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I. INTRODUCCION

El cedrn (Aloysia triphylla), es una planta silvestre que se encuentra en los Andes Peruanos, la produccin, comercializacin y consumo de las hojas, ha alcanzado preferencia no solamente en el poblador peruano sino tambin en el de los pases como Argentina, Chile, Paraguay e Italia, en virtud a sus propiedades aromatizantes, saborizantes y medicinales; bondades que son aprovechadas preferentemente en forma de infusin y como parte de la alimentacin.

Zheng y Wang (2001), evaluaron la actividad antioxidante (ensayo ORAC) y compuestos fenlicos en hierbas selectas y demostraron que el cedrn posee actividad antioxidante, hecho que guarda relacin con la presencia de polifenoles.

Los polifenoles, comnmente se encuentran en las plantas, investigaciones recientes, les atribuyen mltiples efectos biolgicos, incluyendo la actividad antioxidante. Los extractos crudos de frutas, hierbas, hortalizas, cereales y otras plantas ricos en compuestos fenlicos son cada vez de mayor inters para la Industria Alimentaria, porque poseen la habilidad de retardar la degradacin oxidativa de lpidos y por lo tanto conservar la calidad y el valor nutricional del alimento. La importancia de las plantas como fuente de antioxidantes naturales, se debe al mantenimiento de la salud, proteccin de mltiples enfermedades como el cncer y enfermedades del corazn, principalmente.

Se conocen muchas fuentes de antioxidantes naturales y muchos de ellos se usan corrientemente en una variedad de productos alimenticios, por lo que es de inters la bsqueda de stos, como alternativa al uso de antioxidantes sintticos. Con la finalidad de contribuir con informacin sustentada sobre las propiedades antioxidativas del cedrn, como fuente de antioxidantes naturales, se plantearon los siguientes objetivos:

Evaluar la actividad antioxidante del extracto acuoso del cedrn en modelos in vitro: radical DPPH, catin ABTS+, capacidad quelante, perxido de hidrgeno, e inhibicin de la degradacin de la 2desoxirribosa.

Evaluar la estabilidad en el almacenamiento, de modelos de bebida de cedrn.

II. REVISIN BIBLIOGRFICAA. EL CEDRN

1. Antecedentes

Kossman y Vicente (1992), en un estudio para categorizar plantas aromticas lograron aislar algunos componentes del cedrn, tales como: Saponinas, l-limoneno, dlimoneno, metilheptenona, lcarvona, linalol, geraniol, citral, verbenona, meheptenona, pcimol, dcitronelol, cariofileno, apineno, bpineno, etileugenol, terpenol, felandreno e isosafrol.

Por otro lado, el extracto acuoso de las hojas del cedrn, en ensayos preliminares y en un estudio realizado sobre la actividad antioxidante y compuestos fenlicos en hierbas selectas, demostr tener actividad antioxidante, cuantificado por el ensayo ORAC (Capacidad de Absorbancia de Radicales Oxigenados) de 17,38 ( 0,35 (mol de trolox equivalente por gramo de peso fresco y el contenido de polifenoles de 1,55 ( 0,10 mg de cido glico por gramo de peso fresco (Zheng y Wang, 2001).2. Taxonoma

Segn Mostacero (1991), el cedrn se clasifica taxonmicamente del siguiente modo:

Reino:Plantae

Divisin XVII:Angiospermae

Clase I:Dicotyledoneae

Subclase 2:Metachlamydeae (sympetalae, gamopetalae)

Orden :Tubiflorae (solanales)

Familia:Verbenacea

Nombre cientfico:Aloysia triphylla

Nombre comn:cedrn.

3. Descripcin

El cedrn, es una planta arbustiva, que puede medir entre 1,50 a 2,50 m de altura. Sus tallos son largos, leosos redondos o angulosos, ramificados en la parte superior, provistas de finas rayas lineares. Las hojas simples, rugosas, reunidas en verticilos de tres, raro cuatro, su limbo, entero o un poco dentado, de color verde plido, presenta una nervadura mediana, saliente en la cara inferior, de la cual se destaca una serie de nervaduras secundarias paralelas, que se renen para formar una especie de cordn paralelo al borde foliar y despiden al ser restregadas, un agradable olor a limn, lo mismo que las flores; stas son pequeas, con la corola ensanchada superiormente y bilabiada, blancas por fuera y azul violceo por dentro, y se ubican al extremo de los tallos en espigas agrupadas en panojas. El fruto es una drupa que encierra dos granos que a veces no llegan a la madurez (Kossman y Vicente, 1992).

4. Usos y bondades

Montes (2001), menciona que en el Per, las hojas se utilizan para infusiones teiformes con fines medicinales y con hierbas compuestas en bebidas. Adems, es ornamental y fragante, el aceite esencial se usa en cosmtica y perfumera.

Al cedrn le atribuyen propiedades como: tnico estomacal, antiespasmdico y carminativo, tranquilizante y digestivo, antipirtico y sedativo, antigstrico, antibacteriano, fluidificante sanguneo, neurotnico, y hasta controla la arritmia cardiaca (Kossman y Vicente, 1992).

B. ANTIOXIDANTES NATURALES

1. Aspectos generales

Los antioxidantes son compuestos que inhiben o retrasan la oxidacin de otras molculas mediante la inhibicin de la propagacin de la reaccin de oxidacin (MartnezValverde et al., 2000). Se considera como antioxidante a toda sustancia que hallndose presente a bajas concentraciones con respecto a las de un sustrato oxidable (biomolcula), retarda o previene la oxidacin de dicho sustrato (Halliwell et al., 1987a).

Una gran parte lo componen los compuestos fenlicos que intervienen como antioxidantes naturales en alimentos de origen vegetal, por lo que la obtencin y preparacin de alimentos con un alto contenido en estos compuestos, supone una reduccin en la utilizacin de aditivos antioxidantes, a la vez que se obtienen alimentos ms saludables (MartnezValverde et al., 2000).

2. Efectos Benficos

Los efectos benficos de los antioxidantes naturales, bsicamente estn dados por su capacidad de inhibir radicales libres ejerciendo accin en todos los procesos en los que se reduce o detiene el proceso de oxidacin como: 1) hidrlisis enzimtica de enlaces steres para remover cidos grasos peroxidados de lpidos, 2) quelamiento de iones metlicos de transicin y 3) reduccin de perxidos por catlisis enzimtica (Thomas, 2000).

Los radicales libres son molculas que en su estructura atmica presentan un electrn desapareado o impar en el orbital externo y que pueden existir independientemente (Clarckson y Thompson, 2000), que los hace muy inestable, extraordinariamente reactivos y de vida corta (Guerra, 2001), con una enorme capacidad para combinarse inespecficamente (Halliwell et al., 1995) en la mayora de los casos con la diversidad de molculas integrantes de estructuras celulares: carbohidratos, lpidos, protenas, cidos nucleicos y derivados de cada uno de ellos (Rodrguez et al., 2001).

Se forman en condiciones fisiolgicas normales o por factores exgenos en proporciones controlables por los mecanismos de defensas celulares (GonzlezTorres et al., 2000). En situaciones patolgicas esta produccin se incrementa substancialmente, ingresando al estado del estrs oxidativo (Thomas, 2000).

Los radicales libres pueden capturar el electrn que les falta de las molculas que estn a su alrededor, y as tornarse estables (Clarckson y Thompson, 2000). La molcula atacada (que ahora no tiene un electrn) se convertir entonces en un radical libre y de este modo se inicia una reaccin en cadena que daar muchas clulas y puede ser indefinida si los antioxidantes no intervienen (GonzlezTorres et al., 2000).

Desde el punto de vista nutricional, la actividad antioxidante, se asocia con su papel protector contra enfermedades cardiovasculares y el cncer; y consecuentemente en los procesos de envejecimiento (Vasconcellos, 2000).

3. Polifenoles como antioxidante

Los polifenoles son metabolitos secundarios de las plantas distribuidos ampliamente en alimentos de origen vegetal frutas, cereales, hortalizas y bebidas (Richelle et al., 2001). Poseen diferentes estructuras qumicas y actividad (MartnezValverde, 2000). Gran parte de ellos presentan accin potencialmente beneficiosa para la salud humana (Cadenas, 2001), asociados con el consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles (Scalbert, 2000).

Los polifenoles que poseen actividad antioxidante son conocidos por ser principalmente cidos fenlicos y flavonoides (MartnezValverde et al., 2000). Los cidos fenlicos han sido repetidamente implicados como antioxidantes naturales en frutas, hortalizas y otras plantas, por ejemplo, el cido cafeico, ferlico y vanlico estn ampliamente distribuidos en el reino vegetal (Zheng y Wang, 2001). Los flavonoides, quienes tienen el mismo carbono C15 (C6C3C6) ejercen actividad antioxidante en una variedad de compuestos fcilmente oxidables. En muchas plantas los principales flavonoides son las flavonolaglyconas tales como la quercetina, myricetin (Fiorani et al., 2002), kaempferol y sus glicsidos (Figura 1). En general, los flavonoides que contienen grupos hidroxilos tienen elevada actividad antioxidante frente a radicales peroxilos ms que los cidos fenlicos (Zhen y Wang, 2001).

La actividad antioxidante de los polifenoles se debe principalmente a sus propiedades redox, la cual les permite actuar como agentes reductores, donadores de hidrgeno y secuestradores del oxgeno singulete; adems de tener potencial para quelar metales (Hopia et al., 1999), inhibir la lipoxigenasa y secuestrar radicales libres (MartnezValverde et al., 2000).

Figura 1. Estructura de los principales cidos fenlicos y flavonoides.

Fuente: A) Zheng y Wang (2001); B) Fiorani et al., (2002).

Los polifenoles, como agentes reductores junto con otros agentes reductores de la dieta, como la vitamina C, vitamina E y los carotenoides protegen los tejidos del cuerpo contra el estrs oxidativo (Scalbert y Williamson, 2000), por lo que el consumo de frutas y vegetales ricos en polifenoles, previenen muchas enfermedades, destacando el cncer y las enfermedades cardiovasculares (Yildirim et al., 2001), adems inhiben daos contra el Acido Desoxirribonucleico (ADN) y bloquean la accin de enzimas especficas que causan la inflamacin ciclooxigenasa-I y ciclooxigenasa-II (Vasconcellos, 2000; Cadenas, 2001; Peinado, et al., 2000).

4. Estabilidad de polifenoles en modelos de bebida

La estabilidad de los polifenoles en sistemas alimenticios de origen vegetal, est relacionado con el grado de formacin de pigmentos amarillos y marrones, debido a la actividad de las enzimas polifenoloxidasa (MartnezValverde et al., 2000) y tirosinasa en reacciones enzimticas y a la del oxgeno en reacciones no enzimticas "Reaccin de Maillard" (Bradshaw et al., 2001).

El desarrollo gradual del pardeamiento genera productos de la reaccin de Maillard (MRPs), dependiendo de las condiciones intrnsecas del medio y de los factores como: estructura y concentracin del sustrato (Chen et al., 2001), pH, temperatura, actividad de agua y la presencia de agentes complejos fenoles e iones metlicos (Kitts et al., 1999; MalienAubert et al., 2001), los mismos que al ser sometidos a los diferentes tratamientos durante el procesamiento de manufactura de los alimentos, afectan a su actividad antioxidante y la evolucin de los pigmentos pardos con la consecuente produccin de los MRPs y otros productos en suspensin que tienden a producir precipitacin Figura 2 (Nicoli et al., 1999). Los MRPs pueden actuar como antioxidantes o prooxidantes (Nicoli et al., 1999).

Figura 2. Cambios en la actividad antioxidante total y en la absorbancia de un modelo glucosafructosa y cido glutmico, debido al desarrollo de diferentes productos de la Reaccin de Maillard, T3 > T2 > T1.

Fuente: Adaptado de Nicoli et al., (1999).

Las catequinas del t verde en solucin acuosa y en condiciones aceleradas de almacenamiento, son ms estables a 37C que a 98C (Figura 3) y a bajos valores de pH (Figura 4A). Adems es importante considerar la presencia de otros ingredientes en el sistema alimenticio, ya que de esto depende la relativa vida til del producto Figura 4B (Chen et al., 2001).

Figura 3.Estabilidad de las catequinas del t verde en solucin acuosa.

Fuente:Adaptado de Chen et al., (2001).

Figura 4.Estabilidad de catequinas del t verde en solucin acuosa. (A) a diferentes niveles de pH. (B) en presencia de otros ingredientes.

Fuente: Adaptado de Chen et al., (2001).

C. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN MODELOS IN VITRO1. Mtodos de compuestos cromgenos

Son muchas las tcnicas que se utilizan para medir la actividad antioxidante total de compuestos biolgicos, pero los que ms ampliamente se utilizan en sistemas in vitro son los radicales DPPH y el catin ABTS+ (Re et al., 1999), ambos presentan excelente habilidad en ciertas condiciones en que se realizan las pruebas, as como tambin presentan importantes diferencias (ver Cuadro 1).

Cuando interactan con los antioxidantes presentan una serie de mecanismos, ambos presentan una cintica de reaccin bifsica con la mayora de antioxidantes; son fciles, rpidos y sensibles, estos involucran compuestos cromgenos de naturaleza radical para simular las especies reactivas de oxgeno y nitrgeno ERO y ERN(Arnoa, 2000).

En el Cuadro 2, se presenta una comparacin de la actividad antioxidante de diferentes muestras, cuantificadas con radicales DPPH y el catin ABTS+.

Cuadro 1. Diferencias entre los radicales libres DPPH y ABTS+.

ABTS+DPPH

Adquiridos en polvo como una sal ABTS, la forma radical del catin ABTS+ se genera por reaccin enzimtica (peroxidasa, mioglobina) o qumica, (persulfato de potasio, ABAP, dixido de manganeso).

Adquirido en polvo como radical, listo para ser disuelto.

Es soluble en agua y medios orgnicos (permite medir la Actividad antioxidante en medios hydroflicos y lipoflicos)

Es soluble solamente en medios orgnicos (medios alcohlicos).

Presenta dos diferentes longitudes de onda y coeficiente de extincin molar ():

415 nm ( = 3,6x104 mol1cm1)734 nm ( = 1,5x104 mol1cm1 en medio acuoso y = 1,6x104 mol1cm1 en etanol).Slo presenta una longitud de onda y coeficiente de extincin molar:

515 nm ( = 12,5 mM1cm1 en metanol).

Fuente: Adaptado de Arnoa (2000) y Re et al., (1999).

Cuadro 2. Actividad antioxidante de diferentes muestras usando las pruebas del DPPH y el ABTS+.

MuestraActividad antioxidante (TEACa)

DPPHABTS+

Jugos frescosb

Naranja81,1286,36

Limn62,5467,22

Mandarina55,2870,91

Vinosc

Vino tinto139,27216,29

Vino blanco8,229,58

a TEAC = Capacidad Antioxidante como Trolox Equivalente (mg/100mL).

b Tiempo de reaccin = 5 min.

c Tiempo de reaccin = 20 min.

Fuente: Adaptado de Arnoa (2000).

a. Radical DPPH

El DPPH es un reactivo muy usual para investigar la actividad de inhibicin de radicales libres de los polifenoles (Yildirim et al., 2001). El mecanismo de reaccin consiste en sustraer un tomo de hidrgeno de un fenol donador para dar difenilpicrilhidrazina y un radical fenoxil (Lebeau et al., 2000). La reaccin involucra un cambio de color de violeta a amarillo que fcilmente puede ser monitoreado midiendo el decaimiento de la absorbancia a 515 nm Figura 5 (BrandWilliams et al., 1995).

El radical fenoxil puede sufrir posteriores reacciones tales como el acoplamiento y fragmentacin, que resultan en productos complejos, y que modifica la reaccin y los valores del coeficiente de Inhibicin del 50% del radical, (IC50), por alteracin de la estequiometra (Lebeau et al., 2000).

El IC50 es un parmetro que describe en forma global la reaccin con el radical, proporcionando informacin limitada del mecanismo de reaccin. En el Cuadro 3 se muestran valores de IC50 para diferentes compuestos fenlicos.

El valor de la constante de velocidad de la reaccin (K2) corrige las limitaciones de IC50, incluyendo, adems de la concentracin, la velocidad de inhibicin del radical DPPH (Espin et al., 2000). Esto permite diferenciar a los compuestos de acuerdo a sus reactividad intrnseca (Lebeau et al., 2000).

Donde:

DPPHH

=Radical DPPH reducido

(AH)n=Especies radicales (n = indica la presencia de 1 mas especies radicales).

Figura 5. Qumica de la inhibicin del radical libre por una especie antioxidante.

Fuente: Espin et al., (2000).

Cuadro 3. Actividad antioxidante de polifenoles medido con DPPH.

IC50 despus de 30 minutos

Pentagaloilglucosa3,2

Telimagrandina II4,2

Pedunculagina5,6

Geraniina5,9

Acido chebulnico5,3

Corigalina6,8

Epigalatocatequingalato6,7

Epicatequina galato2,0

Epigalatocatequina11,0

Epicatequina31,0

(+)catequina34,0

cido glico16,0

cido ascrbico39,0

(tocoferol37,0

Fuente: Hiramatsu et al., (1997).

b. Catin ABTS+El ABTS (verdeazl como catin ABTS+), es un radical cromgeno estable, fcil de usar, tiene un elevado nivel de sensibilidad y permite analizar un gran nmero de muestras en tiempo relativamente corto (Re et al., 1999; Kim et al., 2002).

Arnao (2000), menciona que la qumica de reaccin del ABTS en las pruebas, involucra una disminucin en la intensidad del color del ABTS+ de verdeazul a blancotransparente, por efecto de la inhibicin del antioxidante. En la Figura 6, se muestra la formacin del radical catin ABTS+ y su interaccin con un compuesto antioxidante.

Figura 6. Formacin del radical catin ABTS+ y su reaccin con un compuesto antioxidante.

Fuente: Adaptado de Majcherczyk et al., (1999) y Lien et al., (1999).

2. Mtodos para especies reactivas de oxgeno

El oxgeno molecular (O2) que a pesar de su carcter radicalario es estable y moderadamente agresivo (Guerra, 2001), tiene 2 electrones no apareados en su orbital externo, impidindole que capte dos electrones simultneamente en las reacciones que interviene (Rodrguez et al., 2001), la mayor parte del O2 utilizado por el organismo es reducido a agua por la accin del sistema Citocromooxidasa (Citocromo A + a3) de la cadena respiratoria mitocondrial (Cspedes et al., 2000).

EL O2, por reacciones de reduccin secuencial (ecuaciones 4, 5, 6, y 7), producto del metabolismo normal de las clulas (Rodrguez et al., 2001) o por la presencia de factores exgenos (Yen y Chen, 1995; Yildirim et al., 2001) genera especies reactivas empezando por el anin superxido (), y el radical perhidroxilo (), posteriormente el perxido de hidrgeno (H2O2), y finalmente el radical hidroxilo OH (Clarckson y Thompson, 2000), adems de generar el oxgeno singulete 1O2 (Rodrguez et al., 2000), que atacan a las molculas biolgicas, causndoles dao celular, por lo que son implicados en la produccin de numerosas enfermedades, incluyendo la malaria, VIH, diabetes, cncer, etc. adems de inducir la peroxidacin de lpidos que causan el deterioro de los alimentos (Lai et al., 2001).

O2 + e

Radical superxido

(4)

+ H2O + OH Radical hidroperxido

(5)

+ e + H H2O2 Perxido de hidrgeno

(6)

H2O2 + e OH + OH Radical hidroxilo

(7)

Frente a esto, los sistemas de defensa contra los radicales libres constituidos por los sistemas biolgicos enzimticos y los antioxidantes (Yildirim et al., 2001), empiezan su labor, el sistema Citocromooxidasa de la cadena respiratoria mitocondrial es el responsable del mas del 90% de la reduccin del O2 en el organismo humano; la Superxido Dismutasa (SOD), metaloenzima que contiene Manganeso (Mn) en su sitio activo en su ambiente la mitocondria, y Zinc (Zn) y Cobre (Cu) en el citosol (Halliwell et al., 1995), cataliza la dismutacin del radical para dar O2 y H2O2 (ecuacin 8.); la catalasa en el peroxisoma y glutatin peroxidasa en el citoplasma (requiere de selenio en su sitio activo) neutralizan el H2O2 para dar agua y O2 ecuaciones 9 y 10 (Rodrguez et al., 2001).

La Vitamina E (antioxidante liposoluble) y la Vitamina C cido ascrbico (agente reductor o donador de electrones, soluble en agua) reaccionan rpidamente con el , el OH y 1O2 (Rodrguez et al., 2000). El Betacaroteno, el precursor de la Vitamina A, es el secuestrador ms eficiente del 1O2 (Clarckson y Thompson, 2000). Por otro lado estn los antioxidantes exgenos como la Vitamina E, Vitamina C, beta caroteno y el amplio grupo de los flavonoides (Yildirim et al., 2001).

2 + 2H+ H2O2 + O2

(8)

H2O2 + H2O 2H2O + O2

(9)

2GSH + H2O2 GSSH + 2H2O

(10)

Donde:

SOD=Superxido Dismutasa

GSH=Glutatin reducido

GSSH=Glutatin oxidado

a. Inhibicin del perxido de hidrgeno

Yen y Chen (1995) y Wettasingle y Shahidi (1999), encontraron que la inhibicin del H2O2 es dependiente de la concentracin. El extracto etanlico de t verde, inhibi en un 3050% al H2O2 a una dosis de 400 (g/mL. Mientras que Ruch et al., (1989) citado por Yen et al., (1999), en el extracto acuoso del t verde, a una dosis de 50 (g/mL encontraron un efecto bastante notorio sobre la inhibicin del H2O2 al reducirlo de 4 a 0,5 mM, del mismo modo Wettasingle y Shahidi (1999), encontraron una reduccin de 44 a 91% con respecto a la concentracin inicial (6,6 mM) a una dosis de 100200 (g/mL en extractos acuosos de muestras vegetales, por lo que concluyen que, la descomposicin del perxido de hidrgeno a agua puede ocurrir de acuerdo a la siguiente reaccin:

H2O2 + 2H+ + 2e 2H2O

(11)

Debido a que los compuestos fenlicos presentes en el extracto son buenos donadores de electrones, pueden acelerar la conversin del H2O2 a H2O (ecuacin 11).

b. Inhibicin de la degradacin de la 2desoxirribosa

El OH es altamente reactivo, se genera en los sistemas vivos, que estn expuestos a la radiacin ionizante, ataca casi a todas las biomolculas, incluyendo el ADN y la membrana de los lpidos (Lai et al., 2001), por una serie de reacciones con la consecuente formacin de radicales carbonatados en las molculas atacadas que pueden reaccionar con el oxgeno para dar radicales peroxilos quienes pueden agravar ms el dao celular (Halliwell et al., 1987b).

Otra va por lo que se generan los OH es por la descomposicin del H2O2 en presencia de iones de fierro ecuaciones 12, 13 (Fenton) y 14 (HaberWeiss) (Wettasingle y Shahidi, 1999).

Fe3+ + Fe2+ + O2

(12)

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH + OH

(13)

+ H2O2 O2 + OH + OH

(14)

La qumica de la reaccin de Fentn (ecuacin 13) es ms complicada; con la presencia de otras molculas, pueden ocurrir una serie de reacciones posteriores ecuaciones 15, 16, 17 y 18 (Halliwell et al., 1995).

OH + H2O2 H2O + H+ +

(15)

Fe3+ + H2O2 Fe2+ + + 2H+

(16)

+ Fe3+ Fe2+ + O2

(17)

OH + Fe2+ Fe3+ + OH

(18)

Los radicales hidroxilos generados por la reaccin de Fenton, conteniendo H2O2, EDTA y Acido Ascrbico, pueden ser medidos en remanentes de la degradacin del desoxirribosa que reaccionan con el cido Tiobarbitrico (TBA) bajo condiciones cidas (Kitts et al., 2000) por la formacin del malonaldehido (MDA) que se evidencia por el color rosado (Halliwell et al., 1987a). El proceso de prevencin de degradacin del desoxirribosa se esquematiza en las ecuaciones 19 y 20.

Fe2+ EDTA + H2O2 OH + OH + Fe3+EDTA (19)

OH + desoxirribosa fragmentos MDA

fragmentos MDA Color rosado (20)Mas que actividad antioxidante, lo que en realidad cuantifica esta prueba es la capacidad de quelar al in hierro (II) en el sistema Fe2+ EDTA + H2O2, que evita la reaccin de Fenton con el H2O2, no favoreciendo la produccin de OH, en menor o mayor grado, dependiendo de la capacidad quelante.

3. Capacidad Quelante

Lebeau et al., (2000), encontraron que la longitud de onda de mxima absorbancia (380 nm) del espectro de la quercetina, cambi inmediatamente a 430 nm con la adicin de iones cobre (Figura 7), Hu y Kitts (2000), en extractos de las Equinaceas, encontraron el cambio a 400 nm (Figura 7), por lo que concluyen que los compuestos analizados son capaz de quelar metales de cobre, probablemente por sus dos grupos hidroxilos de la posicin ortho.

Figura 7.Capacidad quelante A) de la quercetina B) del extractro de equinacea.

Fuente: A) Lebeau et al., (2000); B) Hu y Kitts (2000).

III. MATERIALES Y MTODOS

A. LUGAR DE EJECUCINEl presente trabajo de investigacin se realiz en los laboratorios de Anlisis de Alimentos y Espectrofotometra de la Universidad Nacional Agraria de la Selva, ubicada en la provincia de Leoncio Prado, departamento de Hunuco, a 670 msnm, con una temperatura media anual de 24C, humedad relativa de 80% y con una precipitacin pluvial de 3200 mm. El trabajo se desarroll entre los meses de enero octubre del 2002.

B. MATERIA PRIMA E INSUMOS1. Materia prima

Para las pruebas preliminares y finales, se utilizaron hojas maduras de cedrn (Aloysia triphylla) procedente de la ciudad de Huancayo.

2. Insumos

Se utiliz azcar blanca, benzoato de sodio y cido ctrico de Riedelde Haen.

C. MATERIALES 1. Materiales de laboratorio

Cubetas de cuarzo (200 340 nm) y poliestireno, fiolas (10, 25, 50 y 250 mL). frascos de vidrio color mbar (50, 100 mL), micropipetas (10, 200 y 1000 (L), Tips (10, 200 y 1000 (L), mortero y piln, probetas (20 y 50 mL), termmetro (0100C), tubos de prueba (1 x 20 cm), vasos de precipitacin (50, 100 y 250 mL), mechero de Bunsen.

2. Equipos

Balanza analtica (Ohaus Co, Suiza), potencimetro (Inolab Co, Alemania), refractmero (Labor MIN, Hungra), bao mara con temperatura regulable, cocina elctrica, cronmetro, espectrofotmetros (Uv-Vis 1201 Shimadzu Co. Japn y Genesys 8), cmara de secado con flujo de aire, estufa con temperatura regulable.

3. Reactivos

2,2azinobis3etilenobenzotiazolino6cido sulfnico (ABTS), persulfato de potasio, cloruro de sodio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, 1,1 difenil2picrilhidrazil (DPPH), etanol 96%, cido clorhdrico, hidrxido de sodio, cloruro frrico, perxido de hidrgeno (30% v/v), sulfato de cobre, cido ascrbico, cido tricloroactico (TCA), Acido tiobarbitrico (TBA), reactivo de Folin Ciocalteau, bicarbonato de sodio, desoxirribosa, tetraacetato de etilendiamina (EDTA), adquiridos en la Merck Lima-Per.

D. MTODOS DE ANALISIS

1. Actividad antioxidante

a. Radical DPPH

Se us el mtodo de BrandWilliams et al., (1995) de inhibicin del radical DPPH, modificado por Sandoval et al., (2001).

b. Catin ABTS+Se realiz por el mtodo del catin radical ABTS+, mejorado por Re et al., (1999).

c. Perxido de hidrgeno

Se realiz por el mtodo de inhibicin del perxido de hidrgeno de Ruch et al., (1989), modificado por Wettasingle y Shahidi, 1999).

d. Inhibicin de la degradacin de la 2desoxirribosaSe realiz por el mtodo de radicales hidroxilos, basado en la degradacin del reactivo 2-desoxirribosa (Halliwell et al., 1987b).

e. Capacidad Quelante

Se us el mtodo de capacidad quelante del cobre de Afanas et al., (1989), modificado por Lebeau et al., (2000) y Hu and Kitts (2000).

2. Polifenoles totales

Se determin con el reactivo Folin Ciocalteau de acuerdo al mtodo de Sklinkard y Rossi (1965), modificado por Hopia et al., (1999).

3. Evaluacin de la estabilidad de los modelos de bebida

Se evalu el pardeamiento y la actividad antioxidante de acuerdo al mtodo de Chen et al., (2001).

E. METODOLOGA

1. Preparacin del extracto acuoso de cedrn

Las hojas maduras de cedrn, se deshidrataron a 60C por 5 horas, se molieron y tamizaron en malla N 40. La muestra seca y molida (CDsm) se empac al vaco (200 mbar x 1,3 s) en bolsas de polietileno de alta densidad y se almacenaron a 20C hasta antes de su anlisis.

2 g de CDsm se coloc en 15 mL de agua herbida por 2 minutos. Luego se filtr en papel Watman 3. El extracto filtrado se afor a 20 mL (extracto acuoso del cedrn stock, EACstock).

2. Actividad antioxidante del extracto acuoso

a. Radical DPPH

Las diluciones finales del EACstock de 200, 400, 600, 800 y 1000 (g/mL se hicieron reaccionar con 100 (M de DPPH en etanol al 96% en proporcin de 50 (L : 950 (L. La absorbancia a 515 nm se monitore cada 30 segundos por 30 minutos. Los resultados se expresaron en IC50, obtenida al plotear el porcentaje remanente de DPPH versus la concentracin de los extractos acuosos de cedrn (EACs), constante de velocidad de segundo orden K2 (Espin et al., 2000) y en equivalente de vitamina C (EVC) por 100 g de peso seco, obtenido de una curva estndar construida en el rango de 16 mg/100 mL de vitamina C (ver anexos 1, 2 y 3). El clculo del porcentaje remanente, se hizo como se indica en la ecuacin 21.

(21)

Donde:

Am=Abosorbancia en el tiempo t.

Ac=Absorbancia del contol.

Para el clculo de K2, se us el modelo multiplicativo, tomando el valor absoluto de la pendiente b de la regresin lineal obtenida, aplicando la transformacin logartmica Ln (Porto et al., 2000) del siguiente modo:

A = a(t + 1)b Modelo Multiplicativo

(22)

DPPHf = DPPHi (t + 1)b

(23)

Donde:

DPPHf =Concentracin del radical DPPH en cualquier tiempo.

DPPHi =Concentracin del radical DPPH en el tiempo cero (0).

t=Tiempo de reaccin

a, b=Parmetros

La pendiente del anlisis de regresin lineal de las concentraciones de los EACs versus los valores de b, es el valor de K2 (mg/mL)-1(s)-1 (Anexo 2).

b. Catin ABTS+10 (L de las diluciones finales de los EACs de 200, 400, 600, 800 y 1000 (g/mL se hicieron reaccionar con 990 (L de una solucin de ABTS+, la absorbancia a 734 nm se monitore cada 5 minutos hasta 30 minutos. Los resultados se expresaron en EVC, obtenido de una curva estndar (Anexo 4) construida en el rango de 16 mg/100 mL de vitamina C (Kim et al., 2002).

c. Perxido de hidrgeno

El EACstock se diluy a 800, 1000 y 1200 (g/mL y se hizo reaccionar a una proporcin de 850(L : 150(L de EAC y perxido de hidrgeno 50mM; la absorbancia a 230 nm se monitore cada 10 minutos hasta 30 minutos. Los resultados se expresaron en IC50 (Ver anexo 5).

d. Inhibicin de la degradacin de la 2desoxirribosa200 (L de los EACs de 800,1600, 2400, 3200 y 4000 (g/mL se hicieron reaccionar con la 2desoxirribosa, cloruro frrico, perxido de hidrgeno y cido ascrbico a 37C por 1 hora y para completar la reaccin se agreg EDTA, TBA y TCA. La absorbancia se monitore a 532 nm. La actividad antioxidante de los EACs se expres en trminos del porcentaje de inhibicin de la degradacin de la 2desoxirribosa, empleando cido glico como estndar y haciendo uso de la ecuacin 24.

(24)

Figura 8.Diseo experimental para la determinacin de la actividad antioxidante del EAC medido por los mtodos del radical DPPH, catin ABTS+, perxido de hidrgeno y la inhibicin de degradacin de la 2-desoxirribosa.Capacidad Quelante

La curva de espectro de absorbancia del EAC (CE1) se levant de 200400 nm. Previamente la muestra se diluy en buffer fosfato salino (PBS) para obtener absorbancias menores a 1,0.

El EAC se hizo reaccionar con una solucin acuosa de sulfato de cobre (50 (M) y la curva de espectro CE2 se levant en el mismo rango de longitud de onda conforme se indica en la Figura 9. La capacidad quelante se evidenci por diferencias entre CE1 y CE2. Los resultados se presentaron como absorbancia versus la longitud de onda de tres evaluaciones (Ver anexos 6 y 7).

3. Polifenoles totales

100 (L de los EACs de 200, 400, 600, 800 y 1000 (g/mL, se hicieron reaccionar con 100 (L de Folin Ciocalteau y 2 mL de bicarbonato de sodio, para completar la reaccin se dej reposar por 30 minutos. La absorbancia se monitore a 740 nm (Figura 10). Los resultados se expresaron en miligramos de equivalentes de cido glico (EAG) por gramo muestra.

Donde:

Ri=Repeticiones (i = 1, 2 y 3).

Figura 9. Diseo experimental para la determinacin de la capacidad quelante del EAC.

Donde:

Ci =Concentraciones finales de: 200, 400, 600, 800 y 1000 (g/mL (i = 1, 2, 3, 4 y 5).

Ri = Repeticiones (i = 1, 2 y 3).

Figura 10. Diseo experimental para la determinacin de polifenoles totales del cedrn.4. Evaluacin de la estabilidad

a. Modelos de bebida de cedrn

Los modelos de bebida de cedrn (MBC) fueron preparados a una concentracin de 1 g/100 mL, a temperatura de ebullicin por 7 minutos. El proceso incluy filtracin con papel watman No. 3, regulacin de los slidos solubles a 11 Brix, adicin de 0,05% de benzoato de sodio como conservante y regulacin (con cido ctrico) del pH: 3, 4 y 5.

b. ndice de pardeamiento y actividad antioxidante

El ndice de pardeamiento (IP) y la actividad antioxidante (AA) de los MBC en almacenamiento fueron evaluados a temperaturas: ambiente, 37 y 45C (el monitoreo se muestra en el anexo 8); en ambas determinaciones se incluy un control (EAC sin regulacin del pH). Las evaluaciones fueron realizadas durante 6 das con frecuencia de 12 horas.

Para el IP se registr la absorbancia de los MBC a 440 nm y a 515 nm para la AA (radical DPPH) despus de 6 minutos de reaccin (Figura 11). Los datos generados fueron procesados empleando la siguiente ecuacin:

IP o AA (%)

(25)

Donde:

At

=Absorbancia a un tiempo t.

Ai

=Absorbancia inicial en el tiempo cero.

F. ANLISIS ESTADISTICO

1. Anlisis de regresin no lineal

Los datos de absorbancia registrados para los modelos in vitro del radical DPPH y para el perxido de hidrgeno se sometieron a un anlisis de regresin no lineal para determinar el IC50 (BrandWilliam et al., 1995 y Wettasingle y Shahidi, 1999).

2. Anlisis de regresin lineal

Los datos de absorbancia registrados para los modelos in vitro del radical DPPH, y catin ABTS+, se sometieron a un anlisis de regresin lineal para determinar el k2 y EVC; y los datos de absorbancia de los polifenoles para expresar en trminos de equivalentes de cido glico (EGA) por gramo de Cedrn (Espin et al., 2000 y Kim et al., 2002).

3. Estadstica descriptiva

Los parmetros calculados en las pruebas de actividad antioxidante, polifenoles totales y estabilidad se expresaron como promedio la desviacin estndar de tres repeticiones (Urea y Darrigo, 1999).

4. Anlisis de varianza

Los porcentajes del IP y AA se analizaron estadsticamente mediante un arreglo factorial de 3x4, bajo un Diseo Completamente al Azar DCA (ecuacin 26), y se us la prueba de Significancia de Duncan (( = 0,05), con tres repeticiones, con el uso del software Sistema de Anlsis Estadstico para Windows SAS Ver. 6.14 (Urea y Darrigo, 1999).

(26)

Donde:

i

=1, 2, 3 niveles del factor A (Temperatura).

j

=1, 2, 3, 4 niveles del factor B (pH).

=Variable respuesta correspondiente a la ksima repeticin que pertenece al jsimo nivel del factor B, correspondiente al isimo nivel del factor A.

(=Efecto de las medias.

(i=Efecto del isimo nivel del factor A.

(j=Efecto del jsimo nivel del factor B.

((()ij=Efecto de la interaccin entre el isimo nivel del factor A y el jsimo nivel del factor B.

(ij=Efecto del error expermental.

Figura 11.Evaluacin de la estabilidad de polifenoles en bebidas modelos de hierba luisa.

IV. RESULTADOS Y DISCUSION

A. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE1. Radical DPPH

a. Cintica de inhibicin

En la Figura 12, se muestra el porcentaje de DPPH remanente cuando es secuestrado por los EACs.

Figura 12. Cintica de inhibicin del DPPH de los EACs. Letras iguales indican que no existe diferencia significante (NS) a un nivel de probabilidad de 0,05. Los datos estn expresados como la media desviacin estndar (SD), n = 3.Se observa que, la inhibicin es dependiente de la concentracin ya que los EACs presentan diferencias en sus actividad de inhibicin (p