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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Escuela de Formación Profesional de Ciencias Biológicas
“SCREENING FITOQUÍMICO Y ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL EXTRACTO
ETANÓLICO DE CUATRO PLANTAS MEDICINALES, IQUITOS-PERÚ”.
Requisito para optar el título profesional de
BIÓLOGO
AUTORES:
David Martin Ruiz Ruiz
Bryan Jordy Arévalo Rodríguez
IQUITOS – PERÚ
2018
TESIS
ii
JURADO CALIFICADOR Y DICTAMINADOR
iii
ASESOR
iv
v
DEDICATORIA
A todos los futuros tesistas que deseen realizar
investigaciones sobre screening fitoquímico y actividad
antibacteriana de diferentes extracto de plantas medicinales
mediante pruebas bioquímicas, para que les sirva como una
línea de información, y posteriormente sea aplicada en otros
trabajos dentro de las políticas de salud pública que posee el
Estado orientados a tomar medidas de prevención y
tratamiento de las mismas.
vi
AGRADECIMIENTO
Al Blgo. Freddy Orlando Espinoza Campos Mgr., nuestro asesor por el apoyo
incondicional en la elaboración de nuestra tesis.
Al Dr. José Aranda, Director encargado del Instituto de Medicina Tradicional (IMET),
por abrirnos las puertas para realizar nuestra tesis profesional.
Al Ing. Jorge Villacrez, jefe encargado del Instituto de Medicina Tradicional (IMET),
por permitirnos realizar las pruebas bioquímicas en el laboratorio de Microbiología
y Farmacología.
Al Químico farmacéutico William Vigo, jefe responsable del laboratorio de
Farmacología, por autorizar la utilización de materiales bioquímicos, y el
desenvolvimiento de nuestra tesis.
A los trabajadores del IMET por prestar su ayuda en la recolección de las plantas
medicinales.
vii
ÍNDICE
JURADO CALIFICADOR Y DICTAMINADOR………………………………………….…………………. ii
ASESOR……………………………………………………………………………………………………..……..…… iii
ACTA DE SUSTENTACIÓN DE TESIS N° 035..………………………………….………………..……. iv
DEDICATORIA……………………………………………………………………………………………………….. vi
AGRADECIMIENTO………………………………………………………………………………………………. vii
ÍNDICE……………………………………………………………………………………………….………………… viii
I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 1
II. OBJETIVOS ................................................................................................. 3
2.1. Objetivo general ............................................................................................ 3
2.2. Objetivos específicos ..................................................................................... 3
III. REVISIÓN DE LITERATURA .......................................................................... 4
3.1. Aspectos generales de Opuntia ficus indica “tuna” ..................................... 4
3.1.1. Clasificación taxonómica ....................................................................... 4
3.1.2. Datos ambientales ................................................................................. 4
3.1.3. Descripción botánica ............................................................................. 5
3.1.4. Usos ........................................................................................................ 5
3.2. Aspectos generales de Erythrina fusca “amasisa” ....................................... 7
3.2.1. Clasificación taxonómica ....................................................................... 7
3.2.2. Datos ambientales ................................................................................. 7
3.2.3. Descripción botánica ............................................................................. 9
3.2.4. Usos ........................................................................................................ 9
3.3. Aspectos generales de Cassia reticulata "retama” .................................... 10
3.3.1. Clasificación taxonómica ..................................................................... 10
3.3.2. Datos ambientales ............................................................................... 11
3.3.3. Descripción botánica ........................................................................... 12
3.3.4. Usos ...................................................................................................... 13
viii
3.4. Aspectos generales de Physalis angulata "bolsa mullaca" ........................ 13
3.4.1. Clasificación taxonómica ..................................................................... 13
3.4.2. Datos ambientales ............................................................................... 14
3.4.3. Descripción botánica ........................................................................... 14
3.4.4. Usos ...................................................................................................... 15
IV. MATERIALES Y MÉTODOS. ........................................................................ 16
4.1. Descripción del área de estudio. ................................................................. 16
4.2. Procedimientos ........................................................................................... 16
4.2.1. Tamizaje fitoquímico ........................................................................... 16
4.2.1.1. Identificación de alcaloides .......................................................... 18
4.2.1.2. Identificación de triterpenos y esteroides ................................... 19
4.2.1.3. Identificación de quinonas ........................................................... 19
4.2.1.4. Identificación de cumarinas ......................................................... 20
4.2.1.5. Identificación de azúcares reductores ......................................... 21
4.2.1.6. Identificación de saponinas .......................................................... 21
4.2.1.7. Identificación de fenoles y taninos ............................................... 21
4.2.1.8. Identificación de aminoácidos y aminas ...................................... 22
4.2.1.9. Identificación de glicósidos cardiotónicos.................................... 22
4.2.1.10. Identificación de flavonoides....................................................... 23
4.2.1.11. Identificación de mucílagos ......................................................... 23
4.2.1.12. Identificación de principios amargos - astringentes ................... 23
4.2.2. Elaboración del extracto ...................................................................... 24
4.2.2.1. Preparación de pulverizado .......................................................... 24
4.2.2.2. Preparación del extracto etanólico .............................................. 24
4.2.3. Antibiograma ....................................................................................... 25
4.2.3.1. Preparación de las concentraciones ............................................. 25
4.2.3.2. Preparación de los discos de sensibilidad .................................... 25
4.2.3.3. Prueba de sensibilidad.................................................................. 26
4.2.4. Procesamiento de la información. ....................................................... 27
V. RESULTADOS ........................................................................................... 28
5.1. Screening fitoquímico ................................................................................. 28
5.2. Determinación de la humedad ................................................................... 31
5.3. Determinación del rendimiento de extracto .............................................. 32
5.4. Antibiograma ............................................................................................... 34
ix
5.5. Prueba de la normalidad ............................................................................. 36
5.6. Prueba t de Student para muestras relacionadas ....................................... 36
5.7. Análisis factorial de la varianza mixto ......................................................... 37
VI. DISCUSIÓN ............................................................................................... 39
VII. CONCLUSIONES ........................................................................................ 46
VIII. RECOMENDACIONES ................................................................................ 47
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ................................................................ 48
X. ANEXO ..................................................................................................... 54
x
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Screening fitoquímico de Opuntia ficus indica “tuna”, Cassia reticulata
“retama”, Erythrina fusca “amasisa”, Physalis angulata “bolsa mullaca” ....... 30
Cuadro 2. Porcentaje de humedad .......................................................................... 31
Cuadro 3. Determinación del rendimiento del extracto Opuntia ficus indica “tuna”,
Cassia reticulata “retama”, Erythrina fusca “amasisa”, Physalis angulata
“bolsa mullaca” ................................................................................................. 33
Cuadro 4. Actividad antimicrobiana de extractos etanólicos .................................. 34
Cuadro 5. Análisis de la prueba de la normalidad ................................................... 36
Cuadro 6. Análisis de prueba t de Student de muestras relacionadas .................... 37
Cuadro 7. Análisis factorial de la varianza mixto (un factor inter y un factor intra) 38
xi
LISTA DE GRÁFICOS
Grafico 1. Porcentaje de humedad .......................................................................... 32
Gráfico 2. Rendimiento de los extractos. ................................................................ 33
Gráfico 3. Efecto antibacteriano de Physallis angulata en disco de 500 mg/ml, 400
mg/ml y 300 mg/ml frente a Pseudomonas sp. ............................................... 35
Gráfico 4. Efecto antibacteriano de Physallis angulata en disco de 500 mg/ml, 400
mg/ml y 300 mg/ml frente a Pseudomonas sp. ............................................... 35
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Antibiograma de Escherichia coli ATCC 35218 frente a extracto etanólico
de Opuntia ficus indica “tuna”” .................................................................. 71
Figura 2. Antibiograma de Escherichia coli O157-H7 frente a extracto etanólico de
Opuntia ficus indica “tuna” ......................................................................... 71
Figura 3. Antibiograma de Enterococcus faecalis ATCC 51299 frente a extracto
etanólico de Opuntia ficus indica “tuna” .................................................... 71
Figura 4. Antibiograma de Pseudomonas sp. frente a extracto etanólico de Opuntia
ficus indica “tuna” ....................................................................................... 71
Figura 5. Antibiograma de Salmonella typhi frente a extracto etanólico de Opuntia
ficus indica “tuna” ....................................................................................... 71
Figura 6. Antibiograma de Escherichia coli ATCC 35218 frente a extracto etanólico
de Physalis angulata “bolsa mullaca” ......................................................... 72
Figura 21. Antibiograma de Escherichia coli O157-H7 frente a extracto etanólico de
Physalis angulata “bolsa mullaca”. ............................................................. 72
Figura 8. Antibiograma de Enterococcus faecalis ATCC 51299 frente a extracto
etanólico de Physalis angulata “bolsa mullaca” ......................................... 72
Figura 10. Antibiograma de Salmonella typhi frente a extracto etanólico de
Physalis angulata “bolsa mullaca” .............................................................. 72
Figura 11. Antibiograma de Escherichia coli ATCC 35218 frente a extracto etanólico
de Erythrina fusca “amasisa” ...................................................................... 73
xiii
Figura 12. Antibiograma de Escherichia coli O157-H7 frente a extracto etanólico de
Erythrina fusca “amasisa” ........................................................................... 73
Figura 13. Antibiograma de Enterococcus faecalis ATCC 51299 frente a extracto
etanólico de Erythrina fusca “amasisa” ...................................................... 73
Figura 15. Antibiograma de Salmonella typhi frente a extracto etanólico de
Erythrina fusca “amasisa” ........................................................................... 73
Figura 16. Antibiograma de Escherichia coli ATCC 35218 frente a extracto etanólico
de Cassia reticulata “retama” ..................................................................... 74
Figura 17. Antibiograma de Escherichia coli O157-H7 frente a extracto etanólico de
Cassia reticulata “retama” .......................................................................... 74
Figura 18. Antibiograma de Enterococcus faecalis ATCC 51299 frente a extracto
etanólico de Cassia reticulata “retama” ..................................................... 74
Figura 19. Antibiograma de Pseudomonas sp. frente a extracto etanólico de Cassia
reticulata “retama” ..................................................................................... 74
Figura 20. Antibiograma de Salmonella typhi frente a extracto etanólico de Cassia
reticulata “retama” ..................................................................................... 74
xiv
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Mapa de ubicación del laboratorio donde se realizaron los ensayos
microbiológicos y fitoquímicos (Ciudad de Iquitos)…………………………………………….. 54
Anexo 2. Esquema de tamizaje fitoquímico………………………………………………………… 55
Anexo 3. Identificación de alcaloides………………………………………………………………….. 56
Anexo 4. Identificación de triterpenos y esteroides (ensayo de Liberman –
Burchard)……………………………………………………………………………………………………………. 56
Anexo 5. Identificación de quinonas (ensayo de Borntrager)……………………………….57
Anexo 6. Identificación de cumarinas (ensayo de Baljet)……………………………………..57
Anexo 7. Identificación de azúcares reductores (ensayo de Fehling)…………………… 57
Anexo 8. Identificación de saponinas (ensayo de la espuma)……………………………… 57
Anexo 9. Identificación de fenoles y taninos (ensayo de cloruro férrico)……………..58
Anexo 10. Identificación de aminoácidos y aminas (ensayo de ninhidrina)…………. 58
Anexo 11. Identificación de glicósidos cardiotónicos (ensayo de Kedde)……………..59
Anexo 12. Identificación de flavonoides (ensayo de Shinoda)…………………………….. 59
Anexo 13. Identificación de mucílago…………………………………………………………………. 60
Anexo 14. Identificación de principios amargos – astrigentes…………………………….. 60
Anexo 15. Preparación de las concentraciones…………………………………………………… 61
Anexo 16. Preparación de los discos de sensibilidad…………………………………………… 61
Anexo 17. Prueba de sensibilidad……………………………………………………………………….. 62
Anexo 18. Proceso de preparación de extractos…………………………………………………. 62
Anexo 19. Definición de términos básicos…………………………………………………………… 63
xv
Anexo 20. Screenig fitoquímico de Opuntia ficus indica “tuna” loretana……………..67
Anexo 21. Screenig fitoquímico Cassia reticulata “retama”………………………………… 68
Anexo 22. Screenig fitoquímico Physalis angulata “bolsa mullaca”……………………. 69
Anexo 23. Screenig fitoquímico Erythrina fusca “amasisa”………………………………… 70
Anexo 24. Antibiograma.......................................................................................... 71
Anexo 25. Datos etnobotánicos de las plantas investigadas................................... 75
Anexo 26. Antimicrobiana por el método de disco difusión-INS............................. 75
xvi
RESUMEN
Se investigó la actividad antibacteriana in vitro de los extractos etanólico, y
se realizó el análisis fitoquímico de sus extractos etanólico, hexánico y acuoso de
cuatro plantas del nor-oriente peruano: Opuntia ficus indica (penca), Erythrina
fusca (corteza), Cassia reticulata (fruto), y Physallis angulata (planta entera). Las
especies fueron recolectadas en el departamento de Loreto. La actividad
antibacteriana se evaluó mediante el método de difusión en agar; las bacterias
patógenas utilizadas fueron Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli O157-H7,
Enterococcus faecalis ATCC 51299, Pseudomonas sp., y Salmonella typhi. La
composición fitoquímica de las plantas investigadas que reveló la presencia de
compuestos fenólicos, taninos, saponinas, aminoácidos-aminas, cumarinas-
lactonas, y azúcares reductores. De los extractos investigados, sólo Physallis
angulata presentó actividad antibacteriana específica contra Pseudomonas sp.,
con halo promedio de 8mm. La prueba de la normal obtuvo un nivel de
significancia de 0,087, lo cual demuestra que no hubo diferencias significativas
entre los extractos respecto al antibiograma.
Palabras claves: Screening fitoquímico, actividad antibacteriana, plantas
medicinales.
1
I. INTRODUCCIÓN
Los antibióticos son una de las herramientas más utilizadas para controlar las
infecciones (1). El abuso de antibiótico debido a las reinfecciones puede ocasionar
resistencia bacteriana (2). Actualmente se ha producido un aumento alarmante en la
incidencia de enfermedades infecciosas resistentes a múltiples fármacos, siendo
necesario la búsqueda de nuevas sustancias antimicrobianas de otras fuentes, como
las plantas (3). Desde tiempos inmemoriales se han utilizado las plantas para el
tratamiento de diversas enfermedades (4). Se conoce muy poco, sobre el uso
tradicional de plantas en medicina (5).
El conocimiento de las propiedades medicinales de las plantas deben
contribuir a resolver, en parte, los problemas de salud de la población menos
favorecida y cuyas posibilidades de curarse son limitadas por el alto costo de los
fármacos (5). En el Perú, como en otros países en vías de desarrollo, las plantas
medicinales representan aún la principal herramienta terapéutica en medicina
tradicional. La flora peruana ofrece grandes posibilidades para el descubrimiento de
nuevos compuestos (6).
Las poblaciones de nuestros países se amparan cada vez más en el uso de la
gran variedad de plantas con propiedades medicinales, complementando o
solucionando sus problemas de salud (7). En respuesta a la necesidad de conseguir
alternativas eficaces para el control de las infecciones bacterianas, se ha recurrido a
la fitoquímica y fitofarmacología, logrando encontrar nuevas moléculas (8). De esta
1
2
forma se determinó que plantas como de Schinus molle “molle” y Silybum
marianum “cardo” (11) poseen actividad antibacteriana y potencian la acción de
sustancias antimicrobianas (10; 11; 12; 13).
En nuestro país el estudio de las plantas medicinales se viene desarrollando
de manera lenta. Se considera que existen grandes vacíos de información en el
estudio de las propiedades antimicrobianas de las plantas medicinales de nuestra
región; y que el abuso de antibióticos durante décadas ha ocasionado resistencia
bacteriana, los cuales han llevado a la necesidad de conseguir nuevos compuestos
antimicrobianos. En este contexto, la presente investigación determinó el screening
fitoquímico y actividad antibacteriana del extracto etanólico de cuatro plantas
medicinales, con la finalidad de encontrar nuevos compuestos antimicrobianos que
ayuden a tratar enfermedades bacterianas resistentes a antibióticos convencionales
y, que a partir de estos nuevos compuestos, se produzcan medicamentos
tradicionales de bajo costo y de fácil acceso a la población amazónica.
3
II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Conocer los componentes fitoquímicos y actividad antibacteriana del
extracto etanólico de cuatro plantas medicinales.
2.2. Objetivos específicos
Determinar la composición fitoquímica de Opuntia ficus indica "tuna",
Erythrina fusca “amasisa”, Cassia reticulata “retama" y Physalis
angulata "bolsa mullaca".
Determinar la sensibilidad de Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia
coli O157:H7 Salmonella typhi, Enterococcus faecalis ATCC 51299 y
Pseudomonas sp. frente al extracto etanólico de Opuntia ficus indica
"tuna", Erythrina fusca “amasisa”, Cassia reticulata “retama" y Physalis
angulata "bolsa mullaca".
4
III. REVISIÓN DE LITERATURA
3.1. Aspectos generales de Opuntia ficus indica “tuna”
3.1.1. Clasificación taxonómica
Reino : Plantae
División : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Orden : Caryophillales
Familia : Cactaceae
Subfamilia : Opuntioideae
Género : Opuntia
Especie : Opuntia ficus indica
Nombres comunes : tuna, higo erguido chumbo, cactus, pera
espinoso, nepal
3.1.2. Datos ambientales
Su hábitat son las laderas rocosas, márgenes de ríos y zonas urbanas
Andinas, resistentes a la sequía (14). Permanece vigorosa en condiciones calientes y
secas crece bien en climas áridos. Se ha introducido en muchas partes del mundo,
5
incluyendo África, el sur de Europa y el sur Asia. Cuenta con una amplia distribución
en Australia (11).
Bien adaptado a las tierras áridas y con una diversidad de climas y están
naturalizado en varias zonas de todo el mundo, incluyendo la cuenca del
Mediterráneo, Oriente Medio, África del Sur, Australia y la India. En África del Sur,
zonas del Mediterráneo y Sudamérica (15).
3.1.3. Descripción botánica
Opuntia ficus indica “tuna” puede crecer hasta 2 metros de altura y producir
flores amarillas limón en la primavera y el verano, seguido por los frutos rojos
purpúreas, resistente a la sequía debido a su naturaleza suculenta, la falta de hojas
y tallos gruesos que se dividen en segmentos (almohadillas o articulaciones) que
son planas, pieles duras, la fruta que es a menudo espinoso y forma de pera. El alto
contenido de azúcar y ácido da a la fruta de cactus un sabor ácido dulce. Utilizan la
mayoría de sus tejidos internos para el almacenamiento de agua y sus partes
exteriores para reducir la pérdida de agua y daños por el pastoreo y por animales
(14).
3.1.4. Usos
La Opuntia ficus indica “tuna” es utilizado en la medicina tradicional debido
a su papel en el tratamiento de una serie de enfermedades y condiciones,
incluyendo efectos anti-inflamatorios, propiedades hipoglucemiantes, la inhibición
6
de úlcera péptica, los efectos neuroprotectores, acciones antioxidantes y también
es utilizado para el tratamiento de quemaduras y asma (14). El fruto y el tallo de
Opuntia ficus indica “tuna” activan los movimientos intestinales y sirven para el
tratamiento del estreñimiento (efecto diurético inflamatorio; efecto anti-úlcera
prevención de la diabetes (11).
También es utilizado en el tratamiento de diabetes, hipertensión,
hipercolesterolemia, dolor reumático, mucosa gástrica y el asma, en muchos países
en el mundo. Hoy en día, es el foco de muchos estudios, ya que contienen
compuestos bioactivos (fitoquímicos), conocidos por sus propiedades relacionadas
con la salud. Se ha estado revelando una correlación positiva entre una dieta rica
en nopal y un menor riesgo de enfermedades asociadas con el estrés oxidativo,
como la diabetes, el cáncer, cardiovasculares y las enfermedades
neurodegenerativas (15).
Además Opuntia ficus indica “tuna” se emplea en la salud, la nutrición y la
cosmética en forma de té, mermelada, zumo y aceite extraído de las semillas de
nopal, flores de cactus y frutas se dan como agentes anti-ulcerogénicos o
antidiarreicos; siendo flores también administrarse como un medicamento anti-
hemorroides oral y savia penca como un tratamiento para la tos ferina, uso como
antidiabéticos y efectos anti-glicación (16).
7
3.2. Aspectos generales de Erythrina fusca “amasisa”
3.2.1. Clasificación taxonómica
Reino : Plantae
División : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Orden : Fabales
Familia : Fabaceae
Subfamilia : Faboideae
Tribu : Phaseoleae
Género : Erythrina
Especie : Erythrina fusca
Nombres comunes : amasisa, gallito, elequeme bucayo y pízamo;
árbol de coral
3.2.2. Datos ambientales
Erythrina fusca “amasisa” crece en zonas tropicales, con precipitación
pluvial de 1800 a 3500mm/año: temperaturas entre 20 y 26°C. Suelo: Se adapta a
una amplia variedad de suelos, desde arenosos - con muy baja fertilidad natural
8
hasta franco arcillo-limosos de buena fertilidad natural. También se encuentra en
laderas escarpadas. Especie pionera en áreas ribereñas inundables, también está
presente en zonas pantanosas y con elevada intensidad lumínica. Comparte su
hábitat con las siguientes especies: caña brava, cetico, gramalote, punga, raya balsa
y tangarana, entre otras (17).
Se distribuye en la zona tropical y la región subtropical del mundo y se ha
utilizado en tradicional medicina para el tratamiento de diversas enfermedades,
especialmente infecciones microbianas. Esta planta es conocida por ser una fuente
rica de alcaloides bioactivos y los flavonoides, principalmente isoflavonas,
terocarpans, flavanonas e isoflavanones. Se han encontrado que estos flavonoides
muestran una variedad de efectos biológicos, como la actividad antimicrobiana;
actividad anti-inflamatoria y la actividad anti-plasmodial (18).
La Erythrina fusca “amasisa” no presenta problemas fitosanitarios, pero es
poco empleada en sistemas de producción agrícola en la región amazónica del
Perú; sin embargo, presenta un buen potencial para recuperar y proteger áreas
degradadas. En sistemas inundables, puede emplearse como cerco vivo o árbol
para linderos en plantaciones lineales puras o intercalado con pandisho, poma rosa,
huito, ubos y shimbillo. Las especies de amasisa sin espina son empleadas como
árboles de sombra para el cultivo del café (17).
9
3.2.3. Descripción botánica
Erythrina fusca “amasisa” es un árbol que alcanza de 10 a 20 metros de altura
y de 20 a 60 centímetros de diámetro. Copa redondeada a umbelada, con follaje
disperso. Tronco con espinas cónicas, a veces anchas y aplanadas. Corteza externa
de color blanco-grisáceo. Ramitas terminales de color verde, con espinas en forma
de aguijón. Hojas trifolioladas, alternas, con el folíolo terminal grande y los otros
dos más pequeños, verdes en el haz y verde-grisáceas en el envés. Folíolos de 5-15
centímetros de largo y de 3-9 de ancho, ovados a oblongos, con ápice obtuso a
redondeado, bordes enteros, base redondeada o ligeramente cordada. El peciolo
pulvinado en la base, presenta dos glándulas en el punto de unión de los dos
folíolos basales (19).
3.2.4. Usos
Se usa contra úlceras; mientras que el líquido obtenido de un cocimiento de
la corteza se emplea en Baños de asiento para las hemorroides, como también en
contra de micosis; la toma del cocimiento de las hojas se usa contra infecciones
urinarias e Inflamación de la próstata (5). También se usa en lavados como
cicatrizante y contra la celulitis, el emplasto en inflamaciones; el cocimiento de las
raíces es usado como sudorífico; el cocimiento de las flores es usado para tratar la
tos; y el cocimiento de las hojas para tratar la inflamación renal (17).
Las especies de Erythrina podría tener analgésico, anti-inflamatorio y
actividad anti-bacteriana. La corteza y las hojas se utilizan principalmente para
10
curar enfermedades tales como dolor de muelas, dolor de oído, esguinces,
ligamentos tensas, abscesos, bronquitis, tuberculosis, infecciones respiratorias,
llagas purulentas y para desinfectar heridas (20).
3.3. Aspectos generales de Cassia reticulata "retama”
3.3.1. Clasificación taxonómica
Reino : Plantae
División : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Subclase : Rosidae
Orden : Fabales
Familia : Fabaceae
Subfamilia : Caesalpinioideae
Tribu : Cassieae
Subtribu : Cassiinae
Género : Cassia
Especie : Cassia reticulata
Nombres comunes : retama, laureño, matapasto
11
3.3.2. Datos ambientales
Cassia reticulata “retama” es una planta tropical, con alta precipitación
pluvial y elevada humedad relativa. Distribuida desde México hasta Bolivia. En el
Perú se encuentra en los departamentos de Loreto, Amazonas y Junín. Es una
especie rústica poco exigente en condiciones de suelo, la especie crece
abundantemente. Habita en terrenos inundables y no inundables, chacras nuevas y
pastizales, en campo abierto y sombreado. Es resistente a la inundación. En suelos
no inundables, se puede asociar con especies forestales como tornillo, moena y
marupa. En restingas bajas puede intercalarse con cedro, capirona y lupuna (17).
Es una especie leñosa pionero que es común en sitios inundables
perturbados ricos en nutrientes del Amazonas y sus afluentes. Se produce
principalmente cerca de los canales de los ríos y en los pastizales abandonados en
las llanuras de inundación. Se limita a los lugares más altos en el gradiente de las
inundaciones que obtienen anegadas durante un máximo de 7 meses al año. La
duración del período de aguas altas no es crucial, ya que esta especie es
extremadamente tolerante a la inundación, sobrevive al mantener algunas hojas
por encima de la superficie del agua. Es de crecimiento rápido y auto compite con
hierbas y otros pioneros leñosos por su rápido crecimiento. La distribución
geográfica es a lo largo de las llanuras aluviales amazónicas de ríos de aguas
blancas, pero también crece en sitios húmedos en la tierra firme, por ejemplo, en la
12
ciudad de Manaos. Se encuentra típicamente en los sitios que son húmedos y con
alta aporte de nutriente (21).
3.3.3. Descripción botánica
Es un arbusto de 3 a 5 m o árbol pequeño de 6 a 8 m. Hojas de 7 a 13 cm de
largo por 2 a 4 cm de ancho, articular, pinnadas, foliolos oblongos en número de 9 a
12 pares, redondeadas en la base y ápice. Inflorescencia racimosa, terminal o axilar.
Flores amarillas. Fruto linear oblongo de 15 cm de largo por 2 cm de ancho,
delgado, plano y glabro (17). Arbolillo de hasta 15 m de alto; las partes jóvenes
incluyendo las hojas inferiores y los racimos, puberulentos o pilosos. Hojas
pinnadas, foliolos 9-12 par, anchamente oblonga u obovada; oblicua, redondeada u
obtusa en ambas puntas, ordinariamente de 7-10 cm de largo y 2-4 cm de ancho.
Flores amarillas, sépalos grandes, casi 12 cm de largo (5)
La Cassia reticulata “retama” tiene hojas compuestas con 8-14 pares de
folíolos que son obovadas-oblongas, obtusas, mucronada, glabras por ambas
partes. Las flores son grandes, de color amarillo, frutos son legumbres largas,
agrandados en cada lado, crenulados. Las ramas son muchos, difundidas de forma
irregular en ángulo, con la bifurcación a partir de baja en el tallo. El dosel es muy
densa y amplia. Los árboles de 4.8 m de altura tienen las copas densas con
diámetros que alcanzan 6.04 m. La especie es rica en compuestos secundarios (21).
13
3.3.4. Usos
El cocimiento de las hojas se usa como anti diarreico; y junto a flores y su
raíz sirve como antiparasitario, y para el tratamiento de infecciones urinarias y
diurético; se toma el cocimiento (2 horas) de las flores como agua de tiempo. No es
conveniente administrar a las mujeres embarazadas (5). El jugo de las hojas,
mezclado con jugo de limón, es utilizado como un remedio para la tiña. La planta es
una cura de picaduras venenosas y afecciones cutáneas como las enfermedades
fúngicas (21).
3.4. Aspectos generales de Physalis angulata "bolsa mullaca"
3.4.1. Clasificación taxonómica
Reino : Plantae
División : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Orden : Solanales
Familia : Solanaceae
Subfamilia : Solanoideae
Tribu : Physaleae
Subtribu : Physalinae
14
Género : Physalis
Especie : Physalis angulata
Nombre común : bolsa mullaca, tomatillo
3.4.2. Datos ambientales
Physalis angulata “bolsa mullaca” se multiplica profusamente en climas
tropicales húmedos, aunque también se adapta a clima templado. Suelos de textura
arcillo-limosa, rico en materia orgánica y con pH alrededor de 7. Es una especie
pionera y predominante en suelos inundables en los cuales comparte su hábitat
principalmente con amasisa, caña brava y gramalote, entre otros. Crece y se
dispersa abundantemente en áreas bien iluminadas. En el Perú se encuentra en los
departamentos de Loreto, Piura, La Libertad, San Martín, Lima, Huánuco, Cajamarca
y Junín. Además, se encuentra en toda la Amazonía (17).
3.4.3. Descripción botánica
Physalis angulata “bolsa mullaca” es una hierba anual de hasta 1 m de
altura, perenne en zonas subtropicales, tallo ramificado, grueso, fistuloso, verde o
parduzco, glabro y carnoso, triangular en la parte inferior y cuadrangular en la
superior, así como en las ramas. Hojas alternas, ovadas, ovado-lanceoladas, ovada
oblonga, cuneadas en la base. Flores solitarias de 8 a 10 mm, en forma de campana
largo de color crema; cáliz sub-angulado y fructífero que amplía para cubrir la fruta
y cuelga hacia abajo como una linterna, pedúnculo recurvado sin mácula y con
15
anteras violáceas. Fruto en baya amarillo verdosa y de apariencia a perla de color
amarillo en una pequeña cápsula, forma linterna y muy delicioso para comer.
Semillas reniformes, comprimidas, rubescentes, de 1,5 mm de longitud. En el Perú
se distribuye ampliamente en siguientes departamentos: Amazonas, Cajamarca,
Huánuco, Junín, La Libertad, Loreto, Madre de Dios, Pasco, San Martín y Ucayali (5;
17).
3.4.4. Usos
La raíz de Physalis angulata “bolsa mullaca” con miel se usan para tratar
diabetes mediante maceración en agua caliente; infusión de raíz para hepatitis,
diurético; inflamaciones y desinfectante con el cocimiento de hojas y frutos se
fricciona la zona afectada. Se aplican también directamente las hojas frescas y
trituradas; asma, fruto para sarna (5). Se usa para tratar el asma, problemas
urinarios, el reumatismo, y los tumores; como también artesanía, ornamental y de
alimentos, el uso más común y el más importante es en la preparación de salsas (22).
También se usa como acaricida; diurético en infusión de las hojas; asadas en
forma de emplastos para abscesos y micosis dérmica; infusión de la parte aérea de
la planta se usa para el asma; infusión de las raíces para inflamaciones, otalgias;
como también son comestibles, generalmente consumidos en estado fresco. En
Centroamérica tiene procesamiento industrial, elaborándose conservas en almíbar
(17).
16
IV. MATERIALES Y MÉTODOS.
4.1. Descripción del área de estudio.
La investigación experimental se llevó a cabo en las instalaciones del
Instituto de Medicina Tradicional (IMET-EsSalud), el laboratorio de fitoquímica,
ubicada en el pasaje San Lorenzo N° 205, con coordenadas (18 M 691818 E –
9583702 S), con una altura de 116 msnm, en la ciudad de Iquitos, capital del
Departamento de Loreto, provincia de Maynas, distrito de San Juan Bautista. Es una
zona considerada bosque húmedo tropical y presenta temperatura media anual de
26°C.
4.2. Procedimientos
4.2.1. Tamizaje fitoquímico
El método que se utilizó para el tamizaje de las muestras fue el descrito por
el Departamento de Farmacognosia de la Universidad Médica de Budapest
(Hungría) y por el Departamento de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y
Alimentos de la Universidad de la Habana, adoptado por el Departamento de
Fitoquímica del IMET-EsSALUD, con el protocolo de estudio respectivo.
Técnica Operatoria: Se maceró al medio ambiente 5 gramos del pulverizado
en 50 ml de éter dietílico durante 48 horas de cada uno de las 4 plantas
medicinales, Cassia reticulata “retama” (fruto), Opuntia ficus indica “tuna” (penca),
Physalis angulata “bolsa mullaca” (planta entera) y Erythrina fusca “amasisa”
17
(corteza). Luego se filtró el extracto etéreo y se distribuyó alícuotas de 5 ml en 6
tubos de ensayo, concentrando los tubos a sequedad en Baño María, para
identificar: alcaloides, triterpenos-esteroides, quinonas, cumarinas, carotenos.
El residuo libre de éter dietílico de la etapa anterior, se secó y se maceró 50
ml de etanol al 95% durante 24 a 48 horas, luego se filtró el extracto etanólico y el
filtrado se distribuyó en alícuotas de 5 ml en 5 tubos de ensayos para identificar:
azúcares reductores, saponinas, aminoácidos y aminas, cumarinas, fenoles y
taninos.
El resto de este extracto etanólico fue llevado a sequedad, disuelto en agua
esterilizada, y luego mezclado con 10 ml de HCl al 10%. Se calentó y se filtró por
dos veces. Con 1 ml del filtrado se realizó la prueba para alcaloides y el resto se
ajustó a pH 9 con amoníaco, se añadió 0.9 gramos de sulfato de sodio, se filtró y se
extrajo 2 veces con 15 ml de cloroformo. Con 2 ml de la fase acuosa se identificó
flavonoides.
La fase clorofórmica se distribuyó en alícuotas de 5 ml en 3 tubos de ensayo
y se concentró a sequedad para identificar glicósidos cardiotónicos, flavonoides y
quinonas. El residuo libre de etanol se maceró con 50 ml de agua destilada durante
24 a 48 horas, luego se filtró y distribuyó en alícuotas de 5 ml en 8 tubos de ensayo,
para identificar alcaloides, azúcares reductores, fenoles y taninos, saponinas,
flavonoides, mucílagos, principios amargos y principios astringentes y glicósidos.
18
En el esquema Nº 01 (Anexo 2) se muestra el flujograma para la obtención
de los diferentes extractos empleados en el tamizaje fitoquímico. La identificación
de la presencia o ausencia de los metabolitos secundarios, estuvo sujeta a la
aplicación de los siguientes ensayos:
4.2.1.1. Identificación de alcaloides
Se realizó tres ensayos para determinar la presencia de alcaloides: ensayo
de Dragendorff, ensayo de Mayer y el ensayo de Wagner (Anexo 3). La fracción fue
disuelta en 1 ml de solución de ácido clorhídrico al 1%, con ausencia de solvente
orgánico se mezcló con una gota del reactivo; luego se midió su nivel de
opalescencia considerándose (+), turbidez definida (++), precipitado (+++) de color
rojo ladrillo (Dragendorff), blanco (Mayer) y marrón (Wagner). En el caso de
acuoso, a la alícuota se le añadió una gota de ácido clorhídrico concentrado y se
procedió de la misma forma.
Ensayo de Dragendorff
Reactivo: En un matraz Erlenmeyer de 125 ml se disolvió 8g de nitrato de
bismuto pentahidratado con 20 ml de ácido nítrico (cuya densidad sea de 1.18
g/ml, al 30%). En otro matraz se colocó 27.2g de yoduro de potasio con 50 ml de
agua. Mezclamos las dos soluciones y dejamos en reposo durante 24 horas. Se
decantó la solución (para separar residuos de cristales de nitrato de potasio) y se
completó con agua a 100 ml.
19
Ensayo de Mayer
Reactivo: solución A: 1,36 g de cloruro de mercurio (II) (HgCl2) + 60 ml de
agua destilada. Solución B: 5 g de yoduro de potasio (KI) + 10 ml de agua destilada.
Se mezcló las soluciones y se aforó a 100 ml.
Ensayo de Wagner
Reactivo: 1.27 g de yodo resublimado + 2 g de yoduro de potasio en 20 ml
de agua destilada; se mezcló y aforó a 100 ml.
4.2.1.2. Identificación de triterpenos y esteroides
Ensayo de Liberman - Burchard
En un tubo de ensayo se colocó 1 ml de fracción disuelta en cloroformo con
1 ml de anhídrido acético y se mezcló bien (Anexo 4). Un ensayo positivo se tuvo
por un cambio rápido de coloración:
Rosado – azul, muy rápido.
Verde intenso – visible, aunque rápido.
Verde oscuro – negro, final de la reacción.
4.2.1.3. Identificación de quinonas
Ensayo de Borntrager
20
La fracción fue disuelta en 1 ml de cloroformo y se agitó con 1 ml de
solución de hidróxido de sodio, de potasio o de amonio al 5 % en agua. Si la fase
acuosa alcalina (superior) se coloreaba de rosado a rojo, el ensayo se consideraba
positivo a naftaquinona y antraquinona (Anexo 5).
El ensayo no excluye presencia de quinonas, ya que pueden encontrarse en
forma de glicósidos, siendo necesaria la hidrólisis previa de los mismos para su
posterior detección.
4.2.1.4. Identificación de cumarinas
Ensayo de Baljet
Permitió reconocer en un extracto la presencia de compuestos con
agrupamientos lactónicos en particular cumarinas, aunque otros compuestos
lactónicos dieron positivo al ensayo, como: las lactosas sesquiterpénicas,
cardiotónicos, etc. Cuando la alícuota del extracto no se encontró en alcohol, se
evaporó el solvente en Baño María y disolvió en la menor cantidad de alcohol (1
ml). En estas condiciones se adicionó 1 ml del reactivo (reactivo A es una solución
de ácido pícrico al 1% en etanol y el reactivo B es una solución al 10% de hidróxido
de sodio), se consideró un ensayo positivo porque apareció un precipitado rojo o
coloración roja (Anexo 6).
21
4.2.1.5. Identificación de azúcares reductores
Ensayo de Fehling
El residuo se dividió en 1 a 2 ml de agua cuando la fracción no fue acuosa, se
adicionó 2 ml de reactivo (solución A: sulfato cúprico; solución B: hidróxido de
sodio y una sal orgánica llamada tartrato de sodio y potasio, sal de Seignette), se
calentó la mezcla en Baño de agua durante 10 a 30 minutos. El ensayo se consideró
positivo poque la solución se coloreó de rojo (Anexo 7).
4.2.1.6. Identificación de saponinas
Ensayo de la espuma
Permitió reconocer la presencia de saponinas tanto del tipo esferoidal como
triterpénica. Cuando la alícuota se encontraba en alcohol, se diluyó con 5 veces su
volumen en agua y se agitó la muestra fuertemente durante 2 minutos. El ensayo
se consideró positivo cuando apareció espuma de 2 mm de altura en la superficie
del líquido y persistente por más de 2 minutos (Anexo 8).
4.2.1.7. Identificación de fenoles y taninos
Ensayo de cloruro férrico
A la fracción disuelta en 1 ml de etanol, se añadió 0.5 ml de una solución de
cloruro férrico al 5% en solución salina. La aparición de un color o precipitado verde
22
oscuro indicó la presencia de fenoles y/o taninos. En el extracto acuoso se adicionó
acetato de sodio previo al ensayo (Anexo 9).
4.2.1.8. Identificación de aminoácidos y aminas
Ensayo de ninhidrina
Se tomó una alícuota de extracto en alcohol, si el extracto se encontró en
otro solvente orgánico, se evaporó a sequedad; en ambos casos se mezclaron con 2
ml de solución al 0,2% de ninhidrina en alcohol. La mezcla se calentó de 5 a 10
minutos en Baño de agua. Este ensayo se consideró positivo porque se observó un
color azul violáceo (Anexo 10).
4.2.1.9. Identificación de glicósidos cardiotónicos
Ensayo de Kedde
La fracción se disolvió en 1 ml de alcohol etílico, se mezcló con 1 ml del
reactivo (solución A ácido dinitrobenzoico al 2% en metanol; solución B hidróxido
de potasio al 5, 7% en agua) y se dejó reposar durante 5 – 10 minutos. Un ensayo
es positivo cuando se observa una coloración violácea persistente durante 1 a 2
horas (Anexo 11).
23
4.2.1.10. Identificación de flavonoides
Ensayo de Shinoda
A 2 ml de fracción acuosa o el residuo disuelto en 2 ml de agua, se le
adicionó 1 ml de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de magnesio metálico
o zinc metálico. Cuando la reacción terminó (en unos 5 minutos), se añadió 1 ml de
alcohol amílico y se agitó (Anexo 12).
El ensayo se consideraba positivo cuando el alcohol amílico se coloreaba de
amarillo, anaranjado o rojo, intenso en todos los casos.
4.2.1.11. Identificación de mucílagos
Permitió reconocer en los extractos vegetales la presencia de estructuras
tipo polisacáridos, que formó un coloide hidrófilo que aumentó la densidad del
agua cuando se extrajo.
Para ello una alícuota del extracto se enfrió de 0 a 5°C y la solución tomó
una consistencia gomosa al tacto, el ensayo fue positivo (Anexo 13).
4.2.1.12. Identificación de principios amargos - astringentes
El ensayo se realizó tomándole el sabor a Ia gota del extracto acuoso del
vegetal (Anexo 14).
24
4.2.2. Elaboración del extracto
4.2.2.1. Preparación de pulverizado
Se colectó hojas, y corteza (cortada en pequeños fragmentos) de Cassia
reticulata “retama”, Opuntia ficus indica “tuna”, Physalis angulata “bolsa mullaca”
y Erythrina fusca “amasisa”; y se envolvió con papel, estos fueron secados en una
estufa a 80°C por 72 horas; se volvió a pesar, y luego con un molino manual se
pulverizó. El pulverizado fue guardado en frascos oscuros hasta que se utilizó
(Anexo 18).
4.2.2.2. Preparación del extracto etanólico
Se pesó 50 gramos de pulverizado de cada uno de las 4 plantas medicinales,
Cassia reticulata “retama”, Opuntia ficus indica “tuna”, Physalis angulata “bolsa
mullaca” y Erythrina fusca “amasisa”; y se remojó en 500 ml de alcohol a 90°, se
maceró por 24 horas. Las suspensiones fueron filtradas poniendo algodón en un
embudo (2 veces) y luego fue filtrado con un papel filtro en un embudo de vidrio. El
extracto fue concentrado a 37ºC, se puso 5ml de extracto en una cápsula de
porcelana previamente pesada y se secó por medio de Baño María; una vez seco se
volvió a pesar la cápsula de porcelana con el extracto seco. Para calcular el
rendimiento se utilizó la siguiente formula:
Rendimiento de extracto (RE)
𝑅𝐸 = (𝑃𝑖 − 𝑃𝑓
𝑃𝑖) 𝑥100
25
Concentración de extractos (CE)
𝐶𝐸 = (𝑃𝑒
𝑃𝑠)𝑥100
4.2.3. Antibiograma
4.2.3.1. Preparación de las concentraciones
Se realizó los cálculos de las concentraciones de los extractos de Cassia
reticulata “retama”, Opuntia ficus indica “tuna”, Physalis angulata “bolsa mullaca”
y Erythrina fusca “amasisa”.
Se pesó 10 g de extracto seco y se puso en 10 ml de agua destilada estéril y
se obtuvo la solución stock a una concentración de 1000 mg/ml.
A partir de esta solución stock se procedió a preparar las siguientes diluciones a las
concentraciones siguientes: 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml, 400
mg/ml y 500 mg/ml (Anexo 15).
4.2.3.2. Preparación de los discos de sensibilidad
Los discos de sensibilidad se prepararon utilizando papel Watman Nº 3, se
empleó un perforador convencional. Estos discos se esterilizaron en autoclave a
121ºC y 15 libras de presión por 15 minutos. Cada uno de los discos fueron
embebidos con 15 μl de una disolución determinada preparada anteriormente con
los extractos vegetales, estas se dejaron secar por 24 horas (Anexo 17).
26
4.2.3.3. Prueba de sensibilidad
Se replicaron las cepas bacterianas (en estudio) en agar nutritivo y luego se
incubaron a 37ºC por 24 horas; después se replicaron las cepas en caldo tripticasa
de soya (tryptic soy broth tsb por sus siglas en ingles), y se utilizaron discos de
gentamicina de 10 μg como control para las enterobacterias, y discos de
ciprofloxacino 5 μg de potencia como control positivo en el caso de Enteroccus
faecalis (ATCC 51299).
Se preparó la suspensión de cada bacteria en caldo tripticasa de soya,
extrayendo de 3 a 5 colonias. Luego se incubaron de 3 a 6 horas, hasta que se
alcanzó el grado 0.5 de turbidez en la escala de Mc Farland.
Mientras tanto, las suspensiones de las cepas bacterianas se incubaron. Una
vez que las suspensiones alcanzaron el grado 0.5 de turbidez en la escala de Mc
Farland se procedió a tomar una alícuota de 50 μl de cada suspensión y se
diseminaron sobre las placas con agar Müller Hinton antes preparado, utilizando
para esto una espátula de vidrio Nº 8.
Sobre las siembras de las bacterias en placas se colocaron los discos de
sensibilidad (50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml, 400 mg/ml y 500
mg/ml) de los extractos de Opuntia ficus indica “tuna”, Erythrina fusca “amasisa”,
Cassia reticulata "retama”, Physalis angulata "bolsa mullaca".
27
La lectura de la prueba se realizó midiendo el halo de inhibición producida
por los discos de sensibilidad y se utilizó además para este propósito un vernier
convencional. Los datos se interpretaron según el método de Kirby – Bauer (Anexo
17 y 26).
4.2.4. Procesamiento de la información.
Los datos fueron procesados en Microsoft Excel 2010 y en
IBM.SPSS.Statistics.v22.x86. Se realizó análisis de correlación y se aplicó el Diseño
Factorial con medidas repetidas. Los resultados fueron presentados en cuadros e
índices estadísticos.
28
V. RESULTADOS
5.1. Screening fitoquímico
El extracto hexano de Opuntia ficus indica “tuna” fue positivo a cumarinas y
lactonas. El extracto etanólico fue positivo a fenoles y taninos, a saponinas (++),
cumarinas (+), aminoácidos y aminas (+++). El extracto acuoso fue positivo a
fenoles y taninos (+), saponinas (++), principios amargos y astringentes (+) y a
azucares reductores (+).
El extracto hexano de Cassia reticulata “retama” fue positivo a quimonas
(+), cumarinas y lactonas (+), mucílagos (+), saponinas (++), cumarinas (++) y a
aminoácidos-aminas (++). El extracto etanólico fue positivo a quimonas (+),
cumarinas (+), fenoles y taninos (+), saponinas (+++), cumarinas (+), y a
aminoácidos-aminas (+++). El extracto acuoso fue positivo a fenoles y taninos (+),
saponinas (+), principios amargos y astringentes (+) y a azucares reductores (+).
El extracto de hexano de Physalis angulata “bolsa mullaca” fue positivo a
triterpenos y esteroides positivo (++), cumarinas/lactonas (+++). El extracto
etanólico fue positivo a saponinas (+++), cumarinas (+++), aminoácidos-aminas (+)
triterpenos y esteroides (++). El extracto acuoso fue positivo a saponinas (+);
principios amargos y astringentes (+), azucares reductores (+).
Extracto hexano de Erythrina fusca “amasisa” fue positivo a quimonas (+/2)
y a curarinas /lactonas (+). El extracto etanólico fue positivo a fenoles y taninos (+),
29
quimonas (+), saponinas (++), cumarinas (++), aminoacidos-aminas (++). El extracto
acuoso fue positivo a fenoles y taninos (++), saponinas (++), principios amargos y
astringentes (+) y a azucares reductores (+/2) (Cuadro 1).
30
Cuadro 1. Screening fitoquímico de Opuntia ficus indica “tuna”, Cassia reticulata “retama”, Erythrina fusca “amasisa”, Physalis angulata “bolsa
mullaca”
Tipo de extracto
Especie vegetal Fenoles y taninos
Saponinas Pincipios amargos y astringentes
Cumarinas/Lactonas Triterpenos/ Esteroides
Amionoácidos-aminas
Azúcares reductores
Mucílago
Cloruro férrico
De la espuma
Baljet Liberman/ Burchard
Ninhidrina Fehling
E Cassia reticulata (F)
(+) (++) (-) (+) (-) (+++) (-) (-)
Opuntia ficus indica (H)
(++) (++) (-) (+) (-) (+++) (-) (-)
Physalis angulata (PE)
(-) (+++) (-) (+++) (-) (-) (-) (-)
Erythrina fusca (C)
(+) (++) (-) (++) (-) (++) (-) (-)
H Cassia reticulata (F)
(-) (++) (-) (+) (-) (-) (-) (-)
Opuntia ficus indica (H)
(-) (-) (-) (++) (-) (-) (-) (-)
Physalis angulata (PE)
(-) (-) (-) (+++) (++) (-) (-) (-)
Erythrina fusca (C)
(-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-)
A Cassia reticulata (F)
(+) (+) (+) (-) (-) (-) (++) (-)
Opuntia ficus indica (H)
(+) (++) (+) (-) (-) (-) (+) (+)
Physalis angulata (PE)
(-) (+) (+) (-) (-) (-) (+) (-)
Erythrina fusca (C)
(++) (++) (+) (-) (-) (-) (+) (-)
Partes estudiadas: H, hojas; F, fruto; PE, planta entera; C, corteza Tipo de extracto: E, etanólico; H, hexano; A, acuoso
31
5.2. Determinación de la humedad
Se obtuvo el porcentaje de humedad de cada una de las plantas estudiadas,
Cassia reticulata tuvo una humedad de 75.92%, Physalis angulata de 90.16% y
Erythrina fusca de 91.40%; para lo cual se utilizó fruto verde de Cassia reticulata,
planta entera de Physalis angulata y corteza de Erythrina fusca; no se calculó la
humedad de Opuntia ficus indica porque es una planta que tiene alto contenido de
agua. Se determinó la humedad para conocer qué cantidad de planta era necesario
utilizar para conseguir suficiente extracto liofilizado y emplearlo en las diferentes
concentraciones en el antibiograma (Cuadro 2).
Cuadro 2. Porcentaje de humedad
Planta Parte usada Peso
fresco (g)
Peso
seco (g) Humedad %
Cassia reticulata fruto verde 231.942 55.843 75.92
Physalis angulata planta entera 236.572 23.270 90.16
Erythrina fusca corteza 1620.485 139.414 91.40
32
Grafico 1. Porcentaje de humedad
5.3. Determinación del rendimiento de extracto
Se hicieron cuatro repeticiones por extracto etanólico de cada planta, en las
cuales se colocaron 5 ml de cada extracto concentrado en placas petri, que luego
fueron puestos a secar en estufa.
En el caso del extracto etanólico de Cassia reticulata “retama” se obtuvo
rendimientos de 3.14% a 3.64% obteniendo un promedio de 3.38 % (Cuadro 2). En
el caso del extracto etanólico de Opuntia ficus indica “tuna” se obtuvo
rendimientos de 3.68% a 4.18% obteniendo un promedio de 3.87 % (Cuadro 3). En
el caso del extracto etanólico de Physalis angulata “bolsa mullaca” se obtuvo
rendimientos de 4.74% a 5.11% obteniendo un promedio de 4.92 % (Cuadro 4). En
75.92%
90.16% 91.40%
0.00%
10.00%
20.00%
30.00%
40.00%
50.00%
60.00%
70.00%
80.00%
90.00%
100.00%
Cassia reticulata "retama" Physalis angulata "bolsamullaca"
Erythrina fusca "amasisa"
humedad
33
el caso del extracto etanólico de Erythrina fusca “amasisa” se obtuvo rendimientos
de 0.95% a 1.13% obteniendo un promedio de 1% (Cuadro 3, Gráfico 2).
Cuadro 3. Determinación del rendimiento del extracto Opuntia ficus indica “tuna”,
Cassia reticulata “retama”, Erythrina fusca “amasisa”, Physalis angulata
“bolsa mullaca”
Extracto etanólico Peso de
placa sin
extracto (g)
Peso de placa
con extracto
seco (g)
Rendimiento
%
Opuntia ficus indica “tuna” 43.12 43.9 3.87%
Cassia reticulata “retama” 26.12 26.8 3.38%
Erythrina fusca “amasisa” 17.92 18.12 1%
Physalis angulata “bolsa mullaca” 18 18.98 4.92%
Gráfico 2. Rendimiento de los extractos.
34
5.4. Antibiograma
Los extractos etanólico de Opuntia ficus indica “tuna”, Erythrina fusca
“amasisa” y Cassia reticulata “retama”, no presentaron actividad antibacteriana
frente Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli O157-H7, Enterococcus faecalis
ATCC 51299, Pseudomonas sp., y Salmonella typhi. Physalis angulata “bolsa
mullaca” presentó efecto antibacteriano ante a Pseudomonas sp., a 300 mg/mL,
400 mg/mL y 500 mg/mL de potencia del disco del extracto con un halo promedio
de 8 mm (gráficos 3 y 4). Escherichia coli ATCC 35218 se mostró resistente a
gentamicina con un halo de 9 mm; Escherichia coli O157-H7 se mostró sensible a
gentamicina con un halo de 20 mm, con 22 mm en Pseudomonas sp., y con 23 mm
en Salmonella typhi; Enterococcus faecalis ATCC 51299 se mostró sensible a
ciprofloxacino con un halo de 22 mm (Cuadro 4).
Cuadro 4. Actividad antimicrobiana de extractos etanólicos
Especies de plantas Partes de plantas
ensayadas*
Tipo de extracto
Diámetro de la zona de halo (mm)
Actividades antibacterianas**
E.c ATCC 35218
E.c O157:H7
E. f. ATCC 51299
P.sp. S.t
Cassia reticulata F Etanólico 0 0 0 0 0
Opuntia ficus indica H Etanólico 0 0 0 0 0
Physalis angulata PE Etanólico 0 0 0 8 0
Erythrina fusca C Etanólico 0 0 0 0 0
Controles
Gentamicina (10μg /ml) 9 20 - 20 23
Ciprofloxacino (5μg /ml) - - 22 - -
*F: fruto; H: hoja; PE: planta entera; C: corteza.
35
**Especies de bacterias: E.c. ATCC 35218, Escherichia coli ATCC 35218; E.c. O157:H7, Escherichia coli O157:H7; E.f. ATCC 51299, Enterococcus faecalis ATCC 51299; P.sp., Pseudomonas sp.; S.t., Salmonella typhi.
Gráfico 3. Efecto antibacteriano de Physallis angulata en discos de 500 mg/ml, 400
mg/ml y 300 mg/ml frente a Pseudomonas sp.
Gráfico 4. Efecto antibacteriano de Physallis angulata en discos de 500 mg/ml, 400
mg/ml y 300 mg/ml frente a Pseudomonas sp.
109 9 9 9
78
98 8
7 7 78 8
0
2
4
6
8
10
12
50
0 m
g/m
L
50
0 m
g/m
L
50
0 m
g/m
L
50
0 m
g/m
L
50
0 m
g/m
L
40
0 m
g/m
L
40
0 m
g/m
L
40
0 m
g/m
L
40
0 m
g/m
L
40
0 m
g/m
L
30
0 m
g/m
L
30
0 m
g/m
L
30
0 m
g/m
L
30
0 m
g/m
L
30
0 m
g/m
L
Physallis angulata
Pseudomonas sp.
68 7 8 88 8 8 8 8
10 10 9 10 9
18 18
22
19 20
0
5
10
15
20
25
FIT 1 FIT 2 FIT 3 FIT 4 FIT 5
Pseudomona sp
Physallis angulata 300 mg/mL Physallis angulata 400 mg/mL
Physallis angulata 500 mg/mL GENTAMICINA
36
5.5. Prueba de la normalidad
Al realizar el procesamiento de la información, en primer lugar, se realizó la
prueba de normalidad para el promedio de los extractos, con el estadístico Z de
Kolmogorov-Smirnov, requisito para utilizar pruebas estadísticas paramétricas
como en Análisis de Varianza (ANOVA) y el análisis factorial, los resultados se
aprecian en el Cuadro 8, del que podemos deducir que el valor calculado de Z-KS =
0,149 y una significancia bilateral (p) de: 0,087; la misma que fue mayor del 5% (p >
0.05), lo que indica que los valores de los extractos provienen de una población
distribuida normalmente (Cuadro 5).
Cuadro 5. Análisis de la prueba de la normalidad
EXTRACTO Kolmogorov-Smirnova
Estadístico gl Sig.
Physallis angulata 0,149 30 0,087
5.6. Prueba t de Student para muestras relacionadas
Para contrastar las hipótesis planteadas se aplicó la prueba t de Student
para muestras relacionadas (cuadro 6). Los resultados muestran que no existe
diferencia significativa entre los extractos con respecto al resultado del
antibiograma, pero si existe diferencia entre las bacterias Escherichia coli O157:H7,
Escherichia coli ATCC 35218, Salmonella typhi, Pseudomonas sp. y Enterococcus
37
faecalis ATCC 51299, lo cual indica que el tamaño del halo en el antibiograma varia
significativamente según la especie bacteriana; además podemos observar que la
concentración del disco empleado presentan diferencia significativas entre sí
respecto al tamaño de halo; por lo que se debe usar el disco con mayor halo
presentes en el antibiograma para posible tratamiento contra estos tipos de
bacterias (Cuadro 6).
Cuadro 6. Análisis de prueba t de Student de muestras relacionadas
Diferencias relacionadas
Media Desviación
típ. T gl
Sig. (bilateral)
Par 1 Extracto - Antibiograma
0,387 6,113 1,676 699 0,094
Par 2 Bacteria - Antibiograma
0,887 6,155 3,814 699 0,000
Par 3 Disco - Antibiograma
1,887 5,265 9,483 699 0,000
5.7. Análisis factorial de la varianza mixto
Por otro lado al realizar el análisis factorial mixto para la varianza de los
factores se concluye que, no existe diferencia significativa entre las medidas 1, 2, 3,
4 y 5 del factor 1; así mismo el factor 1 con la interacción de los diferentes
tratamientos no presentan diferencias significativas, esto nos indica que no existe
un extracto del tratamiento mejor que las otras; concluyendo que en los resultados
del antibiograma en los diferentes extractos que se encontraron, la formación de
un halo no son diferentes entre sí (Cuadro 7).
38
No existe diferencia significativa entre las combinaciones de los factores, es
decir, no existe una combinación de los extractos que tenga un mejor efecto
antibacteriano frente a las cepas de estudio; por lo tanto ningún extracto es mejor
que los otros. Tampoco existe diferencia significativa entre los efectos intra
específicos de los extractos. Las medidas entre ellas son similares confirmando la
hipótesis planteada.
Cuadro 7. Análisis factorial de la varianza mixto (un factor inter y un factor intra)
Contrastes multivariadosa
Efecto Valor F Gl de la
hipótesis Gl del error
Sig.
factor1 Lambda de Wilks
0,996 0,022b 4 23 0,999
factor1 * VAR3
Lambda de Wilks
0,677 0,810 12 61 0,639
a. Diseño: Intersección + VAR3 Diseño intra-sujetos: factor1 b. Estadístico exacto
c. El estadístico es un límite superior para la F el cual ofrece un límite inferior para el nivel de significación. VAR3 = combinaciones de los tratamientos
39
VI. DISCUSIÓN
Las plantas investigadas son usadas de diversa manera en la medicina
popular, tal como se observa en el anexo 25, muchas de ellas se usan en problemas
infecciosos causados por bacterias y hongos. Los resultados de la prueba de
difusión en agar nos demuestra que Physalis angulata “bolsa mullaca” tuvo
actividad antibacteriana específica contra Pseudomonas sp. Esto avala el potencial
que tiene esta planta como antimicrobiano; así como una acertada selección
basada en gran parte en su quimiotaxonomía y uso etnomedicinal.
En el presente estudio, en Opuntia ficus indica no se reportó la presencia de
flavonoides, fue positivo a la prueba de fehling, el cual indicó la presencia de
azúcares reductores (glucosa o fructosa); no se reportó la presencia de quimonas
(naftaquinona y antraquinona). Semejante resultado presentó Ginestra et al.
(2009), quienes además reportaron la presencia de flavonoides (debido al lugar de
procedencia de la planta utilizada). También reportaron monosacáridos como
ramnosa, fucosa, arabinosa, xilosa, manosa, galactosa, glucosa. Repo de Carrasco et
al. (2008), en un estudio de la Universidad Nacional Agraria La Molina, Perú,
también reportaron la presencia de compuestos fenólicos en Opuntia ficus indica
“tuna”, betalaínas, minerales, carotenos, como también antocianinas los cuales dan
capacidad antioxidante.
El extracto etanólico de Opuntia ficus indica “tuna” no mostró actividad
antibacteriana contra Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli O157:H7,
40
Pseudomonas sp., Salmonella typhi y Entrococcus faecalis.; pero estudios realizados
por Shafiei et al. (2013), reportaron que el fruto de Opuntia “tuna” tiene efectos
antibacterianos contra Escherichia coli (PTCC 1270), Escherichia coli (PTCC 1330) y
Staphylococcus aureus (PTCC 1764), a concentraciones 10, 20 y 40 mg/ml
respectivamente. Lee et al. (2011), reportaron la inhibición del crecimiento de
Escherichia coli como también de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, y
Salmonella typhimurium. Alta actividad antibacteriana para 10 mg/disco, mostraron
efectos de inhibición de crecimiento contra Lactobacillus brevis, Lactobacillus
plantarum, y Leuconostoc mesenteroides. La medición de los recuentos de células
viables de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, y Salmonella
typhimurium indicaron efectos de supresión de la concentración de 3% del extracto
de etanol 95% de Opuntia “tuna”. Mientras que Kim et al. (2005), en un estudio en
la Universidad Nacional Pusan, Busan-Corea, reportaron que el extracto metanólico
de Opuntia ficus indica “tuna” presenta actividad antimicrobiana contra bacterias
patógenas, incluyendo bacterias antibióticos resistentes (MRSA, Pseudomonas
aeruginosa, VRE) y Propionibacterium acnes, levaduras y hongos. El extracto retuvo
la actividad después del tratamiento térmico durante 15 min a 100°C y 121°C, y
después de un almacenamiento prolongado, hasta 10 semanas período de
almacenamiento a 4°C y 25°C, también de forma estable retiene su actividad.
Mostró un mejor efecto de inhibición del crecimiento de Escherichia coli que lo hizo
el benzoato de sodio a la misma concentración. En el presente estudio no se
reportó actividad antimicrobiana contra cepas de Pseudomonas sp. y Escherichia
41
coli, esto se debe a diferencias en la compocicion fitoquimica de Opuntia por
diferencias geográficas del lugar de procedencia de las plantas.
En la presente investigación, Physalis angulata “bolsa mullaca” presentó
triterpenos y esteroides concordando con los resultados obtenidos por Pietro et al.
(2000), quienes reportaron la presencia de esteroides (physalin), y también se
encontró cumarinas/lactonas, saponinas, aminoacidos-aminas; principios amargos
y astringentes y azucares reductores. Similar resultado presentaron Donkor et al.
(2012), quienes reportaron en P. angulata “bolsa mullaca” la presencia de
carbohidratos, lípidos, minerales, vitaminas y fitoesteroles. También contiene
estructuras de tipo acrilato. Con los anólidos se definen clásicamente como un
grupo de esteroides del tipo ergostano C28 con una C-22, 26 δ-como grupo lactona.
También tiene fisalinas B, E, F, G, H e I, pero también reporta la presencia de
flavonoides glicósidos (myricetin 3-O-neohesperidosido).
En el presente estudio el extracto etanólico de Physalis angulata “bolsa mullaca”
mostró actividad antibacteriana contra Pseudomonas sp., a 300 mg/ml de potencia
del disco del extracto presentó halo antibacteriano de 7 mm; a 400 mg/ml, presentó
halo de 8mm; a 500 mg/ml, presentó halo de 9 mm. No mostró actividad
antibacteriana contra Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli O157-H7 y
Salmonella typhi. Estos resultados difieren con los resultados reportados por
Donkor et al. (2012), los cuales reportaron que la fruta de Physalis angulata
muestran actividad antibacteriana contra Pseudomonas aeruginosa y
42
Staphylococcus aureus a concentración utilizada (100 mg g-1, 125 mg g-1 y 150 mg
g-1) con zonas de inhibición entre 34,5 mm y 50,5 mm en comparación al
antibiótico estándar (cloramfenicol), que dio una media de inhibición zona diámetro
de 79,8 mm a 100 mg g-1 de concentración, tal investigación concuerda en parte
con nuestros resultados, dado que Physalis angulata “bolsa mullaca” mostró
actividad antibacteriana contra Pseudomonas sp. (300 mg/ml, 400 mg/ml y 500
mg/ml) con una media de halo de 8 mm. Pietro et al. (2000), en la Universidad de
Ribeirão Preto, São Paulo-Brasil, demostraron que los extractos de CHCl3 crudo a
partir de las partes aéreas (500 g/ml) de Physalis angulata “bolsa mullaca” causó la
inhibición del crecimiento total de Mycobacterium tuberculosis células Rv H37. Por
otra parte, 32 g/ml y 625 g/ml de las fracciones que contienen esteroides (Physalin)
eran necesarias para inhibir 100% de Micobacterium tuberculosis y Micobacterium
avium, respectivamente. Purificada Physalin B mostró valores de MIC contra
Micobacterium tuberculosis H37 Rv cepa de 32 g/ml. López et al. (2006), mostraron
que el extracto de etanol de la fruta de P. angulata “bolsa mullaca” tiene mejor
actividad bacteriana respecto a la raíz contra Staphylococcus aureus ATCC 6538,
mostrando respuesta significativa cuando se compara a la ampicilina, que se
preparó en agua a concentraciones que van desde 0,25 hasta 4.090 g/ml. El
extracto mostró una inhibición de 11,17 mm, igualando la gama de linealidad de la
curva del antibiótico, que varió desde 9,60 hasta 20,30 mm. Mientras que Hwang et
al. (2004), reportaron que el extracto etanólico de las flores de P. Angulata “bolsa
mullaca”, exhiben notable actividad antibacteriana contra Streptococcus mutans, en
43
el ensayo bactericida mostró que el extracto de metanol de P. angulata tuvo efecto
frente a S. mutans en 2 min a 50 mg/ml de concentración. Rengifo Salgado et al.
(2013), reporton que Physalis angulata “bolsa mullaca” posee propiedades
antimicrobianas contra Bacillus subtilis y Klebsiella pneumoniae. La fruta y raíz
presenta actividad contra Staphylococcus aureus ATCC 6538 mostrando respuesta
significativa cuando se compara a la ampicilina. El extracto etanólico de las flores
exhiben notable actividad antibacteriana contra Streptococcus mutans que causan
la caries dental. El extracto etanólico de la fruta muestran actividad antibacteriana
contra Staphylococcus aureus.
El análisis fitoquímico preliminar del extracto de Erythrina fusca “amasisa”,
reveló la presencia de compuestos fenólicos, taninos, saponinas, cumarinas y
lactonas, aminoácidos y aminas, no se reportó la presencia de flavonoides; mientras
que Innok et al. (2010), en estudios realizados en la Universidad Ramkhamhaeng,
Bangkok-Tailanda, reportaron flavonoides fuscacarpanos (A-C), faseolidina,
eritribissina A, eritrabissina I, demetilmedicarpina, erivarina D, eripoegina I,
hidroxicristacarpona, orientanol A, upinifolina, lonchocarpol, agenisteina,
liquiritigenina, isoliquiritigenina, vestitona, 8-oxo-(+) erisodina, erisopina e
eritrabissina; esto puede deberse a que en el presente estudio se realizó utilizando
la corteza y no el tallo de Erythrina “amasisa”; de igual forma Rukachaisirikul et al.
(2007), en la Universidad Ramkhamhaeng, Bangkok-Tailandia, reportaron la
presencia de flavonoides (isoflavonoides pterocarpanos). También Chaca et al.
(2005), en la Universidad de Botswana, Botswana, aislaron de la madera del tronco
44
de Erythrina “amasisa” 7,30-dihidroxi-40- dos isoflavonas y una flavanona metoxi-
50- (c, c-dimetilalilo) de isoflavonas (erylatissin A), 7,30-dihidroxi-600600-dimetil-
400500-dehydropyrano [200300: 40,50] isoflavona (erylatissin B), - 7,30-dihidroxi-
40-metoxi-50- (c, c-dimetilalil) flavanona (erylatissin C).
En el presente estudio el extracto etanólico de Erythrina fusca “amasisa” no
mostró actividad antibacteriana contra Pseudomonas sp., Escherichia coli ATCC
35218, Escherichia coli O157-H7, Salmonella typhi y Enterococcus faecalis ATCC
51299, concordando con resultados obtenidos por Innok et al. (2010), quienes
reportaron que Erythrina fusca “amasisa es inactivo” contra Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 (PA) y Escherichia coli ATCC 25922 (CE); pero reportaron
actividad antibacterial fuerte, moderada y débil según el compuesto contra
Staphylococcus aureus ATCC 25923 (SA), meticilina Staphylococcus aureus (MRSA),
con valores de MIC de 4 g/ml; 8 a 64 g/ml de 128 g/ml, y ≥200 mg. Rukachaisirikul
et al. (2007), reportaron efecto antibacterial de flavonoides de Erythrina “amasisa”
contra cepas de Streptococcus con un rango de MIC de 0,78 a 1,56 g/ml, y cepas de
Staphylococcus, incluyendo cepas resistentes a los medicamentos (MRSA y VRSA),
con un rango de CIM de 0,39 a 1,56 g/ml. Compuesto erycristagallin mostró el más
alto nivel de actividad contra todas las cepas ensayadas VRSA, con un rango de MIC
de 0,39 a 1,56 g/ml, lo cual fueron resistentes a ambos antibióticos. Demostrando
que estos agentes fitoquímicos tienen una potente actividad antibacteriana,
especialmente contra la cepas de SARM y VRSA. Chaca et al. (2005), reportaron que
45
estos compuestos muestran actividad antimicrobiano contra Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Candida micoderma. En el presente
estudio el extracto etanólico de Erythrina fusca “amasisa” no mostró actividad
antibacteriana contra Escherichia coli ATCC 35218 y Escherichia coli O157-H7.
El análisis fitoquímico preliminar de Cassia reticulata “retama” reveló la
presencia de saponinas, aminoácidos y aminas, flavonoides y azúcares reductores;
el extracto etanólico no mostró actividad antibacteriana contra Escherichia coli
ATCC 35218, Escherichia coli O157-H7, Pseudomonas sp. y Salmonella typhi. El cual
contradice los resultados obtenidos por Ruiz et al. (2009), sobre Cassia reticulata
“retama” que reportaron efecto inhibidor sobre Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Bacillus
subtilis. Los resultados concuerdan con los obtenidos por Somchit et al. (2003), en
la Universidad Putra Malasia, Malasia, quienes reportaron que Escherichia coli es
resistente al extracto; también reportaron actividad anti-bacteriana contra
Staphylococcus aureus y se detectó sólo con los extractos de hojas usando agua y
etanol. El extracto de agua exhibió una mayor actividad antibacteriana que el
extracto de etanol a partir de hojas (zonas de inhibición de 11/14 y 9/11 mm,
respectivamente). Khan et al. (2001), en la Universidad de Tecnología, Papua New
Guinea, reportaron para el extracto de metanol de Cassia alata “retama” amplio
espectro de actividad antibacteriana contra diferentes especies del genero Bacillus,
Staphylococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Proteus, entre otras.
46
VII. CONCLUSIONES
Se conoció los componentes fitoquímicos y la actividad antibacteriana del
extracto etanólico de cuatro plantas medicinales Opuntia ficus indica “tuna”
(penca), Erythrina fusca “amasisa” (corteza), Cassia reticulata “retama”
(fruto), y Physallis angulata “bolsa mullaca” (planta entera).
Se determinó la composición fitoquímica de las cuatro plantas medicinales,
Opuntia ficus indica (penca), Erythrina fusca (corteza), Cassia reticulata
(fruto), y Physallis angulata (planta entera); y la presencia de diferentes
metabolitos secundarios siendo cumarinas y lactonas, fenoles y taninos,
saponinas, aminoácidos y aminas los principales componentes fitoquímicos
encontrados.
Se determinó la sensibilidad de Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli
ATCC 35218, Salmonella typhi, Enterococcus faecalis ATCC 51299 y
Pseudomonas sp., frente al extracto etanólico de las cuatro plantas
medicinales: Opuntia ficus indica (penca), Erythrina fusca (corteza), Cassia
reticulata (fruto), y Physallis angulata (planta entera). De estos extractos el
que presentó efecto antibacteriano fue el extracto etanólico de Physalis
angulata "bolsa mullaca" frente a Pseudomonas sp., con un halo promedio
de 8mm, lo que muestra que la bacteria es resistente de acuerdo al manual
de antibiograma por el método de disco difusión-INS, para Pseudomonas sp.,
que establece: halos menores o iguales a 12mm es resistente al antibiótico.
47
VIII. RECOMENDACIONES
Realizar ensayos toxicológicos del extracto de las plantas
estudiadas.
Realizar aislamiento y purificación de los compuestos químicos
presentes en el extracto para determinar la capacidad
antibacteriana de cada uno de ellos.
Determinar las interacciones sinérgicas y antagónicas existente
entre los diferentes compones fitoquímicos presentes en los
extractos.
48
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34. Pietro, R. C. L. R., Kashima, S., Sato, D. N., Januario, A. H., and Franca, S. C. In vitro
antimycobacterial activities of Physalis angulata L. Phytomedicine. 2000. 7(4), 335-
338.
54
X. ANEXO
Anexo 1. Mapa de ubicación del laboratorio donde se realizaron los ensayos microbiológicos y fitoquímicos (Ciudad de Iquitos)
Fuente: Google Earth
55
Anexo 2. Esquema de tamizaje fitoquímico
56
Anexo 3. Identificación de alcaloides
Anexo 4. Identificación de triterpenos y esteroides (ensayo de Liberman – Burchard)
5 ml del ext- H2O +
1 ml HCL 1% 1 ml
1 ml
1 ml
+
+
+
5 gotas de Rx. Dragendorh
5 gotas de Rx. Mayer
5 gotas de Rx. Wagner
Color precipitado (rojo-anaranjado)
Color precipitado (blanco-crema)
Color precipitado (marrón-carmelita)
(+)
(+)
(+)
2 ml del ext- DCM
1 ml
1 ml Anh. Acético +
3 gts H2CO4 cc.
Triterpenos
(rojo-rosado)
(+)
Esteroides
(verde-azul-negro)
(+)
57
Anexo 5. Identificación de quinonas (ensayo de Borntrager)
Anexo 6. Identificación de cumarinas (ensayo de Baljet)
Anexo 7. Identificación de azúcares reductores (ensayo de Fehling)
Anexo 8. Identificación de saponinas (ensayo de la espuma)
2 ml del ext- H2O Fehling A + Fehling B
(1 ml) (1 ml) +
BM
15 minutos
Color pp. Color rojo o solución color rojo.
1 ml del ext- ET-OH +
5 ml H2O
Agitar 60 seg.
Espuma 2 mm a más
(+)
2 ml del ext- ET-OH +
Sol. Ác. Pícrico + NAOH 10% (1 ml) (1 ml)
Color precipitado
(rojo-oscuro-anaranjado)
(+)
Rx. Baljet
2 ml del ext- DCM
1 ml
RX. BORNTRAGER
1 ml NAOH 5%
+ Fase acuosa
(rosado-rojo)
(+)
58
Anexo 9. Identificación de fenoles y taninos (ensayo de cloruro férrico)
Anexo 10. Identificación de aminoácidos y aminas (ensayo de ninhidrina)
+ 2 ml del ext- H2O 1 ml Acetato-Na
1 ml
+ 5 gotas de Rx.
FeCl3 5%
Inclinar el tubo
(+) Color (verde-negro-
azul)
2 ml del ext- ET-OH
+
2 ml de Rx. ninhidrina en alcohol 0,2 % BM
5-10 Minutos
Color azul violáceo
(+)
59
Anexo 11. Identificación de glicósidos cardiotónicos (ensayo de Kedde)
Anexo 12. Identificación de flavonoides (ensayo de Shinoda)
2 ml del ext- ET-OH
BM Cc/seq
+ 2 ml de H2O
1 ml
+
1 ml HCLcc 35%
Mg
Consumo de todo el
Mg
1 ml OH-AMÍLICO Fase amílica
(anillo anaranjado-rojo)
(+)
2 ml del ext- ET-OH
+ Solución A + Solución B
(1 ml) (1 ml)
Rx. Kedde
Dejar reposar 5-10 minutos
Coloración violácea durante 1-2 horas
(+)
60
Extracto H2O
Filtrar
Degustar sabor
amargo
Anexo 13. Identificación de mucílago
Anexo 14. Identificación de principios amargos – astringentes
1 ml del ext- ET-OH Enfriar
a 0-5°C
Consistencia gomosa al
tacto
(+)
61
Anexo 15. Preparación de las concentraciones
Anexo 16. Preparación de los discos de sensibilidad
+
10 gr. Extracto seco
10 ml agua destilada
1000 mg/ml Solución Stock
100 mg/ml
300 mg/ml
200 mg/ml
400 mg/ml
500
mg/ml
600
mg/ml
62
Anexo 17. Prueba de sensibilidad
Anexo 18. Proceso de preparación de extractos
63
Anexo 19. Definición de términos básicos
Adaptación: Acción y el efecto de adaptar o adaptarse, un verbo que hace
referencia a la acomodación o ajuste de algo respecto a otra cosa.
Agar: Se trata de una sustancia de tipo gelatinosa que se obtiene a partir de
ciertas algas. El agar es un polisacárido compuesto por galactosa, un azúcar
simple. Cuando se disuelve en agua a alta temperatura y luego se lo enfría,
adquiere su consistencia de gelatina. Esta sustancia se emplea en diversos
contextos. El agar puede utilizarse para espesar preparaciones gastronómicas
y para aclarar la cerveza, por ejemplo. Además sirve como medio de cultivo
para el desarrollo de hongos y de bacterias.
Antibiótico: Sustancia química que producen ciertos hongos y que destruye
microorganismos, especialmente las bacterias.
Antimicrobiano: Medicamento o sustancia que mata o inhibe el crecimiento
de microorganismos.
Antioxidante: Sustancia que impide la formación de óxidos.
Antiradical: Contra aquellas sustancias químicas (radicales libre) muy
reactivas que introducen oxígeno en las células, produciendo la oxidación de
sus partes.
Difusión: Es un proceso físico irreversible, en el que partículas materiales se
introducen en un medio que inicialmente estaba ausente, aumentando la
entropía (desorden molecular) del sistema conjunto formado por las
partículas difundidas o soluto y el medio donde se difunden o disuelven.
64
Dilución: Es la reducción de la concentración de una sustancia química en
una disolución.
Eficacia: Capacidad para producir el efecto deseado o de ir bien para
determinada cosa.
Etanol: Es un tipo de compuesto químico, conocido popularmente como
alcohol etílico, el cual en una situación de presión y de temperatura normal,
se caracteriza por ser un líquido incoloro e inflamable en un punto de
ebullición de 78°C.
Extracto: Es una sustancia muy concentrada obtenida por extracción de una
parte de una materia prima, a menudo usando un solvente como etanol o
agua.
Fármaco: Sustancia que sirve para curar o prevenir una enfermedad, para
reducir sus efectos sobre el organismo o para aliviar un dolor físico.
Fitofarmacología: Es el estudio de los productos químicos de las plantas.
Fitoquímico: Está formado por el prefijo fitos que significa “planta”, y la
palabra químicos, es decir, textualmente, significaría “Los productos
químicos de las plantas”. Los fotoquímicos son sustancias que se encuentran
en los alimentos de origen vegetal, biológicamente activas, que no son
nutrientes esenciales para la vida (por lo menos a corto plazo), pero tienen
efectos positivos en la salud.
Fitosanitario: De la prevención y curación de las enfermedades de las plantas
o relacionado con ello.
65
Fitoterapia: Significa desde el punto de vista etimológico, terapia con
plantas, y se define como la ciencia que estudia el uso de productos de
origen vegetal con fines terapéuticos, para prevenir, atenuar o curar un
estado patológico. El concepto fitoterapia se acostumbra a aplicar a la
utilización terapéutica de productos con una actividad suave o moderada,
con márgenes terapéuticos amplios, con tratamientos menos agresivos y que
hacen de la Fitoterapia una terapia suave. Desde esta visión, la fitoterapia se
considera muy adecuada en el tratamiento de afecciones leves o moderadas,
y en afecciones crónicas.
Inhibición: Reducir, impedir o anular el crecimiento bacteriano.
Halo: Circulo generalmente claro que se forma alrededor de los discos de
sensibilidad al aplicarlo sobre el crecimiento bacteriano mediante ensayos
sobre efectos antibacterianos o antifúngicos en placas Petri conteniendo
algún medio de crecimiento o agar.
Hidroalcohólico/Hidroetanólico: Descripción de una solución en la que el
disolvente es una mezcla de agua y alcohol.
Inducir: Provocar una reacción.
Infección: Invasión y multiplicación de agentes patógenos en los tejidos de
un organismo.
In vitro: Dentro del vidrio.
Metabolito: Es cualquier sustancia producida durante el metabolismo
(digestión u otros procesos químicos corporales). El término metabolito
66
también se puede referir al producto que queda después de la
descomposición (metabolismo) de un fármaco por parte del cuerpo.
Metanol: Es un compuesto químico del grupo de los alcoholes, también
conocido bajo el nombre de alcohol metílico, siendo además, el alcohol más
sencillo del grupo. Su fórmula es CH3OH.
Potenciar: Aumentar el poder o la eficacia.
Producto Fitoterapéutico: Es el producto medicinal empacado y etiquetado,
cuyas sustancias activas provienen de material de la planta medicinal o
asociaciones de estas, presentado en estado bruto o en forma farmacéutica
que se utiliza con fines terapéuticos. También puede provenir de extractos,
tinturas o aceites. No podrá contener en su formulación principios activos
aislados y químicamente definidos. Los productos obtenidos de material de
la planta medicinal que haya sido procesado y obtenido en forma pura no
serán clasificados como producto fitoterapéutico.
Reemergente: Que vuelve a emerger.
Sensibilidad: Capacidad que tienen las bacterias de soportar los efectos de
los antibióticos o biocidas destinados a eliminarlas o controlarlas.
Susceptibilidad: Susceptible es un término que viene del latín “susceptibĭlis”.
Susceptible indica la probabilidad que algo suceda, está vinculado a aquello
capaz de ser modificado o de recibir impresión por algo o alguien.
Tradicional: De la tradición o que está relacionado con ella por el modo de
transmitirse o por su permanencia de generación en generación.
67
a) b) c) d) e) f) g)
h) i) j) k) l) m)
Anexo 20. Screening fitoquímico de Opuntia ficus indica “tuna” loretana.
a) Rx. Dragendorff negativo; b) Rx. Mayer negativo; C) Rx. Wagner negativo; d)
Liberman – Burchard negativo; e) Borntrager negativo; f) Baljet positivo (+);
g) Fehling positivo (+); h) saponinas positivo (++); i) fenoles y taninos positivo
(+); j) aminoácidos y aminas positivo (+++); k) glicósidos cardiotónicos
negativo; l) flavonoides negativo; m) mucilago positivo (+).
68
a) b) c) d) e) f)
g) h) i) j) k) l)
Anexo 21. Screening fitoquímico Cassia reticulata “retama”
a) Rx. Dragendorff negativo; b) Rx. Mayer negativo; C) Rx. Wagner negativo; d)
Liberman – Burchard negativo; e) Borntrager negativo; f) Baljet positivo (+);
g) Fehling positivo (++); h) saponinas positivo (++); i) fenoles y taninos
positivo (++); j) aminoácidos y aminas positivo (+); k) glicósidos cardiotónicos
negativo; l) flavonoides negativo.
69
a) b) c) d) e) f)
g) h) i) j) k) l)
Anexo 22. Screening fitoquímico Physalis angulata “bolsa mullaca”
a) Rx. Dragendorff negativo; b) Rx. Mayer negativo; C) Rx. Wagner negativo; d)
Liberman – Burchard positivo (++); e) Borntrager negativo; f) Baljet positivo
(+++); g) Fehling positivo (+); h) saponinas positivo (+); i) fenoles y taninos
negativo; j) aminoácidos y aminas positivo (+); k) glicósidos cardiotónicos
negativo; l) flavonoides negativo.
70
a) b) c) d) e) f)
h) i) j) k) l)
Anexo 23. Screening fitoquímico Erythrina fusca “amasisa”
a) Rx. Dragendorff negativo; b) Rx. Mayer negativo; C) Rx. Wagner negativo;
d) Liberman – Burchard negativo; e) Borntrager negativo; f) Baljet
positivo (+); g) Fehling negativo; h) saponinas positivo (+); i) fenoles y
taninos positivo (++); j) aminoácidos y aminas positivo (++); k) glicósidos
cardiotónicos negativo; l) flavonoides negativo.
71
Anexo 24. Antibiograma.
Figura 1. Antibiograma de Escherichia coli
ATCC 35218 frente a extracto etanólico
de Opuntia ficus indica “tuna”.
Figura 2. Antibiograma de Escherichia coli
O157:H7 frente a extracto etanólico de
Opuntia ficus indica “tuna”.
Figura 3. Antibiograma de Enterococcus faecalis
ATCC 51299 frente a extracto etanólico de
Opuntia ficus indica “tuna”.
Figura 4. Antibiograma de Pseudomonas sp.,
frente a extracto etanólico de Opuntia ficus
indica “tuna”.
Figura 5. Antibiograma de Salmonella typhi frente a
extracto etanólico de Opuntia ficus indica “tuna”.
72
Figura 6. Antibiograma de Escherichia coli ATCC
35218 frente a extracto etanólico Physalis
angulata “bolsa mullaca”.
Figura 7. Antibiograma de Escherichia coli
O157:H7 frente a extracto etanólico Physalis
angulata “bolsa mullaca”.
Figura 8. Antibiograma de Enterococcus faecalis ATCC
51299 frente a extracto etanólico Physalis angulata
“bolsa mullaca”.
Figura 9. Antibiograma de Pseudomonas sp.,
frente a extracto etanólico Physalis
angulata “bolsa mullaca”.
Figura 10. Antibiograma de Salmonella typhi frente a
extracto etanólico Physalis angulata “bolsa mullaca”.
73
Figura 11. Antibiograma de Escherichia coli ATCC
35218 frente a extracto etanólico Erythrina fusca
“amasisa”.
Figura 12. Antibiograma de Escherichia
coli O157:H7 frente a extracto etanólico
Erythrina fusca “amasisa”.
Figura 13. Antibiograma de Enterococcus
faecalis ATCC 51299 frente a extracto etanólico
Erythrina fusca “amasisa”.
Figura 14. Antibiograma de Pseudomonas
sp., frente a extracto etanólico Erythrina
fusca “amasisa”.
Figura 15. Antibiograma de Salmonella typhi frente
a extracto etanólico Erythrina fusca “amasisa”.
74
Figura 16. Antibiograma de Escherichia coli ATCC
35218 frente a extracto etanólico Cassia reticulata
“retama”.
Figura 17. Antibiograma de Escherichia
coli O157:H7 frente a extracto etanólico
Cassia reticulata “retama”.
Figura 18. Antibiograma de Enterococcus faecalis
ATCC 51299 frente a extracto etanólico Cassia
reticulata “retama”.
Figura 19. Antibiograma de
Pseudomonas sp. frente a extracto
etanólico Cassia reticulata “retama”.
Figura 20. Antibiograma de Salmonella typhi frente a
extracto etanólico Cassia reticulata “retama”.
75
Anexo 25. Datos etnobotánicos de las plantas investigadas
Nombre Científico
Familia Nombre común
Parte usada
Sitio de recolección*
Usos populares
Cassia reticulata
fabaceae retama fruto IMET Tratamiento de
infecciones urinarias y diurético
Opuntia ficus indica
cactácea. tuna cladiodo o penca
IMET Tratamiento de la tos seca
y abscesos
Physalis angulata
solanaceae bolsa
mullaca planta entera
IMET
Tratamiento de diabetes, hepatitis, asma,
paludismo, sarna; antinflamatorio y
desinfectante, se usa además como diurético.
Erythrina fusca
fabaceae amasisa corteza IMET Tratamiento de úlceras, hemorroides, micosis y
antiséptico.
*Sitio de recolección: IMET, Instituto de Medicina Tradicional, Región de Loreto, ciudad de Iquitos.
Anexo 26. Antimicrobiana por el método de disco difusión-INS.
ANTIBIOGRAMA DE Enterococcus spp.
MEDIO DE CULTIVO: Agar Müller Hinton
INOCULO: Método del crecimiento o suspensión directa de la colonia
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA
Grupo I:
Ampicilina
Gentamicina (disco con contenido de
120 mg)
Estreptomicina (disco con contenido
de 300 mg)
Vancomicina
Grupo II:
Teicoplanina
Rifampicina
Cloramfenicol
Tetraciclina
76
Eritromicina
Nitrofurantoína (1)
Norfloxacina (1)
Ciprofloxacina (1)
Levofloxacina (1)
(1) Disco utilizado exclusivamente en cepas provenientes de infecciones de las vías
urinarias
Resistencias Naturales: Los enterococos son resistentes a Oxacilina, Cefalosporinas,
Clindamicina, y Cotrimoxazol.
Los enterococos presentan una resistencia de bajo nivel a los Aminoglucósidos, lo
cual no suprime la sinergia con los betalactámicos, por tanto deben utilizarse discos
con mayores concentraciones de antibiótico que las habituales buscando detectar
una resistencia de alto nivel que si elimina el efecto sinérgico.
Enterococcus gallinarum y Enterococcus casseliflavus son resistentes a los
glicopéptidos.
Incubación: 35°C
Lectura: A las 16 – 18 h. A las 24 h para el disco de Vancomicina
77
INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS CRÍTICOS
Antibióticos y diámetros críticos
Reglas para la lectura e interpretación del antibiograma
Disco de Ampicilina:
a. Si la cepa es sensible a Ampicilina lo es también a Penicilina, la Amoxicilina,
asociaciones de penicilinas e inhibidores de betalactamasas, e Imipenem.
b. En caso de resistencia a Ampicilina, se recomienda la realización del test de la
nitrocefina para la detección de una penicilinasa. Esta resistencia enzimática a
Ampicilina (test de la nitrocefina positivo) es cruzada con Penicilina y Amoxicilina.
78
Discos de Vancomicina y Teicoplanina: Si la cepa es intermedia a Vancomicina y/o
Teicoplanina, se recomienda la medición de la CIM de estos antibióticos para
descartar una posible resistencia.
Discos de Gentamicina y Estreptomicina: Si la cepa es intermedia a Gentamicina y/o
Estreptomicina, se recomienda la medición de la CIM de estos antibióticos para
descartar una posible resistencia de alto nivel.
Disco de Tetraciclina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de
Tetraciclina es válido también para Doxiciclina y Minociclina.
Disco de Eritromicina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de
Eritromicina es válido también para Azitromicina, Claritromicina y Roxitromicina.
CEPA DE REFERENCIA PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO
Staphylococcus aureus ATCC 25923
ANTIBIOGRAMA PARA Pseudomonas aeruginosa
MEDIO DE CULTIVO: Agar Müller Hinton.
INOCULO: Método del crecimiento o suspensión directa de la colonia. Ajustar a la
turbidez equivalente al estándar 0,5 de la escala de Mc. Farland.
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA
Grupo I:
Ceftazidima
Imipenem y/o Meropenem
Gentamicina
Amikacina
Ciprofloxacina
Grupo II:
Aztreonam
79
Cefoperazona/sulbactam
Cefepime
Norfloxacina (1)
Ofloxacina (1)
(1) Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vías urinarias
Resistencias Naturales: Pseudomonas aeruginosa es resistente a Penicilina,
Ampicilina, Amoxicilina, Cefalosporinas de primera y segunda generación,
Cefotaxima, Ceftriaxona, Kanamicina, Tetraciclina, Cloramfenicol, Ácido Nalidíxico y
Ácido Pipemídico.
INCUBACIÓN: 35°C
LECTURA: A las 16 – 18 h.
INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS CRÍTICOS
Antibióticos y diámetros críticos
Reglas para la lectura e interpretación del antibiograma
80
Disco de Ceftazidima: Si la cepa tiene susceptibilidad intermedia (I) o resistente (R) a
Ceftazidima debe informarse también como intermedia (I) o resistente (R) al
Aztreonam aun cuando el resultado del disco indique sensibilidad (resistencia
cruzada).
Disco de Aztreonam: Una resistencia aislada del Aztreonam en relación con una
sensibilidad conservada para los otros betalactámicos (cefalosporinas y
carbapenems) es posible y debe informarse como tal.
Discos de carbapenems:
a. Si una resistencia disociada entre Meropenem e Imipenem (sensible a uno y
resistente al otro) es detectada deberá verificarse la técnica y repetirse la prueba. Si
la resistencia disociada se confirma, la cepa deberá ser enviada al INS.
b. Una resistencia aislada a Imipenem y/o Meropenem en relación con una
sensibilidad conservada para otros betalactámicos (cefalosporinas, monobactams y
combinaciones cefalosporina / inhibidor de betalactamasas) es posible y debe
informarse como tal.
Cepa de Referencia para el control de calidad interno:
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
ANTIBIOGRAMA PARA Enterobacteriaceae
MEDIO DE CULTIVO: Agar Müller Hinton
INOCULO: Método de crecimiento o suspensión directa de la colonia. Ajustar a la
turbidez equivalente al estándar 0,5 de la escala de Mc. Farland.
81
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA
Grupo I:
Ampicilina
Cefalotina
Ampicilina / Sulbactam o Amoxicilina /
Ácido Clavulánico.
Cefuroxima
Cefotaxima o Ceftriaxona
Gentamicina
Amikacina
Ácido Nalidíxico (1)
Norfloxacina (1)
Ciprofloxacina
Cotrimoxazol
(Trimetoprim/Sulfametoxazol)
Nitrofurantoína (1)
Grupo II:
Cefoxitina
Aztreonam
Ceftazidima
Cefixima
Cefoperazona/Sulbactam
Cefepime o Cefpirome
Imipenem o Meropenem
Cloramfenicol
Ofloxacina (1)
(1) Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vías urinarias.
Antibióticos a utilizar en el antibiograma de Salmonella spp. y Shigella spp.
aisladas de coprocultivos:
Ampicilina
Cloramfenicol
Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol)
Ciprofloxacina
Cefotaxima
82
Resistencias Naturales: Las enterobacterias son resistentes a Penicilina, Oxacilina,
Macrólidos, Clindamicina y Glicopéptidos.
Klebsiella spp es resistente a las Aminopenicilinas.
Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae y Enterobacter aerogenes son resistentes
a las Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas,
Cefalosporinas de primera generación y Cefuroxima.
Serratia marcescens es resistente a las Aminopenicilinas,
Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas, Cefalosporinas de primera
generación y Cefoxitina.
Proteus mirabilis es resistente a Nitrofurantoína.
Proteus vulgaris es resistente a las Aminopenicilinas, Cefalosporinas de primera
generación, Cefuroxima y Nitrofurantoína.
Morganella morganii es resistente a las Aminopenicilinas,
Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas, Cefalosporinas de primera
generación, Cefuroxima y Nitrofurantoína.
Providentia stuartii es resistente a las Aminopenicilinas,
Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas, Cefalosporinas de primera
generación, Gentamicina (bajo nivel) y Nitrofurantoína.
INCUBACIÓN: 35°C
LECTURA: 15-18 h
INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS CRÍTICOS
Antibióticos y diámetros críticos
83