luego se fracciona el hidrolizado por cromatografía, seleccionándose la

fracción con mayor actividad in vitro y finalmente se identifica la secuencia de los

péptidos responsable de dicha actividad aplicando espectrometría de masas

(MS/MS) y/o secuenciación N-terminal (Hernández-Ledesma et al., 2004; Otte et al.,

2007b; Tsai et al., 2008). Esta bioactividad se evalúa in vivo en un modelo animal o

en ensayos clínicos con humanos. Ahora bien, los hidrolizados son mezclas

complejas y pueden contener hasta cientos de diferentes moléculas, por lo cual,

localizar péptidos bioactivos en este tipo de muestras ha sido comúnmente una tarea

difícil y que requiere mucho tiempo y dedicación. Las fracciones usualmente

contienen aún múltiples compuestos que requieren ciclos adicionales de

fraccionamiento, concentración y evaluación de bioactividad para lograr identificar la

molécula responsable de dicha actividad (van Elswijk et al., 2003). Por esta razón,

para su aplicación en alimentos se puede optar entre dos opciones: 1) utilizar

4

tecnologías industriales disponibles actualmente para la producción comercial de

péptidos lácteos bioactivos basados en métodos de separación por membranas y de

cromatografía de intercambio iónico (Korhonen y Pihlanto, 2006) procedimiento de

alto costo, sobre todo por la inversión inicial; o 2) determinar la actividad biológica del

hidrolizado completo, o una fracción de él, para luego incorporarlo directamente al

alimento que se le desea conferir de la propiedad de “funcional”.

En la actualidad, los péptidos bioactivos son constituyentes fundamentales de

algunos productos comercializados como “Alimentos Funcionales” o “Nutraceuticos”,

en los cuales son añadidos o enriquecidos modificando los procesos usuales de

manufactura. Estos alimentos funcionales que contienen péptidos bioactivos, se

pueden desarrollar mejorando la bio-disponibilidad de los mismos en productos

lácteos existentes o “creando” nuevos a través de la adición o fortificación de

fracciones aisladas de estos péptidos (Hartmann y Meisel, 2007). Por otra parte, se

han encontrado una variedad de péptidos naturalmente formados en productos

lácteos fermentados, tales como yogurt, crema agria y queso, cuyo beneficio para la

salud no ha sido establecido.

En el país, el producto lácteo fermentado de mayor producción y consumo es el

yogurt, el cual mantiene una tendencia al crecimiento en un mercado que produce 40

millones de kilos y mueve 1,8 millones BsF. Sin embargo, el consumo per cápita de

1,7 Kg/año es bajo si se compara con otras naciones, como Colombia, Estados

Unidos y Europa con 4, 8 y 10 Kg/año, respectivamente. El mercado de yogurt en

Venezuela está dividido en tres categoría principales: yogurt firme 25%, yogurt

líquido 60% y yogurt con cereal 15% (Anónimo, 2006). El yogurt comercializado a

nivel nacional se elabora totalmente con leche de vaca. Sin embargo, si se

aprovechan las propiedades nutricionales y terapeuticas que posee la leche de cabra

(mayor digestibilidad y menor alergenicidad, entre otras) se pueden introducir al

mercado productos atractivos para muchos consumidores con necesidades

especiales o intolerantes a la leche de vaca.

5

En general, en el país los yogurts saborizados tienen mayor demanda que los

“naturales”, y todos los fabricantes ofrecen presentaciones con frutas tradicionales

(fresa, piña, ciruela, durazno, etc.); ninguna marca comercial o artesanal incluye

como ingrediente una fruta no tradicional como, por ejemplo, el tomate de árbol

(Cyphomandra betacea Sendt), al cual en diversos países de Centro y Sur América

se le atribuyen propiedades medicinales, en la curación de heridas y llagas,

eliminación de parásitos intestinales, afecciones de la garganta, dolores musculares,

afecciones del hígado, gripe, afecciones cutáneas, diabetes, reumatismo, “fiebre

intestinal” y mordeduras de serpientes (Reyes y Sanabria, 1993). Los análisis

químicos revelan que el fruto fresco de C. betacea es una fuente importante de -

caroteno (pro-vitamina A), vitamina B6, vitamian C, vitamina E y Hierro (Durán y

Moreno-Alvarez, 2000). Los compuesto fenólicos presentes en la fruta de C. betacea

Sendt protegen a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) de la oxidación y a los

cultivos de células neuronales PC12 del daño inducido por el estrés oxidativo (Kou et

al., 2009). Por estas razones, Han et al. (2011) propusieron incrementar la

funcionalidad de los productos lácteos mediante la suplementación con polifenoles,

con el objetivo de desarrollar nuevos productos que tengan un impacto positivo en el

bienestar y salud del consumidor.

Hasta el presente, en Venezuela no se han realizado estudios que permitan

aprovechar ese gran volumen de lactosuero como fuente de péptidos bioactivos en

el desarrollo de ingredientes y alimentos funcionales. La importancia que

actualmente se le atribuye a los péptidos bioactivos para la salud humana hace del

presente trabajo un aporte significativo a la investigación para cuantificar y

aprovechar el potencial del lactosuero como ingrediente funcional en el desarrollo de

nuevos productos.

6

Objetivo general Obtener, caracterizar y aislar péptidos a partir del lactosuero derivado de la

elaboración de quesos de leche de vaca y de cabra; a los fines de identificar péptidos

con actividad antihipertensiva y/o antioxidante que puedan ser aplicados en el

desarrollo de un yogurt saborizado y con propiedades funcionales, mediante un

proceso tecnológico accesible a pequeños y medianos productores nacionales.

Objetivos específicos: 1. Recolectar y caracterizar muestras de lactosuero provenientes de la producción

de quesos blancos frescos elaborados a partir de leche, tanto bovina como caprina.

2. Concentrar las proteínas presentes en el lactosuero.

3. Hidrolizar los concentrados de proteínas bajo condiciones establecidas

experimentalmente.

4. Determinar actividad antihipertensiva y antioxidante in vitro de las fracciones

menores de 3 kDa de los hidrolizados proteicos.

5. Identificar secuencia de aminoácidos de péptidos presentes en los hidrolizados

con mayor actividad antihipertensiva.

6. Obtener cantidades suficientes de la fracción peptídica, identificada por su

actividad biológica, para el proceso de formulación.

7. Desarrollar y caracterizar un yogurt saborizado funcional, incorporando los

péptidos bioactivos identificados.

8. Determinar vida útil del yogurt funcional.

9. Medir aceptabilidad en consumidores del yogurt funcional.

10. Evaluar, mediante ensayo clínico, la bioactividad del producto funcional

desarrollado

7

CAPÍTULO I

MARCO TEÓRICO Virtualmente todas las innovaciones en desarrollo de nuevos productos en el

mercado lácteo internacional pueden ser clasificadas, por lo menos, bajo uno de

cuatro tópicos clave: 1) salud y bienestar; 2) autogratificación e indulgencia; 3)

conveniencia y “antojos”; y 4) estilo de vida y ética. En el primero, el foco de atención

ha ido cambiando en los últimos años hacia la adición de ingredientes en lugar de la

remoción, por ejemplo, la tendencia a reducir grasas y calorías en los productos

lácteos está siendo continuamente reemplazada por la de incorporar funcionalidad

como la principal ruta para un posicionamiento en salud y bienestar. Así se tiene que

los ingredientes funcionales se han convertido en la vía principal, en segmentos del

sector lácteo como el de yogurt y leches fermentadas, al ser estos considerados muy

buenos portadores de tales ingredientes, para introducir nuevos productos bajo una

creciente tendencia a enfocarse en beneficios específicos para la salud (Brockman y

Beeren, 2011). Y en este sentido, la industria trata de aprovechar muchos de los

desechos de su producción para la obtención de ingredientes funcionales, que

puedan luego ser incorporados en un alimento “convencional” y convertirlo en

funcional.

1.1. Lactosuero El lactosuero es el líquido de color amarillo-verdoso residual de la transformación de

la leche en queso (Jakymec et al., 2001) cuyas características físico-químicas

variarán dependiendo del método de fabricación empleado, tipo de leche (bovina,

caprina, ovina, etc.), época del año, tipo de alimentación del rebaño y etapa de la

lactación promedio (Gómez et al., 1999; Madureira et al., 2007).

8

Según Muñi et al. (2005) se obtienen aproximadamente 9 Kg de lactosuero por cada

kilogramo de queso producido, lo cual representa casi un 90% del volumen original

de leche empleado como materia prima, y a donde pasa el 55% de los nutrientes que

no son retenidos en la cuajada. Ese contenido de nutrientes, hacen del lactosuero

desechado en los cuerpos de agua, un enorme contaminante debido a la elevada

demanda biológica de oxígeno generada. Por tanto, se hace imperativo su

aprovechamiento, tanto desde el punto de vista alimenticio como de protección

ambiental.

En la actualidad el lactosuero bovino es apreciado como una fuente de componentes

bioactivos y se aplican tecnologías modernas para recuperar sus fracciones proteicas

con elevada calidad. En el caso de las leches de oveja y cabras, dedicadas

principalmente a la elaboración de quesos, también se debería incentivar una mayor

investigación para aprovechar los lactosueros generados en esa actividad

(Michaelidou, 2008).

1.1.1. Tipo de lactosuero según método de fabricación La coagulación de las caseínas, etapa básica en la elaboración de todos los quesos,

depende del sistema empleado para desestabilizar esas proteínas y formar la

cuajada. Según Henning et al. (2006) esta desestabilización se logra mediante uno

de estos tres métodos: acidificación directa o mediante cultivo iniciador, proteólisis

limitada empleando enzimas o por una combinación de ambos. En la elaboración

de quesos por acidificación de la leche se obtiene una cuajada sin fosfato cálcico y

un suero ácido con mayor contenido de minerales, cuyo pH será ≤ 4,6 si la

acidificación se realiza por adición directa de algún ácido orgánico o mineral, o será ≤

5,6 si la acidificación se logra por la acción de bacterias ácido lácticas (BAL). Ambos

sueros se agrupan como sueros “ácidos”. Cuando participan enzimas en la

desestabilización de las micelas de caseínas, la cuajada obtenida está formada

principalmente por paracaseína y el suero se caracteriza por poseer un pH≥5,6 por lo

cual se le identifica como suero “dulce”.

9

Las diferencias en ambos tipos de suero, dulce y ácido, han sido ampliamente

estudiadas. Algunos autores señalan que el suero dulce además de presentar un pH

mas elevado, también posee mayor contenido de sólidos totales, proteínas, lactosa y

lípidos, pero menor de calcio y fósforo que los suero ácidos. De igual forma, en el

suero dulce habría mayor contenido de péptidos y aminoácidos debido a la

proteólisis producida por el cuajo (Schmidt et al., 1984).

En general, la principal diferencia en ambos tipos de lactosuero, según se muestra

en la Tabla 1, lo constituye el grado de acidez titulable como ácido láctico y el

contenido de cenizas. Los rangos de valores para el resto de los componentes en

ambos lactosueros se superponen. Se puede observar también que la lactosa

constituye el componente mayoritario del total de sólidos, siguiendo en orden de

abundancia las proteínas, minerales y grasas. La importancia de estos componentes

del lactosuero ha sido reconocida en los últimos años (Walzem et al., 2002).

Tabla 1 – Composición de lactosuero bovino. Tomado de Yang y Silva (1995).

Tipo de lactosuero

Composición (% en base seca) Lactosa Proteína Ac. Láctico Cenizas Cloruros Grasa

Dulce 74-81 12,8-15,2 1,8-2,2 8,0 2,5 1,0 Ácido 65-80 9,9 – 15,5 7 – 10 7,0 -19,4 2,5 1,0

Con respecto a estudios realizados en Venezuela, en la Tabla 2 se presentan los

resultados del trabajo de Faría et al. (2002) sobre la evaluación del efecto de la

tecnología aplicada en la elaboración de tres tipos de quesos elaborados en la

ciudad de Maracaibo, estado Zulia (queso fresco “Blanco Criollo”, queso de mano, y

queso madurado tipo “Parmesano”) sobre la composición del lactosuero. Estos

autores concluyeron que la tecnología quesera afecta la composición del suero

lácteo. Al comparar esos valores con los presentados en la Tabla 1, se tiene que a

pesar de las diferencias en el procesamiento de los tres tipos de quesos, sus

lactosueros son considerados todos como del tipo dulce.

10

Tabla 2 – Contenido promedio de sólidos totales, proteínas, lactosa, grasa y cenizas de lactosueros derivados de la fabricación de tres tipos de quesos elaborados con leche de vaca en el Estado Zulia, Venezuela. Modificado de Faría et al. (2002).

Tipo de lactosuero

Composición en % base húmeda (% base seca) Sólidos totales Proteínas Lactosa Grasa Cenizas Ac.

Láctico de queso

blanco fresco

8,01 ± 1,46 1,06 ± 0,33 (13,2)

5,51 ± 0,92 (68,8)

1,04 ± 0,49 (13,0)

0,40 ± 0,10 (5,0)

0,11 ± 0,09 (1,4)

de queso de mano 7,90 ± 1,37 1,07 ± 0,41

(13,5) 5,64 ± 1,26

(71,4) 0,78 ± 0,12

(9,9) 0,41 ± 0,08

(5,2) 0,18 ± 0,08

(2,3) de queso madurado 7,25 ± 0,84 1,02 ± 0,40

(14,1) 5,17 ± 0,94

(71,3) 0,70 ± 0,17

(9,7) 0,36 ± 0,09

(5,0) 0,12 ± 0,06

(1,7) mezcla de

lactosueros 7,70 ± 0,98 1,00 ± 0,28 (13,0)

5,48 ± 0,23 (71,2)

0,86 ± 0,23 (11,2)

0,39 ± 0,08 (5,1)

0,13 ± 0,04 (1,7)

1.1.2. Composición del lactosuero Los principales nutrientes presentes en el lactosuero son la lactosa (4,5-5% p/v),

proteínas solubles (0,6-0,8% p/v), lípidos (0,4-0,5% p/v) y sales minerales (8-10% de

extracto seco) (Muñi et al., 2005).

Entre las proteínas solubles de la leche liberadas en el suero, las proteínas

globulares -lactoglobulina (-LG) y -lactalbúmina (-LA), en una relación 3:1

representan alrededor del 70%, y junto con los constituyentes minoritarios

seroalbúmina, inmunoglobulinas, lactoferrina, proteosas-peptonas y transferrina

representan mas del 80% de la proteína soluble, 6 g por cada litro de leche completa

empleada como materia prima en la fabricación de quesos (Bordin et al., 2001;

Prudencio et al., 2008; Smithers, 2008).

En la Tabla 3 se presentan el peso molecular, número de aminoácidos y punto

isoeléctrico de las 7 principales proteínas encontradas en el lactosuero bovino.

11

Tabla 3 - Propiedades básicas de las principales proteínas del lactosuero bovino. Modificados de Madureira et al. (2007) y Ounis et al. (2008)

La última de las proteínas mencionadas en la Tabla 3, se corresponde con la porción

hidrosoluble de la -caseína conocida como Glicomacropéptido (GMP) liberada en el

lactosuero por la acción de la quimosina. Esta enzima (cuajo) rompe,

preferentemente, el enlace Phe-Met (105-106) de la -caseína de la leche,

liberándose dos fracciones: el GMP, porción hidrofílica de carácter ácido, constituido

por 64 aminoácidos (f106-169), y una porción hidrofóbica, de carácter básico,

compuesta por 105 aminoácidos, llamada paracaseína-, que pasa a formar parte

integral de la cuajada a partir de la cual se obtienen los distintos tipos de quesos

(Galindo-Amaya et al., 2006). El rango de peso molecular del GMP va de 6 a 8 kDa,

dependiendo de la variante genética de la k-caseína de donde provenga (Rojas et al.,

2009). El GMP representa alrededor de un 20% de la proteína total presente en el

lactosuero (Thomä-Worringer et al. 2006).

La técnica de electroforesis por SDS-PAGE es ampliamente utilizada para el análisis

de las proteínas del lactosuero puesto que tienen un rango de peso molecular mucho

Proteína Peso Molecular (kDa)

Número de residuos de

amino ácidos pI

-Lactoglobulina 18,3 (monómero) 36 (dímero) 162 5,2

-Lactalbúmina 14,2 123 4,5-4,8

Seroalbúmina (SBA) 66,3 582 4,7-4,9

Inmunoglobulinas 22,0-27,0 (“cadena

ligera”) + 50,0–70,0 (“cadena

pesada”) - 5,5-8,3

Lactoferrina 80,0 700 8,0-9,0

Lactoperoxidasa 70,0 612 -

Glicomacropéptido 6,7 64 -

12

mas amplio que las caseínas, las cuales muestran una baja resolución en estos

geles (Chevalier, 2011). Basch et al. (1985) describieron el patrón de proteínas por

el sistema SDS-PAGE del lactosuero dializado como conformado por tres bandas

claras en la parte superior del gel y dos bandas intensamente coloreadas en la parte

inferior, las primeras se corresponden con la lactoferrina (86 kDa), seroalbúmina (67

kDa) e inmunoglobulina de cadena pesada (~55 kDa), y las segundas con la -

lactoglobulina (18,4 kDa) y la -lactalbúmina (14,3 kDa). En las Figuras 1 y 2 se

muestran los patrones electroforéticos para lactosuero bovino y caprino,

respectivamente. En ambas se observan esas bandas, aunque ninguna de las dos

figuras identifica a la lactoferrina, esta banda se puede observar, en las muestras de

lactosuero (banda “raw” de la Figura 1; y las bandas 3-6 de la Figura 2) sobre las

bandas identificadas como seroalbúmina (BSA o SA).

Los autores de estas figuras sólo identifican la cadena pesada (“heavy chain”) de la

inmunoglobulina G, justo debajo de la seroalbúmina, y no la banda de la cadena

ligera (“light chain”) de la inmunoglobulina G, que se observa en ambos geles en la

zona central.

Figura 1 – SDS-PAGE, en condiciones reductoras, de las proteínas de lactosuero bovino comparado con estándares de -LA, -LG, IgG y BSA. Tomado de Lin et al.(2010).

13

Casper et al. (1998) señalaron que el lactosuero caprino mostró una proporción

relativa de SA, IgG y -LG menor que la del bovino, pero mayor en el caso de la -

LA. Según Pesic et al. (2011) esta variación también se observó entre diferentes

trabajos y se reportó como la principal causa al efecto del período de lactación sobre

la distribución de las principales proteínas en el lactosuero caprino.

1.1.3. Secuencia teórica de aminoácidos de las proteínas del lactosuero A modo de recolectar información sobre las dos principales proteínas encontradas en

los lactosueros, para facilitar la discusión posterior, a continuación se resumen datos

pertinentes sobre su tamaño y secuencia de aminoácidos (Figuras 3 y 4), tomadas

de la base de datos disponible en el servidor ExPASy Proteomic

(http://www.expasy.ch/).

Figura 2 – SDS-PAGE, en condiciones reductoras, de lactosuero de cabra (bandas 3-6) comparadas con mezclas de estándares de las cuatro proteínas de referencia-LA, -LG, IgG y SA a diferentes concentraciones (4,16 y 2 g en las bandas 2,7 y 8, respectivamente). Tomado de Casper et al. (1998).

http://www.expasy.ch/

14

CABRA (Capra hiricus) Secuencia:P02756. . Longitud: 180 AA. Masa: 19,976 Da 10 20 30 40 50

MKCLLLALGL ALACGIQAII VTQTMKGLDI QKVAGTWYSL AMAASDISLL 60 70 80 90 100

DAQSAPLRVY VEELKPTPEG NLEILLQKWE NGECAQKKII AEKTKIPAVF 110 120 130 140 150

KIDALNENKV LVLDTDYKKY LLFCMENSAE PEQSLACQCL VRTPEVDKEA 160 170 180

LEKFDKALKA LPMHIRLAFN PTQLEGQCHV

VACA (Bos taurus) Secuencia: P02754. Longitud: 178 AA. Masa: 19,883 Da 10 20 30 40 50

MKCLLLALAL TCGAQALIVT QTMKGLDIQK VAGTWYSLAM AASDISLLDA 60 70 80 90 100

QSAPLRVYVE ELKPTPEGDL EILLQKWENG ECAQKKIIAE KTKIPAVFKI 110 120 130 140 150

DALNENKVLV LDTDYKKYLL FCMENSAEPE QSLACQCLVR TPEVDDEALE 160 170

KFDKALKALP MHIRLSFNPT QLEEQCHI

Figura 3 – Secuencia de la -lactoglobulina de ambas especies, tomadas de ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/). Se subraya los aa diferentes en la de origen caprino.

CABRA (Capra hiricus) Secuencia: P00712. Longitud: 142 AA. Masa: 16,255 Da. 10 20 30 40 50

MMSFVSLLLV GILFHATQAE QLTKCEVFQK LKDLKDYGGV SLPEWVCTAF 60 70 80 90 100

HTSGYDTQAI VQNNDSTEYG LFQINNKIWC KDDQNPHSRN ICNISCDKFL 110 120 130 140

DDDLTDDIVC AKKILDKVGI NYWLAHKALC SEKLDQWLCE KL

VACA (Bos taurus) Secuencia: P00711. Longitud: 142 AA. Masa: 16,247 Da. 10 20 30 40 50

MMSFVSLLLV GILFHATQAE QLTKCEVFRE LKDLKGYGGV SLPEWVCTTF 60 70 80 90 100

HTSGYDTQAI VQNNDSTEYG LFQINNKIWC KDDQNPHSSN ICNISCDKFL 110 120 130 140

DDDLTDDIMC VKKILDKVGI NYWLAHKALC SEKLDQWLCE KL

Figura 4 – Secuencia de la -Lactalbúmina de ambas especies, tomadas de ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/). Se subraya los aa diferentes en la de origen caprino.



15

Se puede observar que la secuencia de aminoácidos de estas proteínas, en ambas

especies, es bastante similar: la -LG caprina posee 2 aminoácidos (AA) mas que la

bovina y difiere en la posición de 13 AA (subrayados en la secuencia). La -LA

caprina posee el mismo número de AA que la bovina, pero difiere en la posición de 7

AA (subrayados en la secuencia). La homología de ambas proteínas entre las dos

especies animales, hace predecible suponer que las principales proteínas del

lactosuero caprino también pueda ser fuente de péptidos bioactivos, como se ha

demostrado en numerosos estudios con las de origen bovino (Hernández-Ledesma

et al., 2011).

1.2. Recuperación de las proteínas del lactosuero Diversas técnicas han sido empleadas para la recuperación de las proteínas

lactoséricas (Vázquez-Puente et al., 2010). La aplicación de procesos industriales

actuales permite la recuperación de las proteínas y péptidos del lactosuero, sin

desnaturalización y conservando su actividad biológica. Algunos de los procesos

unitarios empleados para la concentración, transformación, fraccionamiento y

deshidratación del suero incluyen: 1) técnicas de electrodiálisis y nanofiltración para

su desmineralización y aplicación como ingrediente en formulaciones especiales

infantiles y para pacientes clínicos; 2) otros procesos de membrana, incluyendo

microfiltración y ultrafiltración (MF/UF), para el desarrollo de ingredientes funcionales

de suero, altos en proteínas y bajos en grasa; y 3) diversos procesos de secado

(Smithers, 2008; Yorgun et al., 2008). La composición del producto final dependerá

de la tecnología empleada en la concentración de las proteínas del suero. Por

ejemplo, en la producción comercial de aislado de proteína de suero (WPI) mediante

cromatografía de intercambio iónico (IEC) se obtiene un producto con una menor

proporción de inmunoglobulinas y glicomacropéptido (GMP), en comparación con los

WPI obtenidos por procesos de MF/UF (Ounis et al., 2008).

La tecnología de mayor aplicación a nivel mundial hace uso de membranas para

concentrar macromoléculas. Esta incluye la Ultrafiltración (UF), mediante la cual una

16

membrana permite el paso, hacia una corriente de “permeado”, de sales disueltas,

vitaminas y lactosa, pero retiene las proteínas del suero y los glóbulos de grasa,

estos compuestos se acumulan en la corriente de “retenido” (Zeman y Zydney,

1996). El procedimiento resumido de UF se inicia con la clarificación del suero crudo

por centrifugación, seguido por pasteurización y finalmente sometido de 3 a 10 ciclos

de UF hasta lograr un retenido con un contenido de sólidos entre 22 y 24%, de los

cuales 85% o mas corresponden a las proteínas del suero (Cheryan ,1998). La

proteína así obtenida se caracteriza por no estar desnaturalizada y teóricamente

conserva su actividad biológica intacta, sin embargo, esto la hace un blanco difícil

para la acción de las enzimas; por ejemplo, Peña-Ramos y Xiong (2001) señalaron

que la -LG nativa es poco afectada por la pepsina, mientras que al ser

desnaturalizado por calor, es extensamente degradada a un fragmento principal de 5

kDa después de solo media hora de hidrólisis enzimática.

A nivel de la mediana y pequeña industria nacional, la aplicación de la tecnología de

membranas se ve limitada por su elevado costo de inversión y, en general, ha tenido

muy poca o limitada aceptación (Faría et al., 2003). Por esta razón, se debe buscar

otro procedimiento mas económico para concentrar o separar las proteínas del

lactosuero. Una alternativa viable en este sentido lo constituye la coagulación de las

seroproteínas por la aplicación de calor, termocoagulación o “tratamiento

termoácido”. Esta forma de recuperar las proteínas solubles de suero de leche ha

sido empleada tradicionalmente en la elaboración de quesos de suero (requesón y

ricotta); y constituye una alternativa económica para la pequeña industria lechera. En

los últimos años, se ha evaluado el aprovechamiento de estos quesos, además de su

papel en la nutrición, como alimentos funcionales, especialmente con la

incorporación de especies de bacterias probióticas las cuales muestran una mejor

viabilidad en presencia de proteínas del lactosuero (Madureira et al., 2009)

A nivel de laboratorio este procedimiento se ha aplicado para la obtención de suero

desproteinizado mediante una reducción del pH del lactosuero hasta 4,5 con ácido

fosfórico o acético, seguido de calentamiento hasta 90°C durante 15 a 20 minutos,

17

enfriamiento y separación de la seroproteína precipitada mediante fitración en papel

whatman 42 (Jakymec et al., 2001; Ramírez y Rivas, 2003). A nivel industrial, se

aplica un procedimiento similar en la elaboración de ricotta, pero con un ajuste inicial

del pH a 6,6 antes de calentar a 85-90°C por 10 minutos con agitación constante y

reajuste del pH hasta 4,65 para precipitar las proteínas, las cuales se recolectan por

filtración una vez enfriada la solución (Monsalve y González, 2005).

Ahora bien, la recuperación mediante este procedimiento de termocoagulación está

entre un 50 y 60 % de la proteína originalmente presente en el lactosuero empleado

como materia prima, ya que este porcentaje corresponde a la proteína coagulable

presente en el lactosuero derivado de la elaboración de quesos o de caseínas. Este

porcentaje se corresponde con las principales proteínas del lactosuero: -LG, -LA,

seroalbúmina, lactoferrina e inmunoglobulinas. La porción no coagulable por calor lo

constituyen compuestos nitrogenados precipitables por ácido tricloroacético de

naturalesa peptona o proteosa, además de otras sustancias simples como crestina,

creatinina, úrea, ácido úrico y aminoácidos (Webb y Whittier, 1948). La estabilidad al

calor de las principales proteínas del lactosuero están en el siguiente orden: -LA >

-LG > SA > Ig; sin embargo, el grado de desnaturalización de estas proteínas se

determina por el grado de desnaturalización de la -LG, puesto que representa cerca

del 50% de todas las proteínas del lactosuero (Jovanovic et al., 2007).

1.3. Liberación de péptidos del lactosuero La investigación sobre componentes bioactivos alimenticios constituye un área focal

clave en la investigación de cómo mejorar la salud humana a través de la nutrición

(Bauman et al., 2006). La leche está entre los alimentos más estudiados, contiene

una abundante cantidad de proteínas que han sido relacionadas tanto con la

nutrición como con el control metabólico (Hironaka et al., 1997). En general, es una

excelente y bien balanceada fuente de nutrientes, que además exhibe un rango de

actividades biológicas que afectan la digestión, respuestas metabólicas a los

nutrientes absorbidos, crecimiento y desarrollo de órganos específicos, y resistencia

18

a enfermedades. La mayoría de estas actividades biológicas se deben a los péptidos

presentes en la leche, conocidos como péptidos bioactivos. Parte de la actividad

biológica de estos compuestos está en estado latente, cuando están formando parte

de una estructura proteica más compleja, y es activada solamente por acción

proteolítica: bien sea, durante la digestión de la leche en el tracto gastrointestinal, o

durante el procesamiento y fermentación de la leche (Haque y Chand, 2006). Los

péptidos bioactivos han sido definidos como fragmentos específicos de proteínas que

tienen un impacto positivo sobre ciertas funciones o condiciones corporales y que

pueden definitivamente influir sobre la salud (Korhonen y Pihlanto, 2006). De igual

forma, el término “péptido bioactivo derivado de alimento” se refiere a los diferentes

péptidos de origen animal o vegetal que pueden tener una función reguladora en el

sistema humano, más allá de una nutrición normal y adecuada (Hartmann y Meisel,

2007). A los péptidos bioactivos se le atribuyen diversas propiedades bioquímicas y

fisiológicas, incluyendo actividad opiácea, inmunomoduladora y cardiovascular

(Sipola et al., 2002). Muchos péptidos bioactivos tienen en común propiedades

estructurales que incluyen una cadena corta de aminoácidos (de 2 a 9 aminoácidos),

residuos aminoácidos hidrofóbicos en adición a grupos prolina, lisina o arginina,

también resistencia a la acción de peptidasas digestivas (Kitts y Weiler, 2003).

Estos péptidos son inactivos dentro de la secuencia de la molécula proteica original y

se hacen biológicamente activos al ser liberados por: 1) hidrólisis enzimática durante

la digestión gastrointestinal; 2) fermentación de la leche por cultivos iniciadores

proteolíticos aplicados durante el procesamiento; o 3) hidrólisis por enzimas

proteolíticas derivadas de microorganismo o plantas (Haque y Chand, 2006;

Korhonen y Pihlanto, 2006). Sobre la base de estos dos últimos se han desarrollado

procesos tecnológicos para el aislamiento y enriquecimiento de péptidos bioactivos;

básicamente sometiendo a las proteínas lácteas a la acción de a) mezclas

proteolíticas grado alimenticio derivadas de plantas, hongos, bacterias o enzimas

digestivas; o b) fermentos lácticos proteolíticos (Ruiz-Giménez et al., 2012). Sin

embargo, siempre se debe tener presente que el primer proceso mencionado, la

digestión gastrointestinal, es la que en última instancia define la expresión o no de la

19

potencial función biológica que pueda tener un péptido una vez que entre en el tracto

digestivo. Un péptido con una secuencia apropiada y con un elevado potencial para

ejercer una función biológica específica, comprobada mediante ensayo in vitro,

puede no mostrar ningún efecto esperado en un ensayo in vivo, ya que después de

su ingestión oral, las enzimas gastrointestinales pueden cortar este péptido en otros

péptidos menores con una secuencia poco favorable para interactuar con los demás

elementos involucrados en determinado proceso biológico. Pudiendo también ocurrir

lo contrario, que esos fragmentos menores tengan una mayor potencia que el péptido

original (Miguel et al., 2010)

La aplicación de cultivos iniciadores proteolíticos ha sido exitosa en la liberación de

péptidos bioactivos a partir de las proteínas de la leche durante la elaboración de

quesos y otros productos lácteos fermentados (Pihlanto et al., 2010). Sin embargo,

casi la totalidad de los péptidos así derivados provienen de las caseínas y no de las

proteínas solubles del lactosuero. Korhonen y Pihlanto (2006), por ejemplo,

presentan una lista de 11 estudios experimentales sobre la liberación de péptidos

bioactivos luego de la fermentación de leche empleando diferentes microorganismos

proteolíticos: solo uno de ellos reportó una secuencia peptídica derivada de las

proteínas del lactosuero.

Por el contrario, con la aplicación de enzimas proteolíticas se han alcanzado mejores

resultados en la obtención de péptidos bioactivos a partir de la hidrólisis de las

proteínas del lactosuero. En la actualidad, el principal reto en la producción de

péptidos bioactivos mediante la hidrólisis enzimática in vitro es encontrar la enzima

adecuada y las condiciones que puedan favorecer la bioactividad y su rendimiento en

la producción (Ortiz-Chao et al., 2009). El resultado final del proceso de reacción en

estos sistemas enzimáticos lo determinan los siguientes parámetros: pH,

temperatura, relación enzima-sustrato (E/S) y el tiempo de hidrólisis (Li-jun et al.

2008). El seguimiento o control de este proceso se puede realizar determinando el

grado de hidrólisis (GH) definido como el porcentaje de enlaces peptídicos rotos en

una proteína que ha sido sometida a hidrólisis enzimática (García-Gómez et al.

20

2009). El desarrollo de la hidrólisis es similar en la mayoría de los sistemas

enzimáticos descritos en la literatura: inicialmente se produce un rápido incremento

en el GH, para después disminuir la velocidad gradualmente, debido posiblemente a

la competencia entre la proteína no-hidrolizada y los péptidos formados

constantemente durante la hidrólisis (Kong et al. 2008).

Se han aplicado una gran diversidad de enzimas en el tratamiento del lactosuero.

Peng et al. (2009) aplicaron alcalasa sobre un aislado de suero (pH 8,5 a 65°C, 8

horas, E/S 2:100) encontrando que el GH se incrementó linealmente en las dos

primeras horas y luego se estabilizó alrededor del 30%. Mercier et al. (2004)

hidrolizaron soluciones al 10% de diferentes fracciones de WPI con una mezcla de

tripsina:quimotripsina (1:1) a un pH de 8,8 a 42°C y con una relación E/S de 1:200 y

los GH se estabilizaron en un rango de 12 a 17%; ellos señalaron que mas del 91%

de los péptidos obtenidos tenían un peso molecular menor a 5 kDa. Saint-Sauveur et

al. (2008) aplicaron una mezcla de tripsina:quimotripsina sobre WPI (pH 8 a 42°C, 4

horas, E/S 1:200), y observaron un aumento en el GH durante la primera hora, para

luego estabilizarse lentamente en valores alrededor de 10%; este digerido enzimático

se caracterizó por tener 94% de sus componentes proteicos con un peso molecular

menor a 5 kDa. Li-jun et al. (2008) emplearon alcalasa (pH 8 a 50°C, E/S 3%) sobre

una solución de 200 g/L, de un concentrado de proteína de suero, y obtuvieron un

hidrolizado proteico conformado principalmente por péptidos de peso molecular

menor a 1 kDa. García-Gómez et al. (2009) emplearon proteasas de A. oryzae , de

dos fuentes diferentes (una preparada por fermentación en el laboratorio y otra de

origen comercial “Flavourzyme® 500 MG” de Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca),

para hidrolisar una solución al 1% de proteína de pescado (pH 8 a 50°C, 1 hora, E/S

1:5 para el fermentado y 1:100 para Flavourzyme® 500 MG ), reportaron que aunque

ambas demostraron una rápida hidrólisis en los primeros 30-40 minutos, la proteasa

obtenida por fermentación en el laboratorio alcanzó un GH de 22,2% mientras que el

de la marca comercial Flavourzyme® 500 MG fue de 9,1%.

21

Ahora bien, el GH alcanzado en un determinado momento es el que define el nivel de

la actividad biológica de los péptidos resultantes, por lo cual, se debe determinar el

tiempo de duración de la reacción enzimática en el cual se alcanza la mayor

actividad, ya que, como lo han demostrado los siguientes estudios, éste no coincide

con el máximo GH que puede alcanzar un determinado sistema enzimático. Guo et

al. (2009) en un ensayo con un extracto crudo de proteinasas de L. helveticus,

aplicado por 28 horas a un concentrado de proteínas del lactosuero, encontraron que

la actividad inhibidora ACE se incrementó en el periodo de 0 a 8 horas, para luego

disminuir paulatinamente hasta el final del ensayo; esos autores trabajando con un

tiempo de hidrólisis de 8 horas, alcanzaron niveles de GH de hasta 49,5%, sin

embargo, el GH óptimo para obtener la mayor actividad inhibidora ACE de dicho

hidrolizado fue de 19,3%, alcanzado a un pH de 9,18 a 38,9°C con un E/S de 0,60.

Marambe et al. (2008) encontraron que la actividad inhibidora ACE, del hidrolizado

de proteínas de linasa (Linum usitatissimum) con Flavourzyme®, disminuye

significativamente cuando el grado de hidrólisis es mayor de 25%, el cual se alcanzó

en un período de incubación de 4 horas, con una relación enzima:sustrato de 15 U/g

de proteína.

La principal desventaja de la hidrólisis enzimática, es la liberación de péptidos

amargos, lo cual limita significativamente su potencial aplicación en alimentos, ya

que solo podrán ser incorporados a muy bajas concentraciones para evitar el

rechazo del consumidor (Spellman et al. 2009). Por esta razón, es necesario evaluar

la acción de diversas enzimas sobre las proteínas del suero, de forma de obtener

mayor actividad biológica y, al mismo tiempo, el menor grado de amargor posible. La

mayoría de los trabajos reportados hasta la fecha sobre la obtención de péptidos

bioactivos a partir de hidrolizados de las proteínas de la leche, tales como los arriba

citados, han aplicado una o varias de las siguientes enzimas: pepsina, tripsina,

alcalasa, coralasa y flavouryzyme®. Ésta última es una mezcla de proteasas (endo y

exopeptidasas) crudas, obtenidas de A. oryzae, entre las cuales se encuentran las

carboxipeptidasas responsables de la reducción del amargor en los hidrolizados de

soya, según lo resumido por (Li et al. 2008). Peña-Ramos y Xiong (2001) reportaron

22

que la proteasa F, o Flavouryzyme®, al actuar sobre una solución al 2% de aislado

de proteína de suero (WPI) por 0,5 y 1 hora, obtuvieron un hidrolizado con mayor

actividad antioxidante en comparación con los obtenidos aplicando proteasas de

Bacillus licheniformis.

Por tanto, numerosos autores han demostrado que las propiedades funcionales de

una proteína que pueden ser alteradas por la hidrólisis dependen en gran medida del

grado hasta el cual dicha proteína ha sido hidrolizada (Spellman et al., 2003). Así se

tiene por una parte, estudios recientes han demostrado que después de la hidrólisis,

ciertos péptidos resultantes pueden ser empleados como antioxidantes naturales en

productos alimenticios (Peña-Ramos y Xiong, 2001); mientras que por otra, estudios

como el de Rizzello et al. (2005) han señalado que proteólisis intensas por largo

tiempo pueden ocasionar la hidrólisis de las secuencias biológicamente activas

haciéndolas perder su actividad.

Existen numerosos métodos para la estimación del GH. Se puede cuantificar

determinando la cantidad de nitrógeno liberada durante la hidrólisis mediante el

método de Kjeldahl o por determinación espectrofotométrica en la región visible

luego de una reacción colorimétrica (Spellman et al., 2003). También se puede

cuantificar determinando los grupos amino liberados durante la hidrólisis mediante la

titulación con formol (Taylor, 1957) o empleando compuestos que reaccionan

específicamente con grupos aminos tales como el ácido trinitrobezenosulfónico

(TNBS), p-phthaldialdehido (OPA), ninhidrina o fluorescamina (Adler-Nissen, 1982).

También se puede utilizar osmometría, calculando los cambios en osmolaridad

mediante la depresión del punto de congelación. Midiendo la liberación de protones

durante la hidrólisis mediante titulación por el método de pH stat (Rutherfurd, 2010).

1.3.1. Proteasa de Aspergillus oryzae El complejo de proteasa-endopeptidasa producido por Aspergillus oryzae,

comercializado bajo el nombre de Flavourzyme ®, según Rossini et al. (2009) es mas

23

efectiva que la Alcalasa (proteasa de Bacillus licheniformis) en la producción de

péptidos pequeños según lo demostraron mediante ensayos de cromatografía en gel

y patrón electroforético de los hidrolizados. Esos péptidos a su vez exhibieron una

mayor actividad biológica (Hogan et al., 2009). Flavourzyme® se ha aplicado en la

hidrólisis de proteína de soya (Kong et al., 2008) y en hidrólisis de la leche para

obtener los lactotripéptidos IPP y VPP (Mizuno et al., 2004), también se ha evaluado

en otros productos alimenticios como gluten de maíz (Suh et al., 2003), en desecho

de semillas de linaza luego de la extracción de aceite (Marambe et al., 2008) y en

productos de desecho, como los derivados del procesamiento de camarones (Rossini

et al., 2009; Cheung y Li-Chan, 2010). Tsai et al. (2008) han recomendado el uso de

Flavourzyme® para facilitar la fermentación de la leche por Streptococcus

thermophilus y Lb. Bulgaricus, y obtener así una fracción de lactosuero con una

mayor actividad biológica. Esta proteasa tiene la ventaja adicional de que los

péptidos producidos gracias a su acción hidrolítica tienen un bajo grado de amargor

en comparación con los productos de otras enzimas como la Alcalasa (Cheung y Li-

Chan, 2010).

1.4. Actividad biológica de los péptidos del lactosuero Muchos de los procesos fisiológicos en un organismo son mediados por péptidos: el

cuerpo humano sintetiza péptidos antimicrobianos como defensinas y endorfinas

opioides; la presión sanguínea es regulada por péptidos como la angiotensina II o la

bradykinina; y péptidos endógenos están involucrados en la respuesta inmune

(Martínez-Maqueda et al., 2012). La variedad de compuestos nitrogenados (proteínas

y péptidos) presentes en el lactosuero, exhiben un rango de actividades biológicas

que afectan procesos como la digestión, las respuestas metabólicas a los nutrientes

absorbidos, el crecimiento y desarrollo de órganos específicos, y la resistencia a

enfermedades. Los estudios sobre la actividad biológica de las proteínas de la leche

han sido recopilados en diversas revisiones, tal como la presentada por Madureira et

al. (2007). Estas proteínas contienen dentro de su secuencia de aminoácidos

precursores de péptidos bioactivos que pueden ser liberados por reacciones

24

hidrolíticas. Estos péptidos influencian directamente numerosos procesos biológicos

que provocan diversas respuestas humorales, gastrointestinales, hormonales,

inmunológicas, neurológicas y nutricionales (Clare y Swaisgood, 2000).

1.4.1. Actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina (IECA) La inhibición de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA) involucra la

modulación del sistema renina-angiotensina (RAS), el cual es un importante

regulador del tono vascular, el balance de agua y sodio y de la presión sanguínea; un

RAS intacto es crucial para el desarrollo normal del riñón (Dent et al., 2007). La

enzima conocida como ECA (Enzima Convertidora de la Angiotensina;

peptidildipéptido hidrolasa, EC 3.4.15.1) juega un papel importante en la regulación

de la presión sanguínea y el balance salino de los fluidos en mamíferos, catalizando

la conversión de la angiotensina I (un decapéptido) en el potente vasoconstrictor

angiotensina II (un octapéptido) y al mismo tiempo inactivando al vasodilatador

bradykinina (Hartmann y Meisel, 2007; Erdmann et al., 2008). La angiotensina II

causa un incremento en la presión sanguínea y, de esta forma, la inhibición de la

enzima ECA puede disminuir la presión sanguínea (Tuomilehto et al., 2004). El sitio

activo de la enzima ECA está constituido por tres subsitios (S1, S1’, S2’) en los

cuales se acoplan los tres residuos hidrofóbicos C-terminales de su sustrato, la

angiotensina I, donde son luego “cortados” los dos últimos residuos aminoácidos

produciendo la angiotensina II. De acuerdo a la evidencia acumulada hasta el

momento, los péptidos que muestran actividad inhibidora de la ACE poseen residuos

hidrofóbicos, tales como triptófano (Trp), tirosina (Tyr) o fenilalanina (Phe), en por lo

menos una de las tres posiciones C-terminales con los cuales se unen a los sitios

activos de la enzima ECA, bloqueando su actividad (Abubakar et al., 1998; Murakami

et al., 2004; Otte et al., 2007a; Vinderola et al., 2008). Se ha observado que

secuencias de péptidos de cadena corta que portan residuos de prolina (Pro), en

combinación o no con residuos hidrofóbicos, también tienen actividad inhibidora de la

enzima ECA (Murakami et al., 2004; Hartmann y Meisel, 2007). Adicionalmente, la

potencia inhibidora se puede incrementar con la presencia, en esta posición terminal,

25

de las cargas positivas de Lys (grupo -amino) y Arg (grupo guanidino) (Hernández-

Ledesma et al., 2008). En general, se reconoce que los péptidos que ofrecen

consistentemente una mayor actividad inhibidora de la enzima ECA: a) son de peso

molecular menor a 3 kDa (Lignitto et al., 2010); b) de cadena corta, de 3 a 20

residuos de aminoácidos por molécula; y c) frecuentemente portadores de residuos

polares como la prolina (Korhonen y Pihlanto-Leppälä, 2003; Hartmann y Meisel,

2007).

Numerosas proteínas alimenticias tienen secuencias de péptidos con potencial

actividad inhibidora de la enzima ECA (Murakami et al., 2004). Tsai et al. (2008)

señalaron que estudios clínicos han demostrado que los inhibidores de la enzima

ECA, reducen significativamente la morbilidad y mortalidad de pacientes con

problemas cardíacos; indicaron además que se han aislado varios péptidos

inhibidores de la enzima ECA a partir de hidrólisis enzimática de proteínas lácteas

(tipo Val-Arg-Tyr-Leu) y de la fermentación de la leche con bacterias ácido lácticas

(tipo Ile-Pro-Pro y Val-Pro-Pro). En general, la “potencia” de los péptidos inhibidores-

ECA va a depender del tipo de enzima y/o bacteria láctica utilizada en la hidrólisis

(Pihlanto et al., 2010).

1.4.1.1. Péptidos del lactosuero con Actividad IECA Otte et al. (2007a) obtuvieron cuatro potentes péptidos inhibidores de la enzima ECA

a partir de un hidrolizado de -lactalbúmina catalizado con termolisina, todos ellos

contenían la misma secuencia Pro-Glu-Trp en su extremo C-terminal. En estudio

realizado con la -Lactoglobulina (-Lg), Murakami et al. (2004) identificaron un

tetrapéptido conformado por los residuos de aminoácidos Ala-Leu-Pro-Met (f 142-

145) al cual denominaron “-lactosina B” para distinguirla del péptido “-lactosina A”

proveniente del f(78-80), previamente identificado en la misma proteína. La -

lactosina B mostró una fuerte actividad hipotensiva al ser administrado por via oral a

ratas espontáneamente hipertensivas (SHR), atribuida por los autores al residuo de

prolina presente en el tetrapéptido. En general, se ha encontrado que calentando la

26

-Lg durante los tratamientos enzimáticos (60 a 80°C) se favorece la formación de

péptidos con actividad inhibidora de la enzima ECA, y como un ejemplo de esto se

menciona al fragmento Leu-Glu-Lys-Trp obtenido bajo esta condiciones y que ha sido

descrito como un potente inhibidor de la enzima ECA (Hernández-Ledesma et al.,

2006).

Un potente péptido ECA-inhibidor formado por el fragmento 108-110 del GMP, el cual

corresponde a Ile-Pro-Pro, ha sido purificado a partir de una bebida láctea japonesa;

y en estudios controlados, se ha encontrado que la presión sanguínea de pacientes

hipertensos disminuyó significativamente después de 4-8 semanas de ingesta diaria

de 95 mL de leche agria conteniendo este péptido junto con otro derivado de la -

caseína (Silva y Malcata, 2005). Se ha reportado así que, en comparación con el

GMP intacto, los hidrolizados trípticos del GMP exhibieron niveles más altos de

actividad inhibidora-ECA (Thomä-Worringer et al., 2006).

Los resultados de los ensayos de Tsai et al. (2008) indicaron que al fermentar leche

con bacterias ácido lácticas en combinación con una proteasa, obtuvieron una mayor

producción de péptidos activos inhibidores de la actividad de la enzima ECA, entre

los cuales resaltó como el de mayor bioactividad al péptido Tyr-Pro-Tyr-Tyr.

Concluyeron así que el suero de leche fermentado de esta forma puede ser

empleado en la elaboración de alimentos funcionales formulados para prevenir la

hipertensión.

Mullally et al. (1997) reportaron la secuencia Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg obtenida de

la hidrólisis de la -LG (fragmento 142-148) con tripsina, como un potente péptido

inhibidor de la enzima ECA. Ortiz-Chao et al. (2009) reportaron un producto de la

hidrólisis de la -LG usando proteasa de N-Amano, una preparación comercial grado

alimenticio, como una mezcla de péptidos con potente actividad inhibitoria de la

enzima ECA. Al fraccionar esa mezcla, lograron aislar un péptido correspondiente al

fragmento 36-42 de la -LG que mostró un IC50 de 8 M, el cual según los autores,

es el péptido inhibidor de la enzima ECA mas potente reportado hasta esa fecha.

27

Este novel péptido tiene la secuencia de Ser-Ala-Pro-Leu-Arg-Val-Tyr, es decir, que

en extremo C-terminal posee tres aminoácidos hidrofóbicos, y uno de ellos

aromático.

Recientemente, Pan et al. (2012) reportaron un nuevo dipéptido con buena actividad

IECA in vitro, cuya secuencia fue confirmada como Leu-Leu con una masa de 226,85

Da correspondiente con el fragmento 4-5 de la -LG, obtenido mediante la hidrólisis

con tripsina. Como se puede observar, este péptido no contiene residuos de Pro,

Lys, Arg ni residuos aromáticos, pero cumple con la condición de poseer un

aminoácido hidrofóbico en el extremo C-terminal, la leucina. Mediante un modelo

computarizado ellos evaluaron el mecanismo molecular de “anclaje” del dipéptido en

el sitio activo de la enzima ECA, y encontraron que la interacción del péptido Leu-Leu

con el Zn2+ y los residuos de His383, Glu411 y His387, presentes en el sitio activo,

estabilizan el complejo péptido inhibidor-enzima, inactivando por tanto a la enzima

ECA. Ellos confirmaron la actividad IECA mediante un modelo animal con ratas

espontánemente hipertensas (SHR).

1.4.1.2. Métodos para determinar actividad IECA Hasta hace pocos años, la gran mayoría de los trabajos sobre péptidos

antihipertensivos, determinaban su actividad mediante el método del ácido hipúrico

(Cushman y Cheung, 1971) basado en la hidrólisis del péptido sintético hippuryl-L-

histidina-L-leucina (Hip-His-Leu) por la acción de la enzima ECA, con la liberación del

ácido hipúrico, como uno de los productos de la reacción, y su posterior extracción

con etil acetato, para luego determinar su concentración por espectrofotometría a

228 nm. El resultado se expresa como IC50, la concentración de péptidos ECA-

inhibidores que reducen la actividad de la enzima ECA en 50% (Murakami et al.,

2004; Hernández-Ledesma et al., 2007). Tsai et al. (2008) utilizaron el mismo

principio pero antes de la medición espectrofotométrica incorporaron una separación

por RP-HPLC.

28

Ahora bien, el método del ácido hipúrico tiene importantes limitaciones, tales como el

requisito de la extracción con un solvente, lo cual restringe el número de muestras

que pueden ser analizadas por día e introduce una fuente adicional de error. En vista

de esto, Sentandreu y Todrá (2006) desarrollaron un protocolo para una

determinación precisa, rápida y sensible de la actividad de la enzima ECA. Este

método se basa en el tripéptido intramolecularmente fluorescente o-

aminobenzoilglicil-p-nitro-L-fenilalanila-L-prolina (Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) desarrollado

por Carmel y Yaron (1978). La hidrólisis del sustrato por la acción de la enzima ECA,

genera el producto fluorescente o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly), el cual puede ser

cuantificado fluorimétricamente usando las longitudes de onda de excitación y

emisión apropiadas. La reacción se puede realizar en una placa de 96 pocillos y

leerse en un fluorímetro de microplacas. Este protocolo involucra solo una reacción

de una solo etapa, evitando posteriores derivatizaciones, extracciones con solventes

orgánicos o serparaciones cromatográficas de los productos de reacción.

1.4.1.3. Estudios in vivo para evaluar actividad IECA Debido a la falta de correlación entre las pruebas in vitro de la actividad IECA y la

acción in vivo, la evidencia sobre los efectos beneficiosos de los péptidos

antihipertensivos tiene que estar basada a datos clínicos (Martínez-Maqueda et al.,

2012). El meta-análisis realizado por Pripp (2008) resalta el hecho de que la gran

mayoría de los trabajos sobre el efecto hipotensivo de los péptidos bioactivos se han

basado en ensayos in vitro y con cierta extensión en experimentos con animales de

laboratorio (modelo animal). Este autor evaluó 15 estudios clínicos controlados por

placebo sobre el efecto de péptidos derivados de proteínas alimenticias sobre la

presión sanguínea, publicados en revistas internacionales calificadas. Estos estudios

fueron seleccionados de un total de 227 publicaciones, 212 de las cuales no se

incluyeron por no estar dirigidos al efecto sobre la presión arterial. El promedio de

duración de estas intervenciones fue de 7,4 semanas, con una intervención mínima

de 4 semanas. Mas de la mitad de estos ensayos utilizaron la intervención con los

péptidos IPP y VPP, derivados de la caseína; y del resto solo tres intervinieron con

29

péptidos derivados de proteínas del lactosuero. En la mayoría de los ensayos los

participantes fueron adultos mayores a 50 años en promedio, con una mayor

proporción de hombres que de mujeres. El resultado de este análisis demostró que el

consumo de péptidos derivados de proteínas alimenticias pueden reducir

significativamente las PAS y PAD, con un efecto promedio de 5,13 mmHg por debajo

del valor inicial (intervalo de confianza 95%: 3,14 a 7,12 mmHg) y 2,42 mmHg menos

(intervalo de confianza 95%: 1,03 a 3,82 mmHg), respectivamente.

En otro meta-análisis (Xu et al., 2008) de 12 ensayos clínicos, tomados a partir de un

total de 1561 artículos identificados en buscadores electrónicos, también se reportó

la reducción promedio en PAS y PAD de 4,8 y 2,2 mmHg, respectivamente. Todos

esos ensayos se realizaron con la intervención de los tripéptidos de la caseína, IPP y

VPP, en pacientes hipertensos y tuvieron una duración mínima de 4 semanas.

Ambos trabajos señalaron no poder establecer una dosis recomendada para el

consumo de estos péptidos a partir de los estudios analizados, ya que se requieren

mas estudios epidemiológicos basados tanto en poblaciones normales como

hipertensas para poder determinar la cantidad apropiada de péptidos lácteos para

humanos.

Por otra parte, Dent et al. (2007) no encontraron evidencia de toxicidad al suministrar

dosis entre 500 y 4000 mg/Kg/dia a animales de laboratorio durante 90 días,

trabajando con soluciones de 0,21 mg/mL, 0,84 mg/mL y 1,68 mg/mL de los

lactotripéptidos IPP y VPP. Un estudio mas reciente por Ponstein-Simarro et al.

(2009) obtuvo resultados similares, confirmando que el consumo de productos

lácteos con hidrolizados proteicos, como fuente del lactotripéptido IPP, no tiene

efectos tóxicos.

1.4.2. Actividad Antioxidante Uno de los mas potentes y peligrosos gases sobre la tierra es el oxígeno. Los

sistemas vivos están protegidos contra la oxidación mientras estén vivos, pero se

30

enfrentan al ataque constante de las sustancias conocidas como especies reactivas

al oxígeno, o ROS, por sus siglas en inglés (Koolman y Roehm, 2005). Estas ROS

pueden causar daños en el ADN, aumentando el riesgo de contraer cáncer; oxidar

ácidos grasos poli-insaturados, contribuyendo a la aparición de enfermedades

cardiovasculares; y puede dañar proteínas, interrumpiendo procesos vitales

(Erdmann et al., 2008).

Actualmente existe una creciente conciencia de que la protección contra los estragos

del oxígeno puede tener un efecto muy beneficioso sobre la salud, por lo cual, en la

última década se han cuadruplicado el número de publicaciones sobre antioxidantes

y estrés oxidativo (Huang et al., 2005). No existe duda que al incrementar el

consumo de antioxidantes se consigue prevenir tanto el cáncer como las

enfermedades cardíacas, pero no está claro cuales antioxidantes son los mas

efectivos (F.A.I.A., 2002).

Se ha propuesto la hipótesis de que el principal causante de estas enfermedades son

las sustancias reactivas oxidativas (ROS), las cuales se generan a través de

metabolismo normal y en respuesta al estrés e infección, al igual que a la exposición

a sustancias químicas tóxicas. Cualquier componente de la dieta capaz de actuar

como un antioxidante o de inducir mecanismos de protección antioxidante se

esperaría que pueda ofrecer protección contra los efectos dañinos de las ROS en

células o tejidos susceptibles (Lindsay, 2000).

Péptidos antioxidantes son aquellos péptidos, de 4 a 20 kDa, que tienen la habilidad

de inhibir los daños causados por la oxidación lipídica. Esta habilidad parece estar

relacionada con la presencia de ciertos residuos de aminoácidos, tales como tirosina,

metionina, histidina, lisina y triptófano, los cuales pueden quelar iones metálicos pro-

oxidantes (Virtanen et al., 2007), capturar radicales libres y/o extinguir el oxígeno

reactivo (Erdmann et al., 2008).

31

1.4.2.1. Péptidos del lactosuero con actividad antioxidante Algunos componentes lácteos poseen capacidad antioxidante, esto es, son activos

en la prevención de la peroxidación lipídica y mantienen la calidad de la leche, e

incluso pueden ser usados como ingredientes en alimentos y fármacos para mejorar

la salud de los consumidores. Diversos autores han reportado que la capacidad

antioxidante total de la leche se debe principalmente a las caseínas (Hartmann y

Meisel, 2007; Zulueta et al., 2009b). Péptidos antioxidantes pueden ser liberados a

partir de la hidrólisis de las caseínas durante la fermentación de la leche por cepas

BAL proteolíticas, como el Lb. Delbrueckii subsp. bulgaricus (Korhonen y Pihlanto,

2006). Adicionalmente, se ha encontrado que la disminución en la oxidación de las

grasas lácteas se debe a las propiedades antioxidantes de los compuestos

sulfhidrilos formados naturalmente durante el tratamiento térmico de la leche

(Alvarez, 2009).

Peña-Ramos y Xiong (2001) encontraron que en un hidrolizado de proteína de suero

están presentes péptidos tanto antioxidantes como pro-oxidantes, por lo que el efecto

esperado como antioxidante se ve reducido por el antagonismo de ambos

compuestos. Ellos recomendaron continuar estudios para lograr separar ambos y

evaluar mejor el efecto de cada fracción. Según Virtanen et al. (2007), hasta la fecha

solo unos pocos péptidos antioxidantes han sido identificados en productos lácteos

fermentados. Peng et al. (2009) obtuvieron, hidrolizando un aislado de proteína de

suero (WPI) mediante tratamiento enzimático con Alcalasa, cuatro fracciones con

péptidos de diferentes pesos moleculares. La fracción con péptidos en el rango de

0,1 a 2,8 kDa mostró un efecto reductor de radicales libres significativamente mayor

que las otras fracciones con péptidos de mayor tamaño. Estos autores están

trabajando actualmente en la identificación de la secuencia de aminoácidos de estos

péptidos. Se ha mencionado que la actividad antioxidante de los péptidos derivados

del lactosuero esté relacionada con la presencia de cisteína la cual promueve la

síntesis de glutationato, un potente antioxidante intracelular (Erdmann et al., 2008).

Bayram et al. (2008) obtuvieron resultados similares comparando la actividad

32

antioxidante de las proteínas del suero con la de sus hidrolizados. Sus resultados

sugieren que la actividad antioxidante es inherente a la secuencia de péptidos en la

-Lactoglobulina.

1.4.2.2. Actividad antioxidante de las frutas Existe una base de datos consistente que sugiere que aquellos consumidores que

tienen un alto consumo de alimentos de origen vegetal, poseen una incidencia mas

baja de cáncer y, probablemente, de otras enfermedades relacionadas con el

ambiente. En los alimentos vegetales, los sistemas neutralizadores de los ROS

incluyen a las vitaminas (E y C), las enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa,

glutatión peroxidasa) y otros captadores de radicales no-vitamínicos, entre los que

destacan los polifenones (Espín y Tomás-Barberán, 2007). Por esta razón, los

polifenoles se incluyen entre los componentes o ingredientes considerados como

“funcionales”. Los compuestos fenólicos poseen diferentes actividades biológicas,

además de su capacidad antioxidante y por tanto, se consideran potenciales

reductores del riesgo de aparición de enfermedades cardiovasculares y de otras

enfermedades crónicas (Robles-Sánchez et al., 2007; Vasco et al., 2008).

El tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) pertenece a la familia de las

Solanaceae, y en Venezuela su cultivo está limitado a los estados andinos y el

estado Aragua; se ha descrito la utilización de la pulpa en la elaboración de jaleas,

néctares y la combinación con productos lácteos (Hernández y Moreno-Alvarez,

2000). Desde el punto de vista nutricional, constituye una buena fuente de vitaminas

A, B6, C y E, y minerales como el hierro; además de un bajo contenido de

carbohidratos y menos de 40 calorías por cada 100 g (Márquez et al., 2007). Muñoz-

Jáuregui et al. (2007) realizaron un estudio con nueve frutas del Perú, consideradas

por ellos como recursos “promisorios”, evaluando su actividad antioxidante mediante

diversos métodos, y como conclusión presentaron una clasificación, de acuerdo a la

actividad antioxidante de estos frutos, en: “muy elevada” (Myrciaria dubia y Passiflora

mollisima), “elevada” (Prunus serotina, Morinda citrifolia y Smallanthus sonchifolius),

33

“moderada” (Averrhoa carambola, Physalis peruviana y Cyphomandra betacea

Sendt), “baja” (Passiflora quadrangularis). Repo y Encina (2008) reportaron los

siguiente valores para el fruto del tomate de árbol: DPPH 853 ± 52 g equivalente

Trolox/g de tejido; ABTS 838± 35 g equivalente Trolox/g de tejido; compuestos

fenólicos 130 ± 52 mg equivalente ácido gálico/100g de muestra; ácido ascórbico

16,09 ± 52 mg ácido ascórbico/100g de muestra; carotenos 4,00 ± 0,01 mg -

caroteno/100g de muestra. En un estudio realizado por Kou et al. (2009) se

demostró que los compuesto fenólicos de la fruta de Cyphomandra betacea Sendt

(“tomate de árbol” o “tamarillo”) protegen a las lipoproteínas de baja densidad (LDL)

de la oxidación y a los cultivos de células neuronales PC12 del daño inducido por el

estrés oxidativo; por esa razón, esos autores concluyen que el consumo de tomate

de árbol puede conferir cierta protección contra la ateroesclerosis y las

enfermedades neurodegenerativas.

1.4.2.3. Métodos para determinar actividad antioxidante De acuerdo con la revisión realizada por Huang et al. (2005), hasta el momento, no

se ha desarrollado un método analítico único y conveniente para la rápida

cuantificación de la efectividad antioxidante in vitro de un compuesto en la

prevención de enfermedades, sino que por el contrario se han propuesto un

sinnúmero de ellos. Estos autores clasificaron los numerosos métodos publicados,

dependiendo de las reacciones involucradas, en dos tipos: ensayos basados en la

transferencia de un átomo de hidrógeno (ensayos HAT) y ensayos basados en la

transferencia de electrones (ensayos ET). Estos últimos han tenido mayor aplicación

en la cuantificación de la capacidad antioxidante de los péptidos derivados de las

proteínas lácteas. A) Entre los ensayos HAT, aplicados en este campo, está el

empleado por Peña-Ramos y Xiong (2001), peroxidación de lípidos. Ellos

determinaron la habilidad inhibitoria de los péptidos contra la peroxidación de lípidos

en la membrana celular, empleando liposomas como sustrato para peroxidación. B)

Entre los ensayos ET, el primer ensayo reportado fue el TEAC (Trolox Equivalent

Antioxidant Capacity Assay) y actualmente se ha popularizado el uso de su versión

34

mejorada, el ABTS (ácido 2,2´-azinobis(3-ethylbenzothiazolino-6-sulfónico). Éste es

un método de decoloración, donde el ABTS es oxidado para formar el radical

coloreado ABTS•+ el cual es reducido nuevamente a un compuesto incoloro si la

muestra de interés contienen antioxidantes donadores de hidrógenos (Hernández-

Ledesma et al., 2007; Quirós 2007; Virtanen et al., 2007).

En vista de la dificultad que se presenta al momento de comparar resultados de los

diferentes estudios de capacidad antioxidante basados en diferentes metodologías

de determinación, Prior et al. (2005) propusieron utilizar una metodología

estandarizada para determinar la capacidad antioxidante y compuestos fenólicos en

los alimentos. La metodología propuesta consiste de la aplicación de por lo menos

dos ensayos: el ORAC, por el lado de los métodos HAT y el Folin-Ciocalteu, por el de

los ensayos ET. El método ORAC modificado por Ou et al. (2001) mide la inhibición

antioxidante de las reacciones de oxidación inducidas por radicales peróxido, es

decir, rompiendo la reacción en cadena de transferencia de átomos de hidrógeno

(Cao y Prior, 1998). Entre las ventajas del ORAC está el proveer una fuente

controlable de radicales libres, que se puede cambiar, junto con el solvente, según

se desee detectar antioxidantes hidrofílicos o hidrofóbicos; el mecanismo de reacción

es similar al de los oxidantes fisiológicos; y el uso de un pH fisiológico de forma tal

que los antioxidantes reaccionan con una carga y estado de protonación similar a

aquella en el cuerpo humano (Bisby et al., 2008). El método de Folin-Ciocalteu,

aunque no es muy específico, este protocolo da una buena idea del contenido total

de compuestos fenólicos (Tabart et al., 2009)

1.5. Identificación de la secuencia de aminoácidos en péptidos bioactivos La actividad biológica de los péptidos hasta ahora tratados depende del orden o

secuencia de los aminoácidos que los conforman, de allí la importancia de conocer

dicha secuencia para poder dilucidar el mecanismo molecular por el cual un péptido

en particular ejerce su efecto IECA (Pan et al., 2012) o antioxidante. El procedimiento

de obtener, aislar e identificar péptidos con actividad biológica, incluyendo la IECA y

35

la antioxidante, en general, es muy similar entre los distintos trabajos revisados: en

primer lugar se trabaja con una solución de 1 a 20% de proteínas del suero, a la cual

se le adiciona una enzima específica y se incuba por un tiempo determinado para

obtener el grado de hidrólisis deseado. Luego se fracciona el hidrolizado por

cromatografía de exclusión (SEC) y/o por cromatografía líquida semi-preparativa en

fase inversa (RP-HPLC), seleccionándose la fracción con mayor actividad in vitro y

finalmente se identifica la secuencia de los péptidos responsable de dicha actividad

aplicando espectrometría de masas (LC-MS/MS) y/o secuenciación N-terminal

(Hernández-Ledesma et al., 2004; Otte et al., 2007a; Tsai et al., 2008). En la Figura 5

se muestra un ejemplo de la secuencia seguida en el procesamiento de los datos

obtenidos por esta rutina de trabajo para identificar la secuencia de los péptidos

bioactivos.

Ahora bien, los hidrolizados son mezclas complejas y pueden contener hasta cientos

de diferentes moléculas, por lo cual, localizar péptidos bioactivos en este tipo de

muestras ha sido comúnmente una tarea difícil y que requiere mucho tiempo y

dedicación. Las fracciones usualmente contienen aún múltiples compuestos que

requieren ciclos adicionales de fraccionamiento, concentración y evaluación de

bioactividad para lograr identificar la molécula responsable de dicha actividad (van

Elswijk et al., 2003).

La espectrometría de masas se convierte en una importante herramienta para la

identificación y caracterización de proteínas. A continuación se resume la revisión

presentada por Contreras et al. (2008): a principios de los 80’s, la aplicación de

nuevas técnicas de desorción en los mecanismos de ionización, permitieron la

formación de gases de iones de proteínas o grandes péptidos sin fragmentación, lo

cual fue utilizado para desarrollar técnicas como el FAB (“fast atom bombardment”).

Mediante la combinación de FAB con un analizador de masas (doble enfoque, 4-

sectores o triple quadrupole): FAB-MS/MS, se caracterizaron diversos péptidos

presentes en los extractos solubles de diversos quesos (cheddar, grana-padano,

36

Figura 5 – (A) Separación del producto de la digestión péptica de la S2-CN ovina

por cromatografía de intercambio iónico; (B y C) fraccionamiento por RP-HPLC a escala semipreparativa de las fracciones C y D, respectivamente; (D) espectro MS/MS del ión m/z 1119,3 derivado de la fracción D obtenido por acoplamiento HPLC-ESI-IT-MS. La interpretación de la secuencia sobre la base de los iones observados identificaron al péptido como fragmento 181-208 de la S2-CN ovina (tomado de Contreras et al., 2008)

37

parmigiano-reggiano, comté y quesos de suero) y de productos comerciales de

lactosuero. En la actualidad, los métodos basados en FAB están siendo desplazados

por el empleo de interfaces de ionización a presión atmosférica como ESI (ionización

por “electrospray”). ESI ha sido utilizado en combinación con todos los analizadores

de masas comunes, siendo los mas empleados el triple-quadrupole y la trampa de

iones (IT). Mediante una interface se ha podido adaptar la etapa de cromatografía

con la de ionización-analizador de masas, de esta forma el análisis de fracciones

bioactivas por RP-HPLC-ESI-IT-MS/MS ha permitido conocer las secuencias de

numerosos péptidos con propiedades antihipertensivas, antioxidantes, opioides o

antimicrobianas. La otra técnica que se ha aplicado con éxito recientemente es la de

MALDI-TOF (“matrix-assisted laser desorption ionization – time of fly”), pero que por

manejar la muestra en una matriz sólida no puede ser acoplado a la interface

cromatográfica.

1.6. Desarrollo de alimentos funcionales El desarrollo de nuevos productos es una actividad esencial en el crecimiento y

mantenimiento de la industria en general, y de la agroindustria en particular. Ésta

última debe ajustar el portafolio de productos a las cambiantes necesidades de sus

clientes para poder permanecer en un mercado muy competido. El desarrollo y

lanzamiento de nuevos productos, a criterio de Earle et al. (2001) involucra desde el

desarrollo del concepto hasta la formulación final del producto, pasando por

diferentes etapas en las cuales se evalúan prototipos, se diseñan especificaciones,

se mide la aceptabilidad del consumidor y se determina su factibilidad económica.

Esto constituye la etapa exploratoria del desarrollo, la cual continúa con la etapa

avanzada conformada por: análisis financiero, escalado de la formulación a nivel de

línea de producción, pruebas de mercado y comercialización. El desarrollo de

productos es el proceso secuencial de encontrar ideas para nuevos bienes y

servicios y convertirlos en productos comercialmente exitosos, es decir, que son

seguros, proveen beneficios para el consumidor y pueden ser manufacturados de

manera rentable por la empresa (Dalrymple y Parsons, 1990). La incorporación de

ingredientes funcionales en productos lácteos, como el yogurt y leches fermentadas,

38

se han convertido en la vía principal para introducir nuevos productos bajo una

creciente tendencia a enfocarse en beneficios específicos para la salud (Brockman y

Beeren, 2011).

El desarrollo de un nuevo producto funcional es un proceso costoso y laborioso; la

industria debe tomar en consideración muchas variables para desarrollar o aplicar

reingeniería a productos funcionales, tales como aceptación sensorial, estabilidad,

precio, propiedades químicas y funcionales, y conveniencia. Se necesitan una gran

variedad de técnicas para cubrir metas y expectativas en el área de alimentos

funcionales. El efecto funcional de un alimento o ingrediente alimenticio depende de

que el componente activo gane acceso al sitio o “blanco” funcional; sin embargo,

como la mayoría de los alimentos son mezcla complejas de componentes que

pueden atrapar el compuesto activo, modular su liberación o inhibir su actividad, se

hace necesaria la selección y desarrollo de la matriz apropiada para mantener la

forma molecular activa del compuesto funcional hasta el momento de su consumo y

transporte hasta el blanco fisiológico dentro del organismo (Betoret et al., 2011)

En general, el término de alimento funcional se refire a un alimento que ha sido

modificado de alguna forma para hacerlo “funcional”. La funcionalidad de los

productos lácteos se incrementa con la incorporación de péptidos bioactivos o la

liberación de estos por la proteólisis de sus proteínas en los productos fermentados

(Shah, 2007). Con respecto a los estos últimos, la producción de péptidos bioactivos

con actividades multifuncionales, en el mismo alimento, es una meta atractiva puesto

que esto confiere un efecto saludable positivo adicional a productos lácteos que ya

tienen una imagen de “saludable” y que tienen una larga historia de producción

segura e inocua (Michaelidou, 2008).

La fabricación de ingredientes funcionales con péptidos bioactivos tiene el potencial

de poder ser usados en la formulación de alimentos funcionales, cosméticos y como

potentes drogas con efectos farmacológicos bien definidos. Con el aumento en el

número de cuestionamientos realizados por parte de los consumidores sobre los

39

efectos negativos de los conservantes químicos y el aumento en la preferencia por

los compuestos naturales, las sustancias bioactivas derivadas de la leche pueden

tener una aplicación importante en la conservación de alimentos y como nutracéutico

(Haque y Chand, 2006). Estos alimentos funcionales que contienen péptidos

bioactivos, se pueden desarrollar mejorando la bio-disponibilidad de los mismos en

productos lácteos existentes o “creando” nuevos a través de la adición o fortificación

de fracciones aisladas de estos péptidos (Korhonen y Pihlanto, 2006; Hartmann y

Meisel, 2007). Sobre la base de esto, se puede considerar al suero de leche con

péptidos bioactivos como un ingrediente funcional.

El reto tecnológico de llevar al consumidor un producto funcional basado en péptidos

bioactivos se soporta, según la revisión realizada por López-Expósito y Recio (2006),

en: a) la elaboración de un producto lácteo fermentado con una elevada

concentración de ciertos péptidos bioactivos, o sus precursores, a partir de los cuales

serían liberados durante la digestión en el tracto gastrointestinal; y b) la producción

de hidrolizados de proteínas lácteas con un elevada concentración de péptidos de

bioactividad específica, y con una funcionalidad que los hace convenientes como

ingredientes en otros alimentos, incluyendo otros productos lácteos. El primero se

logra mediante la fermentación de un producto lácteo con una cepa de Bacterias

Ácido Lácticas (BAL) altamente proteolítica. En este grupo, el Lactobacillus

helveticus ha sido el microorganismo fermentativo de preferencia empleado en la

búsqueda de un producto efectivo inhibidor de la enzima ECA. Este proceso de

fermentación debe ser seguido por una concentración de los péptidos producidos, lo

cual se ha logrado mediante ultrafiltración con membranas de puntos de corte de 3 o

5 kDa, así como también mediante cromatografía de fase reversa HPLC. Según esos

mismos autores, los dos productos comerciales producidos de esta forma y que han

sido más ampliamente evaluados son Calpis en Japón y Evolus en Finlandia. Ambos

son productos de leche fermentada, inoculada con una cultivo que contiene L.

helveticus. En el caso de Calpis, adicionalmente se le incorpora una cepa de S.

cerevisiae. Evolus se comercializa como de doble efecto, ya que, por una parte

ayuda a reducir el colesterol, por la acción de un fitoesterol añadido, y por otra,

40

reduce la presión arterial, gracias a los tripéptidos IPP y VPP derivados de la

proteólisis de las proteínas de la leche (Korhonen y Pihlanto, 2006; Shah, 2007).

En el país, el producto lácteo fermentado de mayor producción y consumo es el

yogurt, el cual mantiene una tendencia al crecimiento en un mercado que produce 40

millones de kilos y mueve 1,8 millones BsF. Sin embargo, el consumo per cápita de

1,7 Kg/año es bajo si se compara con otras naciones, como Colombia, Estados

Unidos y Europa con 4, 8 y 10 Kg/año, respectivamente. El mercado de yogurt en

Venezuela está dividido en tres categoría principales: yogurt firme 25%, yogurt

líquido 60% y yogurt con cereal 15% (Anónimo, 2006).

La norma COVENIN 2393:2001 define al yogurt como el “producto coagulado

obtenido por fermentación láctica de la leche o mezcla de ésta con derivados lácteos,

mediante la acción de las bacterias lácticas Lactobacillus delbruckii subsp bulgaricus

y Streptococcus salivarius subsp thermophylus, pudiendo estar acompañadas de

otras bacterias ácido lácticas que por su actividad le confieren las características al

producto terminado; estas bacterias deben ser viables y activas desde su inicio y

durante toda la vida útil del producto. Puede ser adicionado o no de los ingredientes

y aditivos indicados en esta norma.”

El yogurt comercializado a nivel nacional se elabora totalmente con leche de vaca.

Sin embargo, si se aprovechan las propiedades nutricionales y terapeuticas que

posee la leche cabra, se pueden introducir al mercado productos atractivos para

muchos consumidores con necesidades especiales o intolerantes a la leche de vaca.

En este sentido, la principal aplicación de la leche de cabra es su consumo

terapeutico por personas con alergias alimentarias a las proteínas de la leche de

vacas; Haenlein (2004) reseñó diversos estudios donde, por una parte, reportaron la

incidencia de este tipo de alergia, con una prevalencia de 2,5% en niños menores de

3 años, pero que alcanzó hasta un 20% en algunas zonas; y por otra parte,

reportaron que hasta 40% de estos problemas de alergias se resolvieron con el

tratamiento de leche de cabra.

41

La otra ventaja del consumo de leche de cabra es a nivel nutricional. Como lo

señalaron Vargas et al. (2008) la principal diferencia entre la leche de ambas

especies se relaciona con: a) diferentes proporciones de los diferentes tipos de

caseínas, la de cabra es mas pobre o carece totalmente de s1-caseína; b) en la

estructura, las micelas de caseína caprina tienen mayor tasa de dispersión, mayor

mineralización y un nivel mas bajo de hidratación; y c) tamaños de los glóbulos de

grasa y las micelas de proteínas, la leche de cabra se le llama “naturalmente

homogeneizada” debido a la predominancia de glóbulos de grasa de pequeño

tamaño, esto le confiere una mayor digestibilidad.

En el Pais hay mucha aceptacion por los yogures saborizados con frutas, pero no

existe ninguna marca comercial o artesanal que incluya como ingrediente al tomate

de árbol (Cyphomandra betacea Sendt), al cual en diversos países de Centro y Sur

América se le atribuyen propiedades medicinales, en la curación de heridas y llagas,

eliminación de parásitos intestinales, afecciones de la garganta, dolores musculares,

afecciones del hígado, gripe, afecciones cutáneas, diabetes, reumatismo, “fiebre

intestinal” y mordeduras de serpientes (Reyes y Sanabria, 1993). Los análisis

químicos revelan que el fruto fresco de C. betacea es una fuente importante de -

caroteno (pro-vitamina A), vitamina B6, vitamian C, vitamina E y Hierro (Durán y

Moreno-Alvarez, 2000). También posee contenidos altos de potasio, magnesio,

fósforo, así como pectinas y flavonoides. Estos últimos comprenden los flavonoles,

antocianidoles y flavonas (todos presentes en el tomate de árbol), los cuales son

colorantes naturales con acción antioxidante que constituyen el grupo más

importante de la familia de polifenoles; estos compuestos protegen el sistema

cardiovascular y activan las enzimas glutation peroxidasa y catalasa, antioxidantes

presentes en nuestro organismo (Robles-Sánchez et al., 2007).

42

CAPÍTULO II

MATERIALES Y MÉTODOS El presente trabajo se dividió en cinco etapas: en primer lugar se desarrolló un

ingrediente funcional con actividad IECA, obtenido de la hidrólisis aplicada bajo

condiciones determinadas experimentalmente. En segundo lugar, se desarrolló un

yogurt natural funcional, incorporando el hidrolizado bioactivo. Tercero, se desarrolló

un yogurt saborizado funcional, incorporando una mermelada de tomate de árbol (C.

betacea Sendt) para aumentar capacidad antioxidante. Cuarto, se determinó la vida

útil de ambos productos funcionales. Y por último, se realizó estudio clínico para

confirmar “funcionalidad” del yogurt natural con el hidrolizado bioactivo.

2.1. Desarrollo del ingrediente funcional Como criterio de formulación se estableció que el hidrolizado funcional debería tener

una consistencia ligeramente espesa para que pueda ser incorporado al yogurt

natural, y contener una dosis “adecuada” de péptidos con actividad IECA. Sin

embargo, como ya se reseñó, los meta-análisis realizados por Pripp (2008) y Xu et

al. (2008) señalaron no poder establecer una dosis recomendada para el consumo

de estos péptidos a partir de todos estudios analizados, ya que se requieren mas

estudios epidemiológicos basados tanto en poblaciones normales como hipertensas

para poder determinar la cantidad apropiada de péptidos lácteos para humanos. Por

tanto, se procedió a obtener un hidrolizado con la mayor actividad IECA posible,

seleccionado a partir de un análisis factorial 23 con las siguientes variables: especie

lechera (vaca vs cabra), método de concentración (ultrafiltración vs

termocoagulación) y tipo de hidrólisis (enzimática vs fermentación ácido-láctica

asistida por enzima).

43

2.1.1. Procesamiento de la leche y obtención del lactosuero El primer paso en el presente trabajo fue seleccionar la fuente de la proteína sérica

entre las dos opciones disponibles: vacuna y caprina. Para su obtención se

realizaron seis (06) procesos de fabricación de queso blanco pasteurizado: tres (03)

con leche de vaca y tres (03) con leche de cabra. Los primeros se obtuvieron de un

rebaño Holstein puro, ubicado en la Estación Experimental Santa María, Cagua,

Edo. Aragua. Los de leche de cabra, de un rebaño de cabras mestizas Canarias 3/4

y 5/8, pertenecientes a la Unidad Experimental de Producción Caprina (UNEXCA)

Maracay, Edo. Aragua. Ambos rebaños pertenecientes a la Facultad de Ciencias

Veterinarias de la UCV, y manejados bajo régimen de estabulación. Los lotes de

leche fueron recolectados y procesados en diferentes momentos del año, los dos

primero lotes de cada rebaño se tomaron dentro de la época de sequía (diciembre-

mayo), mientras que el tercero fue en la época de lluvias (junio-noviembre). El

procesamiento de los seis lotes de leche se llevó a cabo en las instalaciones de la

Planta piloto de la FCV UCV, núcleo Maracay, Edo. Aragua, utilizando dos tanques

doble camisa de acero inoxidable, cada uno de 200 L de capacidad, según

flujograma presentado en la Figura 6.

Con la leche de vaca se elaboraron quesos blancos pasteurizados, mientras que la

de cabra se destinó a quesos para madurar. En la elaboración de ambos tipos de

quesos se siguieron los mismos pasos básicos: recepción y toma de muestra de la

leche para su caracterización; filtrado; pasteurización; adición de fermento láctico

(Choozit MM100 LYO, Danlac Canada Inc., Alberta, Canada) y cuajo (Marschall

M2.5/100, Danisco, Bogotá, Colombia) en una proporción de 3,5 g y 2,5 g por cada

100 L de leche, respectivamente; reposo por 40 minutos para permitir coagulación;

cortado y separación de la cuajada; recolección del lactosuero. De cada proceso se

tomaron cerca de 4 L de lactosuero, además de las muestras para su

caracterización. Luego del descremado y filtrado, cada lote de lactosuero se dividió

en tres porciones iguales.

44

Figura 6 – Procesamiento de los lotes de leche para obtener lactosuero, y sus subsecuentes tratamientos para seleccionar las condiciones de hidrólisis óptimas.

Leche de vaca o cabra

Filtrar, pasteurizar, agregar cuajo y fermento láctico (BAL), reposo 40 min.

Corte y separación de la cuajada

Cuajada

Suero completo

Descremar y filtrar

PORCIÓN I: Selección de

condiciones de Hidrólisis (pH, T,

E/S, t) con proteasa de A.

oryzae

PORCIÓN II: Concentrado por

ultrafiltración.

PORCIÓN III: Concentrado por

termo-coagulación.

Muestras para Análisis Físicos y Químicos

Obtención de patrón de proteínas por electroforesis SDS-PAGE

Muestras para Análisis Físicos y Químicos

Muestras para Análisis Físico y químico

HIDRÓLISIS

EXTRACTO <3kDa

Medir actividad biológica e identificar péptidos

HIDRÓLISIS

EXTRACTO <3kDa

Medir actividad biológica e identificar péptidos

45

2.1.2. Caracterización física y química de las muestras de leche y suero A cada lote de leche y suero se le determinó su densidad (Fondonorma, 1997f) y

contenidos de proteínas (Fondonorma, 1997d), grasas (Fondonorma, 1997b),

cenizas (Fondonorma, 1997a), carbohidratos (por diferencia), humedad y sólidos

totales (Fondonorma, 1997c).

2.1.3. Descremado Para eliminar la interferencia de la grasa láctea en los análisis posteriores y eliminar

las partículas de cuajada remanente, los lotes de lactosuero se centrifugaron a 20000

g por 30 minutos a 4°C en una centrífuga RC-5 SuperSpeed Refrigerated Centrifuge

(Sorvall Dupont Instruments, EEUU). Luego de lo cual se retiró con cuidado la capa

superior de grasa cristalizada y se filtró el sobrenadante a través de gaza.

Los lactosueros procesados de esta forma fueron luego caracterizados según se

describió en el punto anterior. Los lactosuero descremados se separaron en las tres

porciones señaladas en la Figura 6.

2.1.4. Electroforesis Para comparar el patrón de distribución de las proteínas de ambos tipos de

lactosuero, caprino y ovino, se aplicó a una alícuota de la Porción I, de cada lote de

suero, una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) según el método de

Laemmli (1970) con un gel de separación al 15% y un gel de apilamiento al 3%, bajo

condiciones reductoras, es decir, en presencia de 2-mercaptoetanol y úrea.

Materiales: 1) solución madre de 30% p/v Acrilamida (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,

EEUU); 2) solución buffer 1,5M Tris (pH 8,8) 27,23 g de Tris-base y agua destilada

c.s.p. 150 mL, ajustando pH a 8,8 con HCl; 3) solución buffer 1,0M Tris (pH 6,8)

12,0 g Tris-base y agua destilada c.s.p. 100 mL, ajustando pH a 6,8 con HCl;

46

4)solución 0,125M TrisHCl (pH 6,8) 1,5g Tris-base y agua destilada c.s.p.

100mL,ajustando pH a 6,8 con HCl;5)solución 10% SDS; 6) solución 10% persulfato

de amonio (APS); 7) Tetramethylethylenediamine (TEMED); 8) Úrea; 9) Glicerol; 10)

-Mercaptoetanol; 11) solución buffer de corrida 0,25M (electrodos) 3,03 g de Tris-

base, 18,77 g Glicina y 10 mL solución 0,1 % SDS; 12) solución buffer de carga,

4% SDS, 20% glicerol, 10% -mercaptoetanol, 0,625 mL solución 0,125 TrisHCl (pH

6,8), 0,002 azul de bromofenol; 13) gel de separación (15%): 16 mL solución madre

acrilamida 30%, 7,5 mL buffer de separación, 6M úrea, 10% SDS,10% APS, 0,012

mL TEMED; 14) gel de apilamiento (3%): 0,4 mL solución madre acrilamida 30%,

0,52 mL buffer de apilamiento, 0,04 mL 10% SDS, 0,04 mL 10% APS, 0,004 mL

TEMED, agua c.s.p. 4 mL; 15) solución de tinción: 100 mL sol. 0,1% Coomassie

Blue, 67,5 mL ácido acético, 360 mL metanol, 472,5 mL agua; 16) solución de

decoloración: 75 mL ácido acético, 50 mL metanol, 875 mL agua; 17) patrón de peso

molecular (BlueRanger prestained protein molecular weight marker mix, de Pierce,

Rockford, EEUU: miosina 215k, fosforilasa B 120k, BSA 84k, ovoalbúmina 60k,

anhidrasa carbónica 39,2k, inhibidor de tripsina 28k y lisozima 18,3k). Equipos: 1)

Equipo de electroforesis vertical (V20-EB-GRM de GIBCO BRL, Life Technologies,

Gaithersburg, EEUU); 2) Fuente de Poder; 3) Micropipetas de 1000 L, 100 L y 20

L. Procedimiento: 1) se prepararon 30 mL del gel de separación, vertiéndose

inmediatamente en el molde; una vez polimerizado, se prepararon 4 mL del gel de

apilamiento y se vertieron sobre el gel de separación, colocándose el peine para

formar los pozos para las muestras; 2) se mezclaron 15 L de cada muestra con 10

L del buffer de carga, en un tubo eppendorf de 1,5 mL, se incubaron a 37°C por 15

minutos; 3) una vez polimerizados ambos geles, aproximadamente 45 minutos, se

retiró el peine, se llevó el conjunto ensamblado con el gel al soporte del equipo; 4) se

vertió el buffer de corrida en las cavidades de los electrodos, asegurándose de cubrir

los pozos de descarga de muestra; 5) se cargaron 20L de cada mezcla de muestra

en los pozos, el marcador de peso molecular se cargó en el primer pozo; 6) se

ensambló el equipo y se conectó, dentro de una cava refrigeradora a 2°C, a la fuente

de poder; 7) se aplicaron las siguientes condiciones de corrida: 30 V constantes

hasta que la línea de corrida alcanzó el borde inicial del gel de separación, a partir de

47

allí se aumentó el voltaje a 90V hasta el final de la corrida (6,5 horas); 8)

posteriormente, se retiró el gel del molde y se colocó en bandeja rectangular para

cubrirlo con la solución de tinción, dejándose en reposo toda la noche; 9) al día

siguiente, se eliminó la solución de tinción, se enjuagó el gel con agua, y se colocó

nuevamente en la bandeja, cubriendo el gel con la solución de decoloración por seis

horas. Para estimar el peso molecular de las bandas en las muestras se procede en

primer lugar a graficar el logaritmo del peso molecular de los marcadores vs la

distancia de migración relativa correspondiente a cada marcador en el gel. Luego se

mide la migración de la banda problema y se traslada a la curva de los patrones y se

obtiene el peso molecular al cual corresponde esa distancia.

2.1.5. Concentración de proteínas del lactosuero Debido al bajo contenido de proteínas del lactosuero, es necesario concentrarlo para

que su procesamiento sea mas eficiente y de mayor rendimiento. Con las porciones II

y III de cada lactosuero (Figura 3), para ambos tipos de leche (bovina y caprina), se

evaluaron dos procesos para concentrar las proteínas: ultrafiltración y

termocoagulación.

2.1.5.1. Ultrafiltración del lactosuero La porción II se concentró por ultrafiltración empleando equipo DDS Lab. Módulo 20-

0,36-LAB marca RANNIE, ubicado en el Instituto de Química de FAGRO UCV,

Maracay. Este equipo consta de dos secciones principales: la columna donde se

ensamblan las membranas (Figura 7b) y el motor compresor (Figura 7a). El módulo

de membranas ensamblado en la columna consiste de 20 marcos separadores

(Figura 7c), 10 soportes de membrana con salida para permeado (Figura 7d), 20

láminas de papel filtro (Figura 7e) y 20 membranas semipermeables de acetato de

celulosa tipo 600 cm con área efectiva de 0,36 m2 (Figura 7f). Las condiciones de

trabajo aplicadas fueron las señaladas por Giardina (1995): a) caudal de 8

litros/minuto; b) rango de presión de entrada de 10 a 15 atm; c) rango de presión de

salida de 15 a 20 atm; d) presión hidráulica como contrapresión de 20 Ton. Se

48

descartó el permeado y el retenido se almacenó a -20°C hasta el momento de su

procesamiento.

Figura 7 – a) Motor compresor del equipo de ultrafiltración DDS; b) Columna de equipo de ultrafiltración DDS ensamblado con 12 membranas; c) Marco separador de membranas; d) Soporte de membrana con salida para permeado; e) Lámina de papel de filtro; f) Membrana semipermeable de acetato de celulosa.

2.1.5.2. Termocoagulación del lactosuero La porción III de cada lactosuero se concentró por termocoagulación, separación de

las proteínas del suero por tratamiento termo-ácido, siguiendo el procedimiento

descrito por Ramírez y Rivas (2003), con ciertas modificaciones. En primer lugar, se

determinó el pH inicial del lactosuero, si éste resultó menor a 6,3 se procedió a

ajustarlo dentro del rango 6,3 a 6,5 con una solución de NaOH 2,6M.

Seguidamente se inició el calentamiento a una tasa de aproximadamente

1,7°C/minuto con agitación continua hasta llegar a los 85°C hasta flocular las

a b

c d e f

49

proteínas, en ese punto se añadió ácido acético hasta reducir pH hasta 4,6; se

mantuvo la agitación y el calentamiento por 20 minutos. Se colocó en baño de maría

invertido hasta alcanzar una temperatura entre 40 y 45°C, y luego de lo cual se filtró

a través de papel de filtro (Whatman N°1). La proteína retenida en el papel de filtro se

pesó, se empacó en envase hermético y se almacenó a -20° C. El escalado de este

procedimiento, a nivel de planta semi-industrial, se describe mas adelante en una

sección posterior.

2.1.6. Hidrólisis del lactosuero Para “liberar” los péptidos bioactivos que pudiesen estar contenidos en algunas de

las secuencias de aminoácidos contenidos en las proteínas del lactosuero es

necesario aplicar una hidrólisis enzimática. Ésta hidrólisis debe ser parcial, puesto

que se desean obtener péptidos entre 3 y 20 residuos de aminoácidos, por lo cual se

hace necesario, en primer lugar, determinar las condiciones de temperatura, pH,

relación enzima/sustrato y tiempo de incubación, para obtener un grado de hidrólisis

entre 10 y 20%, para luego hidrolizar los concentrados de lactosuero obtenidos en la

sección anterior.

2.1.6.1. Condiciones óptimas para hidrólisis enzimática Las condiciones de la hidrólisis se determinaron empleando la metodología de

superficie de respuesta con diseño central compuesto 24: 16 corridas centrales, 8

corridas axiales y 7 corridas de punto central, con dos réplicas de cada uno (ver

anexo 1) para un total de 93 experimentos. En la Tabla 4 se muestran los niveles de

los cuatro factores seleccionados (pH, Temperatura, relación Enzima/Sustrato y

tiempo) para la hidrólisis con la proteasa obtenida de A. oryzae en una concentración

de 500 U/mL (Sigma–Aldrich Chemical Co., EEUU).

50

Tabla 4 – valores de los niveles de los factores seleccionados en el diseño central compuesto 24

Factor -a -1 0 1 A (A) pH 5 6 7 8 9 (B) T °C 26 34 42 50 58 (C) E/S % p/p 1 2 3 4 5 (D) t minutos 30 60 90 120 150

La variable dependiente fue el grado de hidrólisis (GH) calculado según la técnica de

titulación con formol descrita por Taylor (1957) a partir del volumen de NaOH añadido

para liberar el formol enlazado a los enlaces péptidicos libres producto de la hidrólisis

enzimática:

GH = [VB NB (1/Mp) (1/ (1/htot)] 100

donde, GH: grado de hidrólisis (%)

VB: volumen de la base muestra – volumen de base del blanco (mL)

NB: normalidad de la base

Mp: masa de proteína (g)

1/: tasa promedio de disociación de los grupos -NH2 (que se calcula por el cociente (10(pH-pK))/(1+10(pH-pK)). Este valor es dependiente de la temperatura, por lo que para cada corrida se tomaron los valores señalados por Prieto-Velasco (2007): 1,16 para 26°C; 1,13 para 34°C; 1,06 para 40°C; 1,04 para 50°C; y 1,03 para 58°C.

htot: número total de enlaces peptídicos en la proteína sustrato (para las proteínas del suero Adler-Nissen (1982) recomienda utilizar un valor de 8,8 meqv./g de proteína, sobre la base de su composición de aminoácidos)

Para cada corrida se estabilizó la temperatura del baño de María a la temperatura

correspondiente, una hora antes de iniciar el ensayo. Paralelamente, se vertieron 100

mL del lactosuero en un beaker de 250 mL, introduciendo en él una barra magnética.

Se colocó sobre el agitador magnético y se le midió el pH original al suero, para

luego ajustarlo al pH de la corrida con NaOH o HCl, según fuese el caso. Se tapó el

beaker con papel de aluminio y se colocó en el baño de María. Una vez alcanzada la

51

temperatura especificada, se sacó el envase del baño de María y se colocó

nuevamente sobre la plancha de agitación y se añadió la enzima en la proporción de

3% del contenido de proteína del lactosuero, una vez mezclado bien, se retornó el

beaker tapado al baño de María, y se mantuvo en incubación el tiempo especificado

para la corrida. Cada media hora, hasta el final de cada corrida, se tomó una alícuota

de 5 mL para determinar el GH mediante la titulación con formol: se colocó en una

cápsula de cerámica, se mezclaron con 3 gotas de fenolftaleína y se ajustó el pH a

8,5 (punto final de la titulación) con una solución 0,1N de NaOH. Seguidamente se

añadieron 4 mL de solución de formol al 35% previamente neutralizado a un pH de

8,5. Esta mezcla se incubó por un minuto a temperatura ambiente y luego se tituló

nuevamente, registrándose el volumen de NaOH empleado en esta segunda

titulación, para calcular el GH según la fórmula arriba descrita. Para cada corrida se

titula un blanco: 5 mL del lactosuero (sin enzima ni cepa BAL) se procesa de igual

manera que las muestras, y el volumen de NaOH de la segunda titulación se utiliza

en la fórmula como el volumen de base del blanco.

2.1.6.2. Hidrólisis de los lactosueros concentrados Una vez definidas las condiciones de pH, temperatura, relación enzima/sustrato y

tiempo, para obtener una hidrólisis parcial moderada (10-20%) de las proteínas del

lactosuero, se procedió a hidrolizar los lactosueros concentrados. Para esto se aplicó

un diseño factorial 23, es decir, se toman en consideración tres factores con dos

niveles cada uno (Tabla 5): origen del lactosuero (bovino o caprino), cómo fue

concentrado (ultrafiltración o termocoagulación) y tipo de hidrólisis (solo enzimática o

combinación enzima-cepa ácido-láctica). Para las muestras tratadas por la

combinación enzima-cepa ácido-láctica (BAL), se utilizó una mezcla de cultivos

termófilos de L. helveticus y St. Salivarius var thermophilus (FD-DVS-TCC-20 de Chr

Hansen, Biotécnica Catalina, Venezuela), en una proporción de 0,02%. La

determinación del GH se realizó mediante la titulación con formol descrito

anteriormente. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado.

52

Tabla 5 – Identificación de los Tratamiento de acuerdo a las variables: origen, proceso de concentración y tipo de hidrólisis.

LACTOSUERO BOVINO LACTOSUERO CAPRINO Ultrafiltración Termocoagulación Ultrafiltración Termocoagulación

Enzima Tratamiento 8 Tratamiento 5 Tratamiento 7 Tratamiento 6 Enzima + BAL Tratamiento 2 Tratamiento 4 Tratamiento 3 Tratamiento 1

2.1.6.3. Extracto soluble menor a 3 kDa de cada hidrolizado Puesto que el producto deseado de la hidrólisis parcial moderada, lo constituyeron

péptidos conformados por 3 a 20 aminoácidos, con peso molecular menor a los 3

kDa, fue necesario separarlos del resto de los componentes proteicos del lactosuero,

para luego poder concentrarlos y poder determinar adecuadamente su actividad

biológica. Para esto, cada uno de los ocho hidrolizados obtenidos en el paso anterior

se ultrafiltró a través de una membrana de celulosa regenerada de 3000 Da de

tamaño de poro y 4,5x10-3 m2 de área efectiva (Millipore Corporation, Bedford, MA,

USA), instalada en equipo de ultrafiltración con agitación (modelo 8400, Millipore).

Luego, cada permeado fue deshidratado por liofilización en un equipo Labconco

LIPH-LOCK 6 (LABCONCO Corp., Kansas City, EEUU) y se almacenó a -20°C, hasta

su posterior procesamiento. El contenido de péptidos se estimó mediante el

procedimiento para determinar proteínas por Kjeldahl, descrito anteriormente.

Para evaluar la presencia de péptidos en los extractos se realizó corrida preliminar en

un espectrómetro de masas prOTOF® 2000 MALDI O-TOF (PerkinElmerSciex,

Conneticut, EE.UU.) ubicado en los laboratorios de la Fundación IDEA. Esta técnica

detecta los péptidos basado en sus relación masa/carga (m/z), generando una

“huella digital” que puede ser única para una proteína o péptido dado. Las muestras

de cada extracto soluble fueron cargadas en una placa MALDI (“matrix-assisted laser

desorption ionization”) usando 1 L de la muestra mezclada en una proporción 1:1

con una solución matriz (solución saturada de ácido -ciano-4-hidroxicinnamico en

53

0,1% ácido trifluoroacético-acetonitrilo). El procesamiento de los datos obtenidos y la

generación de la lista de “picos” se realizó mediante el programa TOFworks 1.0

(PerkinElmer Science). Los valores de la relación m/z de los picos mas intensos se

cargaron en el motor de búsqueda de la base de datos SwissProt para identificar la

secuencia de los péptidos correspondientes.

2.1.7. Actividad biológica de los hidrolizados A cada uno de los extractos solubles menores de 3 kDa se les determinó la actividad

inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina (IECA) y la capacidad

antioxidante determinada por el método ORAC. Posteriormente se seleccionó al

hidrolizado con mayor actividad biológica.

2.1.7.1. Actividad inhibidora de la enzima ECA (IECA)

Para determinar la actividad IECA, se siguió el protocolo descrito por Sentandreu y

Toldrá (2006) debido a que tiene un número de ventajas en comparación con el

método de Cushman y Cheung (1971), tales como, involucrar una reacción de una

sola etapa, que no requiere extracción con solventes orgánicos o separaciones

cromatográficas, la detección de la fluorescencia de los productos de reacción resulta

en una alta sensibilidad y precisión, y se pueden procesar un mayor número de

muestras en menor tiempo. Reactivos: a) o-aminobenzoylglycyl-p-nitro-L-

phenylalanyl-L-proline (Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) (cat. no. M-1100, de

Bachem,EE.UU.); b) Enzima convertidora de la angiotensina (ECA) de pulmón de

conejo (cat. no. A-6778, de Sigma, EE.UU.); c) cloruro de zinc; y d) cloruro de sodio.

Soluciones de trabajo: enzima ECA stock (se diluyó la enzima ECA de pulmón de

conejo en glicerol 50% en buffer 300 mM Tris pH 8,2 y 2 M ZnCl2 para hacer una

concentración aproximada de 150 g/mL, se dividió en porciones de 200 L en tubos

eppendorf, para facilitar su manipulación y conservación); buffer A (se pesaron 11,82

g de Tris-base HCl en agua destilada desionizada hasta un volumen de 500 mL,

ajustándose el pH a 8,3 con NaOH); buffer B (se diluyeron 8,22 g de NaCl en buffer A

54

hasta un volumen de 150 mL); solución base de ZnCl2 (13,6 mg en 1 mL agua);

solución 20M de ZnCl2 (diluir 20 L de la solución base en 100 mL de agua); buffer

C (diluir 50 L de la solución 20M de ZnCl2 en 10 mL de buffer A); solución sustrato

(diluir 5,4 mg de Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro en 25 mL de buffer B); solución trabajo ECA

(diluir 1 volumen de enzima stock en 24 volúmenes de buffer C); cinco diluciones de

cada muestra a analizar (1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024). Procedimiento: En la

Tabla 6 se muestra cómo se distribuyeron los distintos componentes en la placa

multipocillos. La microplaca se llevó a un fluorómetro FLUOstar OPTIMA (BMG

Labtechnologies GmbH, Offengurg, Alemania), con filtros de 350 nm excitación y 420

nm emisión. Una vez completada la medición, se tomaron los valores

correspondientes a los 30 minutos. En una hoja de Excel, se calculó el IC50 a partir

de la curva de regresión obtenida al graficar la fluorescencia de cada concentración

de la muestra.

Tabla 6 – Distribución (en L) de los diferentes componentes de la reacción en el ensayo para determinar la actividad de inhibición de la enzima ECA.

Estos se añaden primero y se incuba a 37°C por 10 minutos

Se adiciona luego de la incubación

agua Tris ZnCl2

Sol. ECA Muestra Sol. Sustrato

Control 40 0 40 0 160 Blanco 40 40 0 0 160 Blanco muestra 0 40 0 40 160

Muestra 0 0 40 40 160 2.1.7.2. Capacidad antioxidante ORACFL

Para determinar la capacidad antioxidante se seleccionó el método ORACFL, según el

procedimiento de Ou et al. (2001) modificado por Dávalos et al. (2004) quienes

demostraron la aplicabilidad de éste método en la evaluación de la actividad

antioxidante de diversas muestras de alimentos, resaltando su simplicidad y

55

sensibilidad. Reactivos: a) Trolox®, ácido 6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametmetilcroman-2-

carboxílico (Sigma–Adrich, Steinheim, Germany); b) fluoresceina (Sigma–Adrich,

Steinheim, Germany); c) AAPH, 2,2’-Azobis (2-amidinopropano) dihidrocloruro

(Sigma–Adrich, Steinheim, Germany). Procedimiento: La reacción se llevó a cabo

en 75 mM bufer fosfato pH 7,4 (PBS) y el volumen de reacción final fue de 200 L.

Se preparó un blanco usando bufer fosfato en lugar del antioxidante y se prepararon

ocho soluciones de Trolox® (0,2-1,6 nmoles, contenido final en mezcla de reacción).

Comunmente el Trolox®, un análogo de la vitamina E soluble en agua, es empleado

como estándar de calibración, debido a su capacidad de “secuestrar” radicales libres.

Las diluciones de los hidrolizados (20 L) y la fluoresceina (FL; 120L de 70 nM de

concentración final) fueron colocadas en los pozos de una microplaca negra de 96

pozos fondo plano y luego preincubadas por 10 minutos a 40°C. Luego, rápidamente

con una pipeta multicanal se dosificaron, en cada pozo, 60 L de una solución 12

mM, de concentración final, de AAPH, el cual es empleado como el generador de

radicales libres. Todas las mezclas de los estándares, blanco y control se colocaron

en la microplaca por duplicado, y las muestras por triplicado. En la Tabla 7 se

resume la distribución de los componentes de la reacción en cada pozo.

Tabla 7 – Distribución (en L) de los diferentes componentes de reacción en cada pozo del ensayo por fluorescencia de la actividad ORAC.

Estos se añadieron primero y se incubaron a 40°C por 10 minutos

Se adiciona

luego de la incubación

PBS Trolox® Sol. FL Muestra Sol. AAPH Control 80 0 120 0 0 Blanco 20 0 120 0 60

Trolox® (cada patrón) 0 20 120 0 60

Muestra 0 0 120 20 60

Inmediatamente, la microplaca se llevó a un fluorímetro FLUOstar OPTIMA (BMG

Labtechnologies GmbH, Offengurg, Alemania) con filtros de 485 nm excitación y 520

56

nm emisión. La temperatura se mantuvo controlada a 40°C y la fluorescencia se

registró durante 137 minutos (104 ciclos), con 10 segundos de agitación antes de

cada lectura por ciclo, según lo recomendado por Contreras et al. (2011). Los datos

brutos fueron exportados del equipo a una página de Excel para los cálculos

posteriores. Se calcularon las áreas bajo la curva (AUC) para cada muestra de

hidrolizado y cada estándar de Trolox®; luego se normalizaron esos valores

restándoles el AUC promedio de los blancos. Con los AUC netos de los estándares

de Trolox® se construyó una curva de calibración, a partir de la cual se obtuvo la

pendiente de la ecuación lineal de regresión; de igual forma, se construyó gráfica

para el AUC de cada muestra vs su contenido en proteínas en la mezcla de reacción.

Los valores ORACFL para cada muestra se calcularon dividiendo la pendiente de la

muestra entre la pendiente del Trolox®. Los resultados finales se expresaron como

moles de Trolox®/ mg de sólidos solubles.

2.1.8. Identificación de péptidos bioactivos por HPLC-MS-MS El hidrolizado con mayor actividad biológica fue analizado mediante espectrometría

de masas para tratar de identificar secuencias de aminoácidos que pudiesen ser

responsables de dicha actividad. Unos 300 L de la muestra se dispensaron en un

vial y se colocó en el carril del inyector automático de un equipo HPLC Agilent 1100

(Agilen Tech., EEUU) conectado en serie con un MS Esquire 3000 quadrupole-ion

trap (Bruker Daltonik, Alemania) con una column RP C18 (250x4,6 mm, 5m de

tamaño de partícula; Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

En el orden de inyección se incluyó un blanco (fase A 100%) al principio y al final del

proceso. El volumen inyectado fue de 100 L y el flujo se ajustó a 0,2 mL/min. La

composición de las fases para la elución de la columna, fue la siguiente: A (100%

agua – 0,037% TFA) y B (100% acetonitrilo – 0,027% TFA); aplicándose el gradiente

de elución descrito en la Tabla 8. Los datos registrados se analizaron mediante el

software: Esquire 5.0 build 169, Biotools 2.1 y SequenceEditor 2.1 (Bruker Daltonik,

Alemania).

57

Tabla 8 – Gradiente de elución empleado en la corrida HPLC-MS-MS. TIEMPO (minutos)

FASES A B

0 – 5 100 0 65 60 40 70 30 70 80 30 70 85 100 0 95 100 0

Los resultados obtenidos de este experimento sirvieron para decidir con cual tipo de

lactosuero se realizarían las siguientes etapas de este trabajo.

2.1.9. Producción el ingrediente funcional a nivel de Planta Piloto (Escalado) Sobre la base de los resultados del análisis factorial 23, se procedió a seleccionar el

hidrolizado funcional para ser elaborado a mayor escala a nivel de planta piloto, de

forma de contar con suficiente producto para las otras etapas de este trabajo.

2.1.9.1. Concentración por termocoagulación El procedimiento aplicado a nivel de laboratorio para la desnaturalización de las

proteínas del lactosuero con aplicación de calor, utiliza el ajuste del pH mediante

aplicación de ácidos y álcalis, lo cual representa un paso que a nivel artesanal es,

por una parte, difícil de controlar en el sentido de que sea constante en todos los

lotes a producir y, por otra, puede constituir un riesgo potencial para el personal que

lo maneja. Por esta razón, para llevar el proceso de termocoagulación a nivel de

planta piloto, se siguió el procedimiento para la “producción de matrices de queso de

suero” descrito por Madureira et al. (2009), en el cual se parte de suero “dulce” con

pH mayor a 6,3 y sin acidificación del medio una vez alcanzado el calentamiento. Se

aplicaron dos modificaciones: 1) no se añadió leche puesto que el objetivo fue

elaborar ricotta y no requesón; y 2) la recolección de la proteína se realizó una vez

precipitada, luego del enfriamiento.

58

Para obtener cantidades suficientes del hidrolizado a nivel de Planta Piloto fue

necesaria la contratación de los servicios de una empresa privada para realizar las

siguientes modificaciones a una marmita doble camisa, de 70 litros de capacidad,

existente en la planta: instalación de agitador con motor y de línea de agua a la

cámara interna de la marmita para permitir el enfriamiento del producto procesado.

Una vez completadas estas modificaciones, se procedió a establecer las condiciones

de trabajo para hidrolizar el lactosuero en la Planta Piloto, en base al esquema

descrito en la Figura 8. Cada lote de lactosuero fue previamente descremado en

descremadora eléctrica de 165 L/h marca AGRITECH (Agritech, Barquisimeto,

Venezuela).

Verter suero lácteo (descremado, Ph >6,0) en marmita

Agitar suavemente

Calentar a 4°C/min hasta 90ºC)

Mantener calentamiento (90-95ºC) durante 20 min

Enfriar hasta 40°C

Retirar 85% (en peso) del lactosuero

Mezclar resto con agitación suave

Recolectar solución de proteína coagulada en moldes de plástico

Llevar a siguiente etapa: hidrolizado

Figura 8 – Diagrama esquemático de la producción de “queso de suero” (modificado de Madureira et al., 2009).

59

2.1.9.2. Hidrolizado de la suspensión de proteínas (ricotta) A la solución de ricotta obtenida en el paso anterior se le determinó el contenido de

proteínas por Kjeldahl y sólidos totales en estufa (ambos procedimientos descritos

anteriormente). A partir del contenido de proteínas, se procedió a calcular la cantidad

de enzima necesaria para una relación enzima/sustrato de 3% del contenido de

proteína, establecido en paso anterior. Utilizando la misma marmita, se aplicó el

esquema presentado en la Figura 9 para hidrolizar la solución de ricotta.

Verter solución de ricotta en marmita

Agitar suavemente

Calentar hasta 42ºC

Añadir proteasa A. oryzae al 3%

Añadir fermento FD-DVS-TCC-20 de Chr Hansen, al 0,02%

Mezclar por 10 minutos con agitación suave

Mantener calentamiento a 42°C por 150 minutos

Calentar hasta 90°C por 10 minutos, para detener la hidrólisis

Enfriar y colocar en envase plástico, congelar a -20°C

Figura 9 – Diagrama esquemático de la hidrólisis de la solución de ricotta.

Iniciando con el calentamiento de la ricotta hasta 42°C, enseguida se incorporó la

enzima y la cepa BAL, se mantuvo durante 150 minutos el calentamiento a 42°C, se

hizo seguimiento al progreso de la hidrólisis mediante la titulación con formol, según

se describió anteriormente, cada 30 minutos, como se indica a continuación: 5 mL de

la solución de ricotta se colocaron en una cápsula de cerámica, se mezclaron con 3

gotas de fenolftaleína y se ajustó el pH a 8,5 (punto final de la titulación) con una

solución 0,1N de NaOH. Seguidamente se añadieron 4 mL de solución de formol al

35% previamente neutralizado a un pH de 8,5. Esta mezcla se incubó por un minuto

60

a temperatura ambiente y luego se tituló nuevamente, registrándose el volumen de

NaOH empleado en esta segunda titulación. El GH se determinó según la fórmula

descrita en la página 37, con el factor 1/ = 1,06 (correspondiente a una temperatura

de 42°C al pH final de la titulación 8,5).

2.1.10. Caracterización del ingrediente funcional Al ingrediente funcional elaborado en la etapa anterior se le realizaron los análisis

descritos en la sección 2.1.2 y adicionalmente se le determinó la actividad IECA a

los extractos solubles menores de 3 kDa de cada lote elaborado.

2.2. Desarrollo de yogurt natural funcional El criterio de formulación aplicado en esta segunda etapa fue la de obtener un yogurt

natural de leche de cabra como base para incorporar el hidrolizado funcional

desarrollado en la etapa anterior.

Se seleccionó la leche de cabra debido a los beneficios reportados en la revisión de

la literatura en comparación con la leche de vaca: mayor digestibilidad, menor

alergenicidad y mayor biodisponibilidad del calcio.

2.2.1. Exploración inicial para la formulación Previo a la elaboración de las fórmulas prototipo, se procedió a realizar una sesión de

grupo con un panel semi-entrenado, conformado por 10 adultos con edades entre 38

y 50 años, con el objetivo de seleccionar descriptores que permitieran comparar un

perfil descriptivo de un yogurt elaborado con leche de cabra y otro elaborado con

leche de vaca. Posteriormente, se prepararon ambos yogures y se les presentaron a

los mismos panelistas para calificarlas sobre la base de los descriptores

seleccionados (ver planilla en Anexo 8).

61

2.2.2. Escalado de producción del yogurt funcional Para obtener el yogurt se siguió el procedimiento descrito por Güler-Akin y Akin

(2007). Se fabricaron dos formulaciones del producto: fórmula A, yogurt natural sin

hidrolizado; y fórmula B, yogurt natural incorporándole hidrolizado bioactivo (Figura

10). El producto obtenido se caracterizó según procedimiento descrito en apartado

2.1.2.

Leche cruda fresca de cabra

Pasteurizar (90°C/10 minutos)

Enfriar hasta 42-45°C (a la fórmula B: agregar el hidrolizado)

Inocular cultivo BAL liofilizado DVS (0,02%)

Incubar a 42°C por 4 horas

Almacenar a 4°C hasta el momento del consumo (evaluación sensorial)

Figura 10 – Diagrama esquemático de la elaboración de yogurt incorporando el

hidrolizado de lactosuero y cepa BAL (modificado de Güler-Akin y Akin, 2007).

2.2.3. Evaluación sensorial del yogurt natural Se realizó una Prueba Triangular presentando a los panelistas el yogurt natural sin el

hidrolizado (A) y el yogurt con el hidrolizado (B) según planilla correspondiente

(Anexo 10). Se trató de determinar si la incorporación del hidrolizado era detectada

por el consumidor. El panel estuvo constituido por 12 evaluadores semi-entrenados,

62

los cuales realizaron dos ensayos cada uno en orden diferente de presentación (AB,

BA). Para un total de 24 ensayos. El análisis estadístico se realizó aplicando la tabla

“Número mínimo de juicios correctos para establecer la significancia a varios niveles

de probabilidad para la prueba de triángulo de una cola” publicada por Roessler et al.

(1978), a un nivel de significancia de 0,05.

Se realizó prueba afectiva del yogurt natural con hidrolizado para determinar la

aceptabilidad del producto, con 100 consumidores con edades comprendidas entre

19 y 45 años (miembros del núcleo de la UCV, Maracay) a los que se les presentó el

producto en vasos plásticos desechables, y se les pidió registrasen su respuesta en

una planilla en la que se les debían marcar su apreciación del producto en una

escala hedónica no-estructura de 15 cm de largo, cuyos extremos estaban marcados

como “me disgusta mucho” y “me gusta mucho”; se les indicó que el punto central (a

7,5 cm) corresponde a una respuesta “indiferente”. Las respuestas fueron tabuladas

y expresadas en centímetros (Stone y Sidel, 1993). 2.2.4. Caracterización del yogurt natural funcional El producto final obtenido se caracterizó sobre la base de los análisis descritos en la

sección 2.1.2 y adicionalmente se le determinó la actividad IECA.

2.3. Desarrollo del yogurt saborizado Una vez comprobada la aceptabilidad del yogurt natural funcional de leche de cabra,

se inició el desarrollo de un yogurt de cabra saborizado como opción para mejorar

esa aceptabilidad. Se siguieron todos las etapas de un Desarrollo Exploratorio en la

elaboración de un yogurt a partir leche de cabra (Capra hiricus), saborizado con una

mermelada de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt), con lo cual se

esperaba incrementar la capacidad antioxidante del yogurt gracias a su contenido de

polifenoles, y otros componentes bioactivo. A continuación se describen dichas

etapas:

63

2.3.1. Evaluación del Concepto Mediante una encuesta con 25 consumidores, en un intervalo de edad de 24 a 55

años, se evaluó el concepto del producto a desarrollar (ver planilla en Anexo 7).

2.3.2. Criterios de formulación y tamaño de la ración

El criterio asumido para establecer la formulación del producto se basó en los

requisitos establecidos en la norma COVENIN 2393:2001, estos son: 1) El color, olor,

sabor y consistencia deben ser característicos de un yogurt batido; 2) Por ser un

yogurt saborizado, debe contener como mínimo un 70% de yogurt en el producto

terminado; 3) Requisitos físicos y químicos, contenido mínimo de: grasa (< 3,2% p/p);

sólidos no grasos de la leche (10% p/p, de los cuales 3% deben ser de proteínas).

Acidez (mínimo 0,7 % ácido láctico); 4) Requisitos microbiológicos: mohos y

levaduras (< 1,0x102 UFC/g); coliformes totales (< 11 NMP/g); S. aureus (< 1,0 x103

UFC/g); 5) Recuentos de L. acidophilus, St. Salivarius subsp. thermophilus, L.

delbrueckii subsp. bulgaricus no menor de 106 UFC/g, durante todo el periodo de

vida útil. La determinación del tamaño de la ración se realizó sobre la base de la

observación en diversos comercios distribuidores al detal de yogurt, para registrar el

tamaño más común entre las diferentes marcas de yogurt batido, y luego seleccionar

el de mayor frecuencia.

2.3.3. Elaboración de la mermelada de fruta Puesto que no existe en el mercado local una mermelada de tomate de árbol, se

procedió a aplicar procedimiento de elaboración desarrollado sobre la base de

experiencias previas. Se adquirieron tomates de árbol de diferentes grados de

maduración en un comercio local. Cada lote se pesó antes de proceder al pelado

manual, el cual se realizó primero sumergiendo los frutos en agua hirviendo durante

2 minutos y luego en baño de agua fría, para facilitar el desprendimiento de la piel.

Los frutos ya pelados se colocaron en envase con 250 mL de agua, se llevaron a

ebullición, se añadió el peso de azúcar (calculado sobre la base de 40 partes de

64

azúcar por 60 partes de fruta), manteniendo el calentamiento hasta alcanzar una

temperatura de 100 °C, se pasó la pulpa por un Tamiz, descartándose las semillas;

se envasó en frascos previamente esterilizados, luego del tapado y enfriado, se

almacenó a 4° C.

2.3.4. Elaboración del Yogurt de cabra saborizado En el siguiente Flujograma (Figura 11) se resume el proceso de obtención del yogurt

de leche de cabra, de acuerdo a la metodología utilizada por Güler-Akin y Akin

(2007) incluyendo la incorporación de la mermelada de tomate de árbol.

Leche de cabra

Pasteurizar (90°C/10 minutos)

Enfriar hasta 42-45°C (agregar el hidrolizado)

Inocular cultivo liofilizado DVS (0,02%)

Incubar a 42°C por 4 horas

Refrigerar a 4°C por 18 horas

Mezclar con mermelada en proporción 75:25

Refrigerar a 4°C

Figura 11 – Diagrama esquemático de la elaboración de yogurt saborizado con mermelada de tomate de árbol (modificado de Güler-Akin y Akin, 2007).

65

2.3.5. Caracterización del yogurt saborizado Tanto a la leche de cabra como al yogurt se le aplicaron los siguientes análisis:

contenido de grasas (Fondonorma 1997b), proteínas (Fondonorma 1997d); sólidos

totales (Fondonorma 1997c), acidez (Fondonorma 1997e). Al yogurt saborizado se le

realizaron adicionalmente: recuento microbiológico de mohos y levaduras

(Fondonorma 1990), coliformes (Fondonorma 1996), S. aureus (Fondonorma 1989).

Recuento de bacterias ácido lácticas (B.A.L.) en medio MRS, incubado

aeróbicamente a 37ºC por 48 horas. La viscosidad se midió utilizando un

viscosímetro de Brookfield DV-I+ (Brookfield Engineering Lab, Inc., Middleboro, MA,

EEUU) con sistema “Helipath”, aguja T-D (código S94), a una velocidad de 2,0 RPM,

a 18°C. Los registros se expresaron en centipoise (cP).

2.3.6. Actividad antioxidante del yogurt saborizado Los análisis de la actividad o capacidad antioxidante, se realizaron en el Laboratorio

de Biología Molecular, de la Universidad Simón Bolívar. Todas las muestras fueron

centrifugadas a 5000 g x 10 minutos en una centrífuga refrigerada Sorvall® RC-5 (E.

I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE, USA) para obtener los

extractos acuosos. El ensayo ORACFL fue aplicado a los extractos solubles de las

siguientes muestras: a) pulpa de tomate de árbol sin procesar; b) mermelada de

tomate; c) yogurt de cabra con fermento seleccionado y d) yogurt batido saborizado

con tomate de árbol. La evaluación de la actividad ORACFL se realizó de igual forma

como se señaló anteriormente.

2.3.7. Contenido de polifenoles Adicionalmente a las muestras de pulpa de tomate de árbol y su mermelada, se les

determinó el contenido de polifenoles totales con el reactivo de Folin-Ciocalteu,

siguiendo la metodología descrita por Payet et al. (2006): se preparó serie de siete

soluciones patrón de ácido gálico (de 0,2 a 0,8 mg/mL) para construcción de curva

66

de calibración, a partir de una solución de 402,6 mg en 50 mL de agua. De igual

forma, cada tratamiento de la pulpa fue disuelta en agua para obtener una

concentración de 0,31 g/mL. Se mezclaron en tubos de ensayos, 100 L de muestra

o solución patrón, 5 mL de solución acuosa al 10% del reactivo de Folin-Ciocalteu y

3,5 mL de solución de 11,5% de carbonato de sodio; se agitaron en vortex y se

colocaron en incubación a 30°C por una hora en baño de María; luego de lo cual, se

leyó la absorbancia de cada mezcla a 765 nm. Se construyó curva de calibración a

partir de la cual se calculó el contenido total de fenoles expresados como mg GAE /

Kg muestra.

2.3.8. Evaluación sensorial En el presente trabajo se aplicaron dos tipos de pruebas sensoriales: analíticas con

panel semi-entrenado para evaluar las fórmulas prototipo a nivel de laboratorio, y

afectivas con consumidores no entrenados tomados al azar para determinar la

aceptabilidad de la formulación seleccionada. Para las primeras, se conformó un

panel de evaluadores con voluntarios pertenecientes a la comunidad de trabajadores

del núcleo Maracay de la UCV. Inicialmente se invitaron a participar a 25 personas,

bajo los siguientes criterios: edad entre 25 y 55 años, no fumadores, consumidores

de productos lácteos y con disposición de asistir a las sesiones programadas para el

panel. Previo a la recolección de datos, se realizaron sesiones de tres horas de

entrenamiento para familiarizar a los panelistas con las diferencias en atributos

sensoriales (gustos básicos, umbral) y el empleo de escalas de evaluación, de

acuerdo a los lineamientos señalados por Wittig de Penna (2001). Con los resultados

de estas dos sesiones, se seleccionaron 19 panelistas, de los cuales 4 se retiraron

por motivos personales. Para todas las sesiones del presente trabajo siempre se

contó con un mínimo de 11 panelistas del total de 15.

Con el objetivo de seleccionar una de las fórmulas prototipo, se aplicó un análisis

discriminativo mediante una comparación múltiple escalar no estructurada con el

panel semi-entrenado. A los panelistas se les solicitó ubicar en una escala hedónica,

67

no-estructurada de 15 cm, la posición relativa de cada una de las tres muestras

presentadas en un orden específico. Sólo se presentaron los extremos de la escala:

“me disgusta mucho” (extremo izquierdo) y “me gusta mucho” (extremo derecho). Las

muestras fueron codificadas con tres dígitos, asignándose tres códigos a cada una y

los órdenes de presentación fueron los siguientes: ABC, ACB, BAC, BCA, CBA, CAB.

Se aseguró que cada orden de presentación le correspondió al menos a un panelista,

para de esta forma reducir el error causado al evaluar primero la misma muestra

(Stone y Sidel, 1993).

La prueba afectiva, con consumidores para determinar la aceptabilidad de la fórmula

seleccionada se realizó con 100 personas a las que se le presentó el producto en

vasos plásticos desechables, y se les pidió registrasen su respuesta en una planilla

en la que se les debían marcar su apreciación del producto en una escala hedónica

no-estructura de 15 cm de largo, cuyos extremos estaban marcados como “me

disgusta mucho” y “me gusta mucho”; se les indicó que el punto central (a 7,5 cm)

corresponde a una respuesta “indiferente”. Las respuestas fueron tabuladas y

expresadas en centímetros (Stone y Sidel, 1993).

2.4. Vida útil del yogurt funcional Para la determinación de la vida útil se aplicó lo que Fernández-Molina y García-

Rujano (2010) denominaron “estudio de almacenamiento”. Este procedimiento

experimental se basa en almacenar el producto, bajo condiciones controladas a la

temperatura de comercialización, hasta que sus características de calidad indiquen

que su vida útil ha llegado a su fin. Durante ese periodo se midieron las variables

consideradas mas importantes, a intervalos definidos, hasta el fin del estudio. El día

“0”, se elaboraron dos lotes de yogurt de cabra: uno saborizado con mermelada de

tomate de árbol y otro “natural” adicionado con el hidrolizado de lactosuero de cabra,

se envasó en recipientes similares a los utilizados en la comercialización normal del

yogurt, se colocaron en nevera con un rango de temperatura de 4 a 6°C. En los días

1, 7, 14, 21 y 28, se tomó un envase y se le evaluaron las siguientes variables: pH,

68

acidez, evaluación sensorial, actividad antioxidante ORACFL y recuento de Bacterias

ácido lácticas (BAL) en medio MRS. Los días 1 y 28, se le determinó la actividad

IECA al yogurt natural con hidrolizado. La evaluación sensorial se realizó con panel

de 25 consumidores mediante escala no estructurada gusto/disgusto de 15 cm.

2.5. Protocolo del estudio clínico Siguiendo los lineamientos establecidos por el programa CONSORT 2010 (Schulz, et

al., 2010), se aplicó un ensayo clínico Fase II para determinar la evidencia de

“actividad” del hidrolizado proteico en la reducción de la presión arterial, mediante la

comparación de dos grupos de pacientes moderadamente hipertensos, en un ensayo

aleatorizado doble ciego controlado. Los participantes se seleccionaron a partir de

los resultados del programa “Estudio Médico Integral 2011” del Instituto de Previsión

del Profesorado de la UCV, campus Maracay, donde participaron profesores y

empleados de la institución. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: adulto,

hombre o mujer, entre 35 y 65 años; presión arterial sistólica ≥ 130 mmHg y/o

presión arterial diastólica ≥ 80 mmHg, con o sin medicación; consumidor de

productos lácteos en general; buen estado de salud general, aparte del cuadro de

hipertensión; y que no presentaron ninguno de los estados descritos en los criterios

de exclusión (en caso de estar recibiendo medicación antihipertensiva, tener menos

de un año de iniciado el tratamiento clínico contra la hipertensión; enfermedad

coronaria crónica; diabetes mellitus; enfermedad maligna; abuso de alcohol; alergia a

la leche o productos lácteos en general; preñez o en período de lactancia). A cada

paciente elegible se le explicó detalladamente, en primer lugar, en qué consistía el

estudio y cuáles eran los pasos a seguir; en segundo lugar, se le solicitó que, en

caso de aceptar participar, entregase el “consentimiento firmado”; y en tercer lugar,

se le asignó aleatoriamente a uno de los dos grupos que formaron parte del estudio:

“tratamiento” y “placebo”. Los integrantes del grupo “tratamiento” recibieron raciones

de yogurt batido en los cuales se incorporó el hidrolizado proteico con propiedades

antihipertensivas; mientras que los del grupo “placebo” recibieron el yogurt batido sin

el hidrolizado. Como bien explicó Fluegel et al. (2010) un placebo “como debe ser”

69

para una bebida láctea viscosa incluiría azúcares y/o edulcorantes artificiales,

carbohidratos y/o espesantes; todos estos componentes podrían tener un efecto

sobre la hipertensión creando un placebo “activo” lo cual confundiría los resultados

del estudio. Para asegurar grupos con una conformación semejante entre sí, se

aplicó un proceso de aleatorización estratificado, ejecutado por la Cátedra de

Bioestadística de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UCV, núcleo Maracay.

Además de la aleatorización, y para evitar que la interpretación de los resultados

fuese influenciada por expectativas previas, ni el paciente ni el médico, encargado de

la toma de la presión arterial, conocieron a qué grupo fue asignado (condición “doble

ciego” del estudio clínico).

Los participantes en el estudio recibieron semanalmente siete raciones de 150 g del

yogurt batido natural (sin saborizar), debidamente codificado. Cada porción fue

consumida durante seis semanas, en su hogar, en el momento mas conveniente

para cada participante, pero se les pidió que siempre fuese el mismo durante las 42

tomas.

La variable respuesta del estudio fue la presión arterial registrada (por triplicado) a

cada participante en tres momentos: el día anterior al inicio del consumo del yogurt,

luego al final de la tercera y sexta semanas. La toma de la presión arterial se realizó,

para todos los participantes, con el mismo equipo (Kit de Presión profesional

Lumiscope, de tamaño de brazalete de 11" - 15", libre de látex) y por la misma

Médico Internista asignada para el estudio. Esta variable es continua, y se

compararon las medias de los dos grupos para determinar si se rechazaba o no la

hipótesis nula (Ho: ambas medias eran iguales) con respecto a la hipótesis alternativa

(Ha: ambas medias eran diferentes, prueba de dos colas). Considerando que el

estudio de Del Campo (2010) realizado en el Hospital Universitario Ramón y Cajal de

la ciudad de Madrid, España, logró determinar una diferencia () de por lo menos

15,2 mmHg en la presión sistólica de los dos grupos experimentales, con una

desviación estándar () de la reducción promedio de 14,6 mmHg, se procedió a

calcular el tamaño de la muestra aplicando la fórmula:

70

2n = (4(Z + Z)2 2)/ 2

Donde Z se tomó de las tablas estadística para un =0,05 y un (1-)=90. Se obtuvo

así un n de 19 pacientes en cada grupo.

Este estudio clínico, se realizó con el financiamiento de FUNDACITE ARAGUA

(proyecto N° 3524, titulado “Valoración de las propiedades antihipertensivas de un

yogurt funcional de leche de cabra”).

2.6. Análisis estadístico Utilizando el programa Statistica 7® (Stat Soft, Tulsa, EEUU) se realizaron los

siguientes análisis:

2.6.1. Estadística descriptiva (promedio y desviación estándar) para la mayoría de los

resultados;

2.6.2. Análisis no-paramétrico de Kruskal-Wallis y prueba de medias por Chi2 (Siegel

y Castellan, 1995) para el análisis de los resultados físicos y químicos, cuyos datos

no cumplieron con los supuestos de normalidad. Prueba de t-student para comparar

concentración de proteínas por dos métodos.

2.6.3. Metodología de superficie de respuesta con diseño central compuesto 24 para

determinar las condiciones óptimas de la hidrólisis de los lactosueros, utilizando el

siguiente modelo:

Donde: Y: grado de hidrólisis (GH) : coeficientes estimados por el modelo : niveles de la variable independiente

: término del error aleatorio

71

2.6.4. Análisis de varianza con un diseño factoria 23 (Tabla 5) para la selección del

hidrolizado con mayor actividad biológica: IECA y ORACFL;

Yijkl = µ + i + j +k +()ij + ()ik + ()jk + ()ijk +ijkl

Donde: Yij: puntaje del producto en escala no estructurada µ: media global i: efecto fijo del i-ésimo nivel factor “método de concentración”. j: efecto fijo del j-ésimo nivel factor “origen del lactosuero” k: efecto fijo del j-ésimo nivel factor “tipo de hidrólisis” ijkl: término del error aleatorio

2.6.5. Prueba no-paramétrica de Friedman (95% de confianza) con una prueba de χ2

para el perfil descriptivo inicial en el desarrollo del yogurt funcional;

2.6.6. Análisis ANOVA con diseño de bloques al azar, determinando la diferencia

entre medias mediante la prueba de Tukey (Montgomery y Runger, 2004) para la

selección de la fórmula definitiva utilizando el siguiente modelo:

Yij = µ + i + j + ij

Donde: Yij: puntaje del producto en escala no estructurada µ: media global i: efecto fijo del i-ésimo nivel tratamiento formulación-tipo fermento. j: efecto fijo del j-ésimo bloque (panelista) ij: término del error aleatorio

2.6.7. Análisis estadístico utilizando la prueba T-Student para grupos independientes,

una vez recopilados todos los resultados para el estudio clínico.

72

CAPÍTULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Desarrollo del ingrediente funcional En esta primera etapa se desarrolló un ingrediente funcional: un hidrolizado de

lactosuero con actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina

(IECA). Se utilizaron como materia prima dos tipos de lactosueros, provenientes de la

elaboración de quesos fabricados a partir de leche de vaca y de cabra. Con ambos

se trabajaron todas las etapas de concentración, hidrolizado y evaluación de la

actividad IECA. Puesto que la recuperación de proteínas fue significativamente

mayor con el lactosuero caprino, se utilizó este como materia prima en la producción

del ingrediente funcional a nivel de planta piloto, con el cual se obtuvieron cantidades

suficientes para completar las etapas posteriores del presente trabajo.

3.1.1. Caracterización de los lotes de leche Como se mencionó anteriormente, la composición del lactosuero varía de acuerdo al

procedimiento aplicado durante la elaboración de los distintos tipos de quesos y al

tipo de leche empleada como materia prima, cuya composición depende, entre otros

factores, de la especie de la cual provenga: vacuna, bufalina, ovina y caprina

(Monsalve y González, 2005; Quiles et al., 1994). En esta sección se trató lo

referente a la comparación de la materia prima disponible, sobre la base de la raza

de origen de la leche: bovina o caprina. En las Tablas 9 y 10 se resumen los

resultados de los análisis físicos y químicos aplicados a ambas, respectivamente. A

pesar de que se ha reportado que la leche de cabra es comparable con la de vaca

(Storry et al., 1983), los resultados aquí obtenidos muestran que los contenidos de

proteína, grasa, sólidos totales y sólidos no grasos de la leche de cabra son

ligeramente superiores a los de la leche del rebaño de vaca Holstein. Esto se debe

73

principalmente a que la leche de esta raza bovina, a pesar de ser la mayor

productora a nivel mundial, se caracteriza por ser la de menor contenido de sólidos

entre las razas lecheras bovinas (Walstra y Jenness, 1987).

Tabla 9 – Análisis físicos y químicos de la leche de vaca utilizada en la

elaboración de tres lotes de queso blanco pasteurizado y su rendimiento quesero.

LOTE 9/02/10 LOTE 3/03/10 LOTE 3/06/10 Proteínas (%) 2,93 ± 0,01 2,92 ± 0,06 3,22 ± 0,04 Grasa (%) 3,28 ± 0,01ab 3,00 ± 0,10b 3,60± 0,10a Cenizas (%) 0,74 ± 0,01 0,70 ± 0,02 0,71± 0,03 Lactosa (%) 4,19 ± 0,01 4,81 ± 0,27 4,80± 0,02 Humedad (%) 88,87 ± 0,02 88,57 ± 0,32 87,65± 0,36 Sól.totales (%) 11,13 ± 0,02b 11,40 ± 0,10ab 12,35± 0,05a Sól. No Grasos (%) 7,86 ± 0,01b 8,43 ± 0,21ab 8,73± 0,06a Densidad (g/mL, a 20°C)

1,02732 ± 0,00002b

1,03063 ± 0,00055a

1,02943± 0,00074ab

Peso de leche (Kg) 137 103 103 Volumen de leche (L) 133 100 100 Peso de Queso (Kg) 12 9,5 9,8 Rendimiento (Kg de queso/ 100 Kg de leche)

8,8 9,2 9,5

Lactosuero (Kg) 125 (91,2 %) 93,5 (90,8%) 93,8 (91,1) a,b: superíndices diferentes indican grupos significativamente diferentes (p<0,05) ver Anexo 1a.

El bajo contenido de proteínas en los tres lotes de leche de vaca, aunque cercano al

valor mínimo de 3,02% reportado por Wendorff y Paulus (2011), estuvo en el límite

inferior del rango de 2,85-3,84 reportado para ese mismo rebaño por Alvarado (2001)

y no se observaron diferencias significativas (p>0,05) entre los lotes para este

renglón.

La disminución en la ración de alimento concentrado, debido a recortes

presupuestarios en la E.E. Santa María, pudo haber sido la causa del bajo contenido

de proteínas.

74

De acuerdo a lo señalado por Alvarado (2001), se observa el efecto de la época del

año sobre la composición de la leche: el tercer lote (3/06/10), tomado en época de

lluvias, resultó con contenidos de grasa, sólidos totales y SNG significativamente

mayores (p=0,0265; 0,0273 y 0,0257 respectivamente) que los de la época seca. Sin

embargo, el valor de los tres lotes está por debajo del valor de 3,70% reportado por

Wendorff y Paulus (2011), incluso el segundo lote de leche de vaca (3/03/2010) no

cumplió con el mínimo de 3,2% establecido por la norma COVENIN 903. La mayor

densidad de ese lote del 3/03 (p=0,0429) concuerda con su bajo nivel en grasa.

Tabla 10 – Análisis físicos y químicos de la leche de cabra utilizada en la

elaboración de tres lotes de queso pasteurizado y su rendimiento quesero.

LOTE 15/4/10 LOTE 20/4/10 LOTE 3/6/10 Proteínas (%) 3,34 ± 0,02b 3,67 ± 0,01a 3,48 ± 0,04ab Grasa (%) 3,93 ± 0,01b 4,49 ± 0,02a 4,18 ± 0,07ab Cenizas (%) 0,74 ± 0,01 0,79 ± 0,01 0,75 ± 0,05 Lactosa (%) 4,33 ± 0,03 4,40 ± 0,03 4,52 ± 0,04 Humedad (%) 87,66 ± 0,04 86,65 ± 0,01 87,06 ± 0,12 Sól. Totales (%) 12,34 ± 0,05b 13,35 ± 0,01a 12,94 ± 0,12ab Sól. No Grasos (%) 8,41 ± 0,04b 8,86 ± 0,02a 8,76 ± 0,05ab Densidad (g/mL, a 20°C)

1,02480 ± 0,00012a

1,02623 ± 0,00005a

1,0300± 0,0023a

Peso de leche (Kg) 119,5 195,0 100 Volumen de leche (L) 116,6 190,0 97,1 Peso de Queso (Kg) 18,5 30,4 16,1 Rendimiento (Kg de queso/ 100 Kg de leche)

15,5 15,6 16,1

Lactosuero (Kg) 99,0 (82,8%) 164,6 (84,4) 83,9 (83,9%) a,b: superíndices diferentes indican grupos significativamente diferentes (p<0,05) ver Anexo 1b.

En el caso de la leche de cabra, el contenido de proteínas de los tres lotes estuvo

en el límite inferior del rango de 3,23 – 4,55% reportado para el mismo rebaño por

Salvador et al. (2006). Esto pudo deberse en parte a las dificultades económicas

que ha presentado el manejo de este rebaño desde finales del año 2009, que ha

75

llevado a una disminución significativa en la ración de heno y alimento concentrado

en las dietas de los animales.

El contenido de grasa estuvo dentro del rango reportado por Salvador et al. (2006) y

no se observó efecto de la época del año, puesto que este rebaño está estabulado y

no recibe pasto fresco en ninguna época del año. Las diferencias entre los dos lotes

del mes de abril, pudieron deberse a cambios puntuales en la alimentación.

Para la leche de cabra no existe en el país una normativa oficial sobre su

composición, pero al comparar el contenido de sólidos totales con lo reportado por

Guo et al. (2004) se observó que la media de todos los lotes de leche de cabra de

12,88 ± 0,51% fue ligeramente superior a la reportada por esos autores de 12,38 ±

0,71%. También resultó superior al promedio de 11,62 ± 0,64% obtenido para los

lotes de leche de vaca de la Tabla 10.

El rendimiento quesero de los dos tipos de leche estuvo dentro de lo esperado de

acuerdo a los resultados químicos ya mencionados, principalmente el contenido de

Sólidos Totales (ST). Según Guo et al. (2004) el contenido de ST es la principal

variable, entre los componentes de la leche, empleada para predecir el rendimiento

quesero de la leche. En el caso de la leche de vaca, por pertenecer a un rebaño de

raza Holstein, caracterizado como de mayor producción lechera pero de menor

contenido de sólidos totales, siempre se obtienen bajos rendimientos en comparación

con otras razas bovinas (Hurtaud et al., 2009; Walstra y Jenness, 1987; Walstra et

al., 2001). Las razas Jersey, Guernsey y Pardo Suiza son conocidas por una menor

producción de leche en comparación con Holstein, sin embargo, su mayor contenido

de sólidos totales, proteínas y grasa, permite obtener un mayor rendimiento en la

producción de quesos (Wendorff y Paulus, 2011). Según Formaggioni et al. (2008) el

rendimiento quesero va desde un mínimo de 9,67 Kg de queso/100 Kg de leche con

2,38% de caseína (Holstein) hasta un máximo de 11,33 Kg de queso/100 Kg de

leche con 2,86% de caseína (Jersey). El rendimiento de 8,8 a 9,5 Kg de queso/100

Kg leche, obtenido en los tres lotes de leche de vaca Holstein, está por debajo de

76

éste mínimo y se corresponde con un nivel de sólidos totales menor al 12% (Tabla

9). Con respecto a la leche de cabra, se obtuvo un rendimiento entre 15,5 y 16,1 Kg

de queso/100 Kg leche, el cual se corresponde con el rango reportado por Guo et al.

(2004) para leche de cabra entre 15,3 y 19,1 Kg de queso/100 Kg de leche. Este

mayor rendimiento de la leche de cabra con respecto al de vaca, se refleja también

en una menor cantidad de lactosuero recolectado: el de la leche de vaca representó

el 91% del peso de la leche inicial (Tabla 9), mientras que el de la leche de cabra fue

el 83% (Tabla 10).

3.1.2. Caracterización de los lotes de lactosuero Como ya se mencionó, la otra variable que afecta la composición del lactosuero es el

procedimiento aplicado en la elaboración de los quesos. En esta etapa se evaluó

dicho efecto. En las tablas 11 y 12 se resumen los resultados de los análisis físicos y

químicos aplicados a los lotes de lactosuero de vaca y cabra, expresados en base

húmeda y base seca, respectivamente. Considerando el contenido de ácido láctico

en base seca y comparando ese valor con el de la Tabla 1 página 9, se tiene que

ambos lactosueros son del tipo “dulce” (Yang y Silva, 1995). Esto era de esperar,

puesto que se obtuvieron de una coagulación enzimática de las caseínas.

Según Hernández et al. (1992) hasta un 20% del contenido de proteína total de la

leche corresponde a las proteínas solubles del suero, por tanto, los lactosueros de

vaca y cabra de este trabajo debieron tener un contenido de proteínas máximo de

0,60% y 0,70%, respectivamente, equivalentes al 20% de la proteína total de la leche

empleada como materia prima. Pero los contenidos promedio aquí obtenidos para

ambos lactosueros fueron 1,33 y 1,36 %, respectivamente. El exceso de proteína en

el lactosuero se consideran así pérdidas en caseínas, ya que esa porción debería

estar formando parte del queso. En el presente trabajo, estas pérdidas fueron de

27% y 14%, para vaca y cabra, respectivamente. En el caso de las grasas, también

se observaron pérdidas, en el orden de 9% y 24%, respectivamente; ya que esa

cantidad debería estar formando parte del queso. Estas pérdidas se pueden atribuir a

77

deficiencias en los procesos de fabricación, tales como, exceso de agitación y

deficiente desuerado, según lo reportado por Barroso (2008) como la causa principal

de pérdidas en caseína y grasa en el lactosuero obtenido en la Planta Piloto de la

FCV UCV, Maracay. La autora señaló pérdidas de caseína en el orden de 2,67 ±

2,32 % y 3,06 ± 2,45 %, y de grasa de 10,42 ± 1,30 % y 12,06 ± 4,18 % en los

procesos de queso palmita y de cabra, respectivamente. En ambos casos, los

valores están por debajo de los encontrado en el presente trabajo, por lo que cabe

deducir que las condiciones de fabricación de estos quesos no han mejorado.

Tabla 11 – Análisis físico y químico de los lactosueros obtenidos de la Planta Piloto de la FCV-UCV (expresados en base húmeda).

BOVINO CAPRINO Proteínas (%) 1,33 ± 0,19 a 1,36 ± 0,11 a

Grasa (%) 0,31 ± 0,14 b 0,67 ± 0,29 a Cenizas (%) 0,60 ± 0,02 a 0,60 ± 0,02 a Lactosa (%) 4,46 ± 0,02 4,16 ± 0,21

Humedad (%) 93,41 ± 0,01 93,6 ± 0,28 Sól.totales (%) 6,98 ± 0,27 a 6,58 ± 0,28 a

Sól. No Grasos (%) 6,67 ± 0,03 a 5,92 ± 0,30 a Acidez (% ác. Láctico) 0,144 ± 0,013 a 0,146 ± 0,009a

a,b: superíndices diferentes indican grupos significativamente diferentes (p<0,05), ver Anexo 1c y d.

Sin embargo, por lo menos para el caso del lactosuero bovino, estas pérdidas

parecen ser frecuentes ya que la literatura reporta los siguientes valores para el

contenido de proteína en lactosuero: 0,83 % (Monsalve y González, 2005; Vázquez-

Puente et al., 2010); 0,94% (Jakymec et al., 2001); 1,20% (Quintero et al., 2001); y

1,34% (Uribarrí et al., 2004). Siendo estos dos últimos similares a los aquí obtenidos.

Ambos tipos de lactosuero difirieron entre ellos, en el contenido de grasa, lo cual es

consistente con el mayor contenido original de grasa en la leche de cabra comparada

con la de vaca. Ambos lactosueros requirieron ser sometidos a un descremado para

78

evitar la interferencia de la grasa en los procesos de concentración y análisis que se

aplicaron posteriormente.

Tabla 12 – Análisis físico y químico de los lactosueros obtenidos de la Planta Piloto de la FCV-UCV (expresados en base seca).

Bovino Caprino Proteínas (%) 19,56 20,67 Grasa (%) 3,92 10,18 Cenizas (%) 8,77 9,16 Lactosa (%) 67,70 60 Humedad (%) - - Sól.totales (%) 100 100 Sól. No Grasos (%) 96,08 89,87 Acidez (% ác. Láctico) 2,10 2,62

3.1.3. Caracterización de los lotes de suero descremado En las tablas 13 y 14 se resumen los resultados de los análisis físicos y químicos

aplicados a los lotes de lactosuero descremado de vaca y cabra, expresados en

base húmeda y base seca, respectivamente. Los contenidos de grasa de todos los

lotes quedaron por debajo del rango de detección del método de Babcock, por lo que

se reportaron como menos de 0,05%. De esta forma, el proceso de descremado

llevó los valores de composición a los rangos señalados por Yang y Silva (1995) para

los lactosueros “dulce” en base seca: proteínas entre 12,8 y 15,2%, lactosa 74 y

81%, cenizas 8%.

Como se puede observar, la reducción en el contenido de proteínas estuvo en el

orden de 5 puntos porcentuales en base seca, debido a que las partículas sólidas de

caseína que pasaron al lactosuero fueron descartadas en el precipitado luego de la

centrifugación aplicada para descremar los sueros. Esto además confirma lo

79

mencionado, en el apartado anterior, sobre las pérdidas de caseína y grasa como

alterantes del perfil de los lactosueros obtenidos.

Tabla 13 – Análisis físicos y químico de lactosueros descremados (expresados en base húmeda)

Bovino Caprino Proteínas (%) 1,06 ± 0,15 a 1,03 ± 0,02 a Grasa (%) < 0,05 < 0,05 Cenizas (%) 0,61 ± 0,04 a 0,63 ± 0,07 a Lactosa (%) 5,35 ± 0,06 a 5,73 ± 0,06 a Humedad (%) 92,96 ± 0,02 92,5 ± 0,01 Sól.totales (%) 7,03 ± 0,41 a 6,9 ± 0,10 a Sól. No Grasos (%) 7,02 ± 0,41 a 6,9 ± 0,10 a

a,b: superíndices diferentes, en las filas, indican grupos significativamente diferentes (p<0,05), ver Anexo 1e y f.

Tabla 14 – Análisis físico-químico de lactosueros descremados (expresados en base seca)

Bovino Caprino Proteínas (%) 14,98 14,96 Grasa (%) < 0,05 < 0,05 Cenizas (%) 8,72 8,91 Lactosa (%) 74,16 76,04 Humedad (%) - - Sól.totales (%) 100 100 Sól. No Grasos (%) 100 100

Así que al final de este proceso se obtuvieron lactosueros de ambas especies con

una composición en proteínas, cenizas, lactosa y sólidos totales, similar a la

conseguida por Muñi et al. (2005) en el lactosuero dulce prefiltrado y centrifugado

antes de la aplicación de un proceso de concentración por ultrafiltración: proteína

0,83%, lactosa 4,95%, cenizas 0,52% y sólidos totales 6,31%.

80

La similitud de ambos sueros también ha sido reportado por Casper et al. (1998)

quienes señalaron que los resultados de la composición del lactosuero de cabra,

obtenido de la manufactura de un queso tipo cheddar, fueron comparables con los

del lactosuero bovino proveniente del proceso del mismo tipo de queso.

A pesar del mayor de contenido de proteínas de la leche de cabra, los lactosueros

resultantes de la fabricación de los dos tipos de quesos, una vez descremados,

resultaron con una composición similar, por lo cual, hasta este punto cualquiera de

los dos lactosueros puede ser empleado para la formulación del ingrediente

funcional.

3.1.4. Perfil electroforético de los lactosueros de cabra y vaca Continuando con la caracterización de los dos tipos de lactosueros como fuente de

proteínas para la hidrólisis, se procedió a determinar el perfil de las proteínas

presentes en ellos utilizando la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida

(SDS-PAGE), bajo condiciones reductoras. Según Fong et al. (2008) la fracción de

proteínas del lactosuero, como cualquier matriz compleja, está dominada por un

pequeño número de las llamadas “proteínas principales” (-Lactoglobulina y -

lactalbúmina, principalmente, junto con la lactoferrina, seroalbúmina e

inmunoglobulinas), las cuales constituyen el 80% de las proteínas del suero. Estas

fueron las proteínas que se buscaron identificar en el perfil electroforético. Basch et

al. (1985) describieron el patrón de proteínas observado en el sistema SDS-PAGE,

para el lactosuero dializado, como conformado por tres bandas claras en la parte

superior del gel y dos bandas intensamente coloreadas en la parte inferior, las

primeras se corresponden con la lactoferrina ( 86 kDa), sero albúmina (67 kDa) e

inmunoglobulina de cadena pesada (~55 kDa), y las segundas con la -lactoglobulina

(18,4 kDa) y la -lactalbúmina (14,3 kDa). La proporción relativa de las proteínas

individuales del lactosuero caprino en comparación con el bovino, es que el primero

tiene menos sero-albúmina, inmunoglobulina G y -LG, pero es mas elevada en -LA

(Casper et al., 1998). En la Figura 12 se muestra la distribución de las proteínas del

81

lactosuero en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Para facilitar el análisis de los geles

se identificaron cuatro zonas, desde arriba hacia abajo, comunes para ambos tipos

de lactosueros: bovino (columnas 2, 3, 5, 6) y caprino (columnas 4,7).

Se observa la similitud en el perfil de proteínas de ambos tipos de lactosueros. En la

primera zona, se identificaron tres bandas: superior con un peso molecular promedio

76,5 ± 8,0 kDa (vaca) y 85,4 ± 4,6 kDa (cabra) correspondiente a la lactoferrina, cuyo

valor reportado oscila alrededor de los 80 kDa (Conesa et al., 2008); la media, con

pesos de 62,5 ± 3,4 kDa (vaca) y 65,4 ± 0,8 kDa (cabra), correspondiendo a

seroalbúmina de 60 kDa (Madureira et al., 2007; Ounis et al., 2008); y la inferior, de

53,5 ± 0,1 kDa (vaca) y 49,3 ± 1 kDa (cabra), identificada como inmunoglobulina G

(cadena pesada o “heavy chain”), que cuando se corre en gel bajo condiciones

reductoras aparece como una banda “pesada” de 50 kDa y otra banda “ligera” de 25

kDa (Powell y Wines, 2004). En la siguiente zona se encuentra la cadena ligera de

las inmunoglobulinas (LCI, “light chain”) con pesos de 28,7 ± 0,1 kDa (vaca) y 28,3 ±

0,3 kDa (cabra). En la tercera, una sola banda en cada columna con pesos de 22,5 ±

Figura 12 - Gel de SDS-PAGE de los lactosueros descremados. Columna 1: Marcadores de peso molecular (miosina 215k, fosforilasa B 120k, BSA 84k, ovoalbúmina 60k, anhidrasa carbónica 39,2k, inhibidor de tripsina 28k y lisozima 18,3k); Columnas 2-3-5-6: bovino (lactosuero de la 5 fue diluído 1:10); Columnas 4-7: caprino.

1 2 3 4 5 6 7

- LA

- LG

Ig(CL)

LF SA Ig(CP)

82

0,1 kDa (vaca) y 21,0 ± 0,1 kDa (cabra), correspondiente a la -Lactoglobulina de

20,6 kDa (Vermeirssen et al., 2004). En la última, también una sola banda con pesos

de 15,5 ± 0,1 kDa (vaca) y 15,1 ± 0,1 kDa (cabra), correspondiente a la -

Lactalbúmina de 16,5 kDa (Vermeirssen et al., 2004). Esta distribución coincide con

lo reportado en otros estudios, tales como el de Lin et al. (2010) mostrado en la

Figura 1 página 12 (perfil de proteínas de lactosuero bovino) y el de Casper et al.

(1998) en la Figura 2 página 13 (perfil de proteínas de lactosuero caprino).

En la Tabla 15 los resultados de los cálculos de peso molecular realizados de

acuerdo a la migración de las bandas en el gel. Casper et al. (1998) señalaron que el

lactosuero caprino mostró una proporción relativa de SA, IgG y LG menor que la

del bovino, pero mayor en el caso de la LA.

Tabla 15 – Peso molecular promedio (kDa) y la proporción relativa (%),

estimado a partir de las bandas obtenidas en el gel SDS-PAGE, con el programa digital ImageJ 1.42q (NIH, EE.UU.).

banda vaca Proporción relativa (%) Cabra Proporción

relativa (%) Identificación 1 76,5 ± 8,0 2 85,4 ± 4,6 3 Lactoferrina 2 62,5 ± 3,4 7 65,4 ± 0,8 4 Sero-Albúmina 3 53,5 ± 0,1 3 49,3 ± 1,1 8 Ig(Cadena pesada) 4 28,7 ± 0,1 11 28,3 ± 0,3 12 Ig (Cadena ligera)

5 22,5 ± 0,1 54 21,0 ± 0,1 49 -LG

6 15,5 ± 0,1 23 15,1 ± 0,1 23 -LA

En el presente trabajo, la proporción relativa de SA y LG coincidió con los

resultados de esos autores, no así la IgG que en este caso resultó mayor la caprina,

mientras que la LA resultó igual en ambos lactosueros. Todos los pesos

moleculares calculados en el presente trabajo son bastante cercanos a los

reportados en la literatura (Tabla 16), las diferencias pudieron deberse a errores en la

medición del desplazamiento, al definir el punto de medida en cada banda de

proteínas.

83

Tabla 16 – Pesos moleculares promedio (kDa) de las proteínas del lactosuero, reportados por otros autores.

banda vaca Cabra referencia Lactoferrina 80

78,06

77,36

(Madureira et al., 2007; Ounis et al., 2008) ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/)

Sero-Albúmina 66,0 68,71 69,29

66,31

(Sabeena et al., 2010) (Vermeirssen et al., 2004)

ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/)

Ig(Cadena pesada) 50-70 (Madureira et al., 2007; Ounis et al., 2008)

Ig (Cadena ligera) 22-27 (Madureira et al., 2007; Ounis et al., 2008)

-LG 18,00 18,30 20,63 19,88

- 18,30

19,98

(Sabeena et al., 2010; Singh, 2011) (Hernández-Ledesma et al., 2011)

(Vermeirssen et al., 2004) ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/)

-LA 14,0

16,53 16,25

~14

16,26

(Sabeena et al., 2010; Hernández-Ledesma et al., 2011)

(Vermeirssen et al., 2004) ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/)

La similitud de los patrones confirma que ambos lactosueros constituyen una fuente

similar de proteínas para la hidrólisis.

3.1.5. Concentración del lactosuero Para mejorar la eficiencia de los procesos aplicados a los lactosueros obtenidos, se

hizo necesario reducir el elevado contenido de agua característico de este producto.

A nivel industrial se aplican procesos de membrana para lograr este objetivo y

aumentar así el contenido de proteína; sin embargo, a nivel de la pequeña y mediana

industria la aplicación de ese proceso tecnológico representa una elevada inversión.

Por esta razón, en el presente trabajo se evaluó la alternativa del mecanismo de

termocoagulación como procedimiento para precipitar las proteínas séricas y de esta

forma aumentar su concentración al eliminar gran parte del agua del lactosuero.

3.1.5.1. Ultrafiltración (UF)





84

A las muestras de suero descremadas se les sometió a un ciclo de ultrafiltración,

separándolas en dos porciones: retenido y permeado (Figura 13). A simple vista, se

observan las características del lactosuero permeado como líquido de color amarillo-

verdoso con mayor contenido de lactosa y minerales, mientras que el lactosuero

retenido obtiene apariencia lechosa por la concentración de las proteínas.

En la Tabla 17 se resumen los resultados promedio obtenidos para las fracciones

(retenido y permeado) en un solo ciclo de ultrafiltración de los lotes de suero

descremado de las dos especies: el contenido de proteína se incrementó un 18 y

79% en los lactosueros bovinos y caprinos, respectivamente, es decir, con factores

de concentración de 1,18 y 1,79; pero el retenido contiene todavía un considerable

porcentaje de lactosa y minerales, ya que la relación proteína/sólidos totales osciló

entre 22 y 25%. La concentración de proteínas de ambos lactosueros resultó similar

(p>0,05) de acuerdo a una prueba t-student aplicada a ambos grupos de datos; pero

la recuperación de las proteínas en el retenido resultó significativamente mayor

(p>0,05) con el lactosuero caprino.

Giardina (1995) logró una mayor concentración con el mismo equipo aplicando

tres ciclos de ultrafiltración y diafiltración, alcanzando un valor cercano al 23% de

proteínas, que representó una relación de proteína/sólidos totales entre 35 y 38%.

Figura 13 - Muestras recolectadas del retenido y permeado del lactosuero de vaca después de aplicar proceso de ultrafiltración.

85

Tabla 17 – Contenido promedio de proteínas y sólidos totales del retenido y permeado resultantes de la ultrafiltración de las muestras de lactosuero descremado.

Retenido Permeado Recuperación de proteínas en el

retenido (%)

Proteína (%)

Sólidos totales (%)

Proteína (%)


Vaca 2,60 ± 0,12 a 11,72±0,15 a 0 2,80±0,26b 93,2 ± 0,5 b

Cabra 2,87 ± 0,19 a 11,48±0,33 a 0 3,63±0,16a 98,8 ± 0,7 a

a,b: superíndices diferentes, en columnas, indican grupos significativamente diferentes (p<0,05)

McDonough et al. (1971) realizaron una concentración secuencial, primero

reduciendo un 50% el volumen original y luego un 90%, obtuvieron una

concentración de proteínas de 1,52 y 8,42%, respectivamente, las cuales

representan una relación proteínas/sólidos totales de 17,1 y 37,7%. Los valores aquí

obtenidos para esta relación de 22 y 25% de los dos retenidos caen dentro de ese

rango, y por tanto, se corresponden a una reducción mayor al 50% del volumen

original.

Para el objetivo del presente trabajo fue suficiente con la concentración lograda, ya

que los factores de concentración concuerdan con el 1,4 recomendado por Sola

(2007) en la elaboración de productos lácteos. La proteína concentrada de esta

forma se caracteriza por no estar desnaturalizada, manteniendo muchas de sus

propiedades funcionales intactas. Sin embargo, es necesario comprobar su

susceptibilidad a la hidrólisis tanto por concentrados enzimáticos como por las

enzimas con las que cuentan las bacterias ácido-lácticas.

3.1.5.2. Termocoagulación (TC) En el país la aplicación de los procesos de membrana en la industria láctea, y en la

industria de alimentos en general, ha tenido muy poca o limitada aceptación (Faría et

86

al., 2003). Por esta razón, en el presente trabajo se evaluó otra opción para

concentrar las proteínas, tomando una segunda porción de ambos lactosueros para

procesarla por termocoagulación. En una primera instancia se siguió el

procedimiento recomendado por Ramírez y Rivas (2003) de bajar el pH hasta 4,5

antes de inciar el calentamiento, pero se observó poca floculación de la proteína,

lográndose una recuperación de apenas 11,4%. Se decidió entonces modificar esta

etapa ajustando el pH a 6,4 mínimo con una solución de hidróxido de sodio 2,5M y

luego iniciar el calentamiento con agitación moderada hasta 90° C, en ese momento

se añadió ácido acético hasta un pH final de 4,6 y se mantuvo calentamiento por 30

minutos. De esta forma si se obtuvo una mayor floculación de las proteínas,

recuperándose 38,8% de la proteína bovina y 54,4% de la caprina (Tabla 18).

Tabla 18 – Contenido promedio de proteínas (base húmeda y base seca) y sólidos totales (base húmeda) de la solución de “ricotta”, obtenida por termocoagulación de las muestras del lactosuero descremado.

Proteína (%)


Recuperación de proteínas (%)

Vaca 6,47 ± 0,58a (70,40% bs)

9,19 ± 0,69 a 38,8 ± 4,5 b

Cabra 7,43 ± 0,19 a (78,13% bs)

9,51 ± 0,20 a 54,4 ± 6,7 a

a,b: superíndices diferentes, en columnas, indican grupos significativamente diferentes (p<0,05)

Esto confirma lo señalado por Vázquez-Puente et al. (2010) quienes concluyeron que

para obtener un máximo rendimiento en “quesos de suero” (requesón y ricotta) se

debe calentar el lactosuero a una temperatura de 93°C, bajar el pH y mantener el

calentamiento de 30 a 40 minutos. La recuperación de proteínas fue

significativamente mayor con el lactosuero caprino (p<0,05).

Al comparar el contenido de proteínas en base seca, 70,40% y 78,13% para las

soluciones de ricotta bovina y caprina, respectivamente, con el contenido en base

seca de 42,86% calculado a partir de la información publicada por Lucey (2011) para

87

la ricotta baja en grasa con 72% de humedad y 12% de proteínas, se tiene que

ambos valores son mayores a 1,6 veces el contenido de proteínas normal de los

“quesos de suero”.

Sin embargo, la recuperación de proteínas en ambos casos está por debajo del

logrado por la ultrafiltración, y esto se debe a que la desnaturalización de todas las

proteínas del lactosuero no es completa, sino que unas son mas sensibles que otras

al efecto del calor, y por tanto, el contenido final de proteínas final variará de acuerdo

a las variables del proceso aplicado para la coagulación: concentración, pH,

temperatura, tiempo y acidez (Nicolai et al., 2011). Según Webb y Whittier (1948)

mediante este procedimiento de termocoagulación se debe recuperar, como proteína

desnaturalizada, solo entre 50 y 60 % de la proteína originalmente presente en el

lactosuero empleado como materia prima, ya que este porcentaje corresponde a la

proteína coagulable del lactosuero derivado de la elaboración de quesos o de

caseínas.

Como se puede observar, en el caso del lactosuero caprino se logró llegar a ese

nivel de recuperación. En el caso del lactosuero bovino es posible que el bajo

rendimiento se deba a la raza de donde se originó la leche con la cual se elaboró el

queso, como se mencionó anteriormente de bajo rendimiento quesero, aunado a los

problemas de manejo del rebaño. La proteína obtenida de esta forma, está

desnaturalizada y en los pasos posteriores se evaluó el efecto de esta condición

sobre la hidrólisis enzimática.

En resumen, la recuperación de proteínas en ambos métodos fue mayor con el

lactosuero caprino, lo cual representa una ventaja para la elaboración del ingrediente

funcional a partir de este tipo de materia prima.

3.1.6. Hidrólisis del lactosuero

88

Antes de aplicar la hidrólisis con el complejo proteasa/peptidasa de Aspergillus

oryzae a los concentrados de lactosueros bovino y caprino, fue necesario determinar

las condiciones óptimas para obtener un grado de hidrólisis moderado entre 10 y

20%, para lo cual se aplicó un análisis de superficie de respuesta.

3.1.6.1. Condiciones óptimas para hidrólisis enzimática La metodología de superficie de respuesta (MSR) ha sido exitosamente aplicada

para optimizar las condiciones de hidrólisis que resulten en la máxima actividad

biológica de los péptidos generados en diferentes hidrólisis enzimáticas (Contreras et

al., 2011;Guo et al., 2009). Esta máxima actividad generalmente se consigue en un

rango de hidrólisis (GH) entre 10 y 20% (Li-jun et al., 2008). Para conseguir una

hidrólisis en este rango con el complejo proteasa/peptidasa de Aspergillus oryzae se

combinaron los niveles descritos en la Tabla 4 (página 51) para los cuatro factores:

pH, Temperatura, relación Enzima/Sustrato y tiempo, para un total de 93 ensayos,

los cuales fueron ejecutados en el orden aleatorio provisto por el programa Statistica

7. La tabla del análisis ANOVA se muestra en el Anexo 2; para la variable

dependiente GH. Se obtuvo un R2= 0,83 con un error por falta de ajuste no

significativo (P>0,01); van der Ven et al. (2002) en un estudio similar obtuvieron un

R2= 0,822 el cual consideraron indicativo de que el modelo estuvo bien adaptado a

los resultados obtenidos, a pesar de haber presentado una falta de ajuste

significativa.

Sobre la base de este análisis, dentro de los rangos evaluados, resultaron

significativas las interacciones lineales: 1) temperatura*relación-enzima/sustrato: a

mayor E/S y mayor temperatura, se obtendrá un mayor GH , 2) pH*tiempo: en el

rango de pH de 6-7, al incrementar el tiempo se obtiene un mayor GH; y 3)

pH*temperatura: en un rango de pH de 5 a 8, al incremento de temperatura en el

rango de 25 a 60°C, produce un mayor GH. Y también los cuatro factores

individuales lineales resultaron significativos: Temperatura, tiempo, pH y relación

enzima/sustrato. Estos se analizan a continuación en el perfil dinámico con la función

de deseabilidad. Los datos generados por este análisis permitieron obtener el perfil

89

dinámico descrito en la Figura 14. Los valores óptimos en el eje de las x son los que

están en rojo y el valor óptimo de la respuesta es 12,372 % de grado de hidrólisis

(GH) en un rango de 0,85 a 24,32. Este resultado concuerda con los de van der Ven

et al. (2002) quienes obtuvieron un GH promedio de 12% en un rango de 0 a 35% en

un diseño central compuesto para determinar el GH de la hidrólisis de un

concentrado de lactosuero con la enzima Corolasa PP. La función de deseabilidad

obtenida fue de 0,982, cuyo valor es considerado como muy bueno cuando se acerca

a 1 (Montgomery y Runger, 2004). Se observa que la respuesta óptima esta en el

rango que indica la función de deseabilidad.

El perfil de tiempo indica que se requirió un mínimo de 150 minutos de hidrólisis para

estar en el rango deseado de hidrólisis. En el perfil E/S, se observa que el

incrementar la relación enzima/sustrato de 1% hasta 5%, solo produce un ligero

aumento en GH.

Ahora bien, si se observan los perfiles de pH y temperatura (T), se tiene que el GH

aumenta moderadamente tanto al disminuir el pH de 7 a 5, como al incrementar T de

34° hasta 50°. Esto resulta importante para la consideración posterior del escalado

en planta piloto del proceso de hidrólisis, donde la operación del ajuste de pH

representa un paso adicional que incrementa el costo de operación, sobre todo

considerando que al acompañar la acción enzimática con el crecimiento de una cepa

ácido-láctica en el lactosuero, se reduce el pH del medio de 7 a 5, debido a la

fermentación de la lactosa.

Por otra parte, ya que en el proceso de hidrólisis en planta se empleó la combinación

de la proteasa con una cepa ácido-láctica cuya temperatura óptima de crecimiento

fue de 42°C, se planteó utilizar esta temperatura en lugar de los 34°C señalados por

el modelo estadístico.

90

Figura 14 – Perfil de valores predichos y deseabilidad de los valores óptimos para las cuatro variables incluidas en el modelo de superficie de respuesta para la hidrólisis enzimática de lactosuero caprino con proteasa de Aspergillus oryzae.

Se tiene entonces que según la metodología de superficie de respuesta, las

condiciones ideales para obtener un grado de hidrólisis intermedio (12,585%) se

logran a pH 7, temperatura de 34°C, relación E/S 3% y tiempo de hidrólisis de 150

minutos. Sin embargo, como se señaló anteriormente, para la siguiente etapa la

temperatura se ajustó a 42°C y el pH se dejó oscilar de 7 a 5 durante los 150 minutos

de incubación.

3.1.6.2. Hidrólisis de los lactosueros concentrados Las condiciones iniciales de hidrólisis seleccionadas para aplicar el complejo

proteasa/peptidasa al lactosuero concentrado, fueron por tanto: pH 7, temperatura

42°C, relación Enzima/Sustrato 3% y tiempo de incubación 150 minutos. Al

implementar estas condiciones de hidrólisis en las cuatro combinaciones propuestas

en el presente trabajo (UF-enzima, UF-enzima+BAL, TC-enzima, TC-enzima+BAL)

Profiles for Predicted Values and DesirabilityReplicat

-5,000

12,372

30,000

pH T E/S t Desirability

0,

1,

0,

,850

0012

,585

24,3

20

DH

1, 3,

,98186

5, 7, 9, 26,34,

58, 1, 3, 5, 30, 150,

Desi

rabi

lity

91

1,00

3,00

5,00

7,00

9,00

11,00

30 60 90 120 150

Gra

do

de

hid

rólis

is (

%)

Tiempo de incubación (minutos)

se obtuvieron cuatro hidrolizados de cada tipo de lactosuero, para un total de ocho

tratamientos. En la Tabla 19 se resumen los cálculos de la masa de proteínas (Mp)

de las muestras manejadas en cada uno de los tratamientos en los que se aplicó

una hidrólisis solo por la acción de la proteasa, para determinar así la cantidad de

enzima necesaria en cada caso asegurando una relación enzima-sustrato del 3%.

Tabla 19 – Grado de hidrólisis (GH) final alcanzado luego de 150 minutos de

incubación a 42°C, de acuerdo a las características de cada tratamiento (concentración-especie) utilizando proteasa de Aspergillus oryzae.

Vaca Cabra

Ultrafiltración tratamiento 8 tratamiento 7 Peso (g) 90,7 57,3

Conc. Proteínas (%) 2,58 2,6 Mp (g proteína/ muestra) 2,3 1,5

3% enzima (L) 70 45 GH (%) 7,37 ± 0,22 10,8 ± 1,97

Termocoagulación tratamiento 5 tratamiento 6 Peso (g) 90,7 95,7


3% enzima (L) 198 221 GH (%) 10,2 ± 1,73 9,61 ± 1,63

En los cuatro tratamientos se obtuvo un grado de hidrólisis moderado entre 7,37 y

10,8%, similar al rango de 7,5 a 12% obtenido por Kim et al. (2007) para 150 minutos

Figura 15- Efecto del tiempo de incubación sobre el grado de hidrólisis del lactosuero de cabra termocoagulado (tratamiento 6), hidrolizado por proteasa de A. oryzae.

92

de hidrólisis con flavourzyme®. En la Figura 15 se muestra una curva ejemplo de la

evolución del GH, determinado por el procedimiento de titulación con formol, durante

la incubación a 42°C. Se observan que hasta los 150 minutos un incremento

moderado en el grado de hidrólisis, sin embargo, según Kim et al. (2007) este

incremento se desacelera luego de ese tiempo para mantenerse mas o menos

alrededor de un valor máximo, que en este caso pareciera estar alrededor del 11%.

Según lo reportado por Tsai et al. (2008) la acción combinada de una proteasa con

una cepa ácido-láctica con actividad proteolítica, permite alcanzar un mayor

contenido en péptidos bioactivos, en el mismo tiempo de incubación que un proceso

con la acción única de la proteasa. Por esta razón, se decidió incluir en este ensayo

la hidrólisis combinada de ambos mecanismos. En la Tabla 20 se resumen los

cálculos de Mp y cantidad de enzima, así como el grado de hidrólisis GH promedio

obtenido al aplicar una hidrólisis por la acción combinada de la proteasa y una cepa

ácido-láctica. Se observa un mayor GH en comparación con el proceso solo

enzimático.

Tabla 20 – Grado de hidrólisis (GH) final alcanzado de acuerdo a las características de cada tratamientos (concentración-especie) utilizando una mezcla de proteasa de A. oryzae y cepa ácido-láctica.

Vaca Cabra

Ultrafiltración tratamiento 2 tratamiento 3 Peso (g) 204,3 50,7


3% enzima (uL) 169 46 GH (%) 20,04± 3,18 13,71± 3,97

Termocoagulación tratamiento 4 tratamiento 1 Peso (g) 50,3 116,8


3% enzima (uL) 91 253 GH (%) 16,96± 3,83 19,65± 2,32

93

1,00

6,00

11,00

16,00

21,00

30 60 90 120 150

Gra

do

de

hid

rólis

is

(%)

Tiempo de incubación (minutos)

En la Figura 16 se muestra una curva ejemplo de la evolución del GH, determinado

con el método de titulación con formol, durante la incubación a 42°C. Igual a la figura

anterior, pareciera que la velocidad de la hidrólisis aumenta a medida que transcurre

el tiempo de incubación, estimándose se estabilizaría posteriormente alrededor de un

GH del 21%.

Para evaluar el grado de hidrólisis alcanzado en los diversos tratamientos aplicados,

se realizó una corrida de electroforesis PAGE-SDS, con el mismo procedimiento

aplicado anteriormente. Luego de coloreado, el gel se evaluó con el programa

ImageJ 1.42q (National Institute of Health, EE.UU.) tanto para estimar los pesos

moleculares como la intensidad relativa de las bandas. En la Figura 17 se muestra el

suero de cabra sin hidrolizar (línea 1) y a distintos tiempos de hidrólisis (60, 120 y

150 minutos, en las líneas 2,3 y 4, respectivamente). En la línea 1, se identificaron

las mismas bandas señaladas anteriormente en la Figura 12 página 82: lactoferrina

LF (71,6 kDa), seroalbúmina SA (66,5 kDa), IgG “cadena pesada” (61,7 kDa), IgG

“cadena ligera” (31,1 kDa), -lactoglobulina (21,8 kDa) y -lactalbúmina (15,5 kDa).

Es decir, al no haber acción enzimática, el perfil de proteínas se mantuvo intacto,

apareciendo todas las bandas señaladas por Basch et al. (1985).

Por el contrario, en las siguientes tres líneas, no se observan las dos primeras

bandas (lactoferrina y seroalbúmina), pero aparecen dos bandas debajo de la IgG

pesada, con PM estimados de 56,1 y 53,2 kDa, y otras dos debajo de la -LA, con

PM estimados de 14 y 13 kDa. Tanto estas nuevas bandas como las originales

Figura 16- Efecto del tiempo de incubación sobre el grado de hidrólisis del lactosuero de cabra termocoagulado, hidrolizado con la mezcla de proteasa de A. oryzae y cepa ácido-láctica

94

disminuyeron en intensidad a los 120 y 150 minutos, indicando su degradación por la

acción de la proteasa.

Figura 17 – Porción del gel PAGE-SDS (15% T; 6M úrea), correspondientes a: 1) suero de cabra sin hidrólisis, 2) suero con E/S 3,0% a los 60 minutos, 3) suero con E/S 3,0% a los 120 minutos, y 4) suero con E/S 3,0% a los 150 minutos.

Kim et al. (2007) presentaron un patrón electroforético para demostrar el avance de

la hidrólisis utilizando Flavourzyme® al 2%, a 50°C y por 30, 60, 90, 120, 150, 180 y

240 minutos. En ese patrón, las tres bandas superiores (lactoferrina, seroalbúmina e

IgG) desaparecen casi completamente a partir de los primeros 30 minutos, mientras

que la -LG y -LA disminuyeron en intensidad a medida que transcurrió el tiempo de

hidrólisis. Esto coincide con lo observado en este trabajo, a excepción de la cadena

pesada de la IgG, la cual no desaparece en los primeros 30 minutos, sino que se

reduce ligeramente en intensidad. En los gráficos de la Figura 18 se ilustra la

evolución de estas bandas durante el curso de la hidrólisis: en el caso de las

Seroalbúmina (66,5 kDa)

IgG pesada (61,7 kDa)

Lactoferrina (71,6 kDa)

IgG ligera (31,1 kDa)

-lactoglobulina (21,8 kDa)

lactalbúmina (15,5 kDa)

Polipéptido (14 kDa)

Polipéptido (13 kDa)

1 2 3 4

95

Figura 18 – Progreso de la hidrólisis de las principales proteínas del lactosuero por

la acción de la proteasa de Aspergillus oryzae bajo las condiciones seleccionadas: T= 42°C, E/S= 3% y pH= 7 (Intensidad relativa (sin unidades) vs tiempo en minutos)

10000

15000

20000

25000

0 60 120 150

Inte

nsi

dad

Tiempo de incubación (min.)

Inmunoglobulina HC 61,7 kDa

0 5000

10000 15000 20000 25000

0 60 120 150

Inte

nsi

dad


Polipéptido 56,1 kDa.

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 60 120 150

Inte

nsi

dad


Polipéptido 53,2 kDa.

0

5000

10000

15000

0 60 120 150

Inte

nsi

dad


Inmunoglobulina LC 31,1 kDa

0

10000

20000

30000

40000

0 60 120 150

Inte

nsi

dad


-LG 21,8 kDa

0

10000

20000

30000

40000

0 60 120 150

Inte

nsi

dad


-LA 15,5 kDa

0

5000

10000

15000

20000

0 60 120 150

Inte

nsi

dad


poliéptido 14 kDa.

0

5000

10000

15000

20000

0 60 120 150

Inte

nsi

dad


poliéptido 13 kDa.

A B

C D

E F

G H

96

proteínas, que provienen originalmente de la leche IgG “cadena pesada”, IgG

“cadena ligera”, -LG y -LA (Figuras 18A, 18D, 18E y 18F, respectivamente) la

intensidad relativa de la banda disminuye progresivamente al transcurrir la

hidrólisis, mientras que las bandas nuevas (Figuras 18B, 18C, 18G y 18H) muestran

un aumento importante en la intensidad a medida que transcurre la hidrólisis, hasta

llegar a un punto en el cual comienza a disminuir en señal de que a su vez pasan a

ser blanco de la hidrólisis enzimática. No se presentan las gráficas para LF y SA,

puesto que ambas bandas casi desaparecen desde los primeros 30 minutos, tal

como mostraron Kim et al. (2007).

3.1.6.3. Extracto soluble menor a 3 kDa de cada hidrolizado Según se demostró en diversos estudios, los extractos solubles que contienen

péptidos de bajo peso molecular, menor a 3 kDa, poseen una mayor actividad

biológica in vitro en comparación con la matriz completa de donde provienen (van der

Ven et al., 2002; Gómez-Ruiz et al., 2002; Hernández-Ledesma et al., 2007;

Contreras et al., 2008; Lignitto et al., 2010). A partir de los tres hidrolizados

realizados para cada tratamiento, se obtuvo un “pool” para someterlo a ultrafiltración

con membrana de 3 kDa, el permeado obtenido se liofilizó y al concentrado obtenido

se le determinó el contenido de proteínas mediante Kjeldahl (Tabla 21). Estos

resultados fueron posteriormente utilizados en los cálculos de la actividad biológica.

Tabla 21 – Contenido de proteínas (% p/p) de los extractos solubles menores de 3 kDa secados por liofilización (promedio ± desviación estándar).


Enzima 12,4 ± 1,3 7,7 ± 0,18 19,5 ± 0,54 14,3 ± 0,20 Enzima +

BAL 9,30 ± 1,15 12,90 ± 0,25 19,00 ± 1,00 7,20 ± 0,06

La discusión que se presenta a continuación, referente a las etapas donde se buscó

definir las variables del proceso, solo se basa en los resultados obtenidos con el

97

lactosuero de cabra, ya que algunos de estos análisis representaron un elevado

costo en el proyecto. En las etapas decisivas si se analizaron ambos lactosueros.

Se realizó evaluación preliminar de la presencia de péptidos en el lactosuero de

cabra mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. En la Tabla 22 se resumen,

por orden decreciente de abundancia, los valores de las masas de los péptidos

encontrados en los extractos solubles de los hidrolizados de lactosuero caprino. Se

observa, en primer lugar que efectivamente las muestras analizadas contienen

péptidos cuyas masas están por debajo de los 3 kDa. En segundo lugar, que el

tamaño de dichos péptidos disminuye a medida que transcurre la hidrólisis: a los 30

minutos los péptidos mas abundantes tienen masas que oscilan entre 3,6 y 1,5 kDa;

mientras que a partir de los 90 minutos la masa de los péptidos mas abundantes es

menor 1 kDa. A los 150 minutos se observa un reordenamiento en la abundancia o

intensidad relativa de esos péptidos menores.

En la Figura 19 se presenta el espectro de masas obtenido para cada uno de esos

tres tiempos de hidrólisis, 30, 90 y 150 minutos; en ellos se observa mas claramente

lo antes expuesto en cuanto a los cambios en la intensidad relativa de los péptidos

registrados: disminuye la intensidad de los péptidos largos y aumenta la de los

péptidos de menor tamaño. En el trabajo de Ortiz-Chao et al. (2009), utilizando un

complejo proteinasa-peptidasa N Amano, propusieron una hipótesis para explicar un

fenómeno similar. Según esta hipótesis la hidrólisis ocurre en dos etapas, la primera

correspondiente a los primeros 60 minutos, la proteinasa N Amano hidroliza la -LG

y se producen péptidos de cadena larga; en la segunda etapa, después de esos

primeros 60 minutos, la peptidasa hidroliza los péptidos largos en otros mas

pequeños. Los péptidos largos de la primera etapa pueden causar inhibición

competitiva de la segunda etapa al convertirse en un sustrato mas específico para la

proteasa N Amano que la -LG, por lo cual se reduce la velocidad de la hidrólisis. Por

tanto, después de una hora de hidrólisis, los péptidos de cadena larga son

preferencialmente hidrolizados sobre la -LG, lo cual resulta en la producción de

péptidos de cadena corta potencialmente con mayor bioactividad.

98

Figura 19 – Distribución de masas MALDI-TOF de los péptidos presentes en los extractos solubles menores de 3 kDa de lactosuero caprino hidrolizado por 30, 90 y 150 minutos con proteasa de A. oryzae.

pH 7 T 42 E/S 3% 30 min. Tabla 22 – Listado de péptidos (por peso molecular, Da) presentes en los extractos solubles menores de 3 kDa, determinadas por espectro-metría MALDI-TOF, en orden de mayor a menor “abundancia”, de los hidrolizados de lactosuero caprino tomados a tres tiempos diferentes de incubación de la hidrólisis enzimática con proteasa de A. oryzae.

T = 30 min t = 90 min t = 150 min

1717.9517 893.0328 893.1105

2104.8232 877.0569 877.1475

1505.8056 908.9984 861.1718

1618.8898 832.3036 909.0888

1880.9981 930.9570 915.1118

1755.8836 915.0104 1506.0226

1488.7705 899.0357 2105.1369

1782.9319 1104.0258 1430.9347

1656.8267 1718.9623 1414.9088

1589.7336 703.9876 1445.9569

1392.7170 1543.8126 1392.9321

1543.7510 862.3191 1527.9956

1668.8438 1142.0028 1718.1748

2413.2746 1082.1856

3600.6427 931.0956

1838.8817 1120.1442

2186.1276 1098.1724

1700.9055 899.2117

pH 7 T 42 E/S 3% 90 min.

pH 7 T 42 E/S 3% 150 min.

99

En la revisión de la literatura, en la búsqueda de reportes de péptidos bioactivos con

masas moleculares como las de la Tabla 22, solo se encontraron referencias

coincidentes con fragmentos de la -LG. Los pesos moleculares resaltados en la

Tabla 22 coinciden con las masas reportadas de péptidos con actividad IECA (Ortiz-

Chao et al., 2009; Contreras et al., 2011) obtenidos a partir de la hidrólisis de

lactosuero bovino con proteasa N Amano. La secuencia de estos péptidos se

muestran en la Tabla 23 y se identificaron dentro de la secuencia de la LG

publicada en la página web de ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/) en la

Figura 20.

Tabla 23 - Identificación de la secuencia de los péptidos presentes en los hidrolizados de lactosuero caprino, utilizando los valores de los pesos moleculares determinados por MALDI-TOF para la búsqueda en la base de datos UniPtrotKB/Swiss-Prot, en línea.

(a) Nomenclatura abreviada de una letra por aminoácido (UniProtKB/Swiss-Prot) 10 20 30 40 50

MKCLLLALGL ALACGIQAII VTQTMKGLDI QKVAGTWYSL AMAASDISLL

60 70 80 90 100

DAQSAPLRVY VEELKPTPEG NLEILLQKWE NGECAQKKII AEKTKIPAVF

110 120 130 140 150

KIDALNENKV LVLDTDYKKY LLFCMENSAE PEQSLACQCL VRTPEVDKEA

160 170 180

LEKFDKALKA LPMHIRLAFN PTQLEGQCHV

Peso Molecular (Da) Secuenciaa Posición dentro

de la proteína Referencia 877.1475 IVTQTMKG (-LG f20-27) (Ortiz-Chao et al., 2009) 899.2117 ALNENKVL ( -LG f104-111) (Ortiz-Chao et al., 2009) 915.1118 KIDALNEN ( -LG f101-108) (Ortiz-Chao et al., 2009) 931.0956 DTDYKKY ( -LG f114-120) (Ortiz-Chao et al., 2009) 1082.1856 IIAEKTKIPA ( -LG f89-98) (Contreras et al., 2011) 1098.1724 VEELKPTPEG ( -LG f61-70) (Ortiz-Chao et al., 2009) 1120.1442 DAQSAPLRVY ( -LG f51-60) (Ortiz-Chao et al., 2009)

Figura 20 – Secuencia P02756 (UniProtKB/Swiss-Prot) de la Lactoglobulina de lactosuero de cabra (Capra hiricus). Se resaltan las secuencias identificadas en la Tabla 23.


100

Para estimar la potencial actividad IECA de los siete péptidos identificados en la

Figura 20 se procedió a evaluar los últimos tres aminoácidos del extremo C-terminal,

de todos ellos, para determinar el cumplimiento o no de las siguientes “condiciones”

establecidas por numerosos estudios (Abubakar et al., 1998; Korhonen y Pihlanto-

Leppälä, 2003; Murakami et al., 2004; Hartmann y Meisel, 2007; Otte et al., 2007a;

Vinderola et al., 2008): poseer residuos hidrofóbicos, tales como triptófano (Trp),

tirosina (Tyr) o fenilalanina (Phe), en por lo menos una de estas posiciones y/o

portar residuos de prolina (Pro), en combinación o no con residuos hidrofóbicos y/o

presentar las cargas positivas de lisina (Lys, grupo -amino) y arginina (Arg, grupo

guanidino). El péptido KIDALNEN (Lys-Ile-Asp-Ala-Leu-Asn-Glu-Asn) no cumple con

ninguna de ellas; los péptidos ALNENKVL (Ala-Leu-Asn-Glu-Asn-Lys-Val-Leu) y

IVTQTMKG (Ile-Val-Thr-Gln-Thr-Met-Lys-Gly) poseen solo una Lys acompañada por

dos aminoácidos hidrofóbicos; IIAEKTKIPA (Ile-Ile-Ala-Glu-Lys-Thr-Lys-Ile-Pro-Ala) y

VEELKPTPEG (Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Thr-Pro-Glu-Gly) poseen un residuo de

Pro; y los péptidos con mayor potencial serían DTDYKKY (Asp-Thr-Asp-Tyr-Lys-Lys-

Tyr) y DAQSAPLRVY (Asp-Ala-Gln-Ser-Ala-Pro-Leu-Arg-Val-Tyr), el primero por

poseer dos Lys acompañadas por un residuo aromático y el segundo por presentar

también un residuo aromático pero acompañado de una Arg. De hecho, éste último

péptido contiene la secuencia SAPLRVY que fue reportada por Ortiz-Chao et al.

(2009) como el mas potente inhibidor de la enzima ECA derivado de la -LG.

3.1.7. Actividad biológica de los hidrolizados Para seleccionar el tratamiento a ser aplicado en el desarrollo final del ingrediente

funcional, se procedió a determinar las actividades IECA y antioxidante ORACFL de

los ocho extractos solubles menores a 3 kDa.

3.1.7.1. Actividad inhibidora de la enzima ECA (IECA) A partir de cada liofilizado, de las ocho fracciones menores de 3 kDa, se prepararon

cinco diluciones seriadas (1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024). Estas se llevaron a la

101

placa multipocillo para medir la actividad IECA, por fluorescencia. Las lecturas del

fluorómetro se cargaron en una hoja de excel y se obtuvieron las curvas de

inhibición, a partir de la ecuación de la curva (y=a ln(x)+b) se obtuvo el IC50 mediante

la siguiente fórmula IC50 = EXP((50-b)/a). En el Anexo 4 se tabulan estos

coeficientes. En la Figura 21 se presenta un ejemplo de las curvas obtenidas.

Figura 21 – Curva de inhibición de la enzima ECA obtenida para diferentes concentraciones (g/mL) de la Muestra 1 (extracto soluble menor de 3 kDa de lactosuero de cabra).

Todos los hidrolizados mostraron actividad inhibidora de la enzima ECA (Tabla 24)

considerándose, por ejemplo, que en el estudio de van der Ven et al. (2002) con 46

hidrolizados de lactosuero con “buena” actividad IECA in vitro, obtuvieron un rango

de IC50 de 170 a 880 g/mL. El hidrolizado con mayor actividad fue el que necesitó

menor concentración de proteínas para inhibir el 50% de la actividad de la enzima

(IC50): 4,27 g/mL del hidrolizado proveniente del lactosuero bovino termocoagulado

tratado con la mezcla de proteasa+BAL, seguido por el caprino bajo las mismas

condiciones de concentración e hidrólisis con 10,54 g/mL.

Estos resultados fueron analizados estadísticamente mediante diseño factorial 23

(Tabla 25) utilizando paquete estadístico Statistica 7. Se analizaron dos niveles de

y = 18,699ln(x) + 7,4944 R² = 0,937

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0 5 10 15 20 25 30

% d

e in

hibi

ción

Concentración de los péptidos (g/mL)

102

cada factor: método de concentración (ultrafiltración o termocoagulación), origen

(bovino o caprino) y tipo de hidrólisis (enzimática o mezcla enzimática-bacteriana).

Tabla 24 – Actividad inhibidora de la enzima ECA de extractos solubles menor a

3kDa de los hidrolizados de lactosueros bovinos y caprinos bajo cuatro tratamientos diferentes (resultados expresados como IC50 en g/mL)


Proteasa 238,90 ± 26,95 b 153,39 ± 13,23 b 87,98 ± 5,16 b 66,18 ± 4,48 b Proteasa

+ BAL 5,77 ± 0,33 a 4,27 ± 0,52 a 10,78 ± 0,18 a 10,54 ± 0,72 a

a,b: superíndices diferentes, en la misma columna, indican grupos significativamente diferentes (p < 0,05).

Tabla 25 – Factores y niveles utilizados en el análisis estadístico de los resultados de la actividad inhibidora de la enzima ECA.

Factor Descripción Nivel Descripción

T1 Método de concentración 1 Ultrafiltración 2 Termo-coagulación

T2 Origen 1 Cabra 2 Vaca

T3 Hidrólisis 1 Sólo enzimática 2 Enzimática + fermento BAL

En la Tabla ANOVA (Anexo 3a) se observa que la interacción de los tres factores fue

significativa, por tanto, el análisis final de estos resultados se hizo sobre la base de

esa interacción. Como se muestra en la Figura 22, cuando T3 se mantiene constante

en el nivel 2 (hidrólisis enzimática + fermento BAL) se obtiene la mayor actividad

inhibidora de la enzima ECA en cualquiera de los niveles de los otros dos factores

(método de concentración y origen del suero). Mientras que con la aplicación de

sólo hidrólisis enzimática (T3:1) se obtiene mayor inhibición con el suero de cabra

(T2:1) tanto ultrafiltrado como termo-coagulado.

103

El análisis estadístico demostró que el método de concentración no afecta la

actividad inhibidora de la enzima ECA de los hidrolizados, mientras que el método

aplicado para la hidrólisis (sólo enzimático o combinación enzimático y fermentación

BAL) sí tuvo un efecto significativo sobre esa actividad independientemente del

método de concentración empleado.

"T1"*"T2"*"T3"; LS MeansCurrent effect: F(1, 16)=12,325, p=,00290

Effective hypothesis decompositionVertical bars denote 0,95 confidence intervals

T1 1 T1 2

T3: 1

T2: 1 2-50

0

50

100

150

200

250

300

IAC

E

T3: 2

T2: 1 2

Figura 22 - Efecto de la interacción de tres factores, sobre la actividad IECA, determinado por análisis factorial 23: factor T1 (método de concentración: 1-Ultrafiltración, 2-Termocoagulación), factor T2 (origen del lactosuero: 1- caprino, 2-bovino) y factor T3 (tipo de hidrólisis: 1-enzimático, 2-enzima mas BAL).

La acción conjunta de la enzima y la cepa ácido-láctica mostró una actividad

inhibidora de la enzima ECA significativamente mayor (p<0,05) que cuando los

hidrolizados se obtuvieron solo por la acción de la enzima. Esto coincide con los

resultados obtenidos por Chen et al. (2007) y por Tsai et al. (2008) donde el IC50 del

hidrolizado se redujo de 1180 y 515 g/mL en la hidrólisis enzimática a 240 y 226

g/mL con la combinación de la fermentación ácido-láctica con la hidrólisis mediante

Flavourzyme®, respectivamente. Ellos concluyeron que la fermentación asistida por

proteasa acelera la producción de péptidos bioactivos con actividad in vitro inhibidora

de la enzima ECA, y que por tanto, podría permitir obtener del lactosuero un

104

ingrediente útil en alimentos fisiológicamente funcionales para la prevención de la

hipertensión arterial.

3.1.7.2. Capacidad antioxidante ORACFL

En la Tabla 26 se resumen los resultados obtenidos para la medición de la actividad

ORAC de los hidrolizados, en general, se observa que los mismos tienen una

capacidad antioxidante moderada.

Tabla 26 - Valores promedio de la actividad antioxidantes (ORACFL, Moles Trolox/mg sólidos solubles) de extractos solubles menor a 3kDa de los hidrolizados de lactosueros bovinos y caprinos bajo cuatro tratamientos diferentes (promedio ± desviación estándar). LACTOSUERO BOVINO LACTOSUERO CAPRINO Ultrafiltración Termocoagulación Ultrafiltración Termocoagulación

Proteasa 0,557 ± 0,006a 0,495 ± 0,031a 0,494 ± 0,026a 0,142 ± 0,029a Proteasa

+ BAL 0,388 ± 0,039b 0,601 ± 0,063a 0,495 ± 0,021a 0,265 ± 0,034a

a,b: superíndices diferentes, en la misma columna, indican grupos significativamente diferentes (p < 0,05).

Estos resultados fueron analizados estadísticamente mediante diseño factorial 23

utilizando paquete estadístico Statistica 7, y los resultados de la Tabla ANOVA se

muestran en el Anexo 3b. En este caso, resultaron significativas las interacciones

entre el factor T1 (método de concentración) y cada uno de los otros dos factores,

por lo cual se procedió a analizar ambas interacciones. No hubo interacción

significativa entre los factores T2 (tipo de lactosuero) y T3 (tipo de hidrólisis), y con

respecto al efecto individual de ambos, sólo resultó significativo el efecto del factor

T2. La actividad ORAC del lactosuero bovino resultó significativamente mayor

(p<0,05) que la del caprino: 0,510 vs 0,349 Moles Trolox/mg, respectivamente.

Con respecto al tipo de hidrólisis, a pesar de que en el caso específico del lactosuero

bovino ultrafiltrado hubo una actividad ORAC significativamente mayor cuando fue

105

hidrolizado solo con la proteasa, en general, el modelo demostró que el tipo de

hidrólisis, por sí solo, no tiene efecto significativo (p>0,05) sobre la actividad ORAC.

En la Figura 23a se muestra la interacción entre el método de concentración y el tipo

de lactosuero: con el proceso de ultrafiltración (T1:1), la actividad antioxidante es

similar en los dos tipos de suero (caprino y bovino); mientras que con la termo-

coagulación (T1:2) se obtuvo mayor actividad antioxidante con el suero bovino

(T2:2). Este resultado pareciera indicar que las proteínas lactoséricas caprinas

pierden mayor actividad antioxidante, por efecto de la temperatura, que las bovinas.

En la Figura 23b se muestra la interacción entre el método de concentración y el tipo

de hidrólisis: con la hidrólisis enzimática + fermento BAL (T3:2), la actividad

antioxidante es similar en los dos métodos de concentración; mientras que con la

hidrólisis enzimática, se obtiene mayor actividad antioxidante del suero concentrado

por ultrafiltración. Sobre la base de esto, se tiene que en general la desnaturalización

térmica de las proteínas del lactosuero reduce su capacidad antioxidante.

"T1"*"T2"; LS MeansCurrent effect: F(1, 16)=239,86, p=,00000


T2 1 T2 2

1 2T1

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

ORA

C

"T1"*"T3"; LS MeansCurrent effect: F(1, 16)=51,405, p=,00000


T3 1 T3 2

1 2T1

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

OR

AC

Figura 23 – Análisis gráfico de la interacción entre el método de concentración (T1:1-Ultrafiltración, T1:2-Termocoagulación) y: a) el origen del lactosuero (T2:1- caprino, T2:2-bovino); b) el tipo de hidrólisis (T3:1-enzimático, T3:2-enzima mas BAL).

106

3.1.8. Identificación de péptidos bioactivos por HPLC-MS-MS Los extractos solubles < 3kDa de los ocho tratamientos fueron analizados por HPLC-

MS-MS para identificar los péptidos que pudiesen ser responsables por la actividad

observada. En el Anexo 5 se muestran los espectros de masas de cada uno de

ellos. En la Tabla 27 se señalan las masas moleculares de los cinco péptidos mas

abundantes en cada tratamiento, se observa en general que los pesos moleculares

oscilan entre 800 y 1300 Da. Para determinar si había diferencias entre los distintos

tratamientos en cuanto a la distribución de estos pesos moleculares, se aplicó un

ANOVA en un diseño factorial 23 con los tres factores manejados hasta este punto:

método de concentración, tipo de lactosuero y tipo de hidrólisis. La tabla ANOVA se

muestra en el Anexo 6, donde se observa que el único factor que parece tener efecto

sobre la distribución de las masas moleculares es el tipo de lactosuero: la media de

los pesos moleculares de los péptidos en el lactosuero bovino fue significativamente

menor (p<0,05) que la de los del caprino.

Tabla 27 – Masas moleculares observadas en espectros HPLC-MS-MS de los ocho tratamientos, agrupados por tipo de lactosuero.

Bovino Caprino T2 T4 T5 T8 T1 T3 T6 T7

988,3 1039,3 1001,4 1001,5 1108,3 1114,2 1103,5 1070,5 950,3 877,4 1041,4 1041,4 1264,5 1264,5 1070,4 1340,5

1131,3 1110,4 887,4 887,4 1215,3 970,2 855,4 1232,5 1167,3 986,3 806,3 1259,5 919,2 877,3 1210,5 1017,4 877,3 948,4 1103,5 1158,5 1375,5 1070,4 1005,4 1270,6

A continuación se presenta la identificación de las secuencias de aminoácidos

correspondientes a los tratamientos que resultaron con mayor actividad IECA: el

número 1 (lactosuero caprino termocoagulado hidrolizado con mezcla enzima-cepa

BAL, Tabla 28) y el número 4 (lactosuero bovino termocoagulado hidrolizado con

mezcla enzima-cepa BAL, Tabla 29). Es de hacer notar que ninguno de los péptidos

107

identificados se corresponden con los arriba mencionados como mas abundantes,

esto se debe a que ninguno de estos dio un buen fraccionamiento en la trampa de

iones del equipo de masas, no pudiéndose identificar una secuencia con reducido

margen de error.

En el caso de tratamiento 1 (Tabla 28), de los péptidos derivados de la -LG, dos de

las secuencias coinciden con las identificadas previamente por MALDI-TOF:

DAQSAPLRVY y ALNENKVL. Como se mencionó anteriormente (página 101) estos

dos péptidos cumplen con las condiciones para inhibir la actividad de la enzima ECA.

Aplicando el análisis del extremo C-terminal, se tiene que el resto de los péptidos

identificados para la -LG, si cumplen con por lo menos una de esas condiciones.

Tabla 28 – Secuencias de péptidos identificados por HPLC-MS-MS, en el extracto

soluble <3kDa del Tratamiento 1 (lactosuero de cabra termocoagulado hidrolizado con proteasa + BAL)

DERIVADOS DE LA β-Lactoglobulina

Ion MS/MS m/z

Masa Calculada Proteína Especie Fragmento proteína Secuencia

1347,5 (1) 1347,7 β-Lg cabra f(51-62) DAQSAPLRVYVE 1119,4(1) 1119,6 β-Lg cabra f(51-60) DAQSAPLRVY 1565,6 (1) 1565,8 β-Lg cabra f(63-76) ELKPTPEGNLEILL 1452,5 (1) 1452,8 β-Lg cabra f(63-75) ELKPTPEGNLEIL 1097,3 (1) 1097,6 β-Lg cabra f(63-72) ELKPTPEGNL 900,3 (1) 900,5 β-Lg cabra f(104-111) ALNENKVL 922,3 (1) 922,5 β-Lg cabra f(158-165) LKALPMHI 829,3(1) 829,4 β-Lg cabra f(116-121) DYKKYL

DERIVADOS DE LA Lactoferrina Ion MS/MS

m/z Masa

Calculada Proteína Especie Fragmento proteína Secuencia

891,3 (1) 891,5 Lactoferrina cabra f(123-129) FQLDQLQ 873,31) 873,5 Lactoferrina cabra f(273-281) AVVARSVDG

El fragmento 158-165 (LKALPMHI) contiene el tetrapéptido Ala-Leu-Pro-Met

reportado por Murakami et al. (2004) como un poderoso inhibidor de la enzima ECA

108

al reducir la presión arterial en 21,4 mmHg, a pesar de no haber mostrado una buena

actividad in vitro, sugiriendo que el proceso de digestión intestinal lo corta en

dipéptidos Ala-Leu y Pro-Met, que al ser absorbidos pudieron ser los responsables

de tal reducción.

En el caso de los dos fragmentos derivados de la lactoferrina, ambos poseen un

aminoácido hidrofóbico, Leu o Gly, pero esto puede no otorgar ninguna ventaja para

interactuar con el sitio activo de la enzima ECA si los otros dos aminoácidos no

cumplen con uno de los requisitos señalados anteriormente (Tavares et al., 2011).

De igual forma, esas secuencias completas no aparecen reseñadas en la literatura

con alguna actividad biológica.

Con respecto al tratamiento 4 (Tabla 29) se identificaron fragmentos derivados de

tres proteínas del lactosuero: -LA, -LG y lactoferrina. La secuencia LDDDLTDD

apareció reportada por N'Negue et al. (2006) como fragmento de la -LA

correspondiente al dominio enlazador de calcio; y por Otte et al. (2007a) como parte

de un hidrolizado de esta proteína con Thermolysin® que demostró una moderada

actividad IECA.

El fragmento de la -LG DAQSAPLRVY ha sido obtenida utilizando otras enzimas:

proteasa N Amano (Ortiz-Chao et al., 2009) y proteasas extraidas de las flores de

Cynara cardunculus (Tavares et al., 2011); en ambos casos, han reportado una muy

buena actividad IECA in vitro.

La secuencia DTDYKKY de la -LG fue reportada por Ortiz-Chao et al. (2009) en una

de las fracciones con baja actividad IECA obtenidas de la hidrólisis de esta proteína

con proteasa N Amano.

Al igual que en lactosuero caprino, los fragmentos identificados como derivados de la

lactoferrina no cumplen con las condiciones para poseer actividad IECA y tampoco

aparecen reseñados en la literatura.

109

Tabla 29– Secuencias de péptidos identificados por HPLC-MS-MS, en el extracto soluble <3kDa del Tratamiento 4 (lactosuero de vaca termocoagulado hidrolizado con proteasa + BAL)

DERIVADOS DE LA α-Lactalbúmina

Ion MS/MS m/z Masa Calculada Proteina Especie Fragmento

proteina Secuencia

1141,3 (1) 1141,5 α-LA Vaca f(62-71) KDDQHPHSSN 921,1 (1) 921,4 α-LA Vaca f(81-88) LDDDLTDD 583,1 (1) 583,2 α-LA Vaca f(35-39) GYDTQ

1234,4 (1) 1234,6 α-LA Vaca f(14-25) DLKYGGVSLPE 658,1 (1) 658,3 α-LA Vaca f(19-25) GGVSLPE

DERIVADOS DE LA β-Lactoglobulina

Ion MS/MS m/z Masa Calculada Proteina Especie Fragmento

proteina Secuencia

1245,4 (1) 1245,6 β-Lg vaca f(125-135) TPEVDDEALEK 932,3(1) 932,4 β-Lg vaca f(96-102) DTDYKKY

1324,5 (1) 1324,7 β-Lg vaca f(47-58) KPTPEGDLEILL 743,1(1) 743,3 β-Lg vaca f(47-53) KPTPEGD 760,2 (1) 760,3 β-Lg vaca f(49-55) TPEGDLE 958,2 (1) 958,4 β-Lg vaca f(152-159) NPTQLEEQ 830,2 (1) 830,4 β-Lg vaca f(152-158) NPTQLEE

1119,4 (1) 1119,8 β-Lg vaca f(33-42) DAQSAPLRVY DERIVADOS DE LA Lactoferrina

Ion MS/MS m/z Masa Calculada Proteina Especie Fragmento proteina Secuencia

1589,7 (1) 1589,8 Lactoferrina vaca f(413-426) ENRKSSKHSSLDCV 873,3(1) 873,4 Lactoferrina vaca f(420-427) HSSLDCVL

Hasta este punto, los lactosuero de ambas especies presentaron características

similares para ser consideradas como materia prima para el desarrollo del

ingrediente funcional. Ambos demostraron una buena actividad IECA al ser

hidrolizados mediante la combinación de proteasa y fermentación ácido láctica,

independientemente del método empleado para concentrar las proteínas. Pero con

110

respecto a la actividad ORAC, el lactosuero bovino hidrolizado demostró mayor

capacidad antioxidante.

Según Ribeiro y Ribeiro (2010) muchos autores han identificado a la leche de cabra

como un ingrediente funcional, gracias a sus propiedades para mantener la salud,

reducción de riesgos de enfermedades crónicas y modificación positiva de las

funciones fisiológicas. Por esta razón y por su potencial actividad IECA, se

seleccionó el lactosuero caprino para las últimas etapas del presente trabajo; para

compensar la deficiencia en la capacidad antioxidante, se evaluó la incorporación de

una fruta rica en polifenoles y otros antioxidantes en la formulación del producto

funcional.

Una consideración importante a tomar en cuenta en el desarrollo del ingrediente

funcional, fue señalada por van der Ven et al. (2002) sobre el hecho de que la

inhibición de la enzima ECA mediante el consumo de hidrolizados proteicos es el

resultado de la acción inhibitoria de varios péptidos presentes en ellos, por lo cual,

ellos propusieron, como la vía mas adecuada para mejorar la actividad IECA de un

hidrolizado, optimizar la composición peptídica completa de todo el hidrolizado, en

lugar de aislar los mejores y aplicarlos como concentrados individuales.

En este mismo sentido Didelot et al. (2006) sugirieron que la ingestión oral de un

péptido bioactivo purificado es menos efectivo que el consumo del hidrolizado

completo, puesto que la digestión gastro-intestinal puede liberar péptidos bioactivos

de este último, pero haría perder su actividad del péptido purificado. Sobre la base de

esto, el desarrollo del ingrediente funcional se realizó en función del hidrolizado

completo, y no de péptidos aislados, con buena actividad IECA in vitro.

3.1.9. Obtención del hidrolizado a nivel de Planta Piloto Para el escalado en planta se seleccionó el tratamiento 1: lactosuero de cabra,

termocoagulado, hidrolizado por combinación proteasa-fermento ácido-láctico. A

111

partir de las modificaciones realizadas en la línea de producción se desarrollaron los

siguientes procedimientos:

3.1.9.1. Termocoagulación de la proteína soluble del lactosuero

Se trabajó con lotes de 60 Kg de lactosuero descremado. Se aseguró de que el pH

inicial del suero fuese mayor a 6,00 ya que de lo contrario no se produce la

coagulación de la proteína. Esto se logró procesando el lactosuero inmediatamente

después de retirarlo del tanque durante el desuerado de la cuajada en la elaboración

del queso. La suspensión final de proteínas (solución ricotta) resultó con una

concentración promedio de proteínas de 5,1% ± 0,4% (Tabla 31), para una

recuperación de 49,2% ± 4,3% de la proteína originalmente presente en el suero

(Tabla 30). Esta recuperación es menor que la obtenida a nivel de laboratorio

(7,43%), debido principalmente al cambio realizado en el escalado al no bajar el pH

una vez alcanzada la temperatura de desnaturalización; pero este cambio aseguró

una mayor solubilidad de la proteína desnaturalizada para evitar la sensación de

grumos en el producto final. El rendimiento promedio de 14,3 % en solución ricotta es

muy cercano al esperado de 15%, puesto que se estableció como paso en el proceso

de elaboración el retirar el 85% en peso del volumen original del lactosuero

procesado, de esta forma se buscó obtener un producto con una composición

estandarizada de una forma sencilla, considerando que el procedimiento se estuvo

diseñando para el productor artesanal, que cuenta con limitados recursos técnicos de

laboratorio.

Tabla 30 – Recuperación promedio de la proteína en la elaboración de las soluciones de ricotta en planta (promedio ± desviación estándar).

Promedio ± desv. estándar

Peso suero (Kg) 55,0 ± 14,2 Peso ricotta (kg) 7,8 ± 2,1

% Rendimiento en solución ricotta 14,3 ± 1,1 Peso proteína en suero (Kg) 0,809 ± 0,295 Peso proteína en ricotta (Kg) 0,395 ± 0,136

% Recuperación de proteína en ricotta 49,2 ± 4,3 pH final de la ricotta 6,24 ± 0,08

112

En cuanto al contenido de lactosa se observa una reducción significativa, en vista de

que gran parte de ella se pierde en el suero retirado del tanque. El bajo nivel de la

grasa original se incrementó ligeramente, en la solución de ricotta, debido a que la

grasa tiende a quedar atrapada en la red de proteínas (Tabla 31).

Tabla 31 – Composición promedio de los cuatro lotes de solución ricotta elaborados a nivel de escalado en planta piloto (promedio ± desviación estándar).

Lactosuero Sol. Ricotta

Sólidos Totales (%) 6,8 ± 0,3 9,1 ± 0,6 Proteínas (%) 1,5 ± 0,3 5,1 ± 0,4 Grasa (%) <0,5 0,6 ± 0,1 Cenizas (%) 0,61 ± 0,04 0,67 ± 0,05 Lactosa (%) 4,7 ± 0,1 2,7 ± 0,2 Humedad (%) 93,2 ± 0,4 90,9 ± 0,6

3.1.9.2. Hidrolizado de la suspensión de proteínas

En el paso anterior se obtuvo un total de 30,6 Kg de solución de ricotta, con un

contenido total de proteínas de 1,561 Kg, para lo cual fue necesario aplicar 46,8

gramos de proteasa, para una relación enzima/sustrato del 3% del peso de las

proteínas, y 5,9 gramos de la cepa BAL liofilizada para una proporción de 0,02% de

peso total de la mezcla con la solución de ricotta. El hidrolizado final, luego del

proceso térmico para desnaturalizar a la enzima y detener el proceso de hidrólisis,

presentó un pH promedio de 5,2 ± 0,1. El producto final se dividió en 7 partes

iguales, para tener porciones de 4,3 Kg del ingrediente funcional para la siguiente

etapa.

3.1.10. Caracterización del ingrediente funcional (fórmula final) La composición porcentual promedio de los siete lotes de solución de ricotta

hidrolizada (Tabla 32), es muy similar a la de la solución original, las ligeras pérdidas

113

en agua y sólidos se debieron a procesos de evaporación y de adherencia de sólidos

en las paredes de la marmita debido al proceso térmico aplicado.

Tabla 32 - Composición promedio de los siete lotes de hidrolizado, elaborados a nivel de escalado en planta piloto (promedio ± desviación estándar).

Sólidos Totales (%) 8,9 ± 0,9 Proteínas (%) 5,0 ± 0,4 Grasa (%) 0,6 ± 0,1 Lactosa (%) 2,6 ± 0,7 Cenizas (%) 0,72 ± 0,05 Humedad (%) 89,7 ± 4,1

La actividad IECA promedio de los siete lotes se muestra en la Tabla 33, así como

también el contenido de proteínas total de los extractos menores a 3 kDa, de cada

lote, de acuerdo a la determinación de N total por Kjeldahl, lo cual representa el

contenido de péptidos principalmente derivados de la hidrólisis. La actividad IECA,

expresada como IC50, del ingrediente funcional es de 13,66 ± 1,25 g/mL, es decir

que con esta concentración de péptidos se inhibe el 50% de la actividad de la enzima

ECA, y cada lote de 4,3 Kg de hidrolizado contiene en promedio 66,27 ± 1,23 g de

péptidos.

Tabla 33 – Actividad IECA (g/mL) y contenido total de proteínas (g) en el extracto menor a 3 kDa (promedio ± desviación estándar), de los siete lotes preparados de hidrolizado de la solución de ricotta (“ingrediente funcional”)

IC50(g/mL) Extracto < 3kDa

(g proteína/4300 g hidrolizado)

Lote 1 11,84 ± 0,81 64,65 ± 0,71 Lote 2 15,02 ± 0,91 65,04 ± 1,27 Lote 3 12,02 ± 1,66 66,47 ± 0,62 Lote 4 15,29 ± 1,10 64,58 ± 1,63 Lote 5 12,97 ± 1,28 67,73 ± 1,72 Lote 6 13,89 ± 1,31 68,62 ± 1,62 Lote 7 14,60 ± 1,66 66,81 ± 1,02

114

Los hidrolizados de proteínas del lactosuero son considerados productos seguros y

no están sujetos a restricción alguna para su aplicación en alimentos (Contreras et

al., 2011). Se tiene así que el ingrediente desarrollado hasta este punto puede ser

aplicado en la formulación de un alimento funcional.

3.2. Desarrollo del yogurt natural batido funcional Una vez obtenido el ingrediente funcional en cantidad suficiente para su

incorporación en el yogurt base, se procedió con la segunda etapa: la elaboración del

yogurt funcional y paralelamente del yogurt natural sin el hidrolizado.

El aspecto mas importante en esta formulación fue definir el contenido del

“ingrediente activo” a nivel de la ración diaria. Según se mencionó anteriormente, los

meta-análisis realizados por Pripp (2008) y Xu et al. (2008) no pudieron señalar una

dosis recomendada sobre la base de todos los estudios evaluados, ya que como

reportaron Seppo et al. (2003) la dosis empleada en los estudios clínicos publicados

varía desde 2,6 mg hasta 20000 mg, llegando a la conclusión de que la dosis de los

péptidos alcanza su máxima eficiencia en cantidades bien pequeñas, y que una dosis

mayor no necesariamente garantiza una mejor respuesta. Jauhiainen et al. (2010)

demostraron una reducción en la presión arterial con una dosis de 50 mg/día y una

tendencia a bajarla cuando la dosis fue de 5 mg/día.

En el presente trabajo se realizaron los cálculos para determinar la dosis que fue

factible alcanzar con la disponibilidad de hidrolizado fabricado. Al añadir 4,3 Kg del

hidrolizado fabricado, con un promedio de 66,27 g de péptidos, a un lote de 40 Kg de

leche de cabra, se consiguió que cada ración de 150g de yogurt natural alcanzara un

contenido medio de 224,4 ± 4,2 mg de péptidos, lo cual está dentro del rango

señalado por Seppo et al. (2003).

115

3.2.1. Perfil descriptivo del yogurt En Tabla 34 se resumen los descriptores mencionados en la sesión de grupo con

panel semi-entrenado. Para cada atributo se seleccionó un descriptor. En la Figura

24, se muestra el perfil descriptivo de ambas muestras. Solo hubo diferencias

significativas para el atributo “cremosidad” (según prueba no-paramétrica de

Friedman, 95 % de confianza). Este resultado confirma lo señalado por Farnsworth et

al. (2006) sobre la dificultad de elaborar yogurt a partir de leche de cabra con una

consistencia comparable con el preparado usando leche de vaca. Ellos se lo

atribuyeron al bajo contenido de caseína S1 en la leche de cabra. Esta caseína

juega un papel primordial en la coagulación de la leche.

Tabla 34 – Resumen de los descriptores propuestos para el perfil descriptivo del yogurt.

ATRIBUTO DESCRIPTORES MENCIONADOS

(* DESCRIPTOR SELECCIONADO)

APARIENCIA HOMOGENEIDAD*, firmeza-cremosidad, sinéresis

COLOR Uniforme, BLANCO*, brillo

OLOR Natural, ÁCIDO*, fresco, agradable

SABOR ÁCIDO*, dulzor

CONSISTENCIA Firmeza, CREMOSIDAD*, cuerpo, homogeneidad, grumosidad

Martín-Diana et al. (2003) al comparar los mismos tipos de yogurt, igualmente

obtuvieron una mejor calificación para la textura del yogurt elaborado con leche de

vaca en comparación con el de cabra y una calificación similar para la apariencia de

ambos. Sin embargo, en cuanto a las otras características evaluadas (aroma, sabor y

aceptabilidad general) ellos obtuvieron menor calificación para el yogurt de cabra, lo

cual difiere con el presente trabajo, cuyos resultados permiten afirmar que el yogurt

de cabra, en general, fue tan aceptado como el elaborado con leche de vaca.

116

Figura 24- Perfil descriptivo de un yogur de cabra y uno de vaca.

Este perfil descriptivo coincide con el elaborado por Vargas et al. (2008) sólo en

relación a la percepción del sabor ácido y a la consistencia en boca (o cremosidad).

En cuanto a ésta última propiedad, los autores le atribuyen la diferencia entre ambos

yogures a las variaciones en la micro-estructura de los geles. El de cabra presenta

un gel con menor grado de contracción, y por tanto, con poros más abiertos; esto se

lo atribuyeron a una menor intensidad de las fuerzas de atracción entre las micelas

de la leche de cabra, en comparación con las de la leche de vaca. Con respecto a las

otras características, sus resultados difieren de los del presente trabajo en: 1)

homogeneidad, señalaron que el de cabra presentaba menos grumosidad (mayor

homogeneidad), 2) sabor ácido, registraron una percepción similar para ambos tipos,

y 3) color blanco, señalaron que el color del de cabra se percibió mucho más blanco.

Es difícil llegar a una conclusión en cuanto al resto de los resultados de ambos

estudios, ya que las mismas se pueden deber tanto a factores intrínsecos de la

materia prima y del producto terminado, como por las condiciones en que se

realizaron los ensayos, incluyendo el panel y el entrenamiento recibido.

Martín-Diana et al. (2003) propusieron que para mejorar la textura del yogurt se debe

aumentar el contenido de sólidos no grasos de la leche y/o emplear fermentos

lácticos productores de exo-polisacáridos (EPS). Puesto que para este prototipo no

se pudieron incrementar los sólidos de leche de cabra, y adicionalmente, se deseaba

evitar el uso de estabilizantes no proteicos, se decidió buscar y seleccionar entre los

0

2

4

6

8 homogeneidad

blanco

olor ácido sabor ácido

cremosidad

cabra

vaca

117

fermentos disponibles en el mercado, aquel con el cual se obtuviese un yogurt de

cabra con una consistencia lo mas cercana posible a la del yogurt elaborado con

leche de vaca, dentro de los parámetros de la norma COVENIN 2393:2001.

Para la selección del fermento láctico, se evaluaron las características de los yogures

elaborados con tres fermentos YoFlex® diferentes: YC-180, YC-280 y YC-380. En la

Tabla 35, se muestran los resultados obtenidos para la consistencia de cada yogurt,

así como su pH y acidez.

Tabla 35 – Valores de pH, acidez y consistencia de cada yogurt base elaborado con diferentes fermentos Yo-Flex® (promedio ± desviación estándar).

Fermento YoFlex pH Acidez Consistencia (cP)

YC180 4,29 ± 0,01 a 1,15 ± 0,04 a 81975 ± 1703 a

YC280 4,50 ± 0,01 a 0,90 ± 0,05 a 58106 ± 2299 b

YC380 4,14 ± 0,01 a 0,92 ± 0,04 a 54413 ± 1095 b (a,b) superíndices diferentes, en cada columna, indican diferencias significativas (p<0,05)

determinadas mediante prueba de rango no-paramétrica de Kruskal-Wallis.

El yogurt elaborado con YC-180 resultó con mayor consistencia, mientras que los

otros dos presentaron una consistencia menor, pero similar entre ellos. Estos

resultados no concuerdan con lo señalado por el proveedor, según el cual, el orden

de consistencia final, de mayor a menor, sería YC-280 > YC-180 > YC-380 (Chr.

Hansen A/S, Dinamarca). Sin embargo, se debe tomar en cuenta que esa

información se basa en ensayos realizados con leche de vaca, por lo cual, era de

esperar un comportamiento diferente considerando lo anteriormente mencionado

sobre las diferencias de la leche de cabra con respecto a la de vaca, especialmente

en el contenido de caseína S1. Por otra parte, mediante la evaluación sensorial de

las fórmulas prototipo, se observó que algunas de las características sensoriales si

coincidieron con las reseñadas por el proveedor (Chr. Hansen A/S, Dinamarca). El

yogurt YC-180, por tener un sabor “a yogurt” menos marcado presentó un mayor

sabor “a leche de cabra”, no detectable en las otras dos formulaciones; el YC-280

presentó buen sabor “a yogurt” pero la consistencia fue ligeramente filante; el YC-380

118

presentó un sabor “a yogurt” más intenso, pero a su vez se percibió como el más

ácido. Las formulaciones así elaboradas para cada tipo de fermento fueron

evaluadas mediante un panel semi-entrenado; en el Tabla 36 se resumen los

resultados. La formulación que recibió mejor puntuación fue la YC-380, con una

ponderación de 12,3 cm cercana al máximo de 15 cm (“me gusta mucho”). Las otras

dos formulaciones recibieron una puntuación cercana al punto medio (7,5 cm) el cual

se considera que denota indiferencia hacia ellos, ni gusto ni disgusto marcados.

Güler-Akin y Akin (2007) también obtuvieron alto puntaje en la evaluación sensorial

de un yogurt de cabra elaborado con el fermento láctico YoFlex® YC-380 de Chr.

Hansen (Peyman-Chr. Hansen, Turquía).

Tabla 36 – Puntaje promedio (expresada en cm) correspondiente a cada formulación evaluada por un panel semi-entrenado (promedio ± desviación estándar).

Formulación Evaluación promedio YC-380 12,3 ± 2,2 a YC-280 7,6 ± 4,7 b YC-180 6,8 ± 4,7 b

(a,b) superíndices diferentes indican diferencias

significativas (p<0,05) prueba de medias de Tukey.

En el Tabla 37 se muestran los resultados de los análisis microbiológicos para la

formulación YC-380. En este caso, también se observa que el prototipo cumplió con

los criterios microbiológicos de formulación.

Tabla 37 – Análisis microbiológicos realizados en la muestra de la fórmula prototipo.

Resultado Criterio de Formulación

Mohos y levaduras (UFC/g) < 10 < 103 Coliformes (NMP/g) 0,3 < 11 S. aureus (UFC/g) 6 < 103 B.A.L. (UFC/g) 2,8 x 108 > 106

UFC: unidades formadoras de colonias. NMP: número más probable.

119

Utilizando el fermento láctico YoFlex® YC-380, se elaboraron en total siete lotes de

yogurt natural con el hidrolizado y otros siete sin el ingrediente activo, con los cuales

de realizaron la evaluación sensorial, el estudio de vida útil y el estudio clínico.

3.2.2. Evaluación sensorial del yogurt natural con hidrolizado En primer lugar, se planteó aplicar una prueba para determinar si los consumidores

podían detectar diferencias entre los dos lotes de yogurt elaborados, mediante una

prueba de Triángulo, con las siguientes hipótesis: Ho: A = B; Ha: A ≠ B. En la Figura

25 se muestran los resultados de la prueba triangular aplicada a dos muestras: A

(yogurt natural de cabra sin hidrolizado) y B (yogurt natural de cabra con hidrolizado).

Llevando estos resultados a la Tabla de Roessler et al. (1978), bajo la columna de

nivel de significancia de 0,05 se tiene que, para un total de 24 evaluaciones, se

requiere un mínimo de 13 aciertos para rechazar la hipótesis nula de que no hay

diferencia entre las muestras. Puesto que solo hubo 9 aciertos, se concluye que no

existe suficiente evidencia muestral para rechazar Ho, y por tanto, el panel no

detectó diferencias entre ambos yogurts.

Figura 25- Resultados de la prueba triangular, con 12 panelistas, para determinar si el consumidor puede detectar diferencia entre dos yogurts de leche de cabra distinguidos por la incorporación o no de hidrolizado de lactosuero.

Una vez determinado que el yogurt con el hidrolizado no se diferenciaba al yogurt

natural sin hidrolizado se procedió a aplicar una prueba con 100 consumidores, a los

cuales se les suministró una muestra de yogurt natural de leche de cabra con

hidrolizado de lactosuero. La evaluación promedio, en una escala de 0 cm “me

ACIERTOS 9

ERRADOS 15

120

disgusta mucho” a 15 cm “me gusta mucho”, fue de 11,19 ± 2,80 cm “me gusta un

poco”. Es decir que un 51% de los evaluadores le dieron al producto una evaluación

mayor a 11,3 cm; lo cual indica una buena aceptabilidad del producto. La principal

objeción entre el 49% que le dio una menor evaluación es el “sabor a cabra”,

“aguado” y el “alto” grado de acidez (Figura 26).

Figura 26 – Diagrama de torta de la frecuencia de la aceptabilidad determinada mediante escala no-estructurada de 15 cm con 100 consumidores.

3.2.3. Caracterización del yogurt natural funcional Los lotes de cada tipo (con o sin hidrolizado) resultaron significativamente diferentes

(p<0,05) en los contenidos de humedad, sólidos totales y proteínas; pero no hubo

diferencias en grasa ni cenizas (Tabla 38). El contenido similar de grasa en ambos,

permitió enmascarar las diferencias en los otros componentes, ya que como se

demostró anteriormente la mayoría de los evaluadores no lograron diferenciar ambos

productos, a pesar de las ligeras diferencias en humedad y proteínas.

6

13

30 28

23

Aceptabilidad

Me disgusta un poco

Indiferente

Me gusta un poco

Me gusta

Me gusta mucho

121

Tabla 38 – Composición porcentual del yogurt natural sin hidrolizado y del yogurt natural funcional (promedio ± desviación estándar).

sin hidrolizado con hidrolizado

Humedad (%) 88,44 ± 0,52b 86,33 ± 0,60a Sólidos Totales (%) 11,56 ± 0,52b 13,67 ± 0,60a Proteínas (%) 4,49 ± 0,37b 5,23 ± 0,30a Grasa (%) 3,06 ± 0,06a 3,00 ± 0,06a Cenizas (%) 0,71 ± 0,02a 0,76 ± 0,09a

a,b: superíndices diferentes, en las filas, indican grupos significativamente diferentes (p<0,05

3.3. Desarrollo del yogurt saborizado El yogurt natural funcional de leche de cabra obtuvo una aceptabilidad promedio de

“me gusta un poco”, y adicionalmente la capacidad antioxidante del hidrolizado

seleccionado fue menor que el bovino.

En la tercera etapa de este trabajo, para mejorar la aceptabilidad del yogurt y para

aumentar la capacidad antioxidante del producto, se propuso la incorporación de un

saborizante natural no tradicional con moderada capacidad antioxidante: la fruta del

tomate de árbol (C. betacea Sendtn.).

3.3.1. Evaluación exploratoria inicial La evaluación del concepto es una parte crítica del sistema de inteligencia de

mercado que ayuda a mejorar la toma de decisiones gerenciales suministrando

información relevante para el desarrollo de nuevos productos (Aaker y Day, 1990).

Los resultados estadísticos de la consulta sobre la intención de compra basada solo

en el concepto presentado, mostró una intención promedio de 4 (“probablemente SI

lo compraría”). Se observó además que un 84 % señaló que si lo compraría, bien sea

“probablemente” o “definitivamente”. Los que dieron respuestas negativas, lo hicieron

principalmente por el rechazo que sienten por el sabor de la leche de cabra.

122

Esta alta aceptabilidad del concepto puede deberse en parte al hecho señalado por

Huang et al. (2005) de que el término “antioxidante” se está haciendo muy popular en

la sociedad moderna gracias a la mayor cobertura que los medios de comunicación

están dando a los beneficios a la salud de aquellos que consumen mayores

cantidades de compuestos con capacidad antioxidante. Así, que sobre la base de

esta respuesta se pudo proseguir con la siguiente etapa del desarrollo.

3.3.2. Fórmula prototipo Se realizó la evaluación preliminar de tres proporciones diferentes del yogurt base y

la mermelada. En el Tabla 39, se observa que la formulación de yogurt con menor

aceptabilidad (“me disgusta ligeramente”, p < 0,05) fue la de 90 % yogurt – 10 %

saborizante (T3). La que resultó con mayor aceptabilidad fue T1 (70 % yogurt – 30 %

saborizante) con una evaluación promedio de “me gusta ligeramente”. Al analizar la

composición de la formulación seleccionada 70:30 (yogurt:saborizante) se encontró

que la misma no cumplió con el criterio de formulación establecido previamente en

cuanto al contenido de proteínas. Al evaluar la composición de la materia prima

(Tabla 40) se encontró que el contenido de proteínas y grasas de la leche en el año

2010, a pesar de provenir del mismo rebaño, eran menores que los de años

anteriores. La razón para esta marcada disminución obedece a cambios en la

alimentación del rebaño.

Tabla 39 – Prueba no-paramétrica de Friedman (95 % de confianza), aplicada a los valores obtenidos del panel de consumidores con los que se efectuó la evaluación sensorial de diferentes formulaciones de yogurt.

Tratamiento Porción yogurt (%)

Porción saborizante (%)

Evaluación promediox

T1 70 30 4

T2 80 20 3

T3 90 10 2 x: Leyenda: 1 Me disgusta mucho; 2 Me disgusta ligeramente; 3 No me

gusta NI me disgusta; 4 Me gusta ligeramente y 5 Me gusta mucho

123

Tabla 40 – Comparación de los análisis químicos (promedio ± desviación estándar) aplicados a la leche cruda de cabra en el presente trabajo (2010) con los obtenidos por Salvador et al. (2006).

Año 2006(+)

Año 2010(++)

Grasa (%) 4,82 ± 1,02 4,49 ± 0,02

Proteínas (%) 3,89 ± 0,66 3,17 ± 0,01

Lactosa (%) - 4,90 ± 0,01

Cenizas (%) 0,70 ± 0,99 0,79 ± 0,01

Humedad (%) 86,25 ± 1,58 86,65 ± 0,01

Sól.totales (%) 13,64 ± 1,58 13,35 ± 0,01

Sól. No Grasos (%) 8,80 ± 1,16 8,86 ± 0,02 (+) Rango de mediciones mensuales registradas durante todo el año 2006.

(++) Promedio de las mediciones (por duplicado) realizadas sobre la materia

prima utilizada en la elaboración del yogurt.

En vista de estos resultados, se procedió a ajustar la formulación a una proporción

75:25, no muy diferente a la seleccionada originalmente de 70:30. La nueva fórmula

presentó valores dentro de los criterios planteados al inicio del trabajo. En el Tabla 41

se muestran los resultados de la composición para esa formulación y se observa que

ésta cumplió con los criterios de formulación, en cuanto a grasa, sólidos no grasos de

la leche y acidez.

Tabla 41 – Composición de la fórmula prototipo con la proporción ajustada a 75 % yogurt: 25 % mermelada.

Resultado Criterio de Formulación

Humedad (% p/p) 77,46 - Proteína (% p/p) 3,03 ≥ 3,0 Grasa (% v/v) 3,15 < 3,2 S.N.G.L. (% p/p) 10,95 > 10 Carboh. (% p/p) 15,6 - Cenizas (% p/p) 1,26 - Acidez (% ac. L.) 1,05 > 0,7

124

3.3.3. Actividad antioxidante Una vez seleccionada la formulación definitiva del yogurt saborizado se procedió a

evaluar la actividad antioxidante tanto de los productos en proceso (yogurt base y la

mermelada de tomate de árbol) como del producto final. En primer lugar se

determinó la actividad antioxidante del tomate de árbol, antes y después del

procesamiento aplicado para obtener la mermelada (Tabla 42). Se ha reseñado que

los compuestos fenólicos tienen la habilidad de secuestrar radicales libres debido a la

presencia de grupos hidroxilo en su estructura (Gulcın et al., 2003), por lo cual se

asume que la cuantificación del contenido de estos compuestos puede indicar el

grado de actividad antioxidante que puede poseer un vegetal determinado.

Tabla 42 – Contenido de Polifenoles y actividad ORAC de la pulpa de tomate de árbol antes y después del procesamiento (promedio ± desviación estándar).

Polifenoles (mg GAE/ Kg muestra)

ORACFL (Moles Trolox/mg ss)

Pulpa Fresca 1512 ± 47 a 0,580 ± 0,083 a

Mermelada 792 ± 35 b 0,469 ± 0,033 b (a,b) superíndices diferentes indican diferencias significativas (p<0,05)


GAE: gallic acid equivalents (equivalentes de ácido gálico).

ORACFL: Oxygen Radical Antioxidant CapacityFluorescein.

En el presente trabajo, el contenido de estos compuestos en la pulpa fresca de

tomate de árbol resultó mayor a los informados por Muñoz-Jáuregui et al. (2007) y

Vasco et al. (2008), de 627,1 y 810 mg GAE/kg de muestra, respectivamente; pero

menor al indicado por Ordóñez et al. (2010) de 2050 mg GAE/kg de muestra. La

divergencia en estos resultados se debe principalmente al tratamiento previo

aplicado a la muestra, en el caso de Muñoz-Jáuregui et al. (2007) realizaron una

extracción en etanol al 60 % y luego una concentración por rotoevaporación,

mientras que Ordóñez et al. (2010) homogenizaron la fruta fresca con agua destilada,

y posteriormente separaron el extracto acuoso por centrifugación a 4500 g x 10

minutos, de forma similar a la realizada en el presente trabajo. Mertz et al. (2009)

125

encontraron que el contenido de compuestos fenólicos en extractos con 70 %

acetona del tomate de árbol oscilaba entre 385 y 712 mg GAE/kg de muestra. Sólo

uno de los trabajos realizados con tomate de árbol presentó resultados de la

actividad ORACFL de extractos crudos similares a los preparados en el presente

trabajo. En la investigación de Mertz et al. (2009) los tomates de árbol amarillo y rojo

mostraron una actividad ORACFL de 6,5 y 10,0 μM Trolox equivalentes/g fruta fresca,

respectivamente. Estos autores resaltan así la mayor capacidad antioxidante del

tomate de árbol rojo en comparación con el amarillo, el cual no posee las

antocianinas presentes en la variedad roja. Sin embargo, resultó difícil la

comparación con los resultados del presente trabajo puesto que están expresados en

miligramos de sólidos solubles y no sobre el peso de la fruta fresca. Luego del

tratamiento térmico, el contenido de polifenoles se redujo en un 48 % con respecto a

la pulpa fresca sin procesar. Sin embargo, ese valor todavía es considerado como un

contenido moderado de compuestos fenólicos acorde a la clasificación presentada

por Muñoz-Jáuregui et al. (2007). La actividad ORACFL, por su parte, se vio reducida

en un 19 %. En cuanto a la actividad antioxidante del yogurt base, en el Tabla 43 se

observa que fue baja. Diversos autores han señalado que la capacidad antioxidante

total de la leche se debe principalmente a las caseínas (Hartmann y Meisel, 2007;

Zulueta et al., 2009a y 2009b). En la actividad ORACFL del yogurt batido con pulpa de

tomate de árbol, se observa que la incorporación de 25 % de mermelada de tomate

de árbol al yogurt, incrementó su actividad ORACFL en un 71 %.

Tabla 43 – Actividad ORACFL del yogurt base y del yogurt batido con mermelada de tomate de árbol (promedio ± desviación estándar)

Yogurt ORACFL

(uMoles Trolox/mg ss)

Base (natural) 0,293 ± 0,016b

Batido con tomate de árbol 0,500 ± 0,049 a

(a,b) superíndices diferentes indican diferencias significativas (p<0,05)


ORACFL: Oxygen Radical Antioxidant CapacityFluorescein.

126

Se obtuvo así un producto con una moderada actividad antioxidante gracias a la

incorporación de los polifenoles presentes en la pulpa de tomate de árbol. Este

resultado concuerda con la propuesta de Han et al. (2011) de incrementar la

funcionalidad de los productos lácteos mediante la suplementación con polifenoles,

con el objetivo de desarrollar nuevos productos que tengan un impacto positivo en el

bienestar y salud del consumidor.

3.3.4. Prueba de aceptabilidad Con la finalidad de conocer el efecto del agregado de fruta al yogurt para mejorar su

sabor, se realizó una prueba de aceptabilidad. A 100 consumidores se les suministró

una muestra de la formulación de yogurt elaborada con el fermento YC-380, y

mezclada con mermelada de tomate de árbol en una proporción 75:25.

La evaluación promedio, en una escala de 0 cm “me disgusta mucho” a 15 cm “me

gusta mucho”, fue de 12,44 ± 1,92 cm “me gusta”. Es decir que el 73% de los

evaluadores le dieron al producto una evaluación mayor a 11,3 cm; lo cual indica una

buena aceptabilidad del producto. La principal objeción entre el 27% que le dio una

menor evaluación es el “sabor a cabra” y el “alto” grado de acidez (Figura 27).

Se logró por tanto mejorar la aceptabilidad del yogurt, al incorporarle la mermelada

de tomate de árbol, al aumentar de 51% (en el yogurt natural) a 71% de los

evaluadores que calificaron el producto entre “me gusta” y “me gusta mucho”. Las

objeciones el sabor de cabra y grado de acidez, se redujeron de 49% a un 27% de

los consumidores.

127

Figura 27 - Diagrama de torta de la frecuencia de los resultados de la aceptabilidad determinada mediante escala no-estructurada de 15 cm con 100 consumidores.

3.4. Vida útil yogurt En la cuarta etapa se realizó estudio para determinar la vida útil del yogurt funcional

de leche de cabra tanto natural como saborizado, durante el almacenamiento

refrigerado a 4°C durante 28 días. El pH del yogurt natural se redujo 0,18 unidades

entre el inicio y el final del ensayo, mientras que el saborizado se incrementó en 0,66

unidades (Figura 28). El comportamiento del yogurt natural fue el esperado; según

Güler-Akin y Akin (2007) el tiempo de almacenamiento afecta significativamente el

nivel de acidez del yogurt de leche de cabra: la acidez titulable aumenta mientras que

el pH disminuye. Ellos reportaron reducciones por el orden de unas 0,2 unidades de

pH en “bioyogurt” de leche de cabra. En el caso del yogurt saborizado, el incremento

del pH denota un cambio en la microbiología del producto.

1

4

22

42

31

Aceptabilidad

Me disgusta un poco

Indiferente

Me gusta un poco

Me gusta

Me gusta mucho

128

Figura 28 – Evolución del pH en muestras de yogurt de leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C

En la Figura 29 se muestra que la carga de coliformes totales se mantuvo por debajo

de 1 Log UFC/mL en ambos productos durante los 28 días de almacenamiento, y el

mismo nivel mantuvieron los hongos y levaduras en el caso del yogurt natural. El

yogurt saborizado mostró un recuento inicial de 1,5 Log UFC/mL, menor al máximo

de 3 log UFC/mL permitido según la norma Covenin 2393, pero a partir de los 21

días de almacenamiento el recuento supera los 2,7 Log UFC/mL. Este incremento en

la carga de levaduras puede explicar el cambio detectado en el pH de esta muestra.

Según Suriyarachchi y Fleet (1981) la introducción de azúcar y frutas en el yogurt

hace del yogurt un medio de crecimiento menos selectivo, pudiendo entonces

soportar el crecimiento de varias especies de levaduras. Ellos reportaron que 45% de

las muestras comerciales evaluadas presentaron cargas de levaduras superiores a 3

Log UFC/mL, y con una vida útil de alrededor de 20 días a 5°C y de menos de 12

días a 20°C. Una evaluación posterior del proceso de fabricación, aplicado en la

elaboración de las muestras del presente trabajo, reveló una contaminación del

producto por levaduras debido al equipo donde se realizó el mezclado de la

mermelada con el yogurt natural, ya que ni el yogurt natural ni la mermelada de

tomate de árbol, almacenados como testigos, mostraron presencia de levaduras.

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

d1 d7 d14 d21 d28

pH

Días de almacenamiento

Yogurt Natural

Yogurt Saborizado

129

Figura 29 – Crecimiento de coliformes, hongos y levaduras en muestras de yogurt de leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C

En la Figura 30 se observa como el nivel de las BAL en el yogurt natural se mantiene

sobre los 6 Log UFC/mL exigido por la norma COVENIN 2393, mientras que en el

saborizado a los 28 días ya presentaba un nivel ligeramente inferior. Esto último va

en concordancia con el cambio en la flora bacteriana referido anteriormente en este

yogurt.

Figura 30 – Recuento de bacterias ácido-lácticas (BAL) en muestras de yogurt de leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C

0

1

2

3

4

5

6

7

d1 d7 d14 d21 d28

Log

UFC

/mL

días de almacenamiento

Yogurt Natural (coliformes)

Yogurt Saborizado (coliformes)

Yogurt Natural (hongos y levaduras)

Yogurt Saborizado (hongos y levaduras)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

d1 d7 d14 d21 d28

Re

cue

nto

de

BA

L (L

og

UFC

/mL)


Yogurt Natural

Yogurt Saborizado

130

La actividad ORAC se mantuvo relativamente constante en ambos productos (Figura

31).

Figura 31 – Evolución de la actividad ORAC en muestras de yogurt de leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C

Solo se pudo determinar la actividad IECA en el yogurt natural los días 1 y 28,

obteniéndose los valores de IC50 de 10,24 ± 0,41 g/mL y 24,19 ± 5,74 g/mL,

respectivamente. Esto representa una ligera disminución en dicha actividad, pero

todavía muy superior al IC50 reportado por Tsai et al. (2008) de 240 a 226 g/mL

obtenido con la combinación de la fermentación ácido-láctica con la hidrólisis

enzimática. En un estudio de vida útil de una bebida con lactosuero hidrolizado,

después de seis semanas de almacenamiento a 4°C, se encontró que el producto

retuvo el 92% de la actividad IECA (Fluegel et al., 2010).

En las Figuras 32 y 33 se refleja la evolución de la aceptabilidad de yogurt natural y

el saborizado, respectivamente. En el primero, se observa que se mantiene una

buena aceptabilidad a lo largo de todo el ensayo, mientras que el saborizado ya

presenta un nivel de rechazo mayor el día 21, por lo cual se suspendió su

degustación en ese momento. Un total de tres (12%) evaluadores señalaron un sabor

“piche” o “pasado” del producto; un 56% lo evaluó a nivel de “me es indiferente” o por

debajo. Por lo tanto, se le dio una vida útil de solo 14 días al yogurt saborizado,

fabricado bajo las condiciones del presente estudio. Pero esa condición se puede

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

d1 d7 d14 d21 d28 OR

AC

( m

g/g

sólid

os

solu

ble

s)


ORAC Yogurt Natural

ORAC Yogurt Saborizado

131

mejorar significativamente controlando el proceso térmico de la fruta y los puntos de

contaminación en la línea de fabricación.

Figura 32 – Evaluación sensorial mediante escala no estructurada de 15 cm (“Me disgusta mucho”=0 a “Me gusta mucho”=15) del yogurt natural con hidrolizado de lactosuero. Total evaluadores por día=25.

Figura 33 – Evaluación sensorial mediante escala no estructurada de 15 cm (“Me disgusta mucho”=0 a “Me gusta mucho”=15) del yogurt saborizado con tomate de árbol. Total evaluadores por día=25.

11,7 11,5 11,3

10,1 10,2

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

11,0

12,0

13,0

14,0

15,0

DÍA 1 DÍA7 DÍA14 DÍA 21 DÍA 28

Pu

ntu

ació

n (

cm)

11,4

11,3

9,6

7,5

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

11,0

12,0

13,0

14,0

15,0

DÍA 1 DÍA7 DÍA14 DÍA 21 DÍA 28

Pu

ntu

ació

n (

cm)

132

En el caso del yogurt natural, se confirma una vida útil de por lo menos 28 días, ya

que mantuvo sus propiedades organolépticas, microbiológicas y bioactivas durante

todo el periodo de evaluación. En vista de este resultado, se tomó la decisión de

realizar el estudio clínico con el yogurt natural.

3.5. Estudio clínico La última etapa de este trabajo consistió en la ejecución de un estudio clínico para

evaluar el efecto antihipertensivo del yogurt funcional desarrollado en las etapas

anteriores. A partir de los resultados del Estudio Médico Integral (EMI-2011)

realizado en el IPP-APUCV, campus Maracay, se seleccionaron 54 pacientes

hipertensos que cumplieron con los criterios de selección. A todos se les convocó a

una reunión para explicarles los alcances del estudio, y al final de la misma, 39

accedieron participar voluntariamente, firmando el correspondiente consentimiento

escrito, y se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos (Tabla 44). Mediante la

asignación aleatoria realizada por un estadístico, externo al presente trabajo, se

lograron obtener dos grupos equilibrados y semejantes en la distribución de sexo,

edad, talla y peso.

Tabla 44 – Distribución aleatoria de los participantes en el estudio clínico sobre el efecto antihipertensivo de un yogurt funcional de leche de cabraa

GRUPO n HOMBRES (n/rango de

edades)b

HOMBRES

(Talla/ Peso)b

MUJERES (n/Rango de

edades)

MUJERES

(Talla/ Peso)b

Amarillo (yogurt con hidrolizado) 21 11 (32-64)

1,72±0,05

92±13 10 (36-62)

1,63±0,09 74±13

Anaranjado (yogurt sin hidrolizado)

18 11 (31-62)

1,72±0,06 87±5

7 (39-58)

1,59±0,07 73±6

(a) El grupo Amarillo representa el grupo “Tratamiento”, mientras que el Anaranjado el grupo “Placebo”. (b) Edad en años; talla en m; peso en Kg.

133

A mitad del ensayo se retiró una de las participantes del grupo placebo, quien por

razones personales debía estar fuera de la ciudad de Maracay mas de dos semanas,

quedando por tanto este grupo conformado por 17 participantes y se descartaron los

datos correspondientes a la persona retirada.

Mediante una encuesta completada al final del estudio por cada participante (Anexo

9) se obtuvo la siguiente información con respecto al cumplimiento de las normas

acordada al inicio del ensayo, con respecto a la toma del producto. A la pregunta de

si consumieron su ración diaria los 42 días del ensayo, un 71% en el grupo placebo y

un 81% en el grupo tratamiento respondieron que sí; el resto dejaron de hacerlo de

uno a cuatro días en total. Con respecto al momento del día para la toma del yogurt,

en el grupo placebo un 77% lo tomó en la mañana, un 6% en la tarde y un 17% en la

noche, mientras que en el grupo tratamiento fue 52%, 24% y 24%, respectivamente.

Una persona en cada grupo varió un día el momento del consumo.

A la pregunta de haber sufrido molestias estomacales durante el ensayo, dos (11%)

personas en el grupo placebo y uno (5%) en el grupo tratamiento, manifestaron algún

grado de acidez, gases y/o cólicos. Sin embargo, ninguno le atribuyó estos síntomas

al consumo del producto. El 88% de los participantes del grupo placebo y el 100%

del grupo tratamiento manifestaron haberse sentido bien durante todo el ensayo.

Adicionalmente, se les solicitó evaluar la aceptabilidad general del producto, el 53%

del grupo placebo seleccionó “me gusta mucho”, 35% “me gusta” y 12% “me gusta

un poco”; para el grupo tratamiento fueron 33%, 43% y 24%, respectivamente. Esto

indica que el yogurt “placebo” obtuvo una mejor aceptabilidad que el yogurt con

hidrolizado (tratamiento). La única observación “negativa” manifestada por algunos

de los participantes fue con respecto a la consistencia del producto, al preferirlo un

poco mas firme. Sobre la base de lo expresado en esta encuesta, con respecto a la

falta de regularidad en el consumo de la ración diaria por parte de un 29% de los

participantes en el grupo placebo y 19% en el grupo tratamiento, correspondiente a

un total de 9 participantes, se procedió a determinar la variación neta en la presión

134

arterial entre la primera toma y la última para cada participante; los resultados se

muestran en la Tabla 45. Ese grupo de 9 personas mostró un incremento promedio

de 13 mmHg en la PAS y de 3 mmHg en la PAD. Por esta razón se procedió a excluir

todos los datos de estos 9 participantes de sus correspondientes grupos para los

análisis estadísticos.

Tabla 45 – Variación neta entre la presión arterial sistólica y diastólica de cada participante al inicio y al final del estudio clínico*.

Grupo Participantes (n)

ΔPAS (mmHg)

ΔPAD (mmHg)

Tratamiento (Yogurt con hidrolizado) 17 Reducción 6 ± 6 Reducción 5 ± 5 Placebo (Yogurt sin hidrolizado) 12 Reducción 9 ± 8 Reducción 6 ± 5

Eliminados 9 Aumento 13 ± 8 Aumento 3 ± 3

(*) El grupo Eliminados representa a los individuos que fueron excluidos del ensayo. ΔPAS: variación de la presión arterial sistólica; ΔPAD: variación de la presión arterial diastólica. Los valores de presión se representan como la media ± la desviación estándar.

De esta forma, para el análisis final de los resultados del estudio clínico se

mantuvieron los datos de presión arterial de 17 personas en el grupo que recibió el

yogurt con el hidrolizado de lactosuero (grupo Tratamiento) y 12 personas en el

grupo que recibió el yogurt sin hidrolizado (grupo placebo). Al comparar ambos grupo

(Tabla 46), en cada día de toma de presión (DTP), se observa que no hay diferencias

significativas (p>0,05) entre las medias de la presión arterial sistólica (PAS). En el

Anexo 11 se resumen los análisis estadísticos aplicados.

Tabla 46 – Prueba de t-student para la comparación de los valores promedio de

presión arterial sistólica entre los dos grupos del estudio clínico.

Tratamiento (mmHg)

Placebo (mmHg)

p

Inicio 136 ± 8,6 139 ± 9,3 0,2093 Final 130 ± 9,5 130 ± 10,7 0,8919

135

En la Tabla 47 se hace una comparación de las medias, pero dentro de cada grupo,

entre los valores PAS del día inicial vs la medición final, respectivamente. En ambos

grupo se observan diferencias significativas (p<0,05) entre el inicio y el final del

estudio. En el grupo que recibió el yogurt con hidrolizado la reducción de la PAS fue

de 6 mmHg, mientras que en el grupo que recibió el placebo fue de 9 mmHg.

Tabla 47 – Prueba de t-student de la comparación, dentro de cada grupo, de la presión arterial sistólica al inicio del estudio con respecto a la última toma de presión arterial.

Grupo

Promedio (mmHg) p

Tratamiento Inicio 136 ± 8,6 Final 130 ± 9,5 0,000930

Placebo Inicio 139 ± 9,3 Final 130 ± 10,7 0,000371

En el caso de la presión arterial diastólica (PAD), al comparar la media de los dos

grupos en cada sesión de medición (Tabla 48), se observa que al principio existieron

diferencias significativas (p<0,05) entre ambos grupos, siendo la PAD media del

grupo tratamiento menor que la del grupo placebo, pero al final del ensayo las

medias de ambos grupos fueron similares (p>0,05).

Tabla 48 – Prueba de t-student de la comparación de los valores promedio de la presión arterial diastólica entre los dos grupos del estudio clínico.

Tratamiento (mmHg)

Placebo (mmHg) p

Inicio 86 ± 6,6 90 ± 5,1 0,0128 Final 82 ± 4,5 84 ± 4,6 0,0591

Dentro de cada grupo se observa una disminución significativa de la PAD al final del

ensayo (Tabla 49), el grupo tratamiento se obtuvo una reducción de 4 mmHg en la

PAD, mientras en el grupo placebo fue de 6 mmHg. Tuomilehto et al. (2004)

obtuvieron un resultado similar y se lo atribuyeron al “acostumbramiento” de los

136

participantes con las mediciones de la presión sanguínea y con el personal del

estudio. Sin embargo, este no parece ser el caso en el presente estudio.

Tabla 49 – Prueba de t-student de la comparación, dentro de cada grupo, de la presión arterial diastólica al inicio del estudio con respecto al final.

Grupo Promedio (mmHg) p

Tratamiento Inicio 86 ± 6,6 Final 82 ± 4,5 0,000090

Placebo Inicio 90 ± 5,1 Final 84 ± 4,6 0,000002

La reducción significativa de la PAS y PAD en ambos grupos indica que un factor

común en ambos productos es responsable de esta reducción: un componente

presente originalmente en la leche de cabra con la cual se elaboraron ambos

productos o liberado durante el proceso de fermentación del yogurt. Datos

epidemiológicos han encontrado una asociación entre el consumo de proteínas

lácteas y la reducción de la presión sanguínea (Liu et al., 2002). La fermentación de

la leche, además de incrementar su valor nutricional, mejora la biodisponibilidad de

los nutrientes y la producción de sustancias que tienen funciones biológicas;

adicionalmente el contenido de calcio y fósforo se ha asociado con la reducción de la

presión sanguínea (Pihlanto et al., 2010). Hata et al. (1996) demostraron en un

estudio de 8 semanas con 30 pacientes hipertensos, bajo medicación, que el

consumo de leche fermentada disminuyó significativamente tanto la PAS como la

PAD. Ellos argumentaron que a pesar del reconocido efecto del calcio sobre la

presión arterial, en su estudio el grupo placebo recibió una leche, artificialmente

acidificada con el mismo contenido de calcio que el tratamiento, y no presentó una

reducción en este parámetro. Por tanto, ellos concluyeron que los efectos

hipotensivos se debían a otros factores diferentes al calcio, como por ejemplo

péptidos derivados de la fermentación láctica.

De los 15 estudios evaluados por Pripp (2008), solo en uno no hubo reducción en la

presión arterial; en el cual se utilizó un hidrolizado de lactosuero. Como señalan

137

estos autores, los péptidos antihipertensivos tienen la limitación de que son

susceptibles a degradación por enzimas presentes en el tracto digestivo.

Fluegel et al. (2010) tampoco encontraron una diferencia significativa en el cambio de

la presión arterial entre los dos grupos que participaron en un estudio clínico donde la

intervención consistió en una bebida láctea suplementada con hidrolizado de la

lactosuero para el grupo tratamiento, y una bebida similar sin el hidrolizado para el

grupo placebo. Sin embargo, al integrar los resultados de los dos grupos encontraron

una reducción significativa en ambas presiones, PAS (8 mmHg) y PAD (8,6 mmHg),

en los pacientes prehipertensos y solo en la PAS (3,8 mmHg) en pacientes con etapa

1 de hipertensión. Según ellos, ese resultado sugirió que la reducción en la presión

arterial se puede deber a otro factor diferente al péptido añadido, mencionando

también el hecho de haberse demostrado que el consumo de productos lácteos per

se tiene efecto antihipertensivo, probablemente porque la digestión gastro-intestinal

de las proteínas lácteas libera directamente los péptidos bioactivos; por lo cual, el

simple incremento en el consumo de proteínas lácteas puede contribuir a reducir los

problemas de hipertensión arterial. Al integrar los resultados de los 29 participantes

(Tabla 50) efectivamente incluidos en el análisis de resultados del presente estudio

se obtuvo que las reducciónes de 7,2 y 5,2 en PAS y PAD, respectivamente, están

por el mismo orden de magnitud a los reportados por Fluegel et al. (2010).

Tabla 50 – PAS y PAD promedio de los 29 participantes en el estudio clínico, al inicio y final

Inicio Final VARIACIÓN (Δ)

Presión arterial sistólica (mmHg)

137,5 ± 8,9a 130,3 ± 9,9b Reducción (7,2)

Presión arterial diastólica (mmHg)

87,7 ± 6,2a 82,5 ± 4,6b Reducción (5,2)

(a,b) superíndices diferentes, en la misma fila, indican diferencias significativas (p<0,05)

138

Al agruparlos de esta forma también se observó también que la reducción fue

significativamente mayor (p<0,05) en la PAS en las mujeres (10,5 mmHg) en

comparación con la de los hombres (5 mmHg), según se muestra en el Anexo 12.

Estudios epidemiológicos han demostrado que una disminución de PAS y PAD de 5

mmHg puede llevar a una disminución en la incidencia de enfermedades

cardiovasculares del 7% y 16%, respectivamente (Xu et al., 2008; Fluegel et al.,

2010).

Por lo tanto, a pesar de que la suplementación con hidrolizado de lactosuero de

demostrada actividad IECA in vitro, no manifestó actividad in vivo en la concentración

evaluada, la reducción en la presión arterial obtenida en el presente estudio, indica

que el consumo regular de yogurt de leche de cabra puede tener un impacto positivo

en la reducción del riesgo de enfermedades cardiovasculares.

139

CAPÍTULO IV

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 4.1. Conclusiones En el presente trabajo, los hidrolizados de lactosueros bovinos y caprinos

demostraron tener actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina

(ECA), lográndose identificar péptidos potencialmente responsables de dicha

actividad.

Estos hidrolizados bioactivos pudieron ser obtenidos a nivel de planta piloto

aplicando un proceso de termocoagulación, cuyas características tecnológicas lo

hacen accesible para el pequeño y mediano productor.

La aplicación de la proteasa de A. oryzae, en combinación con la fermentación

ácido-láctica, en la hidrólisis de los lactosueros bovinos y caprinos, demostró ser

efectiva en la liberación de péptidos antihipertensivos, sin el amargor característico

de los hidrolizados proteicos.

El ingrediente funcional desarrollado con lactosuero caprino pudo ser incorporado

efectivamente en la formulación de un yogurt natural funcional.

Se aprovechó la capacidad antioxidante de la mermelada de la fruta del tomate de

árbol C. betacea Sendt. para incrementar esa bioactividad en el yogurt natural de

leche de cabra, lográndose al mismo tiempo una mejora significativa en su

aceptabilidad.

A pesar de la demostrada actividad IECA in vitro del yogurt funcional de leche de

cabra desarrollado en el presente trabajo, la dosificación seleccionada de 224

140

mg/día para el ensayo clínico no resultó ser efectiva en la reducción de la presión

arterial de pacientes hipertensos. Sin embargo, el estudio clínico demostró que el

consumo de yogurt de leche de cabra redujo tanto la presión arterial sistólica como

la diastólica, pudiendo constituir una importante ayuda en el control de la

hipertensión.

4.2. Recomendaciones Determinar la concentración efectiva de péptidos en el hidrolizado de lactosuero

para obtener una actividad IECA in vivo.

Establecer mejoras en la fabricación de la mermelada de tomate de árbol para

aumentar su vida útil.

Realizar estudios para comprobar la actividad antihipertensiva mostrada por el

yogurt natural de leche de cabra, determinar el agente responsable y si puede ser

sujeto a manipulación para aumentar de manera controlada su actividad.

Desarrollar proceso artesanal para obtener extracto de la proteasa de A. oryzae

como medida para reducir los costos de este producto que actualmente solo se

consigue en el país por importación.

141

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Zulueta, A., Maurizi, A., Frígola, A., Esteve, M., Coli, R., and Burini, G. (2009a). Antioxidant capacity of cow milk, whey and deproteinized milk. Int. Dairy J. , 19, 380-385.

156

Anexo1a

Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,694915 p =,0580

1 2 3

1

0,447214 1,788854

2 0,447214

2,236068

3 1,788854 2,236068

Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)

variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265

1 2 3

1

1,341641 1,341641

2 1,341641

2,683282

3 1,341641 2,683282

Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)


1 2 3

1

2,086997 1,937926

2 2,086997

0,149071

3 1,937926 0,149071

Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping) variable:

Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,322034 p =,0257

1 2 3

1

1,341641 2,683282

2 1,341641

1,341641

3 2,683282 1,341641

Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)


1 2 3

1

1,341641 2,683282

2 1,341641

1,341641

3 2,683282 1,341641

Multiple Comparisons z' values; Densidad (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)


1 2 3

1

2,608746 1,416176

2 2,608746

1,192570

3 1,416176 1,192570

157

Anexo1b

Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265

1 2 3

1

2,683282 1,341641

2 2,683282

1,341641

3 1,341641 1,341641

Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)


1 2 3

1

2,683282 1,341641

2 2,683282

1,341641

3 1,341641 1,341641

Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)


1 2 3

1

2,086997 0,596285

2 2,086997

1,490712

3 0,596285 1,490712

Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)


1 2 3

1

2,683282 1,341641

2 2,683282

1,341641

3 1,341641 1,341641

Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)


1 2 3

1

2,683282 1,341641

2 2,683282

1,341641

3 1,341641 1,341641

Multiple Comparisons z' values; Densidad (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)


1 2 3

1

2,236068 1,788854

2 2,236068

0,447214

3 1,788854 0,447214

158

Anexo1c

Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero vaca completo) Independent (grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,322034 p =,0257

1 2 3

1

1,341641 1,341641

2 1,341641

2,683282

3 1,341641 2,683282

Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis suero vaca completo) Independent

(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,467787 p =,0650

1 2 3

1

0,149071 2,086997

2 0,149071

1,937926

3 2,086997 1,937926

Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero vaca completo) Independent


1 2 3

1

1,341641 1,341641

2 1,341641

2,683282

3 1,341641 2,683282

Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero vaca completo) Independent


1 2 3

1

1,341641 1,341641

2 1,341641

2,683282

3 1,341641 2,683282

Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero vaca completo) Independent


1 2 3

1

1,341641 1,341641

2 1,341641

2,683282

3 1,341641 2,683282

159

Anexo1d

Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero cabra completo) Independent (grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265

1 2 3

1

2,683282 1,341641

2 2,683282

1,341641

3 1,341641 1,341641

Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis suero cabra completo) Independent


1 2 3

1

1,341641 1,341641

2 1,341641

2,683282

3 1,341641 2,683282

Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero cabra completo) Independent


1 2 3

1

2,236068 1,788854

2 2,236068

0,447214

3 1,788854 0,447214

Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero cabra completo) Independent


1 2 3

1

2,683282 1,341641

2 2,683282

1,341641

3 1,341641 1,341641

Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero cabra completo) Independent


1 2 3

1

1,341641 2,683282

2 1,341641

1,341641

3 2,683282 1,341641

160

Anexo1e Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero vaca descremado) Independent


1 2 3 1 1,490712 2,310604 2 1,490712 0,819892 3 2,310604 0,819892

Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero vaca descremado) Independent (grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,384615 p =,0249

1 2 3 1 1,341641 2,683282 2 1,341641 1,341641 3 2,683282 1,341641

Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero vaca descremado) Independent


1 2 3 1 1,341641 2,683282 2 1,341641 1,341641 3 2,683282 1,341641

Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero vaca descremado) Independent


1 2 3 1 1,341641 2,683282 2 1,341641 1,341641 3 2,683282 1,341641

161

Anexo1f

Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero cabra descremado) Independent (grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,581921 p =,0614

1 2 3

1

2,161532 0,298142

2 2,161532

1,863390

3 0,298142 1,863390

Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero cabra descremado) Independent


1 2 3

1

2,683282 1,341641

2 2,683282

1,341641

3 1,341641 1,341641

Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero cabra descremado) Independent


1 2 3

1

2,161532 0,298142

2 2,161532

1,863390

3 0,298142 1,863390

Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero cabra descremado) Independent


1 2 3

1

2,161532 0,298142

2 2,161532

1,863390

3 0,298142 1,863390

162

Anexo 2 - Tabla del análisis ANOVA para la variable dependiente GH. Se obtuvo un

R2= 0,83052 con un error por falta de ajuste no significativo (P>0,01).

SS df MS F p

Blocks 0,604 2 0,3022 0,1108 0,895691

(1)pH (L) 457,985 1 457,9851 167,9965 0,000000

pH (Q) 4,117 1 4,1172 1,5102 0,234927

(2)T (L) 233,028 1 233,0281 85,4785 0,000000

T (Q) 63,865 1 63,8654 23,4269 0,000131

(3)E/S(L) 92,866 1 92,8657 34,0647 0,000016

E/S(Q) 4,196 1 4,1958 1,5391 0,230679

(4)t (L) 517,079 1 517,0792 189,6732 0,000000

t (Q) 103,899 1 103,8990 38,1119 0,000008

1L by 2L 357,248 1 357,2480 131,0444 0,000000

1L by 3L 5,929 1 5,9291 2,1749 0,157556

1L by 4L 71,859 1 71,8586 26,3589 0,000070

2L by 3L 33,117 1 33,1170 12,1479 0,002641

2L by 4L 9,092 1 9,0915 3,3349 0,084459

3L by 4L 4,973 1 4,9730 1,8242 0,193555

Falta de ajuste 355,084 58 6,1221 2,2457 0,029884

Error Puro 49,071 18 2,7262

Total SS 2384,656 92

163

Anexo 3a - Tabla del análisis ANOVA análisis factoria 23 para resultados IECA

Univariate Tests of Significance for IACE (Spreadsheet1 in IACE suero menor 3kDa)Sigma-restricted parameterizationEffective hypothesis decomposition

EffectSS Degr. of

FreedomMS F p

Intercept"T1""T2""T3""T1"*"T2""T1"*"T3""T2"*"T3""T1"*"T2"*"T3"Error

125199,1 1 125199,11055,1230,0000004460,0 1 4460,0 37,587 0,00001419299,0 1 19299,0 162,643 0,00000099494,1 1 99494,1 838,492 0,0000001582,9 1 1582,9 13,340 0,0021484178,9 1 4178,9 35,218 0,00002123325,8 1 23325,8 196,579 0,0000001462,5 1 1462,5 12,325 0,0028971898,5 16 118,7

Anexo 3b - Tabla del análisis ANOVA análisis factoria 23 para resultados ORAC

Univariate Tests of Signi ficance for ORAC (Spreadsheet1 in IACE suero menor 3kDa)Sigma-restricted parameterizationEffective hypothesis decomposition

EffectSS Degr. of

FreedomMS F p

Intercept"T 1""T 2""T 3""T 1"*"T2""T 1"*"T3""T 2"*"T3""T 1"*"T2"*"T3"Error

4,431582 1 4,431582 3841,441 0,0000000,069445 1 0,069445 60,197 0,0000010,101010 1 0,101010 87,559 0,0000000,001305 1 0,001305 1,132 0,3032380,276705 1 0,276705 239,857 0,0000000,059302 1 0,059302 51,405 0,0000020,001395 1 0,001395 1,210 0,2876930,000273 1 0,000273 0,237 0,6330040,018458 16 0,001154

164

Anexo 4 Coeficientes y R2 de las ecuaciones de la recta (y=ax+b) obtenidas en ensayo IECA para cálculo

de los IC50

muestra a b R2 IC50 ( g/mL)

1-1 20,858 0,0535 0,9637 10,96

1-2 21,117 -0,5135 0,9637 10,94

1-3 18,699 7,4944 0,937 9,71

2-1 22,312 9,5732 0,9407 6,12

2-2 19,539 16,79 0,94 5,47

2-3 20,536 14,151 0,9643 5,73

3-1 18,364 6,5051 0,9784 10,68

3-2 17,748 7,9902 0,9915 10,67

3-3 18,765 5,0215 0,9837 10,99

4-1 18,919 21,672 0,9791 4,47

4-2 19,235 20,415 0,984 4,66

4-3 16,146 28,963 0,9918 3,68

5-1 20,637 -54,116 0,9973 155,26

5-2 20,666 -55,593 0,9867 165,59

5-3 18,655 -42,096 0,8559 139,32

6-1 18,016 -24,807 0,9691 63,58

6-2 19,756 -34,311 0,942 71,35

6-3 17,915 -24,396 0,9853 63,61

7-1 17,577 -27,966 0,9721 84,41

7-2 17,984 -31,688 0,958 93,90

7-3 18,134 -30,697 0,9732 85,63

8-1 21,680 -70,22 0,9908 256,01

8-2 21,406 -68,436 0,9929 252,86

8-3 19,003 -51,414 0,9292 207,83

165

229.9

263.9

359.9 441.0

545.1

585.1 643.1

720.2

788.2

833.3

877.3

950.3

988.3

1131.3

1167.3

1264.4

1421.4

1591.6

1664.4 1751.7

2066.32147.7

+MS, 16.8-63.5min #(347-1423)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 m/z

230.0

360.0

390.9

515.0

611.1

681.2

710.1

779.2

843.2

919.2

1005.3

1108.3

1215.31264.5

1375.5

1454.4

1572.6

1814.4 1870.1

1056.3

1090.3

+MS, 10.5-62.6min #(204-1386)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

Anexo 5 – Espectros de masa compuestos de ocho tratamientos de hidrólisis:

Compound mass spectrum tratamiento T1

Compound mass spectrum Tratamiento 2

166

229.9

360.0

518.0 582.1

653.2

706.1

778.1

843.2

877.3

935.3

970.2

1005.3

1070.4

1114.2

1167.3

1215.4

1264.5

1344.4

1377.4

1429.5

1506.5 1591.6

1687.7 1790.61839.2 2012.3 2069.3

761.1

1017.3

+MS, 17.4-61.8min #(360-1392)

0

1

2

3

4

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

Anexo 5 – continuación.



229.9

263.9

309.0355.0

496.1

658.2

730.2

760.2

830.2

877.4

948.4

986.3

1039.3

1110.4

1211.4

1265.51375.5

1486.6

1689.7

2133.5

1465.4

229.9

+MS, 17.4-61.9min #(360-1389)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

167




229.9

360.0 439.1 546.1 603.1

756.3

806.3

887.4

927.3

1001.4

1041.4

1103.5

1158.4

1211.51259.5

1325.5

1427.51466.5

1526.7

229.9

324.1

+MS, 17.4-61.8min #(360-1395)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

229.9

262.9

360.0

392.0

439.1

497.1

546.2

617.2

654.2

701.2756.3

786.3

855.4

932.3

1005.4

1070.4

1103.5

1210.5

1258.5

1292.5

1333.5

1429.6

1566.71680.7

1839.7 1939.32132.9

916.3860.3

+MS, 17.3-61.9min #(360-1410)

0

2

4

6

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

168




229.9

461.8624.2

715.2773.3

900.4

1017.4

1070.5

1232.5

1270.6

1340.5

1446.5

1502.51591.7 1767.7

229.9

276.0

+MS, 17.4-61.9min #(360-1407)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

439.1546.2

583.3

696.3 756.3

806.3

887.4

927.3

1001.5

1041.4

1103.51158.5

1259.5

1325.5 1426.6

1504.7

569.1

698.2

+MS, 17.4-61.8min #(360-1403)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

169

Anexo 6 – Tabla ANOVA diseño factorial 23 de la distribución de masas de los cinco picos mas abundantes en los espectrosgramas HPLC-MS-MS de los ocho tratamientos de hidrolizados

Univariate Tests of Significance for Masa (Spreadsheet1 in HPLCMSMS) Sigma-restricted parameterization Type III decomposition

SS Degr. of MS F p

Intercept 45048577 1 45048577 2736,114 0,000000

Tipo 73969 1 73969 4,493 0,041893

Conc 32064 1 32064 1,947 0,172470

Hidrol 5777 1 5777 0,351 0,557786

Tipo*Conc 3793 1 3793 0,230 0,634521

Tipo*Hidrol 80 1 80 0,005 0,944733

Conc*Hidrol 53049 1 53049 3,222 0,082103

Tipo*Conc*Hidrol 7439 1 7439 0,452 0,506288

Error 526862 32 16464

170

Anexo 7 PLANILLA DE EVALUACIÓN DEL CONCEPTO

Buen día: en la Planta de Leche estamos desarrollando un nuevo producto, cuya descripción sería la siguiente:

Saliste corriendo de tu casa…, no te dio tiempo de desayunar, necesitas algo rápido, nutritivo y de buen sabor… Ahora cuentas con un yogurt batido, rico en nutrientes naturales y de fácil digestión, porque es elaborado con leche pasteurizada de cabra y con una rica jalea de frutas exóticas que aportan antioxidantes…

¡Un vasito de este excelente yogurt te proveerá de la energía y las proteínas necesarias para estar alerta el resto de la mañana!

Pronto estará a la venta en un vasito de 150 g por solo BsF. 2,00

¿Comprarías este producto?

1 Definitivamente NO lo compraría______

2 Probablemente NO lo compraría______

3 Indiferente______

4 Probablemente SI lo compraría______

5 Definitivamente SI lo compraría______

RESULTADO:

TOTAL PERSONAS ENCUESTADAS: 25

Statistix 8.0

Descriptive Statistics

Variable N Mean SD C.V.

compra 25 4.1200 1.2689 30.798

Frequency Distribution of compra

Cumulative

Value Freq Percent Freq Percent

1 2 8.0 2 8.0

2 2 8.0 4 16.0

4 8 32.0 12 48.0

5 13 52.0 25 100.0

Total 25 100.0

171

Anexo 8 PLANILLA DE EVALUACIÓN (ANÁLISIS DESCRIPTIVO)

Teniendo presente lo acordado en la sesión previa donde se seleccionaron los descriptores de yogurt, favor evaluar en la siguiente muestra los atributos señalados, marcando en la línea contigua la calificación que usted le otorga.

1) HOMOGENEIDAD

2) BLANCO

3) OLOR ÁCIDO

4) SABOR ÁCIDO

5) CREMOSIDAD

POCO MUCHO

172

Anexo 9

TITULO: “Valoración de las propiedades antihipertensivas de un yogurt funcional de leche de cabra”

En primer lugar debo expresarles mi agradecimiento por su participación en el

estudio clínico. Favor completar (desarrollar respuesta o marcar con una X) la siguiente encuesta que servirá para redactar el informe final del mismo:

Nombre: _______________________________ Edad:____ Sexo: F____ M____ ¿Color de marca de la tapa del envase? Amarillo ____ Naranja____ Consumió el producto durante los 42 días del ensayo Si ____ No____ ¿Cuántos días dejó de consumirlo?: ____ explique _________________________ ____________________________________________________________________ ¿En qué momento del día consumió el producto? _______________________ ¿Siempre lo hizo en ese mismo momento? SI____ NO____ explique

________________________________________________________________ ¿Durante el ensayo, sufrió de alguna molestia estomacal? Si ____ No____ explique:

________________________________________________ ¿Le atribuye esa molestia al consumo del yogurt? Si ____ No ____ En general, ¿cómo se sintió, en su estado de salud general, durante el ensayo? Bien ____ Regular ____ Mal _____ , explique: ___________________________ __________________________________________________________________ Su apreciación del producto en general, favor indicarla en la siguiente escala: Me gustó mucho_______ Me gustó ______ Me gustó un poco______ Ni me gustó Ni me disgustó____ Me disgustó un poco____ Me disgustó _____ Me disgustó mucho ______ Si el producto sale a la venta, con un rango de precio entre Bs 15 y 25: Definitivamente lo compraría _______ Posiblemente lo compraría ______ Posiblemente no lo compraría_______ Definitivamente no lo compraría ______ Comentario personal: (opcional) __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

173

Anexo 10 PLANILLA PARA PRUEBA TRIANGULAR Instrucciones:

1. Se le presentan 02 series de 03 muestras cada una. Favor PRUEBE CADA SERIE POR

SEPARADO.

2. Cada serie contiene DOS muestras IGUALES y UNA muestra DIFERENTE.

3. Pruébelas en el orden en que se le indica

4. Favor MARQUE CON UNA X LA MUESTRA DIFERENTE EN CADA SERIE.

5. Asegúrese de enjuagarse la boca entre cada muestra.

SERIE 1 654 230 895 SERIE 2 151 295 301

Observaciones:__________________________________________________

__________________________________________________________ Nombre:_________________________________ fecha: ________________ LOS CÓDIGOS EMPLEADOS PARA LAS MUESTRAS FUERO: CON HIDROLIZADO: 230, 895, 301, 682. SIN HIDROLIZADO: 742, 654, 151, 295. ORDEN DE PRESENTACIÓN A LOS PANELISTAS(serie 1-serie 2): BAB-BAA, ABA-ABB, AAB-ABB, AAB-BAB, BAA-BAB, AAB-BBA, BBA-ABA.

174

Anexo 11 Análisis estadístico (t-student) Comparación entre grupo tratamiento (1) y placebo (2) el primer día de toma de presión arterial:

T-tests; Grouping: grupo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1

Mean 2 Mean 1 t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p

PAS 138,91 136,47 1,2649 85 0,209 36 51 9,30 8,57 1,177 0,587 0,536 85 0,465

PAD 89,61 86,27 2,540 85 0,012 36 51 5,14 6,58 1,638 0,127 7,712 85 0,0067

Comparación entre grupo tratamiento (1) y placebo (2) el último día de toma de presión arterial:

T-tests; Grouping: grupo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1


PAS 130,05 130,35 -0,136 85 0,891 36 51 10,73 9,50 1,27 0,423 0,467 85 0,495

PAD 83,61 81,72 1,913 85 0,0591 36 51 4,606 4,47 1,0606 0,836 0,095 85 0,758

Comparación dentro del grupo tratamiento, entre el primer día (1) y el último (3) de toma de presión

arterial:

T-tests; Grouping: DTT (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 1 Group 2: 3


PAS 136,47 130,35 3,4126 100 0,0009 51 51 8,575 9,505 1,228 0,469 0,4636 100 0,4975

PAD 86,27 81,72 4,0810 100 0,00009 51 51 6,585 4,472 2,167 0,0071 8,5032 100 0,0043

Comparación dentro del grupo placebo, entre el primer día (1) y el último (3) de toma de presión

arterial:



PAS 138,91 130,05 3,741 70 0,0003 36 36 9,305 10,73 1,33 0,401 0,343 70 0,559

PAD 89,61 83,61 5,213 70 0,000002 36 36 5,145 4,606 1,247 0,516 0,620 70 0,433

Integrando los datos de todos los participantes, comparación del primer día (1) con el último (3) de

toma de presión arterial:



PAS 137,48 130,22 5,06 172 0,000 87 87 8,914 9,97 1,25 0,299 0,870 172 0,352

PAD 87,65 82,50 6,21 172 0,000 87 87 6,222 4,60 1,83 0,0054 3,446 172 0,0650

175

Anexo 12 EFECTO SEXO

MUJERES: INICIO vs FINAL


Mean INICIO

Mean FIN

t-value df p Va lid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p

PAS 136,25 125,77 4,271 70 0,00006 36 36 11,11 9,630 1,332 0,399 1,163 70 0,2844

PAD 86,61 81,94 2,975 70 0,0040 36 36 8,25 4,522 3,328 0,001 10,911 70 0,0015

HUBO REDUCCIÓN SIGNIFICATIVA TANTO DE LA PAS (10,5 mm de Hg) reducción de COMO DE LA PAD (4,7 mm de Hg).

HOMBRES: INICIO vs FINAL


Mean INICIO Mean FIN t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p

PAS 138,35 133,37 3,118 100 0,002 51 51 6,947 9,046 1,695 0,064 1,546 100 0,2165

PAD 88,39 82,90 6,257 100 0,000 51 51 4,195 4,652 1,229 0,467 0,790 100 0,376

HUBO REDUCCIÓN SIGNIFICATIVA TANTO DEL PAS ( 5 mm de Hg) COMO DE LA PAD ( 5,5 mm de Hg).

COMPARACIÓN EL DÍA INICIAL ENTRE HOMBRES vs MUJERES

T-tests; Grouping: sexo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1

Mean MUJERES

Mean HOMBRES t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p

PAS 136,25 138,35 -1,084 85 0,281 36 51 11,118 6,947 2,560 0,002 12,063 85 0,0008

PAD 86,61 88,39 -1,320 85 0,190 36 51 8,250 4,195 3,867 0,000 18,004 85 0,0001

NO HAY DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS EN LAS PAS y PAD ENTRE HOMBRES Y MUJERES AL INICIO DEL ENSAYO

COMPARACIÓN EL DÍA FINAL ENTRE HOMBRES vs MUJERES

T-tests; Grouping: sexo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1

Mean MUJERES

Mean HOMBRES

t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p

PAS 125,77 133,37 -3,754 85 0,0003 36 51 9,630 9,046 1,133 0,675 0,711 85 0,401

PAD 81,94 82,90 -0,956 85 0,3416 36 51 4,522 4,652 1,058 0,870 0,022 85 0,882

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