Tesis Anael Correcta 2013-Abril

Instituto Tecnológico de Los Mochis

OPCION DE TITULACION I

TESIS PROFESIONAL

Identificación y patogenicidad del agente causal de la mancha angular de calabaza tipo Kabocha (Cucurbita moschata Dutch ex Lam)

Que presenta:

Ruiz Guzmán Anael Guadalupe

Para obtener el título de:

LICENCIADO EN BIOLOGIA

Los Mochis, Sinaloa, Enero 2013

Instituto Tecnológico de Los Mochis

TEMA:

Identificación y patogenicidad del agente causal de la mancha angular de calabaza tipo Kabocha

(Cucurbita moschata Dutch ex Lam) Los Mochis, Sinaloa 2012

REALIZADO EN:

Junta Local de Sanidad Vegetal del Valle de Fuerte

Director de tesis

Dr. Rubén Félix Gastélum

Asesor interno

M.C. María Ochoa Hernández

DEDICATORIAS

AGRADECIMIENTOS

ÍNDICE

Pág.ÍNDICE DE TABLAS..................................................................................... VII

ÍNDICE DE FIGURAS....................................................................................... VIII

RESUMEN..............................................................................................................

IX

I. INTRODUCCION............................................................................................. 2

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………………………….. 3

III. JUSTIFICACION………………………………………………………….. 4

IV. OBJETIVOS............................................................................................... 5

4.1. Objetivo general.................................................................................... 5

4.2. Objetivos específicos........................................................................... 5

V. ANTECEDENTES.......................................................................................... 6

5.1. Generalidades de las Cucurbitáceas...................................................... 6

5.2. Origen……......................................................................................... 7

5.3. Importancia de las Cucurbitáceas.......................................................... 7

5.4. Métodos utilizados para controlar las enfermedades y daños por patógenos………………………………………………………………………

8

5.5. Uso de herramientas moleculares para el estudio de las comunidades fúngicas y bacterianas………………………………………………………….

9

5.5.1. Reacción de Cadena Polimerasa (PCR)…………….............. 10

5.5.2. DNA Polimerasa...................................................................... 10

5.5.3. Concentraciones de Cloruro de magnesio………………….... 11

5.5.4. Desoxirribonucleósidos trifosfatados (dNTPs)......................... 11

5.5.5. “Primers”………………………………………………........... 12

5.6. Pasos básicos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR)….... 13

5.6.1. Desnaturalización. ................................................................... 13

V

Pag.

5.6.2. Hibridación................................................................................ 13

5.6.3. Extensión.................................................................................. 13

5.7. Electroforesis…………………………………………………………... 14

5.8. Enfermedades de las Cucurbitáceas…………………………………. 14

5.8.1. Síntomas………………........................................................... 15

5.8.2. Comentarios sobre la enfermedad………………………….. 16

VI. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………… 17

6.1. Aislamiento de la batería a partir del gen infectado…………………... 17

6.2. Postulados de Koch…………………………………………………... 18

6.3. Pruebas fisiológicas y bioquímicas…………………………………….. 19

6.3.1. Producción de Levana………………………………………….. 19

6.3.2. Oxidasa………………………………………………………… 19

6.3.3. Pudrición en papa……………………………………………… 19

6.3.4. Dihidrolasa de arginina……………………………………….. 20

6.3.5. Reacción de hipersensibilidad………………………………… 20

6.3.6. Tinción Gram…………………………………………………. 20

6.3.7. Difusión de pigmentos……………………………………….. 21

6.3.8. Prueba de KOH al 3%............................................................... 21

6.3.9. Prueba de catalasa…………………………………………….. 21

6.3.10. Utilización de fuentes de carbono…………………………… 21

6.4. Identificación molecular de los aislados por medio de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)………………………………………………...

23

6.4.1. Cuantificación del DNA´S………………………………….. 24

6.4.2. Electroforesis de los productos amplificados………………. 25

VI

Pag.

VII. RESULTADOS……………………………………………………………. 26

7.1. Patogenicidad………………………………………………………….. 26

7.2. Pruebas bioquímicas y fisiológicas…………………………………… 28

7.3. Pruebas moleculares para la identificación de la bacteria asociada a la enfermedad………………………………………………………………………. 31

VIII. DISCUSIÓN……………………………………………………………… 34

IX. CONCLUSIONES………………………………………………………….. 36

X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………….. 37

XI. ANEXOS……………………………………………………………………. 41

VII

ÍNDICE DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Porcentaje del área foliar dañada por seis aislados de

Pseudomonas syringae pv. Lachrymans en Calabaza Kabocha, Pepino,

Calabaza zucchini………………………………………………………………26

Tabla 2a. Morfología colonial de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans

agente causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el

Municipio de Ahome, Sinaloa, México………………………………………..27

Tabla 2b. Aplicación de las prueba LOPAT para la identificación de la

bacteria Pseudomonas syringae pv. Lacrymans, agente causal de la

mancha angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome,

Sinaloa, México…………………………………………………………………28

Tabla 2c. Aplicación de las pruebas bioquímicas y fisiológicas para la

identificación de la bacteria Pseudomonas syringae pv. Lacrymans

agente causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el

Municipio de Ahome, Sinaloa, México………………………………………..29

Tabla 3. Pureza de los DNA´S a una absorbencia de A260/A280………..30

VIII

ÍNDICE DE FIGURAS

Pág.Figura 1.- Planta y flores de Cucurbitáceas tipificadas por un melón

honeydew (Cucumis melo). Las flores perfectas (P), que tienen partes

masculinas y femeninas y las flores estaminadas (S), que tienen

solamente partes masculinas, son portadas individualmente en

pedúnculos delgados. El ovario se desarrolla en un fruto maduro que

lleva semillas después de una polinización y una fertilización

satisfactoria……………………………………………………………………... 3

Figura 2.- Bases nitrogenadas. Estos componentes de los nucleótidos

son la clave de la especificidad del apareo de las cadenas del ADN,

apareándose siempre una purina con una pirimidina………………………9

Figura 3.- Amplificación exponencial del DNA molde, a través de la

técnica de PCR…………………………………………………………………. 11

Figura 4.- Pasos básicos de un ciclo de PCR……………………………… 11

Figura 5.- Mancha angular en calabaza Kabocha…………………………. 14

Figura 6.- Ubicación de los oligonucleótidos F2C y C en la región 16S

del DNA ribosomal de procariotes. ISR= Región de secuencia

intergénica por sus siglas en inglés: intergenic sequence región………… 22

Figura 7.- Procedimiento para cargar cada muestra en el

espectrofotómetro NanoDrop ™………………………………………………

23

Figura 8.- Lesiones bacterianas causadas después de 14 días de la

inoculación, a) calabaza zucchini, b) pepino, c) calabaza Kabocha, d)

planta enferma de calabaza Kabocha. Similares a los observado en

campos comerciales de calabaza kabocha………………………………… 26

IX

Pag.

Figura 9.- a) prueba de levana positiva, b) prueba de oxidasa negativa,

c) pudrición en papa negativa, d) dihidrolasa de arginina tubo izquierdo

positivo tuvo derecho negativo, e) reacción de hipersensibilidad en

tabaco…………………………………………………………………………...30

Figura 10.- Corrida en electroforesis para determinar estabilidad de los

DNA´S carriles del 3 al 12……………………………………………………..32

Figura 11.- Amplificación del ADN ribosomal a partir del ADN genómico

de los aislados de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans a 1.4 pb.

Carriles del 3-12 muestras, carril 13 control negativo, carril 14 marcador

de peso molecular 1kb, carril 15 control positivo Pseudomona

aeruginosa……………………………………………………………………….33

X

RESUMEN.

La calabaza Kabocha (Cucurbita moschata Dutch ex Lam) es atacada por

enfermedades foliares de origen fungoso y bacteriano. En ciclos agrícolas

recientes se ha observado una enfermedad de aparente origen bacteriano;

las plantas presentan una severa mancha angular limitada por las

nervaduras la cual puede destruir follaje exponiendo los frutos al sol

disminuyendo su calidad en el mercado de exportación.

Las siembras de calabaza Kabocha en el norte de Sinaloa coinciden con

siembras de otras Cucurbitáceas y existe el temor de que esta enfermedad

pueda atacar a otros cultivos miembros de la familia de Cucurbitáceas. Por

lo anterior se desarrollaron los siguientes objetivos a) Identificar la bacteria

mediante pruebas fisiológicas y bioquímicas. b) Identificar mediante la

secuenciación de ADN ribosomal. c) Determinar la patogenicidad de los

aislados. En el presente estudio se identificó la bacteria Pseudomonas

syringae pv. Lacrymans como el agente causal de mancha angular en

calabaza tipo Kabocha según pruebas fisiológicas, bioquímicas y

moleculares, donde se observaron sus características fenotípicas y

genotípicas de esta bacteria, las cuales se determino los rangos de

hospedante, en otras Cucurbitáceas tales como pepino, calabaza zucchini

y calabaza Kabocha.

Palabras claves: Identificación, Cucurbitáceas, Síntomas, Tizón foliar.

XI

I. INTRODUCCIÓN

En el estado de Sinaloa, México, se siembra un promedio de 7,055 has de

Cucurbitáceas anualmente (CAADES, 2004), que incluyen dos especies de calabaza

(Cucúrbita pepo L. y Cucúrbita moschata Duch.), pepino (Cucumis sativus L.),

melón (Cucumis melo L.) y sandía (Citrullus lanatus Thumb). Estos cultivos son

atacados por enfermedades foliares de origen fungoso y bacterial (Cebreros et al.,

1991; León, 1988; Ramírez, 1991); dentro de las primeras resaltan por su

importancia el mildiú (Pseudoperonospora cubensis Berk. y Curt.) Rost., la mancha

angular por Alternaria cucumerina (Ellis y Everhart) Elliot, la mancha foliar inducida

por Corynespora cassiicola (Berk. Y Curt.) Wei y la cenicilla atribuida a Erysiphe

cichoraceaum DC (Cebreros et al., 1991) actualmente conocida como

Golovinomyces cichoracearum (DC.) V.P. Gelyuta; sin embargo, en años recientes

se demostró que esta enfermedad es causada por Podosphaera xanthii (Félix-

Gastelum et al., 2005) este grupo de enfermedades se han visto ampliadas por la

presencia de una enfermedad cuyos síntomas eran desconocidos por productores y

técnicos de campo en el norte de Sinaloa. Del mismo modo, se desconoce el agente

etiológico de la enfermedad; así como su ecología, epidemiologia y medidas

adecuadas para su control en campo. Por lo anterior y por solicitud de los

productores de Cucurbitáceas en el norte de Sinaloa (en particular los productores

de calabaza Kabocha) se realizó el presente estudio con el propósito de identificar al

agente causal, lo cual servirá de base para estudios futuros relativos a la ecología,

epidemiologia y manejo de la enfermedad.

1

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En ciclos agrícolas recientes, los productores de calabaza Kabocha (Cucurbita

moschata) del Valle del Fuerte han observado un severa mancha angular en dicho

cultivo. El agente etiológico de esta enfermedad se desconoce y por lo tanto se

desconocen también las estrategias adecuadas para su control. En este sentido los

productores y técnicos de campo han expresado su interés para que se lleven a

cabo estudios relativos a la identificación y el rango de hospedantes del patógeno.

Los síntomas en plantas de calabaza Kabocha se manifiestan mediante un severa

mancha angular en las hojas, lo cual reduce el área foliar y expone los frutos al sol

reduciéndose así su calidad en el mercado de exportación. Los agricultores y

técnicos de campo mencionan que también se han ocurrido síntomas consistentes

en lecciones acuosas en los frutos, y lo relacionan con el mismo organismo que

causa el tizón foliar.

En vista de que en el Valle del Fuerte se produce un amplio grupo de cucurbitáceas

como sandias, melón, pepino, y varios tipos de calabazas, los productores no

descartan la posibilidad que el patógeno pueda atacar a estos cultivos además de la

calabaza Kabocha.

Estudios preliminares indican a las plantas sintomáticas se encuentra asociada una

bacteria en forma de bacilo Gram negativa. El presente estudio aportará

conocimiento para el control de la enfermedad en campo, esto se sustentará en la

cabal identificación del agente causal de la enfermedad y el rango de hospedantes

del patógeno, lo cual contribuirá en la implementación de estrategias de manejo en

calabaza Kabocha y otras Cucurbitáceas.

2

III. JUSTIFICACIÓN

La calabaza Kabocha es atacada por enfermedades foliares de origen fungoso y

bacteriano (Cebreros et al., 1991; León, 1988; Ramírez, 1991); dentro de las

primeras resaltan por su importancia el mildiú (Pseudoperonospora cubensis) el

tizón foliar por Alternaria cucumerina (Ellis y Everhart) Elliot, la mancha foliar

inducida por Corynespora cassiicola (Berk. Y Curt.) Wei y la cenicilla atribuida a

Erysiphe cichoraceaum DC (Cebreros et al., 1991) actualmente conocida como

Golovinomyces cichoracearum (DC.) V.P. Gelyuta. La Golovinomyces

cichoracearum (DC.) V.P. Gelyuta.

En ciclos agrícolas recientes se ha observado una enfermedad de aparente origen

bacteriano. Las plantas presentan un severa mancha angular limitada por las

nervaduras el cual puede destruir follaje exponiendo los frutos al sol disminuyendo

su calidad en el mercado de exportación. Esta enfermedad ha sido motivo de

preocupación por parte de los productores que desconocen con precisión el agente

etiológico y sus formas adecuadas de control; además, esta enfermedad viene a

ampliar el grupo de patógenos que atacan a esta cucurbitácea en la región. Las

siembras de calabaza Kabocha en el norte de Sinaloa coinciden con siembras de

otras cucurbitáceas y existe el temor de que esta enfermedad pueda atacar a otros

cultivos miembros de las familias Cucurbitáceas. Por lo anterior se desarrollo un

estudio que defina la causa de la enfermedad así como el rango de hospedante del

patógeno con el propósito de implementar medidas de control adecuadas en el

futuro.

3

IV. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general.

Identificar la bacteria asociada a síntomas de mancha angular en calabaza

Kabocha y determinar su patogenicidad en el cultivo y en otras

Cucurbitáceas.

4.2. Objetivos específicos

a) Determinar la patogenicidad en calabaza Kabocha de 6 aislados de la

bacteria en condiciones de invernadero.

b) Determinar la patogenicidad en Cucurbitáceas (Calabaza zucchini y Pepino)

de 6 aislados de la bacteria en invernadero.

c) Identificar la bacteria asociada a la mancha angular de calabaza Kabocha

mediante pruebas fisiológicas y bioquímicas.

d) Identificar molecularmente los microorganismos asociados a la enfermedad

mediante la secuenciación de ADN ribosomal.

4

V. ANTECEDENTES

5.1. Generalidades de las Cucurbitáceas.

Las Cucurbitáceas (Cucurbitácea) son una familia de plantas oriundas en su mayor

parte del Nuevo Mundo, normalmente herbáceas, de las cuales muchas poseen gran

importancia etnobotánica; incluye calabazas (Cucurbita spp), el melón (Cucumis

melo), el pepino (Cucumis sativus), la sandía (Citrullus lanatus) y la calabaza bule

(Lagenaria siceraria)(Watson y Dallwitz, 1992).

Son característicamente hierbas rastreras o trepadoras mediante zarcillos en los

tallos (caulinares); muestran hojas alternas, en general simples, más o menos

lobadas, carnosas. Las flores son unisexuales, las masculinas con traza de gineceo,

generalmente monoicas (Figura 1) (Bryonia craetica excepcionalmente es dióica),

regulares, gamopétalas, pentámeras, con periantio doble y estambres atípicos:

filamento sigmoide rematado por una antera con una única teca, estambres libres o

soldados en tres grupos: (2)+ (2)+1. En las formas primitivas se muestran los pétalos

libres, y el ovario ínfero; algunas presentan inflorescencias. Los frutos son muy

variables; casi siempre son bayas (italicas) o bayas modificadas (pepónides), pero a

veces se presentan como cápsulas (italicas), a veces en elaterio (Watson y Dallwitz,

1992).

5

Figura 1.- Planta y flores de Cucurbitáceas tipificadas por un melón honeydew

(Cucumis melo). Las flores perfectas (P), que tienen partes masculinas y femeninas

y las flores estaminadas (S), que tienen solamente partes masculinas, son portadas

individualmente en pedúnculos delgados. El ovario se desarrolla en un fruto maduro

que lleva semillas después de una polinización y una fertilización satisfactoria.

5.2. Origen.

Existe suficiente evidencia arqueológica para considerar que las Cucurbitáceas

comenzaron a cultivarse por primera vez, de manera sistemática, en los estados de

Puebla, Oaxaca y el Estado de México. Su cultivo también se practicó en épocas

prehispánicas en prácticamente toda Mesoamérica, en la trilogía milpera, junto con

el maíz y el frijol. También se conoció y se cultivo en otras culturas americanas,

como en el caso del Perú, donde se ha encontrado cerámica Mochica con

representación del zapallo. Más tarde, a partir del siglo XVI, se llevó a Europa, Asia y

África (Zitter et al.,1996).

5.3. Importancia de las Cucurbitáceas.

Las Cucurbitáceas (familia Cucurbitácea) forman un grupo diverso de especies

cultivadas en todo el mundo en condiciones muy diferentes y para fines muy

distintos. Las principales tipos cultivados son el pepino, el melón (cantalupo o melón

bordado, honeydew Etc.), sandía, calabaza (Cucurbita spp). Los tipos menores

cultivados incluyen chayote, cidra, pepinillo, pepino cornudo y pepino silvestre (Zitter

et al.,1996).

Todas las Cucurbitáceas son sensibles a las heladas, pero difieren en su capacidad

para resistir el frío y el calor; Se cultivan en tierras bajas y en montañas, en campo

abierto y en invernaderos, así como en regiones tropicales, desérticas y templadas.

La mayoría son plantas trepadoras, pero algunos cultivares modernos de Cucurbita

spp. y de pepino producen plantas compactas y tipo mata (Zitter et al., 1996).

El fruto inmaduro o maduro se consume en fresco o cocinado. Como grupo, los

frutos son relativamente bajos en valor nutritivo; los componentes más notables son

las vitaminas y los minerales. Las semillas de muchas Cucurbitáceas son

importantes fuentes de aceite y proteínas en algunas partes de África, Asia y

6

América Latina. La calabaza búfalo produce una gran raíz con féculas y semillas con

alto contenido en proteínas y aceite. Los brotes, hojas y flores de algunas

Cucurbitáceas se comen y son fuentes ricas en vitaminas y minerales. A pesar de

las grandes diferencias entre las especies de Cucurbitáceas y dentro de ellas,

morfológicamente son muy similares en apariencia (Zitter et al., 1996).

5.4. Métodos utilizados para controlar las enfermedades y daños por

patógenos.

En la actualidad, se sabe que las plantas poseen un amplio rango de sofisticados

mecanismos de defensa. En general, las plantas contrarrestan el ataque de los

patógenos ya sea mediante características estructurales que actúan como barreras

físicas e impiden que el patógeno penetre y se propague en ellas; tales como las

ceras en la superficie de las hojas y frutos, el grosor de la cutícula, grosor y dureza

de la pared externa de las células epidérmicas. En su caso, cuando ya ha penetrado

el hongo, se forman estructuras como las capas de corcho, capas de abscisión,

formación de tílides, sustancias gomosas, cambios en las estructuras celulares,

reacciones de defensa citoplásmica, o la reacción de defensa necrótica también

llamada defensa mediante hipersensibilidad o bien por medio de reacciones

bioquímicas que tienen lugar en sus células y tejidos, las cuales producen

sustancias tóxicas para el patógeno o crean condiciones que inhiben su desarrollo

(Agrios, 2006).

En la agricultura moderna, se intenta lograr la sostenibilidad de la productividad

agrícola. El uso de agroquímicos ha permitido obtener incrementos substanciales en

la producción; no obstante, sus efectos adversos impactan significativamente la

sostenibilidad de la agricultura. La práctica del monocultivo y la contaminación por el

uso indiscriminado de agroquímicos han reducido la biodiversidad de los

agroecosistemas, causando la inestabilidad de los mismos, la cual se manifiesta,

entre otros efectos nocivos, en una mayor incidencia de plagas y enfermedades en

los cultivos. Esto y los problemas de seguridad y salud pública inherentes a la

fabricación y uso de agroquímicos han conducido a la búsqueda y establecimiento

de alternativas de manejo de plagas y enfermedades (Zavaleta, 1999).

7

Los métodos de lucha preventiva frente a las bacterias fitopatógenas son múltiples,

pero se basan esencialmente en: a) la aplicación de técnicas de diagnóstico

sensibles y específicas que permitan detectar las bacterias en el material vegetal; b)

el análisis de las características de las cepas de cada especie y su comparación

molecular con las de otros orígenes; c) el conocimiento de las fuentes de inóculo y

los reservorios de cada bacteriosis en nuestras condiciones; d) el estudio de las

estrategias de supervivencia de las bacterias fitopatógenas en distintos hábitats; y e)

el uso de tratamientos preventivos, entre los que destaca el control biológico

(Peñalver, et al.2009). Así como Programas de saneamiento, solarización, rotación

de cultivos y uso de cultivares resistentes, este último método de control ha sido muy

utilizado para el control de varios patógenos (Zitter et al., 1996).

5.5. Pruebas fisiológicas y bioquímicas para la identificación de bacterias

fitopatógenas.

Existen diferentes sistemas de clasificación de bacterias, pero el más comúnmente

utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.

La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación

dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas

y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la

clasificación considerada. Las características a determinar y su número depende

principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificación.

A continuación se propone un esquema de trabajo para la identificación de una

cepa bacteriana desde el punto de vista bioquímico (Biotipo):

1) Obtener un cultivo puro.

2) Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se

determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es

importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características

morfológicas de interés.

3) Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los

métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos,

fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos.

4) Realización de pruebas primarias: En la siguiente tabla, modificada del Cowan &

Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas,

8

denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género,

grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las

pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, fermentación de

glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosisy movilidad.

5) Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie.

Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos,

producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina

deaminasa, etc.)

5.5.1. Ensayos bioquímicos.

La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes

combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de

similitudes.

Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas

convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica

(conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un

medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque

proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un

grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un

valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son

totalmente automatizables.

Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado

para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como

presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o

determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura,

crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un

estudio profundo del metabolismo bacteriano (Sosa-Moss et al., 1996).

Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de

cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo

si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores

9

de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos

azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la

determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de

identificación, comerciales, etc.) (Sosa-Moss et al., 1996).

5.5.2. Método para la realización de pruebas fisiológicas y bioquímicas

Para la realización de de las pruebas fisiológicas y bioquímicas existen técnica ya

predeterminadas para la identificación de organismos bacterianos en base a su

composición bioquímica como los siguientes:

1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o

inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un

sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador

de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación.

2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato

de una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimática.

En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubación) en un

medio en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica,

atmósfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de

medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes

controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa

para ese test. Si bien existen una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas

con fines de identificación, se enumerarán a continuación solo las que se utilizan

más frecuentemente, agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su

nombre corriente. (Sosa-Moss et al., 1996)

1) Enzimas vinculadas con la respiración

a) oxidasa

b) catalasa

2) Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros

2.1) Requerimientos de oxígeno

OF (óxido-fermentación)

10

Crecimiento en caldo tioglicolato

2.2) Producción de ácido, o ácido y gas

Fermentación de carbohidratos

2.3) Detección de enzimas y vías metabólicas

a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer)

b) Gluconato

c) O.N.P.G. (orto nitro ß-D-galactopiranósico)

d) Esculina

e) Hipurato

3) Fuente única de carbono

a) citrato

b) malonato

c) hipurato para coliformes

4) Utilización de compuestos nitrogenados

4.1) Reducción de nitrato

a) asimilación

b) denitrificación

4.2) Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros

a) indol

b) H2S

c) Fenilalanina

d) Lisina, arginina, ornitina

e) Urea

5) Ensayos combinados

a) TSI (Triple Azúcar Hierro)

b) LIA (Agar Hierro Lisina)

c) Bilis esculina

6) Detección de exoenzimas

a) lecitinasa

b) proteasas, coagulasa

c) amilasas

d) celulasas

e) desoxirribonucleasas

11

f) acción de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)

7) Misceláneos

a) KCN

b) Bilis

c) producción de pigmentos

8) Test de crecimiento o inhibición

a) Temperatura

b) NaCl

c) Antibióticos

(Sosa-Moss et al., 1996)

5.6. Uso de herramientas moleculares para el estudio de las comunidades

bacterianas.

Dados los problemas inherentes que presentan los sistemas de identificación

fenotípicos (no todas las cepas de una misma especie muestran características

homogéneas, una misma cepa puede generar diferentes patrones en ensayos

repetidos y también las limitaciones en las bases de datos, entre otros), los métodos

moleculares se han erigido como procedimientos complementarios, alternativos o

incluso de referencia a los fenotípicos. En la década de los 80, comenzó la

búsqueda de candidatos que, siendo genes estables, permitieran establecer

relaciones filogenéticas entre las bacterias, como los genes que codifican para las

subunidades ribosómicas 5S, 16S, 23S y sus espacios intergénicos. En la taxonomía

bacteriana, el análisis de la secuencia génica del ARNr 16S es la herramienta más

ampliamente utilizada. Este marcador housekeeping está presente en todas las

bacterias. Se presenta como una familia de multigenes u operones cuya función no

se modifica con el tiempo y actúa como un marcador eficiente de evolución.

Además, tiene un tamaño adecuado para realizar el análisis. El ARNr 16S además

de ser útil para la detección de bacterias, proporciona información útil y rápida sobre

su identificación y filogenia mediante la comparación con bases de datos públicas

que contienen un amplio número de de secuencias bacterianas. Así pues, la

identificación mediante el ARNr 16S se fundamenta en su secuencia. (Bosshard et

al., 2003).

12

Posteriormente, y de forma simultánea a los avances tecnológicos en las técnicas de

secuenciación, se han utilizando genes cuya secuencia permite una mayor precisión

o una diferenciación intraespecie en grupos, biovariedades, genovaridades o similar.

Inicialmente, la identificación bacteriana basada en el análisis de las secuencias se

hallaba limitada a determinados centros o laboratorios. En la actualidad y como

consecuencia de la automatización, simplificación del proceso y de la reducción de

su costo, estas técnicas se han introducido en un mayor número de laboratorios.

Este avance ha supuesto que en agosto de 2010 en las listas aprobadas de

nomenclatura bacteriana el número de descripciones de nuevas especies alcance la

cifra de 10.000 (http://www.bacterio.cict.fr/number.html#total). Unas de las técnicas

más utilizadas en la identificación molecular de algún organismo es la Reacción en

Cadena de la Polimerasa conocida como PCR, por su nomenclatura en ingles

(Polymorase Chain Reaction).

5.6.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

La Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR, es una técnica de biología molecular

desarrollada en 1983 por Kary Mullis (Bartlett & Stirling 2003), cuyo objetivo es

obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de

un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o

molde.

Esta técnica es considerada la más revolucionaria del último cuarto del siglo XX.

Con ésta se consigue copiar millones de veces, en un par de horas, una secuencia

predeterminada, dentro de una mezcla de ADN tan compleja como el propio genoma

humano, donde la secuencia de interés representa tan solo una diez millonésima

parte (Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004).

5.6.2. DNA Polimerasa.

La polimerasa Taq es un tipo de ADN polimerasa termoestable, nombrada de esta

forma debido a que es producida por la bacteria Thermus aquaticus (T-aq) y a partir

de la cual fue aislada en el año 1968 por Thomas D. Brock. A menudo suele

abreviarse como "Taq Pol" (o simplemente como "Taq"), y es frecuentemente

13

http://www.bacterio.cict.fr/number.html

utilizada en las técnicas de PCR, un método que se utiliza para amplificar

secuencias cortas de ADN.

T. aquaticus es una bacteria que vive en manantiales calientes y fuentes

hidrotermales, y la polimerasa Taq que de ella se extrae ha sido caracterizada como

una extremoenzima capaz de soportar las condiciones de alta temperatura

requeridas durante el proceso de PCR sin desnaturalizarse. Por esta razón ha

reemplazado a la ADN polimerasa proveniente de E. coli (Eco pol) que era la que

originalmente se utilizaba en esta técnica, pero que requería ser reemplazada luego

de cada ciclo de calentamiento aumentando las probabilidades de contaminación y

prolongando los tiempos. La temperatura óptima de funcionamiento de la Taq es de

75–80°C, con una semivida mayor a las dos horas a 92,5°C, 40 minutos a 95ºC y 9

minutos a 97,5ºC. Esta enzima puede replicar una cadena de ADN de 1000 pares de

bases en menos de 10 segundos funcionando a 72ºC de temperatura.

Habitualmente, se suele utilizar de 2 a 3 unidades de DNA polimerasa en una

reacción de volumen 100µl. (Invitrogen 2004).

5.6.3. Concentraciones de Cloruro de magnesio.

Tanto el ión magnesio como el manganeso tienen una función crítica en la reacción,

requiriéndose a una concentración que oscila regularmente entre 0.5 y 2.5 mM. La

concentración de MgCl2 debe optimizarse para cada ensayo en particular, ya que

puede tener efecto tanto en la especificidad como en el rendimiento de la reacción.

En general, concentraciones insuficientes de Mg+2 dan lugar a bajo rendimiento,

mientras que en exceso se obtienen amplificaciones inespecíficas.

5.6.4. Desoxirribonucleósidos trifosfatados (dNTPs)

Los cuatro dNTPs (dATP, dTTP, dCTP y dGTP; distinguibles por sus bases

nitrogenadas) son los ladrillos con los que se construyen las nuevas cadenas de

ADN (figura 2).

14

Figura 2.- Nucleótidos. Estos componentes de los nucleótidos son la clave de la

especificidad del apareo de las cadenas del ADN, apareándose siempre una purina

con una pirimidina.

La variación en su concentración afecta la especificidad y fidelidad de la reacción.

Concentraciones altas de los mismos hacen disminuir la fidelidad con la que la

polimerasa efectúa su trabajo, e incluso pueden llegar a inhibir su actividad. También

afecta a la fidelidad de la reacción el uso de concentraciones desbalanceadas de

estos cuatro ingredientes, siendo las concentraciones usuales, en la mayoría de los

casos, entre 0.2 a 1 mM. Los dNTPs pueden captar iones de magnesio por lo que

las concentraciones de ambos componentes deben guardar siempre la misma

relación, aconsejándose que la concentración de Mg+2 sea 0.5 a 1mM superior a la

concentración de los dNTPs (Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004).

5.6.5. “Primers”.

Los “Primers” o iniciadores son el componente más sensible que determina el éxito

de un ensayo de PCR. Su longitud suele estar entre 18 y 30 nucleótidos, y su

contenido en G+C entre 40-75%. La concentración a la que suelen emplearse en

una PCR está en el intervalo de 0.1-0.5 µM. Los iniciadores normalmente se diseñan

15

para ser exactamente complementarios al molde de ADN (Rodríguez-Sánchez y

Barrera-Saldaña, 2004).

5.7. Pasos básicos de la Reacción en Cadena de la Polimerasaa(PCR).

La Reacción en Cadena de la Polimerasa se lleva a cabo en tres pasos en un

termociclador: desnaturalización, hibridación y extensión. A continuación se

describirán.

5.7.1. Desnaturalización.

El sustrato de la enzima de la PCR es el ADN de cadena simple que actúa como

molde para la síntesis de su nueva cadena complementaria. Mediante un

calentamiento a 94°C, (figura 3) el ADN de doble cadena logra que sus cadenas se

separen o desnaturalicen, esto se logra debido a que los puentes de hidrógeno se

rompen dejando al DNA en forma de cadena sencilla, permitiendo así exponer las

diferentes bases nitrogenadas para la hibridación con los “primers” o iniciadores

(Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004).

Figura 3.- Amplificación exponencial del DNA molde, a través de la técnica de PCR.

5.7.2. Hibridación.

16

El alineamiento específico de ambos iniciadores (cebadores) se produce a una

temperatura determinada por composición de bases y oscila entre 40 y 72°C. Ambas

cadenas originales del ADN sirven simultáneamente como moldes para sintetizar

sus respectivas cadenas complementarias nuevas. Un aumento de temperatura

favorece la especificidad, ya que disminuye las uniones incorrectas de los cebadores

con sitios apócrifos del ADN molde (Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004).

5.7.3. Extensión.

Esta etapa debe realizarse a una temperatura alta, que es la que coincide con la

máxima actividad de la polimerasa (72°C) (figura 4) para evitar alineamientos

inespecíficos de los iniciadores. Con el DNA molde la cadena sencilla, excepto en

sitios donde los indicadores se aparean, la polimerasa empieza a copiar la hebra,

incorporando desoxirribonucleósidos monofosfatos en dirección 3-5. El tiempo de

extensión depende del tamaño de la amplificación, debiendo estimar 1 min. para

alargar 1000 nucleótidos. Es común que al finalizar todos los ciclos se realice un

último alargamiento de 5 min. a 72ºC, para asegurarse que todos los productos de

amplificación estén completamente terminados y tengan, exactamente la misma

longitud (Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004).

17

Figura 4.- Pasos básicos de un ciclo de PCR.

5.8. Electroforesis

La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas

en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término

electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de

un campo eléctrico. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego

phoros, significa «trasladar». Así pues, la electroforesis en gel es una técnica

consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una

placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a

los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de una molécula

determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de

un medio gelatinoso.

Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los

péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos

ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas

eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga

neta, las partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por

ejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos

fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo

(Westermeier, 1997).

5.9. Enfermedades de las Cucurbitáceas

Existen más de 200 enfermedades conocidas de las Cucurbitáceas de diversas

etiologías. El control eficaz de las enfermedades de las Cucurbitáceas requiere de

una identificación acertada de los agentes causales la cual conduce a una reducción

de riegos de pérdida en la producción. Las estrategias de control se basan en la

prevención de las enfermedades y en métodos que limiten la propagación de dichas

enfermedades. El uso de cultivares resistentes a enfermedades ha mejorado

considerablemente el control de las enfermedades en pepino, en melón, sandia y

más recientemente calabaza. La semilla libre de enfermedades está recibiendo

18

mayor atención por parte de las empresas productoras de semilla. La práctica de la

rotación de cultivo para prevenir enfermedades se ha convertido en un pilar de la

producción sustentable de Cucurbitáceas.

Dentro de los agentes causales de enfermedades bacterianas se encuentra el

género "Pseudomonas" el cual se ha generalizado en un bacilo Gram negativo con

flagelación polar. En la familia Pseudomonadaceae se incluyen los bacilos rectos o

ligeramente curvados, incapaces de formar esporas y que crecen aeróbicamente. La

ganancia energética tiene lugar por respiración aeróbica, en algunas especies por

respiración anaeróbica (desnitrificación), pero no por fermentación. Desde el punto

de vista fisiológico y metabólico las Pseudomonas se caracterizan por el amplio

espectro de sustratos orgánicos utilizables. También utilizan un gran número de

compuestos heterocíclicos y aromáticos, que no son atacados por otras bacterias.

Algunas especies de Pseudomonas oxidan los azúcares de forma incompleta y

excretan los ácidos correspondientes (gluconato, 2-oxogluconato). (Frazier y

westhoff, 1978; Chen, 2010). Algunos miembros del género son psicrófilos, mientras

que otros sintetizan sideróforos fluorescentes de color amarillo-verdoso con gran

valor taxonómico. Es común la presencia de plásmidos (Esnard, 1996; Michel,

2004).

Pseudomonas puede crecer a las temperaturas normales de refrigeración, pero la

temperatura óptima de crecimiento, está comprendida entre 25-30 C ⁰ (Frazier y

westhoff, 1978). Es tolerante a una amplia variedad de condiciones físicas,

incluyendo la temperatura. Es resistente a las altas concentraciones de sales y

colorantes, antisépticos débiles, y muchos antibióticos de uso común. Pseudomonas

tiene predilección por el crecimiento en ambientes húmedos, que es probablemente

un reflejo de su existencia natural en el suelo y el agua. Estas propiedades naturales

de la bacteria, sin duda, pueden contribuir a su éxito ecológico como un patógeno

oportunista (Todar, 2008).

Dentro del género Pseudomonas existe la especie Pseudomona syringae el cual es

un agente fitopatógeno que puede infectar un amplio rango de especies de plantas,

existiendo más de 50 diferentes patovares (Young et al., 1996). Muchos de estos

patovares fueron en su momento consideradas especies individuales dentro del

género Pseudomonas, pero las técnicas de biología molecular tales

19

http://es.wikipedia.org/wiki/Pl%C3%A1smido

http://es.wikipedia.org/wiki/Sider%C3%B3foro

http://es.wikipedia.org/wiki/Psicr%C3%B3filo

como hibridación de ADN han mostrado que todos son parte de P. syringae (Kreig y

Holt, 1984).

Dentro de los hospedantes susceptibles a Pseudomona syringae se incluyen a las

Cucurbitáceas como la calabaza, Cucurbita pepo, la sandía, Citrullus lanatus; el

melón, Cucumis melo; y el pepinillo, Cucumis sativus en las cuales ocasiona una

disminución en la producción y calidad en los cultivos. En la incidencia y severidad

de la enfermedad influyen, la susceptibilidad de la planta y el medio ambiente

(Almodóvar, 2005). Dentro de las enfermedades causada por Pseudomona syringae

pv. Lachrymans está la Mancha angular que afecta gravemente a pepino, melón,

sandía, calabaza.

5.9.1. Síntomas de la mancha angular.

La Mancha angular de la hoja ocurre más comúnmente en el pepino, pero también

se le encuentra en melones. Las lesiones sobre el follaje empiezan como manchas

acuosas que cambian de color gris a marrón. Las manchas pueden inicialmente

desarrollar un halo de amarillo a verde pálido. Conforme el tejido afectado se seca,

el tejido interno puede desprenderse, dando a la hoja la apariencia hilachosa. Las

lesiones son delimitadas por las venas, dándole a ellas una forma angular, aunque

en condiciones altamente favorables para la enfermedad, las lesiones pueden

coalescer y formar una severa mancha angular (Figura 5). Las lesiones en los frutos

son generalmente superficiales, y se acompaña de un exudado lechoso claro que se

colecta en la parte más baja de la lesión como una lágrima. Al secarse forma una

delgada costra blanca sobre o adyacente a la lesión (Zitter, et al.1996).

20

Figura 5.- Mancha angular en calabaza Kabocha.

5.9.2. Métodos de dispersión de la enfermedad.

La bacteria que causa la mancha angular de la hoja sobrevive sobre residuos del

hospedante, en el suelo y dentro de la semilla. Durante las lluvias, las bacterias se

dispersan desde el suelo a los tallos, a las hojas y más tarde a los frutos. Una vez

que la infección toma lugar, el organismo se dispersa en el campo a través de las

manos de los trabajadores. Condiciones húmedas favorecen el desarrollo de la

enfermedad. La lluvia o el riego por aspersión conducen a una rápida dispersión de

la enfermedad. La enfermedad también es dispersada por la maquinaria que se

mueve a través de los campos. La mancha angular es más severa durante periodos

lluviosos prolongados con temperaturas que oscilen entre los 16 a 27ºC (Zitter et al.,

1996).

21

VI. MATERIALES Y MÉTODOS.

6.1. Aislamiento de la batería asociada a la mancha angular de la Calabaza

kabocha.

Se recolectaron hojas de calabaza Kabocha con síntomas de mancha angular en

diez lotes comerciales en el municipio de Ahome y se llevaron al Laboratorio de

Diagnóstico Fitosanitario de la Junta Local de Sanidad Vegetal del Valle del Fuerte

(JLSVV). De cada muestra se realizaron preparaciones para ser observadas al

microscopio compuesto, de los tejidos adyacentes a las aéreas infectadas. Se

aislaron cepas de las bacterias mediante el método de inmersión del tejido en agua

deionizada esterilizada (Rodríguez-Mejia, 1994); para ello, se hicieron pequeños

cortes de material enfermo de 1-2 mm de longitud. Los trozos se lavaron con agua

destilada y se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 1 minuto.

Después se lavaron en tres ocasiones consecutivas con agua deionizada estéril.

Finalmente, con la ayuda de una aguja de disección esterilizada a la flama, los

trozos se introdujeron en tubos de ensayo con 5ml de agua deionizada estéril. El

material se dejó en reposo durante 5 minutos. Con una asa bacteriológica (100/1)

estéril, Se tomó parte de la suspensión y se sembró mediante estría cruzada en

cajas Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) cortes de 0.5 de longitud

del margen de las lesiones y se colocaron en un tubo de ensayo con agua destilada

estéril. El tejido se agitó durante 25-30 segundos; conseguido se tomó una asada y

se deslizó en forma de estría en agar nutritivo (AN).

También se depositaron trozos de tejido enfermo en placas con PDA. Las siembras

se incubaron a 28 C durante 24 a 48 horas. Después de este tiempo y al detectar el⁰

desarrollo de las colonias bacterianas y de hongos a partir del material enfermo, se

procedió a obtener cultivos puros. Para ello, se observaron las colonias con la

ayuda del microscopio estereoscópico con luz oblicua (Olympus SZX7), procediendo

a separar las colonias basándose en sus características morfológicas. Se trasfirieron

a nuevas placas Petri con PDA. Finalmente las colonias puras de bacterias se

pasaron a tubos de ensayo con agua deionizada estéril. Los tubos se taparon

herméticamente, se etiquetaron y se conservaron a temperatura de 4 C.⁰

(Rodríguez-Mejía, 1994).

22

6.2. Determinación de la patogenicidad de seis aislados de la bacteria asociada

a la mancha angular de calabaza Kabocha.

La patogenicidad de la bacteria asociada a la mancha angular se determinó en

calabaza Kabocha; adicionalmente se incluyeron pepino y calabaza zucchini. Las

semillas de las Cucurbitáceas se trataron con hipoclorito de sodio 0.5%. Se sembró

en vasos de poliuretano de un litro y cuando las plantas tenían 40 días de edad se

inocularon en forma separada con los aislamientos de la bacteria. Los cultivos se

ajustaron 3x 108 ufc/ ml (unidades formadoras de colonias) de acuerdo con la escala

propuesta por McFarland citado por (Kiraly, et al. 1974). Se utilizaron cuatro plantas

de cada especie por aislamiento las plantas inoculadas y las plantas testigo sin

inocular se distribuyeron en un arreglo completamente al azar se cubrieron con

polietileno, previa colocación de papel periódico saturado con agua potable para

inducir un 100% de humedad. Las plantas se incubaron por 48 horas, la temperatura

varió de 8 a 21 C durante este periodo. Enseguida, las plantas se sometieron a⁰

humedad relativa del 100% sólo durante 12 horas (durante la noche) durante 5

noches consecutivas.

23

6.3. Pruebas fisiológicas y bioquímicas.

A diez aislados, incluyendo los seis que resultaron patogénicos se les realizó las

pruebas de (LOPAT), siglas que hacen alusión a: levana, oxidasa, pudrición en

papa, dihidrolasa de arginina, hipersensibilidad en tabaco. También se determinaron

características fisiológicas como tinción Gram, difusión de pigmentos fluorescentes,

crecimiento a 41°C, prueba de KOH y catalasa y por último la utilización de fuentes

de carbono tales como: D- manitol, Adonitol, Insitol, D-Sorbitol, Celobisa, Trehalosa,

D-Arabinosa, L- Rhamnosa, Maltosa, Lactosa, Sacarosa. Todas las pruebas se

realizaron a partir de aislados puros de 48 horas de edad siguiendo procedimientos

previamente descritos (Manovsky, 1982; Fahy y Persley, 1983; Schaad, 1980 y

Rodríguez-Mejía, 1994).

6.3.1. Producción de Levana.

Se utilizó el medio para producción de Levana (Anexo 1.4). La bacteria se sembró

en cuatro partes de la caja de petri con una asa bacteriológica y se mantuvo a 28°C

durante 24-48 hrs. con la caja sin invertirse. Las colonias pulvinadas y mucoides se

consideran positivas, y las colonias planas o ligeramente convexas y húmedas

negativas.

6.3.2. Prueba de Oxidasa.

Para la prueba de oxidasa se esterilizó papel filtro (Whatman # 1), sobre el papel se

colocó con un pica diente estéril una colonia del aislado y se le agregó una gota del

reactivo (Oxidase Reagent REF 55 635); después de un minuto en el papel filtro se

muestra con un color lila a azul significa positivo; sin color negativo.

6.3.3. Pudrición en papa

Tubérculos de papa sana variedad Fianna se sumergieron en una solución de

hipoclorito de sodio al 0.5 % durante 4 minutos; enseguida se cortaron con un bisturí

rodajas de aproximadamente 5 mm de grosor y con el mismo bisturí se realizó una

24

incisión en el centro de las rodajas, cerca de mechero de bunsen, se tomó una

asada del aislamiento para pasarse por la incisión tres veces. Las rodajas así

inoculadas se pasaron a una cámara húmeda por 72 hrs. Se consideró positivo si en

la incisión se presentaba pudrición, negativo si no se observó síntoma.

6.3.4. Prueba de Dihidrolasa de arginina.

Se utilizó el medio de arginina (Anexo 1.5) el cual se preparó en tubos de ensayé de

16 x 150 mm con tapón de rosca. A partir del cultivo bacteriano se inocularon por

picadura dos tubos del medio con una asa bacteriológica previamente flameada y se

les adicionó 1 ml de aceite mineral estéril y se incubaron a 28°C durante 72 hr. La

prueba se consideró positiva cuando los tubos inoculados presentaron cambio de

color de rosa pálido a púrpura o violeta; La prueba es negativa cuando no hay

cambio de color en el medio de cultivo.

6.3.5. Reacción de hipersensibilidad.

Se utilizó una planta de tabaco var. Xanthi, con cada aislamiento se llenó una jeringa

de 3 ml esterilizada con una suspensión bacteriana de 107 células/ ml; Se tomó una

de las hojas del tabaco entre los dedos y se infiltró en el envés de la hoja, ejerciendo

una pequeña presión, sin traspasar la hoja y se empujó el embolo para infiltrar. Los

resultados se observaron a las 24 horas después de la infiltración. La prueba es

positiva si la zona infiltrada presenta necrosis o flacidez; La prueba es negativa

cuando se observó clorosis después de las 72hrs.

6.3.6. Tinción Gram.

Se marcó un portaobjetos con el nombre del aislamiento y se tomó una asada del

inoculo el cual se sembró en espiral en el centro del portaobjeto y se fijó en el

mechero bunsen, se le añadieron 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación,

hasta que se cubrió por completo 1 minuto. Una vez transcurrido el tiempo, la

preparación se lavó con agua destilada utilizando una piseta; se agregaron 1 ó 2

gotas de solución lugol a la preparación por 1 minuto, transcurrido el tiempo, se

lavó, con cuidado se le añadió gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparación

25

durante 10 segundos; Se añadió el colorante de contraste, safranina (1 ó 2 gotas)

durante 30 segundos y se lavó con la piseta; Se secó al aire y se observó bajo el

microscopio compuesto con el objetivo de inmersión.

6.3.7. Difusión de pigmentos

Se utilizó el medio de B de King (Anexo 1.2). Sobre el medio de cultivo en caja petri

se sembraron los asilamientos por estría cruzada. Los resultados se observaron a

las 24 hrs después de la siembra; para ello los cultivos se expusieron a luz

ultravioleta en obscuridad. Se considera prueba positiva si se observa fluorescencia,

la prueba es negativa cuando las colonias no fluorescen.

6.3.8. Prueba de KOH al 3%

En un portaobjetos se colocó una gota de KOH al 3% (Anexo 3); una asada del

cultivo bacteriano se mezcló con el KOH mediante movimientos giratorios durante un

minuto. Si al separar el asa del portaobjetos se forma una hebra viscosa, esto indica

que se trata de bacterias Gram negativas, si la hebra no se forma se trata de

bacterias Gram positivas.

6.3.9. Prueba de catalasa.

Con el asa estéril se tomó una colonia del asilamiento y se colocó en un

portaobjetos, con una pipeta Pasteur se adicionó una gota de H2O2 al 30% (Anexo

3). La prueba es positiva si de inmediato se observarón burbujas. La prueba se

considera negativa cuando no se observan burbujas.

6.3.10. Utilización de fuentes de carbono

Para esta prueba bioquímica se utilizó el medio base de Ayers (Anexo 1.3) el cual se

preparó en matraces erlenmeyer de 500 ml. a cada matraz se le agregó uno de los

siguientes azúcares: D- manitol, Adonitol, Insitol, D-Sorbitol, Celobisa, Trehalosa, D-

Arabinosa, L- Rhamnosa, Maltosa, Lactosa, Sacarosa (Shaad, 1980). Los medios de

cultivo se esterilizaron en autoclave a 118°C por 15 min. y se dispensaron en cajas

26

petri. Se utilizaron dos cajas de petri con cada fuente de carbono para cada aislado,

las cuales se sembraron por estría y se incubaron a 28ºC por 7 días. La prueba es

positiva si la bacteria utiliza la fuente de carbono y crece en el medio, y es negativa

si la bacteria no crece en el medio de cultivo.

27

6.4. Identificación molecular de los aislados mediante Reacción en Cadena de

la Polimerasaa(PCR).

Los aislados identificados mediante las pruebas bioquímicas y fisiológicas, se

crecieron en placas de LB (Luria Broth), por 24 horas a 37 °C; de las placas se

colectó una asada de cada aislado por separado y se depositó en un tubo Eppendorf

de 1.5 ml el cual contenía 2 ml de medio LB. Los cultivos se sometieron a agitación

de 200 revoluciones durante 16 horas a 37 °C. El ADN genómico fue empleado para

la identificación molecular posterior, mediante la técnica de la Reacción en Cadena

de la Polimerasaa(PCR). Para la identificación molecular de los posibles

microorganismos de origen procariótico, se tomó 1 μl del DNA eluído y se combinó

con 24 μl de la mezcla de reacción para PCR conteniendo H2O destilada estéril, 0.5

μM de cada uno de los oligonucleótidos; 1X de buffer para PCR; 1mM de MgCl2; 500

μM de cada uno de los dNTPs; 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Cat. No. 10966-030.

Lote TPKB1d, Invitrogen EUA). Se emplearon oligonucleótidos dirigidos a la

amplificación de la región 16S del ADN ribosomal (Figura 6). Para lograr este

objetivo, se utilizaron los oligonucleótidos F2C (5’- AGAGTTTGATCATGGCTC -3’) y

C (5’- ACGGGCGGTGTGTAC -3’) (Shi et al., 1997) los cuales se ubican

respectivamente en las posiciones 8 a 25 y 1392 a 1406 de la secuencia del 16S

rDNA de Escherichia coli (Brosius et al.,1987).

Figura 6.- Ubicación de los oligonucleótidos F2C y C en la región 16S del DNA

ribosomal de procariotes. Región de secuencia intergénica por sus siglas en inglés:

ISR= intergenic sequence región.

Las condiciones del programa de PCR para amplificar el ADNr de procariotes fueron

las siguientes: para la desnaturalización 4 min a 95 ºC, 1 min a 95 ºC; anillamiento 1

min a 55 ºC; elongación 2 min a 72 ºC, por 32 ciclos; y un paso final de elongación

de 5 min a 72 ºC. Una vez terminados los programas de amplificación, se procedió a

su visualización por medio de la técnica de electroforesis. Los tubos Eppendorff

28

16S 23S ISRISR

F2C

C

conteniendo las mezclas de reacción se colocaron en un termociclador (BioRad, Cat.

No. 580BR-2592, CA, EUA).

6.4.1. Cuantificación del DNA´S.

De los tubos Eppendorff conteniendo los productos de PCR se utilizó una fracción

mínima de la cantidad de muestra (0.5-2 µl). Este sistema de medición emplea la

tensión superficial para mantener la muestra estática entre dos fibras ópticas, lo que

permite la medición de muestras altamente concentradas sin la necesidad de utilizar

diluciones.

Antes de empezar se realizó la calibración del equipo: se limpió el pedestal (punto

de medición) con agua mili-q y papel secante suave. Se cargaron 2 µl de agua mili-q

en el pedestal y se inició la lectura.

Procedimiento:

1. Se cuantificó el blanco, es decir, el buffer donde se encuentra el ADN, para

identificar cualquier tipo de contaminación. Se cargaron 2 µl de buffer de elución y se

inicio la lectura.

2. Para medir cada muestra, se ingresó primero el código de cada muestra en la

ventana del software y se cargaron 2 µl de la misma en el pedestal del

espectrofotómetro. Se inició la lectura y se repitió el procedimiento para cada

muestra (Figura 7).

Figura 7.- Procedimiento para cargar cada muestra en el espectrofotómetro

NanoDrop ™

29

6.4.2. Electroforesis de los productos amplificados.

Para la visualización de los productos de PCR se prepararon geles de agarosa al

1%. La agarosa se disolvió en 50 ml de TAE 0.5 X (40 mM Tris-HCl, ácido acético

pH 8.0, 1 mM EDTA) aplicando calor mediante un horno de microondas por un

período de 45 segundos, y se dejó enfriar a aproximadamente 50 °C y

posteriormente se agregó 1.5 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml) (Sambrook et al.,

1989); se vertió en la base de la cámara de electroforesis con un peine para formar

los pozos. Una vez que la agarosa gelificó, se colocó en la cámara buffer TAE 0.5 X

hasta cubrir el gel. En cada pozo se cargaron 2 µl de buffer de carga (glicerol 30%,

25 mM EDTA pH 8.0, 0.025% colorante azul de bromofenol y xilen-cianol) por cada

10 µl de muestra (producto de PCR). Se empleó como marcador de peso molecular

el marcador de 1 Kb ADN Ladder Plus (Invitrogen, EUA, Cat. No. 15628 019). El

proceso de electroforesis se realizó con un voltaje de 80 V por un tiempo de 40 min.

El gel de agarosa fue visualizado mediante la aplicación de luz ultravioleta en un

fotodocumentador (CHEMIDOC Universal Hood II de Biorad, Cat. No. 765/07032,

CA, EUA).

30

VII. RESULTADOS.

7.1. Patogenicidad de los seis aislados de Pseudomonas syringae pv.

Lachrymans en Calabaza Kabocha y otras Cucurbitáceas.

Sesenta y dos horas después de la inoculación se observaron los primeros síntomas

en la hojas de calabaza Kabocha (Cucurbita moschata Dutch ex Lam) así como en

pepino, calabaza zucchini variedad (gray), en las hojas se presentaron lesiones

irregulares de color pardo oscuro; Las lesiones se incrementaron en tamaño hasta

cubrir gran área foliar, llegando a causar el atizonamiento; El cual estuvo delimitado

por la nervadura principal en las hojas (figura 8).

Figura 8.- Lesiones bacterianas causadas después de 14 días de la inoculación, a)

calabaza zucchini, b) pepino, c) calabaza Kabocha, d) planta enferma de calabaza

Kabocha. Similares a los observado en campos comerciales de calabaza kabocha.

31

Tabla 1. Porcentaje del área foliar dañada por seis aislados de Pseudomonas

syringae pv. Lachrymans en Calabaza Kabocha, Pepino, Calabaza zucchini.

32

Hospedante Daño en porcentaje por planta

Pepino Calabaza zuchini Calabaza Kabocha

Aislamientos

Ps 3 30 80 80

30 80 75

40 80 80

40 80 75

Ps 4 15 12 35

15 12 35

15 12 40

15 13 35

Ps 6 15 35 40

15 35 40

15 35 40

15 35 40

Ps 8 75 80 80

75 80 80

75 80 80

75 80 80

Ps 9 35 50 30

35 50 30

35 50 30

35 50 30

Ps 12 15 50 15

15 50 12

15 70 15

15 70 15

Testigo sin

inocular

0 0 0

7.2. Pruebas bioquímicas y fisiológicas.

Los aislados bacterianos asociados a la mancha angular de calabaza Kabocha

(Cucurbita moschata Dutch ex Lam) caracterizadas fuerón Gram negativo, las

colonias fueron circulares, puntiformes, convexas, suaves y de un color blanco a

crema (Tabla 2a). Todos los aislamientos indujeron a reacción de hipersensiblilidad

en tabaco. También produjeron pigmento fluorescente en el medio B de King.

Fueron positivas para las pruebas de catalasa y levana, pero fueron negativas en

caso de oxidasa y Dehydrolasa arginina (figura 9). Los aislamientos no utilizaron

Celobiosa, Trehalosa, D-arabinosa, L-ramnosa, Lactosa, Sacarosa, Adonitol,

Maltosa, pero utilizarón Manitol, Sorbitol, Inositol. Ningún aislamiento creció a 41°C

(Tablas 2b y 2c).

Los resultados arriba indicados sugieren que los díez aislamientos en el municipio

de Ahome, Sinaloa corresponden a Pseudomonas syringae pv. Lacrymans lo cual

concuerda con estudios previos (Schaad., 1980; Rodríguez-Mejía 1994).

Tabla 2a. Morfología colonial de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans agente

causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome,

Sinaloa, México.

Esperado

según

(Schaad.,

1980)

Resultado

Morfología

colonial

Forma

Circular,

Puntiforme

Circular,

Puntiforme

Bordes Uniforme Uniforme

Elevación Convexa Convexa

Color

Blanco a

Crema

Blanco a

Crema

Superficie Lisa Lisa

33

Tabla 2b. Aplicación de las prueba LOPAT para la identificación de la bacteria

Pseudomonas syringae pv. Lacrymans, agente causal de la mancha angular de

calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome, Sinaloa, México.

Aislamientos

Prueba

bioquímica y

fisiológica

(Schaad.,

1980)

PS

3

PS

4

PS

5

PS

6

PS

7

PS

8

PS

9

PS

10

PS

11

PS

12

Levana + + + + + + + + + + +

Oxidasa - - - - - - - - - - -

Pudrición en

papa - - - - - - - - - - -

Dihidrolasa de

arginina - - - - - - - - - - -

Reacción de

hipersensibilidad + + + + + + + + + + +

Figura 9.- a) prueba de Levana positiva, b) prueba de Oxidasa negativa, c)

pudrición en papa negativa, d) Dihidrolasa de arginina tubo izquierdo positivo tubo

derecho negativo, e) reacción de hipersensibilidad en tabaco.

Tabla 2c. Aplicación de las pruebas bioquímicas y fisiológicas para la identificación

de la bacteria Pseudomonas syringae pv. Lacrymans agente causal de la mancha

angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome, Sinaloa, México.

34

Aislamientos

Prueba bioquímica

y fisiológica*

(Schaad.,

1980) Ps

3

Ps

4

Ps

5

Ps

6

Ps

7

Ps

8

Ps

9

Ps

10

Ps

11

Ps

12

Caracteristicas

fisiologícas

Tinción Gram - - - - - - - - - - -

Difusión de

pigmentos

fluorescente + + + + + + + + + + +

Crecimiento a 41˚C - - - - - - - - - - -

Prueba de KOH + + + + + + + + + + +

Catalasa + + + + + + + + + + +

Utilización de

fuentes de

carbono

Maltosa - - - - - - - - - - -

Adonitol - - - - - - - - - - -

Sacarosa - - - - - - - - - - -

Lactosa - - - - - - - - - - -

Inositol + + + + + + + + + + +

Ramnosa - - - - - - - - - - -

Arabinosa - - - - - - - - - - -

Sorbitol + + + + + + + + + + +

Trehalosa - - - - - - - - - - -

Celobiosa - - - - - - - - - - -

Manitol + + + + + + + + + + +

*Los resultados se registraron de 4-5 días después de la siembra de los 10 aislamientos de la bacteria en los medios de cultivos respectivos.

5.3. Pruebas moleculares para la idenficiación de la bacteria asociada a la

enfermedad.

35

Para llevar a cabo las pruebas moleculares se realizó la extracción y cuantificación

de ADN; y enseguida se corrió en electroforesis para su estabilidad antes de ser

sometida a la reacción de PCR (Figura 10).

Figura 10.- Corrida en electroforesis para determinar estabilidad de los DNA´S

carriles del 3 al 12.

En el protocolo del espectrofotómetro NanoDrop ™ a una relación de A260/280 la

pureza de los DNA debe estar entre 1.8 y 2.1, ocho de las muestras tiene pureza

absoluta y solo dos tiene residuos de proteínas, polisacáridos, polifenoles, entre

otros elementos considerados como contaminantes en el proceso de extracción

(Tabla 3).

Tabla 3. Pureza de los DNA´S a una absorbencia de A260/A280

36

Muestras

Concentración de Ácidos

nucleídos Unidad A260 A280 A260/A280

3 18.8 ng/µl 0.375 0.166 2.26

4 3.3 ng/µl 0.066 0.03 2.2

5 18.6 ng/µl 0.372 0.188 1.98

6 77.7 ng/µl 1.555 0.78 1.99

7 30.5 ng/µl 0.61 0.298 2.05

8 95.4 ng/µl 1.908 0.914 2.09

9 41.7 ng/µl 0.833 0.405 2.06

10 25 ng/µl 0.5 0.244 2.05

11 26.5 ng/µl 0.53 0.269 1.97

12 72.2 ng/µl 1.445 0.703 2.06

El análisis molecular de ADN obtenido de diez asilados de Pseudomonas syringae

pv. Lacrymans causante de la mancha angular de calabaza Kabocha, y sometido a

PCR, permitió la amplificación para lograr un producto de 1400 a 1500 pares de

bases (pb), los cuales fueron iguales en tamaño al control positivo Pseudomona

aeruginosa (figura 11).

Figura 11.- Amplificación del ADN ribosomal a partir del ADN genómico de los

aislados de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans a 1.4 pb. Carriles del 3-12

muestras, carril 13 control negativo, carril 14 marcador de peso molecular 1kb, carril

15 control positivo Pseudomona aeruginosa.

37

A continuación, la secuencia consenso se introdujo en bases de datos de acceso

público (NCBI), con el objetivo de identificar los 10 aislados mediante la comparación

con las otras secuencias depositadas, en estas bases. Actualmente, la base de

datos que presenta mayor número de consultas por su mayor versatilidad en

organismos, orígenes, genes, y tipo y número de secuencias depositadas es la base

pública GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov) con programas como BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) para el alineamiento de secuencias. Además,

GenBank contiene una sección de taxonomía (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy

que incluye información y secuencias sobre más de 160.000 organismos.

En esta base de datos se identifico de los diez aislado un solo género Pseudomonas

syringae pv. Lacrymans.

VIII. DISCUSIÓN

38

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

La mancha angular de la calabaza Kabocha se ha presentado en condiciones

epidémicas en sitios agrícolas recientes en el Municipio de Ahome; estudios previos

mencionan a esta enfermedad de las Cucurbitáceas causando pérdidas

considerables en otras zonas productoras en este tipo de hortalizas (Zitter et al.,

1996) los síntomas observados en calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome se

asemeja a los previamente reportados (Zitter et al., 1996). Sin embargo, en esta

región se manifiestan como lesiones pequeñas y acuosas a partir de los bordes de

las hojas, éstas se incrementan en tamaño e invaden hasta una tercera parte de la

lámina foliar sin delimitarse su avance por las nervaduras. En la inducción de la

mancha angular de las Cucurbitáceas se ha implicado a la bacteria Pseudomonas

syringae pv. lacrymans (Young, 1996; Kritzman y Zutra, 1983a).

Pruebas en condiciones de invernadero en el presente estudio, demostraron la

patogenicidad de seis aislados bacterianos obtenidos de calabaza Kabocha con

síntomas de mancha angular en campo en el municipio de Ahome. Estos aislados

resultaron patogénicos en la propia calabaza Kabocha así como en calabaza

zucchini y pepino. La severidad de la enfermedad en hojas inoculadas coincide con

estudios previos (Elwakil et al., 2001) donde se ha demostrado que en inoculaciones

artificiales la bacteria en más severa en estos órganos que en yemas y tallos. La

susceptibilidad de estas dos últimas especies ha sido consignada en trabajos en

otras partes del mundo (Fatmi et al., 2008). Los resultados indican que bajo las

condiciones del norte de Sinaloa, la mancha angular puede diseminarse hacia

plantaciones comerciales de pepino y calabaza zucchini los cuales cubren una

superficie de 3,066.98 y 5217.90 ha, respectivamente, en el norte de Sinaloa durante

el otoño e invierno (SIAP, 2012).

Las pruebas fisiológicas y bioquímicas indicaron que la bacteria asociada a la

mancha angular en calabaza Kabocha y cuya patogenicidad se demostró en el

mismo cultivo así como en pepino y calabaza zucchini es P. syringae pv. lacrymans

(Smith y Bryan) Yong et al. Dichas pruebas levana, oxidasa, pudrición en papa,

deshidrolasa de arginina e hipersensibilidad en tabaco (LOPAT), así como la

capacidad de los aislados para la asimilación de fuentes de carbono como son: D-

manitol, Adonitol, Insitol, D-Sorbitol, Celobisa, Trehalosa, D-Arabinosa, L-

Rhamnosa, Maltosa, Lactosa, Sacarosa (Shaad, 1980).

39

Las pruebas moleculares ubicaron a diez de los aislados como P. syringae, pero

sólo uno de ellos se identificó como P. syringae pv. lacrymans. Estudios adicionales

deberá desarrollarse para la cabal identificación de todos los aislados obtenidos en

el ciclo agrícola 2011-2012, así como los obtenidos del ciclo 2012-2013. Enseguida

se deberán desarrollar investigación sobre el estudio de la diversidad genética del

patógeno donde se aborden técnicas moleculares de Reacción en Cadena de la

Polimerasaaen combinación con Polimorfismos de Pongitud de Fragmentos de

Restricción (PCR-RFLP, por sus siglas en inglés) tal como se ha realizado en

algunos países Europeos (Olczak-Woltman et al., 2007).

Estudios adicionales sobre P. syringae pv. lacrymans deberán considerar la

sobrevivencia de este patógeno en residuos de la cosecha incorporados al suelo en

de norte de Sinaloa; en este sentido, aún cuando este tema ha sido abordado en

otras partes del mundo (Kritzman y Zutra, 1983a), los resultados no son aplicables a

esta región, pues las Cucurbitáceas se siembran durante la temporada de otoño-

invierno y el patógeno debe sobrevivir el verano, lo cual contrasta con otros estudios

donde las Cucurbitáceas se cultivan en verano y el patógeno sobrevive durante el

invierno.

Estudios previos también indican que P. syringae pv. lacrymans se transmite a

través de semilla de Cucurbitáceas (Kritzman y Zutra, 1983b; Gomah,1997;

Gustafson y Gustafson, 1980); este tema deberá considerarse en futuras

investigaciones con el fin de eliminar el patógeno de la simiente, pues esto

contribuirá de manera significativa al manejo de la enfermedad.

Finalmente, el presente estudio contribuye al conocimiento de una enfermedad de

origen bacteria en calabaza Kabocha y establece las bases para estudios futuros.

Dichos estudios tendrán aplicación práctica en el manejo de la enfermedad y de esta

forma se minimizará el impacto de la enfermedad en la producción de Cucurbitáceas

en el norte de Sinaloa.

IX. CONCLUSIONES

40

Seis aislados de la bacteria asociada la mancha angular de calabaza Kabocha

indujeron síntomas similares observados en campo al realizar pruebas de

patogenicidad en condiciones de invernadero. Los mismos aislados causaron

enfermedades en otras Cucurbitáceas tales como pepino y calabaza zucchini.

Las pruebas fisiológicas y bioquímicas indican que 10 aislamientos de la bacteria

causante de la mancha angular de calabaza kabocha en el municipio de Ahome

corresponden a Pseudomonas syringae pv. Lacrymans.

Pruebas moleculares de los 10 aislados indican que la bacteria causante de la

mancha angular de la calabaza Kabocha y otras Cucurbitáceas en el municipio de

Ahome corresponde a Pseudomonas syringae. Estudios moleculares adicionales

son necesarios para determinar la identidad a nivel patovar.

X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

41

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XI. ANEXOS

FÓRMULAS DE MEDIOS DE CULTIVO

I. MEDIOS DE AISAMIENTO

45

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http://www.textbookofbacteriology.net/

I.1 MEDIO PAPA DEXTROSA AGAR (PDA)

Infusión de Papa 200.0 g

Dextrosa 20.0 g

Agar Bacteriológico 15.0

Agua 1000.0 ml

pH 5.6 ± 0.2

Método:

Suspender 39 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación

suave hasta su completadisolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en

autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15minutos. Enfriar a una

temperatura entre 45-50 °C y vaciar en placas de Petri estériles.

I.2 MEDIO B DE KING (B. K.)

Tripteína 10.0 g

Peptona de carne 10.0 g

Fosfato dipotásico 1.5 g

Sulfato de magnesio* 7H2O 1.5 g

Agar 15.0

Agua 1000.0 ml

pH final: 7.2 ± 0.2

Método:

Suspender 38 g del polvo en un litro de agua destilada. Agregar 10 ml de

glicerina. Calentar con agitación constante para homogeneizar el producto. Llevar

a ebullición para que se disuelva por completo. Distribuir y esterilizar 15 minutos

a 121 ºC.

II. MEDIOS PARA CARACTERIZACIÓN

1.3 MEDIO AYERS UTILIZACIÓN DE FUENTES DE CARBONO

46

Fosfato monobásico de Amonio 1.0 g

Cloruro de potasio 0.2 g

Sulfato de magnesio * 7 H2O 0.2 g

Azul de bromotimol 0.03 g

Agar 12 g

Agua 1000.0 ml

pH final: 7.2 ± 0.2

Método:

Se le agrega a la concentración final 0.1 % (w/v) de la fuente de carbono y se

esteriliza en autoclave por 15 min. a 15 lb de presión.

1.4 MEDIO PARA PRODUCCIÓN DE LEVANA

Extracto de carne 3 g

Peptona 10 g

Sacarosa 50g

Agar 20g

Agua 1000.0 ml

Método:

Calentar con agitación constante para homogeneizar el producto. Llevar a

ebullición para que se disuelva por completo. Distribuir y esterilizar 15 minutos a

121 ºC.

1.5 MEDIO DE ARGININA

Peptona 1 g

Cloruro de sodio 5g

Difosfato de potasio 0.3 g

Agar 3 g

Rojo de fenol 1.0 mg

L (+) hidrocloruro de arginina 10 g

Agua 1000.0 ml

Método:

47

Disolver los ingredientes en agua destilada y ajustar el pH a 7.2; distribuir en

tubos y esterilizar a 121 ºC. durante 15 min.

III. REACTIVOS

3.1. KOH

Hidróxido de potasio químicamente puro.......................... 40 g

Creatina............................................................................. 0.3 g

Agua destilada........................................................... cbp 100 mL

Preparación:

- Agregar el hidróxido de potasio a 75 ml de agua destilada, agitando y enfriando

constantemente.

- Cuando la solución está más ó menos a temperatura ambiente (25 °C) agregar

la creatina y suficiente agua destilada para obtener un volumen final de 100 ml.

3.2. REACTIVO PARA LA PRUEBA DE LA CATALASA.

Solución acuosa de Peróxido de Hidrógeno de 10 volúmenes %

48

Tesis Anael Correcta 2013-Abril

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