Tesis de Grado Debanano en Etanol
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tad OBTENCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE BANANO DE RECHAZO POR ACCIÓN DE Zymomonas mobilis. JUAN FELIPE CANO PALACIO CARLOS ANDRÉS NARANJO MERINO Trabajo Dirigido de Grado presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniero Químico. Director: MARTA CECILIA MEJÍA LAVERDE I.Q UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
Transcript of Tesis de Grado Debanano en Etanol
tad
OBTENCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE BANANO DE RECHAZO POR ACCIÓN DE
Zymomonas mobilis.
JUAN FELIPE CANO PALACIO
CARLOS ANDRÉS NARANJO MERINO
Trabajo Dirigido de Grado presentado
como requisito parcial para optar al
título de Ingeniero Químico.
Director: MARTA CECILIA MEJÍA LAVERDE
I.Q
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MEDELLÍN
FACULTAD NACIONAL DE MINAS
Medellín, 2002
NOTAS DE ACEPTACIÓN
Primer Jurado
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Fecha ______________________________ Jurado _____________________________.
Segundo Jurado
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Fecha ______________________________ Jurado _____________________________.
DEDICATORIA
ii
A nuestros Padres, por todo su apoyo
Juan Felipe y Carlos Andrés
AGRADECIMIENTOS
iii
Los autores expresan sus agradecimientos:
A MARTA CECILIA MEJÍA LAVERDE. I.Q. Profesora Asociada a la Universidad Nacional
Sede Medellín y Directora del Trabajo de Grado.
A OLGA INES MONTOYA C, Microbiologa. M.Sc. Directora del Laboratorio de
Microbiología de la Universidad Nacional Sede Medellín.
A CARLOS GAVIRÍA. Tec.Qco. Encargado del Laboratorio de Alimentos Universidad
Nacional Sede Medellín.
AL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOTECNOLOGICAS (CIBIOT) Universidad
Pontificia Bolivariana – Medellín.-
A todas aquellas personas que en una u otra forma colaboraron en la realización del
presente trabajo.
iv
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
LISTA DE TABLAS viii
LISTA DE FIGURAS x
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
INTRODUCCIÓN 2
1. MARCO TEÓRICO 4
1.1 MATERIA PRIMA 4
1.1.1. El banano de rechazo como materia prima 51.1.2 Características del banano 61.1.3 Producción de banano en Colombia 101.1.4 Generalidades sobre el almidón y el almidón de banano 14
1.2 TRATAMIENTO DE LA MATERIA PRIMA 15
1.2.1 Hidrólisis ácida 151.2.2 Hidrólisis enzimática 161.2.3 Reseña bibliográfica sobre hidrólisis de banano 17
1.3 FERMENTACIÓN 21
1.4 MICROORGANISMO 22
1.4.1 Antecedentes históricos 221.4.2 Taxonomía 231.4.3 Catabolismo 241.4.4 Efectos de ciertos parámetros fisicoquímicos sobre el crecimiento y la producción de etanol por Zymomonas mobilis 291.5 ASPECTOS TECNOLÓGICOS DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL por Zymomonas mobilis 34
1.5.1 Medio de cultivo 351.5.2 Ventajas y desventajas de la fermentación batch
v
y continua utilizando Zymomonas mobilis 38
1.6 ALCOHOL ETÍLICO 39
1.6.1 Generalidades 391.6.2 Aplicaciones del alcohol etílico 391.6.3 Formas comerciales de etanol 40
1.7 PROCESO FERMENTATIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE ALCOHOL. PARÁMETROS QUE SE DEBEN TENER EN CUENTA 41
1.7.1 Descripción del proceso general partiendo de una fuente de carbono, en este caso el hidrolizado 411.7.2 Revisión bibliográfica sobre la producción de alcohol 42
2. DESARROLLO EXPERIMENTAL 47
2.1 DESCRIPCIÓN DEL PROCESO DE HIDRÓLISIS 47
2.1.1 Caracterización de la materia prima 482.1.2 Hidrólisis 50
2.2 PROCESO FERMENTATIVO 54
2.2.1 Materiales y métodos 552.2.2 Fermentación 57
2.3 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 63
2.4 COMPARACIÓN CON LOS RESULTADOS REPORTADOS PARA Saccharomyces cerevisiae 66
3. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 69
BIBLIOGRAFÍA 72
ANEXOS
ANEXO 1. Determinación de azúcares totales 79
ANEXO 2. Determinación de azúcares reductores 79
vi
ANEXO 3. Determinación de contenido de almidón 81
ANEXO 4. Determinación de biomasa 83
ANEXO 5. Fundamentos de los métodos de determinación de biomasa 86
ANEXO 6. Determinación de alcohol 87
ANEXO 7. Coloración de Gram 88
vii
LISTA DE TABLAS
TABLA Pág.
1. Clasificación botánica del banano 7
2. Composición en porcentaje de una banana verde 7
3. Composición promedio de la harina de banano verde de rechazo (Urabá) 8
4. Referencias bibliográficas de diferentes composiciones químicas
de banano 9
5. Color de la cáscara de banano en diferentes etapas de maduración 10
6. Referencias bibliográficas de diferentes hidrólisis de banano 19
7. Características fenotípicas del género Zymomonas 24
8. Parámetros cinéticos en condiciones anaeróbicas para la
Zymomonas mobilis 33
9. Medios de mantenimiento, crecimiento y fermentación para la
Zymomonas mobilis 37
10. Referencias bibliográficas de diferentes fermentaciones alcohólicas
a partir de banano 46
11. Azúcares reductores contenidos en la materia prima 49
12. Determinación de azúcares totales 49
13. Hidrólisis Ácida con ácido sulfúrico 51
viii
14. Hidrólisis Enzimática 53
15. Métodos de desinfección 56
16. Medio de fermentación óptimo seleccionado 57
17. Determinación de nutrientes en el jugo hidrolizado 58
18. Datos obtenidos en el proceso de fermentación 60
19. Productividad y rendimientos de la fermentación 63
20. Comparación de Z.mobilis y S.cerevisiae en la producción de alcohol 67
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURAS Pág.
1. Procesos de obtención de etanol 5
2. Arriero 6
3. Trabajo de selección en finca bananera 11
4. Cultivos de banano Zona de Urabá 12
5. Cadena de Lavado y Empaque 13
6. Clúster de banano 13
7. Sigatoka Negra 14
8. Fermentadores industriales 21
9. Zymomonas mobilis vista al microscopio 22
10. Zymomonas mobilis vista al microscopio II 23
11. Metabolismo de sacarosa, glucosa y fructosa en la Zymomonas mobilis 25
12. Ciclo del gas Carbónico producido por el Bioetanol 40
13. Diagrama de flujo 47
14. Jugo de banano diluido 49
15. Centrifugación del jugo de banano 50
16. Hidrólisis Ácida del jugo de banano 51
x
17. Jugo de banano hidrolizado 52
18. Diagrama de flujo del proceso fermentativo 54
19. Fermentación del jugo de banano hidrolizado 59
20. Cinética de la fermentación de hidrolizado de banano verde
por acción de Zymomonas mobilis 61
21. Microdestilación del etanol 88
xi
RESUMEN
Se propone la utilización de banano verde de rechazo de la zona de Urabá (Colombia)
como un sustrato de bajo costo para la producción de etanol por acción de Zymomonas
mobilis
La harina de banano se somete a hidrólisis ácida y enzimática de los almidones,
escogiéndose la ácida con un rendimiento del 67% en la conversión de almidones a
glucosa, que es la fuente de carbono para el microorganismo.
Del trabajo experimental se concluye que la Zymomonas mobilis NRRLB14022 produce
41.86 g/L de etanol en jugo de banano verde hidrolizado a partir de 100 g/L de glucosa
inicial con adición de pequeñas cantidades de suplementos nutricionales y sin regulación
de pH. Obteniéndose un rendimiento de 0.47 gramos de etanol por gramo de glucosa, lo
que corresponde a un 95% de la productividad teórica; mientras que la levadura
Saccharomyces cerevisiae, reporta rendimientos de hasta un 90% de la productividad
teórica.
Estos resultados sugieren que este jugo hidrolizado de banano verde puede ser usado
como un sustrato de bajo costo para la producción de etanol, disminuyendo la
contaminación causada por el banano de rechazo.
1
INTRODUCCIÓN
La crisis energética que comenzó en 1973 disminuyó la oferta de petróleo e incrementó su
precio en forma exorbitante. Esto obligó a los países en desarrollo a reducir o retrasar
importantes programas de desarrollo para poder adquirir el petróleo que necesitan para
mantener la marcha de sus economías. Se planteó la urgente necesidad de encontrar y
desarrollar fuentes alternativas de energía, tales como otros combustibles fósiles (carbón,
gas), energía nuclear o recursos energéticos renovables.
El carbón se encuentra en su mayoría en los países industrializados, constituyendo las
reservas de América Latina y Africa menos del uno por ciento del total mundial, por lo que
resulta improbable que esta parte del Tercer Mundo pueda utilizar grandes cantidades de
carbón. La alternativa nuclear resulta inconveniente; el riesgo de accidentes, la
disposición de desechos radiactivos, el terrorismo nuclear y la proliferación de armas
nucleares son peligrosos de por sí, y hacen que esta forma de energía resulte demasiado
costosa (Brown, et al. sin fecha). Más aún, la adquisición de energía nuclear del mundo
industrializado produciría una mayor dependencia tecnológica y económica con respecto
a los países desarrollados. Una alternativa más factible para el petróleo, el carbón y los
reactores nucleares en los países en desarrollo es la utilización directa e indirecta de la
energía apartir de biomasa, que es renovable, abundante, descentralizada y no
contaminante.
Teniendo en cuenta que la tecnología necesaria para el aprovechamiento de los recursos
energéticos renovables es simple y relativamente económica, es importante desde un
punto de vista estratégico que la planificación energética en los países del Tercer Mundo,
particularmente los del trópico húmedo, se oriente al desarrollo de la alternativa de
combustibles renovables, ya que ésta constituye una de las pocas oportunidades de
alcanzar un desarrollo independiente de los países industrializados. Con este fin, la
planificación energética deberá también estimular la conservación de la energía, y
2
optimizar el uso de los subproductos y residuos orgánicos generados por las actividades
económicas y domésticas
El etanol, también llamado alcohol etílico o simplemente alcohol, se fabrica mediante un
proceso de síntesis a partir del etileno, o de fermentación de sustancias amiláceas y
glucídicas. Actualmente, el uso del alcohol se ha ampliado de la destilación de bebidas
espirituosas al sector de las industrias química, farmacéutica y de cosméticos. El etanol
se produce biotecnologicamente a partir de la caña de azúcar y el maíz, pero también
puede obtenerse de la yuca, la madera y otras sustancias. La caña de azúcar sólo
necesita tratamiento físico; la yuca requiere además un tratamiento térmico y enzimático,
mientras que la madera requiere un tratamiento termoácido y neutralización hidrolizada.
La fermentación se realiza con microorganismos los cuales segregan enzimas
específicas para la fragmentación de las hexosas y otros azúcares simples. La sustancia
resultante se destila para producir el etanol puro quedando como residuo una forma de
vino. Un microorganismo, Zymomonas mobilis, a despertado un gran interés en la
comunidad biotecnologica del mundo por su alta velocidad de fermentación. [Favela,
1993]
Además recientes trabajos con Zymomonas mobilis a partir de biomasa reportan
excelentes resultados en la obtención de etanol, con amplias ventajas sobre otros
microorganismos; haciéndola muy atractiva para su utilización a escala industrial.
[Kondo,1996; Laplace, 1991; Doelle, 1990].
En el caso de nuestro trabajo se propone la obtención de etanol a partir de la
fermentación de banano de rechazo (el cual es causa de un gran daño ecológico en el
país) como sustrato, por la acción de Zymomonas mobilis. Se trata de un estudio a escala
de laboratorio en proceso discontinuo.
Durante la realización del trabajo se encontraron dificultades en encontrar el medio optimo
de crecimiento, mantenimiento y fermentación de la Zymomonas mobilis, ya que en el,
manejo de la cepa con los medios de nutrición recomendados, la bacteria presentaba
bajo crecimiento, se moría, o crecía demasiado lento, además de que en ocasiones se
presentaron situaciones de estrés. Se requirió de un arduo trabajo en el laboratorio de
Microbiología de la Universidad y de mucha asesoría de parte del encargado de este,
3
debido a que la Zymomonas mobilis se contaminaba y mutaba fácilmente a pesar de los
cuidados que se tenían.
1. MARCO TEÓRICO
En general con un apropiado pretratamiento varias formas de biomasa pueden servir
como sustratos para una fermentación alcohólica, por ejemplo remolacha, caña de
azúcar, cereales como trigo, maíz, arroz, etc.
El proceso global de obtención de etanol a partir de biomasa puede dividirse en las
siguientes etapas: [Llinares,1983; Glazer, 1995].
- Pretratamiento de la materia prima.
- Hidrólisis o sacarificación.
- Fermentación.
- Separación y purificación de etanol.
Este esquema es solo general, ya que hay procesos en que la hidrólisis resulta
innecesaria, por encontrarse los azucares ya libres, y otros, en que dicha hidrólisis tiene
lugar simultáneamente a la fermentación. En la Fig. 1 se presenta un flujograma que
describe la conversión de varios tipos de materia prima en alcohol.
1.1 MATERIA PRIMA
Cualquier producto que posea en su estructura interna azúcares o carbohidratos
fácilmente transformables a azucares puede ser fermentado para la obtención de etanol.
El alcohol etílico puede elaborarse a partir de tres tipos de materias primas:
- Materiales azucarados: Donde los carbohidratos aparecen como azúcares (remolacha,
caña de azúcar, melazas de caña y sorgo, etc).
4
FIGURA 1. Procesos de obtención de etanol
- Materiales amiláceos: Incluye los cereales y algunos tubérculos en los cuales los
carbohidratos aparecen como almidón e insulina. Entre estos figuran trigo, cebada,
arroz, yuca, maíz, centeno, etc.
- Materiales celulósicos: Comprende la madera y residuos de agricultura como cortezas
y troncos de hortalizas.
1.1.1 El banano de rechazo como materia prima
El banano es uno de los principales cultivos comestibles y produce una gran cantidad de
alimento por área plantada; así una plantación bien administrada produce mas de 75000
Lb de fruta verde por área, equivalente a 84000 Kg por ha. [Bowman, 1979].
Cosechas de caña
de azúcar
Pretratamiento mecánico
Fermentación Destilación y deshidratación
Etanol anhidro
Almidones Pretratamiento mecánico
Gelatinización Hidrólisis enzimática
Fermentación Destilación y deshidratación
Etanol anhidro
Celulosa Pretratamiento mecánico
Pretratamiento químico o biológico
Hidrólisis enzimática
Hidrólisis ácida
Hidrólisis y fermentación simultáneas
Fermentación Destilación y deshidratación
Etanol anhidro
Hidrólisis ácida
Azúcares como
sacarosa
Pretratamiento mecánico
Fermentación Destilación y deshidratación
Etanol anhidro
Hidrólisis ácida o
enzimática
5
Debido a las exigencias cargadas al fruto de exportación, en Colombia se rechazan en
promedio el 20 % de la producción anual (200.000 Ton/año aprox.) convirtiéndose así en
un problema de contaminación ambiental en las regiones de producción, tal es el caso de
la región del Urabá antioqueño. Este banano gracias a su contenido de almidón y de
azúcares fermentables puede ser aprovechado para la producción de etanol.
1.1.2 Características del banano
Historia
La historia del banano se remonta a relatos literarios antiguos de China, Grecia, Roma y
pueblos de oriente; llegando a ser importante en la alimentación de la población.
[Revista del Instituto colombiano de Normas Técnicas, 1993]
Los mercaderes portugueses en su paso
por China hace más de 500 años,
encontraron un sitio sembrado de Banano
en la costa de Guinea y fueron los
encargados de propagar el cultivo,
respetando su nombre original – Banano –
palabra de origen sánscrito “Fruta de los
sabios “, “manjar de los dioses”, “bendición de dios”, “fruta del
paraíso” y muchas otras expresiones, dan cuenta de la
importancia del banano en la
FIGURA 2. Arriero alimentación del hombre a través de los tiempos. [Revista del
Instituto colombiano de Normas Técnicas. 1993]
Clasificación botánica
Banano (Musa sapientum)
6
Nombres vulgares: banano, banana, plátano nuevo. La Clasificación botánica
comúnmente aceptada, para el banano es la que figura en el sistema de Engler:
TABLA 1. Clasificación Botánica del banano. [Fonseca, 1992]
División Espermatofitas
Subdivisión Angiosperma
Clase Monocotiledóneas
Orden Excitaminales
Familia Musáceas
Sub-familia Musoideas
Genero Musa
Composición química
Un banano pesa entre 100 y 200 gramos, contiene alrededor del 60% en pulpa comestible
la cual es, por lo general de color blanco o marfil fuerte, ligeramente pastosa, de fácil
digestión y valor nutritivo de primer orden. Está formado de agua, almidón, azúcares,
celulosa y pequeñas cantidades de gomas, resinas, taninos, dextrinas, albuminoides y
sustancias minerales. [Revista del Instituto colombiano de Normas Técnicas, 1993].
En la Tabla 2 se presenta la composición promedia en porcentaje para una banana verde
de 100 g de peso. [Males, 1979; Botero, 1993].
TABLA 2. Composición en porcentaje de una banana verde.
Agua 69.00%
Almidón 14.00%
Azúcares totales 14.00%
Celulosa 1.20%
Cenizas 0.76%
7
Sustancias Intermedias 1.04%
La composición promedio de la harina de banano verde de rechazo de la zona de Urabá
incluyendo su cáscara es: [Bayona, 1989].
TABLA 3. Composición promedio de la harina de banano verde de rechazo. (Urabá)
Componente Humedad Proteínas Grasa Fibra Carbohidratos
% 13.7 3.5 0.5 1.0 78.6
Para información mas detallada ver Tabla 4.
Cambios físicos
En general, el cambio del color del banano se debe a una reducción en el contenido de
clorofila, con escasa o ninguna formación de carotenoides.
El proceso de maduración del banano ha sido clasificado en ocho etapas consecutivas, de
acuerdo con el color de la cáscara como se observa en la Tabla 5.
8
TABLA 4. Referencias bibliográficas de diferentes composiciones químicas de banano .
Ref. 3 3 5 5 46 64 64 65 65 68Banano Maduro Harina Verde
frescoHarina Maduro Verde Maduro Verde
frescoMaduro fresco
Maduro
ComponenteHumedad 71 13.7 75.8 18.4 75.1 69.58 72.12 74.4 77.4 74.8Almidón 13.78 58.67 4 15 4 12.83 1.2-7 1.2
Azúcares totales 22 14 18.23 11.64 18.74 21.2Azúcares reductor 2.81-7.24 2.81-7.24
Azucares no reductor
4.85-6.52 4.85-6.52
Carbohidratos totales
78.6 20.25 20.5-21.5 18-20
Sacarosa 14-15 9.3 2.5 9.3Glucosa 6 5.2
Fibra 1 0.245 0.594 0.85 0.75 0.6Proteína 3.5 2 1.069 1.788 1.17 .5-2 1.2Grasas 0.1 0.5 0.43 0.3 0.3 0.43 .17-.5 0.2Cenizas 0.76 0.76 0.765 0.964 1.06 .76-1.2 0.8Taninos 0.02 0.23 0.417 20.65-
21.151.71-1.77
Celulosa 1.2 1 7 1Sustancias Intermedias
2.4
* Datos dados en porcentaje (los datos no reportados corresponden a trazas de minerales)
9
TABLA 5. Color de la cáscara de banano en diferentes etapas de maduración.
Etapa Color Cascara
0 Verde
1 Verde
2 Verde con trazas amarillas
3 Mas verde que amarillo
4 Mas amarillo que verde
5 Amarillo con una punta verde
6 Todo amarillo
7 Amarillo con manchas cafés
8 Amarillo con muchas manchas cafés
La diferencia entre la etapa cero y uno es que en la cero el banano esta recién cortado;
mientras que en la uno ya a sido expuesto a gas acetileno o etileno para maduración.
Mas información [Botero,et. al;1993].
1.1.3 Producción de Banano en Colombia
El cultivo agroindustrial de banano en Colombia con propósitos de exportación data de
1890 con 120 ha en el Magdalena.
El desarrollo bananero con fines de explotación comenzó propiamente en 1930
alcanzando en 1943 un área sembrada de 28.467 ha.
El nacimiento de la producción de banano comercial en la región de Urabá, en el
departamento de Antioquía, se dio gracias a ventajas comparativas de localización y
calidad de los suelos con respecto a otras zonas productoras en Centroamérica, y el
dinamismo en que se encontraba el mercado internacional, dieron un gran impulso al
desarrollo de este cultivo en nuestro país.
10
En los 90’s sobresalen, la ampliación de la frontera bananera, incorporación de nuevas
tecnologías al proceso de producción, y la llegada nuevamente a Urabá de empresas
multinacionales.
En Colombia la producción de banano para la exportación, está concentrada en los
municipios de Carepa, Chigorodó, Apartadó y Turbo, en el Urabá antioqueño y de
Ciénaga, Aracataca, y El Retén en el departamento de Magdalena.
FIGURA 3. Trabajo de Selección en Finca Bananera
Actualmente, se desarrolla en 42.500 ha sembradas con la variedad Cavendish
principalmente; emplea a 22.000 personas en forma directa y 64.000 más en forma
indirecta; exporta cada año alrededor de 80.000.000 de cajas, que representan ingresos
al país de US 430 millones, participando con aproximadamente el 30% del total de
exportaciones agropecuarias y con más del 3% en las exportaciones totales del país.
La calidad de la fruta colombiana y su sistema de comercialización no sólo ha llevado a
que Colombia sea el tercer país exportador de banano a nivel mundial, después de
Ecuador y Costa Rica, sino también, a que la participación de las exportaciones se hayan
mantenido en el mercado.
Las exportaciones colombianas de banano en 2000 ascendieron a 91.9 millones de cajas
de 18.14 kg por un valor de US 460.9 millones, presentando variaciones positivas del
16.18% y 11.30% en volumen y valor respecto al año de 1999.
11
El mercado hacia el cual se exportó la mayor cantidad de banano fue el europeo, a donde
se enviaron 37 millones de cajas, que representan el 40.32% del total de exportaciones,
seguido del norteamericano hacia donde se exportaron 32.7 millones de cajas.
[www.augura.com.co].
El banano de rechazo (Zona de Urabá)
Todos los países exportadores de banano producen considerables cantidades de
desperdicio debido a las exigencias de calidad. Para el banano de exportación se han
fijado normas de calidad inflexibles, acumuladas en algo más de 14 defectos que castigan
severamente la fruta.
FIGURA 4. Cultivos de Banano Zona de Urabá.
El banano es rechazado como producto exportable en tres puntos de la cadena de
actividades que constituyen esta agroindustria.
El primero de ellos es directamente en el campo, al avanzar las cuadrillas de corte
cosechando la fruta y detectar racimos que por tener más del 50% de las manos (bananos
que conforman un racimo) no aprovechables son rechazados y picados. El segundo punto
de control de calidad es en la empacadora donde la fruta se rechaza al no cumplir
especificaciones de tamaño, forma y aspecto, y por último en el embarcadero.
Durante el proceso de cosecha y empaque, significativos volúmenes de banano verde son
rechazados a diario llegándose a establecer cifras anuales que oscilan entre 200.000 a
250.000 toneladas año en 29.586 ha cultivadas. [Augura, 2001]
12
FIGURA 5. Cadena de Lavado y Empaque
De acuerdo con la información suministrada por Fundauniban, el banano de rechazo tiene
varios usos, de los cuales se pueden considerar como aprovechamiento un 50% (9%
consumo animal, 1% consumo en la población de Urabá y 40% como comercio de frutas a
otras ciudades del país). El otro restante 50% que no se aprovecha se reparte de la
siguiente forma: 10% perdidas de campo y el 40% se tira al río o potreros desocupados.
Causas de rechazo
Por regla general, las comercializadoras realizan inspecciones de calidad durante el
tiempo de embalaje y embarque. Se trata de detectar los defectos y deficiencias que se
cometen en la cosecha y proceso de empaque, que va en detrimento de la calidad.
FIGURA 6. Cluster (Manos) de banano.
13
El número de defectos se establece por “Cluster” o manos que caben generalmente de 12
a 17 por caja con un peso que puede ser de 12 a 18 kg. Para la evaluación se tienen
grados para cada defecto tomando como punto de referencia una base del 100% por cada
caja sin defecto.
- Defectos de origen mecánico antes de la cosecha
- Después de la cosecha
- En la empacadora
- Fisiológicos y Morfológicos
- Daños por clima
- Patogénicos
- Por insectos FIGURA 7. Sigatoka Negra.
- Otros: Residuo químico, Pájaros, Murciélagos.
1.1.4 Generalidades sobre el almidón y el almidón de banano
El almidón es un carbohidrato clasificado entre los polisacáridos, que se almacena en las
plantas con funciones nutritivas; presente en semillas, raíces y tubérculos. Es el principal
constituyente de muchos alimentos y la mayor fuente de energía. La unidad fundamental
del almidón es la glucosa y es el único monosacárido obtenido de la hidrólisis total del
polisacárido. El almidón se presenta en los tejidos vegetales en forma de gránulos, solo
distinguibles con un microscopio normal; cuyo tamaño y forma dependen de la especie
vegetal de la cual provenga,. [Botero et. al., 1993]
El almidón de banano presenta propiedades intermedias entre el almidón de maíz y de
papa. Los tamaños de los gránulos varían de 6 a 80 m y la mayoría está en el intervalo
de 20 a 60 m. Los intervalos de la temperatura de gelatinización son poco afectados por
los diferentes grados de maduración. Durante la maduración el almidón es degradado
rápidamente y los azúcares sacarosa, glucosa y fructosa son acumulados; trazas de
maltosa pueden estar presentes. Para mayor referencia. [Botero et. al, 1993; Taylor,
1993].
14
1.2 TRATAMIENTO DE LA MATERIA PRIMA
El almidón de banano no puede ser utilizado directamente por el microorganismo para la
producción de etanol, por lo cual se debe realizar un tratamiento para llevarlo hasta un
sustrato asimilable, el cual pueda ser desdoblado por la Zymomonas mobilis (glucosa en
este caso).
La hidrólisis tiene como finalidad la transformación de los polímeros de glucosa en
azúcares sencillos. [Llinares, et.al, 1983]. La hidrólisis de almidones para producir
azúcares, consiste en el rompimiento de los enlaces entre las moléculas de glucosa,
añadiéndose una molécula de agua por cada unidad de azúcar.
Contrariamente a las melazas, la celulosa y el almidón no pueden ser directamente
metabolizados por microorganismos, por lo que la hidrólisis de estos productos
previamente a su fermentación es necesaria.
De estudios anteriores se concluye que hay mejores resultados en la fermentación
cuando hay una previa hidrólisis del sustrato. [Favela, 1993].
Para mayor información. [Fennema,1993].
1.2.1 Hidrólisis Ácida
El almidón puede retornarse a su forma monomérica original mediante la hidrólisis ácida,
en la cual los iones H+ actúan como catalizadores de la siguiente reacción:
(C6H10O5)n + n H2O n C6H12O6
Industrialmente se utiliza ácido clorhídrico o ácido sulfúrico como fuentes de H+; el primero
produce mayores rendimientos.
La extensión de la hidrólisis depende directamente de la temperatura, del tiempo de
reacción, de la concentración del ácido, de la concentración de almidón en la lechada
inicial (observándose que a concentraciones más bajas de almidón se obtienen mayores
rendimientos).
15
La hidrólisis de almidón con ácido sulfúrico al 2% produce 97% de glucosa del cual un
88% puede ser aislada en forma cristalina. [Brautletch,1953]
El producto final de la hidrólisis ácida de almidón es glucosa en su mayor parte, pero
puede presentar maltosa en pequeñas proporciones. [Enyon,1928]
Hay suficiente evidencia que demuestra que la velocidad de reacción de la hidrólisis es de
primer orden respecto a la concentración del almidón. [Valencia,1989].
Durante la hidrólisis ácida del almidón además de presentarse la reacción hasta glucosa,
se presentan otros dos tipos de reacciones; por una parte se encuentra la producción de
gentobiosa por recombinación de dos moléculas de glucosa, cuya reacción es reversible.
Por otro lado después que la glucosa se forma esta puede degradarse dando como
resultado hidroximetilfurfural, el cual a su vez se puede descomponer para formar ácido
levulínico y ácido fórmico, o polimerizarse para formar sustancias de composición
desconocida. [Botero,et.al;1993]
1.2.2 Hidrólisis Enzimática
Lleva consigo un proceso de elaboración de enzimas por microorganismos. Se distinguen
dos tipos de sistemas enzimáticos: los que actúan sobre la celulosa y los que actúan
sobre el almidón. [Llinares,1983].
En la degradación enzimática del almidón están involucrados dos tipos de enzimas: las
primeras son enzimas que rompen los enlaces -(1,4) produciendo una disminución en la
viscosidad de la solución de almidón y facilitando la acción de otras enzimas (dentro de
este grupo pueden ser clasificadas las endoenzimas, que producen rompimiento al azar, y
las exoenzimas, que actúan desde el final de las cadenas), y el segundo tipo rompe
enlaces -(1,6).
El tratamiento de la amilosa o la amilopectina con -amilasa da como resultado una
mezcla de maltosa, glucosa y panosa (si la reacción continua por un largo período). La -
16
amilasa retira unidades de maltosa del extremo no reductor de la cadena del almidón,
hidrolizando los enlaces glicosídicos alternos.[Botero,1993]
Estas referencias [Brautletch,1953; Enyon,1928], aunque son muy viejas no han sufrido
ningún cambio significativo, debido a la simpleza del método utilizado para la hidrólisis.
1.2.3 Reseña bibliográfica sobre hidrólisis de banano.
En trabajos anteriores se reporta condiciones tales como:
- Hidrólisis de banano maduro (Cavendish) de 85 días de maduración. Secado al sol a
50 OC, molido y tratado después con ácido sulfúrico de 2 al 5%, con una presión entre
1.36 y 1.63 at durante 30 minutos de incubación, relación de ácido a sustrato es de
dos a uno (v/w).
El jugo hidrolizado contiene 28% (w/v) de azúcares reductores, del cual el 74% o
más fue glucosa. Se realiza una fermentación discontinua con S.diastaticus
obteniéndose etanol al 6% (w/v), con un tiempo de fermentación de 7 horas.
[Pontiveros, et.al. 1980].
- Hidrólisis ácida, con ácido sulfúrico concentrado, llevando el pH del jugo de banano a
un valor entre uno y dos, en una autoclave a una presión de 1 at y una temperatura de
65 0C por 15 minutos. La fermentación fue realizada con S. cerevisiae. No se reportan
resultados. [Morales, et. al. 1993].
- Hidrólisis con ácido sulfúrico al 60% de banano maduro, se ajusta el pH del jugo entre
uno y dos, a una presión de 15 at, durante dos horas. La fermentación fue realizada
con S. cerevisiae. Por trece kilos de banano maduro sin pelar se obtuvo un litro de
alcohol al 84%. [Palacio,1982]
- El almidón de banano verde se convierte en azúcar fermentable (hidrólisis) en una
hora, a partir de una solución con 25 partes de almidón y 75 partes de agua que
contiene de tres a seis por ciento de ácido sulfúrico a una temperatura entre 135 y 140 0C y una presión de 6 at durante 15 minutos. De 0.64% de azúcares reductores
17
iniciales se obtienen 9.9% de azúcares reductores finales en base húmeda. [Valencia,
et. al. 1987].
- Se utiliza ácido sulfúrico al 2% para hidrolizar banano verde a una presión entre 2.5 a
3 at, llevando el jugo a un pH de 3.5, todo esto se realiza en un tiempo de una hora.
Obteniéndose un porcentaje de azúcares invertidos finales de 18%. Se utiliza
levadura prensada (S. cerevisiae) para realizar la fermentación obteniéndose un
rendimiento de etanol de 7%. [Méndez, 1979].
- Se realizan dos tipos de hidrólisis: Hidrólisis enzimática, utilizando dos enzimas, la
primera - amilasa bacterial (BAN), que lleva el almidón hasta dextrinas, en un tiempo
entre una y dos horas; la segunda una mezcla de glucoamilasa y pululanasa
(Dextrozyme) que lleva las dextrinas hasta glucosa, en un tiempo entre 24 y 72 horas.
Obteniéndose una eficiencia de hidrólisis del 40%. La hidrólisis ácida con ácido
sulfúrico al 2%, llevando el jugo a un pH de 3.5 a una presión entre 2.5 y 3 at durante
una hora. No se reportan resultados para la hidrólisis ácida. [Botero, et. al. 1993].
- Para facilitar el manejo de banano como jugo se adiciona una enzima pectinolítica
para romper la estructura de la pectina y facilitar la extracción de líquido intracelular.
Se utiliza la S. cerevisiae variedad ellipsoideus. Los porcentajes de alcohol obtenidos
oscilan entre un 5.7 y 10%. [García, Gómez, 1996].
- También es posible obtener etanol a partir de plátano maduro (con cáscara y sin
cáscara), las condiciones óptimas en las cuales se debe realizar el proceso de
hidrólisis del almidón, son cinco minutos a una temperatura de 60 0C, utilizando una
concentración de enzima amiloglucosidasa de 200 ppm. El tiempo de fermentación
necesario para obtener la mayor producción de etanol utilizando una concentración de
levadura fresca (Saccharomyces cerevisiae) al 5% (p/v) es de 15 horas a una
temperatura de 30 0C. Obteniendo un porcentaje en volumen de 11.48% de etanol
puro, y de 10.39% para el filtrado de pulpa más cáscara. [Valdés, 2000].
La Tabla 6. Presenta un resumen de las referencias bibliográficas de la hidrólisis.
18
TABLA 6. Referencias bibliográficas de diferentes hidrólisis de banano.
Ref.
Autor Materia Prima
Pretratamiento Hidrólisis T(oC) Presión pH Tiempo Cf Observación
64 MEZA, JulioUIS (1979)
Banano verde
cienaguero
Pulpa ÁcidaHCl ccial
37%
146 55 psi 2 30 min. 100g/L Relación Líquido/Sólido = 8.6
EnzimáticaMalta seca
60 Atmosférica 5.5 60 min. 40.6 g/L Relación Almidón/Malta = 1.27
Almidón de banano
ÁcidaHCl ccial
37%
146 55 psi 2.05 20 min. 130 g/L Relación Líquido/Sólido = 6.66
EnzimáticaMalta seca
60 Atmosférica 5.5 60 min. 40.6 g/L Relación Almidón/Malta = 2.5
41 MENDEZ, Jairo.
Unal (1979)
Banano verde
Pulpa + Cáscara ÁcidaH2SO4 2%
Cocción 0 3.5 1 a 2 h 147.3 g/L
EnzimáticaMalta
germinada
65 6 a 8 h 150.1 g/L
2 g de malta/100g de muestra
5 BOTERO, Amed
Unal (1993)
Banano verde
Harina Enzimática-amilasa
dextrozyme7060
6 a 6.54.3
1.5 h70 h
68.4 g/L 227g de harina = 133 g de almidón0.75 g de enzima/kg de sustrato
46 PALACIO, Jorge
UdeA (1982)
Banano maduro
Pulpa + Cáscara ÁcidaH2SO4 60%
15 atm 1 a 2 2 h
42 MORALES, Juan
UdeA (1993)
Banano maduro
Pulpa + Cáscara ÁcidaH2SO4
concentrado
121 15 psi 1 a 2 15 min.
Cf = Concentración final de glucosa
Cteo = Concentración teórica de glucosa
19
Según la bibliografía, la mayoría trabaja la hidrólisis ácida, debido a:
- Los buenos resultados que ha tenido esta hidrólisis en trabajos anteriores (búsqueda
bibliográfica).
- Los productos de reacción, azúcares, no inhiben el curso de ésta, tal como ocurre en
la hidrólisis enzimática.
- Costo económico relativamente bajo.
- Mayor velocidad que la hidrólisis enzimática.
- No son necesarios pretratamientos costosos.
Aunque hay que tener en cuenta ciertos inconvenientes con esta hidrólisis al momento de
realizarla tales como:
- La corrosión, debido al empleo de ácidos a temperaturas elevadas.
- La necesidad de recuperar el ácido para que el proceso resulte más económico.
- Se puede presentar una eventual degradación de los azúcares.
- Al operar a altas temperaturas se debe sobrepresionar el sistema para que continúe
en fase líquida. [Botero, et. al. 1993].
- Es necesario neutralizar la solución de azúcares antes de la fermentación.
- Es necesaria gran cantidad de energía para alcanzar las temperaturas adecuadas.
Comparación de la hidrólisis ácida y enzimática
La hidrólisis enzimática tiene como desventaja que la conversión es relativamente
incompleta ya que la dextrina residual y los almidones están siempre presentes. Por
medio de la vía química, más específicamente por hidrólisis ácida, es posible alcanzar
una conversión completa y una masa estéril que no requiere control. [Valencia, et.al.
1987].
Se recomienda en la hidrólisis ácida utilizar ácido sulfúrico por ser un reactivo menos
corrosivo que el ácido clorhídrico y además por ser más fácil y favorable su consecución.
20
1.3. FERMENTACIÓN
Los procesos de producción de alcohol pueden ser realizados por síntesis química o
biológica. La producción por síntesis química se basa en la oxidación del etileno bajo
condiciones drásticas de presión y temperatura. La producción de alcohol por vía
biológica se ha utilizado desde hace miles de años, entre los microorganismos
productores de etanol se encuentran las levaduras.
FIGURA 8. Fermentadores Industriales
La fermentación es la transformación de una sustancia orgánica en otra utilizable, es
producida por microorganismos o enzimas que provocan reacciones de oxidación-
reducción, de las cuales el organismo productor deriva la energía suficiente para su
metabolismo.
Desde un punto de vista práctico las fermentaciones tienen su interés por el producto o
productos finales que de ellas se derivan. Las fermentaciones pueden ser anaeróbicas o
aeróbicas. Las fermentaciones más comunes en la industria alimentaria son la del azúcar,
con formación de alcohol etílico (producida por microorganismos tales como: las
levaduras, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ovarum y en la actualidad se
investiga la alta eficiencia de conversión de azucares en alcohol mostrada por la bacteria
Zymomonas mobilis) en la elaboración del vino y del pan; la del alcohol, con formación de
ácido acético, en la elaboración del vinagre (producida por el Acetobacter aceti, un tipo de
bacterias capaces de producir ácido acético por oxidación de soluciones alcohólicas sobre
las que viven), y la fermentación láctica, en la obtención de quesos y yogures. Las
21
fermentaciones tienen gran importancia económica. Su utilización por el hombre tiene
raíces milenarias. En la actualidad la industria fermentativa se vale de tanques de
fermentación, en los que se realiza en condiciones controladas de temperatura (entre 27 a
35 0C), presión, pH (entre 4 y 5), concentración de azúcares (inferior al 22%) y
concentración de etanol (inferior al 14%) que permiten regular constantemente la entrada
y salida de productos.
1.4. MICROORGANISMO
El organismo escogido para trabajar la fermentación alcohólica es la Zymomonas mobilis,
debido a que se ha demostrado que en comparación con las levaduras tradicionalmente
utilizadas para la producción de etanol, presenta rendimientos y
velocidades de producción de etanol superiores.
FIGURA 9. Zymomonas mobilis vista al microscopio.
Más información [Laplace 91, Doelle 90, Favela 93, Schügerl, K 2000]
1.4.1 Antecedentes Históricos
Desde que fue aislada en 1912, la Zymomonas mobilis ha sido objeto de numerosos
estudios, pero su eficiencia para la producción de alcohol es conocida desde 1931,
gracias a los estudios de Kluyver, Hoppenbrouwers.
En 1934, Screder demostró que cuando la Zymomonas mobilis era cultivada en presencia
de glucosa, 98% del sustrato era transformado en etanol y CO2. A principios de los 50`s
Gibbs y DeMoss demostraron que la bacteria metabolizaba su sustrato glucosa por la vía
Entner-Doudoroff (E-D). En los años 60`s la bacteria fue utilizada a escala industrial para
la producción de pulque (bebida alcohólica mexicana), también se ha utilizado en
22
procesos de producción de etanol a nivel de laboratorio en países como Australia, India,
Japón, Estados Unidos y Canadá. Algunos de estos procesos se encuentran patentados
bajo el nombre de Sucrotech (US Patent 4797360) y Glucotech. [Doelle, 1990]
FIGURA 10. Zymomonas mobilis vista al microscopio II.
La Zymomonas forman parte de la microbiota que está presente en el material de reserva
de algunos vegetales tropicales. Algunas bacterias de este género se han aislado como
contaminantes durante la producción de cidra y cerveza.
1.4.2 Taxonomía
Debido a su morfología, y al hecho de metabolizar su sustrato por la vía (E-D), la bacteria
a sido clasificada dentro de la familia de las Pseudomonadaceae. Utilizando criterios
taxonómicos, Swings y deLey propusieron una clasificación que reagrupa a todas las
cepas de Zymomonas en una especie (Zymomonas mobilis) y dos subespecies:
Zymomonas mobilis mobilis y Zymomonas mobilis pomaceae.
La mayoría de las cepas pertenece a la subespecie mobilis. En la Tabla 7 se resume
algunas características fenotipicas del genero Zymomonas
23
TABLA 7. Características fenotipicas del genero Zymomonas.
1. Bastón gramnegativo de 1 a 1.4 m de ancho y de 2 a 6m de largo.
2. Inmóvil o móvil debido a la presencia de 1 a 4 flagelos lofótricos.
3. Arreglo celular pleomórfico (cadenas, rosetas, filamentos).
4. Ausencia de esporas, de cápsulas y de constituyentes de almacenamiento celular.
5. Catalasa positiva y Oxidasa negativa.
6. Anaeróbico y microaerofílico.
7. La utilización de sacarosa es inducible y puede ir acompañada de formación de
levanas.
8. Las únicas fuentes de carbono que metaboliza son: Glucosa, Fructosa y Sacarosa.
9. Contenido de G + C de 47.5 a 49.5%.
10. Talla de gnoma 1.5 x 109 kdaltones, aproximadamente 1500 cistrones.
11. Bastón recto con borde redondeado u ovide encontrándose individualmente o en
pares.
12. Gelatinasa negativa.
La Zymomonas mobilis es una bacteria quimiorganótrofa, que presenta auxotrofía por el
pantotenato de calcio, y la biotina. Cuando es cultivada en una mol de glucosa y fructosa,
produce dos mol de etanol, dos moles de CO2 y algo de ácido láctico. [Bergey’s, 1984]
El nitrógeno necesario para el crecimiento puede proporcionársele por medio de sales
minerales, aminoácidos o peptidos. El azufre, magnesio y potasio son proporcionados en
forma de sales. Los oligoelementos necesarios al metabolismo de la bacteria se
encuentran en estado de trazas en las sales utilizadas para la preparación del medio del
cultivo. Los nitritos y nitratos no son asimilados por la bacteria. [Sreekumar, 1995]
1.4.3 Catabolismo
Metabóliza su sustrato por la vía (E-D)
En la Figura 11. Se muestra como la Zymomonas mobilis sintetiza la sacarosa, fructosa y
glucosa por la ruta Entner-Doudoroff.
24
FIGURA 11.Metabolismo de sacarosa, glucosa y fructosa en la Zymomonas mobilis
[Glazer,et. al.,1995]
25
Desde el punto de vista energético ha sido considerada ineficiente para producir biomasa,
ya que una sola molécula de ATP (Adenosin Tri-Fosfato) es producida por cada molécula
de monosacárido metabolizada. Sin embargo, si se considera la producción de etanol, es
claro que la bacteria representa un sistema biológico muy eficaz, debido a que posee
tasas catabólicas elevadas, utilización simultánea de glucosa y fructosa, tolerancia a altas
concentraciones de etanol y de azúcares, formación de diferentes subproductos en
función del tipo de sustrato carbonado utilizado, conversión elevada del sustrato en etanol
y en CO2.
En general:
1 mol Glucosa (1.58 – 1.93) moles Etanol + (1.7 – 1.9) moles CO2 +
(0.02 – 0.2) moles Lactato + (0.011) moles Material celular
También se forman pequeñas cantidades de acetaldehido, acetilmetilcarbinol y glicerina.
El mecanismo aeróbico parece estar limitado a la oxidación en ácido acético.
[Bergey`s,1984]
Metabolismo de Glucosa
La glucosa entra a la célula por medio de un mecanismo estereoespecífico de baja
afinidad y alta velocidad de difusión facilitado por un sistema de transporte. La ruta E-D
produce dos moles de NADH por cada mol de glucosa consumida. Las dos moles de
piruvato producida por cada mol de glucosa son convertidas a dos moles de acetaldehído.
La reducción de acetaldehido a etanol, la cual es catalizada por alcohol deshidrogenasa,
estequeométricamente regenera NAD+ (Nicotinamida, intermediario energético de la
cadena respiratoria, junto con NADH). [Glazer,et. al.,1995]
Metabolismo de Fructosa
Zymomonas mobilis toma fructosa como glucosa por un sistema constitutivo de transporte
por difusión facilitada. Cuando la glucosa es la fuente de carbono, la pérdida de carbono
26
por la formación de producto es insignificante. Cuando la fructosa es la fuente de carbono
el resultado es muy diferente. Experimentos usando la misma especie de Zymomonas,
bajo condiciones similares de fermentación batch muestra que la producción de etanol a
partir de glucosa es del 95% del teórico y de fructosa únicamente del 90%. La producción
celular también disminuye, mostrando que el decrecimiento en la producción de etanol no
refleja una mayor utilización de la fructosa para el crecimiento celular.
La mayor cantidad de productos de fermentación batch a partir de fructosa con
concentración del 15% son en (g/L): Etanol 45, Dihidroxiacetona 4, Manitol 2.5, Glicerol
1.7. Sin embargo se sabe que la dihidroxiacetona y el acetaldehído inhiben el crecimiento
celular. [Glazer,et. al.,1995]
Metabolismo de Sacarosa
Zymomonas mobilis produce la enzima Levansucrasa, la cual hidroliza sacarosa a
glucosa y fructosa. Esta enzima ha sido detectada en los cultivos y en el interior de las
células. En adición a su actividad hidrolítica la Levansucrasa posee actividad
transfructosilante que permite la formación de polímeros azucarados de alto peso
molecular (>107 Dalton) llamados levanas, cuando Zymomonas mobilis crece en
sacarosa. Además también se forman cantidades de fructoligosacáridos de bajo peso
molecular.
La formación de levanas y oligómeros compite con la fermentación de fructosa a etanol.
Afortunadamente la formación de levanas es ampliamente disminuida a altas
temperaturas (37º C). [Glazer,et. al,1995]
A partir de sacarosa la formación de levanas y sorbitol provoca una disminución de hasta
un 20% en el rendimiento de producción de etanol en comparación con el obtenido con
glucosa. [Favela, 1993]; aunque se ha encontrado que a partir de jugo de piña utilizando
una especie de Zymomonas mobilis dada, el rendimiento de etanol fue de un 92.4% del
teórico y la productividad es de 2.81% (g/L h) utilizando como fuente de carbono la
sacarosa presente en el jugo correspondiente a 125 (g/L). [Tanaka, 1999]
27
Las especies mutantes y sus padres tienen similares velocidades de hidrólisis a partir de
sacarosa pero las velocidades de producción de levanas son más altas para las mutantes.
En la fermentación de sacarosa, las mutantes exhiben una velocidad específica de
crecimiento suavizada comparada con la de sus padres (0.07 comparada con 0.1 h –1), sin
embargo no es una diferencia altamente significante. [Ananthalakshmy, 1999]
Formación de Sorbitol
El Sorbitol es otro producto secundario que disminuye la producción de etanol cuando la
Zymomonas fermenta sacarosa en vez de glucosa como fuente de carbono. Este es el
producto de una abundante enzima citosólica, glucosa-fructosa oxidoreductasa, la cual
convierte glucosa a sorbitol usando glucosa como reductor.
Cuando una mezcla de fructosa y glucosa es adicionada al medio de fermentación, o
cuando aparece en el medio como resultado de la hidrólisis de sacarosa, la Zymomonas
mobilis convierte como mucho un 11% de las fuentes iniciales de carbono a sorbitol, la
cual no puede ser usada como una fuente de carbono y simplemente es acumulada en el
medio. [Glazer,et. al.,1995]
Estructura de la pared celular
La pared celular de la Zymomonas mobilis es característica de las bacterias
gramnegativas, esta comprende una membrana externa, una membrana interna y la
mureína.
La proporción de ácidos grasos insaturados es elevada; también se ha demostrado la
presencia de hopanoides, cuya estructura es muy similar a la de los esteroles.
28
Aspectos genéticos
Con el objetivo de aumentar el número de azúcares fermentables por la bacteria, muchos
grupos de investigación se han dedicado a la búsqueda de vectores de clonación. Se ha
sugerido que el gene que codifica para una de las dos alcoholdeshidrogenasas se
encuentra a nivel plasmídico.
Se ha encontrado que las especies madres siempre forman células elongadas (células
anguila), que a altas temperaturas resultan en un obstáculo para el fermentador; pero las
especies mutantes son pequeños bastones que mantienen una alta eficiencia y viabilidad.
[Sreekumar, 1999]
1.4.4 Efectos de ciertos parámetros fisicoquímicos sobre el crecimiento y la
producción de etanol por Z. mobilis
Efecto del sustrato
Algunas cepas de Z. Mobilis pueden crecer en medios con concentraciones muy elevadas
de azúcares. La mayoría de las cepas crecen en presencia de 200 g/L de glucosa. La
producción de 85 g/L de etanol a partir de 460 g/L de sacarosa fue reportada
[Favela,1993]. El aumento de la concentración inicial de azúcares tiene un efecto mas
importante sobre los parámetros relacionados con el crecimiento que sobre aquellos
relacionados con la producción de alcohol.
La Z. Mobilis tiene alta osmotolerancia a la glucosa, pero baja tolerancia a la sal. Ninguna
especie puede crecer en NaCl al 2%, sin embargo muchas levaduras pueden tolerar altas
concentraciones de sal.
Un estudio para la optimización de los componentes del medio para la producción de
etanol usando Zymomonas mobilis [Sreekumar, 1999] muestra que:
29
- La biomasa producida muestra una tendencia parabólica a concentraciones de
glucosa crecientes, el crecimiento de biomasa ocurre únicamente cuando niveles
apropiados de extracto de levadura están presentes, por otra parte los altos niveles de
fuente de carbono no producen una fracción constante de la biomasa esperada.
- El extracto de levadura requerido para la máxima utilización de la glucosa fue
absolutamente evidente, así que muy altas concentraciones de azúcar conducen
siempre a altos niveles de azúcar no utilizados, sin tener en cuenta la concentración
de extracto de levadura. Sin embargo, a bajas concentraciones de azúcar en el medio,
el extracto de levadura muestra una fuerte interacción en la utilización de la fuente de
carbono.
- Un incremento en la concentración de sulfato de amonio ((NH4)2SO4, componente del
medio de cultivo) genera un incremento en la producción de etanol.
- Unicamente los niveles óptimos de glucosa y extracto de levadura dan el máximo
rendimiento.
- El extracto de levadura y la concentración del inóculo contribuyen a aumentar la
producción de etanol, pero este rendimiento es comparativamente menor que el de
extracto de levadura y glucosa juntos.
- No se observan variaciones significantes con la fuente de fosfato (KH2PO4) y nitrógeno
((NH4)2SO4), resultando en un insignificante papel para el fosfato y comparativamente
menos apreciable para el sulfato de amonio, ya que las células pueden utilizar el
nitrógeno disponible del extracto de levadura. El exceso de nitrógeno podría conducir
a mayor concentración de biomasa pero menor producción de etanol.
En principio se encontró que en vez del sulfato de amonio en el medio de cultivo se
observa que la úrea (0.5 (g/L)) fue un mejor componente de este, ya que conduce a
mejores rendimientos en la producción de etanol. [Sreekumar, 1995]
30
El pantotenato de calcio se encontró como una vitamina esencial para la producción de
etanol, aunque es muchas veces reemplazado por extracto de levadura o peptona (5 g/L).
[Sreekumar, 1995]
Efecto de la Temperatura
Aunque la Zymomonas mobilis es capaz de crecer en un intervalo de temperaturas de 25
a 40 oC, su temperatura óptima de crecimiento se sitúa entre 30 y 35 oC. A temperaturas
superiores a 30 oC, los rendimientos en etanol y en biomasa se ven afectados, más que
los parámetros específicos.
A altas temperaturas la concentración de fosfolípidos en Zymomonas mobilis disminuye,
lo que causa la pérdida de integridad de la membrana celular; también la fluidez
disminuye proporcionalmente a la concentración de ácidos grasos insaturados. El
aumento de temperatura induce a la acumulación del etanol en el interior de las células, lo
que amplifica su efecto inhibidor. Durante el cultivo de Zymomonas mobilis a 40 oC, la
adición de Mg2+ al medio de cultivo mejora en un 100 % el rendimiento de producción de
etanol. [Favela,1993]
Se sugiere el uso de especies mutantes de Zymomonas mobilis que sean
termotolerantes, ya que las altas temperaturas de fermentación podrían reducir
significativamente los costos de destilación y enfriamiento, especialmente en los países
tropicales. [Sreekumar, 1999]
Efecto del Etanol
El interés de producir el etanol a concentraciones elevadas ha provocado muchos
estudios sobre el efecto inhibidor de este sobre los microorganismos que lo producen. El
etanol tiene un efecto muy importante sobre la composición de la membrana celular.
Estudios realizados sobre el efecto del etanol adicionado al medio de cultivo y del
producido por Zymomonas mobilis mostraron que en ambos casos, su efecto inhibidor es
más importante sobre el crecimiento que sobre su producción [Favela,1993], mientras que
31
el efecto de inhibición se hace más intenso cuando hay un ascenso en la concentración
de etanol. [Daugulius, et.al.1997]
Los resultados obtenidos sobre el efecto inhibidor del etanol adicionado al medio de
cultivo no deben tomarse en cuenta de una manera cuantitativa, pues no se considera ni
la adaptación progresiva de las células al etanol producido ni el choque al que son
sometidas las células al adicionar el etanol. [Favela,1993]
Efecto del pH
La Zymomonas mobilis puede crecer en una amplia gama de valores de pH (3.0 a 7.0).
Tradicionalmente, valores de pH de 5.0 a 6.5 se han usado para estudiar el metabolismo
de Zymomonas mobilis, pero el hecho de que la bacteria pueda crecer a pH inferiores a
5.0 la hacen interesante desde el punto de vista biotecnológico. En efecto, los riesgos de
contaminación pueden ser reducidos considerablemente. [Favela,1993]
El uso de un fermentador de pH controlado podría reducir significativamente el periodo de
fermentación a 16 o 20 horas (De un tiempo total de 60 horas aprox.). [Sreekumar, 1999]
Efecto del Oxígeno
Aunque Zymomonas mobilis puede crecer en aerobiosis, el oxígeno tiene un efecto
negativo sobre la producción de alcohol. Este induce la formación de subproductos de la
fermentación (acetato, acetaldehido y lactato). Aparentemente el efecto inhibidor del
oxígeno está ligado a la concentración de sustrato.
Para concentraciones de sustrato bajas el crecimiento y el rendimiento en biomasa son
independientes de la presencia de oxígeno. Por el contrario, en presencia de
concentraciones elevadas en azúcares, los parámetros relacionados con el crecimiento
disminuyen en presencia de oxígeno. [Favela,1993]
32
Otros efectos
[McLellan,et al.,1999] Encontraron experimentalmente un cambio periódico en la
morfología, específicamente la formación de células filiformes; esta variación fue valorada
en una escala de uno a diez para la que 1 corresponde a células diminutas, 3 a células de
longitud normal y 10 a poblaciones de células extremadamente elongadas (5 a 20 veces
de la longitud normal para la forma unicelular).
Los resultados morfológicos son importantes por dos razones:
- Provee un soporte adicional experimental para la hipótesis de que la inhibición es
causada por una respuesta retrasada al STRESS en el medio, la cual en algunos
casos es la velocidad de cambio positiva en la concentración de etanol.
- Indica la naturaleza fisiológica de la respuesta, es decir la formación de células
filamentosas o elongadas en respuesta a medios de estrés.
La Tabla 8 reporta los parámetros cinéticos para la Zymomonas mobilis en condiciones
anaeróbicas.
TABLA 8. Parámetros cinéticos en condiciones anaeróbicas para la
Zymomonas mobilis
Parámetro de modelo Laplace,1991
max (h-1) 0.34
Yx/s (g.g-1) 0.03
Yp/s (g.g-1) 0.36
Qp (g.g-1.h-1) 1.85
Donde: max: Velocidad especifica de crecimiento máximo.
Yx/s: Rendimiento de producción de biomasa. (g células producidas/g sustrato
usado).
Yp/s: Rendimiento de producción de etanol. (g etanol producido/g sustrato
usado).
Qp: Promedio de la productividad especifica del etanol. (g etanol/g célula por h)
33
1.5 ASPECTOS TECNOLÓGICOS DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL POR
Zymomonas mobilis
La Zymomonas mobilis es un organismo que:
- Exhibe altas velocidades metabólicas.
- Reduce tiempos de fermentación.
- Prácticamente elimina problemas de infección.
- No requiere esterilización de medios o sustratos.
- Exhibe una baja masa celular, así hay menor generación de calor.
- Elimina inoculaciones repetidas, reciclando o centrifugando.
- Mejora la productividad de etanol por unidad de alimento.
Estudios realizados presentan una eficiencia de conversión entre un 96-98% de
biomasa, y una concentración de etanol del 12% (v/v). [Doelle, 1990].
Conocer la cantidad de biomasa en un sistema y su comportamiento en el tiempo es
fundamental en cualquier trabajo de biotecnología. Esta variable puede ser tomada como
parámetro de control en el fermentador, más aún, teniendo en cuenta que su tasa de
crecimiento depende del tipo de microorganismo, la edad del cultivo, el medio de
crecimiento, y parámetros fisicoquímicos tales como, temperatura, pH, oxígeno disuelto,
entre otros.
En forma general, se puede definir la tasa de crecimiento como el incremento de la
biomasa con el tiempo. El problema básico de su medida está en la selección de un
parámetro disponible que sea proporcional a la cantidad de biomasa. Tradicionalmente el
crecimiento se mide mediante la turbidez como parámetro de población promedio, el cual
es proporcional al peso seco.
Las propiedades de una población microbiana, representan valores medios sobre la
población. Estas propiedades son distribuidas de acuerdo al microorganismo como ente
individual, a su estado en el ciclo celular, al igual que a su metabolismo y proceso de
crecimiento. Sólo bajo condiciones apropiadas, se consigue una curva con este tipo de
distribución.
34
Dentro de las técnicas disponibles para medir la tasa de crecimiento figuran las técnicas
de enumeración, o métodos que pueden ser evaluados por compatibilidad con la
bioquímica, metabolismo y ciclo celular del microorganismo de interés.
Además las características del microorganismo requeridas para la producción a gran
escala de alcohol son:
- Capacidad de metabolizar varios sustratos.
- Tasas de crecimiento y de producción de etanol elevadas.
- Máxima eficiencia para la conversión del sustrato.
- Tolerancia a altas concentraciones de sustrato y de etanol.
- Tolerancia a altas temperaturas.
Esta información fue obtenida de [Favela, 1993]; para una mayor información de la Z.
mobilis referirse a [Bergey`s,1984; Etanol cap. 11; Kondo, 1996; Laplace,1991; Doelle,
1990], más artículos publicados en la Web.
1.5.1 MEDIO DE CULTIVO
Las exigencias nutricionales de un microorganismo se derivan preferentemente de las
sustancias que intervienen en las síntesis de la célula. Los sustratos se eligen de acuerdo
con las necesidades recogidas en la bibliografía como correspondientes a cada especie o
los microorganismos afines.
Por lo general se recurre a la siguiente combinación básica de medios nutricionales:
- Fuente de N inorgánico para microorganismos autotrófos y N orgánico para aquellos
que son heterotrófos. La energía consumida en la síntesis intracelular de proteína
depende de la estructura de las proteínas extracelulares. Según esto, el consumo de
energía es mínimo si se aportan aminoácidos directamente. Las fuentes de N más
importantes son: peptonas, polipéptidos, aminoácido y soluciones nutricias naturales
(agua de levadura, jugo de cerveza).
- Fuente de C (glucosa, sacarosa y fructosa).
35
- Sales minerales, poseen con frecuencia una acción específica sobre el metabolismo
de los microorganismos. Así, el azufre, magnesio y fósforo son necesarios para la
síntesis de sustancias protéicas, mientras que el potasio es necesario para la
constitución del protoplasma.
- Vitaminas, actúan estimulando el crecimiento, y son menos efectivas como fuente de
energía. En particular deben mencionarse aquí aquellas vitaminas que desarrollan la
función de coenzima. Ejemplos son: La riboflavina, ácido nicotínico, tiamina,
nicotinamida, ácido pantoténico, piridoxina, biotina y complejo B12.
Las exigencias nutricias cuantitativas de los diversos microorganismos son diferentes y
dependen de:
- La composición global del sustrato.
- La proporción carbono/nitrógeno.
- El espectro enzimático de la especie.
- La clase y proporción de sustancias estimulantes y del crecimiento y de factores
rectores fisiológicos. [Kunz,1986]
En la Tabla 9, se reportan los medios de mantenimiento, crecimiento y fermentación para
la Zymomonas mobilis.
36
TABLA 9. Medios de mantenimiento,creciimiento,fermentac ón para Z.mobilis.GLUCOSA (g/L) EXTRACTO DE
LEVADURA (g/L)(NH)4SO4
(g/L)KH2PO4
(g/L)MgSO4.7H2O (g/L)
pH T(0C) OBSERVACIONES
Daugulis, 1999 100 19 1.9 1.9 0.95 5 30 T. C:18 hChen, 1991 100 5 1 2.5 0.5 4.6 - 5 32 T.C: 18 h
Ag. 100 rpmSreekumar, 1999 120.4 6.5 0.96 0.02 0.5 5.5 30 T.C: 16 -24 h
C.c: Log 10 8.4Tanaka, 1999 125 (sacarosa) 10 1 1 0.5 5.5 30 T.C: 18 h
Ag. 200 rpmSreekumar, 1995 100-300 5 1 2 0.5 5.5 30 T.f: 72 h
C.c: 0.01 (g/L)Ananthalakshmy,
1999M.m 20 10 0 2 0 6 30
F. 150 (sacarosa) 10 0 2 0 6 30
Hobley, 1994 100 5 1.5 5 1 6 30 A.g: 200 rpmC.c:1.6x109 (cel/ml)Inyección de N2
Stanley, 1997 100 5 0 0 0 5.2 30 Enriquecido con triptona, 10 (g/L) y NaCl, 9 (g/L)A.g 100 rpmInyección de N2
T.C: 48 hKondo, 1996 M.m 100 3 0 0 0 6.5 30 A.g: 100 rpm
T.f: 24 hEnriquecido con polipeptona, 2 (g/L) y glicerol, 3 (g/L)
C. 120 3 0 0 0 6.5 30
Thordsen, 1993 100 5 1 0 1 5 30Kim, 1992 100 2.5 1 0 1 5 30
Carey, 1983 10 5 0 5 0 30 Enriquecido con triptona, 10 (g/L),MgSO4, 8 (g/L) y Solución salina, 100 ml
Hellendoorn, 1999 M.m 10 5 0 0 2 6.8 4 T.f: 16 hC. 100 10 1 1 0.5 6.8 30
Abreviaturas: M.m: Medio de mantenimiento T.C: Tiempo de crecimiento C.c: Concentración celular C: Medio de crecimiento T.f : Tiempo de fermentación F: Medio de fermentación Ag: Agitación
37
1.5.2 Ventajas y desventajas de la fermentación Batch y Continua utilizando
Zymomonas mobilis
Fermentación Batch utilizando Zymomonas mobilis
Generalmente los carbohidratos polimericos son prehidrolizados con enzimas apropiadas
y el hidrolizado es usado para la fermentación tanto en Batch como en continuo. La
mezcla de cultivos de diferentes especies etanologenicas (productoras de etanol) puede
ser usada en la fermentación para obtener una productividad mejorada.
La fermentación Batch es un proceso el cual se puede realizar a escala de laboratorio con
mayor facilidad en el control de las variables sin la necesidad de esperar a que se llegue a
un estado de equilibrio (lo contrario a lo que ocurre en una fermentación continua).
El desarrollo de sistemas para una rápida fermentación batch conlleva dos problemas, la
baja concentración celular y el efecto inhibitorio del etanol. Estos inconvenientes harían
totalmente antieconómicos dichos procesos. [Chen, 1991]
Fermentación Continua utilizando Zymomonas mobilis
Una desventaja asociada con la fermentación continua de Zymomonas mobilis es la
incidencia de un comportamiento oscilatorio en el cual biomasa, producto y sustrato ciclan
bajo ciertas condiciones. [McLellan,et al. 1999]
La productividad de etanol decrece por periodos de tiempo durante oscilaciones,
conduciendo a altos niveles de sustrato residual (que se traducen en perdidas en la
producción). Los resultados reportados por McLellan, et.al, confirman la incidencia del
comportamiento oscilatorio a concentraciones combinadas del sustrato y bajas
velocidades de dilución.
38
Las células de Zymomonas mobilis son incapaces de responder instantáneamente a
cambios en su medio, se ha postulado que existe un retraso en el tiempo en que la célula
experimenta un cambio y el de su repuesta metabólica.
1.6 ALCOHOL ETÍLICO
1.6.1 Generalidades
Desde la antigüedad se conocían las bebidas alcohólicas, y así lo consignan escritos
antiguos, la primera noticia que se tiene de la existencia de alcohol data del siglo XII;
Nicolás Teodoro De Saussure (1808) obtuvo alcohol completamente libre de agua y en
1845 Berthelot lo obtuvo por síntesis.
El alcohol etílico (C2H5OH) es un compuesto ternario de carbono (52.15%), oxígeno
(34.73%), hidrogeno (13.12%). Funde a –117.3 0C y su punto de ebullición es de 78.35 0C
a 760 mm Hg. A 15 0C tiene una densidad relativa de 0.7943. Es un líquido incoloro de
olor aromático, reacción neutra, sabor ardiente y altamente higroscópico.
1.6.2 Aplicaciones del alcohol etílico
Sus aplicaciones son innumerables y van desde las bebidas fermentadas para consumo
humano, hasta su utilización industrial como solvente o materia prima para la elaboración
de otros productos químicos. El alcohol se utiliza para producir bebidas fermentadas tales
como: vinos, aguardiente, vodka, ron, brandy, etc. Como solvente se utiliza en gran
cantidad de procesos por ejemplo: disolución de la nitrocelulosa, disolvente de colorantes
en las industrias alimenticias y textil; disolvente de: resinas; jabón, aceites, ceras, etc.; por
oxidación en la fabricación de ácido acético, vinagre, acetaldehído.
En la Figura 11 se muestra el ciclo de transformación del bioetanol a CO2 cuando es
utilizado como combustible.
39
FIGURA 12. Ciclo del gas Carbónico producido por el Bioetanol.
El alcohol etílico se puede mezclar con la gasolina, para mejorarle ciertas propiedades
como carburante. Se recomienda una mezcla en proporción del 10 al 25%, ya que se
logra un índice de octano entre 70 y 75, mayor que el de la gasolina.
Las mezclas de alcohol – gasolina permiten aumentar la compresión en el motor, dan un
funcionamiento más regular, su recalentamiento es menor y por tanto se puede utilizar a
un mayor número de revoluciones. [Mendez,1979]
1.6.3 Formas comerciales de etanol
El alcohol etílico se presenta en el mercado bajo las siguientes formas:
Alcohol Neutro: (96-97 0GL) este alcohol se utiliza en la preparación de licores y vinos de
baja graduación, en clinicas y hospitales.
Alcoholes Desnaturalizados: (90 0GL) son aquellos en los cuales se ha mezclado el etanol
con alguna sustancia extraña que lo hace impropio para el consumo humano. Se emplean
en usos industriales como fabricación de cloruro de etilo, sustancias colorantes, etc.
Alcohol Deshidratado, Absoluto o Carburante: (99.6-99.8 0GL), utilizado en laboratorios y
en mayor escala como carburante, mezclado con la gasolina.
40
Alcohol Sólido: utilizado por comodidad para reemplazar el alcohol combustible en los
viajes (en forma de pastillas). [Mendez,1979; Pereira,1986; Glazer,1995].
1.7 PROCESO FERMENTATIVO PARA LA PRODUCIÓN DE ALCOHOL.
PARAMETROS QUE SE DEBEN TENER EN CUENTA.
1.7.1 Descripción del proceso general partiendo de una fuente de carbono, en este
caso el hidrolizado.
Pretratamiento de Materia Prima
El pretratamiento tiene como objetivo transformar la biomasa utilizada cuando esta es
poco asequible a la transformación o a la hidrólisis.
El tratamiento previo en el caso del banano verde se lleva a cabo en las siguientes
etapas.
Cortado
Se realiza en forma longitudinal, en pedazos de espesor pequeño, para que haya mayor
área de contacto para el secado en horno.
Secado
Se debe alcanzar un bajo porcentaje de humedad para disminuir la posibilidad de ataque
de microorganismos, esto se hace no a muy altas temperaturas para evitar la degradación
(caramelización) del sustrato.
41
Molienda
Con el propósito de adecuar la partícula para permitir una mayor superficie de reacción y
disminuir el tamaño de las fibras, se puede hacer en una picadora o en un molino de
atricción de disco doméstico.
Reacción (Hidrólisis ácida)
Un intervalo de pH recomendado para hidrólisis ácida con ácido sulfúrico es de 1.0 a 2.0.
Un pH de 3.0 garantiza que a medida que avanza la reacción el pH se mantenga dentro
de los límites encontrados debido a que por efecto de la evaporación del agua la
concentración del ácido puede ir aumentando. Se realiza a una temperatura de 90 OC en
un baño María.
Fermentación
Para este caso, el jugo o puré diluido (harina de banano ya hidrolizada) se filtra, se le
adicionan los micronutrientes (sulfato de amonio y de magnesio, extracto de levadura,
fosfato de potasio) y se ajusta el pH; este sustrato se esteriliza y luego se inocula con
Zymomonas mobilis, en una cantidad conocida de microorganismo. La Zymomonas
mobilis es capaz de transformar los azucares en este caso glucosa en etanol. Para un
proceso en fermentación batch con este microorganismo se deben controlar parámetros
tales como pH (5.0 – 6.0, preferiblemente 5.5), Temperatura (30 0C) , concentración de
etanol y concentración de azucares.
1.7.2 Revisión bibliográfica sobre la producción de alcohol
El consumo de glucosa en un tiempo de 18 horas por parte de la Zymomonas mobilis
en cultivo puro utilizando 100 ml/L de inoculo a 300C indicó que es mejor utilizar un
medio con micronutrientes. [Laplace, et.al.1991].
42
S. cerevisiae y la Z. mobilis son dos microorganismos, usualmente usados para
fermentar glucosa. Han obtenido mejor rendimiento y velocidades de conversión que
muchos otros microorganismos tales como Pichia stipitis, Candida shehatae. [Laplace,
et.al.1991].
La S. cerevisiae no se ve afectada apreciablemente por la velocidad de transferencia
de oxígeno (VTO) probada en un intervalo de 0.0-3.5 (mmol / L h) bajo esas
condiciones el intervalo de rendimiento de etanol va desde 0.41 a 0.45 g/g glucosa y la
productividad específica de etanol es de alrededor de 0.70 g/g glucosa h. [Laplace,
et.al.1991].
La Z. mobilis da los más altos rendimientos fermentativos bajo estrictas condiciones
anaerobias (medio continuamente inyectado con nitrógeno): bajo esas condiciones el
rendimiento de etanol fue de 0.43 g/g glucosa y la productividad especifica de etanol
es en promedio 2.3 g/g glucosa.h. Concluyendo que la Z. mobilis posee un
rendimiento mucho más alto que el de la S. cerevisiae. [Laplace, et.al.1991].
A partir de jugo de piña la S. cerevisiae var. Sake tiene una producción de etanol
máxima de 89% de la producción teórica, la productividad fue de 1.44g/L.h, cuando
se usó S. cerevisiae CM1 la máxima producción de etanol fue 2.22g/L.h y la
producción de etanol teórica fue de 77%. Al comparar estos resultados con la
producción de etanol con Z. mobilis ATCC 10988, esta produjo del jugo de piña un
92.4% de la producción de etanol teórica y la productividad fue de 2.81 g/L.h [Tanaka,
1999].
La fermentación Batch de hidrolizado de almidón de Cassava (Yuca) por células
inmovilizadas Z. mobilis muestra una concentración máxima de etanol de 59 g/L y una
productividad de 3.57 g/L.h. La concentración final obtenida con células libres fue de
66 g/L con una productividad de 2.75 g/L.h, se reporta que las células inmovilizadas
son estables por siete ciclos (etapas completas de fermentación). [Gunasekaran et.al,
2001]
Chay, et al. reportan que las mejores especies para la producción de etanol de jugos
sacarificados son las cepas de Z. mobilis y S.diastaticus. [Gunasekaran et.al, 2001]
43
Toran y Diaz et al. Investigaron el efecto de la hidrólisis ácida y enzimática de los
sustratos en la producción de etanol por Z. mobilis ZM4 y ZM4F, obteniendo una
productividad de etanol de 4.8 g/g.h con Z. mobilis creciendo en jugo de alcachofa
Jerusalén, el cual fue más alto que el reportado para la levadura Kluyveromyces
marxianus por Duvnjek et al., ellos observaron que el jugo de alcachofa Jerusalén fue
fermentado sin la adición de nutrientes. [Gunasekaran et.al, 2001]
Lawford et al. demostraron que el licor de maíz es un sustrato barato para la
producción de etanol por Z. mobilis ZP4[Gunasekaran et.al, 2001]
Torres y Baratti, investigaron la fermentación del almidón hidrolizado de cereales por
Z. mobilis, reportaron que en una fermentación Batch, concentraciones de azúcar de
223g/L pueden ser fermentadas para producir 105g/L en 70 horas. El porcentaje
teórico de producción fue del 92%.[Gunasekaran et.al, 2001]
Bring y Meyer, reportan que en una fermentación continua usando un cultivo mixto de
Z.mobilis y S.cerevisiae, se obtiene una producción de 54.3 g/L de etanol después de
3 días, con una productividad de 70.7 g/L.h, una concentración final de 49.5 g/L y
una producción de 0.5 g de etanol/g de sustrato, lo que corresponde a una producción
teórica de 98% y conversión del 99% del sustrato. [Gunasekaran et.al, 2001]
Una producción continua de etanol del jugo de alcachofa Jerusalén, usando ZM4F de
Z.mobilis fue estudiada por Allais et al. sus resultados muestran una productividad
volumétrica de 67.2 g/L.h con una concentración final de etanol de 42 g/L de 100 g/L
de azúcares iniciales[Gunasekaran et.al, 2001]
Doelle describe un proceso de producción continua de etanol de un hidrolizado de
almidón este proceso hace uso de la Z.mobilis en una fermentación de una etapa, el
autor dice que la calidad del hidrolizado de almidón no es crucial para que suceda la
fermentación, y reporta una eficiencia de conversión del 92%. [Gunasekaran et.al,
2001].
44
De estas referencias bibliográficas se pueden sacar las mejores condiciones de
temperatura, presión, pH para diferentes fermentaciones con Z. mobilis. Tambien se
puede observar el trabajo de fermentación por acción de Z. mobilis sobre diferentes
sustratos reales (piña, alcachofa, licor de maíz, etc).y su comportamiento hacia ellos con
buenos rendimientos en la producción de etanol.
En la Tabla 10, se resumen algunas referencias sobre fermentación alcohólica a partir de
banano, utilizando como microorganismo la S. cerevisiae.
45
TABLA 10. Referencias bibliográficas de diferentes fermentaciones alcohólicas a partir de banano.
Ref Materia Prima
Pretratamiento Hidrólisis Microorganismo Cantidad T(oC) pH Tiempo Rf * Observaciones
23 Banano maduro
Pulpa Ninguna S.cerevisiae var.ellipsoideus
5ml/100ml de sustrato
Población E10
33 5.2 48h 85.8 Concentración de etanol = 3.9%p/v
Vol. Fermentación = 2.5 litrosAnaerobia72 r.p.m.
41 Banano verde
Pulpa + cascara Enzimática(malta)
S.cerevisiae(levadura prensada)
2 g/L 25-30 3.5 2 a 3 días
83.0 5 g de malta/litro de muestra
42 Banano maduro
Pulpa + cascara Acida(H2SO4)
S.cerevisiae 30 3.5-4.5
Anaerobio
46 Banano maduro
Pulpa + cascara Acida(H2SO4)
S.cerevisiae 1g/100 ml 33-37 3.5-4.5
Recipiente oscuroAdición de
micronutrientes64 Banano
verdePulpa Acida
(HCl)S.cerevisiae
(levadura prensada)
0.1g / g de azúcar
26 5 72 h 81.8 Concentración de azúcar con
evaporación a 50oCEnzimática
(malta)S.cerevisiae
(levadura prensada)
0.1g / g de azúcar
26 4.5 60 h 82.0
Almidón de banano
Acida(HCl)
S.cerevisiae(levadura prensada)
0.1g / g de azúcar
26 4.75 72 h 83.0
Enzimática(malta)
S.cerevisiae(levadura prensada)
0.1g / g de azúcar
26 4.5 60 h 82.0
* Rf: Porcentaje del rendimiento teórico.
46
2. DESARROLLO EXPERIMENTAL
2.1 DESCRIPCIÓN DEL PROCESO DE HIDRÓLISIS.
FIGURA 13. Diagrama de flujo.
El banano utilizado, es del tipo banano Urabá exportación (rechazo), en su primera etapa
de maduración. El cual fue comprado en la plaza central Mayorista de Medellín –
Antioquia.
47
Cortado Longitudinal
Secado0-64 h 40 0C64-76 h 60 0C
Molienda
ReacciónH2SO4, pH 1-2
T= 90 0CP= 1 at
t= 45 min
Los bananos se cortan en tajadas longitudinales, incluyendo cáscara, luego se colocan en
un horno de secado con circulación de aire. Se deja a una temperatura de 40 OC durante
64 horas liberándose así gran parte de la humedad y evitando la caramelización.
Entre las 64 y 76 horas se aumenta la temperatura a 60 OC dando como resultado un
material con una humedad aproximada de 13%.
Luego este material se muele (Lab. de micotoxinas, UNAL), obteniéndose harina de
granulometría de 1 mm de diámetro aproximadamente.
2.1.1 Caracterización de la materia prima.
En la caracterización de la materia prima, o sea la harina de banano verde, se determina
el contenido de almidón, azúcares reductores, azucares totales y porcentaje de humedad,
con el fin de conocer las condiciones iniciales de trabajo.
Determinación de Almidón de la Harina
El método utilizado para este análisis es el propuesto por Marta Quicazán. (Ver Anexo 3).
Para la harina de banano. El porcentaje reportado fue de 30% (base húmeda)
Determinación de azúcares reductores de la materia prima
Se realizan dos ensayos con diferentes cantidades de harina y se hacen por triplicado, el
ensayo 1 corresponde a la muestra 1,2 y 3; el ensayo 2 corresponde a la muestra 4,5 y 6.
Los resultados se pueden apreciar en la Tabla 11. Para determinar azúcares reductores
se sigue el método de Miller (Anexo 2).
48
TABLA 11. Azúcares reductores contenidos en la materia prima
Muestra Absorbancia Azúcares Reductores
(ppm)
% (g azúcar/100 g muestra)
1 0.295 283.6 9.51
2 0.270 258.6 8.67
3 0.275 263.6 8.84
4 0.283 271.6 9.05
5 0.278 266.6 8.89
6 0.287 275.6 9.19
Determinación de azúcares totales
Realizada según el método utilizado en el laboratorio de alimentos de la Universidad
Nacional Sede Medellín. (Anexo 1). Los resultados se reportan en la Tabla 12.
TABLA 12. Determinación de azúcares totales
Volumen Final
(ml)
Absorbancia Azúcares Reductores
(ppm)
% (g azúcar/ 100 g
muestra)
66 0.758 746.6 8.2
69 0.706 694.6 8.0
Los azúcares totales corresponden a una cantidad menor que los reductores iniciales, por
lo que se piensa que el ácido tuvo un efecto destructor sobre los azucares.
FIGURA 14. Jugo de banano diluido
49
2.1.2 Hidrólisis
Se trabajan tanto la hidrólisis ácida como la enzimática sustentado en lo reportado en la
bibliografía y buscando la que presente los mejores resultados.
FIGURA 15. Centrifugación del jugo de banano
Hidrólisis Ácida
Se realizan preensayos con dos reactivos: ácido clorhídrico y ácido sulfúrico. En la
hidrólisis con ácido clorhídrico se encuentra que el contenido de azúcares luego de la
hidrólisis es menor que el reportado para la harina sola, por lo cual se concluye que este
tiene un efecto destructor de los azúcares. Además el ácido clorhídrico es de mayor costo
y más difícil consecución.
En la hidrólisis con ácido sulfúrico se realiza una determinación de las mejores
condiciones de reacción debido a las incongruencias presentadas en la bibliografía. Con
la asesoría del profesor Aicardo Pérez (Universidad Nacional) el cual ha tenido
experiencia en trabajos de hidrólisis anteriores, y por medio de varios ensayos a distintas
condiciones se llega a establecer el siguiente método:
Se diluyen aproximadamente 6 g de harina de banano verde en 100 ml de agua destilada,
se licúa y se filtra, se toma una alícuota de 25 ml y se diluyen a 50 ml, de esta se toman
cuatro alícuotas de 10 ml a las que se le adiciona ácido sulfúrico hasta obtener un pH
50
entre 1 y 2, después se llevan a un baño María a una temperatura de 90 oC y presión
atmosférica. El jugo ya hidrolizado se lleva a un pH igual a 5.4 con NaOH. Los resultados
de la hidrólisis ácida con ácido sulfúrico se presentan en la Tabla 13.
FIGURA 16. Hidrólisis Acida del jugo de banano
TABLA 13. Hidrólisis Ácida con ácido sulfúrico
Muestra Tiempo
Hidrólisis
(min.)
Vol. Final
(ml)
Absorbancia Azúcares red.
(ppm)
% (g azúcar/ 100 g
harina inicial)
1 15 50 0.521 509.6 16.99
2 30 54 0.754 742.6 26.73
3 45 62 0.716 704.6 29.12
4 60 68 0.634 622.6 28.22
Luego de la hidrólisis se hace una determinación del porcentaje de almidón que hay
presente y para el hidrolizado de harina es de 2.78% (en la muestra 4); concluyendo de
esta manera que se convierte un 93% de los almidones presentes inicialmente.
51
FIGURA 17. Jugo de banano hidrolizado
Hidrólisis Enzimática
La enzima facilitada por Cervunión S.A, la cual es una enzima dextrizante de alto peso
molecular (de 400 a 500 u.m.a.), no se conoce su caracterización debido a que hace parte
del know-How de la empresa, al no conocer esta caracterización no sabemos cual es la
verdadera potencialidad de hidrólisis, o sea hasta que punto llega a degradar los
almidones, si realmente llega a glucosa o a otro producto diferente. Se sospecha que es
-amilasa. Esta se agrega al sustrato en ebullición o maceración
Se seleccionan como condiciones las recomendadas por Botero en su trabajo de hidrólisis
enzimática: Volumen de agua 867 ml y peso de harina 227 g (las cuales obtuvieron los
mejores resultados para la obtención de glucosa), [Botero, 1993].
Se prepara un jugo clarificado (47 g de harina + 200 ml de agua destilada); se procede a
hacer la gelatinización en un baño María a 80 OC durante 5 minutos teniendo el jugo a un
pH entre 6 y 6.5, después de tener la suspensión gelatinizada se enfría hasta 70 OC, luego
de la cual se le agrega una solución preparada (agua destilada 20 ml + Enzima 0.015 g/g
almidón). Se sacan 4 alicuotas de 50 ml, las cuales se colocan en el baño María a 70 OC.
Al final de la experiencia se realiza análisis de azucares reductores a distintos tiempos.
Los resultados para esta hidrólisis se presentan en la Tabla 14.
52
TABLA 14. Hidrólisis Enzimática
Muestra Tiempo (horas) Porcentaje Azúcares reductores %
1 1 8.46
2 1.5 9.12
3 2 12.09
4 2.5 10.81
Al analizar estos resultados se observa que no se presento hidrólisis de almidones, ya
que los porcentajes corresponden a los porcentajes de azúcares reductores de la muestra
inicial. Por lo tanto se escoge la hidrólisis ácida en vez de la enzimática, por tener mejores
resultados.
Selección del método entre hidrólisis ácida con ácido sulfúrico y enzimática con
y amilasa
Se escoge la hidrólisis ácida con ácido sulfúrico como el mejor método de hidrólisis,
debido a que:
- Se tiene a disposición todos los equipos de laboratorio necesarios para realizar la
hidrólisis ácida.
- Las enzimas necesarias para realizar la hidrólisis enzimáticas ( y amilasa)son
costosas y difíciles de conseguir (deben ser importadas).
- El método de la hidrólisis enzimática es más riguroso que el de hidrólisis ácida, debido
a las condiciones de asepsia, mantenimiento de la enzima a bajas temperaturas (40C).
- El tiempo de hidrólisis es menor en hidrólisis ácida que enzimática.
- La hidrólisis enzimática reporta malos resultados, ya que la tasa de conversión de
almidón a azúcares reductores es baja. (la hidrólisis enzimática si tiene buenos
resultados según la bibliografía consultada, pero contando con todos los medios
apropiados, enzimas, para su realización).
53
2.2. PROCESO FERMENTATIVO
En la Figura 18 se observan las etapas del proceso fermentativo.
FIGURA 18. Diagrama de flujo del proceso fermentativo
54
Neutralización del hidrolizadoLlevar a pH= 5
Enriquecimiento
Esterilización del medio
Inoculación
Fermentaciónt= 60 h
T= 30 0CpH= 5
2.2.1 Materiales y métodos
Equipo
El equipo utilizado para la fermentación fue el siguiente:
- Reactor batch : Balón de vidrio de dos bocas de 500 ml, al cual se le adapta un
sistema de venoclisis (previamente esterilizado) para la toma de muestra y el escape
de CO2.
Este reactor se introduce en un tanque (Baño María), el cual se coloca sobre una plancha
de agitación con calentamiento adecuando la temperatura para el proceso fermentativo
(30 oC) a 100 r.p.m
- Autoclave: Consolidate. Stills & Sterilized. Boston. Modelo 16D36
- Incubadora: Cenco. Con control de temperatura
- pHmetro: (PHC-2201), BiottCo Ltd, Tokyo.
- Vidriería: Pipetas, Erlenmeyer, Beaker, Cajas de Petri, Tubos de ensayo.
- Equipos de microbiología : Microscopio, Asas, Estiletes, Mechero, Portaobjetos.
Esterilización y Desinfección
La finalidad de la esterilización es eliminar todos los microorganismos o evitar su posterior
reproducción. Generalmente se esterilizan los equipos implicados con el proceso (reactor,
herramientas, utensilios) y el medio.
La esterilización generalmente se realiza con vapor y se logra que las levaduras y los
hongos similares mueran a temperaturas y presiones altas ( >100 oC y >15 Lb). [Brock]
55
TABLA 15. Métodos de desinfección
Vidriería Solución jabonosa antibacterial, agua caliente.
Autoclave
Reactor Solución jabonosa antibacterial, agua caliente.
Hipoclorito de Sodio.
Area de trabajo Solución jabonosa antibacterial, Hipoclorito de
Sodio.
Microorganismo
Se utiliza Zymomonas mobilis NRRLB14022, cedido por el Departamento de Agricultura
de los Estados Unidos (USDA) la cual se encontraba liofilizada, por lo que tuvo que ser
rehidratada de acuerdo al medio de rehidratación recomendado por USDA; el medio de
rehidratación está compuesto por (g/L): Glucosa 20, Extracto de levadura 10, y Peptona 5.
Se dejo en una incubadora a una temperatura de 30 0C, por un tiempo de 48 horas.
Se selecciona este microorganismo debido a que en comparación con otros, como la
Saccharomyces cerevisiae, la Zymomonas tiene una mayor velocidad de producción de
alcohol, además de muchas otras ventajas, como mayor tolerancia a la concentración de
alcohol, entre otras ya mencionadas anteriormente.
Luego de rehidratar la Zymomonas mobilis, esta se siembra en un medio de
mantenimiento compuesto de glucosa, extracto de levadura y agar. Despues de 24 horas
y a una temperatura de 30 0C, se realiza una coloración por medio del método de Gram
(Anexo 7), con el fin de visualizar en el microscopio las características de la bacteria; se
realiza la prueba de la Catalasa y la oxidasa, dando como resultado que la bacteria es un
bacilo gram negativo, de Catalasa positiva y Oxidasa negativa, y con el tamaño reportado
en la bibliografía.
56
Medio de cultivo
Después de realizar muchos ensayos se encuentra que el medio óptimo de crecimiento y
fermentación es el propuesto por [Sreekumar, 1999] con la siguiente composición:
TABLA 16. Medio de fermentación óptimo seleccionado
Glucosa (g/L) 120.4
Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 (g/L) 0.96
Fosfato Dihidrogenado de potasio KH2PO4 (g/L) 0.02
Extracto de Levadura (g/L) 6.5
Sulfato de Magnesio Heptahidratado MgSO4.7H2O (g/L) 0.5
En este medio se observa un buen crecimiento, mientras que en los medios propuestos
por [Kondo, 1996] y [Bergey`s,1984] no dieron los resultados esperados para esta cepa
de Zymomonas mobilis.
Métodos de Análisis
La concentración de azúcares se determina por el método del ácido dinitrosalicílico (DNS)
(Ver Anexo 2). La concentración de almidón se determina por el método de Marta
Quicazán (UNAL) (Ver Anexo 3). Los azúcares totales por el método de ácido clorhídrico
(UNAL) (Ver Anexo 1). El etanol por el método de índice de refracción (UNAL) (Ver
Anexo 6).
2.2.2 Fermentación
Preparación del medio de fermentación
Se realiza un análisis de nutrientes del jugo de harina de banano ya hidrolizado para
determinar si es necesario adicionar los nutrientes básicos para una buena fermentación
exigidos por la Zymomonas mobilis.
57
Determinación de Nutrientes en el jugo hidrolizado
La concentración inicial de azúcares en el jugo hidrolizado fue de 90 g/L, el análisis de los
micronutrientes fue realizado en el laboratorio de Ingeniería Sanitaria de la Universidad
Nacional, Sede Medellín.
Los resultados fueron los siguientes:
TABLA 17. Determinación de nutrientes en el jugo hidrolizado
Dureza cálcica, CaCO3 40.0 mg/L
Nitrógeno amoniacal NH3 como N 7.2 mg/L
Fósforo total, P 7.64 mg/L
Debido a que estas cantidades son muy pequeñas, comparadas con las requeridas por el
medio nutricio, se adicionaron las cantidades recomendadas por [Sreekumar,1999]. Ver
Tabla 16.
Esterilización
Se esteriliza el jugo hidrolizado enriquecido en autoclave a 15 psi, 121oC durante 15
minutos. Esta causa evaporación y por tanto incrementa la concentracion de azucares a
100.37 g/L.
Inoculación
El objetivo de la etapa de inoculación es conseguir un medio donde los microorganismos
estén en condiciones óptimas de crecimiento. Su cantidad debe ser tal que al inocular en
el fermentador se logre una adecuada capacidad de asimilación de sustrato.
Para evitar la fase Lag y además evitar choques osmóticos debido a los gradientes de
concentración entre el medio fermentativo y el medio de inoculación, se necesitan
58
relaciones entre el volumen del inóculo y el volumen del medio fermentativo entre el 5 –
10 % en volumen. Se debe utilizar el mismo sustrato en el medio de inoculación ya que
favorece la síntesis de bioenzimas necesarias para el consumo del sustrato del medio
fermentativo.
La temperatura del inoculo debe ser la misma del medio fermentativo para evitar choques
térmicos; la temperatura del proceso es de 30 oC que corresponde a la temperatura
optima de crecimiento de Z. mobilis. [Kondo, 1996]
Con respecto a la cantidad de bacteria en el inóculo los autores estudiados recomiendan
que se obtiene un mayor rendimiento en la producción de etanol con concentraciones
iniciales alrededor de 0.2 g/L de Z. mobilis en el inóculo. [Laplace, 1991]
FIGURA 19. Fermentación del jugo de banano hidrolizado.
Seguimiento del proceso (Datos obtenidos)
Se toman muestras periódicamente para determinar consumo de azúcares reductores,
producción de etanol; concentración de microorganismo y pH, el cual se mantuvo
constante en un intervalo de 5.2 a 5.5.
La fermentación terminó cuando la concentración de etanol se mantuvo constante con el
tiempo y cesa la producción de CO2.
59
La Tabla 18 reporta los datos obtenidos y la Figura 20 muestra la cinética de la
fermentación.
TABLA 18. Datos obtenidos en el proceso de fermentación
Tiempo
(h)
Concentración
de Azúcar
(g/L)
Concentración
de Alcohol
(ml/L)
Concentración
de Alcohol
(g/L)
Concentración
de Biomasa
(g/L)
1 100.37 5.98 4.73 0.74
6 99.63 5.98 4.73 0.68
11 98.88 5.98 4.73 0.92
14 98.88 7.69 6.08 1.16
17 97.68 8.55 6.75 0.91
20 95.58 11.11 8.78 0.98
26 64.43 18.80 14.85 1.81
29 52.75 25.64 20.26 2.25
32 39.42 27.35 21.61 2.71
35 28.34 44.44 35.11 3.44
38 18.30 46.15 36.46 3.59
42 14.71 48.72 38.49 3.69
46 11.71 50.43 39.84 4.09
65 10.50 52.99 41.86 3.83
Las muestras del mosto fermentado se centrifugaron con el fin de separar la biomasa para
el posterior análisis.
60
FIGURA 20. Cinética de la fermentación de hidrolizado de banano verde por
acción de Zymomonas mobilis.
61
Rendimientos
Hidrólisis
Rendimiento de hidrólisis = ( Azúcar después de hidrólisis – Azúcar antes de hidrólisis ) x 100
Almidón Inicial
A partir de 30 g de almidón se obtienen 21 g de azúcares reductores, con un rendimiento
del 70%.
Fermentación alcohólica.
A partir de 100 g/L de azúcares reductores iniciales, la Zymomonas mobilis utiliza 90 g/L
(un 90%) de los cuales se obtienen 41.86 g/L de etanol, con un rendimiento de 0.47
gramos de etanol por gramo de glucosa a las 65 horas, lo que corresponde a un 95% del
rendimiento teórico.
Rendimiento Real = [ ] de alcohol x 100
[ ] de azucares
Rendimiento Teórico = 0.5 g de etanol / g de glucosa
Productividad Real = [ ] de alcohol (g/L) x 100
[ ] de azucares (g/L) x tiempo (h)
Donde:
[ ] = concentración
A partir de estas ecuaciones y de los datos de la Tabla 18, se obtiene la Tabla 19.
62
TABLA 19. Productividad y Rendimientos de la fermentación.
Tiempo
(h)
Rendimiento Real
(g etanol/g glucosa)
Productividad
Real (g/g.h) x10 -3
% Rendimiento teórico
=(Rendimiento Real
/Rendimiento teórico) x 100
1 0.05 5.0 10.73
6 0.05 8.3 10.73
11 0.05 4.5 10.73
14 0.07 5.0 13.80
17 0.08 4.7 15.33
20 0.10 5.0 19.93
26 0.17 6.5 33.73
29 0.23 7.9 45.99
32 0.24 7.5 49.06
35 0.39 11.1 79.73
38 0.41 10.8 82.80
42 0.43 10.2 87.39
46 0.44 9.6 90.46
65 0.47 7.2 95.06
2.3 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
- Los métodos estandarizados para determinación de almidón, azucares reductores,
alcohol y cantidad de biomasa, son buenos pero presentan el inconveniente de:
exigencia de equipos especializados como espectrofotómetro, polarímetro,
refractómetro y reactivos muy costosos
- La elaboración de la harina de banano no presentó ningún inconveniente, debido a
que se encontró el equipo necesario y se obtuvo una humedad optima (13%), gracias
a la cual no se presentó contaminación por microorganismos.
63
- Al diluir la harina se presentan problemas debido a la alta viscosidad, lo que impide
una buena agitación, lo cual hace que el régimen de agitación no sea igual para todos
los ensayos y su variación pudo afectar los resultados finales (en la concentración de
azucares del jugo) ya que no hay reproducibilidad.
La filtración del jugo requiere gran cantidad de tiempo y no se contó con un equipo
especializado para realizarlo (filtroprensa o filtración al vacío tipo Oliver) y la forma
como se llevo a cabo permitió además de la contaminación (polvo de la centrifuga,
manipulación con la mano y equipos contaminados), la perdida de material, lo cual
influye en los resultados.
- Los resultados presentados por la bibliografía de los diferentes tipos de hidrólisis,
tanto la enzimática como la ácida, presentan grandes incoherencias en las
condiciones de presión, temperatura, tiempo, concentración de ácidos y enzimas; y
rendimientos de conversión a azucares reductores. Lo que causo problemas en la
selección del método optimo a seguir.
- Para la hidrólisis enzimática, no se contó con las enzimas apropiadas. Los ensayos
de esta hidrólisis se desarrollaron por una enzima donada por Cervunión, la cual se
sospechaba que era y amilasa (más no se tuvo la caracterización de esta por
hacer parte del know-how de la empresa), sin obtenerse ningún resultado en la
realización de la hidrólisis.
- La hidrólisis ácida se realizó con H2S04, debido a que no se obtuvo ningún resultado
con HCl. Además, no se contó con ningún equipo especializado para la realización de
la hidrólisis que evitara perdidas del jugo por evaporación y que controlara el pH de
este. El jugo hidrolizado también tuvo que filtrarse (formación de sustancia gomosa),
pero este ya no presentó problema alguno (filtración al vacío simple).
- En el desarrollo del trabajo, la hidrólisis ácida presenta resultados reproducibles (se
realizó varias veces obteniéndose resultados similares), el contenido de azucares se
triplico. Ver Tabla 13.
64
- El encontrar el medio optimo de crecimiento, mantenimiento y fermentación de la
Zymomonas mobilis, trajo muchas dificultades y retrasos en el trabajo. Ya que, o no
crecía, o se moría, o crecía demasiado lento, o se estresaba. Se requirió de un arduo
trabajo en el laboratorio de Microbiología de la Universidad y de mucha asesoría de
parte del encargado de este, debido a que la Zymomonas mobilis se contaminaba
muy fácil a pesar de los cuidados que se tenían, también mutaba muy fácil
(crecimiento pleomórfico, lo cual baja la eficiencia del microorganismo en la
fermentación), al hacer los repiques para la renovación de la cepa. Se recomienda
para un buen manejo de la cepa, una persona especializada en este campo, que le
dedique el tiempo necesario para obtener buenos resultados.
- La inexperiencia en la escogencia, preparación (esterilización), del reactor y en el
sistema de la toma de muestras y escape de CO2, trajo retrasos de tiempo.
- De acuerdo a la Tabla 19, se observa que el rendimiento obtenido es un poco mayor
al rendimiento alcanzado en otras fermentaciones alcohólicas reportadas por la
bibliografía (a nivel de laboratorio) el cual no excede el 90 a 95% del valor teórico.
- La Figura 20, muestra el progreso en el tiempo de la producción de etanol. La
velocidad de producción de etanol en la fase temprana del cultivo utilizando jugo de
banano hidrolizado es relativamente lenta, pero se incrementa rápidamente después
de las 24 horas. La fermentación se completó después de las 46 horas. La
concentración final de etanol fue de 41.86 g/L.
- Está figura también muestra el cambio en la concentración residual de glucosa, y se
observa que a partir de las 46 horas la concentración de glucosa permanece
constante sin agotarse totalmente (10.50 g/L).
- En la misma figura, se observa una semejanza entre la curva de concentración de
etanol y la curva de biomasa, observándose que el punto de máxima concentración de
etanol coincide con el de máxima concentración de biomasa, esto puede deberse a
que el microorganismo no presenta retardo en eliminar el etanol que produce
65
- La producción de etanol en cultivo Batch, usando jugo de banano verde hidrolizado es
de 0.47 gramos de etanol por gramo de glucosa, lo que corresponde a un 95% de la
productividad teórica.
- La máxima productividad se presenta entre las 35 y 38 horas (0.0111 g/g.h). Ver Tabla
19.
- El crecimiento del microorganismo presenta una curva típica (Figura 20); se monitorea
el crecimiento celular de la Zymomonas mobilis, observándose que la fase de
adaptación se da en las primeras 20 horas, después de las cuales comienza la fase
exponencial de crecimiento la cual se da hasta las 36 horas, de hay en adelante se
aprecia una fase de desaceleración del crecimiento a las 65 horas.
- A las 46 horas se observa el máximo crecimiento de la Zymomonas mobilis
equivalente a 4.09g/L de células. A partir de este momento el microorganismo
empieza a disminuir hasta llegar a 3.83 en las 65 horas (Figura 20)
2.4 COMPARACIÓN CON LOS RESULTADOS REPORTADOS CON Saccharomyces
cerevisiae
Las fermentaciones industriales para la producción de alcohol son desarrolladas casi
exclusivamente por levaduras (Saccharomyces cerevisiae), la bacteria Zymomonas
mobilis es un organismo potencialmente útil para la producción comercial de alcohol, el
cual puede fermentar glucosa, fructosa y sacarosa.
Comparando la Z.mobilis con la S.cerevisiae en la producción de alcohol, la Zymomonas
mobilis tiene mayor velocidad de producción, aún cuando ambos organismos son
similares en otras facciones (ver Tabla 20)
Al comparar los resultado obtenidos en este trabajo, con la Tabla 20, se crea la duda de
cómo fue calculada la velocidad de productividad de etanol (son 50 veces mas altos)y la
velocidad de productividad volumétrica de etanol por este autor, ya que no se presenta
información experimental de cómo se obtuvieron los datos expuestos en la Tabla 20.
66
TABLA 20. Comparación de Z.mobilis y S.cerevisiae en la producción de
alcohol. [Glick, 1994]
Productores
de alcohol
Conversión
de azúcar a
etanol (%)
Velocidad de
productividad
de etanol
(g/g.h)a
Velocidad de
productividad
volumétrica
de etanol
(g/L.h) a
Intervalo de
pH para la
producción
de etanol
Temperatura
optima (oC)
Z.mobilis 96 5.67 200 3.5-7.5 25-30
S.cerevisiae 96 0.67 29 2-6.5 30-38
a La velocidad de productividad de etanol es medida bajo condiciones de fermentación batch. La
velocidad de productividad volumétrica de etanol fue medida durante un cultivo continuo. La
producción de las dos cepas tuvieron la misma máxima concentración de etanol (12%) y poseen la
misma tolerancia de azúcar (>40%).
Muchos de los experimentos realizados sobre las Z.mobilis se han concentrado en
expandir los sustratos que esta puede utilizar, por ejemplo codificación de genes de
enzimas que pueden hidrolizar lactosa, almidón , celulosa, xilosa y celubiosa, han sido
introducidos en las Zymomonas. [Glick, 1994]. Muchos investigadores están confiados
que algún día estas Z.mobilis codificadas con genes puedan ser usadas para convertir
materiales de desecho en alcohol sin previo tratamiento de este. [Glick, 1994]
La Zymomonas mobilis presenta algunas ventajas sobre las levadura (Saccharomyces
carlsbergensis, Saccharomyces cereviseae)para la producción de etanol, a partir de un
medio con concentraciones elevadas de glucosa, son:
- Velocidades especificas de consumo de sustrato y de producción de etanol elevados.
- Mayor productividad volumétrica de etanol.
- Rendimiento de etanol superior y el de biomasa inferior.
- No necesita aporte de oxigeno.
- Mayores posibilidades de manipulación genética.
- Alta tolerancia al etanol y a las altas temperaturas.
- Bajos niveles de productos tales como ácidos y glicerol.
- Características apropiadas de floculación y sedimentación que facilitan el reciclo.
67
La desventaja principal de la Z. mobilis frente a la S.cerevisiae, es que se requiere un
manejo microbiologico mas exigente; y otra es que la S.cerevisiae es mas fácil de
conseguir (supermercados, tiendas).
En los trabajos de fermentación de banano por acción de S.cerevisiae (Tabla 10), se
observa que la fermentación se da entre 48 y 60 horas, en este trabajo con Z.mobilis, la
fermentación prácticamente se completa a las 36 horas.
Los porcentajes de rendimiento teórico para S.cerevisiae oscilan entre 80 y 90%, mientras
que con Z.mobilis se obtuvo un 95% del rendimiento teórico.
68
3. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
- Al realizar la parte experimental de este trabajo se pudo obtener alcohol mediante un
proceso de fermentación a partir de banano de rechazo, previa hidrólisis por acción de
Zymomonas mobilis.
- La importancia de este trabajo, es que se realizo a partir de un sustrato real (Banano
de rechazo) y no a partir de un sustrato sintético (Glucosa, extracto de levadura,
peptona, sales minerales, etc), como lo hacen en muchos estudios consultados en la
bibliografía (muchos de estos estudios trabaja con sustratos sintéticos).
- En la elaboración de harina a partir de banano verde, se logró mantener uniformidad
en las muestras a analizar, evitando maduración del fruto y eventuales focos de
contaminación.
- Se recomienda la hidrólisis ácida con ácido sulfúrico gracias a: la fácil consecución y
bajo costo del ácido, que se lleva a cabo a presión atmosférica, tiempo de desarrollo
corto, y buena conversión de almidón a azúcares reductores; aunque la temperatura
de la hidrólisis ácida es alta (90oC) no difiere mucho de la de hidrólisis enzimática (70 oC). (al realizar la hidrólisis ácida se observa que hay una conversión a glucosa del
93% de los almidones presentes en la harina de banano, triplicándose los azúcares
iniciales). El rendimiento de esta hidrólisis es de 0.67 g de glucosa/g de almidón
inicial.
Los resultados de la fermentación obtenidos en este estudio sugieren que el jugo de
banano verde hidrolizado contiene cantidades adecuadas de fuente de carbono las
cuales son esenciales para el crecimiento satisfactorio y producción de etanol por
parte de Zymomonas mobilis.
69
- No solo se realizo una corrida de la fermentación, se hicieron varios preensayos de
esta, los cuales arrojaron resultados muy parecidos. La dificultad de estas corridas era
la falta de equipos y reactivos de laboratorio, espacio en los laboratorios.
- Se obtuvo rendimiento de 0.47g de etanol/g glucosa (lo que corresponde a un 95% del
rendimiento teórico); con una concentración final aproximada de etanol al 5.3%(v/v) ó
4.19%(p/v) en un tiempo de 38 a 46 horas contando la fase de latencia. Después de
que la Z.mobilis ha pasado su período de latencia, la fermentación se efectúa en 20 a
24 horas aproximadamente.
- El pH en la fermentación alcohólica (Batch) no tiene un cambio significativo
permaneciendo en el intervalo requerido, por lo tanto no es necesario un control de
este.
- Se recomienda buscar un método óptimo de filtración, para evitar las excesivas
pérdidas de material.
- Para disminuir la fase de latencia del microorganismo hay que adaptarlo con el fin de
que se acostumbre al sustrato antes de la fermentación para obtener mejores
resultados
- Se sugiere calentar el jugo antes de la hidrólisis a 50oC durante 15 minutos para lograr
una mejor solubilización de los almidones.
- La productividad de la fermentación con Z.mobilis, puede ser mejorada realizando
barridos con nitrógeno al reactor, ya que se dan mejores condiciones de anaerobiosis.
- Trabajar con células inmovilizadas permitiría realizar una fermentación continua, la
cual tiene una mayor eficiencia que la fermentación Batch (según la bibliografía).
- Ver la posibilidad de conseguir una cepa mejorada de Zymomonas mobilis, la cual sea
más resistente y más eficiente (mejor comportamiento cinético).
70
- Conseguir equipos especializados para la filtración, hidrólisis y fermentación, los
cuales permitan un manejo más aceptable de ascepcia y eviten pérdidas de material
excesiva, lo cual lleva a una mayor eficiencia del proceso.
- Estudiar con el propósito de optimizar los métodos de hidrólisis ácida y enzimática, en
busca de obtener mejores rendimientos y menor perdida de material (sustrato).
- Se recomienda un estudio especializado en el manejo genético y microbiológico de la
Zymomonas mobilis, con el fin de aprovechar los avances en este campo, en el que se
realizan: simultáneamente hidrólisis y fermentación por acción de esta bacteria
modificada genéticamente, mayor tolerancia a concentraciones altas de sustrato y
producto, altas temperaturas, capacidad de desdoblar celulosa, lignocelulosa, xilosa,
etc.
- Estudiar con le propósito de optimizar los métodos de concentración y purificación de
alcohol obtenido.
71
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ANEXOS
ANEXO 1. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES TOTALES
Según el método utilizado en el Lab. de alimentos de la universidad, se toman
aproximadamente 6 g de harina se diluye en agua destilada y se llevan a un balón de 100
78
ml, de acá se toma una alícuota de 10 ml y se le adicionan 10 ml de HCl (6 N), se calienta
al baño María a 70 oC durante un tiempo de 15 min. El jugo hidrolizado se lleva aun pH
igual a 5.4 con NaOH para después analizar por el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico.
Los azúcares totales corresponden los azúcares obtenidos después de realizado este
proceso menos los azúcares iniciales en la harina
ANEXO 2. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES
Método: Usando el ácido dinitrosalicílico [Miller, 1959]
Fundamento
El ácido 3,5-dinitrosalicílico se reduce a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico mientras los grupos
aldehídos se oxidan a grupos carboxílicos.
La principal ventaja de este ácido en la determinación de azúcares reductores, se
encuentra en la gran conveniencia que tiene comparada con la mayoría de las otras
pruebas para azúcares, en las cuales generalmente se deben realizar un gran número de
pruebas.
Procedimiento
Preparación del reactivo de Summer
Este se prepara conteniendo 1% de ácido 3,5-dinitrosalicílico, 0.2% de fenol, 0.05% de
bisulfito de sodio y 1% de hidróxido de sodio, con los porcentajes en peso por volumen.
Se pesan cantidades exactas de los reactivos y se disuelven todos los sólidos en la
solución que contiene 1% de hidróxido de sodio. Este reactivo debe guardarse a baja
temperatura.
79
Preparación de la sal de Rochelle
Se prepara con una concentración de 40% porcentaje en volumen. (tartrato de sodio).
Construcción de la curva patrón
Se parte de una solución patrón de glucosa con una concentración de 1 mg/ml. Se
establece una escala estándar de 0 a 1 mg/ml tomando volúmenes de 0,5,7,10,17,20,25
ml de la solución patrón y completando a 25 ml con agua destilada en balones
volumétricos.
Se toman alicuotas de 3 ml de cada una de las soluciones de la escala estándar, se llevan
a tubos de ensayo con 3 ml de agua destilada y 3 ml de reactivo de Summer. Se agita y
se lleva a baño María durante 15 minutos, se retiran y se le agrega a cada tubo 1 ml de la
sal de Rochelle, se dejan enfriar a temperatura ambiente.
Se llevan las soluciones al espectrofotómetro para realizar las curvas de absorbancia a
una longitud de onda de 575 nm; utilizando la solución con concentración de 0 mg/ml de
glucosa como blanco.
Con los datos obtenidos se construye una gráfica Absorbancia vs. Concentración, la cual
debe ser una línea recta con un coeficiente de correlación que no debe ser menor de
0.99.
La ecuación para relacionar absorbancia contra concentración con un coeficiente de
correlación de 0.9909 es:
C= ( A – 0.0114 )/ 0.001
Donde: C: Concentración de azúcares reductores (mg/ml)
A: Absorbancia obtenida
80
Para la etapa de fermentación, se realiza otra curva de calibración, debido a que se contó
con un espectrofotómetro diferente.
La ecuación para relacionar absorbancia contra concentración con un coeficiente de
correlación de 0.9998 es:
C= ( A + 0.0002 )/ 0.6677
Donde: C: Concentración de azúcares reductores (mg/ml)
A: Absorbancia obtenida
ANEXO 3. DETERMINACIÓN DE CONTENIDO DE ALMIDÓN
Fundamento
Se fundamenta en la hidrólisis que ejerce el ácido clorhídrico sobre el almidón,
produciendo glucosa, sustancia ópticamente activa. Este producto se evalúa
polarimétricamente y su contenido se corrige descontando los azucares que contenga el
alimento, los cuales son extraídos con agua y tratados con ácido. [Quicazán, 1992]
Equipo
- Balanza analítica.
- Agitador magnético.
- Polarímetro.
- Baño María.
- Balones volumétricos.
- Embudos.
Reactivos
81
- Acido Clorhídrico al 1.128%.
- Acetato de Zinc al 21.9%
- Ferrocianuro de Potasio al 1.6%
Procedimiento
Se toma 2.5 g de muestra seca a 60 0C en un volumétrico de 100. Se adicionan 50 ml de
HCl y se coloca al baño María a ebullición con agitación durante 15 min. Se enfría
rápidamente y se le adicionan 20 ml de agua destilada, 5 ml de solución de acetato de
zinc y de solución de ferrocianuro; se completa el volumen con agua destilada y se filtra.
Para este filtrado se lee el ángulo de rotación en el polarímetro utilizando un tubo de 200
mm.
Tratamiento del blanco : En un volumétrico de 100 ml se toma 5 g de muestra. Se le
adiciona 40 ml de agua para suspender la muestra y luego otros 5 ml para enjuagar las
paredes del volumétrico. Se le adicionan 5 ml de acetato de zinc y solución de
ferrocianuro de potasio, se completa el volumen con agua destilada y se filtra. Se toma
una alícuota de 50 ml de filtrado en un volumétrico de 100 ml, se le adicionan 2 ml de HCl
al 37%. Se calienta con agitación al baño María durante 15 min. Se enfría, se completa a
volumen y determinamos el ángulo de rotación.
Cálculos
% Almidón = [( B- C) x V x 100] / ( 2 x D x F x M)
Donde: %A: contenido de almidón en la muestra, en porcentaje.
D: Rotación específica para cada alimento (180 para este caso)
B: Ángulo de rotación total.
C: Ángulo de rotación del blanco.
V: Volumen total.
M: Peso en gramos de la muestra.
82
F: Factor de equivalencia entre alimento fresco y alimento seco a
60 0C.
ANEXO 4. DETERMINACIÓN DE BIOMASA
Para conocer el crecimiento del microorganismo en el medio de cultivo se realizó esta
determinación en el Laboratorio de Control Microbiológico y Físico Químico de los
Alimentos del Colegio Mayor de Antioquia. Se anexa el correspondiente informe.
L A C M ALABORATORIO DE CONTROL MICROBIOLOGICO Y FÍSICO QUÍMICO DE LOS ALIMENTOS
CONTROL: 041-02EMPRESA: UNIVERSIDAD NACIONAL - MEDELLÍNPRODUCTO A ANALIZAR: Microorganismo en medio de cultivo.FECHA DE RECOLECCION: 27-06-2002.FECHA DE ANÁLISIS: 27-06-2002.ANALISIS SOLICITADO: Curva de crecimiento.MUESTRA TOMADA POR: Carlos Naranjo.CANTIDAD: 200 ml aprox.EMPAQUE: Frasco de vidrio estéril con tapa rosca
plástica.
ANALISIS ORGANOLÉPTICOASPECTO Líquido no translucido, turbio.COLOR Amarillo ámbarOLOR Propio.
CURVA DE CRECIMIENTO DE LA BACTERIA Zymomonas mobilis
PROCEDIMIENTO:
El proceso se inicia realizando una suspensión en dilución 1:9 de la bacteria rehidratada en un medio de cultivo líquido que contiene sales de fosfato y glucosa, siendo éste t0
(tiempo = 0 horas), t1 (tiempo = 6 horas), t2 (tiempo = 12 horas), t3 (tiempo = 24 horas) y t4
(tiempo = 36 horas).
Para la elaboración de la curva de crecimiento se utilizaron 3 métodos diferentes: determinación de biomasa, recuento directo de células en cámara de Neubauer y turbidimetría (D.O).
83
DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE BIOMASA: se obtiene peso constante mediante evaporación del agua a 103°C. El resultado se obtiene por diferencia de peso expresado en porcentaje. Se aplica la técnica a un blanco equivalente al medio de cultivo, así como a alícuotas de t0, t2 y t3.
Resultados: Blanco = 8.36% t0 = 8.66% t2 = 8.85% t3 = 10.80%
Se resta el blanco a t0, t2 y t3 para obtener el porcentaje de la masa celular:
t0 = 8.66% – 8.36% = 0.3% de biomasat2 = 8.85% - 8.36% = 0.49% de biomasat3 = 10.8% - 8.36% = 2.44% de biomasa
RECUENTO DIRECTO DE CÉLULAS EN CÁMARA DE NEUBAUER: se realiza conteo de células en el retículo central de la cámara que posee 25 cuadrados, con un área de 1 mm2, profundidad de 0.1 mm, volumen de llenado de 0.01 ml. El resultado se obtiene multiplicando el número de células contadas por un factor de conversión. Se aplica la técnica a t0, t1 , t2, t3 y t4 .
Resultados: t0 = 9.7 x 105 células/ ml t1 = 10.6 x 105 células/ ml
t2 = 10.7 x 105 células/ ml t3 = 51.3 x 105 células/ ml
t4 = 77.5 x 105 células/ ml
TURBIDIMETRIA: se realiza lectura en espectrofotómetro a una longitud de onda de 578 nanómetros (nm), en absorbancia (Densidad Óptica) a t0, t3 y t4.,frente a blanco de agua destilada. Cada una de las alícuotas se someten a centrifugación a 3000 RPM por 5 minutos, para obtener un pellet de las células y luego ser lavadas y resuspendidas en solución salina isotónica estéril para realizar la medición en el espectrofotómetro. La absorbancia obtenida es confrontada con la escala de Mac Farland, cuyas concentraciones fueron medidas a la mismas condiciones de las alícuotas (absorbancia y longitud de onda).
Resultados: t0 = 0.019 D.O. t3 = 0.060 D.O. t4 = 0.088 D.O.
CONTROL: 041-02
Patrón de Mac - Farland: Tubo 1: 0.025 D.O. equivalente a una concentración de 3 x 108 cél./ ml
84
Tubo 2: 0.031 D.O. equivalente a una concentración de 6 x 108 cél. / mlTubo 3: 0.047 D.O. equivalente a una concentración de 9 x 108 cél. / mlTubo 4: 0.062 D.O. equivalente a una concentración de 12 x 108 cél. / mlTubo 5: 0.089 D.O. equivalente a una concentración de 15 x 108 cél. / mlTubo 6: 0.099 D.O. equivalente a una concentración de 18 x 108 cél. / mlTubo 7: 0.112 D.O. equivalente a una concentración de 21 x 108 cél. / mlTubo 8: 0.128 D.O. equivalente a una concentración de 24 x 108 cél / mlTubo 9: 0.161 D.O. equivalente a una concentración de 27 x 108 cél. / mlTubo 10: 0.175 D.O. equivalente a una concentración de 30 x 108 cél. / mlCorrelacionando los resultados con el patrón de Mac – Farland se determina que el t3 = 12 horas presenta una concentración aproximada a 12 x 108 células / mililitro y t4 = 24 horas presenta una concentración aproximada a 15 x 108 células / mililitro.
CONCLUSIÓN
Los resultados obtenidos en las 3 técnicas aplicadas: determinación del porcentaje de biomasa, recuento de células en cámara y turbidimetría para la elaboración de la curva de crecimiento de Zymomonas mobilis indican que la fase de latencia o adaptación se realiza en las primeras 12 horas, para continuar con la fase logarítmica o exponencial entre las 24 horas y las 36 horas.
SUGERENCIAS
Realizar curva de crecimiento de Zymomonas mobilis determinando las 4 fases: latencia o adaptación, logarítmica o exponencial, estacionaria y declinación o muerte
Margarita Gutiérrez BuriticáBacterióloga CMAEspecialista en Ciencia y Tecnología de AlimentosJefa LACMA Medellín, junio 19 de 2002ANEXO 5. FUNDAMENTOS DE LOS METODOS DE DETERMINACION DE BIOMASA
El crecimiento de una población microbiana se mide siguiendo los cambios en el numero
de células o el peso de la biomasa celular, de acuerdo a los siguientes métodos:
[Madigan, 1997]
Contaje total de células
El número de células de una población puede medirse directamente al microscopio. Se
puede realizar en muestras líquidas, las que requieren “cámaras especiales de Contaje’.
85
En ellas la superficie del porta lleva marcada una rejilla, encima de cada cuadrado de la
rejilla se coloca un volumen conocido de muestra. El número de células por unidad de
área de la rejilla se cuenta directamente en el microscopio, lo que nos da un número de
células por unidad de volumen. Convertir este valor a número de células por mililitro de
suspención se hace fácilmente: el valor obtenido por un valor de conversión.
El contaje microscópico directo es una manera rápida de estimar el número de células
microbianas. Sin embargo tiene una serie de limitaciones: (1) las células muertas no se
distinguen de las vivas. (2) las células pequeñas son difíciles de ver al microscopio y
algunas de ellas probablemente no se cuentan. (3) se requiere tiempo y habilidad para
conseguir precisión por este método. (4) se requiere de un microscopio de contraste de
fases cuando la muestra no este teñida. (5) este método no es bueno para una
suspensión de células poco densa. En el caso de bacterias si la suspensión tiene menos
de 106 células/ml se verán pocas células en campo del microscopio. Estas muestras
diluidas pueden, sin embargo contarse, si previamente se concentran por centrifugación
en un pequeño volumen.
Medidas de masa celular y turbidez
En algunos casos, es necesario estimar la masa de células presente en el cultivo más que
el número de células. Sin embargo, debido a que la masa celular es proporcional al
número se puede utilizar la determinación de un parámetro para estimar el otro. Se
puede medir la masa celular neta por centrifugación de un volumen conocido y
simplemente pesar el precipitado. El procedimiento habitual es determinar el “peso
seco” después de secar las muestras durante una noche a 90-110oC. La masa seca de
las células bacterianas es aproximadamente entre el 10 y el 20% de la masa húmeda.
Un método más rápido y útil, para obtener una estimación del número de células o
biomasa, consiste en la utilización de “medidas de turbidez”. Una suspensión celular
aparece turbia porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. La
turbidez puede medirse con un espectrofotómetro en unidades de densidad óptica (DO).
Para organismos unicelulares, las unidades fotométricas DO son proporcionales (dentro
de ciertos limites) a la masa celular y también al número de células. Por lo tanto las
86
medidas de turbidez pueden utilizarse como un sustituto para otros métodos de contaje.
Sin embargo y antes de utilizar la turbidez, hay que realizar una curva estándar que
relacione las medidas directas (peso seco) con las indirectas de turbidez. Tales curvas
contienen datos para masa celular, permitiendo la estimación de este parámetro a partir
de una sola medida de turbidez.
ANEXO 6. DETERMINACIÓN DE ALCOHOL.
Método A.O.A.C 920.58: Por volumen desde refracción
Tomar 5 ml de muestra y hacer una microdestilación (equipo especial: microdestilador);
destilar por lo menos 2 ml. Si hay formación de espuma, esto se puede prevenir por la
adición de un antiespumante.
Se determina por inmersión en el refractómetro por lectura del índice de refracción del
destilado obtenido, y encuentre el correspondiente porcentaje de alcohol a partir de la
curva de calibración.
FIGURA 21. Microdestilación del etanol.
Construcción de la curva de calibración
87
Partir de una solución de etanol al 99.9% y preparar diluciones así: 1/10, 1/8, 1/6, 1/4.
Mezclar bien, luego leer en el refractómetro el índice de refracción. Realizar la curva
Indice de refracción vs. Concentración.
Ecuación obtenida de la curva de calibración
C = (I – 1.3338) / 0.117
Donde: C = Concentración de alcohol.
I = Indice de refracción.
ANEXO 7. COLORACIÓN DE GRAM.
El bacteriólogo danés Christian Gram descubrió en 1884 un método de coloración el cual
ha dividido las bacterias en dos grupos. El de las gram positivas y el de las gram
negativas. La técnica está basada en la capacidad de las bacterias para retener el
colorante cristal violeta durante la decoloración con alcohol acetona.
Las bacterias gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona, perdiendo el color
púrpura del cristal violeta.
Las bacterias gram positivas no se decoloran y retienen el color violeta. Después de la
decoloración se utiliza safranina, que es un colorante de contraste de color rojo; dicho
colorante da un color rojo claro a las células decoloradas.
Procedimiento para fijar muestra.
- Coloque la muestra de cultivo en el portaobjetos utilizando para ello un asa estéril.
- Extienda la gota sobre el porta objetos formando una película fina.
- Seque la preparación pasándola varias veces sobre la llama de un mechero.
Tinción de la muestra.
88
- Coloque los porta objetos en un puente de coloración.
- Cubra el extendido con cristal violeta, déjelo actuar durante un minuto.
- Lave el exceso de colorante con agua
- Cubra el extendido con lugol, durante un minuto
- Lave con agua
- Recolore con alcohol acetona, durante 20 a 30 segundos aproximadamente
- Lave con agua.
- Cubra el extendido con safranina, déjelo actuar durante un minuto.
- Lave con agua, seque y observe al microscopio.
89
