TESIS · 2017-12-14 · Método fenol -sulfúrico para la determinación de azúcares totales...

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN

TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.

ESTUDIO DE LA DINÁMICA POBLACIONAL DE UN CULTIVO

MIXTO DE LEVADURAS SILVESTRES DURANTE LA

FERMENTACIÓN DE MEZCLAS DE AZÚCARES EMPLEANDO

TÉCNICAS MOLECULARES

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE

MAESTRO EN CIENCIAS EN INNOVACIÓN BIOTECNOLÓGICA

CON OPCIÓN TERMINAL EN BIOTECNOLOGÍA

AGROALIMENTARIA

PRESENTA:

L.Q.I. EDUARDO JOSÉ BURGOS VALENCIA

Director: Dra. Ingrid Mayanin Rodríguez Buenfil

Co-director: Dr. José Alberto Narváez Zapata

Asesor: Dr. Manuel Octavio Ramírez Sucre

Asesor: Dra. Guadalupe López Puc

MÉRIDA, YUCATÁN, NOVIEMBRE, 2017

JUNTA DIRECTVA

I

-JUNTA DIRECTIVA

ESTUDIO DE LA DINÁMICA POBLACIONAL DE UN CULTIVO MIXTO DE

LEVADURAS SILVESTRES DURANTE LA FERMENTACIÓN DE MEZCLAS DE

AZÚCARES EMPLEANDO TÉCNICAS MOLECULARES

Presenta: L.Q.I. Eduardo José Burgos Valencia

JUNTA DIRECTIVA

Director: Dra. Ingrid Mayanin Rodríguez Buenfil

Co-director: Dr. José Alberto Narváez Zapata

Asesor: Dr. Manuel Octavio Ramírez Sucre

Asesor: Dra. Guadalupe López Puc

DEDICATORIA

II

-DEDICATORIA

A mis padres. Por su apoyo en los momentos difíciles, así como por todo su amor brindado

durante mis 26 años de vida.

A mis familiares. Por todo el amor que me han dado y por todos los buenos momentos que

hemos pasado juntos.

A la doctora Ingrid Mayanin Rodríguez Buenfil, por sus conocimientos, su apoyo, guía y

dedicación brindados durante la realización de este proyecto.

Al doctor José Alberto Narváez Zapata, por su apoyo, dedicación y conocimientos brindados

durante mi estancia en Reynosa en el Centro de Biotecnología Genómica del IPN.

A todos mis amigos y compañeros de estudio que me dieron su apoyo desinteresado durante la

realización de este proyecto. Por todos los buenos momentos que hemos pasado y por su

convivencia, que me ha ayudado a crecer como profesionista y como persona.

AGRADECIMIENTOS

III

-AGRADECIMIENTOS

Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ)

por haberme dado la oportunidad de estudiar una maestría y de trabajar en sus instalaciones y

con sus equipos, así como por el aprendizaje adquirido durante la realización de mi tesis.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), por haberme otorgado la beca

número 590286 para la realización de mi maestría.

A mi directora de tesis la doctora Ingrid Mayanin Rodríguez Buenfil por haberme aceptado

como su estudiante de maestría, así como por su apoyo, guía y conocimientos brindados que me

permitió terminar con éxito la misma.

Al doctor José Alberto Narváez Zapata por haberme aceptado como su estudiante, así como por

sus conocimientos y apoyo brindados durante mi estancia en el Centro de Biotecnología

Genómica (CBG) del IPN. Asimismo, agradezco al CBG el haberme aceptado para trabajar en

sus instalaciones y con sus equipos durante mi estancia, que me ayudó a finalizar mi proyecto.

A mis asesores el doctor Manuel Octavio Ramírez Sucre y la doctora Guadalupe López Puc, por

su apoyo, conocimiento, seguimiento e interés en la realización de este proyeto. Asimismo, al

doctor Max Mizraím Apolinar Hernández por sus valiosas aportaciones y correcciones durante

la revisión de este trabajo.

A todos mis compañeros del CIATEJ y del CBG, que de alguna manera contribuyeron a la

realización de este trabajo. Por todos los buenos momentos que hemos pasado y por su

convivencia, que me ha ayudado a crecer como profesionista y como persona. Mis más sinceros

agradecimientos.

A todos mis amigos, gracias.

ÍNDICE DE CONTENIDO

IV

I. ÍNDICE DE CONTENIDO

-JUNTA DIRECTIVA ............................................................................................................... I

-DEDICATORIA ...................................................................................................................... II

-AGRADECIMIENTOS ........................................................................................................ III

I. ÍNDICE DE CONTENIDO ................................................................................................ IV

II. ÍNDICE DE CUADROS ................................................................................................... IX

III. ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................... XI

IV. ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS .............................................................................. XIII

1. RESUMEN ............................................................................................................................. 1

2. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 3

3. MARCO TEÓRICO/ANTECEDENTES ............................................................................ 6

3.1. Biocombustibles y bioetanol ............................................................................................ 6

3.2. Biomasa lignocelulósica. Estructura y composición ........................................................ 8

3.3. Procesos para conversión del material lignocelulósico en etanol ................................... 11

3.4. Fermentación y factores ambientales ............................................................................. 15

3.5. Microorganismos usados en la fermentación alcohólica de carbohidratos .................... 19

3.6. Rutas metabólicas para la fermentación de carbohidratos y asimilación de azúcares.... 25

3.7. Fermentación con cultivos mixtos para la producción de bioetanol ............................... 29

3.8. Técnicas para el estudio de cultivos mixtos ................................................................... 37

3.8.1. PCR Tiempo Real .................................................................................................... 43

3.8.2. rep-PCR ................................................................................................................... 47

3.9. Técnicas de tipificación de Candida spp. ....................................................................... 52

3.10. Xilulosa cinasa .............................................................................................................. 55

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ......................................................................... 58

5. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 59


V

6. HIPÓTESIS .......................................................................................................................... 60

7. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 61

7.1. Objetivo general ............................................................................................................. 61

7.2. Objetivos específicos ...................................................................................................... 61

8. METODOLOGÍA ................................................................................................................ 62

8.1. Microorganismos ............................................................................................................ 62

8.2. Medios de cultivo ........................................................................................................... 62

8.2.1. Medio de cultivo YPD ............................................................................................. 62

8.2.2. Medio de fermentación ............................................................................................ 62

8.3. Determinación de los parámetros cinéticos de crecimiento y fermentación de las

levaduras individuales en un medio sintético con mezcla de carbohidratos ......................... 63

8.3.1. Propagación de las levaduras (preparación del inóculo) ......................................... 63

8.3.2. Fermentación en un medio sintético con mezcla de carbohidratos para determinar

los parámetros cinéticos de crecimiento y de fermentación de las levaduras individuales

........................................................................................................................................... 64

8.4. Análisis in silico de la secuencia parcial de los genes XK de las cepas de C. glabrata T1

y LR2 ..................................................................................................................................... 67

8.4.1. Diseño de oligonucleótidos para la amplificación de un fragmento del gene XK en

las cepas de C. glabrata T1 y LR2 .................................................................................... 67

8.4.2. Extracción de ADN ................................................................................................. 67

8.4.3. Amplificación de los fragmentos de genes XK ........................................................ 68

8.4.4. Análisis de las secuencias amplificadas de los fragmentos del gene XK ................ 70

8.4.5. Análisis de la región promotora .............................................................................. 71

8.5. Determinación de los patrones de “fingerprinting” por REP-PCR de las cepas de C.

glabrata T1 y LR2 ................................................................................................................. 71


8.5.2. REP-PCR ................................................................................................................. 72

8.6. Establecimiento de las condiciones de fermentación de los cultivos mixtos ................. 73


VI

8.7. Determinación de los perfiles de asimilación y parámetros de fermentación de un

cultivo mixto a partir de un medio sintético con mezcla de carbohidratos ........................... 74

8.7.1. Fermentación de cultivos mixtos con inoculación simultánea en medio sintético

con mezcla de carbohidratos.............................................................................................. 74

8.8. Métodos de análisis ........................................................................................................ 75

8.8.1. Determinación de carbohidratos y etanol ................................................................ 75

8.8.2. Parámetros cinéticos de crecimiento ....................................................................... 76

8.8.3. Parámetros cinéticos de fermentación ..................................................................... 78

8.8.4. Análisis estadístico .................................................................................................. 79

9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 80

9.1. Determinación de los parámetros cinéticos de crecimiento y fermentación de los

cultivos individuales de C. glabrata LR2 y T1 en un medio sintético con mezcla de

carbohidratos ......................................................................................................................... 80

9.1.1. Crecimiento de los microorganismos individuales .................................................. 80

9.1.2. Perfil de asimilación de carbohidratos y parámetros de fermentación de los cultivos

individuales ........................................................................................................................ 85


y LR2 ..................................................................................................................................... 95

9.2.1. Diseño de oligonucleótidos para la amplificación de un fragmento de los genes XK

en las cepas de C. glabrata T1 y LR2 ............................................................................... 95


9.2.3. Amplificación de los fragmentos del gene XK ...................................................... 101

9.2.4. Análisis de las secuencias amplificadas de los fragmentos del gene XK .............. 102

9.2.4.1. Análisis de las secuencias nucleotídicas amplificadas de los fragmentos del

gene XK ....................................................................................................................... 102

9.2.4.2. Análisis de las secuencias de aminoácidos de Xk .......................................... 109

9.2.5. Análisis de la región promotora ............................................................................ 112


glabrata T1 y LR2 ............................................................................................................... 116

9.4. Establecimiento de las condiciones de fermentación de los cultivos mixtos ............... 122


VII


cultivo mixto a partir de un medio sintético con mezcla de carbohidratos ......................... 131

9.5.1. Fermentación de cultivos mixtos con inoculación simultánea en medio sintético

con mezcla de carbohidratos............................................................................................ 131

10. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 141

11. PERSPECTIVAS/RECOMENDACIONES .................................................................. 144

12. REFERENCIAS .............................................................................................................. 145

13. ANEXOS .......................................................................................................................... 163

13.1. Técnicas analíticas (Anexo 1)..................................................................................... 163

13.1.1. Método del ácido dinitrosalicílico (DNS) para azúcares redudctores libres ....... 163

13.1.2. Método de determinación de etanol con dicromato ............................................. 165

13.1.3. Método fenol-sulfúrico para la determinación de azúcares totales ..................... 167

13.2. Análisis estadístico (Anexo 2) .................................................................................... 168

13.2.1. Crecimiento y parámetros de crecimiento de los cultivos individuales de C.

glabrata T1 y LR2 ........................................................................................................... 168

13.2.2. Perfil de asimilación de carbohidratos y parámetros de fermentación de los

cultivos individuales ........................................................................................................ 170

13.2.3. Perfiles de asimilación de carbohidratos y parámetros de fermentación de los

cultivos mixtos CM1 y CM2 ........................................................................................... 176

13.2.4. Asimilación de carbohidratos totales y parámetros de fermentación de los cultivos

mixtos CM3, CM4, CM5 y CM6 .................................................................................... 183

13.3. Alineamiento múltiple de secuencias para el diseño de oligonucleótidos para la

amplificación de un fragmento del gene XK (Anexo 3) ...................................................... 187

13.4. Secuencias amplificadas del gene XK en las cepas de C. glabrata LR2 y T1 (Anexo 4)

............................................................................................................................................. 193

13.5. Resultados de BLASTn de las secuencias amplificadas (Anexo 5) ........................... 195

13.6. Mapa de dominios catalíticos de las secuencias amplificadas de XK de las cepas C.

glabrata T1 y LR2 (secuencias nucleotídicas) (Anexo 6) ................................................... 198


VIII

13.7. Matrices de distancia para los experimentos de REP-PCR de las cepas C. glabrata T1

y LR2 (Anexo 7) .................................................................................................................. 200

13.8. Presentaciones en congresos y artículos publicados (Anexo 8) ................................. 204

ÍNDICE DE CUADROS

IX

II. ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Microorganismos usados en la producción de bioetanol ......................................... 22

Cuadro 2. Ejemplos de estudios de cultvos mixtos en microorganismos en la producción de

etanol ......................................................................................................................................... 34

Cuadro 3. Estudios relacionados con la aplicación de técnicas de qPCR y rep-PCR para la

caracterización y cuantificación de microoganismos y cultivos mixtos ................................... 50

Cuadro 4. Identificación de las levaduras silvestres usadas en este trabajo ............................. 62

Cuadro 5. Medio mínimo base nitrógeno para levaduras suplementado con carbohidratos como

fuente de carbono....................................................................................................................... 63

Cuadro 6. Condiciones de reactivos usados para la PCR para la amplificación de fragmentos

de genes XK en las cepas de C. glabrata T1 y LR2 .................................................................. 69

Cuadro 7. Condiciones de reactivos usados inicialmente para la REP-PCR en las cepas C.

glabrata T1 y LR2 y en Colletotrichum AL-09 ........................................................................ 72

Cuadro 8. Diseño factorial 22 para determinar las condiciones de fermentación de cultivos

mixtos secuenciales de C. glabrata T1 y LR2........................................................................... 73

Cuadro 9. Parámetros cinéticos de crecimiento de los cultivos individuales de C. glabrata T1

y LR2 ......................................................................................................................................... 83

Cuadro 10. Consumo de carbohidratos y velocidad de consumo de carbohidratos por los

cultivos individuales de C. glabrata T1 y LR2 ......................................................................... 91

Cuadro 11. Parámetros cinéticos de producción de etanol de los cultivos individuales de C.

glabrata T1 y LR2 ..................................................................................................................... 92

Cuadro 12. Lista de oligonucleótidos propuestos para la amplificación de fragmentos del gene

XK .............................................................................................................................................. 97

Cuadro 13. Parejas de oligonucleótidos propuestas para la amplificación de los fragmentos del

gene XK ..................................................................................................................................... 98

Cuadro 14. Cuantificación y determinación de la pureza del ADN extraído de T1 y LR2 ..... 99

ÍNDICE DE CUADROS

X

Cuadro 15. Regiones regulatorias predichas por la plataforma SCDP The Promoter Database

of Saccharomyces cerevisiae ................................................................................................... 114

Cuadro 16. Cantidad de reactivos usados para la REP-PCR en las cepas C. glabrata T1 y LR2

y en Colletotrichum AL-09 con las condiciones ajustadas...................................................... 116

Cuadro 17. Parámetros cinéticos de fermentación para los cultivos mixtos CM3, CM4, CM5 y

CM6 de C. glabrata T1 y LR2 ............................................................................................... 127

Cuadro 18. Consumo de carbohidratos y velocidad de consumo de carbohidratos por los

cultivos mixtos CM1 y CM2 de C. glabrata T1 y LR2 .......................................................... 135

Cuadro 19. Parámetros cinéticos de producción de etanol para los cultivos mixtos CM1 y CM2

de C. glabrata T1 y LR2 ......................................................................................................... 136

ÍNDICE DE FIGURAS

XI

III. ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Diferentes tipos de hemicelulosa. ............................................................................... 9

Figura 2. Representación esquemática de la estructura básica de la pared celular de las plantas

................................................................................................................................................... 10

Figura 3. Estructura de la lignina ............................................................................................. 10

Figura 4. Procesos para convertir la biomasa lignocelulósica en etanol. ................................. 15

Figura 5. Catabolismo de las hexosas en S. cerevisiae. ........................................................... 27

Figura 6. Catabolismo de la xilosa y la arabinosa en S. cerevisiae genéticamente modificada.

................................................................................................................................................... 28

Figura 7. Ejemplo de curvas de amplificación en PCR Tiempo Real. ..................................... 44

Figura 8. Ejemplo de curvas de desnaturalización de ADN. .................................................... 45

Figura 9. Secuencias REP, ERIC y BOX en microorganismos ............................................... 48

Figura 10. Estructura general de las ATPasas .......................................................................... 56

Figura 11. Esquema de las cinéticas de fermentación de los cultivos individuales y mixtos en

medio mínimo con mezcla de carbohidratos ............................................................................. 65

Figura 12. Esquema del procesamiento de las muestras .......................................................... 66

Figura 13. Condiciones de temperatura y número de ciclos de la PCR para la amplificación de

fragmentos de genes XK en las cepas de C. glabrata T1 y LR2 ............................................... 69

Figura 14. Condiciones de temperatura y número de ciclos de la REP-PCR en las cepas C.

glabrata T1 y LR2 y de Colletotrichum AL-09 ........................................................................ 72

Figura 15. Crecimiento de las cepas C. glabrata T1 y LR2 en cultivo individual ................... 81

Figura 16. Gráfica de medias para parámetros cinéticos de crecimiento en cultivos individuales

de las cepas de C. glabrata T1 y LR2 ....................................................................................... 84

Figura 17. Consumo de carbohidratos y producción de etanol por las cepas de C. glabrata T1

y LR2 ......................................................................................................................................... 87

ÍNDICE DE FIGURAS

XII

Figura 18. Gráfica de medias para parámetros cinéticos de fermentación de C. glabrata T1 y

LR2 ............................................................................................................................................ 93

Figura 19. Extracción de ADN de las muestras de C. glabrata T1 y LR2 ............................... 99

Figura 20. Resultados de la PCR con los oligonucleótidos para XK en C. glabrata T1 y LR2.

................................................................................................................................................. 101

Figura 21. Alineamiento de las secuencias XK amplificadas de C. glabrata T1 y LR2 y

secuencias relacionadas. .......................................................................................................... 106

Figura 22. Árbol filogenético de XK con las secuencias de las cepas de C. glabrata T1 y LR2

y secuencias relacionadas en levaduras ................................................................................... 107

Figura 23. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de Xk de C. glabrata T1 y LR2 y

algunas secuencias de Xk de otros organismos ....................................................................... 110

Figura 24. Mapa de regiones catalíticas de las secuencias de aminoácidos de Xk de C. glabrata

T1 y LR2. ................................................................................................................................. 111

Figura 25. Mapa de las posibles regiones regulatorias en la secuencia de C. glabrata

(CR380953: 890248-891247) .................................................................................................. 113

Figura 26. Patrones de bandeo obtenidos por REP-PCR en C. glabrata T1 y LR2. .............. 120

Figura 27. Consumo de carbohidratos y producción de etanol por los cultivos mixtos CM3,

CM4, CM5 y CM6 de C. glabrata T1 y LR2 .......................................................................... 125

Figura 28. Diagramas de Pareto para los parámetros cinéticos de fermentación de los cultivos

mixtos CM3, CM4, CM5 y CM6 de C. glabrata T1 y LR2 .................................................... 128

Figura 29. Consumo de carbohidratos y producción de etanol por los cultivos mixtos CM1 y

CM2 de C. glabrata T1 y LR2 ................................................................................................ 133

Figura 30. Gráfica de medias para los parámetros cinéticos de producción de etanol los cultivos

mixtos CM1 y CM2 de las cepas de de C. glabrata T1 y LR2 ............................................... 137

ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

XIII

IV. ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

Símbolo Definición

°C Grados Celsius

ΔG Energía libre de Gibbs

ADH Alcohol deshidrogenasa

AFLP

Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (en inglés “Amplified Fragment Length

Polymorphism”)

AI L-arabinosa isomerasa

ANOVA Análisis de varianza (en inglés “ANalysis Of VAriance”)

AR L-arabinosa reductasa

ARDRA

Análisis de restricción del ADN ribosomal amplificado (en inglés “Amplified Ribosomal DNA

Restriction Analysis”)

BLAST Programa “Basic Local Alignment Search Tool”

CBC Bioproceso consolidado (en inglés “Consolidated Bioprocessing”)

CLPP

Perfil del nivel fisiológico de la comunidad (en inglés “Community Level Physiological

Profile”)

CM1 Cultivo mixto con inoculación simultánea incubado a 35 ºC

CM2 Cultivo mixto con inoculación simultánea incubado a 40 ºC

CM3 Cultivo mixto con inoculación secuencial T1 (0 h) y LR2 (72 h) incubado a 35 ºC

CM4

CM5

Cultivo mixto con inoculación secuencial LR2 (0 h) y T1 (72 h) incubado a 35 ºC

Cultivo mixto con inoculación secuencial T1 (0 h) y LR2 (72 h) incubado a 40 °C

CM6 Cultivo mixto con inoculación secuencial LR2 (0 h) y T1 (72 h) incubado a 40 °C

Cq Ciclo de cuantificación

CRBF Sistema de fermentación en batch con reciclamiento de células (en inglés “Cellular Recycle

Batch Fermentation”)

DGGE

Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (en inglés “Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis)

DNS Ácido 3,5-dinitrosalicílico

ED Entner-Doudoroff (ruta metabólica)

EMP Embden–Meyerhoff–Parnas (ruta metabólica)

ERIC-PCR

PCR de secuencias consenso repetitivas intragénicas de enterobacterias (en inglés

“Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR”)

FAME Metil-ésteres de ácidos grasos (en inglés “Fatty Acid Methyl Ester”)

FISH Hibridación fluorescente in situ (en inglés “Fluorescence in situ Hybridization”)


XIV


g Gramos

GRAS Generalmente reconocido como seguro (en inglés “Generally Recognized As Safe”)

h Horas

HMF Hidroximetilfurfural

HPLC Cromatografía líquida de alta resolución (en inglés “High-Performance Liquid

Chromatography”)

dHPLC HPLC en condiciones desnaturalizantes

HXT Transportadores de hexosas

ITS Espaciador interno transcrito (en inglés “Internal Transcribed Spacer”)

kcal Kilocaloría

L Litros

L-RPE L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa

LAD L-arabitol-4-deshidrogenasa

LXR L-xilulosa reductasa

M Molar

m Metro

min Minutos

MS Espectrómetro de masas

μ Velocidad de crecimiento

nm Nanómetro

NCBI Centro Nacional para la Información Biotecnológica (en inglés “National Center for

Biotechnology Information”)

PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida (en inglés “Polyacrilamide gel electrophoresis”)

pb Pares de bases

PCR Reacción en cadena de la polimerasa (en inglès “Polymerase Chain Reaction”)

qPCR PCR Tiempo Real, PCR Cuantitativa

pH Logaritmo negativo de la actividad de los iones hidronio (H+)

PLFA Ácidos grasos fosfolipídicos (en inglés “Phospholipid fatty acid”)

Pmax o Qp Productividad máxima

ppm Partes por millón (mg·L-1)

PPP Ruta de las pentosas-fosfato (en ingles “Pentose Phospate Pathway”)

PTFE Polifluoroetileno


XV


RAPD

ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (en inglés “Randomly Amplified Polymorphic

DNA”)

REP-PCR PCR de secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas (en inglès “Repetitive Extragenic

Palindromic-PCR”)

rep-PCR PCR de elementos repetitivos (en inglès “repetitive element PCR fingerprinting”)

RFLP

Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (en inglés “Restriction Fragment

Length Polymorphism”)

RGE “Rapid Growth Element”

RISA

Análisis de espaciadores intergénicos ribosomales (en inglés “Ribosomal Intergenic Spacer

Analysis”)

RK L-ribulocinasa

rp Velocidad de producción de etanol

rpm Revoluciones por minuto

rs Velocidad de consumo de sustrato

s Segundos

SDA Agar dextrosa Sabouraud

SHF Hidrólisis y fermentación separadas (en inglés “Separate Hydrolysis and Fermentation”)

SSCF

Sacarificación y co-fermentación simultáneas (en inglés “Simultaneous Saccharification and

Co-Fermentation”)

SSCP

Polimorfismo conformacional de una cadena (en inglés “Single-Strand Conformational

Polymorphism”)

SSF

Sacarificación y fermentación simultáneas (en inglés “Simultaneous Saccharification and

Fermentation”)

T-RFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (en inglés “Terminal

Restriction Fragment Length Polymorphism”)

TAE Buffer Tris-acetato-EDTA

Td Tiempo de duplicación

TGGE Electroforesis en gel con gradiente de temperatura (en inglés “Temperature Gradient Gel

Electrophoresis”)

Tm Temperatura “melting” del ADN

UPGMA Algoritmo “Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean”

UPLC Cromatografía líquida de ultra resolución (en inglés “Ultra Performance Liquid

Chromatography”)


XVI


V Volt

vvm Volumen de aire/volumen de medio·min

WGD “Whole Genome Duplication”

YPD Medio extracto de levadura, peptona, dextrosa

Yp/s Constante de rendimiento de etanol

Yx/s Constante de rendimiento de biomasa

XDH Xilitol deshidrogenasa

XI Xilosa isomerasa

XR Xilosa reductasa

XK Xilulosa cinasa

RESUMEN

1

1. RESUMEN

Se emplearon dos cepas de Candida glabrata, una aislada del líquido ruminal bovino (LR2) y

otra del estómago de termita (T1) para la fermentación de una mezcla de azúcares en

proporciones similares a las encontradas en desechos de cítricos (51% glucosa, 30% fructosa,

8% galactosa, 7% arabinosa, 2% xilosa y 2% sacarosa). Primero, se determinó el perfil de

asimilación y los parámetros cinéticos de fermentación de las levaduras en cultivos individuales.

Las fermentaciones se llevaron a cabo a 35 °C y 200 rpm para T1 y a 40 °C y 200 rpm para

LR2. La cepa LR2 tuvo mayor población celular y biomasa, mientras que la cepa T1 tuvo mayor

velocidad de crecimiento y menor tiempo de duplicación. Ambas cepas tuvieron una producción

similar de etanol, pero diferentes productividades. La cepa T1 produjo 24.28±0.78 g·L−1 de

etanol con una productividad máxima de 4.05±0.13 g·L−1·día-1, mientras que LR2 produjo

21.36±1.41 g·L−1 en menos tiempo, con una productividad de 5.84 ± 0.38 g·L−1·día-1. Al día de

máxima producción de etanol, T1 tuvo mejor asimilación de glucosa (90.03±0.33%), fructosa

(82.69±0.41%), galactosa (52.64±0.71%) y xilosa (56.75±0.66%), mientras que LR2 destacó

por su mayor consumo de arabinosa en los cultivos individuales (60.00±0.45%). Luego, se

determinó la acumulación y la productividad del etanol en cultivos mixtos con inoculación

simultánea, CM1 y CM2. El primero (CM1) fue incubado a 35 ºC y 200 rpm y tuvo una

producción similar a la obtenida en el cultivo de T1 (24.32±1.0 g·L−1), aunque la menor

productividad máxima (3.47±0.14 g·L−1·día-1). Al día de máxima producción, también tuvo un

mayor consumo de glucosa (94.81±0.12%) y de arabinosa (62.12±0.42%) con respecto a T1,

LR2 y CM2. El cultivo CM2 fue incubado a 40 °C y 200 rpm, produciendo 11.59±1.21 g·L−1

de etanol, y destacando por su productividad máxima y velocidad de producción, más altas que

en los otros cultivos individuales y mixtos (6.98±0.73 g·L−1·día-1 y 0.128±0.004 g·L−1·h-1,

respectivamente). Los cultivos mixtos con inoculación secuencial fueron los menos eficientes

en la producción de etanol, siendo los más destacables los cultivos incubados a 35° C: CM3,

con una producción de etanol de 12.80±0.51 g·L−1, y CM4, con una producción de 11.97±0.39

g·L−1. Sin embargo, produjeron etanol lentamente y tuvieron productividades máximas de

1.83±0.07 g·L−1·día-1 y 2.00±0.07 g·L−1·día-1, respectivamente, más bajas que en los cultivos

de T1 y LR2, CM1 y CM2.

RESUMEN

2

Considerando las diferencias observadas en el perfil de asimilación de xilosa para estas cepas

individuales, como primera estrategia, se seleccionó al gene xilulosa cinasa (XK) como probable

gene marcador para diferenciar a las cepas individuales en los cultivos mixtos. Para esto se

diseñaron oligonucleótidos específicos para tres diferentes fragmentos del gene XK con el fin

de obtener el mayor número de polimorfismos posibles, y se analizaron las secuencias obtenidas

de las cepas T1 y LR2. Para ambas cepas, el conjunto de oligos F1-XK/R1-XK obtuvó un

fragmento de 196 pb, el F1-XK/R2-XK uno de 190 pb y el F1-XK/R3-XK uno de 356 pb. Las

secuencias presentaron alta identidad (98-99%) con secuencias de XK de C. glabrata

encontradas en el GenBank. Las regiones amplificadas traducidas a sus secuencias de

aminoácidos presentaron los dominios de carbohidrato-cinasas (Connect 1 y Phospate 2),

residuos de aminoácidos de unión de xilulosa, Mg2+ y ATP, y un residuo catalítico de aspartato.

Las secuencias amplificadas con el mismo juego de oligonucleótidos tuvieron 100% de

identidad para ambas cepas, aunque sí fue posible identificar dos alelos del mismo gene,

presentes en ambas cepas. Los fragmentos amplificados con los oligos F1-XK/R1-XK y F1-

XK/R3-XK se diferenciaron sólo en la longitud y podrían tratarse del mismo alelo. El alelo

amplificado con el conjunto F1-XK/R2-XK presentó una identidad de 98.94% con respecto a

los otros dos fragmentos, teniendo una diferencia de dos bases con respecto los otros dos grupos.

La identidad entre las secuencias obtenidas impidió usar este gene para diferenciar a las

levaduras en cultivos mixtos. Como estrategia adicional en la diferenciación de estas cepas

utilizando al gene XK se realizó un análisis de una región 1000 pb río arriba de una secuencia

putativa de este gene en C. glabrata (numero de accesión CR380953) encontrada en el GenBank

y se halló un elemento GCR1, regulador de enzimas glucolíticas y de la gluconeogénesis que

podría servir para este propósito. Como segunda estrategia para la discriminación de estas cepas

se utilizó la técnica fingerprinter (REP-PCR), la cual genero un perfil de bandas similar para

ambas cepas, aunque si mostró de una a tres bandas especificas para la cepa T1 o LR2. No

obstante, estas bandas fueron poco reproducibles por las limitaciones de la técnica y no se

recomendó su uso para discriminar ambas cepas en cultivos mixtos.

INTRODUCCIÓN

3

2. INTRODUCCIÓN

El creciente interés en la producción de fuentes de energía alternativa debido al incremento en

la demanda energética, el agotamiento de combustibles fósiles, la preocupación de países en

temas de seguridad energética y la contaminación ambiental han llevado a una creciente

investigación y desarrollo en fuentes de energía renovables y sustentables. El bioetanol es una

fuente de energía alternativa que puede usarse como complemento de los combustibles fósiles

(Balat, Balat y Öz, 2008). Se obtiene mediante la fermentación alcohólica empleando

microorganismos como bacterias y levaduras, los cuales utilizan los carbohidratos de un sustrato

para producir bioetanol. Entre los sustratos de mayor interés en la producción de bioetanol se

encuentran la biomasa vegetal, y particularmente los residuos agrícolas y forestales. Esto es

debido a la abundancia del material lignocelulósico y a la abundancia de los residuos de origen

vegetal, dándoles de este modo un uso para la obtención de un producto de valor agregado al

mismo tiempo que ayuda a disminuir la acumlación de éstos en el ambiente (Gupta y Verma,

2015). La biomasa lignocelulósica contiene azúcares (hexosas y pentosas) como la glucosa, la

galactosa, la xilosa y la arabinosa. Una fermentación económicamente viable requiere que los

microorganismos sean capaces de utilizar todos los azúcares presentes en el sustrato,

produciendo etanol. Sin embargo, los microroganismos presentan capacidades preferenciales

por algunos azúcares, como la glucosa, y son pocos los microroganismos silvestres capaces de

utilizar eficientemente todos los azúcares de un sustrato. Saccharomyces cerevisiae es un

microorganismo tradicionalmente empleado en las fermentaciones debido a su capacidad de

fermentar hexosas y producir altas cantidades de etanol en altas concentraciones de azúcar. Sin

embargo, las cepas silvestres no son eficientes para utilizar las pentosas (Tesfaw y Assefa,

2014). Otros microorgansmos pueden utilizar hexosas y pentosas, sin embargo, requieren

condiciones estrictas y tienen menor tolerancia al etanol y otros inhibidrores, así como menor

capacidad de producción de etanol en comparación con S. cerevisiae (Jönsson, Alriksson y

Nilvebrant, 2013; Mohd Azhar et al., 2017). Otra limitación es que, al encontrarse en mezclas

de azúcares, presentan preferencias, especialmente por la glucosa, dando como resultado un uso

incompleto e ineficiente de los demás azúcares. Una alternativa para superar estas limitaciones

es el uso de cultivos mixtos de microroganismos con diferentes preferencias por los azúcares y

capacidades en la producción de etanol (Prijambada, Hidayat y Widianto, 2013; Jiang et al.,

INTRODUCCIÓN

4

2017). Se ha demostrado que estos cultivos pueden tener una fermentación más eficiente de los

carbohidratos presentes en los materiales lignocelulósicos. Por ejemplo, Singh et al. (2017)

usaron cocultivos de cepas celulolíticas y xilanolíticas de Clostridium sp., así como una cepa de

Thermoanaerobacter fermentadora de azúcares pero incapaz de hidrolizar carbohidratos

complejos, para fermentar sustratos como avicel, xilano y paja de arroz, observando que la

producción de etanol fue superior en los cocultivos en comparación a los monocultivos. En otro

trabajo, Jahnke et al. (2016) usaron cepas de S. cerevisiae y Aspergillus oryzae para la

producción de etanol a partir de maltodextrinas. La levadura fue incapaz de usar las

maltodextrinas, mientras que A. oryzae fue capaz de hidrolizar estos carbohidratos y consumir

los azúcares liberados, pero no produjo etanol. La combinación de ambas cepas fue capaz de

hidrolizar las maltodextrinas y producir etanol. Para el mejor entendimiento de este tipo de

cultivos es importante conocer los cambios poblacionales que se dan durante la fermentación

para lo cual es necesario poder difereciar los distintos microorganismos que los componen. Las

técnicas de biología molecular son una herramienta que permite el monitoreo de los diferentes

microorganismos, aún cuando sean fenotípicamente similares. Estos métodos dan información

en varios aspectos de las comunidades microbianas, tales como la diversidad filogenética y

funcional, la detección o identificación de microorganismos y la dinámica poblacional, usando

secuencias de ADN como marcadores moleculares para poder caracterizarlos (Nagarajan y Loh,

2014).

Recientemente se ha estudiado la capacidad fermentativa de cepas de Candida glabrata

silvestres que tienen la capacidad de asimilar hexosas y pentosas (glucosa, fructosa, galactosa,

xilosa y arabinosa) en mezcla. Además, se ha observado que tienen diferente capacidad de

asimilación de xilosa (Estrada-Martínez, 2013). Una enzima clave en la ruta de asimilación de

la xilosa en los microorganismos es la xilulosa cinasa (XK: E.C.2.7.1.17) (Chandel et al., 2011).

Una propuesta es usar el gen de XK como marcador molecular para estudiar la dinámica

poblacional de cultivos mixtos de cepas de C. glabrata aisladas de líquido ruminal bovino (LR2)

y estómago de termita (T1), que tienen una capacidad diferente en su asimilación de xilosa

(Estrada-Martínez, 2013), por lo que se espera podrían tener diferencias en su secuencia que

permitan distinguirlas por medio de técnicas de biología molecular.

INTRODUCCIÓN

5

En este trabajo se determinaron los perfiles de asimilación de mezclas de hexosas y pentosas

comúnes en residuos cítricos de las cepas LR2 y T1, tanto en cultivos individuales como en

cultivos mixtos y se determinaron sus parámetros cinéticos de fermentación. Asimismo, se

compararon secuencias parciales del gene XK de ambas levaduras, con el fin de encontrar

semejanzas y diferencias para determinar su factibilidad de ser usados como marcadores

moleculares para discriminar a las cepas entre sí. Adicionalmente, se probó la técnica

fingerprinter (REP-PCR) con el fin de diferenciar a LR2 de T1.

MARCO TEÓRICO/ANTECEDENTES

6

3. MARCO TEÓRICO/ANTECEDENTES

3.1. Biocombustibles y bioetanol

Se le llama biocombustibles a todos aquellos productos de tipo renovable que se obtienen a

través de diversas transformaciones biológicas de la biomasa (biodiesel, alcoholes, hidrógeno),

o bien, materia prima que se origina a partír de ésta, y que se usan como energía en diversas

aplicaciones como por ejemplo: en la generación de electricidad, en la generación de calor para

aplicaciones industriales y domésticas y como combustible para vehículos (Salinas-Callejas y

Gazca-Quezada, 2009). La investigación y uso de éstos están motivados por razones tales como:

la reducción de la contaminación causada por el uso de combustibles fósiles, como por ejemplo

en la emisión de gases de efecto invernadero; el uso de biocombustibles en combinación con los

combustibles fósiles mejora la calidad de éstos; la reducción de la dependencia de los países

hacia los combustibles fósiles (seguridad energética); la creciente demanda energética en el

mundo y agotamiento de los combustibles fósiles, haciendo necesaria la búsqueda de nuevas

fuentes de energía renovable (Valentine et al., 2012; Gupta y Verma, 2015; Chen, Smith y

Wolcott, 2016).

De acuerdo a Janda, Kristoufek y Zilberman (2012), los biocombustibles se pueden clasificar

en biocombustibles convencionales (de primera generación) y biocombustibles avanzados

(segunda, tercera y cuarta generación). Los biocombustibles de primera generación se producen

a partir de materia prima como cultivos alimentarios ricos en almidón o azúcar o en aceites

vegetales. Los biocombustibles de segunda generación son producidos a partir de partes

residuales de cultivos, como hojas, tallos y cáscaras que no se utilizan con propósitos

alimentarios, residuos de la industria maderera, así como cultivos no alimenticios, tales como

“switchgrass”, jatropha, especies del género Miscanthus (cultivos energéticos). Los

biocombustibles de tercera generación se obtienen a partir de algas y los de cuarta generación

provienen de procedimientos que no pertenecen a las otras categorías (reacciones de la

fotosíntesis artificial, organismos genéticamente modificados para secretar hidrocarburos).

Uno de los biocombustibles de mayor investigación en la actualidad es el bioetanol. Balat, Balat

y Öz (2008) lo definen como el etanol que se usa como combustible y que se produce a partir


7

de biomasa como materia prima empleando tecnologías de conversión. Suele usarse en mezcla

con la gasolina, mejorando propiedades combustibles como el índice de octano (parámetro de

calidad de la gasolina). El etanol es un atractivo combustible debido a que se obtiene de recursos

renovables y es un combustible oxigenado, lo que hace que su combustión sea más eficiente y

permite reducir la emisión de contaminantes como partículas, hidrocarburos y monóxido de

carbono.

El bioetanol se puede clasificar en bioetanol de primera generación y bioetanol de segunda

generación. Actualmente, el bioetanol es producido principalmente por Estados Unidos de

América a partir del maíz y por Brasil a partir de caña de azúcar. Sin embargo, la expansión de

su producción a partir de cultivos alimentarios, como el maíz, se ha cuestionado por la

competición de los cultivos con los alimentos y consiguiente aumento del precio de éstos. Por

otro lado, el etanol de segunda generación es generalmente producido a partir de biomasa

lignocelulósica, como residuos agroindustriales, o bien, cultivos energéticos (pastos o árboles

plantados especialmente para la producción de biocombustibles) (Gupta y Verma, 2015). Los

beneficios de producir bioetanol de segunda generación a partir de residuos agroindutriales y

cultivos energéticos sobre los sustratos empleados en el bioetanol primera generación son la

abundancia de la biomasa lignocelulósica y de los residuos de naturaleza lignocelulósica,

haciendo esta materia prima potencial para la producción de etanol, al mismo tiempo ayudando

en la solución de la disposición de residuos, contribuyendo en la disminución de su acumulación

y en los problemas ambientales que conlleva (Gupta y Verma, 2015; Karmee, 2016) Además,

los cultivos energéticos, como el Miscathus, pueden crecer en tierras marginales sin necesitar

tantos insumos a diferencia de los cultivos alimentarios como el maíz (Valentine et al., 2012).

Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar la tecnología para aprovechar los carbohidratos

presentes en el material lignocelulósico para la conversión en etanol.


8

3.2. Biomasa lignocelulósica. Estructura y composición

La lignocelulosa representa el material orgánico más abundante en la biosfera. Se trata de un

complejo formado por varios polímeros como la lignina, la hemicelulosa y la celulosa y otros

componentes como lípidos, pectinas y proteínas. Forma parte de las paredes celulares de las

plantas. Se puede encontrar en materiales como por ejemplo: tallos de plantas herbáceas; las

cortezas y hojas de los árboles; el bagazo de caña; los tallos de maíz y algodón; la cáscara de

arroz, avena, cacahuate, cítricos, frutos secos; la paja de cereal (Chandel et al., 2011; Fernández-

González et al., 2015). La celulosa es un homopolímero de glucosa, en donde los residuos de

glucosa están unidos por enlaces β(1,4) (Nelson y Cox, 2014). La celulosa se encuentra

comúnmente organizada en microfibrillas de 3-6 nm de diámetro que contienen alrededor de 36

cadenas de glucano, cada una con miles de residuos de glucosa. Los enlaces de hidrógeno entre

las moléculas de glucosa conducen a una estructura de matriz fuerte y cristalina. De acuerdo al

grado de cristalinidad, la celulosa puede ser clasificada en celulosa cristalina y amorfa (Zheng,

Pan y Zhang, 2009). La hemicelulosa es un heterogéneo de polisacáridos lineales o ramificados

compuestos de diferentes azúcares y derivados de azúcar como la glucosa, la manosa, la

galactosa, la xilosa, la arabinosa y el ácido galacturónico. Dichos residuos pueden estar

metilados o acetilados. La mayoría de los polímeros de hemicelulosa presentan enlaces β(1,4)

en los azúcares que componen la cadena principal. En general, las cadenas de los polímeros de

hemicelulosa son más cortas que las de la celulosa (500-3000 unidades de azúcares en la

hemicelulosa en comparación a 7000-15000 unidades de glucosa en la celulosa) (Chandel et al.,

2011). La composición de los diferentes heteropolímeros y, por lo tanto, de monosacáridos varía

según la naturaleza del material lignocelulósico. Entre los tipos de hemicelulosa se encuentran

los glucuroxilanos, galactoglucomananos, arabinoglucuronoxilanos, xiloglucanos,

arabinoxilanos y homoxilanos (Gírio et al., 2010). Algunos ejemplos de moléculas de

hemicelulosa se muestran en la Figura 1. La hemicelulosa está embebida en la pared celular,

unida, junto con las pectinas, a la celulosa, formando una red de fibras que rodean cada fibra de

celulosa, resultando en conjunto en una matriz compleja (Figura 2). La lignina es un conjunto

de polímeros aromáticos unidos a la hemicelulosa a través de enlaces covalentes. Los polímeros

de lignina están compuestos por unidades de naturaleza hidroxifenilpropanoide entrecruzadas

por medio de diferentes tipos de enlaces químicos (Figura 3). El tipo de unidad más habitual


9

pertenece al grupo de ácidos hidroxicinámicos y sus formas alcohólicas. Se encuentran

localizados en la pared celular de las plantas y aportan rigidez e impermeabilidad (Vanholme et

al., 2010; Achinas y Euverink, 2016).

Figura 1. Diferentes tipos de hemicelulosa. Se muestran las unidades de monómeros que conforman algunos

polímeros de hemicelulosa (Modificado de Pascual-Valero et al., 2012).


10

Figura 2. Representación esquemática de la estructura básica de la pared celular de las plantas mostrando la

disposición de la celulosa y la hemicelulosa (Modificado de Chandel et al., 2011).

Figura 3. Estructura de la lignina.


11

3.3. Procesos para conversión del material lignocelulósico en etanol

Existen cuatro procedimientos para la conversión de biomasa lignocelulósica en etanol, los

cuales se muestran en la Figura 4. En general, los procedimientos de conversión de la biomasa

lignocelulósica constan de tres pasos principales: pretratamiento, hidrólisis y fermentación. El

pretratamiento es la etapa en la cual por medio de procedimientos mecánicos, fisicoquímicos o

biológicos los carbohidratos se hacen más accesibles para los tratamientos de hidrólisis y

fermentación posteriores. Una de las dificultades en la conversión de la lignocelulosa en etanol

es su naturaleza recalcitrante, es decir su resistencia inherente a enzimas, microorganismos o

químicos. Esto se debe a la misma estructura compleja de la lignocelulosa, es decir, la presencia

de lignina, la organización y unión por enlaces covalentes y no covalentes de las fibras de

celulosa, hemicelulosa y lignina en la matriz lignocelulósica o la estructura cristalina de la

celulosa (Kumar et al., 2016). El pretratamiento ayuda a disminuir la recalcitrancia. En general,

los pretratamientos deben lograr romper la estructura de la lignocelulosa para aumentar la

accesibilidad de la celulosa y la hemicelulosa, preservando dichas fracciones y minimizando la

formación de productos de degradación, al mismo tiempo deben ser económicos. Los métodos

de pretratamiento se pueden dividir en i) físicos (molienda, pirolisis, ultrasonido, microondas);

ii) fisicoquímicos (explosión de vapor, hidrotermólisis, oxidación húmeda, tratamiento con

amonio), iii) químicos (tratamientos con ácidos, con bases, con agentes oxidantes, ozonólisis,

organosolv), iv) biológicos (tratamiento con microorganismos como los hongos de pudrición

blanca). También se pueden emplear una combinación de estos métodos aprovechando sus

diferentes beneficios (Kumar y Sharma, 2017).

En la hidrólisis o sacarificación se usan enzimas como celulasas, xilanasas,

arabinofuranosidadas, mananasas, manosidasas o galactosidadas, para hidrolizar los

polisacáridos (celulosa y hemicelulosa) en sus monómeros. Las enzimas son secretadas por

microorganismos como Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Aspergillus, Fusarium o

Trichoderma y pueden usarse solas o inoculando al microorganismo. En esta etapa existen retos

para desarrollar procesos económicamente viables con altos rendimientos de hidrólisis (Gupta

y Verma, 2015). De acuerdo a Madadi (2017), los factores que afectan la hidrólisis enzimática

pueden dividirse en los relacionados con el sustrato y los relacionados con la enzima. Entre los


12

primeros se encuentran el contenido de lignina que afecta la accesibilidad de los sustratos a la

enzima, el tamaño de partícula, el área superficial accesible, el grado de cristalinidad y

polimerización de la celulosa. En la segunda categoría se encuentran la actividad enzimática, su

estabilidad (térmica, pH), el costo de producción y la dosis de enzima aplicada. También es

importante conocer las condiciones óptimas de factores como temperatura, pH y tiempo de

incubación. El alto costo de la celulosa y otras enzimas hidrolíticas son dificultades en la

comercialización de la biomasa lignocelulósica para su conversión en etanol. La baja

accesibilidad de las enzimas a sus sustratos, la inhibición de las enzimas por componentes

generados en el pretratamiento o en la hidrólisis o fermentación (oligómeros, glucosa, etanol) o

los bajos rendimientos de sacarificación obtenidos en condiciones industriales, como por

ejemplo en sustratos con altos contenidos de sólidos, afectan la eficiencia de los tratamientos

enzimáticos y son razones para el aumento de las dosis enzimáticas para alcanzar rendimientos

de sacarificación industrialmente aceptables, y por consiguiente los costos de producción de la

enzima. El control de factores tales como las condiciones de reacción, la cantidad de sustrato a

las óptimas dosis enzimáticas y pretratamientos efectivos para disminuir la recalcitrancia del

sustrato son recomendaciones para el aumento de los rendimientos con un funcionamiento

óptimo de las enzimas. El uso de microorganismos genéticamente modificados que secreten

enzimas más eficientes, materia prima genéticamente modificada con menor contenido de

lignina y alto contenido de carbohidratos, así como la adopción de estrategias como la

sacarificación y fermentación simultáneas son métodos que se están ensayando para el aumento

de la eficiencia y disminución de los costos de las enzimas (Kumar et al., 2016; Madadi, 2017).

La fermentación es la etapa en la cual los azúcares hidrolizados son convertidos en bioetanol

por medio de la fermentación alcohólica realizada por microorganismos, que pueden ser

silvestres, híbridos o genéticamente modificados. En esa etapa se encuentra el obstáculo de

fermentar eficientemente las hexosas y pentosas del sustrato, para lo cual se necesita de

microorganismos capaces de fermentar completamente los azúcares con altos rendimientos y

productividades, tolerar las altas concentraciones de etanol, el estrés osmótico y altas

temperaturas, además de ser tolerantes a los inhibidores presentes en los hidrolizados (Mohd

Azhar et al., 2017).


13

Los procedimientos o configuraciones mostrados en la Figura 4 para la producción de etanol a

partir de biomasa lignocelulósica son hidrólisis y fermentación separadas (SHF), sacarificación

y fermentación simultáneas (SSF), sacarificación y co-fermentación simultáneas (SSCF), y el

bioprocesamiento consolidado (CBP). En el proceso de SHF la separación de los procesos de

hidrólisis y fermentación permite operar las enzimas o microorganismos del proceso de

sacarificación y a los microoganismos en el proceso de fermentación a sus óptimas de

incubación cuando estas son distintas (Mohd Azhar et al., 2017). Sin embargo, una desventaja

es que la disminución de los rendimientos de sacarificación debido productos que inhiben la

actividad enzimática, como la glucosa (Olofsson, Bertilsson y Lidén, 2008). En la SSF la

sacarificación y la fermentación ocurren en el mismo reactor. El proceso SSF tiene ventajas con

respecto al proceso SHF: reducción de los productos de inhibición (acumulación de azúcares)

de las enzimas hidrolíticas, reducción de los costos de operación debido al menor número de

reactores necesitados. Desventajas de este procedimiento son: las diferencias en las

temperaturas óptimas de las enzimas hidrolíticas y los microoganismos fermentadores, siendo

generalmente las primeras temperaturas más altas que las del proceso fermentativo. En el

proceso de SHF ambas temperaturas se pueden ajustar independientemente, pero en SSF es

necesario un compromiso en el ajuste de las condiciones (Olofsson, Bertilsson y Lidén, 2008).

El uso de sustratos con altas concentraciones de sólidos en el proceso de SSF (y también en

SSCF) resulta en un aumento en la viscosidad, llevando a una disminución en la transferencia

de masa y calor, así como el empleo de mucha energía para el mezclado. Un alto contenido de

sólidos también da una alta cantidad de inhibidores, afectando negativamente la producción de

etanol (Wang, Unrean y Franzén, 2016). En el proceso SSCF se realiza la cofermetación de

pentosas y hexosas (en el mismo bioreactor), pudiéndose emplear un microorganismo o varios,

para lo cual se requiere que sean compatibles, como por ejemplo que puedan operar a la misma

temperatura y pH (Gupta y Verma, 2015). Se suelen usar combinaciones de microoganismos

fermentadores de hexosas y fermentadores de pentosas, que pueden ser silvestres o modificados

genéticamente, como Escherichia coli/ S. cerevisiae (Yasuda et al., 2014) o Zymomonas

mobilis/ S. cerevisiae (Zhang y Lynd, 2010). Una desventaja de este método es que los

microorganismos fermentadores de pentosas también asimilan hexosas, como la glucosa, con

mayor preferencia sobre las pentosas, llevando a un uso inefciente de las últimas. En el CBP la


14

producción de celulasas, la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica y la producción de etanol

ocurren en un solo reactor. Los microorganismos producen las enzimas hidrolíticas en el mismo

reactor en vez de añadirse éstas exteriormente. Se pueden emplear microorganismos

individuales o en consorcio, teniendo la ventaja de ahorro de costos de operación en procesos

tales como la reducción del número de reactores o en la producción separada de enzimas

hidrolíticas. Para este proceso existen varios microorganismos candidatos, como C.

thermocellum, F. oxysporum, Neurospora crassa o Paecilomyces sp. En este proceso se tiene la

desventaja de que muchos microorganismos no presentan todas las características deseables para

producir bioetanol con rendimientos rentables, además de requerir largos períodos de

fermentación (Gupta y Verma, 2015).


15

Figura 4. Procesos para convertir la biomasa lignocelulósica en etanol. SHF es el proceso de hidrólisis y

fermentación separadas, SSF es el proceso de sacarificación y fermentación simultáneas, SSCF es el proceso de

sacarificación y co-fermentación simultáneas, CBP se refiere al bioprocesamiento consolidado (en inglés,

Consolidated Bioprocessing) (Modificado de Devarapalli y Atiyeh, 2015).

3.4. Fermentación y factores ambientales

La fermentación se puede definir como cualquier proceso en el que los microorganismos

producen metabolitos o biomasa, a partir de la utilización de sustancias orgánicas, en ausencia

o presencia de oxígeno (Hernández-Peñaranda, 2003). Según el microrganismo, el sustrato y las

condiciones de fermentación utilizadas, se pueden obtener varios productos, como etanol, ácidos

orgánicos e hidrógeno. Las fermentaciones microbianas se emplean con frecuencia para la

obtención de productos industriales como alimentos, saborizantes, bebidas alcohólicas y

combustibles, como es el caso del bioetanol (Koolman y Röhm, 2004; Nelson y Cox, 2014). En

la fermentación alcohólica las levaduras y otros microorganismos fermentan los azúcares

produciendo etanol y dióxido de carbono. La ruta metabólica puede dividirse en dos pasos.

Primero, el piruvato obtenido a partir de la glucólisis es descarboxilado hasta acetaldehído por

medio de la piruvato descarboxilasa, la cual requiere tiamina pirofosfato como coenzima y


16

magnesio. El acetaldehído es reducido a etanol por medio de la enzima alcohol deshidrogenasa

(ADH), que requiere NADH y zinc y de esta forma se regenera el poder reductor (NAD+) que

puede seguir participando en la ruta glucolítica. Como productos de la fermentación se obtiene

dióxido de carbono, etanol y otros metabolitos, como ácidos orgánicos y polioles, según el

microorganismo utilizado, el sustrato y las condiciones de fermentación (Gírio et al., 2010;

Nelson y Cox, 2014). La ecuación química general de la fermentación alcohólica se puede

expresar como:

𝐶6𝐻12𝑂6 → 2𝐶𝐻3𝐶𝐻2𝑂𝐻 + 2𝐶𝑂2

De acuerdo a Mohd Azhar et al. (2017), entre los factores que afectan la producción de etanol

están: la temperatura, la concentración de azúcares, el pH, el tiempo de fermentación, la

velocidad de agitación y el tamaño de inóculo. Estos factores varían de un microorganismo a

otro, por lo que es necesario conocerlos para trabajar de manera óptima. Los microoganismos

tienen una temperatura óptima de crecimiento y fermentación. La velocidad de crecimiento

depende de la temperatura a la cual se esté realizando la fermentación. Por ejemplo,

generalmente S. cerevisiae tiene una temperatura óptima en el rango de a 30-40 °C.

Temperaturas más altas son un factor de estrés que afecta el crecimiento de los

microorganismos. Las altas temperaturas afectan la fluidez de la membrana plasmática, las

enzimas que regulan las actividades metabólicas de los microorganismos y los ribosomas,

desnaturalizarlos e inactivándolos, afectando negativamente la capacidad fermentativa e incluso

llevando a la muerte de las células (Tesfaw y Assefa, 2014; Mohd Azhar et al., 2017). La

fermentación a altas temperaturas es deseable debido a sus beneficios como la reducción de

costos de sistemas de enfriamiento, minimización del riesgo de contaminación por bacterias en

fermentación con levaduras, facilita la utilización del método SSF. Se han reportado cepas de S.

cerevisiae capaces de soportar condiciones de estrés a temperatura de 40 °C y fermentar glucosa

para obtener etanol con una producción similar a la conseguida a 30 °C (Kitichantaropas et al.,

2016).

La concentración inicial de azúcar es un factor que influencia la velocidad de fermentación.

Generalmente, el incremento en el nivel de azúcares por arriba de cierto valor causa el

incremento en la velocidad de fermentación, pero si se excede la capacidad metabólica de


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asimilación de carbohidratos por los microorganismos, puede ocasionar que la tasa de

fermentación permanezca estacionaria. En fermentaciones en batch, el uso de altas

concentraciones iniciales de azúcares permite la obtención de altas productividades y altos

rendimientos, aunque podrían requerir un largo tiempo de fermentación (Zabed et al., 2014;

Mohd Azhar et al., 2017). Además, concentraciones muy altas de azúcar originan un ambiente

hipertónico para los microoganismos, que son afectados por la pérdida de agua desde el interior

de la célula (Da Silva, Batistote y Cereda, 2013).

El tiempo de fermentación afecta el crecimiento de los microorganismos. Tiempos de

fermentación cortos pueden causar una producción ineficiente debido al crecimiento inadecuado

de los microorganismos, pero tiempos largos puede causar efectos tóxicos sobre los

microorganismos debido a la prolongada exposición a compuestos producidos durante la

fermentación, como el etanol (Mohd Azhar et al., 2017). En general, para completar una

fermentación a bajas temperaturas se requiere de un tiempo más largo que a temperaturas

superiores.

Los microrganismos tienen un pH óptimo para el desarrollo de sus actividades metabólicas. El

pH expresa la concentración de los iones H+ en el medio, los cuales pueden cambiar la carga de

la membrana plasmática afectando la permeabilidad de los nutrientes en la célula. El pH del

medio afecta el crecimiento de los microorganismos, la velocidad de fermentación, la

producción de etanol, la formación de productos secundarios, la permeabilidad de nutrientes a

través de las membranas o la actividad de las enzimas del microorganismo (Zabed et al., 2014;

Mohd Azhar et al., 2017). Los ácidos orgánicos pueden entrar a la célula por difusión a través

de la membrana plasmática en su forma no disociada y tras disociarse intracelularmente

disminuyen el pH citoplasmático, desnaturalizando las proteínas del interior de las células

(Jönsson, Alriksson y Nilvebrant, 2013; Tesfaw y Assefa, 2014).

Lin et al. (2012) mostraron como afectan estos factores el crecimiento y producción de etanol.

Encontraron que en S. cerevisiae BY4742 se producía etanol a temperaturas de 10, 20, 30, 40 y

45 °C en un medio con 40 g·L-1 de glucosa. Sin embargo, a temperaturas más bajas el tiempo

de fermentación para alcanzar la máxima producción fue más largo, acortándose a medida que

aumentaba la temperatura. A 45 °C, aunque se produjo etanol rápidamente, éste declino pronto.


18

Además, a 50 °C se produjo la menor concentración de etanol (menos de 5 g·L-1 contra la mejor

producción de cerca de 20 g·L-1 a 30 °C), así como el menor crecimiento, mostrando el efecto

inhibitorio de las altas temperaturas sobre la fermentación y el crecimiento de los

microorganismos. La velocidad de crecimiento también fue menor a bajas temperaturas en

comparación con las más altas. La producción de etanol también fue afectada por la

concentración inicial de glucosa, tendiendo a ir en aumento a medida que la concentración de

glucosa aumentaba de 20-160 g·L-1, pero requiriendo un mayor tiempo de fermentación a

medida que la cantidad de sustrato aumentaba, mientras que a 300 g·L-1 la concentración de

etanol producida disminuyo. La velocidad específica de producción de etanol y la velocidad de

crecimiento dependieron también de la temperatura y la concentración inicial del sustrato. En

general, la velocidad específica de producción de etanol fue mayor a las temperaturas de 30 y

40 °C y tendió a ir en aumento a medida que la concentración de azúcar aumentaba de 20 g·L-1

a 160 g·L-1. La velocidad de crecimiento aumentó en general a medida que la temperatura

aumentó de 10 a 45 °C, siendo óptima entre 40 °C y 45 °C, pero disminuyó a 50 °C. Además,

encontraron que el pH óptimo para la producción de etanol se encontraba en el rango de 4.0 o

5.0, mientras que a pH más altos o más bajos la producción de etanol disminuyó.

La velocidad de agitación controla la transferencia de masa entre los nutrientes y los

microorganismos, así como la cantidad de oxígeno disuelto en microorganismos que lo

requieran. La agitación ayuda a mantener un gradiente de concentración entre el interior y el

exterior de las células. Dicho gradiente trabaja en ambas direcciones, la difusión ayuda a

mantener un suministro de azúcares y otros nutrientes en la célula, así como facilita la remoción

de productos del catabolismo, como el etanol, del microambiente de las células (Rodmui,

Kongkiattikajorn y Dandusitapun, 2008).

La concentración de inóculo es un factor que tiene influencia sobre la duración de la fase lag, la

velocidad específica de crecimiento el rendimiento de biomasa y en la calidad del producto, la

velocidad de asimilación de los azúcares y en la producción de etanol. De Albuquerque-

Wanderley, Soares y Gouveia (2014) evaluaron la producción de etanol de dos cepas

encontraron de S. cerevisiae con tamaños de inóculo de 0.4, 4.0 y 8.0 g·L-1 y encontraron que a

la concentración de inóculo más alta se tuvo el mayor consumo de sustrato, produjeron mayor


19

cantidad de etanol y tuvieron mayor productividad. Otros factores ambientales que afectan la

producción de alcohol incluyen el tipo de carbohidratos en el medio y la presencia de nutrientes

o inhibidores (composición).

3.5. Microorganismos usados en la fermentación alcohólica de carbohidratos

Durante la fermentación alcohólica de los hidrolizados provenientes de material lignocelulósico,

un requisito importante es que los microorganismos sean capaces de asimilar las hexosas

(glucosa, manosa, galactosa) y pentosas (xilosa y arabinosa) con rendimientos rentables. De

acuerdo a las ecuaciones generales de fermentación, el rendimiento teórico máximo que se

puede obtener a partir de 1 kg de glucosa o xilosa es 0.51 kg de etanol y 0.49 kg de dióxido de

carbono por kg de azúcar (Balat, Balat y Öz, 2008). Sin embargo, en la práctica, los

microorganismos usan parte del carbono en su crecimiento y funciones celulares, por lo que los

rendimientos son menores al 100%.

3𝐶5𝐻10𝑂5 → 5𝐶2𝐻5𝑂𝐻 + 5𝐶𝑂2 (fermentación de xilosa)

𝐶6𝐻12𝑂6 → 2𝐶2𝐻5𝑂𝐻 + 2𝐶𝑂2 (fermentación de glucosa)

Las características deseables de los microoganismos para la producción de etanol son las

siguientes: tener una amplia capacidad de asimilación de sustratos (hexosas y pentosas), deben

de ser capaces de soportar el estrés osmótico (alta concentración de azúcares), tolerar los

inhibidores presentes en el medio, ya sea producidos durante el pretratamiento del material

lignocelulósico o los producidos durante la hidrólisis o fermentación (principalmente etanol, así

como ácidos alifáticos, hidroximetilfurfural y furfural o compuestos aromáticos), deben tolerar

pH ácidos y altas temperaturas y producir etanol a altas velocidades y rendimientos (Jönsson,

Alriksson y Nilvebrant, 2013; Mohd Azhar et al., 2017).

Los microorganismos con potencial para utilizar los carbohidratos presentes en el material

lignocelulósico y convertirlos en productos de valor agregado como el etanol pueden ser

aislados de fuentes tales como el estómago de xilófagos (termitas) y el rumen de los herbívoros.

El estómago de las termitas es un nicho anaerobio en el cual microorganismos como las

bacterias, levaduras y protozoarios, viven en simbiosis con las termitas, y pueden degradar y


20

usar los carbohidratos celulósicos y hemicelulósicos. La digestión de la lignocelulosa en el

estómago de las termitas involucra actividades tanto del huésped como de los microorganismos.

El tracto intestinal de las termitas tiene uno o varios compartimentos en donde ocurren las

actividades hidrolíticas y fermentativas por acción de los microoganismos que los habitan o por

las enzimas de la saliva de la termita. En el intestino anterior, las partículas de madera

producidas por las mandíbulas de la termita son parcialmente hidrolizadas por las enzimas de

las glándulas salivales de la termita y además son trituradas por la molleja muscular. Los

carbohidratos simples, como la glucosa, son absorbidos por las células epiteliales del intestino

medio, mientras que el material lignocelulósico parcialmente digerido es hidrolizado y

fermentado por la acción de los microoganismos en el espacio voluminoso del intestino

posterior. La actividad enzimática de los microorganismos del estómago de las termitas

hidroliza los carbohidratos complejos, que posteriormente son fermentados principalmente a

metano, hidrógeno, ácidos grasos u orgánicos de cadena corta, que son reabsorbidos por el

huésped. Adicionalmente, existen actividades microbianas de fijación del nitrógeno y

reutilización del nitrógeno desechado por el huésped como ácido úrico (Brune, 2014). Se han

aislado microoganismos celulolíticos de estómago de termita como cepas pertenecientes al

género Bacillus, Cellulomonas, Enterobacter, Microbacterium, Ochrobactrum y Aspergillus, y

se han usado en procesos para la producción de etanol (Sharma et al., 2015; Asad et al., 2016;

Azizi-Shotorkhoft et al., 2016)

El rumen es parte del sistema digestivo de algunos herbívoros como vacas, cabras u ovejas. Es

una gran cámara con un ambiente anóxico en donde existe un complejo ecosistema donde

microorganismos como bacterias, protozoarios y hongos viven en simbiosis y varios de ellos

tienen un sistema enzimático complejo que les permite realizar la hidrólisis y fermentación de

los carbohidratos lignocelulósicos complejos, convirtiéndolos principalmente hidrógeno,

metano y ácidos grasos de cadena corta, los cuales son absorbidos por el huésped

(Christopherson y Suen, 2013). Algunos microorganismos celulolíticos de importancia en el

rumen son Ruminococcus flavefaciens, R. albus, Prevotella ruminicola y Pseudobutyrivibrio

xylanivorans por su alta capacidad enzimática, por lo que son de interés biotecnológico para

usarse en la hidrólisis de polisacáridos para diversas aplicaciones, como la producción de

biocombustibles (Zorec, Vodovnik y Marinšek-Logar, 2014). Por ejemplo, R. albus es un


21

microorganismo que puede hidrolizar carbohidratos lignocelulolíticos como celulosa,

homoxilanos, glucomananos y producir etanol y acetato (Christopherson et al., 2014).

Los grupos de microoganismos empleados en fermentaciones para la producción de bioetanol

incluyen bacterias, hongos filamentosos y levaduras. Entre las bacterias se encuentran

principalmente Z. mobilis y E. colli, así como B. macerans, B. polymyxa, Kiebsiella

pneumoniae, C. acetobutylicum, Aeromonas hydrophila, Acetobacter sp., Erwina sp.,

Leuconostoc sp y Lactobacillus sp. Adicionalmente, existen bacterias termotolerantes que se

han estudiado en cuanto a su capacidad de producir etanol. Entre otras, podemos encontrar a C.

thermohydrosulfuricum, Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum y C. thermocellum

(Sánchez y Cardona, 2008; Chandel et al., 2011). Entre las levaduras se encuentran S. cerevisiae,

así como Pachysolen tannophilus, Scheffersomyces stipitis (anteriormente Pichia stipitis),

Kluveromyces marxianus, C. shehatae, C. tropicalis y C. tenius. Los hongos filamentosos que

pueden usar pentosas y hexosas incluyen a F. oxysporum, N. crassa, Monilia sp. y Mucor sp.

(Chandel et al., 2011; Kalhorinia, Goli and Rao, 2014).

Las levaduras son los microorganismos tradicionalmente empleados en la producción de etanol.

Son ascomicetos o basidiomicetos que se reproducen habitualmente por gemación y no

producen hifas en esta forma, pero pueden presentar un estado dimórfico en el cual muestran

una forma capaz de desarrollar hifas o pseudohifas (Wolf, 1996). Muchos investigadores han

encontrado levaduras en gran número en una amplia variedad de hábitats naturales tan diferentes

como hojas, flores, frutas dulces, granos, hongos, insectos, estiércol, aguas dulces y saladas,

estuarios y diversos suelos. S. cerevisiae es el microorganismo tradicionalmente empleado en la

producción industrial de etanol debido a su buena capacidad fermentativa, tolerancia a los pH

ácidos, tolerancia al etanol y a altas concentraciones osmóticas y es reconocida como

microorganismo GRAS (“generalmente reconocida como segura”, por sus siglas en inglés).

Alcanza concentraciones de etanol tan altas como 20% (v/v) y puede utilizar hexosas como D-

glucosa, D-manosa, D-galactosa, y disacáridos como sacarosa y maltosa. Su principal

desventaja es que no puede utilizar pentosas, como la D-xilosa y la L-arabinosa, azúcares

importantes de la hemicelulosa (Gírio et al., 2010; Tesfaw y Assefa, 2014; Mohd Azhar et al.,

2017). Otras levaduras que se han empleado para la fermentación de pentosas incluyen a S.


22

stipitis, C. shehatae, P. tanophilus y K. marxianus (Gírio et al., 2010; Chandel et al., 2011). Los

microorganismos fermentadores de pentosas sin embargo tienen algunas limitaciones, como es

la preferencia de hexosas, especialmente glucosa, sobre la xilosa o la arabinosa, y también la

represión de la asimilación y fermentación de las pentosas en presencia de glucosa. La

conversión de pentosas a etanol también puede ser baja, debido al uso de éstas en la generación

de energía para formación de biomasa o mantenimiento celular. Varios microorganismos

fermentadores de pentosas también requieren de condiciones microaerobias y son sensibles a

compuestos inhibidores, como el hidroximetilfurfural (HMF) y el ácido acético, formados en la

hidrólisis de los carbohidratos complejos (Nitiyon et al., 2016; Buckeridge y Souza, De, 2017).

En el Cuadro 1 se muestran ejemplos de microorganismos empleados en la producción de

bioetanol.

Cuadro 1. Microorganismos usados en la producción de bioetanol.

Microorganismo Sustrato

asimilable

Etanol (g·L-1) Yp/s Qp (g·L-1·h-1) Referencia

S. cerevisiae Glucosa 58.4 0.41 1.8 Ortiz-Muñiz et al,

(2010)

Z. mobilis Glucosa 60-75 0.468-

0.485

4.33-5.02 Ajit, Sulaiman y

Chisti (2017)

S. stipitis Glucosa y xilosa 10.81-31.10 0.34-0.42 0.54-1.53 Santos et al. (2016)

C. shehatae Glucosa y xilosa 27.82 0.38 0.39 Yuvadetkun y

Boonmee (2016)

K. marxianus

S.cerevisiae

Glucosa,

fructosa y

sacarosa (savia

de palma

aceitera)

36.8-45.4

24.4-44.5

0.382-

0.471

0.253-

0.462

0.84-1.84

0.49-1.20

Murata et al. (2015)

K. marxianus Xilosa 2.88 0.11 0.040 Sharma et al. (2016)

S. passalidarum

Glucosa,

celobiosa y

xilosa

40

0.42

0.53

Long et al. (2012)


23

Z. mobilis es una bacteria gram-negativa reconocida como GRAS con una alta tolerancia a

concentraciones de glucosa, por lo que puede usarse en fermentaciones de alta gravedad (altas

concentraciones de carbohidratos). Su producción de etanol y rendimientos pueden ser incluso

mayores que en S. cerevisiae. Esta bacteria emplea la ruta de Entner-Doudoroff (ED) bajo

condiciones anaerobias, en la cual se produce 1 ATP por mol de glucosa en contraste con 2 ATP

por mol de glucosa en la ruta convencional de Embden–Meyerhoff–Parnas (EMP), por lo que

produce menos biomasa celular y más etanol para compensar la baja cantidad de energía

generada, lo que le da una alta especificidad de productividad de etanol. Sin embargo, tiene un

estrecho rango de asimilación de azúcares (glucosa, fructosa y sacarosa) y menor tolerancia a

inhibidores en comparación con S. cerevisiae, además tiene un rango de pH cercano al neutro,

aumentando el riesgo de contaminación con otros microoganismos (Gírio et al., 2010; Singh,

Majumder y Ghosh, 2014). Ajit, Sulaiman y Chisti (2017) estudiaron la fermentación de glucosa

(150 g·L-1 de concentración inicial a 35 °C) usando una cepa de Z. mobilis en un medio sintético

con extracción del etanol por medio de los solventes alcohol oleico, isooctadecanol y 2-octil-1-

dodecanol. Encontraron que en general, los tratamientos de extracción del etanol durante la

fermentación con solvente mejoraron los resultados de biomasa, consumo de glucosa y

concentración de etanol.

S. stipitis, C. shehatae y K. marxianus se encuentran entre las levaduras fermentadoras de

pentosas. Yuvadetkun y Boonmee (2016), con una cepa de C. shehatae produjeron un promedio

de 27.82 g·L-1 de etanol en mezclas de xilosa y glucosa a una concentración total de

carbohidratos de 80 g·L-1, con diferentes relaciones de glucosa:xilosa (4:0, 3:1, 1:1, 1:3, 0:4), y

una Yp/s promedio de 0.38. Observaron que la glucosa tuvo mayor preferencia en su consumo,

en aproximadamente 32 h, mientras que la xilosa se consumía entre 56-70 h, retardándose su

consumo mientras mayor fuera la concentración de glucosa. Las productividades también

disminuyeron de 0.86 g·L-1·h-1 en cultivos en glucosa hasta un promedio de 0.39 g·L-1·h-1 en

mezcla de azúcares, con el retardo en el consumo de xilosa.

Santos et al. (2016) usaron una cepa de S. stipitis en un medio sintético con una mezcla de

glucosa y xilosa (75-89.3 g·L-1 de azúcares con 17.33-20.27% de glucosa y 81-79.73% de xilosa)

usando un sistema de fermentación en batch con reciclamiento de células (CRBFs, por sus siglas


24

en inglés) con una concentración de inóculo inicial de 10-15 g·L-1 en peso seco de biomasa, con

cinco ciclos de fermentación, disminuyendo en cada ciclo la temperatura de 30-26 °C, logrando

en cada ciclo un consumo de glucosa de 100% y un consumo progresivo de xilosa de 19.31%

en el primer ciclo a 81.13% en el segundo ciclo y una producción progresiva de etanol de 10.81

g·L-1 a 31.10 g·L-1 en el último ciclo, con una Yp/s y productividad también crecientes.

K. marxianus una levadura que además de fermentar hexosas (como glucosa) y pentosas, destaca

por su termotolerancia, pudiendo producir alcohol a temperaturas arriba de 40 °C (Fonseca et

al., 2008), lo que es una ventaja en la disminución de los costes por sistemas de refrigeración

en los fermentadores y la disminución de costos en el uso de enzimas hidrolíticas, las cuales

generalmente tienen alta actividad a alta temperatura. Murata et al. (2015) observaron que cepas

de K. marxianus incubadas en medio YPD (extracto de levadura, peptona, dextrosa) a 45 °C

presentaron crecimiento en contraste con cepas de S. cerevisiae, que no presentó crecimiento a

esta temperatura. También se observó una superioridad de la cepa de K. marxianus con respecto

a S. cerevisiae en fermentación a temperaturas 40-45 °C a partir de savia de palma aceitera (que

presentaba los azúcares glucosa, fructosa y sacarosa a 96.26 g·L-1 de azúcares totales). Sharma

et al. (2016) usaron una cepa de K. marxianus adaptada previamente en medios con xilosa como

fuente de carbono a alta temperatura (45 °C) por medio de incubaciones sucesivas en medios

con xilosa. En un medio con 30 g·L-1 de xilosa la cepa produjo 2.88 g·L-1 de etanol en

comparación con la cepa nativa, que produjo 0.57 g·L-1. La cepa destacó por su producción de

xilitol, con 18.75 g·L-1 en contraste con la producción de 3.28 g·L-1 de la cepa nativa.

Como se comentó anteriormente, muchos microorganismos no pueden usar todos los

carbohidratos presentes en el material lignocelulósico y también muestran diferentes

preferencias hacia estos. Como, por ejemplo, S. cerevisiae, la cual no puede fermentar

eficientemente pentosas como la xilosa y la arabinosa que son azúcares importantes en la

biomasa lignocelulósica. También muestra diferentes preferencias en la asimilación de

carbohidratos como la glucosa, la fructosa y la sacarosa cuando estos se encuentran en mezcla.

Se han observado cepas que consumen la fructosa cuando la glucosa ya se ha consumido,

momento en el cual la concentración de etanol y otros inhibidores en el medio llevan a las

levaduras a una incompleta utilización de la fructosa (Prijambada, Hidayat y Widianto, 2012).


25

Microorganismos fermentadores de pentosas y hexosas, como Pachysolem tannophilus,

Scheffersomyces stipitis, Kluyveromyces marxianus y C. shehatae normalmente tienen

preferencia a azúcares como la glucosa sobre las pentosas. Esto lleva a una ineficiente

fermentación de los otros azúcares en mezclas de glucosa y pentosas y crecimiento diaúxico

(Fonseca, De Carvalho y Gombert, 2013). Algunos microorganismos pueden co-fermentar

carbohidratos simultáneamente como Spathaspora passalidarum, que se ha observado que es

capaz de fermentar simultáneamente mezclas de xilosa y celobiosa o glucosa, celobiosa y xilosa

con una producción de etanol de aproximadamente 40 g·L-1 y Yp/s de 0.43 y 0.42 con

productividades de 0.58 g·L-1·h-1 y 0.53 de 0.58 g·L-1·h-1, respectivamente (Long et al., 2012).

3.6. Rutas metabólicas para la fermentación de carbohidratos y asimilación de azúcares

De acuerdo a van Maris et al. (2006), para que un microorganismo pueda fermentar

carbohidratos debe presentar tres criterios:

-La presencia de un transportador funcional en la membrana plasmática

-La presencia de las enzimas que introducen a los carbohidratos en la ruta glucolítica

-El mantenimiento de un equilibrio redox

En la Figura 5 se muestra un mapa de las rutas metabólicas de asimilación de hexosas en S.

cerevisiae. La glucosa puede transportarse al interior de la membrana plasmática a través de

transportadores de hexosas (HXT) por difusión facilitada, para posteriormente entrar a la ruta

glucolítica. En S. cerevisiae y varias levaduras esta ruta es la de EMP, en la cual, a través de una

serie de diez reacciones enzimáticas consecutivas, la glucosa se oxida a dos moléculas de

piruvato. La primera reacción de esta ruta es la fosforilación de la glucosa a glucosa-6-fosfato

por la enzima hexocinasa. La glucosa-6-fosfato se isomeriza a fructosa-6-fosfato por la acción

de la fosfoglucoisomerasa, que posteriormente es fosforilada a fructosa 1,6-bisfosfato por la

fosfofructocinasa-1, que usa ATP. Este azúcar se rompe en gliceraldehído-3-fosfato y

dihidroxiacetona fosfato por acción de la aldolasa. Esta última se isomeriza a gliceraldehído-3-

fosfato por acción de la triosa fosfato isomerasa. Posteriormente se producen dos moléculas de

ATP y una de NADH por cada molécula de gliceraldehído-3-fosfato en la fase de ganancia de


26

la glucólisis. En una de estas reacciones el gliceraldehído-3-fosfato se oxida a 1,3-

bisfofoglicerato por acción de la glicerladehído-3-fosfato deshidrogenasa, formándose NADH.

El 1,3-bisfofoglicerato es desfosforilado a 3-fosfoglicerato por acción de la fosfoglicerato

cinasa, formándose la primera molécula de ATP. En la última reacción de la ruta metabólica, se

produce piruvato y otra molécula de ATP a partir de fosfoenolpiruvato por acción de la piruvato

cinasa. El resultado global es la formación de dos moles de piruvato, dos moles de ATP y dos

de NADH por mol de glucosa. En condiciones anaerobioas, el piruvato es convertido a

acetaldehído por la enzima piruvato descarboxilasa, formándose CO2 en el proceso.

Posteriormente, la enzima ADH cataliza la reoxidación del NADH formado durante la glucólisis

a NAD+ con reducción simultánea del acetaldehído a etanol. Esta reoxidación es necesaria para

la regeneración del NAD+ y el mantenimiento del equilibrio de NADH/NAD+. De este modo, a

partir de un mol de glucosa se obtienen dos moles de etanol (Nelson y Cox, 2014).

La manosa y la fructosa son transportados por las HXT y son fosforilados por las hexocinasas a

fructosa-6-fosfato y manosa-6-fosfato, esta última es isomerizada a fructosa-6-fosfato por la

enzima fosfomanosa isomerasa. De este modo. Ambas moléculas entran a la vía glucolítica (van

Maris et al., 2006).

La galactosa es metabolizada por la vía de Leloir, que enlaza el metabolismo de la galactosa con

la ruta glucolítica principal. Este azúcar es transportado por la galactosa permeasa (Gal2p). La

galactosa es posteriormente fosforilada a galactosa-1-fosfato por la galactocinasa (Gal1p). La

galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (Gal7p) convierte la UDP-glucosa y a la galactosa-1-

fosfato en UDP-galactosa y glucosa-1-fosfato. La UDP-galactosa es convertida en UDP-glucosa

por la UDP-glucosa 4´-epimerasa (Gal10p). Finalmente, la fosfoglucomutasa (Gal5p) cataliza

la conversión de la glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato, que entra a la glucólisis (Demir y

Kurnaz, 2006; van Maris et al., 2006).


27

Figura 5. Catabolismo de las hexosas en S. cerevisiae. Los números EC corresponden a enzimas de las rutas

metabólicas. Los nombres de los genes que codifican para las enzimas señaladas en la Figura se muestran entre

paréntesis en la leyenda de esta Figura. Catabolismo de la glucosa: 2.7.1.1, hexocinasa (HXK1/HXK2); 2.7.1.2,

glucocinasa (GLK1); catabolismo de la galactosa: ruta de Leloir: 2.7.1.6, galactocinasa (GAL1); 2.7.7.12, galactosa-

1-fosfato uridiltransferasa (GAL7); 5.1.3.2, UDP-glucosa 4-epimerasa (GAL10); 5.4.2.2 fosfoglucomutasa

(GAL5/PGM2). Catabolismo de la manosa: 2.7.1.1, hexocinasa I (HXK1); 5.3.1.8, manosa-6-fosfato isomerasa

(PMI40). G-3-P, gliceraldehído-3-fosfato; DHAP, dihidroxiacetona fosfato; PEP, fosfoenolpiruvato; PPP, ruta de

las pentosas fosfato (modificado de van Maris et al., 2006).

La Figura 6 muestra la ruta catabólica de la xilosa y la arabinosa en hongos, levaduras y

bacterias. En la ruta metabólica principal del catabolismo de xilosa en hongos y levaduras,

primero la xilosa reductasa (XR) cataliza la reducción de la xilosa a xilulosa, dependiente de

NAD(P)H; posteriormente la xilitol deshidrogenasa (XDH) cataliza la oxidación del xilitol a

xilulosa por medio de la NAD+. En bacterias, la xilosa se isomeriza a xilulosa en una reacción

catalizada por la xilosa isomerasa (XI). En ambas rutas, la xilulosa cinasa (XK) cataliza la


28

fosforilación de la xilulosa para dar xilulosa-5-fosfato, tras lo cual entra a la ruta de las pentosas

fosfato (PPP) y posteriormente a la glucólisis (Gírio et al., 2010). Por otro lado, la L-arabinosa

es convertida a xilitol a través de una serie de reacciones de oxidorreducción consecutivas que

involucra la L-arabinosa reductasa (AR) que reduce la L-arabinosa a L-arabitol; la L-arabitol-

4-deshidrogenasa (LAD) que reduce el L-arabitol a L-xilulosa; y finalmente, la L-xilulosa

reductasa (LXR) que reduce la L-xilulosa a xilitol, el cual se incorpora a la ruta catabólica de la

xilosa descrita anteriormente. En bacterias, la ruta involucra la conversión de L-arabinosa en L-

ribulosa por acción de la enzima L-arabinosa isomerasa (AI), la fosforilación de ésta por la L-

ribulocinasa (RK) y finalmente la conversión a xilulosa-5-fosfato, que involucra a la L-ribulosa-

5-fosfato-4-epimerasa (L-RPE) (Gírio et al., 2010; Komeda et al., 2014).

Figura 6. Catabolismo de la xilosa y la arabinosa en S. cerevisiae genéticamente modificada. Los números EC

representan enzimas de la ruta metabólica. Los nombres de los genes de las enzimas se muestran en paréntesis en

la leyenda de esta Figura. 1.1.1.21, aldosa/xilosa reductasa (GRE3/xyl1); 1.1.1.9, xilitol deshidrogenasa

(XYL2/xyl2); 2.7.1.17, xilulocinasa (XKS1/xyl3); 5.3.1.5, xilosa isomerasa (xylA); 1.1.1.12, arabinitol 4-

deshidrogenasa (lad1); 1.1.1.10, L-xiiulosa reductasa (lxr1); 5.3.1.4, L-arabinosa isomerasa (araA); 2.7.1.16, L-

ribulocinasa (araB); 5.1.3.4, L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa (araD). G-3-P, gliceraldehído-3-fosfato; PPP, ruta

de las pentosas fosfato (modificado de van Maris et al., 2006).


29

3.7. Fermentación con cultivos mixtos para la producción de bioetanol

Como se ha comentado anteriormente, en un proceso de fermentación eficiente todos los

carbohidratos (hexosas y pentosas) deben ser fermentados, normalmente en presencia de

compuestos inhibitorios producidos durante la hidrólisis, como ácidos, compuestos fenólicos,

furfurales e hidroxifurfurales, asimismo tolerar las altas concentraciones de etanol y de

carbohidratos presentes en el medio. Desafortunadamente la mayoría de los microorganismos

no pueden asimilar todos los carbohidratos o presentan capacidades preferenciales para la

asimilación de los diferentes azúcares. Tampoco tienen la misma capacidad para tolerar las

condiciones inhibitorias presentes en los medios de cultivo. Como es difícil que un solo

organismo reúna todos los requisitos para la fermentación de los hidrolizados, se ha optado por

otras estrategias, como el uso de microorganismos mejorados con técnicas de biología

molecular. Se han producido cepas recombinantes de E. coli que expresan enzimas heterólogas

de la ruta de fermentación, cepas recombinantes de S. cerevisiae y Z. mobilis con enzimas de

las rutas de degradación de pentosas, obteniendo resultados más o menos prometedores.

Otra estrategia es el uso de cultivos mixtos. De acuerdo a Stanier et al. (1996), un cultivo mixto

es aquel que está compuesto por más de una clase de microorganismos en contraste con un

cultivo puro o axénico, que contiene sólo una clase de microorganismo. Se suelen formular

cultivos mixtos usando cepas con diferentes capacidades fermentativas o metabólicas cuyo uso

combinado presente un efecto sinérgico para el mejoramiento de la asimilación de los

carbohidratos y la producción de etanol. Los cultivos mixtos normalmente muestran eficiencias,

productividades o tolerancia más altas en comparación con las características mostradas en

cultivos individuales. El uso de cultivos mixtos en la industria se ha usado para la obtención de

productos variados como vinagre, salsas, quesos, bebidas alcohólicas, pan, materiales como

polihidroxialcanoatos, politrimetileno tereftalato o biocombustibles como biogás, biohidrógeno

o bioetanol. Las fermentaciones industriales con cultivos puros requieren condiciones asépticas

y sustratos puros, operaciones que incrementan el costo de los procesos (Prijambada, Hidayat y

Widianto, 2013; Jiang et al., 2017).


30

Las ventajas de los cultivos mixtos en comparación con las fermentaciones con un solo

microorganismo incluyen:

-La sinergia de diferentes sistemas enzimáticos y combinación de diferentes capacidades

metabólicas de diferentes microorganismos en la utilización más eficiente de sustratos y un

espectro más estrecho de productos, reduciendo costos de purificación de los productos.

-La producción, productividad y rendimiento de los productos de fermentación pueden ser

mayores que en cultivos individuales.

-Ciertos microorganismos pueden producir factores de crecimiento o compuestos esenciales

para el crecimiento o el metabolismo de otros microorganismos del cultivo, o bien, producir

compuestos que se complementan unos a otros. También pueden ayudar en la exclusión de

microorganismos no deseados.

-Facilita la utilización de sustratos baratos o impuros (melazas, material lignocelulósico).

Se han hecho varios estudios sobre el uso de cultivos mixtos de microorganismos para la

fermentación de los carbohidratos en mezcla o de biomasa lignocelulósica para la obtención de

etanol. Como ejemplos, se presentan los mostrados en el Cuadro 2.

Prijambada, Widianto y Hidayat (2017) evaluaron la fermentación de savia de sorgo dulce

utilizando diferentes cultivos mixtos de cepas de S. chevaliery (OUT7096) y dos de S. steineri

(OUT7913 y OUT7921) inoculadas simultáneamente, capaces de fermentar la glucosa, fructosa

y sacarosa que componen la materia prima. La combinación de las cepas OUT7913 y OUT7921

tuvo la producción y rendimientos más altos de etanol, así como la mejor eficiencia de

conversión de azúcares, en comparación con otros cultivos mixtos y los cultivos individuales.

Otra estrategia de inoculación de cultivos mixtos es la secuencial, que presenta ventajas cuando

un microorganismo compite con el otro o uno de ellos es poco tolerante al etanol.

Gutiérrez-Rivera et al. (2015) usaron un cultivo mixto de S. cerevisiae y S. stipitis para

fermentar los azúcares presentes en hidrolizados de bagazo de caña de azúcar adicionado con

melazas “B”. En cultivos con las cepas inoculadas simultáneamente encontraron que la


31

producción y la productividad de etanol fueron similares a las obtenidas en cultivos individuales

de las cepas. Observaron que probablemente pudo haber una competencia entre ambas cepas y

que la cepa de S. stipitis quedó inhibida por el etanol al tener menor tolerancia a éste de entre

las dos cepas, por lo que utilizaron un cultivo secuencial inoculando primero la cepa de S.

stipitis,menos tolerante al etanol, y posteriormente a S. cerevisiae, continuando la producción

del alcohol y alcanzando una concentración máxima de 53.80 g·L-1 de etanol contra un promedio

de 25.14 g·L-1 en los otros cultivos individuales y mixtos simultáneos.

La combinación de una cepa altamente productora de etanol como S. cerevisiae y una cepa capaz

de producir enzimas hidrolíticas para romper los carbohidratos complejos en azúcares simples

que la levadura pueda fermentar, como por ejemplo A. oryzae, es una de las combinaciones que

más se están estudiando para la producción de etanol a partir de residuos lignocelulósicos como

los residuos de alimentos. Jahnke et al. (2016) usaron cepas de S. cerevisiae y A. oryzae para

producir etanol a partir de varios sustratos. En maltodextrinas observaron que mientras la

levadura fue incapaz de usar el sustrato para la producción de etanol y A. oryzae hidrolizó las

maltodextrinas y produjo azúcares libres, pero no etanol, la combinación de ambas cepas fue

capaz de degradar los carbohidratos y producir el alcohol. También observaron que la adición

de la levadura dos días después de inocular a A. oryzae produjo mayor etanol (2%) que en la

inoculación simultánea (0.7%) ya que aparentemente en este último cultivo S. cerevisiae asimiló

y fermentó rápidamente los azúcares liberados de la hidrólisis, produciendo etanol e impidiendo

que A. oryzae se estableciera correctamente, por lo que se necesitó un tiempo de adaptación de

ésta última antes de la inoculación de la levadura. Cuando se usaron como sustrato residuos de

alimentos se observó el consumo de los azúcares liberados de la hidrólisis, así como la

producción de etanol a partir de la inoculación secuencial de A. oryzae y S. cerevisiae.

En otro trabajo, Zhang et al. (2017) estudiaron la capacidad fermentativa de dos cepas

recombinantes, S. cerevisiae y P. stipitis. La primera levadura expresó una endoglucanasa, una

exoglucanasa y una β-glucosidasa para la hidrólisis de la celulosa a glucosa. La segunda

levadura expresó una endoxilasa y una β-xilosidasa para la hidrólisis de hemicelulosas para

liberar xilosa. Usando monocultivos y un co-cultivo de ambas cepas produjeron etanol a partir

de paja de trigo. Encontraron que la combinación de ambas levaduras dio un mayor consumo


32

de carbohidratos (celulosa, hemicelulosa, glucosa y xilosa) y una mayor producción de etanol

debido a la combinación de la capacidad celulolítica y de fermentación de glucosa de la cepa de

S. cerevisiae y a la capacidad xilulolítica y de fermentación de xilosa de la cepa de P. stipitis.

Zuroff, Xiques y Curtis (2013) establecieron cultivos mixtos de C. phytofermentans con C.

molischiana o S. cerevisiae cdt-1 en donde se observó una simbiosis entre los microorganismos.

C. phytofermetans es capaz de hidrolizar la celulosa y aprovechar las celodextrinas para producir

etanol, pero con rendimientos bajos. Además, es un anaerobio obligado. Las cepas de S.

cerevisiae cdt-1 y C. molischiana, por su parte, pueden fermentar las celodextrinas y la glucosa

con altos rendimientos, pero no la celulosa. Para el aprovechamiento de la celulosa, se usó un

co-cultivo de levadura y bacteria en un medio sintético de α-celulosa con una endoglucanasa

para mejorar la hidrólisis. En este cultivo, la levadura le dio protección respiratoria a la bacteria

(la cual fue incapaz de crecer en cultivo individual en presencia de oxígeno), mientras que esta

última hidrolizó la celulosa liberando carbohidratos más sencillos que fueron utilizados por

ambos microorganismos como fuente de carbono para sus actividades metabólicas. Se encontró

que el mejor cultivo mixto se estableció entre S. cerevisiae y C. phytofermentans con una mejor

producción de etanol que en los cultivos individuales (22 g·L-1 contra 6-9 g·L-1) y un mejor

aprovechamiento de los carbohidratos tras 400 horas de sacarificación y fermentación.

Las fermentaciones de carbohidratos complejos a altas temperaturas en procesos como SSF o

CBP usando cepas termotolerantes o termofílicas ofrecen ventajas tales como mejora de la

catálisis enzimática de enzimas hidrolíticas, reducción de costos por uso de sistemas de

enfriamiento y minimización del riesgo de contaminación con microorganismos externos. Singh

et al. (2017) usaron cocultivos de una cepa de Clostridium sp. (DBTIOC-C19) anaeróbica

termofílica celulolítica junto a una cepa de Clostridium sp. (DBT-IOC-DC21) xilanolítica y una

cepa de Thermoanaerobacter (DBT-IOC-X2) fermentadora de azúcares, pero incapaz de

hidrolizar carbohidratos complejos. Durante la fermentación a alta temperatura (60 °C) de varios

sustratos como avicel, xilano, mezclas de xilano y avicel, paja de arroz pretratada y no pretratada

observaron que la producción de etanol fue superior en los cocultivos que en monocultivos de

las cepas celulolítica y xilanolítica.


33

La inmovilización de células en partículas como el alginato de calcio es una tecnología que

ofrece ventajas como una extracción de producto de fermentación más económica,

reciclamiento de células, mantenimiento de una alta densidad celular, alta productividad, buen

mezclado y transferencia de masa con el medio con bajo riesgo de contaminación. Meethit,

Ratanaprasit y Sakdaronnarong (2016) usaron un cocultivo de C. shehatae (fermentadora de

pentosas) y S. cerevisiae (fermentadora de hexosas) inmovilizadas en partículas de aginato de

calcio en un reactor de lecho empacado para la fermentación de hidrolizados de bagazo de caña

de azúcar y paja de arroz. En un sistema de fermentación continua obtuvieron rendimientos de

producción de etanol de 0.38 y 0.40, correspondientes al 74.5% y 78.4% de los rendimientos

teóricos en los hidrolizados de bagazo de caña de azúcar y paja de arroz, respectivamente. En

un sistema de batch con reciclaje obtuvieron rendimientos de producción de 0.49 y 0.50,

correspondientes a valores de 96.1% y 98.0% del rendimiento teórico en los hidrolizados de

bagazo de caña de azúcar y paja de arroz, respectivamente, con un consumo de la mayor parte

de la glucosa y la xilosa de los hidrolizados.


34

Cuadro 2. Ejemplos de estudios de cultvos mixtos en microorganismos en la producción de etanol.

Autor Sustrato Microorganismo Etanol (g·L-1) Yp/s Qp(g·L-1·h-1)

Prijambada,

Widianto y

Hidayat (2017)

Savia de sorgo

dulce

S. chevaliery (OUT7096)

S. steineri (OUT7913

S. steineri (OUT7921)

OUT7096/OUT7913

OUT7096/OUT7921

OUT7913/OUT7921

79.74

76.16

78.96

95.88

78.28

115.90

0.413

0.398

0.405

0.489

0.398

0.591

Singh et al.

(2017)

Paja de arroz

pretratada

Paja de arroz

nativa

Clostridium sp. DBTIOC-

C19

Clostridium sp. DBT-IOC-

DC21

DBTIOC-C19/DBT-IOC-

DC21/ DBT-IOC-X2

Clostridium sp. DBTIOC-

C19

Clostridium sp. DBT-IOC-

DC21

DBTIOC-C19/DBT-IOC-

DC21/ DBT-IOC-X2

0.691

0.461

1.165

0.116

0.092

0.415

0.007

0.005

0.012

0.001

0.001

0.004


35

Zhang et al.

(2017)

Paja de trigo

pretratada

S. cerevisiae

P. stipitis

S. cerevisiae/P. stipitis

24.2

11.7

32.6

0.44

0.39

0.42

0.303

0.167

0.466

Jahnke et al.

(2016)

Maltodextrinas

S. cerevisiae

A. oryzae

S.cerevisiae/A. oryzae

4.0

<4.0

20.0

0.024

<0.024

0.119

Meethit,

Ratanaprasit y

Sakdaronnarong

(2016)

Hidrolizados

de bagazo de

caña de azúcar

Hidrolizados

de paja de

arroz

S. cerevisiae/C. shehatae

S. cerevisiae/C. shehatae

18.50

16.60

0.49

0.50

0.11

0.10

Gutiérrez-Rivera

et al. (2015)

Hidrolizados

de bagazo de

caña de azúcar

con melazas

“B”

S. stipitis

S. cerevisiae

S. stipitis/S. cerevisiae

26.17

21.81

53.80

0.377

0.343

0.443

0.323

0.441-4.686

1.07

Estrada-Martínez

(2013)

Mezcla de

azúcares

(glucosa,

fructosa,

galactosa,

arabinosa,

xilosa y

sacarosa)

C. glabrata T1

C. tropicalis LR4

C. glabrata T1/

C. glabrata LR4

23.08

35.31

45.27

0.27

0.42

0.50

0.120

0.163

0.269


36

Zuroff, Xiques y

Curtis (2013)

α-celulosa

C. phytofermetans

S.s cerevisiae cdt-1

C. phytofermetans/

S. cerevisiae cdt-1

6.0

9.0

22.0

0.015

0.023

0.055

Estrada-Martínez (2013) estudió la capacidad fermentativa de cepas del género Candida para

producir etanol a partir de mezclas de azúcares (en un medio sintético), la mezcla de azúcares

se encontraba en proporciones similares a las encontradas en residuos de cítricos. Dichas cepas

fueron aisladas de líquido ruminal bovino (C. glabrata LR2, C. glabrata LR5 y C. tropicalis

LR4) y de estómago de termina (C. glabrata T1) y se observó que tienen capacidad para asimilar

hexosas y pentosas (glucosa, fructosa, galactosa, xilosa y arabinosa) y producir etanol a partir

de éstas. Las cepas C. tropicalis LR4 y C. glabrata T1 en cultivos mixtos tuvieron mejores

producciones, rendimientos y productividades de etanol que en cultivos individuales. Ambas

cepas se han registrado con los números NRRL Y-50876 y Y-50877, respectivamente,

protegidas para su uso en fermentación de mezclas de azúcares para producción de alcohol por

el Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C.

(CIATEJ). Otras combinaciones de estas cepas no fueron investigadas. Dado a la diferencia en

los perfiles de asimilación de azúcares y capacidades de producción de etanol entre estos

microorganismos, una propuesta es investigar otras combinaciones de las cepas, como por

ejemplo las cepas LR2 y T1. Para un mejor entendimiento de los cultivos mixtos una propuesta

es estudiar su dinámica poblacional y de este modo conocer el comportamiento o cambios

poblacionales de ambas cepas cuando están juntas y de deducir las posibles relaciones entre las

cepas. Uno de los retos para estudiar la dinámica poblacional de las cepas LR2 y T1 es que

tienen características microscópicas y macroscópicas (aspecto de las colonias en medio sólido)

similares por lo que no es posible distinguirlas fácilmente. De este modo, se propone usar otras

técnicas para poder diferenciar ambas levaduras en el cultivo mixto.


37

3.8. Técnicas para el estudio de cultivos mixtos

Las técnicas para la caracterización de los cultivos mixtos pueden clasificarse en

microbiológicas, bioquímicas y basadas en biología molecular. Entre los métodos

microbiológicos podemos encontrar el conteo celular, el conteo en placa y el perfil del nivel

fisiológico de la comunidad (CLPP, por sus siglas en inglés). Esto métodos confían en el

crecimiento selectivo de los microorganismos en medios de cultivo (Nagarajan y Loh, 2014).

Los métodos de conteo no dan información sobre la comunidad, filogenia o diversidad de los

microoganismos cuando se usan sin otras técnicas complementarias. El conteo de

microorganismos es una característica básica de las comunidades microbianas, pero solo es un

punto de partida de la caracterización de éstas. El conteo directo de células implica la

observación al microscopio de los diferentes microorganismos presentes en una muestra.

Cuando se comparan con las técnicas de conteo indirecto, tienen la ventaja de que se toman en

cuenta varios tipos de células, viables, no viables, cultivables, no cultivables. Una limitante

importante de esta técnica es que no es posible diferenciar microorganismos que tengan la

misma morfología celular. Se pueden usar colorantes como el colorante fluorescente naranja de

acridina, que se une al ADN o al ARN, produciendo un aumento de sensibilidad de la técnica.

Los métodos de conteo indirecto, como el conteo en placa, por otro lado, involucran el cultivo

de los microorganismos en medios de cultivo. Esto restringe el análisis a aquellos

microorganismos que son capaces de crecer en el medio. Además, puede producir resultados

artificiales al favorecer el crecimiento de sólo unos cuantos microorganismos que no

necesariamente son los más abundantes. Por lo tanto, estas técnicas dan solo un estimado de la

diversidad de microorganismos, pero realmente no son representativas más que de una pequeña

porción de la comunidad microbiana (Spiegelman, Whissell y Greer, 2005).

La técnica de CLPP refleja la diversidad metabólica de una comunidad microbiana mediante la

inoculación de los microorganismos en una serie placas que contienen cada una diferentes

fuentes de carbono. Uno de los kits más usados para este fin es el BIOLOG, el cual consiste en

una placa con 96 microplacas cada una con diferentes fuentes de carbono y un indicador redox,

como violeta de tetrazolio. Cuando una muestra con microorganismos es inoculada en las

microplacas, el NADH producto del catabolismo del carbono reduce el tetrazolio, dando una


38

coloración rosa o violeta que puede ser medida fotométricamente. Algunas otras placas miden

la turbidez en vez de cambios de coloración. Existen varias variantes de estas microplacas para

diferentes aplicaciones como caracterización de bacterias gram-negativas y bacterias gram-

positivas (Weber and Legge, 2010). Una limitación importante de esta técnica es que no permite

la detección de microorganismos no cultivables o que no crezcan en las fuentes de carbono

dadas. Tampoco es útil para identificar especies o cepas en concreto, más bien grupos de

microorganismos en base a sus actividades metabólicas.

Las técnicas bioquímicas caracterizan los cultivos microbianos con base en el ADN de la

comunidad o con biomoléculas como las quinosas o los ácidos grasos que componen a los

microorganismos. El análisis de ácidos grasos o de metil-ésteres de ácidos grasos (FAME, por

sus siglas en inglés), y el análisis de ácidos grasos fosfolipídicos (PLFA) son métodos

independientes de cultivo que da información de las comunidades microbianas a nivel

fenotípico, donde la composición de los ácidos grasos que componen los lípidos o fosfolípidos

de las membranas celulares se utilizan como un marcador para caracterizar comunidades

microbianas. Los lípidos son extraídos de las muestras microbiológicas y se analizan por

cromatografía de gases acoplado a masas para identificar los ácidos grasos que componen la

muestra (Quideau et al., 2016). En los microorganismos, los lípidos o fosfolípidos que

componen la membrana celular se presentan en proporciones constantes dentro de grupos

taxonómicos, por lo que pueden usarse para diferenciar entre grupos en las comunidades.

También es útil para conocer cambios en las comunidades microbianas y el estado fisiológico

de los microorganismos debido a factores ambientales con base a los cambios en la composición

de las membranas. Sin embargo, la interpretación de los perfiles para la identificación de

individuos o grupos específicos en una comunidad está limitada debido a la sensibilidad de la

composición de los fosfolípidos a las condiciones ambientales o al estado de crecimiento del

microorganismo. Los resultados obtenidos también son sensibles a cambios en la metodología

de obtención de los perfiles de lípidos. La interpretación de los perfiles también se ve afectada

por la abundancia de un grupo de microorganismos sobre otros cuando ambos comparten ácidos

grasos comunes, influenciando incluso el ecosistema donde se toma la muestra, o incluso por la

riqueza o diversidad de ácidos grasos de un grupo de microorganismos sobre otros, pudiendo

aparentar un grupo mayor diversidad que otros por la abundancia o diversidad de ácidos grasos.


39

Por lo tanto, estas técnicas son más bien usadas para generar perfiles de comunidades

microbianas para la comparación entre varias muestras y detectar cambios en la estructura de

las comunidades debidas determinados factores. También pueden dar información acerca del

fenotipo y la actividad de las comunidades microbianas (Frostegård, Tunlid y Bååth, 2011). De

manera similar, se puede establecer un perfil de quinonas para caracterizar las comunidades de

microorganismos (Kunihiro et al., 2014).

El análisis del ADN incluye técnicas que toman en cuenta las fracciones teóricamente más

representativas de los ácidos nucleicos de la comunidad, como el perfil de reasociación del

ADN, la hibridación del ADN de la comunidad y el fraccionamiento por % de GC. La

reasociación del ADN utiliza la propiedad de unión de las dos cadenas de ADN tras ser

desnaturalizado térmicamente. El ADN extraído es desnaturalizado para ser llevado

posteriormente a una temperatura por debajo de la temperatura de fusión de las moléculas. La

reasociación del ADN se mide espectrofotométricamente a lo largo del tiempo, aumentando la

absorbancia a medida que el ADN se renaturaliza. La velocidad de reasociación dependerá de

la similitud entre secuencias, siendo más lenta a medida que la diversidad aumenta,

interpretándose como una mayor diversidad microbiana (Spiegelman, Whissell y Greer, 2005).

El fraccionamiento con base en % de GC mide la diversidad microbiana con base en el contenido

de guanina y citosina, que es diferente para distintos grupos taxonómicos, separando el ADN de

la comunidad por centrifugación con gradiente de densidad para obtener fracciones, cada una

con diferente contenido de G+C, el cual puede ser analizado por otras técnicas más específicas

como DGGE. La hibridación del ADN de la comunidad permite la comparación del ADN de

dos comunidades para dar información sobre las relaciones entre éstas (Agrawal, Agrawal y

Shrivastava, 2015). Estas técnicas generan perfiles de las comunidades y dan una información

de la diversidad genética global o general. Una información taxonómica más específica

requeriría otras técnicas.

Las técnicas de biología molecular son técnicas independientes de cultivo que se basan en

secuencias de ADN o ARN para la caracterización de microorganismos y que en comunidades

microbianas favorecen la determinación de la diversidad, la filogenia, funcionalidad y la

diferenciación y cuantificación de individuos que las componen. Permiten tener información


40

más específica que con las técnicas de análisis del ADN comunitario (Nagarajan y Loh, 2014).

Además, no dependen estrictamente de cultivar los microorganismos, haciendo posible

caracterizar microorganismos no cultivables y nuevos microorganismos. Estas técnicas usan

marcadores moleculares, que se definen como regiones de ADN (o proteínas como las

isoenzimas) asociados con un genoma y que sirven para marcar o señalar un genoma o un

fragmento del genoma del cual se puede obtener información como el estudio de la variabilidad

o la identificación y/o diferenciación de un individuo (microorganismo) en un cultivo mixto o

comunidad microbiana (Eguiarte, Souza y Xitlali, 2007; Liu et al., 2012). Por otro lado, muchas

de las técnicas tienen un paso de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para la

amplificación de fragmentos de ADN que servirán como marcadores moleculares. Estos

métodos requieren la extracción del ADN para posteriormente realizar la amplificación de los

fragmentos de ácido nucleico usando oligonucleótidos adecuados, seguido del análisis post-

PCR. Se puede realizar una multiplex-PCR y una PCR cuantiitativa (qPCR). En la primera se

realizan varias PCR en un solo mix de reacción usando varios juegos de oligonucleótidos para

detectar simultáneamente varios microorganismos, mientas que la segunda puede detectar y

cuantificar microorganismos basándose en la cuantificación del número de copias de un gene

objetivo (marcador) en una muestra. En otras técnicas se realiza una electroforesis para separar

los productos de PCR, obteniéndose un patrón de bandeo (“fingerpriting”) que da información

acerca de la estructura de la comunidad microbiana con base a variaciones de longitud y

secuencia de los fragmentos de ADN (Douterelo et al., 2014).

El gene más utilizado como marcador molecular en la identificación de bacterias es el gene de

ARN ribosomal 16S (16S ARNr), también se usa el 23S ARNr. Otro gene es el de la subunidad

β de la ARN polimerasa (rpoB); de la subunidad ADN girasa (gyrB); de la proteína de choque

térmico HSP70 (dnaK), el gene dsrAB (para bacterias reductoras de azufre), que codifica las

subunidades de enzimas que reducen el sulfito a sulfido; el gene de recA, que codifica proteínas

involucradas en la reparación del ADN dañado y la recombinación de ADN homólogo; la región

intergénica 16S-23S; entre otros genes y regiones (Liu et al., 2012). En eucariotas se suelen usar

las regiones ITS1 e ITS2 (espaciadores internos transcritos). En organismos fúngicos podemos

encontrar los genes 18S ARNr y las regiones D1/D2 del 25S/28S ARNr, genes de β-tubulina,

entre otros (Das et al., 2014). Otros marcadores moleculares consisten en secuencias repetitivas


41

de ADN, como los microsatélites o las secuencias REP (secuencias palindrómicas repetitivas

extragénicas) presentes a lo largo de los genomas, o incluso secuencias amplificadas al azar con

oligonucleótidos adecuados (RAPD) (Eguiarte, Souza y Xitlali, 2007).

En el grupo de técnicas moleculares se incluyen la electroforesis en gel con gradiente

desnaturalizante (DGGE), ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), análisis de

espaciadores intergénicos ribosomales (RISA), análisis de restricción del ADN ribosomal

amplificado (ARDRA), polimorfismo conformacional de una cadena (SSCP), PCR de

secuencias repetitivas (rep-PCR), PCR Tiempo Real cuantitiativa (qPCR), hibridación

fluorescente in situ (FISH), polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción y de

fragmentos de restricción terminal (RFLP y T-RFLP, respectivamente), polimorfismo de

longitud de fragmentos amplificados (AFLP), microarreglos (“microarrays”) y HPLC en

condiciones desnaturalizantes (dHPLC). En el DGGE se examina la diversidad microbiana con

base en la electroforesis de productos de PCR, como por ejemplo del ARNr, a través de un gel

de poliacrilamida con gradiente de concentraciones crecientes de agentes desnaturalizantes

como foramida y urea. Las moléculas de ADN migrarán en función de su comportamiento frente

a la desnaturalización, lo que a su vez depende su secuencia de nucleótidos, migrando una mayor

distancia aquellas moléculas resistentes a la desnaturalización. Una variante de este método, que

usa un gradiente de temperatura desnaturalizante (TGGE), las moléculas de ADN migran a

través de un gel con un gradiente de temperatura creciente, migrando más aquellas que tengan

una temperatura de fusión (Tm) mayor. Esto permite una visualización del perfil de las especies

en el cultivo mixto, y permite monitorear cambios a través del tiempo. Las bandas también

pueden cortarse y secuenciarse para la identificación taxonómica (Douterelo et al., 2014;

Agrawal, Agrawal y Shrivastava, 2015). Los RAPD son marcadores que amplifican

aleatoriamente segmentos de ADN a lo largo del genoma usando oligonucleótidos con

secuencias al azar de 10 nucleótidos y PCR con temperaturas de alineamiento bajas. Los

productos de PCR se separan por electroforesis y los patrones de bandeo distinguen los

microorganismos de acuerdo a la presencia o ausencia de bandas. Una de sus desventajas es que

es poco reproducible y las condiciones de amplificación deben ser optimizadas caso por caso.

En la técnica RISA, los espaciadores intergénicos entre los genes de ARNr son amplificados

por PCR y separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida en condiciones


42

desnaturalizantes. Es útil para diferenciar entre microorganismos por la heterogeneidad en la

longitud y en las secuencias de los espaciadores de diferentes individuos. Por otro lado, ARDRA

se basa en las variaciones en secuencias de los genes de ARNr, los cuales son amplificados por

PCR y digeridos con diferentes enzimas de restricción. Las bandas son separadas por

electroforesis y los patrones de bandeo obtenidos permiten monitorear los cambios de las

comunidades microbianas por ausencia o presencia de bandas. La SSCP es un método que

permite detectar diferencias en las secuencias de ADN, llegando incluso a poder detectar

diferencias de un nucleótido. El procedimiento involucra la amplificación del ADN objetivo, la

desnaturalización de los amplicones por agentes desnaturalizantes o calor para obtener ADN de

cadena sencilla y realizar una corrida en electroforesis en gel de poliacrilamida no

desnaturalizante (PAGE). Las cadenas de ADN adquirirán diferentes conformaciones durante

su migración en base a sus secuencias de nucleótidos, migrando a diferentes velocidades y

distancias, incluso si tienen el mismo tamaño (Agrawal, Agrawal y Shrivastava, 2015). Las

RFLP utilizan enzimas de restricción para digerir productos de PCR de un gene marcador y los

fragmentos resultantes son separados por electroforesis. El polimorfismo observado depende de

las variaciones en las secuencias de los sitios de restricción entre las moléculas de ADN o por

inserciones o deleciones entre dos regiones de corte. En la T-RFLP, la PCR se realiza con

oligonucleótidos etiquetados con moléculas fluorescentes y se realiza la digestión con enzimas

de restricción. Los fragmentos de restricción terminales estarán marcados fluorescentemente.

Es útil para cuantificar los microorganismos presentes en la muestra por medición de la

fluorescencia de estos fragmentos. En los microarreglos, el ADN genómico comunitario o los

productos de PCR de una muestra de ADN, son marcados con una molécula fluorescente y son

directamente hibridados a oligonucleótidos complementarios al ADN objetivo inmovilizados en

soportes sólidos y ordenados en series conocidas como microarreglos. Tras la unión de los

amplicones y las sondas, es posible observar señales positivas con el uso de microscopía

confocal de barrido láser. Esta técnica es usada para conocer la expresión de genes en una

muestra de cultivo, mediante la extracción de ARN y síntesis del ADNc por transcripción

reversa, el cual puede ser usado para ensayar la expresión de genes funcionales en el cultivo

mixto. La intensidad de la señal se puede relacionar con el nivel de expresión de los genes. Una

de las ventajas de esta técnica es que se pueden ensayar muchas muestras simultáneamente, lo


43

cual es una ventaja cuando se analizan cultivos mixtos (Eguiarte, Souza y Xitlali, 2007;

Nagarajan y Loh, 2014). La técnica FISH, a diferencia de las anteriores, permite la identificación

de los microorganismos en los cultivos por microscopia de epifluorescencia sin extraer el ADN.

En esta técnica se usan oligonucleótidos marcados con moléculas fluorescentes para marcar una

secuencia objetivo de ADN. Estos oligonucleótidos pueden ser específicos para un grupo de

microorganismos en el cultivo mixto. Las células son permeabilizadas e incubadas con las

sondas para que éstas entren al interior de la célula para encontrar sus secuencias objetivo. Una

vez marcadas, las células pueden ser observadas y cuantificadas por microscopia de

epifluorescencia (Douterelo et al., 2014; Nagarajan y Loh, 2014). La dHPLC, por su parte, se

basa en la separación de moléculas de ADN o amplicones parcialmente desnaturalizados

mediante HPLC por cromatografía en fase reversa de par iónico. Los fragmentos de ADN se

eluyen de la columna por un gradiente creciente de acetonitrilo y son detectados con detectores

de fluorescencia o UV. La separación se basa en las diferencias de tamaño y secuencias de las

moléculas de ADN de distintos microorganismos (Priha et al., 2013).

3.8.1. PCR Tiempo Real

La PCR Tiempo Real o PCR cuantitativa (qPCR) usa moléculas reporteras fluorescentes para

visualizar la producción de amplicones durante cada ciclo de una PCR, en contraste con una

PCR punto final en donde el producto de PCR es detectado tras la amplificación completa. El

monitoreo de la amplificación se basa en el aumento del incremento de la fluorescencia de las

moléculas reporteras permitiendo la cuantificación del ADN blanco. Adicionalmente es posible

cuantificar la cantidad de ADN y relacionarla con la cantidad de microorganismos en un cultivo

con base a la intensidad de la fluorescencia, que es proporcional a la cantidad de ADN inicial.

En la PCR Tiempo Real hay cuatro fases separadas en un ciclo de amplificación: una fase de

retraso inicial en la que no se detecta el producto, una fase exponencial del producto amplificado

detectado, una fase de lineal de amplificación y una fase de meseta. La cantidad inicial de ADN

puede determinarse cuando se determina el número de ciclos necesarios para que la señal

alcance un umbral arbitrario (la porción de la curva donde la señal comienza a aumentar de

forma exponencial). Esta medición se realiza en la fase exponencial, donde la señal de

fluorescencia se puede relacionar con la cantidad inicial de ADN. Se define el ciclo de


44

cuantificación (Cq) como el número de ciclo de amplificación en el cual la señal fluorescente

aumenta por encima de la línea umbral definida anteriormente. El logaritmo de la cantidad

inicial de ADN es inversamente proporcional al Cq, por lo que la cantidad de ADN inicial en

una muestra desconocida se puede determinar en una curva estándar donde se mida el Cq para

muestras de ADN de concentración conocida (Smith y Osborn, 2009; Kralik y Ricchi, 2017).

Estos conceptos se muestran en la Figura 7.

Figura 7. Ejemplo de curvas de amplificación en PCR Tiempo Real. El ciclo de cuantificación (Cq) es el ciclo en

el cual la señal de fluorescencia sobrepasa un valor umbral definido en el experimento. Una vez definido el valor

umbral, las cuantificaciones se hacen a un mismo valor de fluorescencia. A mayor concentración de ADN inicial,

menor número de ciclos son necesarios para sobrepasar el valor umbral, y el Cq se alcanzará antes. Como el Cq y

la cantidad de ADN inicial son inversamente proporcionales, se puede conocer la cantidad de ADN de una muestra

desconocida interpolando en una recta de regresión del logaritmo de ADN contra el Cq.

Los agentes fluorescentes más usados para la detección del amplicón son de dos tipos: los que

implican la unión inespecífica al ADN de doble cadena de un colorante fluorescente, como el

SYBR Green; y las sondas fluorescentes, como los TaqMan, que son oligonucleótidos

etiquetados con una molécula fluorescente complementarios al ADN de interés. Otro concepto

importante, y que se debe de tomar en cuenta para el estudio de la dinámica poblacional, es el

análisis de las curvas de desnaturalización, que miden la energía necesaria para la

desnaturalización de la doble cadena de ADN y depende de la secuencia de bases del ADN de


45

interés. Se realiza una vez terminada la amplificación. La temperatura se reduce hasta por debajo

de la temperatura de hibridación del ADN y las sondas u oligonucleótidos diseñados para la

detección del ADN y se aumenta gradualmente la temperatura. A medida que ésta va

aumentando, la doble cadena se va separando, al tiempo que se mide la disminución de

fluorescencia. La gráfica de la derivada negativa de la fluorescencia contra el aumento de la

temperatura da como resultado curvas con picos máximos que indican un valor llamado

temperatura de fusión, Tm (temperatura a la cual el 50% del ADN es cadena simple) y este valor

depende de la secuencia de nucleótidos del ADN, por lo que si la secuencia de un gene en dos

o más cepas difiere en su composición de nucleótidos, es posible diferenciarlas por medio del

análisis de las curvas de fusión, es decir, diferentes cepas tendrán diferentes valores de Tm

(Smith y Osborn, 2009; Nagarajan y Loh, 2014). El concepto de análisis de las curvas de

desnaturalización se observa en la Figura 8.

Figura 8. Ejemplo de curvas de desnaturalización de ADN. Los diferentes picos observados se deben a diferencias

en la secuencia de nucleótidos un gene o una región de ADN que se usa como marcador molecular y que puede ser

usado para diferenciar microorganismos en un cultivo mixto.


46

La PCR Tiempo Real se ha usado en varios estudios para la identificación y enumeración de

microorganismos, así como el monitoreo de los cambios poblacionales en cultivos mixtos. Se

muestran algunos de estos en el Cuadro 3.

Valera et al. (2013) identificaron y cuantificaron cepas de A. malorum y A. cerevisiae en vinos

y vinagres usando una técnica de qPCR con oligonucleótidos y sondas TaqMan para la

identificación específica de estas especies amplificando regiones ITS entre los genes 16S-23S

ARNr.

Herbel et al. (2013) usaron el gene de proteína de choque térmico 60 (hsp60) para la

cuantificación de cepas de Lactobacillus en yogurt. El ensayo permitió la identificación

específica a nivel especie de diferentes microorganismos y su cuantificación en productos

lácteos y en yogurt, con ayuda de la obtención de las curvas de desnaturalización para cada cepa.

Udomsil et al. (2016) desarrollaron un método para la cuantificación de Virgibacillus sp. y

Tetragenococcus halophilus como cultivos iniciadores para la fermentación de salsa de pescado.

Se usaron el gene de la serina proteasa-X alcalina (aprX) y regiones ITS para el diseño de sondas

de hibridación y oligonucleótidos para la detección y cuantificación específica de Virgibacillus

sp. y T. halophilus viables, lográndose el monitoreo de los cambios poblacionales de estas cepas

durante la fermentación de salsa de pescado, tanto individualmente como en cultivos mixtos.

Otros microorganismos no fueron detectados. Para la detección únicamente de las células

viables, se usó propidio monoazida, que es un colorante fotorreactivo, que se une al ADN

impidiendo su amplificación durante la PCR, pero impermeable a la membrana celular, por lo

que sólo se une al ADN de las células con membrana dañada. De este modo, pudieron

monitorear la dinámica poblacional sin una sobreestimación de la población por células muertas.

En un enfoque diferente, Lv et al. (2017) propusieron un método para el monitoreo de la

dinámica poblacional de S. fibuligera, Rhizopus oryzae, y Monascus purpureus durante el

proceso de fabricación del vino de arroz glutinoso Hong Qu usando una técnica de PCR Tiempo

Real con retrotranscripción (RT-qPCR) usando oligonucleótidos específicos para las regiones

de ITS-5.8S ARNr para los dos primeros microorganismos y oligonucleótidos específicos para

el gene de la β-tubulina para M. purpureus. Para cuantificar células viables, usaron como

templado en vez de ADN, el ARN total, el cual se usó para producir el ADNc por


47

retrotranscripción para posteriormente realizar la qPCR, logrando de este modo la cuantificación

específica de dichos microoganismos durante la fabricación del vino.

3.8.2. rep-PCR

Las técnicas de “fingerprinting” en las que se amplifican secuencias repetitivas distribuidas a

lo largo del genoma de los organismos se agrupan bajo el nombre de rep-PCR. Se pueden

mencionar las técnicas de REP-PCR (repetitive extragenic palinromic), ERIC-PCR

(enterobacterial repetitive intergenic consensus), los elementos BOX y las secuencias repetitivas

(GTG)n (Agrawal, Agrawal y Shrivastava, 2015). Las secuencias REP, descubiertas

inicialmente en E. coli, consisten en secuencias de aproximadamente 35 pb con un motivo

central palindrómico altamente conservado. Se han encontrado generalmente en regiones entre

genes en bacterias. Las secuencias REP pueden tener variaciones de acuerdo a la especie

Aranda-Olmedo et al. (2002) (Figura 9A y 9B). Por su parte, las secuencias ERIC son

palíndromos imperfectos de 127 pb, aunque pueden ser más grandes o pequeñas debido a

inserciones o deleciones internas (Figura 9C). Están localizadas en regiones intergénicas y,

como las REP, distribuidas a lo largo del genoma. Se han encontrado principalmente en

enterobacterias como E. coli, Salmonella typhimurium, S. entérica y Vibrio cholera (Wilson y

Sharp, 2006). Los elementos BOX consisten en tres regiones de 59, 45 y 50 pb denominadas

boxA, boxB y boxC, encontradas generalmente en regiones no codificantes en diferentes

combinaciones (van Belkmun y Hermans, 2001) (Figura 9D). Algunos de estos elementos, como

REP y ERIC, pese a que fueron inicialmente descubiertas en bacterias, se ha encontrado que

pueden usarse también en eucariotas. En muchos de estos microorganismos, los

oligonucleótidos usados hibridan al azar con secuencias parcialmente similares a secuencias

REP o ERIC genuinas, distribuidas en el genoma de los microorganismos (Gillings y Holley,

1997; Mehta, Mehta y Rosato, 2002; Hierro et al., 2004).


48

Figura 9. A: secuencias consenso de REP en bacterias (modificado de Versalovic, Koeuth y Lupski 1991). B:

secuencias consenso de REP en Pseudomonas putida (modificado de Aranda-Olmedo et al., 2002). Las bases en

rojo representan aquellas conservadas en 90% de 804 secuencias REP en dicha especie, mientras que las letras

azules representan aquellas bases conservadas en 50% de las secuencias. El motivo central palindrómico esta

subrayado. C: secuencia ERIC descrita (modificado de Wilson y Sharp 2006). D: estructura secundaria de una

secuencia BOX consenso. Los pares de bases apareados se indican con un círculo negro. El límite entre la secuencia

boxA y boxB es el nucleótido en posición 60, el límite entre boxB y boxC es el nucleótido 104 (modificado de van

Belkmun y Hermans, 2001).

Entre los primeros trabajos para el uso de estos elementos para la identificación de

microorganismos se encuentra el de Versalovic, Koeuth y Lupski (1991), que desarrollaron


49

oligonucleótidos para las regiones REP y ERIC en procariotas, demostrando la utilidad de esta

técnica en la distinción de microorganismos. El uso de secuencias repetitivas para el análisis de

genomas de microorganismos ha servido para realizar estudios sobre microbiología ecológica,

ambiental, diagnóstico médico y epidemiología. Debido a que cada microorganismo tiene

secuencias repetitivas distribuidas de diferente manera en el genoma, se obtienen varios

amplicones en una PCR por cada microorganismo y el polimorfismo observado entre distintos

microorganismos está en función al número de unidades repetitivas y a la distancia entre

elementos repetitivos adyacentes. Esto se traduce en patrones de bandeo únicos cuando los

productos de PCR se resuelven por electroforesis. Las técnicas de rep-PCR tiene las ventajas de

ser simple y rápido en comparación con otras técnicas como PFGE (electroforesis en gel de

campo pulsado) (Fernández-Cuenca, López-Cerero y Pascual-Hernández, 2013). Esta técnica

permite comparar la estructura de diferentes comunidades microbianas, la diversidad genética o

monitorear cambios poblacionales, pero no da información taxonómica directa, para lo cual

depende de que los microrganismos sean aislados para conocer el perfil de bandeo individual.

Con esta técnica es posible también monitorear la ausencia o presencia de un determinado

microorganismo durante los cambios poblacionales en un cultivo mixto por la ausencia o

presencia de bandas específicas. Por otro lado, la calidad y la utilidad de estas técnicas están

influenciadas por la misma reacción de PCR y por los métodos utilizados para resolver los

amplicones generados, siendo afectadas por factores como la calidad de los reactivos de la PCR,

el tipo de Taq-polimerasa utilizada, e incluso en la intensidad de las bandas en el gel de

electroforesis (Ishii y Sadowsky, 2009; Agrawal, Agrawal y Shrivastava, 2015).

Ejemplos de trabajos donde se han aplicado estas técnicas para la tipificación de

microorganismos y estudios de dinámica poblacional en cultivos mixtos se muestran en el

Cuadro 3.

Por ejemplo, Katara et al. (2012) obtuvieron diferentes perfiles de bandeo en distintas cepas de

B. thuringiensis aisladas en diferentes hábitats de India usando REP-PCR y ERIC-PCR,

logrando discriminar varias de éstas. Ayu, Suwanto y Barus (2014) usaron la técnica de ERIC-

PCR para determinar la diversidad genética de Klebsiella pneumoniae en el alimento

fermentado tempeh y discriminarlas de las variedades patógenas encontradas en aislamientos


50

clínicos. Jarocki et al. (2016) usaron varias técnicas de biología molecular para la discriminación

de bifidobacterias (RAPD, ARDRA y rep-PCR con oligonucleótidos de BOX y (GTG)5.

Encontraron que las técnicas de rep-PCR tuvieron un mayor poder discriminatorio que la técnica

de ARDRA y similar a la RAPD-PCR, diferenciando incluso cepas a nivel intra-especie.

Visintin et al. (2017) usaron una técnica de “fingerprinting” con (GTG)5-PCR y por qPCR para

monitorear los cambios poblacionales de S. cerevisiae y Torulaspora delbrueckii como cultivos

iniciadores para la fermentación de granos de cacao, encontrando que T. delbrueckii aparecía al

inicio de la fermentación para ir disminuyendo mientras que S. cerevisiae dominó

posteriormente la fermentación.

Cuadro 3. Estudios relacionados con la aplicación de técnicas de qPCR y rep-PCR para la caracterización y

cuantificación de microoganismos y cultivos mixtos.

Autor Resultados

Lv et al. (2017)

Se usó la técnica de RT-qPCR (qPCR con transcripción reversa) para la cuantificación

de S. fibuligera, R. oryzae y M. purpureus durante el proceso tradicional de

fabricación del vino de arroz glutinoso Hong Qu. Se usaron oligonucleótidos

específicos para especies basados en ITS-5.8S ARNr para los dos primeros

microorganismos y oligonucleótidos específicos para el gene de la β-tubulina para M.

purpureus. El método desarrollado mostró 100% de inclusividad y 100% de

exclusividad. La especificidad de los oligonucleótidos fue ensayada con el ADNc

objetivo mezclado con otros ADNc y los resultados mostraron que no hubo diferencia

entre el valor de Cq obtenido con el ADNc solitario y el valor de Cq del ADNc cuando

se encuentra en mezcla. Los oligonucleótidos probados con 26 especies fúngicas

filogenéticamente relacionadas o encontradas comúnmente en el proceso de

fabricación del vino dieron resultados positivos de qPCR sólo para la especie para la

cual fueron diseñados. Uno sólo pico fue observado en las curvas de desnaturalización

con los respectivos oligonucleótidos ensayados. Los límites de detección fueron de

101 copias de genes/µl para S. fibuligera, 102 copias de genes/µl para R. oryzae y M.

purpureus. La eficiencia de la qPCR fue de 90.87%, 94.695 y 95.60% para S.

fibuligera, R. oryzae y M. purpureus, respectivamente. También se logró la

cuantificación de sólo las células viables al usar el ARn en vez del ADN. Se usó la

metodología desarrollada para el monitoreo de los cambios poblacionales de las tres

especies durante la elaboración del vino de arroz glutinoso Hong Qu.


51

Visintin et al. (2017)

Se monitorearon los cambios poblacionales de S. cerevisiae y T. delbrueckii utilizadas

como cultivos iniciadores durante la fermentación de granos de cacao. Se tipificaron

aislamientos obtenidos durante la fermentación mediante la técnica de (GTG)5-PCR.

Como resultado, se encontró que durante las primeras 24 h T. delbrueckii fue el

microorganismo predominante, siendo la mayoría de los aislamientos identificados

como pertenecientes a esta especie, mientras que S. cerevisiae predominó en las

etapas posteriores. Mediante qPCR con oligonucleótidos específicos para especies se

observó que T. delbrueckii fue disminuyendo con el paso del tiempo en la

fermentación mientras que S. cerevisiae aumentó su población.

Jarocki et al. (2016)

Se usaron varias técnicas de varias técnicas moleculares (ARDRA, RAPD-PCR y rep-

PCR con oligonucleótidos de BOX y (GTG)5 para la diferenciación de bifidobacterias

a niveles de especie, sub-especie y cepa. Las técncias de RAPD-PCR y rep-PCR

mostraron mayor capacidad dsicrminativa que ARDRA a todos los niveles, pero los

patrones de bandeo fueron más reproducibles con ARDRA que en las otras dos

técnicas.

Udomsil et al. (2016)

Se desarrolló una metodología de qPCR para la cuantificación de Virgibacillus sp.

SK37 y T. halophilus MS33 usados como cultivos iniciadores en fermentaciones de

salsa de pescado. El ensayo de PCR se acopló con el uso del propidio monoazida

(PMA) para la detección de únicamente células viables. Mediante el gene de la serina

proteasa-X alcalina (aprX) se diseñaron sondas y oligonucleótidos para la detección

y cuantificación específica de Virgibacillus sp. Del mismo modo, se usaron regiones

ITS para el diseño de sondas y oligonucleótidos para la detección y cuantificación de

T. halophilus, probándose la especificidad en 28 aislamientos de salsa de pescado y

seis cepas de referencia, incluyendo a V. halodenitrificans y a T. halophilus,

mostrando el ensayo especificidad a nivel especie, pero no a nivel de cepas. La

eficiencia de la qPCR fue 101.1% para V. halodenitrificans y de 90.2% para T.

halophilus. El límite de detección fue de 103 UFC/ml para V. halodenitrificans y 102

UFC/ml para T. halophilus. El desarrollo de la metodología PMA-Qpcr fue exitoso

para el monitoreo de los cambios poblacionales de ambos microroganismos la

fermentación de salsa de pescado. En contraste, una técnica de plaqueo de los

microorganismos aislados a lo largo de la fermentación mostró poca especificidad.


52

Ayu, Suwanto y Barus

(2014)

Se usó la técnica de ERIC-PCR para la diferenciación de cepas de K. pneumoniae

patógenas y cepas encontradas en el alimento fermentado tempeh. Los patrones de

ERIC-PCR de aislamientos provenientes de tempeh mostraron un patrón similar. Los

aislamientos médicos mostraron patrones diversos pero distintos de los provenientes

de tempeh. En un árbol filogenético construido con los patrones de bandeo, las cepas

provenientes de tempeh se dividieron en dos grupos, mientras que las cepas de

aislamientos médicos formaron un grupo distinto.

Herbel et al. (2013)

Se usó el gene de proteína de choque térmico 60 (hsp60) para la identificación

específica de cepas de Lactobacillus (L. acidophilus, L. brevis, L. delbrueckii subsp.

bulgaricus, L. helveticus y L. reuteri). Los microorganismos pudieron diferenciarse

por medio de sus valores de Cq y las curvas de desnaturalización. El límite de

detección para todos los microorganismos estuvo entre 104 a 106 UFC/ml. Se

cuantificó a L. delbrueckii subsp. bulgaricus en muestras de yogurt comercial.

Valera et al. (2013)

Se Identificación y cuantificación cepas de A. malorum y A. cerevisiae en vinos y

vinagres mediante qPCR usando oligonucleótidos y sondas TaqMan-MGB para la

región ITS entre los genes 16S-23S. Los oligonucleótidos y las sondas fueron

altamente específicos, con un límite de detección de 102 células/ml para ambas

especies, y la eficiencia de la técnica fue superior al 80%. La técnica fue aplicada en

muestras de vinos para evaluar la población de Bacterias ácido acéticas (AAB),

usando las sondas diseñadas y otras cinco previamente disponibles, cada una para una

especie específca de bacteria. Se logró la enumeración de cada una de las AAB y cada

especie fue detectada en las muestras. En contraste, con técnicas de plaqueo sólo se

cuatro de las siete especies evaluadas.

Katara et al. (2012)

Se tipificaron 113 cepas de B. thuringiensus nativas de la India aisladas de diferentes

localizaciones y 27 cepas de B. thuringiensus de un banco de cepas. Se usaron las

técnicas de REP-PCR y ERIC-PCR. Ambas técnicas fueron suficientemente

discriminatorias para mostrar diferencias en los aislamientos y las cepas de referencia.

El poder de resolución y el índice de marcador de la ERIC-PCR fue de RP 9.39, MI

6.34, mientras que para REP-PCR fue de RP 6.20, MI 4.4, mostrando la ERIC-PCR

ser la más informativa entre las dos técnicas.

3.9. Técnicas de tipificación de Candida spp.

El género Candida está compuesto por levaduras que comprende alrededor de 150 a 200

especies ubicuas alrededor del mundo. Algunas de estas son patógenas para el ser humano.


53

Pueden crecer como levadura o tener crecimiento filamentoso (formación de hifas o

pseudohifas) (Neppelenbroek et al., 2014). En el área de producción de bioetanol, varias

levaduras de éste género se han usado en cultivos individuales y mixtos en la fermentación de

biomasa lignocelulósica (Acourene y Ammouche, 2012; Hickert et al., 2013; Thongdumyu,

Intrasungkha y O-Thong, 2014; Hermansyah, Novia y Wiraningsih, 2016; Sopandi y Wardah,

2017).

Varias técnicas fenotípicas y moleculares se han desarrollado para la identificación de levaduras

de este género. Los métodos convencionales para la identificación de especies del género

Candida están basados en características morfológicas o fisiológicas, desarrollándose incluso

sistemas automatizados para la identificación rutinaria. Sin embargo, debido a la variabilidad

en las características fenotípicas, también se han aplicado los métodos moleculares para su

identificación. Algunas de las técnicas morfológicas y fisiológicas se mencionan a continuación.

Las características coloniales y microscópicas diferenciales en medios de cultivo especiales son

utilizadas para la identificación. Algunos de estos medios son el SDA (agar dextrosa

Sabouraud), agar Tween 80 con harina de maíz. Es posible observar estructuras como el tubo

germinal, característico de C. albicans, o las clamidiosporas, peculiares de C. albicans, C.

dubliniensis y algunos aislamientos de C. tropicalis. La formación de estas estructuras tiene

diferentes patrones entre especies y depende también del medio de cultivo donde las desarrollen.

La temperatura de crecimiento también puede usarse para la identificación, como en el caso de

C. dubliniensis y C. albicans, la primera de las cuales tiene un nulo o pobre crecimiento a 42-

45 °C, mientras que la segunda crece bien a dichas temperaturas (Neppelenbroek et al., 2014).

Otros medios cromogénicos, como CHROMagar, se basan en la detección de determinadas

actividades enzimáticas por parte de las levaduras mediante la hidrólisis específica de un

sustrato cromogénico. El uso de este método tiene la ventaja de facilitar la detección en mezclas

de levaduras. En CHROMagar, las colonias de C. glabrata son rosadas o púrpuras, al contrario

de C. albicans, que son verde esmeralda, las de C. parapsilopsis son blancas, las de C.

dubliniensis son verde oscuro y las de C. tropicalis son azul oscuro (Silva et al., 2012;

Neppelenbroek et al., 2014). Otras técnicas son las pruebas de asimilación y fermentación de

carbohidratos o nitrógeno, así como actividades enzimáticas, que suelen emplearse con ayuda

de kits de detección basados en pruebas de asimilación de nutrientes y enzimáticas como API


54

20C AUX, Auxacolor y Uni-Yeast-Tek. El sistema API 20C AUX se basa en la asimilación de

19 carbohidratos. La identificación se apoya con un sistema computarizado que genera un valor

de confianza de identificación de acuerdo a los resultados. El sistema Auxacolor es una

microplaca con 16 pocillos donde se evalúa la asimilación de 13 carbohidratos, resistencia a la

actidiona y actividad fenoloxidasa. El sistema Uni-Yeast-Tek evalúa la asimilación de carbono

y nitrato en placas de agar, así como un medio agar Tween 80 con harina de maíz para la

observación de características morfológicas (Neppelenbroek et al., 2014).

Las técnicas moleculares también se han usado para la detección e identificación de levaduras

del género Candida dadas su alta precisión, sensibilidad y especificidad, no dependiendo de la

diferenciación de características fenotípicas que presentan variabilidad o imprecisiones para su

análisis. Varias de las técnicas de biología molecular mencionadas en la sección anterior, como

los RFLP, los AFLP, los microarreglos, la PCR Tiempo Real, FISH, SSCP, y otras se han

aplicado para la identificación y diferenciación de levaduras del género Candida (Singh, 2014).

El análisis cariotípico electroforético ha evolucionado con el desarrollo de la PFGE, que

resuelve fragmentos de ADN de 50 kb sometiéndolos a un campo que alterna su dirección

(López et al., 2005). Otra técnica molecular que se ha usado es la dHPLC. Telleria et al. (2012)

usaron la HPLC en condiciones no desnaturalizantes para identificar a C. parapsilosis, C.

tropicalis, C. albicans, C. gullermondii, C. nivariensis, C. glabrata y C. bracarensis con base a

amplicones de regiones ITS. La técnica de amplificación basada en la secuencia de ácidos

nucleicos (NASBA) es una técnica sensible de amplificación de ARN que requiere la acción de

tres enzimas: transcriptasa inversa, RNasa H y ARN polimerasa T7 en un proceso isotérmico de

amplificación que usa al ADNc como intermediario. Su principal ventaja con respecto a la PCR

es que no requiere un termociclador, y la detección específica de células vivas al usar el ARN

en vez de ADN (Singh, 2014).

Los métodos de PCR, adoptan dos estrategias. La primera, cuando se requiere la identificación

específica se usan oligonucleótidos específicos de una especie. También se pueden usar

oligonucleótidos universales si se está buscando un amplio espectro de especies, lo cual requiere

de un análisis post-PCR para la identificación específica (Singh, 2014). La PCR y la PCR

Tiempo Real se ha usado para la identificación, discriminación y cuantificación de levaduras


55

del género Candida (Arancia et al., 2009; Fricke et al., 2010; Bineshian et al., 2015) y expresión

de genes bajo diferentes tratamientos, como por ejemplo bajo tratamiento con medicamentos en

cepas de interés clínico (Li, Skinner y Bennett, 2012). Las técnicas de rep-PCR también se han

usado para la identificación de levaduras del género Candida (Hierro et al., 2004; Abaci et al.,

2011).

3.10. Xilulosa cinasa

La xilulosa cinasa (XK: E.C.2.7.1.17) es una enzima clave en el metabolismo de la xilosa.

Cataliza la reacción, dependiente de ATP, de la xilulosa (intermediario en la ruta de asimilación

de la xilosa) en xilulosa-5-fosfato en un paso clave del metabolismo de xilosa, antes de que sea

canalizada a la ruta de las pentosas fosfato y a la ruta glucolítica. También es clave en el

metabolismo de la L-arabinosa, ya que esta es convertida en xilulosa a través de una serie de

reacciones redox, antes de ser incorporada a la ruta de las pentosas fosfato (Pival et al., 2011;

Wang et al., 2011). La reacción catalizada es la siguiente:

𝐷 − 𝑥𝑖𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑎 + 𝐴𝑇𝑃 − 𝑀𝑔2+ → 𝐷 − 𝑥𝑖𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑎 − 5 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜 + 𝐴𝐷𝑃 − 𝑀𝑔2+

Esta enzima pertenece a la superfamilia de las ATPasas y dentro de éstas, a la familia las

carbohidrato cinasas. Los miembros de esta superfamilia tienen dos dominios, el dominio I y el

dominio II (también llamados FGGY_N y FGGY_C al referirse específicamente a las

carbohidrato cinasas), los cuales están separados por una hendidura en donde se encuentra el

sitio activo y en donde se unen el azúcar sustrato y el ATP. Cada uno de estos dominios está

compuesto, a su vez, de dos subdominios: Ia, IIa, Ib y IIb. Los subdominios Ia y IIa tienen una

estructura similar, consistente en una hoja plegada β rodeada por hélices α, con idéntica

topología de conexiones con “loops”. El azúcar sustrato se une profundamente dentro de la

hendidura donde se encuentra el sitio catalítico, formando interacciones principalmente con el

dominio N-terminal, mientras que el ATP se une cerca del punto de contacto de los dominios

N- y C-terminales. En este grupo de enzimas hay 5 motivos conservados: Phospate I, Phospate

II, Adenosine, Connect I y Connect II (Bork, Sander y Valencia, 1992; Di Luccio et al., 2007).

También, fuera de este núcleo catalítico conservado se pueden encontrar diferencias entre

secuencias de distintas especies. Por otro lado, se conoce el mecanismo de reacción que cataliza


56

la hidrólisis del γ-fosfato o, como en el caso de la xilulosa cinasa, la transferencia del fosfato a

un grupo hidroxilo de un azúcar. La catálisis está precedida por un cierre del sitio activo para

impedir la entrada del solvente, el cual es inducido por la unión del sustrato. La transferencia

del grupo fosfato es promovida por dos residuos de aspartato altamente conservados, uno

localizado en la región N-terminal del dominio I y que interacciona con el ATP-Mg2+, además

que parece tener una función de estabilización del grupo saliente de ADP durante la

transferencia del grupo fosfato al azúcar. El otro residuo tiene una función de base general,

desportonando al grupo hidroxilo del carbono 5, haciéndolo un mejor nucleófilo para el ataque

al grupo fosfato. Otro residuo conservado importante es un residuo de treonina que parece

estabilizar el estado de transición durante el ataque nucleofílico a través de un puente de

hidrógeno con el oxígeno del grupo hidroxilo cargado negativamente (Di Luccio et al., 2007).

En la Figura 10 se presenta la estructura general de las ATPasas, como modelo de la estructura

de la xilulosa cinasa.

Figura 10. Estructura general de las ATPasas, que engloba a las enzimas carbohidrato cinasas y a las XK

(modificado de Bork, Sander y Valencia, 1992).


57

Como se ha comentado anteriormente, recientemente se ha estudiado la capacidad fermentativa

de cepas de C. glabrata (T1 y LR2) en mezclas de hexosas y pentosas que simulan la

composición de azúcares de residuos cítricos (Estrada-Martínez, 2013). Estas cepas fueron

aisladas de líquido ruminal bovino (LR2) y de estómago de termina (T1) y se ha observado que

tienen distintos perfiles de asimilación en mezclas de hexosas y pentosas (glucosa, fructosa,

manosa, xilosa y arabinosa) y producen etanol a partir de éstas. También tienen una capacidad

diferente en su asimilación de xilosa. Asimismo, han sido caracterizadas molecularmente,

mediante secuencias de ITS y se ha comprobado que se trata de cepas distintas. A pesar de

conocerse su capacidad de producción de etanol y de asimilación de carbohidratos

individualmente, es posible que en cultivos mixtos de ambas levaduras se observe una mejora

en la asimilación de carbohidratos y producción de etanol. Para la caracterización de este tipo

de cultivos es necesario conocer los cambios poblacionales a lo largo de la fermentación. Sin

embargo, dichas cepas poseen características coloniales y microscópicas similares, por lo que

es difícil distinguirlas. Se propone diferenciarlas por medio de técnicas moleculares, empleando

para este fin un gene clave de la ruta de asimilación de los carbohidratos como marcador

molecular. Una propuesta es emplear el gene XK para dichas cepas con capacidades diferentes

de asimilación de xilosa, por lo que se espera que las cepas podrían tener diferencias en su

secuencia. Se propone el uso de la técnica de PCR en Tiempo-Real con la técnica de curvas de

desnaturalización para estudiar la dinámica poblacional de cultivos mixtos de levaduras, con lo

que se tendría un mejor conocimiento de los cultivos mixtos para mejorar los procesos de

fermentación.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

58

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La eficiente obtención de bioetanol a partir de la fermentación de carbohidratos que componen

la biomasa lignocelulósica requiere de microorganismos capaces de realizar la completa

utilización de las hexosas y pentosas presentes en el material. Sin embargo, es difícil encontrar

microorganismos que puedan fermentar todos los azúcares presentes en los hidrolizados

lignocelulósicos, teniendo capacidades diferentes y preferenciales por algunos azúcares,

disminuyendo la eficiencia en el uso de los otros azúcares. El uso de cultivos mixtos con

microorganismos con diferentes perfiles de asimilación de azúcares y de fermentación es una

opción para mejorar la producción, eficiencia y productividad. La adecuada caracterización de

este tipo de cultivos requiere conocer los cambios poblacionales a lo largo de la fermentación.

La diferenciación de cepas con características macroscópicas y microscópicas similares es

difícil, siendo una opción el uso de técnicas moleculares que requieren del uso de marcadores

moleculares adecuados. El uso de genes de la ruta de asimilación de carbohidratos como

marcadores moleculares para la diferenciación de cepas en una fermentación mixta es una

opción para entender mejor el desempeño por parte de los microorganismos durante la

fermentación. Se plantea la utilización del gene XK para la diferenciación de dos cepas de C.

glabrata (T1 y LR2) que poseen características microscópicas y macroscópicas similares, pero

capacidades diferentes de asimilación de xilosa, durante la fermentación de mezclas de

carbohidratos.

JUSTIFICACIÓN

59

5. JUSTIFICACIÓN

En la actualidad, con el agotamiento y encarecimiento de los combustibles fósiles, así como el

cambio climático debido a las emisiones de gases de efecto invernadero, existe una tendencia

hacia la producción de fuentes energéticas renovables, más amigables al ambiente y más

económicas. Es de especial interés el bioetanol proveniente del material lignocelulósico de

residuos agroindustriales y municipales, debido a la abundancia de estas fuentes. En este

material hay tanto hexosas como pentosas que deben ser fermentadas para tener buenos

rendimientos de producción de etanol, por lo que es importante contar con cepas capaces de

fermentar estos carbohidratos. Dadas las diferencias en capacidad y preferencia de los

microoganismos por distintos azúcares, el empleo de cultivos mixtos con microrganismos

silvestres con diferentes capacidades de asimilación y fermentación es una alternativa para

aumentar los rendimientos de producción, adicionalmente muchos microorganismos se

encuentran patentados y no están disponibles para usarse libremente. El estudio de los cambios

poblacionales de los cultivos mixtos es importante para hacer más eficientes los procesos

productivos, por lo que es necesario contar con metodologías, como las de biología molecular,

que permitan identificar y cuantificar las diferentes cepas durante la fermentación. Las cepas de

C. glabrata T1 y LR2 tienen diferentes capacidades en la asimilación de xilosa. La xilulosa

cinasa es una enzima importante en la ruta de asimilación de la xilosa para la producción de

etanol. El uso de esta enzima como marcador molecular en estas cepas con diferentes

capacidades de asimilación del azúcar podría ser útil para evaluar el desempeño de los

microorganismos durante la asimilación de xilosa, una pentosa abundante en los materiales

lignocelulósicos, lo que le daría un valor agregado al uso de las herramientas moleculares para

el estudio de los cultivos mixtos.

HIPÓTESIS

60

6. HIPÓTESIS

El empleo de técnicas de biología molecular usando el gene XK como marcador molecular

permitirá diferenciar y cuantificar las diferentes levaduras silvestres (LR2 y T1) en un cultivo

mixto permitiendo determinar la dinámica poblacional de las mismas durante la fermentación

de mezclas de carbohidratos en un medio sintético.

OBJETIVOS

61

7. OBJETIVOS

7.1. Objetivo general

Estudiar la dinámica poblacional de un cultivo mixto de dos levaduras silvestres durante la

fermentación de una mezcla de carbohidratos.

7.2. Objetivos específicos

1. Determinar los parámetros cinéticos de crecimiento y fermentación de las levaduras

individuales en un medio sintético.

2. Analizar in silico la secuencia parcial de los genes XK de las dos levaduras fermentadoras.

3. Determinar los patrones de “fingerprinting” por REP-PCR de las dos levaduras

fermentadoras.

4. Establecer las condiciones de fermentación de los cultivos mixtos en medio sintético con

mezcla de carbohidratos.

5. Determinar el perfil de asimilación de azúcares y parámetros de fermentación de un cultivo

mixto de levaduras silvestres para la producción de alcohol a partir de la mezcla de

carbohidratos.

METODOLOGÍA

62

8. METODOLOGÍA

8.1. Microorganismos

Se utilizaron dos cepas silvestres de C. glabrata, una aislada de líquido ruminal bovino (LR2)

y la otra de estómago de termita (T1), como se muestra en el Cuadro 4.

Cuadro 4. Identificación de las levaduras silvestres usadas en este trabajo.

*NRRL (ARS Culture Collection, USA): Número de registro en el banco de cepas

NR**: no registrada

8.2. Medios de cultivo

8.2.1. Medio de cultivo YPD

Para la propagación de las levaduras previa inoculación en los medios de fermentación, se usó

el medio YPD, el cual está constituído por dextrosa (20 g·L-1), peptona de caseína (20 g·L-1) y

extracto de levadura (10 g·L-1).

8.2.2. Medio de fermentación

Para determinar los perfiles de asimilación y los parámetros cinéticos de crecimiento y de

fermentación de las levaduras de manera individual y en cultivo mixto se utilizó un medio

mínimo base nitrógeno con mezcla de carbohidratos a una concentración total de 120 g·L-1, cuya

composición se muestra en el Cuadro 5.

Cepa Especie Origen NRRL*

LR2 C. glabrata Líquido ruminal bovino NR**

T1 C. glabrata Estómago de termita Y-50877

METODOLOGÍA

63

Cuadro 5. Medio mínimo base nitrógeno para levaduras suplementado con carbohidratos como fuente de carbono

(Wilkins et al., 2005; Atlas, 2010; Boluda-Aguilar y López-Gómez, 2013).

Fuente de carbono (%) Sales (g·L-1 o mg·L-1) Sales (g·L-1 o mg·L-1)

Glucosa 51

Fructosa 30

Galactosa 8.0

Arabinosa 7.0

Xilosa 2.0

Sacarosa 2.0

(NH4)2SO4 5.0 g

KH2PO4 1.0 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

NaCl 0.1 g

CaCl2.2H2O 0.1 g

KI 1.0 mg

H3BO3 0.5 mg

ZnSO47H2O 0.4 mg

MnSO4.4H2O 0.4 mg

FeCl3 0.2 mg

Na2MoO4.4H2O 0.2 mg

CuSO4.5H2O 0.04 mg

8.3. Determinación de los parámetros cinéticos de crecimiento y fermentación de las

levaduras individuales en un medio sintético con mezcla de carbohidratos

8.3.1. Propagación de las levaduras (preparación del inóculo)

Se siguió el esquema para la cinética de fermentación de la Figura 11. Las cepas LR2 y T1,

conservadas en YPD-glicerol (60:40 v:v) a -20 °C a una concentración de 1000 x 106

células·mL-1 por vial, se inocularon de manera individual en un matraz Erlenmeyer con 100 mL

de YPD (previamente ajustado a pH 4.5), usando por cepa 3 mL de microorganismo en glicerol.

Cada cepa fue incubada durante seis horas a 35 °C y 200 rpm. Se determinó la población celular

por conteo en cámara de Neubauer (40x) a la hora cero y la hora seis. Los cultivos se

centrifugaron a 4700 rpm, 4 °C durante 20 min y el paquete celular se lavó dos veces con

solución fisiológica estéril. El pellet se resuspendió en medio base nitrógeno con mezcla de

carbohidratos, ajustando previamente el pH a 4.5 (Cuadro 5).

METODOLOGÍA

64

8.3.2. Fermentación en un medio sintético con mezcla de carbohidratos para determinar

los parámetros cinéticos de crecimiento y de fermentación de las levaduras individuales

El cultivo resuspendido en medio base nitrógeno con mezcla de carbohidratos se inoculó por

duplicado en matraces Erlenmeyer de 500 mL que contenían este mismo medio (Cuadro 5), con

el pH previamente ajustado a 4.5. Para esto, se determinó la población celular en el inóculo

resuspendido por conteo directo en cámara de Neubauer (40x) y se calculó el volumen de

inóculo necesario para tener una población inicial de 20 x 106 células·mL-1 en 300 mL de

cultivo. El medio contenía 120 g·L-1 de carbohidratos totales (gluosa, fructosa, galactosa,

arabinosa, xilosa y sacarosa), en proporción similar a las encontradas en residuos cítricos, de

acuerdo a Wilkins et al. (2005) y Boluda-Aguilar y López-Gómez (2013), como se especifica

en el Cuadro 5. Una vez inoculadas las cepas, los cultivos se incubaron a sus mejores

condiciones de fermentación de acuerdo a los resultados de Estrada-Martínez (2013). Las

condiciones de incubación de la cepa T1 fueron 35 °C y 200 rpm, mientras que el cultivo de la

cepa LR2 se incubó a 40 °C y 200 rpm. La fermentación se realizó durante 10 días. El esquema

de la cinética de fermentación en medio mínimo con mezcla de carbohidratos se detalla en la

Figura 11. Cada cinética se realizó por duplicado.

El procesamiento de las muestras tomadas a lo largo de la cinética se esquematiza en la Figura

12. Para cada muestra, una parte fue usada para monitorear el crecimiento de los

microorganismos por conteo directo en microscopio a 40x en una cámara de Neubauer y por

medición de la absorbancia a 450nm. La otra parte se centrifugó a 4700 rpm, 4 °C, 20 min. El

pellet celular se usó para determinar el peso seco, lavándose previamente dos veces con agua

destilada estéril y centrifugando a las condiciones anteriores, resuspendiendose en agua

destilada y secándose en estufa a 80 °C sobre unas charolas de aluminio previamente taradas a

peso constante. El sobrenadante se guardó a -20 °C para el análisis de azúcares y etanol. La

mezcla de azúcares se analizó por UPLC acoplado a un espectrómetro de masas (MS). El etanol

se determinó por el método del dicromato de potasio. Los detalles de las metodologías usadas

para las determinaciones analíticas se muestran en la sección 8.8 y en el Anexo 1.

METODOLOGÍA

65

Figura 11. Esquema de las cinéticas de fermentación de los cultivos individuales y mixtos en medio mínimo con

mezcla de carbohidratos.

METODOLOGÍA

66

Figura 12. Esquema del procesamiento de las muestras.

METODOLOGÍA

67


y LR2

8.4.1. Diseño de oligonucleótidos para la amplificación de un fragmento del gene XK en las

cepas de C. glabrata T1 y LR2

La búsqueda de secuencias de genes XK pertenecientes a levaduras del género Candida se

realizó en la base de datos del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Posteriormente se hizo

un alineamiento multiple usando el programa CLC Sequence Viewer versión 7.8.1

(https://www.qiagenbioinformatics.com), utilizando las regiones conservadas, observadas en el

alineamiento, se diseñaron oligonucleótidos “forward” y “reverse”. Para el cálculo de la Tm y

las energías de formación de dímeros y estructuras secundarias, los oligonucleótidos se

analizaron con el programa OligoAnalyzer 3.1 del IDT (https://www.idtdna.com/calc/analyzer)

y la aplicación de análisis de oligonucleótidos de Eurofins Genomics

(https://www.eurofinsgenomics.eu/). Se propusieron varias parejas de oligonucleótidos para la

amplificación de secuencias parciales de genes XK en las cepas de C. glabrata T1 y LR2.

8.4.2. Extracción de ADN

El ADN de las cepas de C. glabrata T1 y LR2 se extrajo por un método de fenol-cloroformo

como se describe a continuación. Primeramente, se reactivaron las cepas conservadas en discos

de papel filtro inoculándolas en medio YPD (pH 4.5) e incubándolas a 35 °C y 200 rpm durante

aproximadamente 16 h. Posteriormente se tomó 1 mL del cultivo crecido y se trasvasó a un tubo

eppendorf de 1.5 mL. Se centrifugó a 13000 rpm por 5 min, se desechó el sobrenadante y se

conservó la pastilla. Se realizó este procedimiento dos veces más de manera secuencial en el

mismo tubo eppendorf para aumentar la biomasa, centrifugando un total de 3 mL de cultivo por

extracción. Posteriormente, en cada tubo eppendorf se agregaron 500 µL de buffer de extracción

(200 mM Tris-HCl, pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) y 4 perlas de vidrio de

5 mm de diámetro. Los tubos se agitaron en vórtex durante 2 min y 30 s. Posteriormente se

incubaron por 10 min a temperatura ambiente. Tras la incubación, se añadieron 500 µL de fenol-

cloroformo 25/25 refrigerado a 4 °C y se homogeneizó el contenido mediante agitación con

vórtex por 5 min. Se centrifugaron los tubos a 13000 rpm por 30 min y se transfirió la fase

METODOLOGÍA

68

acuosa (superior) a un nuevo tubo eppendorf en el cual se adicionaron 400 µL de cloroformo

frío. Se homogeneizó el contenido por agitación con vórtex durante 1 min y posteriormente se

realizó una centrifugación durante 5 min a 13000 rpm para la separación de las fases. La fase

acuosa (superior) se transfirió en un nuevo tubo eppendorf y se adicionaron 4 µL de RNasa (10

mg·mL-1). Los tubos se dejaron incubar a 37 °C por 30 min y 450 rpm. Tras la incubación se

añadió a los tubos 500 µL de isoporpanol frío, se homogeneizó el contenido de los tubos por

inversión ligera y se incubaron a -20 °C durante aproximadamente 1 h y 30 min. Se realizó una

centrifugación a 13000 rpm por 5 min y se decantó el sobrenadante. En el tubo se adicionaron

500 µL de etanol al 70% frío, se mezcló el contenido por inversión ligera y se volvió a

centrifugar a las mismas condiciones anteriores para desechar el sobrenadante y recuperar las

pastillas de ADN. Éstas se dejaron secar sobre papel absorbente y se resuspendieron en 50 µL

de agua Milli-Q estéril. El ADN se almacenó a -20 °C hasta su uso.

La calidad del ADN se evaluó por observación de la integridad del ADN en gel agarosa y

mediante espectrofotometría por la determinación de los cocientes de las absorbancias a 260/280

y 260/230 que indica la pureza del ADN a compuestos como proteínas y compuestos fenólicos.

La concentración de ADN se cuantificó por espectrofotometría a 260nm. Para las mediciones

espectrofotométricas se usó un equipo Nanodrop 2000. La integridad del ADN se comprobó

mediante la observación de las bandas en una electroforesis en gel de agarosa 1% en TAE 1X,

corriendo 3 µL de ADN a 88 V durante 40 min.

8.4.3. Amplificación de los fragmentos de genes XK

Los fragmentos de los genes XK se amplificaron usando los juegos de oligonucleótidos

diseñados anteriormente. Se usaron temperaturas de alineamiento de entre 58, 59 y 61 °C. Las

condiciones de PCR usadas se muestran en la Figura 13 y Cuadro 6. Se usó una Taq polimerasa

BIOLASE (Bioline, 5 U/µL, Cat: BIO-21042).

METODOLOGÍA

69

Figura 13. Condiciones de temperatura y número de ciclos de la PCR para la amplificación de fragmentos de genes

XK en las cepas de C. glabrata T1 y LR2.

Cuadro 6. Condiciones de reactivos usados para la PCR para la amplificación de fragmentos de genes XK en las

cepas de C. glabrata T1 y LR2.

Reactivo Volumen para una reacción Concentración final

Buffer de reacción 10 X 2.5 μL 1X

MgCl2 (50 mM) 0.75 μL 1.5 mM

Oligonucleótido “forward” 5 µM 1 μL 0.2 µM

Oligonucleótido “reverse” 5 µM 1 μL 0.2 µM

dNTP´s (10 mM) 0.2 μL 0.08 mM

Taq polimerasa (5 U/μL) 0.2 μL 1 U

ADN (300-900 ng/μL) 1 μL 12-36 ng/μL

Agua MiliQ 18.35 μL ---------------

Volumen total 25 μL

Para comprobar los productos de PCR, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1.5%

en TAE 1X, corriendo 5-7 µL de producto a 88 V o 100 V durante 70 min, aproximadamente.

Las PCR que dieron una banda definida se realizaron nuevamente por duplicado y los productos

de PCR se secuenciaron como se describe a continuación.

La preparación de las muestras para la secuenciación se realizó del siguiente modo. Para los

productos de PCR obtenidos con las parejas de oligonucleótidos F1-XK/R1-XK y F1-XK/R2-

XK se realizaron reacciones de PCR de 20 μL con: 4 μL de Buffer Big Dye V.3.1 (5x), 1 μL del

oligonucleótido F1-XK (5 μM), 4 μL de Big Dye V.3.1 Ready Mix, 1.5 μL de producto de PCR

y 9.5 μL de agua Milli-Q. Se realizaron PCR con el siguiente programa de ciclos:

desnaturalización inicial a 94 °C por 5 min; 35 ciclos de 94 °C por 30 s, 60 °C por 30 s y 72 °C

por 1 min; finalmente una extensión final de 7 min a 72 °C. Los productos de PCR obtenidos

METODOLOGÍA

70

con la pareja de oligonucleótidos F1-XK/R3-XK se preparaon del siguiente modo. Se realizaron

reacciones de PCR de 20 μL con: 4 μL de Buffer Big Dye V.3.1 (5x), 1 μL del oligonucleótido

F1-XK (5 μM), 4 μL de Big Dye V.3.1 Ready Mix, 3 μL de producto de PCR y 8 μL de agua

Milli-Q. El programa de PCR fue el siguiente: desnaturalización inicial a 94 °C por 2 min; 35

ciclos de 94 °C por 30 s, 58 °C por 30 s y 72 °C por 30 s; finalmente una extensión final de 7

min a 72 °C. La reacción de purificación se realizó con el siguiente protocolo. Se añadieron 10

μL de producto de PCR de las reacciones anteriores a un tubo eppendorf en el que se adicionaron

10 μL de X-Terminator y 45 μL de SAM. Se realizó una breve agitación de la mezcla con vórtex

y se incubó a 25 °C por 30 min con agitación de 1300 rpm. Se realizó otra agitación con vórtex

y la mezcla se centrifugó por 3 min a 13500 rpm. Se recuperó el sobrenandante

(aproximadamente 30-40 μL) del cual se tomaron 20 μL, los cuales fueron transferidos a un

nuevo tubo que fue entregado para realizar la secuenciación.

8.4.4. Análisis de las secuencias amplificadas de los fragmentos del gene XK

Se realizó un BLASTn con las secuencias amplificadas usando el software de la plataforma del

NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para la búsqueda de secuencias similares.

Posteriormente se realizó un alineamiento múltiple usando las secuencias amplificadas y las

secuencias de genes XK encontradas en el BLAST para observar semejanzas y diferencias entre

ellas, empleando el software de alineamientos del programa CLC Sequence Viewer versión

7.8.1 (https://www.qiagenbioinformatics.com).

Se realizó un árbol filogenético usando el programa Mega7 (http://www.megasoftware.net/).

Para esto se usaron las secuencias nucleotídicas de XK que presentaron homología con las

secuencias amplificadas y se realizó un segundo BLASTn en la plataforma del NCBI para

encontrar secuencias de XK relacionadas. Teniendo las secuencias, se hizo un alineamiento

múltiple entre las secuencias amplificadas y las relacionadas por ClustalW y posteriormente se

diseñó el árbol filogenético por el método de Minimun Evolution con un bootstrap de 1000,

usando las herramientas correspondientes del programa Mega7.

Adicionalmente las secuencias amplificadas se tradujeron a sus secuencias de aminoácidos

correspondientes y se encontraron secuencias proteicas similares por medio de un BLASTx en

METODOLOGÍA

71

la plataforma del NCBI. Se realizó un alineamiento múltiple de éstas utilizando la herramienta

correspondiente del programa CLC Sequence Viewer para localizar residuos de aminoácidos

conservados y regiones conservadas. Posteriormente se elaboró un mapa gráfico de los dominios

y regiones catalíticas de las secuencias amplificadas usando como secuencia de referencia una

secuencia proteica de Xk de C. glabrata encontrada en la base de datos del NCBI con la que

aquéllas presentaron alta similitud (XP_446768). Se hallaron los dominios y las regiones

catalíticas de dicha secuencia usando la aplicación CD-Search perteneciente al NCBI

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). Se realizó un alieneamiento múltiple

entre las secuencias traducidas y la secuencia de referencia con ayuda de las herramientas

correspondientes del programa CLC Sequence Viewer. Se marcaron las zonas alineadas en

donde hubiera señalado un dominio o región catalítica en la secuencia de referencia.

8.4.5. Análisis de la región promotora

Usando la secuencia genómica de XK en el cromosoma de C. glabrata con la que las secuencias

presentaron alta similitud (CR380953: 891248-892996) se seleccionó una región de 1000

nucleótidos río arriba (“upstream”) de dicho gene y se analizó con la plataforma SCDP The

Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae (http://rulai.cshl.edu/SCPD/) para encontrar

elementos putativos regulatorios predefinidos. Adicionalmente se diseñó un mapa de regiones

regulatorias para señalar la posición de dichos elementos regulatorios.


glabrata T1 y LR2


La extracción de ADN genómico se realizó de manera similar a como se realizó en el inciso

8.4.2. La determinación de la pureza y la cuantificación del ADN se realizaron por

espectrofotometría mediante un equipo Nanodrop 2000 por medio de los cocientes 260/280,

260230 y por la absorbancia a 260nm. La integridad del ADN se comprobó por electroforesis

en gel de agarosa al 1% de manera similar a como se describió en dicha sección.

METODOLOGÍA

72

8.5.2. REP-PCR

Para realizar la REP-PCR se utilizaron los oligonucleotidos REP1R-I y REP2-I diseñados por

Versalovic, Koeuth y Lupski (1991) y basándose en las condiciones del ciclo de PCR usadas

por Hierro et al. (2004) con ajustes en la cantidad de ADN, de oligonucleótidos y la temperatura

de alineamiento para mejorar los patrones de bandeo. En la Figura 14 se muestran las

condiciones utilizadas en el ciclo de PCR y en el Cuadro 7 las condiciones iniciales de reactivos.

En todas las reacciones se usó un testigo positivo de Colletotrichum sp. (clave: AL-09) de la

cual se conocen sus patrones de bandeo de REP-PCR.

Figura 14. Condiciones de temperatura y número de ciclos de la REP-PCR en las cepas C. glabrata T1 y LR2 y

de Colletotrichum AL-09.

Cuadro 7. Condiciones de reactivos usados inicialmente para la REP-PCR en las cepas C. glabrata T1 y LR2 y en

Colletotrichum AL-09.

Reactivo Volumen para una reacción Concentración final

Buffer de reacción 10 X 2.5 μL 1X

MgCl2 (50 mM) 0.75 μL 1.5 mM

Oligonucleótido REP1R-I 5 µM 1 μL 0.2 μM

Oligonucleótido REP2-I 5 µM 1 μL 0.2 μM

dNTP´s (10 mM) 0.5 μL 0.2 mM

Taq polimerasa (5 U/μL) 0.5 μL 2.5 U

ADN (100 ng/μL) 2 μL 8 ng/μL

Agua MiliQ 16.75 μL ---------------

Volumen total 25 μL

Para la determinación de los patrones de bandeo de las cepas T1 y LR2, se realizaron cuatro

reacciones independientes de REP-PCR, cada una por duplicado. Para la observación de las

bandas se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 2% en TAE 1X entre 60-100 V hasta la

separación de las bandas, cargando entre 10-14 µL de producto de PCR, según la cantidad de

METODOLOGÍA

73

ADN amplificado. Posteriormente se realizaron árboles UPGMA

(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) usando el programa PyElph versión

1.4 (Pavel y Vasile, 2012) para el cálculo de las distancias entre las cepas mediante el análisis

de los patrones de bandeo dados en la REP-PCR. En dicho análisis se incluyó la cepa

Colletotrichum AL-09.

8.6. Establecimiento de las condiciones de fermentación de los cultivos mixtos

Se realizó un diseño factorial 22 con cuatro tratamientos en orden aleatorio con dos réplicas,

evaluando los factores esquema de inoculación y temperatura. El primer factor, esquema de

inoculación tuvo de niveles: primer nivel (-1) inocular a la cepa T1 en el tiempo t0 y luego a

LR2 a los tres días; segundo nivel (+1) inocular a LR2 en el tiempo t0 y luego a T1 a los tres

días. El segundo factor, temperatura de fermentación tuvo de niveles: primer nivel (-1) 35 °C;

segundo nivel (+1) 40 °C. El diseño factorial también se muestra en el Cuadro 8.

Cuadro 8. Diseño factorial 22 para determinar las condiciones de fermentación de cultivos mixtos secuenciales de

C. glabrata T1 y LR2.

La propagación y la cinética de fermentación se realizaron siguiendo el esquema de la Figura

11, considerando que se realizó una inoculación mixta de manera secuencial. Primeramente, se

propagó la cepa 1 a partir de 3 mL de cultivo conservado en glicerol a -20 °C, inoculándolo en

YPD (pH 4.5) a 35 °C y 200 rpm durante seis horas. Tras el crecimiento, los cultivos se

centrifugarón a 4700 rpm, 4 °C, 20 min y el paquete celular se lavó dos veces con solución

fisiológica (0.85% NaCl) estéril. Los pellets fueron resuspendidos en el medio mínimo base

nitrógeno con mezcla de carbohidratos con el pH previamente ajustado a 4.5 (Cuadro 5) y se

determinó la población celular por conteo directo al microscopio en cámara de Neubauer. Se

inocularon las cepas resuspendidas en matraer Erlenmeyer de 500 mL que contenían el mismo

medio, realizando los cálculos para tener un cultivo de 300 mL con una población inicial de 10

Tratamiento X1 X2 Esquema de inoculación Temperatura ( °C)

1 (CM3) - - T1 a t0 y luego LR2 a los 3 días 35

2 (CM4) + - LR2 a t0 y luego T1 a los 3 días 35

3 (CM5) - + T1 a t0 y luego LR2 a los 3 días 40

4 (CM6) + + LR2 a t0 y luego T1 a los 3 días 40

METODOLOGÍA

74

x 106 células·mL-1 y se incubó a la temperatura indicada en el diseño experimental, con agitación

constate de 200 rpm. A los tres días, se realizó el mismo procedimiento de propagación con la

cepa 2, que se inoculó a las 72 h en el cultivo a una población inicial de 10 x 106 células·mL-1.

La fermentación prosiguió durante 240 h (diez días), manteniendo la agitación a 200 rpm. Los

muestreos y análisis de las muestras se realizaron como se indica en los esquemas de las Figuras

11 y 12, donde el consumo de carbohidratos totales se realizó por el método de fenol-sulfúrico.


cultivo mixto a partir de un medio sintético con mezcla de carbohidratos

8.7.1. Fermentación de cultivos mixtos con inoculación simultánea en medio sintético con

mezcla de carbohidratos

Se formularon dos cultivos mixtos con las cepas LR2 y T1, para evualuar la fermentación en

medio mínimo con mezcla de carbohidratos con un pH ajustado a 4.5 (Cuadro 5). En ambos

cultivos los microorganismos fueron inoculadas simultáneamente en la misma proporción (10 x

106 células·mL-1 de cada cepa). El cultivo mixto 1 (CM1) fue incubado a 35 °C. El cultivo mixto

2 (CM2) fue incubado a 40 °C. Ambos cultivos estuvieron en agitación constante a 200 rpm

durante 240 h (diez días). Los cultivos fueron realizados por duplicado. El esquema de

inoculación y de fermentación fue el mismo que el de los cultivos individuales (Figura 11), con

la diferencia de que se realizó la inoculación mixta en vez de individual en el medio mínimo. Se

tomaron 15 mL de muestra en diferentes tiempos para el monitoreo del crecimiento celular y la

determinación de biomasa (peso seco), los azúcares individuales y etanol, como se describe en

la Figura 12.

METODOLOGÍA

75

8.8. Métodos de análisis

8.8.1. Determinación de carbohidratos y etanol

A las muestras centrifugadas a 4700 rpm, 4 °C, 20 min se les separó el pellet para la

determinación de peso seco y el sobrenadante para las determinaciones de azúcares y etanol.

La mezcla de azúcares (glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa, xilosa y sacarosa) fue analizada

por Cromatografía Líquida de Ultra Definición (UPLC), acoplada a un detector de masas (MS).

Una muestra de sobrenadante fue diluída en agua Milli-Q de 2 a 200 veces, de acuerdo a la

concentración de carbohidratos esperada. Las diluciones se filtraron a través de membranas

Phenex-PTFE (polifluoroetileno) de 0.2 µm de tamaño de poro y 15 mm de diámetro

(Phenomenex). El análisis se realizó en un sistema Acquity UPLC H-Class equipado con un

detector Xevo TQ-S MS (Waters) usando una columna Acquity UPLC de BEH-Amide (150

mm x 3.0 mm i.d., 1.7 µm de tamaño de partícula, Waters). La temperatura de la columna fue

de 35 °C y se inyectaron 0.2 mL de muestra por duplicado con un flujo de 0.2 mL·min-1 durante

25 min. La fase móvil consistió en una mezcla de solvente A (acetonitrilo: agua 30:70 con 0.1%

NH4OH) y B (acetonitrilo: agua 80:20 con 0.1% NH4OH). La elución se hizo por gradiente con

el siguiente programa: 100% (B) a los 0 min, 20:80 (A:B) a los 8 min, 25:75 (A:B) a los 12 min,

40:60 (A:B) a los 18 min, finalmente 100% (B) desde los 18.01 min hasta los 25 min. Los

carbohidratos se identificaron por comparación del tiempo de retención y el peso molecular de

estándares de los seis azúcares (Sigma-Aldrich) en mezcla. La cuantificación se hizo a partir de

curvas de calibración de los distintos azúcares en mezcla, con la xilosa y la sacarosa a

concentraciones de 10 ppm a 350 ppm y los demás azúcares a concentraciones de 100-350 ppm.

Las curvas de calibración se realizaron por triplicado.

El etanol se determinó por el método del dicromato de potasio, como se detalla en el Anexo 1.

Para preparar la muestra, 5 mL de sobrenadante fueron mezclados con 5 mL de agua destilada

y se destilaron en un microdestilador de vidrio hasta recuperar 5 mL. A los destilados se les

determinó el etanol usando un reactivo de dicromato de potasio acidificado (Anexo 1) y

realizando lecturas de los productos de reacción a 585nm en un espectrofotómetro UV-Vis. Se

METODOLOGÍA

76

determinó el etanol con ayuda de una curva de calibración de 2-20 g·L-1 de etanol (Sigma-

Aldrich).

Los azúcares reductores libres se determinaron por el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico

(DNS), utilizando 0.5 mL de muestra como se detalla en el Anexo 1. Las lecturas de los

productos de reacción se hicieron a 550nm. Se realizó una curva de calibración de glucosa de

0.1 a 1 g·L-1.

La determinación de azúcares totales se realizó con la técnica de Dubois (fenol-sulfúrico). Se

trata la muestra con una mezcla de fenol 5% y ácido sulfúrico concentrado, como se detalla en

el Anexo 1. A los productos de reacción se les determinó la absorbancia a 490nm. Para calcular

la concentración, se usó una curva de calibración de sacarosa (Sigma) con estándares de

concentraciones de 0.01-0.1 g·L-1. Las curvas estándares de cada prueba colorimétrica se

realizaron por duplicado y se usaron los valores promedios para el cálculo de las concentraciones

en las muestras.

8.8.2. Parámetros cinéticos de crecimiento

Los parámetros cinéticos de crecimiento (biomasa celular, peso seco de la biomasa, velocidad

de crecimiento, tiempo de duplicación y constante de rendimiento de biomasa) se calcularon

como se explica a continuación:

Determinación de la biomasa celular

Las células fueron contadas con ayuda de la cámara de Neubauer bajo un microscopio con el

objetivo 40x. El número total de células se calculó con la ecuación:

𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑚𝐿=

𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠

𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠(𝐷)(𝐹)

Donde:

D: dilución efecutada

F: factor de cámara (0.25 x 106)

METODOLOGÍA

77

Determinación de peso seco en la biomasa

Las muestras tomadas a lo largo de la cinética fueron centrifugadas a 4700 rpm, 4 °C durante

20 min. Los paquetes celulares fueron lavados dos veces con agua destilada estéril (15 mL) y se

secó dentro de una estufa a 80 °C sobre recipientes de aluminio previamente llevado a peso

constante. La biomasa (en g·mL-1) se calculó con la siguiente ecuación:

𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 (𝑔

𝑚𝐿) =

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑦 𝑟𝑒𝑐𝑖𝑝𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 (𝑔) − 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑟𝑒𝑐𝑖𝑝𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒(𝑔)

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑚𝐿)

Velocidad de crecimiento (µ)

La velocidad de crecimiento (µ) se calculó a partir de la ecuación:

𝑑𝑥

𝑑𝑡= 𝜇𝑥

Donde “x” es la biomasa en términos de peso seco (g·L-1) y dx/dt es la expresión diferencial de

la biomasa con respecto al tiempo (h) calculado en cada punto de la cinética. La ecuación

diferencial una vez integrada y despejada dio como resultado la expresión:

𝜇(ℎ−1) =ln(𝑥𝑡) − ln (𝑥0)

𝑡 − 𝑡0

Donde “xt” y “x0” son la biomasa en el tiempo “t” y el tiempo cero (t0), respectivamente.

El valor µ máximo es considerado la velocidad máxima de crecimiento (μmax), la cual fue el

valor reportado en este trabajo.

Tiempo de duplicación (Td)

El tiempo de duplicación de las células (Td) es:

𝑇𝑑(ℎ) =ln (2)

𝜇

METODOLOGÍA

78

Constante de rendimiento de biomasa (Yx/s)

El rendimiento de biomasa (Yx/s) es se calculó como la división entre la cantidad de biomasa

producida (peso seco) y los azúcares totales consumidos.

𝑌𝑥/𝑠 =𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑎 (

𝑔𝐿)

𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 (𝑔𝐿)

8.8.3. Parámetros cinéticos de fermentación

Se calcularon los parámetros: constante de rendimiento de etanol, cantidad de etanol producido,

productividad máxima, velocidad de consumo de sustrato y velocidad de producción de etanol.

Constante de rendimiento de etanol (Yp/s)

La constante de rendimiento de etanol (Yp/s) se calculó como la cantidad de etanol producido y

los azúcares totales consumidos.

𝑌𝑝/𝑠 =𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 (

𝑔𝐿)

𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 (𝑔𝐿)

Productividad máxima de etanol (Pmax)

La productividad máxima se calculó con la ecuación:

𝑃𝑚𝑎𝑥 (𝑔

𝐿 · 𝑑í𝑎) =

𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 (𝑔𝐿)

𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑒𝑛 𝑞𝑢𝑒 𝑠𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑗𝑜 (𝑑í𝑎)

METODOLOGÍA

79

Velocidad de consumo de azúcares (rs) y de producción de etanol (rp)

La velocidad de consumo de sustrato se calculó con la ecuación:

𝑟𝑠𝑆 (𝑔

𝐿 · ℎ) = −

𝑑𝑆

𝑑𝑡

Donde “S” es la concentración de azúcar (g·L-1) y dS/dt es la expresión diferencial del consumo

de sustrato con respecto al tiempo (h), calculado en cada punto de la cinética. El valor máximo

es la velocidad de consumo de sustrato reportada.

La velocidad de producción de etanol se calculó con la expresión:

𝑟𝑝𝑃 (𝑔

𝐿 · ℎ) =

𝑑𝑃

𝑑𝑡

Donde “P” es la concentración de etanol (g·L-1) y dP/dt es la expresión diferencial de la

producción de etanol con respecto al tiempo (h), calculado en cada punto de la cinética. El valor

máximo es la velocidad de producción de etanol reportada.

8.8.4. Análisis estadístico

El análisis de varianza se realizó por una prueba de ANOVA para determinar si existieran

diferencias significativas entre factores. El nivel estadístico de significancia fue ajustado a

P<0.05 con dos réplicas (n=2). Se usó el software Statgraphics Centurion XVI para realizar los

análisis y para el diseño de las gráficas de medias y loa diagramas de Pareto, así como las

pruebas de rangos múltiples para apoyar los resultados.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

80

9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

9.1. Determinación de los parámetros cinéticos de crecimiento y fermentación de los

cultivos individuales de C. glabrata LR2 y T1 en un medio sintético con mezcla de

carbohidratos

9.1.1. Crecimiento de los microorganismos individuales

Las cepas C. glabrata LR2 y T1 fueron aisladas en el CIATEJ-Unidad Sureste a partir de líquido

ruminal bovino y estómago de termita, respectivamente. Sus mejores condiciones de

crecimiento y de fermentación fueron previamente determinadas (Estrada-Martínez, 2013). Para

el crecimiento las condiciones seleccionadas fueron 35 °C y 200 rpm, mientras que, para la

fermentación, éstas fueron 35 °C y 200 rpm para T1 y 40 °C y 200 rpm para LR2. En este

trabajo, estas cepas fueron incubadas diez días en un medio sintético con una mezcla de azúcares

en proporciones similares a las reportadas en residuos cítricos (Wilkins et al., 2005; Boluda-

Aguilar y López-Gómez, 2013) para determinar sus perfiles de asimilación de azúcares y de

producción de etanol por sus posibles aplicaciones futuras en la fermentación de residuos

cítricos.

En la Figura 15 se muestran las curvas de crecimiento de ambas cepas, en términos de peso seco.

Se observa en esta Figura que la cepa T1 tuvo su crecimiento exponencial principalmente

durante 0.7 días desde el inicio de la fermentación (las primeras 16 h), seguido de un crecimiento

más pequeño hasta el día dos, en donde alcanzó una biomasa de 1.84 ± 0.13 g·L-1, tras lo cual

se observó una fase estacionaria hasta el final de la fermentación. Por su parte, la cepa LR2

mantuvo una fase exponencial de dos dias (48 h), alcanzando una biomasa máxima de 1.92 ±

0.04 g·L-1. Posteriormente presentó una fase estacionaria hasta el final de la fermentación.


81

Figura 15. Crecimiento de las cepas C. glabrata T1 y LR2 en cultivo individual durante diez días de fermentación

en mezcla de azúcares a una concentración total de 120 g·L-1 de carbohidratos (51% glucosa, 30% fructosa, 8%

galactosa, 7% arabinosa, 2% xilosa and 2% sacarosa. La cepa T1 (círculo azul) fue incubada a 35 °C y 200 rpm y

la cepa LR2 (triángulo rojo) fue incubada a 40 °C y 200 rpm.

En el Cuadro 9 y la Figura 16 se pueden observar los resultados de los parámetros cinéticos de

crecimiento de ambas levaduras en el medio sintético con mezcla de carbohidratos, así como las

gráficas de medias de los parámetros cinéticos de crecimiento. De acuerdo a estos resultados, la

cepa LR2 alcanzó un crecimiento ligeramente superior al de T1, tanto en términos de biomasa

(peso seco) como de población celular. Por otro lado, la cepa T1 presentó la mayor velocidad

de crecimiento y el menor tiempo de duplicación entre ambas. La Yx/s de T1 también fue

ligeramente superior. Esto indica que la cepa T1 creció más rápido y durante este tiempo usa

más fuente de carbono (azúcares) hacia la formación de biomasa en comparación con LR2. Por

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Peso s

eco (

g·L

-1)

Tiempo de fermentación (días)


82

otro lado, LR2 tuvo un crecimiento exponencial más prolongado, permitiéndole alcanzar una

mayor población y biomasa. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente

significativas, como se puede observar en el Cuadro 9 y en las gráficas de medias de la Figura

16. Los detalles de los ANOVA de estos parámetros se encuentran en el Anexo 2. Los resultados

obtenidos fueron inferiores a los obtenidos por Merico et al. (2007) en C. glabrata, obteniendo

una µ de 0.28 h-1 y una Yx/s de 0.11. En otro trabajo, Hagman et al. (2013) obtuvieron una µ de

0.149 h-1 y una Yx/s de 0.16 para C. glabrata, valores superiores a los obtenidos en este trabajo.

Sin embargo, en ambos trabajos los resultados obtenidos fueron en glucosa (20 g·L-1). Otra

diferencia es que en ambos trabajos se utilizó un medio con sales similar al usado en este trabajo,

pero en el cual se añadieron las vitaminas la biotina, el pantotenato, el ácido nicotínico, la

tiamina HCl y el piridoxol HCl, además de inositol y ácido p-aminobenzoico. Éstos aportan a

las levaduras elementos necesarios en su metabolismo. Por ejemplo, la biotina es un grupo

prostético de la píruvato carboxilasa que cataliza la carboxilación del piruvato para formar

oxaloacetato, un intermediario de varias rutas bioquímicas como el ciclo del ácido cítrico, la

gluconeogénesis y el metabolismo de los aminoácidos. El pantotenato forma parte de la

coenzima A, que interviene en rutas como el ciclo del ácido cítrico y en el catabolismo de ácidos

grasos. La tiamina, en forma de tiamina pirofosfato (TPP), es una coenzima que interviene en

rutas relacionadas el metabolismo de carbohidratos y la fermentación, siendo importante para la

piruvato descarboxilasa durante la producción de etanol. El ácido nicotínico forma parte del

NAD+ y el NADP+ actuando como aceptor de electrones en varias reacciones catabólicas y

anabólicas, como en la síntesis de ácidos grasos, la glucólisis y el ciclo de del ácido cítrico. Es

importante para la alcohol deshidrogenasa durante la producción de etanol. El piridoxol HCl, en

forma de piridoxal fosfato (PLP), es un grupo prostético de las aminotransferasas, teniendo

importancia en el metabolismo de aminoácidos (Nelson y Cox, 2014). El inositol y sus derivados

pirofosfatados desempeñan papeles de señalización molecular en procesos relacionados con el

metabolismo energético, respuestas a estrés, mantenimiento de telómeros, tráfico vesicular y es

mediador de la fosforilación de proteína (Steidle et al., 2016). El ácido p-aminobenzoico es un

precursor de moléculas como la ubiquinona, que se requiere en la cadena de transporte de

electrones, y también del folato, requerido en varias rutas metabólicas, como en las de los

aminoácidos y nucleótidos (Marbois et al., 2010). En dichos trabajos, al proporcionar las


83

moléculas a las cepas, esto les proporcionó elementos para sus procesos metabólicos como los

relacionados con el catabolismo de la glucosa, la producción de etanol y el crecimiento. En este

trabajo, aunque el medio mineral fue similar al usado por aquellos autores en cuanto a

composición de sales, la ausencia de cofactores y otros compuestos como inositol

probablemente dificultaron el metabolismo, requiriendo su síntesis o el uso de los preexistentes

durante la propagación en el medio YPD, pero en cuya maquinaria celular no serían recientes,

por lo que algunos pudieran tener que renovarse.

Cuadro 9. Parámetros cinéticos de crecimiento de los cultivos individuales de C. glabrata T1 y LR2 durante diez

días de fermentación en mezcla de azúcares a una concentración total de 120 g·L-1 (51% glucosa, 30% fructosa,

8% galactosa, 7% arabinosa, 2% xilosa and 2% sacarosa).

Parámetro Cepa

C. glabrata T1* C. glabrata LR2**

Población celular (106

células·mL-1)

214 ± 14.14a 248 ± 12.37a

Biomasa (g·L-1) 1.84 ± 0.13a 1.92 ± 0.04a

Yx/s 0.024 ± 0.003a 0.021 ± 0.001a

μmax (h-1) 0.093 ± 0.007a 0.076 ± 0.005a

Td (h) 7.50 ± 0.57a 9.12 ± 0.64a

Día max. Biomasa 2 2

a, b: letras diferentes la misma fila indican diferencias significativas entre cepas (p<0.05).

*C. glabrata T1 at 35 °C y 200 rpm

** C. glabrata LR2 at 40 °C y 200 rpm


84

Figura 16. Gráfica de medias para: a) población celular, b) peso seco, c) Yx/s, d) velocidad de crecimiento, e)

tiempo de duplicación en medio sintético con mezcla de carbohidratos para los cultivos individuales de las cepas

de C. glabrata T1 y LR2 en mezcla de azúcares.


85


individuales

En la Figura 17 se muestra la cinética de consumo de azúcares, producción de etanol y el

crecimiento celular de las cepas LR2 y T1 en cultivos individuales. En el Cuadro 10 se muestra

el porcentaje de consumo de carbohidratos el día de máxima producción de etanol y tras los diez

días de fermentación, así como la velocidad de consumo de cada azúcar. En la Figura 17A se

puede observar que la cepa T1 tuvo una producción mayor de etanol (24.28±0.78 g·L-1)

comparado con la cepa LR2 en la Figura 17B (21.36±1.41 g·L-1), aunque esta última lo produjo

más rápidamente, alcanzando el máximo a los 3.7 días (88 h), en comparación con los seis días

que le tomó a la cepa T1 alcanzar su máxima producción. Se puede observar que ambas cepas

fueron capaces de asimilar glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa y xilosa. La sacarosa no fue

detectada en el análisis por UPLC. La cepa LR2 empezó el consumo de todos los azúcares desde

el inicio de la fermentación, con excepción de la fructosa, que presentó un retraso de 0.7 días

(16 h), cuando aproximadamente el 34% de la glucosa fue consumida, y de la xilosa, que tuvo

un retraso de un día (24 h), cuando más del 50% de la glucosa ya había sido consumida. El

consumo total de azúcares fue de 84.09±0.03%. La glucosa fue asimilada rápidamente durante

los primeros dos días hasta aproximadamente 83% de su consumo, tras lo cual tuvo un consumo

más lento hasta llegar a 92.16±0.13% al décimo día (Cuadro 10). La fructosa fue el segundo

azúcar preferido por la cepa. Tras 0.7 días de retraso, fue consumida en paralelo con la glucosa,

con un perfil de consumo similar hasta llegar al décimo día con 84.59±0.11%. La arabinosa fue

consumida desde el inicio de la fermentación hasta los tres días, llegando a un 60.00±0.45 de

consumo, tras lo cual se mantuvo estable hasta el final de la fermentación. La galactosa fue

asimilada desde el inicio de la fermentación, acelerándose su consumo 16 h después del inicio

de la fermentación, y se estabilizó al cuarto día con aproximadamente 45% de consumo, tras lo

cual continuo con un pequeño consumo hasta llegar a 48.88±0.03% al final de la fermentación.

Tras el retraso de un día, la xilosa fue consumida principalmente hasta los cinco días del inicio

de la fermentación, con aproximadamente 52% de asimilación, tras lo cual se estabilizó,

teniendo un consumo más pequeño hasta llegar a 54.92±0.40% la final de la fermentación.


86

La cepa T1 tuvo un consumo total de azúcares de 83.48±0.39%. De manera similar a LR2, tuvo

preferencia por la glucosa y la fructosa sobre los demás azúcares. La glucosa fue asimilada

rápidamente durante los primeros dos días de fermentación, llegando a aproximadamente 77%

de consumo, y luego tuvo una asimilación más lenta, llegando hasta 91.83±0.71% al final de la

fermentación. La fructosa tuvo un retraso de 0.7 días (16 h) para iniciar su asimilación, cuando

había un 30% de glucosa consumida, tras lo cual fue asimilada rápidamente los dos primeros

días de fermentación hasta un 63% de consumo, y luego más lentamente hasta el final de la

fermentación, con 84.73±0.53% de consumo. De manera similar a LR2, el consumo de fructosa

fue casi en paralelo con el consumo de glucosa después de las 16 h del inicio de la fermentación.

La galactosa también presentó un retraso de 0.7 días, tras lo cual fue consumida principalmente

hasta el quinto día de fermentación, con aproximadamente un 52% de consumo. Posteriormente

su consumo fue prácticamente estable, llegando a 52.86±1.02% al final de la fermentación. La

arabinosa fue consumida durante los primeros tres días de fermentación, estabilizándose el

consumo hasta el final de ésta, con un 53.71±0.40%. La xilosa tuvo un retraso de dos días (48

h), cuando más del 75% de la glucosa ya había sido consumida, tras lo cual la asimilación de la

pentosa aceleró de alrededor del 15%, en el segundo día, a 55% al quinto día. Posteriormente,

su consumo fue prácticamente estable, llegando a 57.49±1.71% al final de la fermentación.


87

Figura 17. Consumo de carbohidratos y producción de etanol durante diez días de fermentación en mezcla de

azúcares a 120 g·L-1 de azúcares totales (51% glucosa, 30% fructosa, 8% galactosa, 7% arabinosa, 2% xilosa and

2% sacarosa) en: A) C. glabrata T1 a 35 °C y 200 rpm, B) C. glabrata LR2 a 40 °C y 200 rpm. Glucosa (círculo

rojo), fructosa (triángulo verde), galactosa (rombo azul), arabinosa (cuadrado amarillo), xilosa (círculo rosa), etanol

(cuadrado transparente), población celular (círculo negro).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Pobla

ció

n c

elu

lar

(x10

7célu

las·m

L-1

), e

tanol

(g·L

-1)

Consum

o d

e c

arb

ohid

rato

s (

g·L

-1)

Tiempo (días)

A

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Pobla

ció

n c

elu

lar

(x10

7célu

las·m

L-1

),eta

nol (g

·L-1

)

Consum

o d

e c

arb

ohid

rato

s (

g·L

-1)

Tiempo (días)

B


88

Con respecto a la producción de etanol, como se observa en la Figura 17, ambas cepas

produjeron etanol y biomasa desde el inicio de la fermentación. La cepa T1 produjo etanol desde

el día cero hasta los 6 días (144 h), alcanzando su máximo. También presentó un rápido

crecimiento celular desde el inicio de la fermentación hasta los 0.7 días y luego uno más lento

hasta los cuatro días. Posteriormente, se observó un decrecimiento en el número de células hasta

los seis días, momento en el cual el etanol alcanzó su máxima producción y empezó a disminuir

en paralelo con un aumento en número de células. En este momento el total de azúcares

consumido fue de 81.83±0.18% y el consumo continuó hasta 83.48±0.39% al final de la

fermentación. La cepa LR2 tuvo un crecimiento celular rápido durante el primer día (24 h) de

fermentación y luego un crecimiento más moderado hasta el final de la fermentación. Alcanzó

su producción máxima de etanol a los 3.7 días (88 h), momento en el que empezó a consumir el

alcohol. En ente punto, los azúcares totales consumidos eran el 69.97±0.16% y continuo hasta

alcanzar 84.09±0.03% al final de la fermentación. De lo anterior se puede concluir que ambas

cepas usaron desde el principio los carbohidratos para su crecimiento en biomasa y en la

producción de etanol. Tras alcanzar el máximo de producción de etanol, ambas cepas usaron

tanto los carbohidratos remanentes como el alcohol para su crecimiento o mantenimiento

celular. Zilli et al. (2015) en cultivos de C. glabrata en medio YP con glucosa o trehalosa

produjeron etanol y biomasa durante el transcurso de la fermentación. De manera similar a lo

observado en este trabajo, tras el consumo de los carbohidratos, el etanol fue usado como fuente

de carbono para el crecimiento. Esto fue más evidente en la cepa T1 que, tras el día seis,

prácticamente su consumo total de azúcares llegaba a la estabilización, momento en el que

empezó a usar el etanol como fuente de carbono.

Por otro lado, esta reportado que C. glabrata es una levadura que puede asimilar glucosa y

trehalosa, pero no galactosa o sacarosa debido a la pérdida de genes relacionados con el

metabolismo de estos carbohidratos, como los genes de invertasa y genes de la ruta metabólica

de Leloir (Bolotin-Fukuhara y Fairhead, 2014; Zilli et al., 2015). El consumo de sacarosa require

primeramente de una hidrólisis extracelular o intracelular por las invertasas que rompen el

disacárido en sus monosacáridos glucosa y fructosa (Gargel et al., 2014; Marques et al., 2016).

En la galactosa, está reportado por autores como Hittinger, Rokas y Carroll (2004) que varios

genes de la ruta de Leloir de asimilación de galactosa se han perdido (GAL1, GAL10, GAL7,


89

GAL3, GAL80, GAL4). Esto se cree que es debido al estilo de vida comensal y patogénico de la

levadura, haciendo que se hayan perdido varios genes metabólicos en un proceso de evolución

reductiva. A pesar de esto, en este trabajo ambas cepas pudieron asimilar la galactosa. Además,

Estrada-Martínez (2013) reportó el uso de la sacarosa por estas mismas cepas. Por lo tanto, sería

interesante corroborar la asimilación de estos azúcares por T1 y LR2 y encontrar si posee los

genes de las rutas de asimilación de sacarosa y galactosa.

En la cinética de asimilación de los azúcares se observó que los resultados obtenidos para

algunos de éstos fueron similares a los de Fonseca, De Carvalho y Gombert (2013) en K.

marxianus. Esto autores, en mezclas de glucosa y fructosa (10 g·L-1 de cada azúcar) en medio

mínimo con sales, observaron un retraso en el consumo de la fructosa hasta que hubo 8 g·L-1 de

glucosa en el medio (aproximadamente 20% de consumo) y posteriormente su consumo fue en

paralelo con el consumo de glucosa, muy similar a lo observado en las cepas T1 y LR2. Fonseca,

De Carvalho y Gombert (2013) también reportaron represión en la asimilación de galactosa por

K. marxianus en mezclas de glucosa y galactosa (10 g·L-1 de cada azúcar) en medio sintético

con sales, similar a T1. En el caso de estos autores, la represión en el consumo de galactosa

ocurrió hasta que quedaron en el medio 2 g·L-1 de glucosa (aproximadamente 80% de consumo).

A diferencia de lo observado por estos autores y por T1, con la cepa LR2 no se observó una

represión tan pronunciada en el consumo de la galactosa, aunque se observó la asimilación lenta

al inicio y tras 16 h de fermentación, con 34% de glucosa consumida, ésta aceleró. Prijambada,

Hidayat y Widianto (2012) reportaron la preferencia en el consumo de glucosa sobre fructosa

por S. cerevisiae en mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa y de glucosa con fructosa,

observando en general una cantidad residual de fructosa mayor que la de glucosa. Du Preez,

Bosch y Prior (1986) observaron en la fermentación de una mezcla de azúcares (glucosa,

manosa, galactosa, xilosa y celobiosa, a 10 g·L-1 cada carbohidrato) por C. shehatae y P. stipitis

una preferencia por la glucosa y un retraso en el consumo de manosa, galactosa, xilosa y

celobiosa. La manosa, xilosa y galactosa fueron reprimidas por la glucosa y consumidas por C.

shehatae tras el agotamiento de ésta. No se observó consumo de celobiosa. Para P. stipitis

observaron que la xilosa y celobiosa fueron reprimidas fuertemente por la glucosa y fueon

consumidas por P. stipitis tras su agotamiento. En comparación, en este trabajo se observó

represión de la galactosa y xilosa para T1 y para la xilosa en LR2, aunque la asimilación empezó


90

antes del total agotamiento de la glucosa, siendo más extremo para la xilosa, que se empezó a

consumir con más del 50% de la glucosa usada. De igual modo, Hickert et al. (2013) encontraron

represión catabólica de xilosa y arabinosa por cultivos de C. shehatae y cocultivos de C.

shehatae y S. cerevisiae en medio sintético con mezcla de glucosa (20 g·L-1), xilosa (20 g·L-1)

y arabinosa (10 g·L-1). Observaron que mientras la xilosa se consumio una vez consumida la

glucosa, la arabinosa se consumio hasta la fase final, tras haberse agotado la xilosa y la glucosa

en el cultivo de C. shehatae, o bien no se consumio en el cocultivo. En este trabajo no se observó

retraso en el consumo de arabinosa, que se empezó a asimilarse desde el inicio de la

fermentación tanto en T1 como en LR2.

Las preferencias de las cepas T1 y LR2 por los diferentes azúcares se pueden observar como

porcentajes de asimilación del Cuadro 10. De acuerdo a los resultados, la glucosa y la fructosa

fueron los carbohidratos preferidos por ambas cepas. En el día de máxima producción de etanol

la cepa T1 tuvo, de mayor a menor porcentaje de asimilación, las siguientes preferencias:

glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa y galactosa, con preferencias similares por la xilosa,

arabinosa y galactosa. La cepa LR2 tuvo el siguiente orden de porcentaje de asimilación en el

día de máxima producción de etanol: glucosa, fructosa, arabinosa, galactosa y xilosa. La

galactosa y la xilosa, así como la arabinosa y la fructosa, tuvieron un porcentaje de asimilación

similar. Se observó una diferencia significativa en la asimilación de estos azúcares, teniendo

mayor porcentaje de asimilación la cepa T1 respecto a la cepa LR2 en todos los carbohidratos,

menos en la arabinosa, en la que LR2 tuvo el mejor consumo. Al final de la fermentación (diez

días), el orden de porcentaje de asimilación de T1 fue similar al de su día de máxima producción:

glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa y galactosa, con valores similares a los del día de máxima

producción (día seis). El orden de preferencia en el uso de los azúcares, de mayor a menor

porcentaje, para la cepa LR2 al final de la fermentación fue: glucosa, fructosa, arabinosa, xilosa

y galactosa. Este orden fue similar al observado en el día de máxima producción (día 3.7), con

excepción de la xilosa, la cual tuvo una mayor asimilación que la galactosa al llegar al día diez.

No se observó diferencia significativa en el porcentaje de asimilación de la glucosa, la fructosa

y la xilosa para las cepas T1 y LR2 al final de la fermentación, aunque la cepa T1 tuvo un

porcentaje de consumo de xilosa ligeramente superior al de LR2. La cepa LR2 tuvo una mejor


91

asimilación por la arabinosa que la cepa T1, mientras que ésta tuvo un mejor porcentaje de

asimilación por la galactosa que aquélla, con diferencias significativas.

Cuadro 10. Consumo de carbohidratos y velocidad de consumo de carbohidratos por los cultivos individuales de

C. glabrata T1 y LR2 durante diez días de fermentación en mezcla de azúcares a una concentración total de 120

g·L-1 (51% glucosa, 30% fructosa, 8% galactosa, 7% arabinosa, 2% xilosa and 2% sacarosa).

C. glabrata T1** C. glabrata LR2***

* % Max % final rs (g·L-1·h-1) %Max % final rs (g·L-1·h-1)

G 90.03±0.33a 91.83±0.71a 0.036±0.003a 80.49±0.10b 92.16±0.13a 0.036±0.003a

F 82.69±0.41a 84.73±0.53a 0.021±0.0001a 62.77±0.13b 84.59±0.11a 0.026±0.0003b

GA 52.64±0.71a 52.86±1.02a 0.011±0.003a 44.47±1.00b 48.88±0.03b 0.011±0.002a

A 53.71±0.40a 53.71±0.40a 0.016±0.007a 60.00±0.45b 60.00±0.45b 0.016±0.0003a

X 56.75±0.66a 57.49±1.71a 0.007±0.0002a 42.48±1.15b 54.92±0.40a 0.007±0.00002a

a, b: letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas entre cepas (p<0.05).

*G: glucosa, F: fructosa, GA: galactosa, A: arabinosa, X: xilosa, %Max: porcentaje de consumo al día de máxima

producción de etanol, %final: porcentaje de consumo tras diez días de fermentación.

**C. glabrata T1 at 35 °C y 200 rpm

*** C. glabrata LR2 at 40 °C y 200 rpm

En el Cuadro 10 también se observa que la glucosa tuvo una mayor velocidad de asimilación,

comparada con los otros azúcares. Así, la glucosa con el mayor porcentaje de asimilación y la

mayor velocidad de consumo fue el azúcar preferido por LR2 y T1. Las velocidades de

asimilación de los carbohidratos fueron similares entre cepas, con excepción de la fructosa, en

la que LR2 tuvo una mejor velocidad de asimilación en comparación con T1, con diferencia

significativa. La xilosa tuvo la menor velocidad de asimilación en ambas cepas. Jeffries y

Sreenath (1988) reportaron represión en la asimilación de xilosa en mezclas de glucosa y xilosa

por C. shehatae, en la que concentraciones crecientes de glucosa disminuían más fuertemente

la velocidad de asimilación de la pentosa en comparación a la disminución de la velocidad de

asimilación de glucosa en medios con concentraciones crecientes de xilosa. Las velocidades

obtenidas por estos autores fueron mayores a las obtenidas por T1 y LR2 en este trabajo (0.41 a

2.31 g·L-1·h-1 para glucosa y 0.11 a 1.70 g·L-1·h-1 para xilosa) aunque fueron obtenidas en medio

rico en vez de medio mínimo.


92

En el Cuadro 11 se muestran los resultados de los parámetros de producción de etanol.

Cuadro 11. Parámetros cinéticos de producción de etanol por C. glabrata T1 y LR2 durante diez días de

fermentación en mezcla de azúcares a una concentración total de 120 g·L-1 (51% glucosa, 30% fructosa, 8%

galactosa, 7% arabinosa, 2% xilosa y 2% sacarosa).

Parámetro Cepa

C. glabrata T1* C. glabrata LR2**

Etanol (g·L-1) 24.28 ±0.78a 21.36 ±1.41a

Pmax (g·L-1·día-1) 4.05 ± 0.13a 5.84 ± 0.38b

rp (g·L-1·h-1) 0.053±0.001a 0.079 ± 0.008b

Yp/s 0.32±0.02a 0.32±0.03a

Día max. producción 6 3.7

a, b: letras diferentes en la misma fila indican diferencia significativa entre cepas (p<0.05).

*C. glabrata T1 at 35 °C y 200 rpm

** C. glabrata LR2 at 40 °C y 200 rpm

Se observa que la cepa T1 tuvo una producción de etanol ligeramente superior a la cepa LR2,

aunque sin diferencia significativa. La cepa LR2 alcanzó el máximo de producción a los 3.7

días, por lo que su productividad y velocidad de producción fueron superiores con diferencia

significativa a los de la cepa T1, quien alcanzó el máximo de producción a los 6 días. Donde no

hubo diferencia fue en la Yp/s, siendo en promedio de 0.32 para ambas cepas. En la Figura 18 se

muestran las gráficas de medias de los parámetros cinéticos de producción de etanol, donde

también se aprecia la mayor productividad y velocidad de producción de etanol de la cepa LR2.

Los detalles de los ANOVA de los parámetros cinéticos de fermentación se encuentran en el

Anexo 2.


93

Figura 18. Gráfica de medias para: a) etanol producido, b) productiviad máxima, c) velocidad de producción d)

Yp/s en mezcla de carbohidratos para los cultivos individuales de las cepas de C. glabrata T1 y LR2.

La producción de etanol obtenida por T1 y LR2 fue similar a la obtenida por Hickert et al.

(2013) en cultivos de C. shehatae en una mezcla de glucosa (20 g·L-1), xilosa (20 g·L-1) y

arabinosa (10 g·L-1). Su producción fue de aproximadamente 23 g·L-1 en 100 h, consumiéndose

los tres azúcares. También fue superior a un cultivo mixto de C. shehatae con S. cerevisiae (13

g·L-1 de etanol en 25 h). La Yp/s de estos autores fue de 0.40 en cultivo individual y 0.42 en

cultivo mixto, superiores a los obtenidos en este trabajo por las cepas T1 y LR2. Du Preez,

Bosch y Prior (1986), en mezcla de azúcares (glucosa, manosa, galactosa, xilosa y celobiosa, a

10 g·L-1 cada uno) obtuvieron una producción de etanol de 13.4 g·L-1 con C. shehatae en 40 h,

con una velocidad de 0.50 g·L-1·h-1 y una Yp/s de 0.35. Con P. stipitis obtuvieron una producción


94

de 18.6 g·L-1 en aproximadamente 50 h, con una velocidad de 0.73 g·L-1·h-1 y una Yp/s de 0.37.

La producción de las cepas T1 y LR2 fue superior a las obtenidas por dichos autores, aunque

las velocidades de producción y Yp/s fueron inferiores. La producción de etanol de T1 y LR2

también fue superior a las de S. cerevisiae (14.25 g·L-1) y las Yp/s fueron similares a las de este

cultivo (0.32) en un trabajo de Rouhollah et al. (2007) en una mezcla de glucosa (30 g·L-1),

xilosa (30 g·L-1), manosa (12 g·L-1) y galactosa (8 g·L-1) en medio sintético, posiblemente

debido a que ésta cepa fue incapaz de consumir la xilosa del medio. Los parámetros de T1 y

LR2 fueron inferiores a la producción y la Yp/s de P. stipitis (30.23 g·L-1 y 0.40) y K. marxianus

(28.15 g·L-1 y 0.36) en dicho trabajo.

Otra observación fue que las Yp/s de las cepas T1 y LR2 fueron muy superiores a sus propias

Yx/s (Para T1 una Yx/s de 0.024±0.003 contra una Yp/s de 0.32±0.02 y para LR2 se tuvo una Yx/s

de 0.021± 0.001 contra una Yp/s de 0.32±0.03), lo que indica que estas levaduras usaron las

fuentes de carbono más hacia la producción de etanol que para la producción de biomasa. Un

comportamiento similar ha sido observado por otros autores. Hagman et al. (2013), en medios

con glucosa (20 g·L-1) en aireación a 1 vvm y 200-1200 rpm obtuvieron una Yp/s de 0.38 y una

Yx/s de 0.16 en C. glabrata. Para S. cerevisiae obtuvieron una Yp/s de 0.39 y una Yx/s de 0.16.

Estas dos cepas están filogenéticamente relacionadas y comparten un comportamiento Crabtree

positivo, en el cual ciertas levaduras producen etanol a altas concentraciones de azúcares en

presencia de oxígeno, en vez de realizar un metabolismo puramente respiratorio. Como

resultado del efecto Crabtree, se reduce la producción de biomasa, observándose menores Yx/s

y mayores Yp/s que en levaduras Crabtree negativas. En K. marxianus y P. pastoris, como

representantes de levaduras Crabtree negativas, en condiciones aerobias no produjeron etanol,

teniendo una Yp/s de 0.00 en ambas cepas, y una Yx/s de 0.57 y 0.50, respectivamente. También

observaron que las levaduras con un efecto Crabtree más fuerte tendían a tener mayores

velocidades específicas de consumo de glucosa. Asimismo, reportaron que estas levaduras

comparten una estrategia de producción “make-accumulate-consume” para el etanol, en la cual se

consume la glucosa a la vez que se produce el etanol. Al agotarse aquélla y llegando al máximo de

etanol, éste empezó a usarse como fuente de carbono. Este comportamiento es similar al observado

para la cepa T1 en la cinética de producción de etanol, y en menor medida para LR2 (Figura 17).

Comportamientos similares fueron observados por Merico et al. (2007), que en medio con


95

glucosa (20 g·L-1) y aeración 1 L·min-1 con 800-1400 rpm, reportaron tendencias a Yp/s más

altas y Yx/s más bajas para levaduras Crabtree positivas que en Crabtree negativas. Para C.

glabrata obtuvieron una Yp/s de 0.31, similar a la obtenida en este trabajo para T1 y LR2, y una

Yx/s de 0.11, superior a la obtenida por T1 y LR2.


y LR2

9.2.1. Diseño de oligonucleótidos para la amplificación de un fragmento de los genes XK

en las cepas de C. glabrata T1 y LR2

Se diseñaron dos oligonucleótidos “forward” y cuatro “reverse” a partir de un alineamiento

multiple de secuencias genómicas de XK de varias levaduras del género Candida encontradas

en bases de datos de genes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). En el Anexo 3 se muestra dicho

alineamiento, señalando las zonas conservadas que se seleccionaron para el diseño de

oligonucleótidos. En los Cuadros 12 y 13 se presentan los oligonucleótidos propuestos y sus

características (Tm, %GC, longitud, formación de estructuras secundarias y formación de

dímeros, así como el tamaño esperado del amplicón para cada pareja).

En el alineamiento de las secuencias de los genes de XK de varias especies de Candida, se

incluyó una secuencia de C. glabrata (CR380953.1). Como se puede observar en el Cuadro 12

y en el Anexo 3, se diseñaron por zona conservada dos oligonucleótidos, uno con la misma

secuencia del gen XK de C. glabrata, mientras que el otro se diseñó considerando las

degeneraciones del alineamiento multiple de los genes XK, con el fin de amplificar otros genes

XK con variaciones en su secuencia. Los oligonucleótidos F1-XK y F2-XK fueron diseñados a

partir de la misma región conservada. F1-XK es 100% idéntico a la secuencia de XK de C.

glabrata en dicha región, mientras que para F2-XK se tomaron en cuenta las degeneraciones del

alineamiento multiple de genes XK de varias especies de Candida. Los oligonucleótidos R1-XK

y R2-XK fueron diseñados a partir de la misma región conservada. R1-XK es idéntico a la

secuencia genómica XK de la C. glabrata mencionada anteriormente, mientras que para R2-XK

se tomaron en cuenta las posibles degeneraciones en la región seleccionada. Para el diseño R3-

XK y R4-XK se procedió de un modo similar, siendo R3-XK idéntico a la secuencia de la C.


96

glabrata en la región conservada seleccionada, mientras que R4-XK se diseñó tomando en

cuenta las degeneraciones en la zona seleccionada. Debido a que R1-XK y R2-XK fueron

diseñados con base en la misma región y, de manera similar, F1-XK y F2-XK también fueron

diseñados de la misma región, en las 4 combinaciones “forward” y “reverse” de este grupo se

esperaba de un tamaño de 245 pb, de acuerdo a la secuencia del gene XK de C. glabrata

encontrada. De manera similar, para las 4 combinaciones de parejas “forward” y “reverse” de

F1-XK y F2-XK con R3-XK y R4-XK se esperaba un mismo tamaño de amplicón el cual es

405 pb, como se indica en el Cuadro 13. Otra consideración en el diseño fue que se cuidó que

las regiones amplificadas también abarcaran parte de la región catalítica de la enzima, en este

caso teóricamente los motivos conservados Connect 1 y Phospate 2 (Wang et al., 2011), de

acuerdo al análisis de las Xk codificadas por los genes seleccionados para el diseño. Además,

con el fin de optimizar el anclaje de los oligonucleótidos a su secuencia objetivo, se procuró que

los nucleótidos del extremo 5´ y el extremo 3´ fueran de un codón de pocas degeneraciones,

evitando especialmente los codones con seis degeneraciones, como los de la leucina, la serina y

la arginina (Sambrook y Rusell, 2001). En los oligonucleótidos F1-XK y F2-XK los codones de

los extremos 5´ y 3´ pertenecieron al glutamato y a la metionina, respectivamente. En los

oligonucleótidos R1-XK y R2-XK los codones de los extremos 5´ y 3´ fueron de isoleucina y

de fenilalanina, respectivamente. En los oligonucleótidos R3-XK y R4-XK los codones de los

extremos 5´ y 3´ fueron la asparagina y la tirosina, respectivamente.

Por otro lado, como se observa en el Cuadro 12, los valores de Tm estuvieron en el rango de 58-

64.6 °C. Estos valores de Tm dependen en parte de la composición de nucleótidos que forman el

oligonucleótido. Se recomienda un %GC de entre 40-60%, una longitud de 18-30 nucleótidos y

una Tm de entre 52-65 °C. Además, la diferencia de los valores de Tm de una pareja de

oligonucleótidos debe ser de máximo aproximadamente 5 °C (Sambrook y Rusell, 2001; Abd-

Elsalam, 2003; Bartlett y Stirling, 2003). Sin embargo, el %GC de los oligonucleótidos

“reverse” estuvo debajo de 40%. A pesar de lo anterior, las Tm de los oligonucleótidos

resultaron sobre 52 °C y similares, con una diferencia máxima de 6.6 °C para las parejas F1-

XK/R1-XK. En los oligonucleótidos con un %GC menor al recomendado es posible extender la

longitud del oligonucleótido para mantener el valor de Tm en los rangos recomendados (Abd-

Elsalam, 2003), tal como se hizo en este trabajo. Finalmente, también se consideró el tamaño


97

esperado de los fragmentos amplificados, el cual se recomienda que debe tener una longitud de

alrededor de 200-300 pb para la cuantificación por qPCR (Overbergh et al., 2003). Además, los

fragmentos amplificados deben tener diferencias en su composición de nucleótidos para

diferenciar los genes entre cepas, por lo que se consideró que las zonas seleccionadas en el

alineamiento múltiple abarcaran regiones no conservadas.

Cuadro 12. Lista de oligonucleótidos propuestos para la amplificación de fragmentos del gene XK.

Secuencia Tm (°C) %GC Longitud

(nt)

ΔG hairpin

(kcal·mol-1)

ΔG homodímero

(kcal·mol-1)

F1-XK

5´-GAAGAAGCGG

ATGCATGTGGAATG-3´

64.6

50

24

2 estructuras:

-1.3

-0.39

10 dímeros

Rango:

-10 a -1.47

F2-XK

5´-GAAGAARSKG

ATGCWTGTGGAATG-3’

62.9

41.66-

50

24

4 estructuras:

Rango:

1.97 a 2.75

17 dímeros

Rango:

-10.05 a -1.47

R1-XK

5´-ATAGTTGCCA

AATTATCACCAGTAA-3´

58

32

25

10 estructuras

Rango:

1.54 a 2.49

18 dímeros

Rango:

-5.36 a -0.96

R2-XK

5´-ATWGTDGCCA

AATTRTCHCCAGTAA-3

59.9

32-44

25

7 estructuras:

Rango:

2.49 a 3.47

27 Dímeros

Rango:

11.99 a -0.96

R3-XK

5´-ATTGCAATAG

CATATCATTGCC

ATGTA-3´

60

33.33

27

2 estructuras:

-2.53

-1.43

25 dímeros

Rango:

-13.88 a -0.96

R4-XK

5´-ATTRCAATAR

CAWAKCATWSC

CATRTA-3´

58.5

22.22-

37.03

27

1 estructura:

1.41

34 dímeros

Rango:

-12.49 a -0.96

*S=G,C; R=G,A; K=G,T; W=T,A; Y= C,T; M=A,C; D= A,G, T; H= A,C,T (código para degeneraciones)


98

Cuadro 13. Parejas de oligonucleótidos propuestas para la amplificación de los fragmentos del gene XK.

Oligonucleótidos Tamaño teórico del

amplicón (pb)

ΔG heterodímeros

(kcal·mol-1)

F1-XK

5´-GAAGAAGCGGATGCATGTGGAATG-3´

R1-XK

5´-ATAGTTGCCAAATTATCACCAGTAA-3´

245 pb

26 dímeros

Rango:

-5.09 a -1.47

F1-XK


R2-XK

5´-ATWGTDGCCAAATTRTCHCCAGTAA-3´

245 pb

29 dímeros

Rango:

-6.6 a -1.47

F1-XK


R3-XK

5´-ATTGCAATAGCATATCATTGCCATGTA-3´

405 pb

25 dímeros

Rango:

-7.05 a -1.47

F1-XK


R4-XK

5´- ATTRCAATARCAWAKCATWSCCATRTA-3´

405 pb

27 dímeros

Rango:

-10.02 a -1.47

F2-XK

5´-GAAGAARSKGATGCWTGTGGAATG-3’

R1-XK

5´-ATAGTTGCCAAATTATCACCAGTAA-3´

245 pb

29 dímeros

Rango:

-10.25 a -1.47

F2-XK


R2-XK

5´-ATWGTDGCCAAATTRTCHCCAGTAA-3´

245 pb

33 dímeros

Rango:

-10.25 a -1.47

F2-XK


R3-XK

5´-ATTGCAATAGCATATCATTGCCATGTA-3

405 pb

30 dímeros

Rango:

-8.34 a -1.47

F2-XK


R4-XK

5´- ATTRCAATARCAWAKCATWSCCATRTA-3´

405 pb

31 dímeros

Rango:

-10.05 a -1.47

* S=G,C; R=G,A; K=G,T; W=T,A; D= A,G, T; H= A,C,T (código para degeneraciones)


99


Los resultados de la extracción de ADN se muestran en la Figura 19 y el Cuadro 14.

Figura 19. Extracción de ADN de las muestras de C. glabrata T1 y LR2. Carril 1, extracción 1 de la cepa T1; carril

2, extracción 2 de T1; carril 3, extracción 1 de la cepa LR2; carril 4, extracción 2 de LR2. Se cargaron 3 μL de

ADN (aproximadamente de 927 ng a 2679.6 ng de ADN). Electroforesis en gel de agarosa 1% en TAE 1X corrida

40 min a 88 V.

Cuadro 14. Cuantificación del ADN extraído de las cepas de C. glabrata T1 y LR2 por espectrofotometría a 260nm

y determinación de la pureza con los cocientes 260/280 y 260/230.

Muestra Concentración (ng·μL-1) 260/280 260/230

T1 muestra a 825.3 1.95 2.49

T1 muestra b 567.5 1.94 2.48

LR2 muestra a 309.2 1.83 2.23

LR2 muestra b 893.2 1.92 2.09

Al evaluar la calidad del ADN extraído de una muestra, es importante conocer tanto la integridad

como la pureza de ésta. La pureza puede ser evaluada a partir de un ensayo espectrofotométrico

en donde se compara la absorbancia medida a 260nm (absorción de UV por las bases

nitrogenadas de la molécula de ADN) contra la absorbancia a 280nm y 230nm, en donde

absorben compuestos fenólicos, proteínas y carbohidratos. Una relación 260/280 de entre 1.8 a

2 y una relación 260/230 de entre 1.8 o 2 a 2.2 son indicadores de ADN de buena pureza y

valores más bajos que éstos son indicadores de impurezas en el ADN extraído. Para observar la

integridad del ADN se puede correr un gel de electroforesis para observar las bandas obtenidas.

Un ADN íntegro tendrá una banda definida sin barrido (Fonseca-Mendoza, Mateus-Arbeláez y


100

Contreras-Bravo, 2010; Desjardins y Conklin, 2010). En el Cuadro 14 se muestra los resultados

espectrofotométricos de la evaluación del ADN. Los cocientes 260/280 obtenidos se encuentran

entre 1.8 y 2, lo que indica una buena pureza del ADN de compuestos fenólicos o proteínas. Un

cociente 260/230 menor a 1.8 o 2 puede indicar contaminación por carbohidratos. Los valores

obtenidos en las muestras tienen un valor superior a dicho valor, sugiriendo una buena pureza

en éstas. En la Figura 19 se puede observar que se logró obtener un ADN con una banda definida,

aunque se observó un barrido ligero que podría indicar algo de degradación. No obstante, las

bandas indican suficiente integridad que podría usarse en una PCR convencional. Concluyendo,

el ADN obtenido presentó una calidad suficiente para la realización de las PCR punto final para

la amplificación de los fragmentos del gene XK.


101

9.2.3. Amplificación de los fragmentos del gene XK

Las ocho combinaciones de oligonucleótidos se probaron a temperaturas de hibridación de 58,

60 y 61 °C. Se logró la amplificación de una banda definida usando las combinaciones de

oligonucleótidos F1-XK/R1-XK y F1-XK/R2-XK a la temperatura de hibridación de 60 °C, y

la combinación F1-XK/R3-XK a una temperatura de hibridación de 58 °C. En la Figura 20 se

muestran los productos de amplificación obtenidos con estas combinaciones de

oligonucleótidos. Estos productos de PCR se secuenciaron para su análisis.

Figura 20. PCR con los juegos de oligonucleótidos F1-XK/R1-XK y F1-XK/R2-XK con una temperatura de

hibridación de 60 °C y de F1-XK/R3-XK con una temperatura de 58 °C. Todas las amplificaciones se hicieron por

duplicado. Carril 1: marcador molecular 100 pb DNA Ladder (Invitrogen), carril 2 y 3: cepa T1 con F1-XK/R1-

XK, carril 4 y 5: cepa LR2 con F1-XK/R1-XK, carril 6 y 7: T1 con F1-XK/R2-XK, carril 8 y 9: LR2 con F1-

XK/R2-XK, carril 10 y 11: T1 con F1-XK/R3-XK, carril 12 y 13: LR2 con F1-XK/R3-XK, carriles 14-19: testigos

negativos (C-). Electroforesis en gel de agarosa 1.5% en TAE 1X a 88 V, cargando 5 o 7 µL de producto de PCR.


102

9.2.4. Análisis de las secuencias amplificadas de los fragmentos del gene XK

9.2.4.1. Análisis de las secuencias nucleotídicas amplificadas de los fragmentos del gene

XK

El alineamiento de las secuencias amplificadas se muestra en la Figura 21. Las secuencias se

encuentran enlistadas en el Anexo 4. Las secuencias amplificadas con la pareja de

oligonucleótidos F1-XK/R1-XK, es decir las secuencias T1(F1R1) y LR2(F1R1), tuvieron un

tamaño de 196 nucleótidos contra un tamaño esperado de 245 pb. Las secuencias T1(F1R2) y

LR2(F1R2) corresponden a las amplificaciones con la pareja de oligonucleótidos F1-XK/R2-

XK. Su longitud fue de 190 nucleótidos contra un tamaño esperado de 245 pb. Las secuencias

T1(F1R3) y LR2(F1R3) corresponden a las amplificaciones con la pareja F1-XK/R3-XK, y

tuvieron una longitud de 356 nucleótidos contra un tamaño esperado de 405 pb. Se muestra en

la Figura 21 la posición del oligonucleótido F1-XK en la secuencia de referencia de C. glabrata

CR380953 que se usó en el diseño de oligonucleótidos y se observa que está a una distancia de

aproximadamente 50 nucleótidos del inicio de los amplicones en el extremo 5´. Considerando

que se usó el oligonucleótido F1-XK para la secuenciación directa, esto elimina

aproximadamente 50 pb hacia el extremo 5´ de las secuencias, por lo que los tamaños obtenidos

se aproximarían a los predichos. En la Figura 21 también se observa que la posición de los

oligonucleótidos R1-XK, R2-XK y R3-XK coincidió con los extremos 3´ de las respectivas

secuencias amplificadas. El alineamiento múltiple mostró que las secuencias de un mismo grupo

(aquellas amplificadas con la misma pareja de oligonucleótidos) fueron 100% idénticas entre

las cepas T1 y LR2. Entre distintos grupos se encontraron algunas diferencias en las

pertenecientes a F1R2 (tanto en T1 como en LR2) con respecto al resto de las secuencias. La

identidad entre los grupos de secuencias F1R1 y F1R3 con el grupo de secuencias F1R2 fue de

98.74%. Esta diferencia corresponde a la posición de nucleótidos degenerados en el

oligonucleótido R2-XK. Posiblemente estos nucleótidos hayan sido incorporados por alguna de

las combinaciones del oligonucleótido R2-XK. Otra posibilidad es que se hayan amplificado

dos alelos del gene XK en las cepas T1 y LR2. Uno de ellos sería el amplificado por las parejas

de oligonucleótidos F1-XK/R1/XK y F1-XK/R3-XK, siendo ambos conjuntos muy similares

entre sí, diferenciadose únicamente en longitud. El otro alelo seria el conjunto amplificado por


103

la pareja de oligonucleótidos F1-XK/R2-XK, teniendo una diferencia de dos bases con respecto

a los otros fragmentos.

Debido a que no se encontraron diferencias entre las secuencias de las cepas T1 y LR2

amplificadas con una misma pareja de oligonucleótidos, la estrategia planteada para diferenciar

a las cepas con este fragmento de gene, que consistía en aprovechar las diferencias en las

secuencias de las cepas para poder diferenciarlas por medio de una técnica de qPCR, no podría

ser posible, por lo menos en el fragmento del gene amplificado. No obstante, como se comentó

anteriormente, es posible que se haya amplificado un alelo del gene, por lo que éstos se podrían

diferenciar en base a su diferencia de secuencias.

El resultado del BLASTn mostró que a nivel de nucleótidos las secuencias del grupo F1R1 y

F1R3 presentaron identidad con una secuencia del cromosoma G de C. glabrata similar a una

secuencia de gene XK (CR380953), con una secuencia de ARNm (ARN mensajero) de una Xk

hipotética en C. glabrata CBS 138 (XM_446768) y con una secuencia de ARNm de una Xk

hipotética en C. tropicalis MYA-3404 (XM_002549530). Las secuencias del grupo F1R2

mostraron identidad sólo con las secuencias de C. glabrata. Los resultados del BLASTn se

muestran en el Anexo 5. En el alineamiento múltiple de la Figura 21 se incluyeron estas

secuencias. Se puede observar que las secuencias amplificadas tuvieron alta identidad con las

secuencias CR380953 y XM_446768 de C. glabrata. Los fragmentos amplificados con las

parejas de oligonucleótidos F1-XK/R1-XK y F1-XK/R3-XK tuvieron una identidad del 99%

con aquéllas secuencias de C. glabrata. El fragmento amplificado con la pareja de

oligonucleótidos F1-XK/R2-XK tuvo una identidad del 98% con dichas secuencias. En

contraste, la secuencia XM_002549530 de C. tropicalis presentó menor identidad con respecto

a las secuencias amplificadas. Las secuencias amplificadas con el juego de oligonucleótidos F1-

XK/R1-XK tuvieron una identidad del 44.89% con dicha secuencia. Las secuencias

amplificadas con los oligonucleótidos F1-XK/R2-XK tuvieron una identidad del 43.68% con

dicha secuencia. Las secuencias amplificadas con los oligonuclótidos F1-XK/R3-XK tuvieron

una identidad de 51.40% con esa secuencia. La mayor identidad de las secuencias amplificadas

con la secuencia XM_002549530 estuvo en las zonas cercanas a las correspondiente al

oligonucleótido R1-XK/R2-XK, que corresponde a una zona con motivos y residuos


104

conservados, como se explica más adelante en la sección 9.2.4.2. Esto coincide con los

resultados encontrados en el BLASTn, donde, con respecto a la secuencia de C. tropicalis, los

fragmentos amplificados con el juego de oligonucleótidos F1-XK-R1-XK tuvieron un

porcentaje de identidad del 94%, pero un valor de cobertura del 17%, con un alineamiento que

abarcó la zona conservada; mientras que los fragmentos amplificados con el juego de

oligonucleótidos F1-XK/R3-XK tuvieron un valor de identidad del 75% y un valor de cobertura

del 54%, abarcando desde la zona conservadas de la región del oligonucleótido R1-XK/R2-XK

hasta el extremo 3´ de los amplicones. De lo anterior se concluye que, aunque la técnica de

qPCR propuesta no podría diferenciar entre las cepas de C. glabrata T1 y LR2, podría usarse

para diferenciar entre éstas y cepas de C. tropicalis abarcando las zonas no conservadas del

fragmento de gene amplificado.

Las técnicas de PCR se han usado para identificar y diferenciar microoganismos del género

Candida. Por ejemplo, Fricke et al. (2010) pudieron diferenciar por medio de las curvas de

desnaturalización varias cepas del género Candida en muestras clínicas, por medio de PCR

Tiempo Real y usando el gene del ARNr 18S, aprovechando las distintas Tm del gene entre

microorganismos. Arancia et al. (2009) y Bineshian et al. (2015) se basaron en un gene de

manoproteína (MP65) para diferenciar diferentes especies del género Candida basándose en la

longitud de los amplicones obtenidos. En estos estudios se diseñaron oligonucleótidos

específicos para cada especie seleccionando regiones poco conservadas del gene, de tal manera

que cada pareja de oligonucleótidos abarcara regiones de tamaño diferente en el gene, y

obtuvieron amplicones de distinto tamaño para cada especie. En estos estudios se usó una

característica diferencial gene seleccionado, como la temperatura de desnaturalización o la

longitud de los amplicones, para diferenciar a los microorganismos. Además, en dichos trabajos,

las cepas diferenciadas fueron de distintas especies. En este trabajo, al ser distintas cepas de la

misma especie cuyas regiones amplificadas en el gene XK fueron idénticas, tanto en secuencia

como en tamaño, no se pudieron aplicar las técnicas.

Carvalho-Netto et al. (2013) usaron secuencias minisatélites para producir patrones de bandeo

por PCR, dando polimorfismo de tamaño con lo cual pudieron diferencias varias cepas de S.

cerevisiae y usaron esta técnica para monitorear los cambios poblacionales en cultivos mixtos


105

durante la producción de bioetanol a partir de azúcar de caña. Para encontrar las regiones de

mejor polimorfismo, compararon secuencias del genoma de cepas de S. cerevisiae. Encontraron

cuatro genes de proteínas de pared celular y relacionadas con funciones de síntesis y

mantenimiento de la pared de S. cerevisiae (YKL163W, YKL201C, YLL021W), así como en

procesos importantes como la reparación del ADN, la acetilación de histonas y la transcripción

(YFL024C). Estos genes tuvieron suficiente polimorfismo de longitud para discriminar tanto

cepas de S. cerevisiae usadas en la fermentación de caña de azúcar como cepas no relacionadas

con la fermentación de la caña. Los minisatélites fueron encontrados principalmente en regiones

codificantes y los patrones de bandeo de las cepas fueron idénticos entre reaislamientos a lo

largo de las fermentaciones, sugiriendo que los marcadores fueron genéticamente estables

durante la propagación y fermentación. Además, se ha encontrado polimorfismo de longitud en

varios otros genes de pared celular, o relacionados con la síntesis y mantenimiento de la pared

celular, debido a repeticiones intragénicas en tándem en cepas de S. cerevisiae (Verstrepen et

al., 2005). Por otro lado, se han encontrado secuencias homólogas de genes de pared celular en

cepas del género Candida, incluyendo a C. glabrata (‘Candida Genome Database’), y se han

estudiado, proponiendo funciones similares a las de S. cerevisiae y encontrando polimorfismo

por minisatélites en muchos de ellos (Thierry et al., 2008; Hall y Gow, 2013; Gómez-Molero

et al., 2015). Una propuesta podría ser la amplificación y el secuenciamiento de los

correspondientes genes homólogos en las cepas T1 y LR2 para encontrar si existe polimorfismo

entre ellos para realizar la discriminación de las levaduras ya sea por patrones de bandeo de los

minisatélites o por qPCR. Además, se podría realizar una secuenciación de los genomas de T1

y LR2 y compararlos para encontrar otros genes y otras regiones polimórficas para usarse en la

discriminación de las cepas.


106

Figura 21. Alineamiento de las secuencias amplificadas con las parejas de oligonucleótidos F1-XK/R1-XK, F1-

XK/R2-XK y F1-XK/R3-XK en las cepas C. glabrata T1 y LR2 y secuencias de genes XK de C. glabrata (Números

de accesión CR380953 y XM_446768) y de C. tropicalis (XM_002549530) con las que presentaron alta identidad

de acuerdo a un resultado de BLASTn. El alineamiento se realizó con la herramienta del programa CLC Sequence

Viewer 7.8.1. En cada secuencia amplificada se presenta el consenso de un duplicado. Se marca también con barras

la zona de los oligonucleótidos F1-XK (barra gris), R1-XK y R2-XK (barra naranja) y R3-XK (barra azul). El lugar

marcado con el oligonucleótido F1-XK corresponde a su posición en la secuencia CR380953 de C. glabrata, misma

que se usó en el diseño de los oligonucleótidos.


107

En la Figura 22 se muestra el árbol filogenético construido con las secuencias amplificadas y

secuencias de genes XK de varias levaduras relacionadas.

Figura 22. Árbol filogenético de XK con las secuencias de las cepas de C. glabrata T1 y LR2 y secuencias

relacionadas de XK en levaduras. Se utilizó el software Mega 7 para realizar el alineamiento de las secuencias por

ClustalW y posteriormente se realizó el árbol filogenético por Minima Evoluctión con un bootstrap de 1000.

En dicho árbol se observa que las secuencias de las cepas T1 y LR2 están muy cercanas, con

F1R1 y F1R3 agrupadas en la misma rama, mientras que las secuencias del grupo F1R2 están

agrupadas en la rama más cercana. Posiblemente esta separación de estas últimas pueda deberse

a las diferencias en los nucleótidos que se ha comentado anteriormente y a su menor longitud

en relación con las de los otros dos grupos. La agrupación de las amplificaciones obtenidas con

la misma combinación de oligonucleótidos en la misma rama refleja su 100% de similitud, tal


108

como se mostró en la Figura 21. También se destaca la cercanía a las secuencias de genes XK

de C. glabrata encontradas en las bases de datos, tal como se esperaba al pertenecer a la misma

especie.

Se observó además que las secuencias de C. glabrata estuvieron más cercanas con las de S.

cerevisiae y Naumozyma castellii, que con las otras cepas del género Candida, la mayoría de las

cuales estuvieron agrupadas en una rama muy separada a C. glabrata. Esto es similar a lo

observado en otras publicaciones. Se sabe que C. glabrata está más filogenéticamente

relacionada a varias levaduras del género Saccharomyces y Naumozyma que a otros

microorganismos del género, como C. albicans, C. tropicalis o C. dubliniensis. Éstas últimas se

agrupan en el clado CTG, donde este codón es traducido a serina en vez de a leucina, alteración

que no se encuentra en C. glabrata. Además, C. glabrata y S. cerevisiae pertenecen a un clado

separado de otras especies de Candida y de P. stipitis, compartiendo algunas características en

común, como las relacionadas a respuestas a estrés y metabolismo fermentativo (Roetzer,

Gabaldón y Schüller, 2011; Ahmad et al., 2014). El linaje de levaduras donde se incluyen C.

glabrata y S. cerevisiae sufrió un fenómeno conocido como “whole genome duplication”

(WGD), en donde se crearon copias adicionales del genoma entero en dichas especies. Así,

muchas levaduras de estos linajes post-WGD tienen varias copias de genes de HXK (HXK,

GLK1/EM2), así como de otros genes de la ruta glucolítica como los pertenecientes a la

gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (TDH2/TDH3), a la enolasa (ENO1/ENO2) y a la

piruvato cinasa (CDC19/PYK2) (Conant y Wolfe, 2007; Lin y Li, 2011). Otras adaptaciones

post-WGD que comparten individuos de este linaje son la generación de mutantes

deficientemente respiratorias con deficiencias en su ADN mitocondrial (“petites”), un fuerte

comportamiento Crabtree-positivo (Merico et al., 2007; Hagman et al., 2013) y modificaciones

de promotores para la expresión de genes de rápido crecimiento relacionados con el

metabolismo respitatorio (RGE rewiring) (Ihmels, 2005; Rozpędowska et al., 2011).


109

9.2.4.2. Análisis de las secuencias de aminoácidos de Xk

Las secuencias traducidas a aminoácidos del grupo F1R1 tuvieron una longitud de 64

aminoácidos, las del grupo F1R2 fueron de 62 aminoácidos y las del grupo F1R3 fueron de 118

aminoácidos. El alineamiento de la Figura 23 mostró que, a pesar de la diferencia a nivel de

nucleótidos entre secuencias de distintos grupos, a nivel de secuencia de aminoácidos son

idénticas entre sí y con una Xk putativa de C. glabrata (XP_446768). El alineamiento con

secuencias de Xk de varios organismos relacionados mostró que se amplificaron algunas

regiones y residuos de aminoácidos conservados de la familia de las carbohidrato-cinasas y la

superfamilia de la ATPasas. En concreto, mostró tener los motivos “Connect 1” y “Phospate 2”

(señalados en la Figura 23 dentro de un recuadro negro discontinuo y continuo,

respectivamente), así como los residuos señalados con una flecha, incluyendo un residuo de

aspartato (D), de glicina (G), de treonina (T) y de serina (S), los cuales son altamente

conservados en la familia de las carbohidrato-cinasas. El residuo de aspartato catalítico funciona

como una base general que activa al grupo hidroxilo para el ataque nucleofílico en el γ-fosfato

del ATP. Estas regiones son similares a las señaladas en otras Xk de otros microorganismos,

como muestran Guo et al. (2006) y Wang et al. (2011).


110

Figura 23. Alineamiento de las secuencias de Xk amplificadas traducidas en aminoácidos y algunas secuencias de

Xk de varios organismos: C. glabrata (XP_446768), H. sapiens (NP_005099), E. coli (WP_038348817),

Zygosaccharomyces bailii (CDF87458), Z. parabailii (AQZ17178), T. delbrueckii (XP_003681932), Kazachstania

naganishii (CCK71141), Lachancea thermotolerans (CAR21434), L. lanzarotensis (CEP62659), K. africana

(XP_003956749), K. saulgeensis (SMN21446), N. dairenensis (XP_003669776), S. cerevisiae (EGA78735), K.

marxianus (ADW23548), Tetrapisispora phaffii (XP_003683541). En recuadro negro se marca la región

correspondiente a los motivos “Connect 1” y “Phospate 2” de la superfamilia de las ATPasas (línea discontinua y

continua, respectivamente). Se marca con flechas aminoácidos conservados en las carbohidrato-cinasas.

En la Figura 24 se presenta el mapa de regiones catalíticas de las secuencias traducidas en

comparación con la secuencia de Xk de C. glabrata de referencia (XP_446768), marcando las

regiones catalíticas putativas señaladas por el CD_Search del NCBI. En el Anexo 6 se ha puesto

el mapa de dominios catalíticos en secuencias nucleotídicas. De acuerdo a estos resultados, se

amplificó una parte de la región catalítica de las Xk. La zona incluye residuos de aminoácidos

de sitio de unión a xilulosa, como el mismo aminoácido catalítico D señalado anteriormente,

uno de asparagina (N) y uno de metionina (M). Otros sitios marcados fueron el de unión de


111

metal, (residuo D) y el de unión del MgATP donde se observa al residuo D, uno de leucina (L),

uno de G y uno de T, pertenecientes al motivo conservado “Phospate 2”.

Figura 24. Mapa de regiones catalíticas. Se realizó un alineamiento múltiple con las secuencias de amoniácidos de

los fragmentos amplificados del gen XK en las cepas T1 y LR2 usando el programa CLC Sequence Viewer versión

7.8.1. La secuencia de referencia para localizar los dominios catalíticos fue una de Xk putativa de C. glabrata

(XP_446768) y se usó el CDD Search del NCBI para encontrar dichos dominios.

Los residuos de aminoácido D y N de las secuencias amplificadas que tienen señaladas

funciones de unión a xilulosa en el mapa de dominios catalíticos se alinearon en la Figura 23

con los aminoácidos D280 y N281 de una Xk humana (NP_005099) en la que Bunker et al.

(2013) propusieron dichos residuos como parte de los aminoácidos de unión a la xilulosa en una

estructura cristalina de la proteína. Además, el residuo D280 fue propuesto como un residuo

catalítico, actuando como una base general que activa al grupo hidroxilo O5 para un ataque

nucleofílico al γ-fosfato del ATP. De manera similar, el residuo D señalado en el mapa de

dominios catalíticos de las secuencias amplificadas tiene una función catalítica predicha.

Los residuos de D, N y T señalados en el mapa de dominios catalíticos, y adicionalmente el

residuo de S señalados en la Figura 23, se alinearon con los residuos de aminoácidos D233,

N234, T255 y S256 de la Xk de E. coli (WP_038348817). Di Luccio et al. (2007), en un estudio


112

de la estructura de dicha proteína bacteriana, propusieron a D233, N234 y S256 como parte de

los residuos de unión a xilulosa, a D233 y T255 como parte de los residuos de unión del MgATP,

y a D233 como un residuo catalítico con función similar a la mencionada por Bunker et al. Los

residuos señalados en el mapa dominios catalíticos de las secuencias amplificadas tienen

predichas funciones similares a las propuestas por dichos autores en la proteína bacteriana.

Considerando lo anterior, es posible que las funciones predichas para los residuos de

aminoácidos en las Xk amplificadas de las cepas LR2 y T1 tengan una función biológica similar

a la de los aminoácidos correspondientes en las Xk de E. coli y de Homo sapiens.

9.2.5. Análisis de la región promotora

Con el objetivo proponer la diferenciación de las cepas T1 y LR2 con base en su expresión de

la enzima XK, se hizo un análisis de la región promotora para encontrar elementos regulatorios

relacionados con la enzima. Con base en la secuencia de cromosoma G de C. glabrata

CR380953 encontrada en la base de datos del NCBI se seleccionó una región de 1000

nucleótidos río arriba de la región estructural del gen XK (890248-891247). Se usó la plataforma

SCDP The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae para realizar la búsqueda de

elementos putativos regulatorios predefinidos, arrojando los resultados mostrados en el Cuadro

15 y en el mapa de regiones regulatorias de la Figura 25. Relacionado con el metabolismo de

carbohidratos, se encontró un lugar de unión del factor de transcripción GCR1, que regula varios

genes de enzimas glucolíticas y de la gluconeogénesis (Hossain et al., 2016).


113

Figura 25. Mapa de regiones regulatorias predichas en la secuencia de C. glabrata (CR380953: 890248-891247),

analizada con la plataforma SCDP The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae.


114

Cuadro 15. Regiones regulatorias predichas por la plataforma SCDP The Promoter Database of Saccharomyces

cerevisiae, señalando el nombre del elemento regulatorio.

Elemento

regulatorio

Secuencia Posición Función del factor de transcripción

RAP1 ACACCCA

AAACCCA

GCACCCA

-915 a -909

-843 a -837

Cadena – de -448 a

-442

Proteína de regulación de transcripción en

levaduras cuyos sitios de unión a DNA se

pueden encontrar en tres tipos de elementos

cromosomales: promotores, silenciadores y

telómeros. RAP1 también está involucrado

en la regulación de la estructura de los

telómeros. Las funciones reguladoras de

RAP1 no son intrínsecas a sus sitios de unión,

sino que resultan de interacciones con

diferentes factores en promotores y

silenciadores.

GCN4 TGACTG

TGAGTG

TGACTA

TGACTA

TGAATA

TGACTT

TGAATT

TGAATA

TGATTG

TGAATG

TGAATC

-905 a -900


-894


-814

-621 a -616


-576

-572 a -567

Cadena- de -414 a -

409

-347 a -342


-259


-97

Cadena – de -37 a -

32

Es un factor de transcripción que es

responsable para la activación de más de 30

genes requeridos para la biosíntesis de

aminoácidos o purinas en respuesta a

inanición de aminoácidos o purinas.


115

GCR1 CTTCC

CTTCC

-884 a -880

-301 a -297

Es un factor de transcripción que regula la

expresión de genes de enzimas glicolíticas

como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato-

deshidrogenasa, fosfoglicerato cinasa,

fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa. Actúa

junto con otro factor, GCR2 para mediar la

expresión de altos niveles de expresión de los

genes glicolíticos (activador transcripcional).

ACE2 GCTGGT Cadena – de -802 a -797 Factor de transcripción requerido para la

destrucción del septum tras la citocinesis. En

C. albicans regula la expresión de genes

involucrados en la separación celular y de la

pared celular.

SWI5 TGCTGG

Cadena – de -801 a -796 Activa la transcripción de genes expresados

en la fase G1 y entre la fase M/G1.

ABF1 TCGAAATACACG Cadena – de -731 a -720 Proteína de unión a DNA con posible

actividad de reorganización de cromatina,

involucrada en la activación transcripcional,

silenciamiento de genes y replicación y

reparación de DNA.

Mat-alfa2 CGTGTATTT -731 a -723 Determina, junto con otros reguladores, el

tipo el tipo celular diploide α/a por represión

de los genes específicos de células haploides.

HSTF GAAGGGTCC Cadena- de -516 a -508 Factor de transcripción de choque térmico

que participa en la inducción de genes de

respuesta al choque térmico.

BAS2 TAATAA

TAATAA

TAATAA

Cadena – de -489

a -484

Cadena – de -227

a -222

-51 a -46

Factor de transcripción homeodominio. Se

une cooperativamente con Pho4 al promotor

PHO5, está involucrado en la regulación del

metabolismo de fosfato.


116

LEU3 CCGTCTGCGG -462 a -453 Factor de transcripción de dedo de zinc,

represor y activador, regula genes

involucrados en la biosíntesis de aminoácidos

ramificados y asimilación de amonio. Actúa

como un represor en condiciones de

abundancia de leucina y como activador en

presencia de α-isopropilpalmitato, un

intermediario en la biosíntesis de leucina que

se acumula durante la inanición de leucina.


glabrata T1 y LR2

Primeramente, se ajustaron las condiciones de la REP-PCR a partir de las condiciones iniciales

del Cuadro 7 y la Figura 14. Se modificaron las cantidades de ADN y de oligonucleótidos en la

reacción para obtener bandas definidas. Posteriormente se modificó la temperatura de

alineamiento de 47 °C a 46 °C para aumentar el número de bandas en cada cepa. Las condiciones

finales de reactivos se muestran en el Cuadro 16, mientras que las condiciones del ciclo de

reacción se presentan en la Figura 14, considerando la disminución de la temperatura de

alineamiento a 46 °C.

Cuadro 16. Cantidad de reactivos usados para la REP-PCR en las cepas C. glabrata T1 y LR2 y en Colletotrichum

AL-09 con las condiciones ajustadas.

Reactivo Volumen de

reacción LR2

Volumen de reacción

para T1 y AL-09

Concentración final

Buffer de reacción 10 X 2.5 μL 2.5 μL 1X

MgCl2 (50 mM) 0.75 μL 0.75 μL 1.5 mM

Oligonucleótido REP1R-I 5 μM 2 μL 2 μL 0.4 µM

Oligonucleótido REP2-I 5 μM 2 μL 2 μL 0.4 µM

dNTP´s (10 mM) 0.5 μL 0.5 μL 0.2 mM

Taq polimerasa (5U/μL) 0.5 μL 0.5 μL 2.5 U

ADN (200-900 ng/μL) 2 μL 3 μL 24-108 ng/μL

Agua MiliQ 14.75 μL 13.75 μL ---------------

Volumen total 25 μL 25 μL


117

Debido a que no se encontraron diferencias en las secuencias del gen de XK para discriminar a

las cepas, como alternativa se usó la técnica de REP-PCR para su diferenciación. En la Figura

26 se muestran los resultados de las REP-PCR, que se realizaron en cuatro experimentos

independientes. En cada uno se realizó la REP-PCR de las cepas T1 y LR2 por duplicado. En

cada experimento se seleccionaron las bandas de cada cepa para elaborar dendrogramas

mediante UPGMA que reflejaran las diferencias entre patrones de bandeo. Las matrices de

distancias de los distintos geles se muestran en el Anexo 7.

En la Figura 26A se observa un patrón de bandeo distinto entre las cepas T1 y LR2 en la zona

800-1000 pb. Se oservó también dos bandas tenues entre 600 y 800 pb en la muestra LR2-2,

pero no en LR2-1 ni en la cepa T1, por lo que se descartaron en la elaboración del árbol UPGMA

por no aparecer en el duplicado de LR2. El testigo positivo de Colletotrichum AL-09 no se

incluyó debido a que las bandas fueron muy tenues. En la Figura 26C se observa otro

experimento de REP-PCR en donde se observó un mayor número de bandas. Se observaron

bandas entre 700 y 800 pb en T1 que no se presentaron en la cepa LR2. Ésta última presentó

una banda a 600 pb y dos entre 1500 y 2072 pb que no estuvieron presentes en la cepa T1. Se

observó también en la zona entre 800 y 1000 pb de T1 y LR2 un patrón similar al presentado en

la cepa LR2 en la Figura 26A. En la Figura 26E se observó que ambas cepas presentaron un

patrón idéntico de bandeo. Todas las cepas presentaron una banda cercana a 600 pb que

aparentemente fue la observada en las cepas LR2 en la REP-PCR de la Figura 26C. En la Figura

26G se observó un patrón de bandeo similar al de la Figura 26E en las bandas superiores a 600

pb. Pese a la similitud de los patrones de bandeo, se observaron bandas inferiores en las cepas

LR2 que no fueron observadas en T1. En los dendrogramas de las Figuras 26 B, D y H las cepas

T1 y LR2 se agruparon en ramas distintas, mientras que en la Figura 26F, ambas cepas se

agruparon en la misma. Las separaciones observadas en los dendrogramas se debieron a las

bandas que diferencian a las cepas, pero que, como se describió anteriormente, fueron

inconsistentes entre un experimento y otro. Usando sólo aquéllas que fueron consistentes se

observó un mismo patrón de bandeo entre ambas levaduras. Por lo tanto, no se garantiza su

diferenciación, por lo menos en las condiciones de reacción evaluadas. Sin embargo, la técnica

podría servir para diferenciar a T1 y LR2 de Colletotrichum AL-09.


118


119


120

Figura 26 (páginas 118 y 119). Patrones de bandeo obtenidos por REP-PCR para las cepas T1 y LR2. Figura 26A:

experimento 1, patrón de bandeo de las diferentes cepas. Pocillo 1: marcador molecular 100 pb DNA Ladder

(Invitrogen), pocillo 2: testigo positivo Colletotrichum AL-09 (C+), pocillo 3: T1-1, pocillo 4: T1-2, pocillo 5:

LR2-1, pocillo 6: LR2-2, pocillo 7: testigo negativo (C-). Figura 26B: árbol UPGMA de los patrones de bandeo de

las cepas T1 y LR2 en el experimento de la Figura 26A. Figura 26C: experimento 2, patrón de bandeo de las

diferentes cepas. Pocillo 1: C+, pocillo 2: T1-1 pocillo 3: LR2-1, pocillo 4: T1-2, pocillo 5: LR2-2, pocillo 6: T1-

3, pocillo 7: LR2-3, pocillo 8: C-, pocillo 9: marcador molecular 100 pb. Figura 26D: árbol UPGMA de los patrones

de bandeo de las cepas T1, LR2 y el testigo positivo del experimento de la Figura 26C. Figura 26E: experimento

3, patrón de bandeo de las diferentes cepas. Pocillo 1: marcador molecular 100 pb, pocillos 2: C+ 1, pocillo 3:C+

2, pocillo 4: T1-1, pocillo 5: T1-2, pocillo 6: LR2-1, pocillo 7: LR2-2. Figura 26F: árbol UPGMA de los patrones

de bandeo de las cepas T1, LR2 y el testigo positivo de la Figura 26E. Figura 26G: experimento 4, patrón de bandeo

de las diferentes cepas. Pocillo 1: C+, pocillo 2 T1-1, pocillo 3: T1-2, pocillo 4: LR2-1, pocillo 5: LR2-2, pocillo

6: C-, pocillo 7: marcador molecular 100 pb. Figura 26H: árbol UPGMA de los patrones de bandeo de las cepas

T1, LR2 y el testigo positivo en la Figura 26G. Electroforesis realizadas en gel de agarosa 2% en TAE 1X, cargando

10-14 µL de producto de PCR. Las muestras seleccionadas para elaborar los árboles se señalan con una flecha

negra en la parte superior de los geles. Se resaltan mediante un círculo negro punteado las bandas que separaron a

las cepas T1 y LR2 en cada uno de los geles.

Los oligonucleótidos REP1R-I y REP2-I usados en este trabajo fueron diseñados a partir de los

extremos de secuencias REP consenso en bacterias (Versalovic, Koeuth y Lupski, 1991). Pese

a haber sido diseñado para secuencias de bacterias, la técnica se ha usado también para la

diferenciación de eucariotas, incluyendo levaduras, como en el trabajo de Hierro et al. (2004).

Se sabe que los patrones obtenidos por REP-PCR y otras técnicas relacionadas, como ERIC-

PCR, no necesariamente son resultado de amplificaciones en secuencias repetitivas, pudiendo

deberse también a amplificaciones al azar en zonas del genoma donde haya cierta similitud con

los oligonucleótidos, tal como han señalado algunos autores (Gillings y Holley, 1997; Mehta,

Mehta y Rosato, 2002). Hierro et al. (2004) realizaron REP-PCR con los mismos

oligonucleótidos usados en este trabajo para identificar distintas levaduras en vinos.

Encontraron algunos problemas en la reproducibilidad de los patrones de bandeo, pero pudieron

identificar levaduras a nivel de especie, incluyendo algunas del género Candida, como C.

boidinni, C. mesentérica, C. sake y C. stellata, sin embargo, cepas de la misma especie no

pudieron ser diferenciadas. Por otro lado, mediante una técnica de ERIC-PCR con

oligonucleótidos (ERIC1R y ERIC2), también basados en secuencias bacterianas (Versalovic,


121

Koeuth y Lupski, 1991), pudieron diferenciar algunas cepas de levaduras de la misma especie,

como C. boidinni, C. stellata y Issatchenkia terrícola. De manera similar, en este trabajo

mediante REP-PCR se pudieron diferenciar las cepas de C. glabrata T1 y LR2 con respecto a

la de Colletotrichum AL-09, pero no se pudieron diferenciar entre sí. Además, también se

encontró poca reproducibilidad en varias bandas tanto para T1 como para LR2. Los

oligonucleótidos REP1R-I y REP2-I tienen nucleótidos de inosina en su secuencia. Este

nucleótido puede hibridar con los de adenina, guanina, citosina o timina y es añadido para

sustituir a nucleótidos en posiciones donde exista degeneración; sin embargo, puede llevar a

amplificaciones inespecíficas, como comentan Hierro et al. (2004). Teniendo en cuenta que la

técnica de REP-PCR amplifica secuencias al azar distribuidas en el genoma y que los

oligonucleótidos usados fueron diseñados en base a secuencias bacterianas, existiría poca

similitud entre los oligonucleotidos y las secuencias blanco en el genoma de las cepas T1 y LR2,

llevando a tener amplificaciones inespecíficas. Además, la presencia de nucleótidos de inosina

podría aumentar la inespecificidad. Considerando lo anterior, las bandas poco observadas o

inconsistentes en la Figura 26 se habrían debido a amplificaciones poco específicas al azar que

por lo tanto no pudieron reproducirse.

Abaci et al. (2011) identificaron diferentes cepas de C. albicans en muestras de la cavidad bucal

de por medio de REP-PCR usando los oligonucleótidos Ca-21 y Ca-22 basados en elementos

repetitivos de Candida. También, Katara et al. (2012) tipificaron distintas cepas de B.

thuringiensis por REP-PCR con oligonucleótidos Bc-REP-1 y Bc-REP-2, basados en secuencias

repetitivas de B. cereus, pudiendo diferenciar entre cepas de dicha especie. Mediante ERIC-

PCR con los oligonucleótidos ERIC1R y ERIC2 también pudieron diferenciarlas y además

concluyeron que esta técnica tuvo una mayor capacidad discriminatoria. En otro trabajo,

Aranda-Olmedo et al. (2002) usaron oligonucleótidos REPc, basados en secuencias repetitivas

de P. putida y lograron amplificaciones con diferentes patrones de bandeo en diferentes cepas

de esta especie. Con estos oligonucleótidos específicos no obtuvieron amplificaciones en otras

especies del género Pseudomonas. Los oligonucleótidos para REP usados por estos autores

fueron más específicos para los microorganismos en los que fueron usados y no tuvieron inosina

en su composición. Es posible que el uso de otros oligonucleótidos de REP-PCR basados en

secuencias repetitivas de alguna levadura relacionada con C. glabrata pueda ayudar a


122

diferenciar a las cepas T1 y LR2 y a obtener patrones de bandeo más consistentes. También se

podría usar otra técnica, como la ERIC-PCR, que en otros trabajos ha presentado mayor

capacidad discriminatoria que la REP-PCR.

9.4. Establecimiento de las condiciones de fermentación de los cultivos mixtos

Como se observó anteriormente (Figura 17, Cuadro 10 y Cuadro 11), las cepas LR2 y T1 tienen

diferentes características de asimilación de los azúcares y de producción de etanol. En términos

de porcentaje de consumo, la cepa LR2 tuvo una preferencia mayor por la arabinosa que la cepa

T1, mientras que ésta tuvo una mayor preferencia por la galactosa y la xilosa que aquélla. La

cepa LR2 además tuvo mayor preferencia por la arabinosa que por la galactosa y la xilosa y la

cepa T1 tuvo una mayor preferencia por la xilosa que por la arabinosa. La habilidad de fermentar

la galactosa y pentosas como la xilosa y la arabinosa, es importante para el aprovechamiento

integral de los carbohidratos presentes en los residuos cítricos, en los cuales se incluyen éstos

azúcares. Además, ambas cepas tuvieron preferencia por la glucosa, seguida por la fructosa,

sobre los demás azúcares. Estos dos carbohidratos son mayoritarios en los hidrolizados de

residuos cítricos, por lo que para el aprovechamiento de éstos es importante usar cepas con

capacidad de asimilación de éstos (Boluda-Aguilar y López-Gómez, 2013). La cepa LR2 tuvo

una mayor velocidad de producción de etanol y una mayor productividad máxima en

comparación con la cepa T1, aunque ésta última tuvo una producción levemente superior.

Además, la cepa LR2 tiene su mejor temperatura de fermentación a 40 °C y T1 a 35 °C. El uso

de cepas fermentadoras de pentosas y termotolerantes es importante para reducir los costos de

operación y de enfriamiento en los sistemas de fermentación, especialmente en países tropicales.

Por lo que el uso de éstas cepas, y especialmente de LR2, es interesante en la fermentación de

residuos cítricos para producir bioetanol. Por estas diferentes capacidades de asimilación de

azúcares y de producción de etanol se decidió realizar cultivos mixtos de ambas para evaluar el

mejoramiento en la producción de etanol y en el uso de los carbohidratos.

En los cultivos individuales a las 72 h la cepa T1 se encontraba a la mitad del tiempo que

necesitaba para alcanzar su máxima producción, mientras que en este mismo tiempo la cepa

LR2 estaba cerca de su máxima producción (Figura 17), por lo que se seleccionaron las 72 h

como punto de inoculación de la cepa 2 en el diseño experimental con el fin de mejorar la


123

producción de etanol. Las temperaturas seleccionadas se eligieron a partir de las mejores

temperaturas de fermentación para T1 (35 °C) y LR2 (40 °C). De estas combinaciones se

formularon cuatro cultivos mixtos (CM): CM3, CM4, CM5 y CM6 definidos de acuerdo a la

clave del Cuadro 8. Los resultados de la cinética de fermentación se muestran en la Figura 27,

donde únicamente se determinaron los azúcares totales.

En el cultivo CM3 se observó que tanto la biomasa como el etanol empezaron a producirse desde

el día cero. La cepa T1 tuvo una fase exponencial de 1.7 días (40 h), tras lo cual se observó una

disminución. Posteriormene se inoculó la cepa LR2 a los tres días (72 h), observándose una fase

exponencial que duró 16 h hasta los 3.7 días (88 h), seguido de un crecimiento más moderado

hasta el final de la fermentación. Los azúcares se consumieron durante los siete primeros días,

tras lo cual se mantuvieron prácticamente estables, llegando a un consumo total del

54.28±3.54%. El etanol se produjo casi de manera continua, llegando al máximo a los siete días

(12.80±0.51 g·L-1), tras lo cual se empezó a consumir mientras se observó la producción de

biomasa. En el cultivo CM4 se observó una fase exponencial de un día (24 h) para la cepa LR2,

tras lo cual la población se mantuvo estable hasta el día dos. Posteriormente se observó una

disminución que duró hasta el día tres. En este punto se inoculó la cepa T1, observándose un

crecimiento exponencial de dos días (48 h). Al quinto día de fermentación se observó una fase

estacionaria que duró hasta el final de la cinética. Los azúcares se consumieron primero durante

0.7 días (16 h), tras lo cual se observó una estabilización que duró hasta el segundo día de

fermentación, seguido de una continuación del consumo que duró hasta el final de la

fermentación, llegando a 55.49±3.40% de azúcares totales consumidos. El etanol se produjo

casi de manera continua desde el inicio de la fermentación hasta el día seis, con un máximo de

11.97±0.39 g·L-1, tras lo que inició su consumo que duró el resto de la cinética. En el cultivo

CM5, la cepa T1 inoculada inicialmente tuvo una fase exponencial de dos días (48 h), seguido

de una fase estacionaria. Al tercer día desde el inicio de la fermentación (72 h) se inoculó la

cepa LR2, observándose una fase exponencial de un día (24 h). A partir del día cuatro se observó

primero una estabilización en la biomasa y luego un crecimiento moderado hacia el final de la

fermentación. Los azúcares se consumieron principalemte los cuatro primeros días, tras lo cual

se mantuvieron estables. El consumo final fue de 40.54±0.39%. El etanol se produjo desde el

día cero hasta el día 3.7 (88 h), alcanzando 5.79±1.22 g·L-1. Posteriormente se consumió


124

prácticamente hasta el final de la fermentación, mientras se observaba la producción de biomasa.

En el cultivo CM6, la cepa LR2 inoculada inicialmente presentó una fase exponencial de un día

(24 h), seguido de una fase estacionaria hasta los 2.7 días (64 h). Se observó una disminución al

tercer día (72 h), momento en el cual se inoculó la cepa T1, observándose una fase exponencial

de 0.7 días (16 h). Tras lo anterior, la biomasa aumentó de manera moderada hasta el final de la

fermentación. Los azúcares se consumieron principalmente durante los primeros cuatro días,

tras lo cual se observó una estabilización. Su consumo final fue de 33.44±2.04%. El etanol se

produjo principalmente durante los primeros dos días, tras lo cual se mantuvo prácticamente

estable, aunque al noveno día se observó una producción de 5.46±0.03 g·L-1.


125

Figura 27. Consumo de carbohidratos y producción de etanol durante diez días de fermentación en un medio con

mezcla de azúcares a una concentración total de 120 g/l (51% glucosa, 30% fructosa, 8% galactosa, 7% arabinosa,

2% xilosa and 2% sacarosa) en: A) CM3, cultivo mixto de C. glabrata T1 inoculada al día cero y C. glabrata LR2

inoculada al tercer día, e incubadas a 35 °C; B) CM4, cultivo mixto de C. glabrata LR2 inoculada al día cero y C.

glabrata T1 inoculada al tercer día,e incubadas a 35 °C; C) CM5, cultivo mixto de C. glabrata T1 inoculada al día

cero y C. glabrata LR2 inoculada al tercer día, e incubadas a 40 °C; D) CM6, cultivo mixto de C. glabrata LR2

inoculada al día cero y C. glabrata T1 inoculada al tercer día, e incubadas a 40 °C. Cada cepa fue inoculada a 10 x

106 células·mL-1. Los cultivos se mantuvieron en agitación a 200 rpm. Círculo rojo: azúcares totales, triángulo azul:

peso seco, cuadrado transparente: etanol.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Peso s

eco (

/10,

g·L

-1),

eta

nol (g

·L-1

)

Consum

o d

e c

arb

ohid

rato

s (

g·L

-1)

Tiempo (días)

A

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Peso s

eco (

/10,

g·L

-1),

eta

nol (g

·L-1

)

Consum

o d

e c

arb

ohid

rato

s (

g·L

-1)

Tiempo (días)

B

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Peso s

eco (

/10 g

·L-1

), e

tanol (g

·L-1

)

Consum

o d

e c

arb

ohid

rato

s (

g·L

-1)

Tiempo (días)

C

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Peso s

eco (

/10 g

·L-1

), e

tanol (g

·L-1

)

Consum

o d

e c

arb

ohid

rato

s (

g·L

-1)

Tiempo (días)

D


126

En el Cuadro 17 se muestran los parámetros cinéticos de fermentación de los cultivos mixtos.

Se observa que los mejores resultados de producción de etanol se obtuvieron con los cultivos

mixtos a 35 °C (CM3 y CM4). Esto se puede observar también en el diagrama de Pareto de la

Figura 28a, donde se observa que sólo la temperatura tuvo un efecto significativo sobre la

producción. Los resultados fueron inferiores al obtenido con los cultivos individuales de T1 y

LR2 (24.28 ±0.78 g·L-1 y 21.36 ±1.41 g·L-1, respectivamente). A 40 °C se obtuvieron los

menores valores de producción de entre los cultivos individuales y mixtos, por lo que esta

temperatura no se recomienda para la producción de etanol en los esquemas de cultivo

secuenciales planteados. La productividad máxima se vio afectada tanto por la temperatura,

como por el esquema de inoculación y su interacción (Figura 28b). La mejor productividad se

obtuvo con el cultivo CM4, seguido del cultivo CM3, aunque el máximo de etanol se produjo

hasta el sexto y séptimo días, respectivamente. En comparación, la cepa T1, también incubada

a 35 °C, produjo más etanol y tuvo una mayor productividad (4.05±0.13 g·L-1·día-1) y también

una mayor velocidad de producción del alcohol (0.053±0.001 g·L-1·h-1). La velocidad de

producción de los cultivos mixtos no se vio afectada significativamente por ninguno de los

factores ni por su interacción (Figura 28c), de acuerdo al análisis estadístiico. Sin embargo, la

mejor velocidad se produjo con el cultivo CM5, seguido del cultivo CM6, aunque su producción

fue baja en comparación con los cultvios mixtos CM3 y CM4. En este caso el cultivo individual

de LR2, con una mayor velocidad de producción (0.079±0.008 g·L-1·h-1), una mayor

productividad máxima (5.84±0.38 g·L-1·día-1) y también con una producción mayor sería más

recomendable. La Yp/s se vió afectada de manera significativa sólo por la temperatura (Figura

28d), siendo mayor en los tratamientos a 35 °C independientemente del esquema de inoculación,

con el cultivo CM4 como el que tuvo mejor resultado. El porcentaje de consumo final se vio

afectado significativamente sólo por la temperatura (Figura 28e), donde el mejor consumo final

se obtuvo con el cultivo mixto CM4, seguido por el cultivo mixto CM3. Sin embargo, fueron

mucho menores al consumo obtenido con los cultivos individuales (83.48±0.39%. para T1 y

84.09±0.03%) para LR2. La velocidad de consumo se vió únicamente afectada

significativamente por la interacción entre la temperatura y los esquemas de inoculación (Figura

28f), siendo la mejor velocidad la obtenida con CM6. Las tablas de ANOVA para los análisis

estadísticos de CM3, CM4, CM5 y CM6 se encuentran en el Anexo 2.


127

Cuadro 17. Parámetros cinéticos de fermentación para los cultivos mixtos CM3, CM4, CM5 y CM6 de C. glabrata

T1 y LR2 durante diez días de fermentación en mezcla de azúcares a una concentración total de 120 g·L-1 (51%

glucosa, 30% fructosa, 8% galactosa, 7% arabinosa, 2% xilosa y 2% sacarosa).

Parámetro Cultivo

CM3*** CM4**** CM5***** CM6******

% final** 54.28±3.54Aa 55.49±3.40Aa 40.54±0.39Ab 33.44±2.04Ab

rs (g·L-1·h-1) 0.018±0.001Aa 0.013±0.00002Aa 0.013±0.002Aa 0.023±0.002Aa

Etanol (g·L-1) 12.80±0.51Aa 11.97±0.39Aa 5.79±1.22Ab 5.46±0.03Ab

Pmax(g·L-1·día-1) 1.83±0.07Aa 2.00±0.07Ba 1.58±0.33Ab 0.61±0.003Bb

rp (g·L-1·h-1) 0.027±0.003Aa 0.022±0.005Aa 0.066±0.008Aa 0.046±0.034Aa

Yp/s 0.16±0.02Aa 0.26±0.03Aa 0.14±0.06Ab 0.12±0.01Ab

Día max. producción 7 6 3.7 9

A, B: letras mayúsculas diferentes en la misma fila indican diferencia significativa entre esquemas de inoculación

(p<0.05); a, b: letras minúsculas diferentes en la misma fila indican diferencia significativa entre temperaturas de

incubación (p<0.05).

**%final: porcentaje de consumo de azúcares totales al final de la fermentación.

***CM3: cultivo mixto de C. glabrata T1 inoculada al día cero y C. glabrata LR2 inoculada al día tres con 10 x

106 células·mL-1de cada cepa e incubado a 35 °C y 200 rpm

****CM4: cultivo mixto de C. glabrata LR2 inoculada al día cero y C. glabrata T1 inocula al día tres con 10 x

106 células·mL-1de cada cepa e incubado a 35 °C y 200 rpm

*****CM5: cultivo mixto de C. glabrata T1 inoculada al día cero y C. glabrata LR2 inoculada al día tres con 10

x 106 células·mL-1de cada cepa e incubado a 40 °C y 200 rpm

******CM6: cultivo mixto de C. glabrata LR2 inoculada al día cero y C. glabrata T1 inoculada al día tres con 10

x 106 células·mL-1 de cada cepa e incubado a 40 °C y 200 rpm


128

Figura 28. Diagramas de Pareto para a) producción de etanol, b) productividad máxima, c) velocidad de

producción, d) Yp/s, e) porcentaje de consumo de azúcares totales, f) velocidad de consumo de azúcares totales, en

medio con mezcla de azúcares para los cultivos mixtos secuenciales CM3, CM4, CM5 y CM6 de C. glabrata T1 y

LR2.

En general, se observa que las mejores producciones, las mejores productividades y los mejores

porcentajes de consumo de azúcares se obtuvieron tanto con CM3 como por CM4, ambos

incubados a 35 °C. La fermentación se vio afectada negativamente de alguna forma a 40 °C.

Estas diferencias pueden deberse a las diferentes condiciones de fermentación de las levaduras.


129

Estrada-Martínez (2013), en medio YPD observó que ambas cepas tenián sus mejores

condiciones de crecimiento y producían etanol a 35 °C y 200 rpm, aunque con mejores

resultados de producción para T1 en comparación a LR2 (8.90 g·L-1 y Yp/s de 0.47 para T1

contra 7.62 g·L-1 y Yp/s de 0.40 para LR2). En la Figura 27A (CM3) se puede observar que al

inocular a la cepa T1, esta crece durante unas 48 h mientras el etanol también se va produciendo,

en tanto que al inocular a LR2 se observa un crecimiento general durante 16 h, mientras el etanol

se sigue produciendo. En la Figura 27B (CM4) se observa que LR2 crece 24 h mientras produce

etanol. Al inocular a T1, se observa un crecimiento general durante 48 h, mientras el etanol se

sigue produciendo. Aunque no se diferenciaron las cepas, dada la similitud del tiempo de

crecimiento al inocular cualquier cepa a la hora cero con el tiempo de crecimiento general

observado al inocular a la misma cepa a las 72 h, es posible que la mayor parte del crecimiento

y la fermentación observados en este último lapso se deba a la seguda cepa recién inoculada,

complementando la producción de etanol iniciada por la cepa 1. Por otro lado, en los cultivos

CM5 y CM6, incubados ambos a 40 °C y 200 rpm, la producción de etanol se vio muy

desvaforecida. Estrada-Martínez (2013) a dichas condiciones en YPD observó que la cepa LR2

era mejor productora de etanol que T1 (6.78 g·L-1 y Yp/s de 0.37 para T1 en comparación con

9.40 g·L-1 y Yp/s de 0.50 para LR2), mientras T1 tuvo un mejor crecimiento en compración con

LR2 (µmax de 0.51 h-1 y población de 205 x 106 células·mL-1 para T1 en comparación con µmax

de 0.45 h-1 y población de 124 x 106 células·mL-1 para LR2). En CM5 y CM6 es posible que

exista competencia entre T1 y LR2, siendo la cepa T1 más favorecida hacia el crecimiento que

a la producción de etanol y disminuyendo la cantidad de etanol producido al usar parte de la

fuente de carbono hacia biomasa.

Por otro lado, a 40 °C la velocidad de producción de etanol fue mayor que a 35 °C,

independientemente del esquema de inoculación, aunque sin diferencia significativa. Se observa

que CM3 (incubado a 35 °C) tuvo una velocidad de producción de 0.027±0.003 g·L-1·h-1 en

compración con CM5 (incubado a 40 °C), que tuvo una velocidad de producción de 0.066±0.008

g·L-1·h-1, teniendo los dos el mismo esquema de inoculación. Del mismo modo, CM4 (incubado

a 35 °C) tuvo una velocidad de producción de 0.022±0.005 g·L-1·h-1 en comparación con CM6

(incubado a 40 °C), cuya velocidad de producción fue de 0.046±0.034 g·L-1·h-1, teniendo ambos

cultivos el mismo esquema de inoculación. Lin et al. (2012) observaron en un medio con 40


130

g·L-1 de glucosa un aumento en la velocidad específica de producción de etanol en una cepa de

S. cerevisiae a medida que la temperatura aumentada de 10 °C a 40 °C. La velocidad más alta

se obtuvo a 40 °C (aproximadamente 90 g·kg-1·h-1) contra la velocidad obtenida a 30 °C

(aproximadamente 80 g·kg-1·h-1). Por el contrario, la mejor producción de etanol se obtuvo a 30

°C (aproximadamente 18 g·L-1) en comparación con la producción a 40 °C (aproximamente 14

g·L-1). Además, por arriba de 40° C, la producción de etanol se vio perjudicada, teniendo la

menor a 50° C (producción menor a 5 g·L-1 con una velocidad específica de producción cercana

a 5 g·kg-1·h-1). Una mayor temperatura puede aumentar la velocidad de producción y acortar el

tiempo de fermentación, pero también puede ser perjudicial si se superan las temperaturas

óptimas del microorganismo fermentador. Aunque es deseable una fermentación a altas

temperaturas debido a sus beneficios como la reducción de costos de sistemas de enfriamiento,

minimización del riesgo de contaminación por bacterias en fermentación con levaduras y la

compatibilidad de temperatura del microorganismo fermentador con las enzimas hidrolíticas en

sistemas de hidrólisis y fermentación simultánea (Kitichantaropas et al., 2016), temperaturas

por arriba de las óptimas para un determinado microorganismo tienen un efecto negativo sobre

su capacidad fermentativa, afectan la fluidez de la membrana plasmática, las enzimas que

regulan las actividades metabólicas de los microorganismos, así como las proteínas en general

y los ribosomas, desnaturalizarlos e inactivándolos (Lin et al., 2012; Mohd Azhar et al., 2017).

Varios parámetros de fermentación, como la menor cantidad de etanol producida por estos

cultivos, las menores velocidades de producción, las menores productividades y el menor

consumo de sustratos obtenidos con los cultivos con respecto a los cultivos individuales también

pudo estar influenciada por la menor cantidad de inóculo usada. Se sabe que la concentración

de inóculo puede afectar parámetros de producción de etanol. Mientras que en los cultivos

individuales se inocularon 20 x 106 células·mL-1 al mismo tiempo, en los cultivos secuenciales

se inocularon 10 x 106 células·mL-1 al inicio de la fermentación y a las 72 h. Esto pudo hacer

que la producción de etanol, así como la productividad máxima y el porcentaje de consumo de

azúcares sean menores en los cultivos mixtos que en los dos cultivos individuales, así como la

velocidad de producción de los cuatro cultivos mixtos en comparación con la obtenida con el

cultivo de LR2. De Albuquerque-Wanderley, Soares y Gouveia (2014) observaron que la

producción de etanol, la productividad y el consumo de sustrato aumentaron en cepas de S.


131

cerevisiae inoculadas en medio sintético con 100 g·L-1 de glucosa al pasar de una menor

concentración de inóculo a una mayor concentración de inóculo, siendo usadas concentraciones

de inóculo de 0.4 g·L-1, 4.0 g·L-1 y 8.0 g·L-1.


cultivo mixto a partir de un medio sintético con mezcla de carbohidratos

9.5.1. Fermentación de cultivos mixtos con inoculación simultánea en medio sintético con

mezcla de carbohidratos

Se formularon dos cultivos mixtos: CM1, evaluado a 35 °C y 200 rpm, condiciones

fermentativas más adecuadas para de T1; y CM2, evaluada a 40 °C y 200 rpm, condiciones

fermentativas más adecuadas para LR2. A diferencia de los cultivos CM3, CM4, CM5 y CM6,

se decidió formular los cultivos en inoculación simultánea de las cepas LR2 y T1 a la misma

proporción (10 x 106 células·mL-1). En la Figura 29 se muestran los resultados de las cinéticas

de fermentación. En CM1 (Figura 29A) se observó un consumo preferencial por la glucosa y la

fructosa. Asímismo, todos los azúcares empezaron a consumirse desde el inicio de la

fermentación, a diferencia de los cultivos individuales de T1 y LR2, aunque la xilosa tuvo un

retraso entre el primer día y el tercer día desde el inicio de la fermentación, tras lo cual prosiguió

su consumo. La glucosa fue consumida principalmente las primeros dos días, llegando a más

del 80% de consumo, tras lo cual su consumo se asimiló más lentamente hasta llegar a

94.81±0.12% al final de la fermentación. La fructosa se consumió durante seis días, llegando a

más del 80% de su consumo. Al final de la fermentación alcanzó 86.89±0.42% de consumo. La

galactosa se consumió principalmente los dos primeros días con 45% de consumo, tras lo cual

su consumo se volvió más lento, llegando a 53.08±7.14% al final de la fermentación. La

arabinosa se consumió durante los primeros tres días principalmente y se estabilizó. Al final de

la fermentación se consumió el 62.84±1.43%. La xilosa se consumió el primer día hasta el 20%,

tras lo cual se estabilizó hasta el tercer día, cuando más del 85% de la glucosa fue consumida, y

se aceleró hasta el quinto día, llegando a aproximadamente el 50% de asimilación. Su consumo

final fue de 53.35±0.58%. El consumo total de azúcares fue de 86.90±0.58%.


132

El crecimiento celular se produjo desde el inicio de la fermentación, observando una fase

exponencial de dos días (48 h) llegando a un peso seco de 2.18±0.07 g·L-1, tras lo cual se observó

una disminución a los 2.7 días (64 h) y estabilización del crecimiento. Al mismo tiempo, el

etanol se produjo desde el inicio de la fermentación hasta los dos primeros días junto al consumo

principal de la mayoría de los azúcares y a la producción de biomasa. Se estabilizó del día dos

al día tres para continuar la producción hasta el día siete, alcanzando una producción máxima

de 24.32±1.00 g·L-1, tras lo cual se empezó a consumir como fuente de carbono para el

mantenimiento celular, punto en el cual el consumo de los azúcares estaba prácticamente

estabilizado. Este comportamiento fue similar al observado en el cultivo individual de T1. Como

se comentó anteriormente, C. glabrata tiene un estilo de vida de producción de etanol “make-

accumulate-consume”, produciendo y acumulando etanol durante el consumo de carbohidratos,

mientras usa la energía para el crecimiento y funciones celulares, y tras agotarse los azúcares, usan

el etanol como fuente de carbono (Hagman et al., 2013; Zilli et al., 2015).


133

Figura 29. Consumo de carbohidratos y producción de etanol durante diez días de fermentación en mezcla de

azúcares a 120 g·L-1 de concentración total (51% glucosa, 30% fructosa, 8% galactosa, 7% arabinosa, 2% xilosa

and 2% sacarosa) en: A) CM1, cultivo mixto de las cepas C. glabrata T1 y C. glabrata LR2 a 35 °C y 200 rpm,

inoculadas simultáneamente a la misma proporción (10 x 106 células·mL-1cada cepa); B) CM2, cultivo mixto de

las cepas C. glabrata T1 y C. glabrata LR2 a 40 °C y 200 rpm, inoculadas simultáneamente a la misma proporción

(10 x 106 células·mL-1 cada cepa). Glucosa (círculo rojo), fructosa (triángulo verde), galactosa (rombo azul),

arabinosa (cuadrado amarillo), xilosa (círculo rosa), etanol (cuadrado transparente), peso seco (círculo negro).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Peso s

eco (

/10 g

·L-1

), e

tanol (g

·L-1

)

Consum

o d

e c

arb

ohid

rato

s (

g·L

-1)

Tiempo (días)

B

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Peso s

eco (

/10 g

·L-1

), e

tanol (g

·L-1

)

Consum

o d

e c

arb

ohid

rato

s (

g·L

-1)

Tiempo (días)

A


134

En la Figura 29B se muestra el perfil de asimilación de azúcares y producción de etanol del

cultivo mixto CM2. La glucosa se consumió principalmente los primeros dos días hasta un 80%

y posteriormente se asimiló más lentamente hasta 89.47±0.63% de consumo. La fructosa se

consumió casi en paralelo con la glucosa, siguiendo tendencias similares, aunque su consumo

total fue inferior, con 84.06±0.28% de asimilación. La galactosa se consumió durante seis días

y posteriormente tendio a la estabilización. Su consumo final fue de 63.92±1.85% La arabinosa

se consumió principalmente durante los tres primeros días, con más del 50% de la arabinosa y

llegando a un consumo final de 58.21±4.70% al final de la fermentación. La xilosa tuvo un

retraso en su asimilación el primer día (primeras 24 h), tras lo cual se consumió durante los diez

días, llegando a 40.90±0.95% de asimilación. En total se usaron 82.71±0.24% de los azúcares

en el trascurso de la fermentación.

El crecimiento celular se observó desde el inicio de la fermentación, con una fase exponencial

de 1.7 días (40 h), alcanzando una biomasa de 1.83±0.02 g·L-1 y luego una fase estacionaria

hasta el final de la fermentación. Paralelamente se observó la producción del etanol, llegando al

máximo al día 1.7 (40 h), con 11.59±1.21 g·L-1 de alcohol, con aproximamente el 57% de los

azúcares consumidos. Posteriormente se consumió parte del etanol y se continuó el consumo de

los carbohidratos, por lo que las cepas T1 y LR2 posiblemente usaron ambos para el

mantenimiento celular.

En el Cuadro 18 se muestran los porcentajes de asimilación de los azúcares por los cultivos

mixtos y las correspondientes velocidades de asimilación. Al día de máxima producción (día 7),

el cultivo CM1 tuvo, ordenadas de mayor a menor porcentaje, una preferencia por la glucosa, la

fructosa, la arabinosa, la xilosa y la galactosa. El cultivo CM2 tuvo el siguiente orden de

preferecia: glucosa, fructosa, arabinosa, galactosa y xilosa al día de máxima producción (día

1.7). El cultivo CM1 tuvo un mayor porcentaje de asimilación por todos los azúcares que el

cultivo CM2, con diferencias significativas, excepto la galactosa, en la cual el procentaje de

consumo fue sólo ligeramente superior.


135

Cuadro 18. Consumo de carbohidratos y velocidad de consumo de carbohidratos por los cultivos mixtos CM1 y

CM2 de C. glabrata T1 y LR2 durante diez días de fermentación en mezcla de azúcares a una concentración total

de 120 g·L-1 (51% glucosa, 30% fructosa, 8% galactosa, 7% arabinosa, 2% xilosa and 2% sacarosa).

CM1 ** CM2 ***

* % Max % final rs (g·L-1·h-1) %Max % final rs (g·L-1·h-1)

G 94.81±0.12a 94.81±0.12a 0.043±0.006a 67.00±0.09b 89.47±0.63b 0.034±0.002a

F 83.83±0.60a 86.89±0.42a 0.016±0.001a 51.68±0.13b 84.06±0.28b 0.026±0.002b

GA 47.29±1.04a 53.08±7.14a 0.013±0.003a 44.19±0.76a 63.92±1.85a 0.018±0.006a

A 62.12±0.42a 62.84±1.43a 0.018±0.0001a 48.69±0.01b 58.21±4.70a 0.017±0.00001b

X 53.08±0.96a 53.35±0.58a 0.010±0.001a 8.40±0.03b 40.90±0.95b 0.004±0.0003b

a, b: letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas entre cultivos (p<0.05).

*G: glucosa, F: fructosa, GA: galactosa, A: arabinosa, X: xilosa, %Max: porcentaje de consumo al día de máxima

producción de etanol, %final: porcentaje de consumo tras diez días de fermentación.

**CM1: cultivo mixto a 35 °C y 200 rpm de C. glabrata T1 y C. glabrata LR2 inoculadas simultáneamente a la

misma proporción (10 x 106 células·mL-1 cada cepa)

***CM2: cultivo mixto a 40 °C y 200 rpm de C. glabrata T1 y C. glabrata LR2 inoculadas simultáneamente a la

misma proporción (10 x 106 células·mL-1 cada cepa)

Al final de la fermentación, el orden de preferencia de CM1 fue similar al del día de máxima

producción, con consumo similar de xilosa y galactosa. El cultivo CM2 tuvo el siguiente orden

de preferencia al final de la fermentación: glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa y xilosa. En

este punto, el cultivo CM1 tuvo una mayor asimilación por la glucosa, fructosa, xilosa y

arabinosa en comparación con CM2, con diferencias significativas excepto en la arabinosa. El

cultivo CM2 tuvo una mayor asimilación por la galactosa, aunque también sin diferencia

significativa. Destaca también la mayor preferencia de CM1 por la arabinosa en comparación

con el cultivo individual de T1 (Cuadro 10), tanto al día de máxima producción como al final

de la fermentación, siendo que ambos cultivos se incubaron a 35 °C. Esto se explica por la

presencia de la cepa LR2 en el cultivo mixto, la cual mostró una mejor asimilación por la

arabinosa en comparación con la cepa T1 en los cultivos individuales. En el cultivo mixto CM2

la galactosa tuvo una mejor asimilación final que en los dos cultivos individuales. En las

velocidades de asimilación, el cultivo CM1 tuvo una mayor velocidad de consumo por la

glucosa y la xilosa en comparación al cultivo CM2, aunque sin diferencia significativa en la

velocidad de consumo de glucosa, mientras que CM2 tuvo una mayor velocidad de consumo en

la fructosa y la galactosa, aunque sin diferencia siginificativa en esta última.


136

En el Cuadro 19 se muestran los parámetros de producción de etanol de los cultivos CM1 y

CM2. En la Figura 30 se muestran las gráficas de medias correspondientes. El cultivo mixto

CM1 presentó una mayor producción de etanol en comparación con el cultivo CM2. Además,

CM2 tuvo una menor producción incluso que los cultivos individuales de T1 y LR2 (Cuadro 11,

24.28 ±0.78 g·L-1 y 21.36 ±1.4 g·L-1, respectivamente). Sin embargo, tuvo una mayor

produtividad máxima y una mayor velocidad de producción si se compara con CM1 e incluso

con los cultivos individuales de T1 y LR2, llegando a su máxima producción en 40 h (1.7 días).

En comparación con los cultivos individuales, CM1 tuvo una mayor velocidad de producción

que T1 y similar a la de LR2, y una producción similar a la de T1, aunque su productividad

máxima fue la menor entre los cuatro cultivos. Por otro lado, la Yp/s fue mayor para CM1 en

comparación com CM2, aunque sin diferencia siginificativa. Sin embargo, fueron menores a las

obtenidas por los cultivos individuales. Los ANOVA realizados para el análisis estadístico de

los parámetros cinéticos de fermentación de los cultivos CM1 y CM2 se encuentran en el Anexo

2.

Cuadro 19. Parámetros cinéticos de producción de etanol para los cultivos mixtos CM1 y CM2 de C. glabrata T1

y LR2 durante diez días de fermentación en mezcla de azúcares a una concentración total de 120 g·L-1 (51% glucosa,

30% fructosa, 8% galactosa, 7% arabinosa, 2% xilosa y 2% sacarosa).

Parámetro Cultivo

CM1* CM2**

Etanol (g·L-1) 24.32±1.00a 11.59±1.21b

Pmax (g·L-1·día-1) 3.47±0.14a 6.98±0.73b

rp (g·L-1·h-1) 0.082±0.004a 0.128±0.004b

Yp/s 0.29±0.01a 0.23±0.02a

Día max. Producción 7 1.7

a, b: letras diferentes en la misma fila indican diferencias significativas entre cultivos (p<0.05).

*CM1: cultivo mixto a 35 °C y 200 rpm de C. glabrata T1 y C. glabrata LR2 inoculadas simultáneamente a la

misma proporción (10 x 106 células·mL-1 cada una)

**CM2: cultivo mixto a 40 °C y 200 rpm de C. glabrata T1 y C. glabrata LR2 inoculadas simultáneamente a la

misma proporción (10 x 106 células·mL-1 cada una).


137

Figura 30. Gráfica de medias para: a) etanol producido, b) productividad máxima, c) velocidad de producción d)

Yp/s en medio sintético con mezcla de carbohidratos para los cultivos mixtos CM1 y CM2 de las cepas de de C.

glabrata T1 y C. glabrata LR2 inoculadas simultáneamente a la misma proporción.

El comportamiento de producción de etanol refleja la combinación del metabolismo de ambas

cepas. El cultivo CM1 tuvo una velocidad de producción de etanol similar a la de LR2, aunque

su productividad y su producción fueron más comparables a las de T1, llegando a su máxima

producción al día 7, similar al cultivo de T1 (día 6). Si se observan los parámetros de crecimiento

de las cepas individuales (Cuadro 9), T1 a sus condiciones más adecuadas determinadas

previamente en el trabajo de Estrada-Martínez (2013) (35 °C y 200 rpm) tuvo una mayor

velocidad de crecimiento y un menor tiempo de duplicación en comparación a LR2 a sus

mejores condiciones (40 °C y 200 rpm) (µmax: 0.093 h-1 contra 0.076 h-1, Td: 7.50 h contra 9.12


138

h para T1 y LR2, respectivamente). Considerando que CM1 fue incubado a las condiciones más

adecuadas de crecimiento y de fermentación de T1, probablemente la fermentación por esta cepa

haya sido favorecida sobre la de LR2, dominando a lo largo de la cinética, por lo que el perfil

de producción fue similar al de T1. La velocidad de producción de etanol similar a la de LR2

puede ser consecuencia de una cofermentación de ambas cepas, resultando en una producción

más rápida de etanol que se observó al inicio de la fermentación. De manera similar, en el cultivo

CM2, si se considera que la cepa T1 tiene una mayor velocidad de crecimiento y menor tiempo

de duplicación a sus mejores condiciones en comparación con LR2 a sus mejores condiciones,

y que dicha ventaja de T1 en crecimiento podría también encontrarse a 40 °C y 200 rpm,

posiblemente se haya establecido una competencia entre la producción de etanol de LR2 y el

crecimiento de T1 en el cultivo mixto, en consecuencia, se produjo menos etanol que en el

cultivo individual de LR2, aunque el perfil de producción del cultivo CM2 se asemeja al de LR2

en productividad máxima y en velocidad de producción, que le permitió alcanzar el máximo a

los pocos días.

La producción de etanol de CM1 fue similar a la reportada por Hickert et al. (2013) en un cultivo

individual de C. shehatae (23 g·L-1) en medio sintético con glucosa (20 g·L-1), xilosa (20 g·L-1)

y arabinosa (10 g·L-1) y superiores a los obtenidos en un cultivo mixto de C. shehatae y S.

cerevisiae (13 g·L-1), mientras que la producción de CM2 fue comparable a la de dicho cultivo

mixto, aunque la Yp/s de CM1 y CM2 fue menor a la obtenida por dichos autores (0.40 para en

cultivo de C. shehatae y 0.42 para el cultivo mixto de C. shehatae y S. cerevisiae). La

producción y la Yp/s de CM1 y CM2 también fue inferior a la obtenida por cultivos mixtos de

P. stipitis y K. marxianus (31.87 g·L-1 y 0.36) y de P. stipitis y S. cerevisiae (29.45 g·L-1 y 0.41)

obtenidas por Rouhollah et al. (2007) en una mezcla de glucosa (30 g·L-1), xilosa (30 g·L-1),

manosa (12 g·L-1) y galactosa (8 g·L-1), aunque la producción de CM1 fue superior a la obtenida

por un cultivo de S. cerevisiae (14.25 g·L-1) en el mismo trabajo, mientras que la producción de

CM2 fue comparable a la obtenida por éste cultivo.

Además, en general los resultados de producción de alcohol, de productividad máxima, de

velocidad de producción, de Yp/s y hasta el consumo total de azúcares fue mayor a los obtenidos

en los cultivos con inoculación secuencial (Cuadro 17). Con respecto a este punto, también es


139

notorio que, pese a que el cultivo CM2 tuvo una producción de etanol similar a CM3 y CM4,

esta cantidad de etanol la haya producido en un menor tiempo (40 h contra los seis y siete días

de CM4 y CM3, respectivamente) y con una mayor velocidad, razón por la cual su productividad

máxima fue mucho mayor. El cultivo CM1 tuvo una mayor producción, mayor velocidad de

producción y mayor productividad máxima en comparación con CM3 y CM4, pese a que el

tiempo para alcanzar la máxima producción fue similar y a que fue incubado a 35 °C como CM3

y CM4. Esto podría indicar una cofermentación de T1 y LR2 cuando se inoculan

simultáneamente, al menos al inicio de la fermentación, a pesar de que con el tiempo llegara a

dominar una sobre la otra.

A diferencia de este trabajo, varios otros autores han reportado la mayor eficiencia de cultivos

mixtos secuenciales en la fermentación de carbohidratos para la producción de etanol. Guan et

al. (2013) evaluó cultivos mixtos de S. cerevisiae o Brettanomyces bruxellensis con C. shehatae

en un medio con 50 g·L-1 de glucosa, 40 g·L-1 de xilosa y 50 g·L-1 de celobiosa en un cultivo

mixto secuencial, primero inoculando a C. shehatae para el consumo de xilosa y glucosa,

produciendo 33.8 g·L-1, y posteriormente inocularon a S. cerevisiae para el consumo de la

glucosa proveniente de celobiosa hidrolizada, o B. bruxellensis, para la fermentación de la

celobiosa. Los mejores resultados los obtuvieron con el segundo cultivo mixto, llegando a

producir aproximadamente 58 g·L-1 de etanol. Gutiérrez-Rivera et al. (2015) evaluaron la

fermentación de hidrolizados de bagazo de caña de azúcar usando cultivos mixtos de S. stipitis

y S. cerevisiae. Primeramente, evauaron la inoculación simultánea de las cepas a diferentes

proporciones entre ellas, pero las producciones de etanol fueron similares en todos los cultivos

mixtos (29.72 g·L-1 en promedio) y especularon que esto pudo deberse a una competencia entre

las cepas que limita la producción de etanol, por lo que probaron un cultivo mixto secuencial,

primero con S. stipitis, que es menos tolerante al etanol en comparación con S. cerevisiae, y es

capaz de fermentar la xilosa, y 42 h después de iniciar la fermentación inocularon a S. cerevisiae

para continuar el consumo hexosas y la producción de etanol, logrando producir 53.80 g·L-1 del

alcohol al final de la fermentación. Si se considerara lo anterior, una inoculación secuencial de

las cepas T1 y LR2 podría mejorar los resultados de producción de etanol. Sin embargo, los

resultados fueron opuestos, siendo los cultivos con inoculación simultánea los mejores, pese a

existir una aparente competencia entre las cepas T1 y LR2. Además, existe la posibilidad de que


140

las cepas T1 y LR2 llegaran a su máxima toleracia al etanol a aproximadamente 24 g·L-1, razón

por la que la producción no aumentara más allá de esa candidad en los cultivos mixtos.

Buragohain et al. (2013) encontraron en varias cepas de C. glabrata en YPD con etanol una

tolerancia máxima en los medios que tuvieron entre 4% y 8% de etanol. Si se considera la

densidad del etanol de 0.789 g·mL-1, esto equivaldría a entre 31.56 g·L-1 a 63.12 g·L-1 de

tolerancia máxima al etanol en C. glabrata. El valor de 24.32±1.00 g·L-1 alcanzado por CM1 se

encuentra cercado al rango mínimo indicado, por lo que pudiera ser que las cepas T1 y LR2

estén cerca de su límite de tolerancia al etanol, lo que sería otro factor que limitaría su

producción.

Con base en los resultados anteriores, los cultivos secuenciales planteados fueron menos

eficientes para la producción de etanol con respecto a los cultivos individuales o los cultivos

simultáneos CM1 y CM2. Entre éstos últimos, en términos de equilibrio en producción,

velocidad de producción y productividad máxima de etanol, el cultivo individual de LR2 tuvo

los mejores resultados. Sin embargo, su consumo de azúcares en el punto de su máxima

producción de etanol fue menor en comparación a la del cultivo de T1, excepto por la arabinosa,

donde mostró un consumo superior. Se propone como opción para completar el consumo de

azúcares y continuar la producción de etanol inocular esta cepa en cultivo mixto con alguna otra

especie, especialmente una altamente productora de etanol como S. cerevisiae.

CONCLUSIONES

141

10. CONCLUSIONES

En cultivos individuales, la cepa LR2, incubada a 40 °C y 200 rpm, tuvo mayor crecimiento

tanto en población celular 248 ±12.37 x 106 células·mL-1, como en biomasa (1.92±0.04 g·L-1).

Por otro lado, la cepa T1, incubada a 35 °C y 200 rpm, tuvo mayor velocidad de crecimiento

(0.093±0.007 h-1) y menor tiempo de duplicación (7.50 ± 0.57 h). Sin embargo, no hubo

diferencias significativas entre cepas. Las cepas de C. glabrata T1 y LR2 fueron capaces de

consumir glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa y xilosa en mezcla en proporciones similares a

las reportadas en residuos de cítricos, siendo la glucosa y la fructosa los azúcares preferidos. Sin

embargo, la cepa T1 presentó mayor consumo de glucosa, fructosa, galactosa y xilosa que la

cepa LR2 al día de máxima producción de etanol. La cepa LR2 destacó por su consumo de

arabinosa, tanto en el día de máxima producción, como al final de la fermentación, alcanzando

60.00±0.45% de consumo de arabinosa contra el 53.71±0.40% de consumo del azúcar por T1.

La producción de etanol fue similar entre las cepas T1 y LR2, siendo de 24.28 ±0.78 g·L-1 y

21.36 ±1.41 g·L-1, respectivamente. Sin embargo, LR2 produjo el alcohol más rápidamente, por

lo que tuvo una mayor productividad máxima (5.84 ± 0.38 g·L-1·día-1) y una mayor velocidad

de producción de etanol (0.079 ± 0.008 g·L-1·h-1).

El cultivo mixto con inoculación simultánea incubado a 35 °C (CM1) presentó un mayor

consumo de glucosa, fructosa, arabinosa y xilosa que el cultivo mixto con inoculación

simultánea incubado a 40 ºC (CM2) al día de máxima producción. El cultivo mixto CM1 mostró

una producción de etanol (24.32±1.00 g·L-1) similar a la del cultivo individual T1. La

productividad de CM1 (3.47±0.14 g·L-1·día-1) fue ligeramente inferior a la productividad de T1

(4.05±0.13 g·L-1·día-1). El cultivo CM1 tuvo una velocidad de producción de etanol

(0.082±0.004 g·L-1·h-1) similar a la del cultivo individual de LR2 y superior a la del cultivo de

T1 (0.053±0.001 g·L-1·h-1). El cultivo CM1 también tuvo un consumo mayor de arabinosa con

respecto al cultivo individual de T1, y ligeramente superior al del cultivo de LR2, al día de

máxima producción. El cultivo CM2 presentó mayor productividad (6.98±0.73 g·L-1·día-1) que

los cultivos CM1 y T1, y mayor velocidad de producción de etanol (0.128±0.004 g·L-1·h-1) en

comparación con los cultivos CM1, T1 y LR2. Sin embargo, tuvo la menor producción de etanol

(11.59±1.21 g·L-1) de entre los cuatro cultivos. El cultivo con mejor equilibrio de producción

CONCLUSIONES

142

de etanol, productividad máxima y velocidad de producción fue el cultivo individual de LR2.

Sin embargo, su aprovechamiento de carbohidratos al día de máxima producción fue menor con

respecto al cultivo individual de T1, excepto por la arabinosa, en la que presentó una asimilación

superior. Por lo tanto, la cepa LR2 podría ser usada junto con otro microorganismo en cultivo

mixto para el aprovechamiento de los azúcares remanentes y aumentar la producción de etanol.

Los cultivos con inoculación secuencial fueron menos eficientes en la fermentación de mezclas

de azúcares. Los más destacables fueron los incubados a 35 °C y 200 rpm, CM3 y CM4, con

una producción de etanol similar (12.80±0.51 g·L-1 y 11.97±0.39 g·L-1, respectivamente),

similar a la obtenida por CM2, pero sus productividades fueron menores (1.83±0.07 g·L-1·día-1

y 2.00±0.07 g·L-1·día-1, respectivamente). También tuvieron un bajo consumo de azúcares

totales, que fue de 54.28±3.54% y 35.16±0.73%. La temperatura de 40 °C no benefició a los

cultivos mixtos secuenciales incubados a ésta temperatura (CM5 y CM6), independientemente

del esquema de inoculación, presentando menor producción de etanol, Yp/s y porcentaje de

consumo con respecto a los tratamientos a 35 ºC.

Se obtuvieron amplificaciones del gene XK con tres de las parejas de oligonucleótidos F1-

XK/R1-XK, F1-XK/R2-XK y F1-XK/R3XK. La identidad entre las secuencias de T1 y LR2

amplificadas por una misma pareja de oligonucleótidos fue de 100%. Por lo tanto, no fue posible

diferenciar a las cepas T1 y LR2 con base a las diferencias del fragmento de gene amplificado.

Las parejas F1-XK/R1-XK y la pareja F1-XK/R3-XK tuvieron 100% de identidad y

posiblemente representen un alelo del gene XK. El grupo de secuencias amplificadas con la

pareja de oligonucleótidos F1-XK/R2-XK tuvo una identidad del 98.94% con respecto a los

otros dos grupos y posiblemente representen otro alelo del gene XK. Las secuencias mostraron

alta identidad (98-99%) con secuencias del gene XK en C. glabrata. Además, el análisis

filogenético demostró que las secuencias amplificadas con el mismo juego de oligonucleótidos

fueron idénticas. Las secuencias de los grupos F1-XK/R1-XK y F1-XK/R3-XK, que representan

uno de los posibles alelos del gene XK, se agruparon en la misma rama. El otro alelo, formado

por las secuencias del grupo F1-XK/R2-XK, se agrupó en la rama más cercana. Todas las

secuencias estuvieron cercanas a secuencias de XK de C. glabrata. La zona amplificada

traducida a sus secuencias de aminoácidos presentó algunas regiones y motivos característicos

CONCLUSIONES

143

de las carbohidrato-cinasas, como el motivo “Phospate 2”, residuos de aminoácidos de unión a

xilulosa, a Mg2+ y ATP, así como un residuo catalítico de aspartato. Además, se encontró un

elemento regulatorio GCR1 de enzimas glucolíticas y relacionadas con la gluconeogénesis a una

distancia de 884 a -880 y a una distancia de -301 a -297 río arriba de una secuencia del gene XK

de C. glabrata (CR380953) encontrada en GenBank. La técnica de REP-PCR no fue útil para

diferenciar a las cepas T1 y LR2, por lo menos en las condiciones evaluadas y con los oligos

usados debido a las limitaciones de la técnica.

PERSPECTIVAS/RECOMENDACIONES

144

11. PERSPECTIVAS/RECOMENDACIONES

Para diferenciar a las cepas T1 y LR2 se recomienda realizar una secuenciación de los genomas

de T1 y LR2 para encontrar regiones polimórficas que puedan usarse como marcadores

moleculares para diferenciarlas por alguna técnica de biología molecular.

Ya determinado el marcador molecular a utilizar, estudiar la dinámica poblacional de los

microorganismos en los cultivos mixtos usados en este trabajo u en otras formulaciones.

Realizar el análisis de los azúcares individuales de los cultivos mixtos CM3, CM4, CM5 y CM6

por UPLC acoplado a MS u otra técnica adecuada.

Probar las cepas T1 y LR2 con otras combinaciones de microorganismos en cultivos mixtos.

Probar el uso de las cepas T1 y LR2 de manera individual y en cultivo mixto en sustratos como

hidrolizados o harinas de residuos cítricos.

Usar los fragmentos del gene XK amplificados para el estudio de la expresión de XK en las

cepas T1 y LR2 durante la fermentación de xilosa. Asimismo, estudiar la expresión de otros

genes de las rutas metabólicas de carbohidratos.

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ANEXO: Técnicas analíticas

163

13. ANEXOS

13.1. Técnicas analíticas (Anexo 1)

13.1.1. Método del ácido dinitrosalicílico (DNS) para azúcares redudctores libres

Esta determinación se utilizó para la determinación de los azúcares reductores libres. El método

usado es una modificación del método de Miller (1959).

a) Reactivos utilizados

- 10 g·L-1 Hidróxido de sodio

- 10 g·L-1 Ácido 3, 5-dinitrosalicílico (DNS)

- 200 g·L-1 Tartrato de sodio y potasio

- 2 g·L-1 Fenol

- 0.5 g·L-1 Metabisulfito de sodio

b) Preparación de la solución de DNS

Disolver los reactivos en agua destilada, dejando al final el DNS, el cual se debe ir adicionando

de poco en poco hasta su completa disolución. Aforar a un litro con agua destilada.

c) Procedimiento

Adicionar en tubos de ensayo 0.5 mL de muestra, añadirle 1.5 mL de la solución de DNS y

agitar. Calentar posteriormente en baño de agua a punto de ebullición durante 15 min y enfriar

a temperatura ambiente. Añadir 8 mL de agua destilada, agitar y leer la absorbancia a 550nm.

Realizar el mismo procedimiento para el blanco (agua destilada).

d) Curva de calibración

Se prepara una solución patrón 1 g·L-1 de glucosa anhidra para preparar estándares de 0.1 g·L-1

a 1 g·L-1. Se realiza el procedimiento de reacción de DNS como se describió anteriormente. Se

grafican las absorbancias contra las concentraciones de glucosa y se realiza un análisis de

regresión lineal para obtener la ecuación de la curva.


164

y = 1.1627x + 0.0261R² = 0.9975

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Concentr

ació

n d

e g

lucosa (

g·L

-1)

Absorbancia 550nm

Azúcares reductores libres


165

13.1.2. Método de determinación de etanol con dicromato

La técnica utilizada para la determinación de etanol se basa en la técnica de dicromato de potasio

(Bohringer y Jacob, 1964).


- Dicromato de potasio (33.768 g)

- Ácido sulfúrico concentrado (323 mL)

- Agua destilada

b) Preparación del reactivo

Se diluye el ácido sulfúrico en aproximadamente 400 mL de agua destilada y se deja enfriar

antes de añadir el dicromato de potasio diluído en aproximadamente 200 mL de agua destilada.

Homogeneizar y aforar a un litro con agua destilada.

c) Procedimiento

A 1 mL de muestra destilada se le agregan 2 mL de la solución de dicromato. Se

homogeneiza por agitación y se deja reposar por diez minutos. Posteriormente adicionar 5

mL de agua destilada. Homogeneizar por agitación y leer la absorbancia a 585nm. Realizar

el mismo procedimiento para el blanco (agua destilada).

d) Curva de calibración

Se prepara una solución patrón de etanol de 20 g·L-1, tomando en cuenta la densidad y el

porcentaje de pureza del reactivo de etanol a utilizar. Se preparan estándares de concentraciones

de 2 g·L-1 a 20 g·L-1 a partir de la solución madre y se somenten al procedimiento del dicromato

de potasio. Se grafican los resultados de absorbancia contra concentración de etanol y se realiza

un análisis de regresión lineal para obtener la ecuación de la curva.


166

e) Preparación de la muestra

A 5 mL de muestra se le agregan 5 mL de agua destilada. Se destila la mezcla en un

microdestilador de vidrio hasta tener 5 mL de destilado. Guardar los destilados en frascos ámbar

y almacenar a -20 °C hasta su uso.

y = 18.548x + 0.1018R² = 0.9979

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Co

ncen

tració

n d

e e

tan

ol

(g·L

-1)

Absorbancia 585nm

Etanol


167

13.1.3. Método fenol-sulfúrico para la determinación de azúcares totales

La técnica usada para la determinación de azúcares totales se basa en la técnica propuesta por

Dubois et al. (1956).


- Ácidos sulfúrico concentrado

- Fenol 5% (p/v)

b) Procedimiento

A 1 mL de muestra se le adiciona 1 mL de fenol 5% y enseguida 5 mL de ácido sulfúrico

concentrado con el pipetor de forma brusca para conseguir el efecto de hidrólisis.

Posteriormente dejar reposar 5 min a temperatura ambiente, agitar y poner en baño de hielo

durante 10 min. Realizar el mismo procedimiento para el blanco (agua destilada). Determinar

la absorbancia a 490nm.

c) Curva de calibración

Se prepara una solución patrón de sacarosa de 0.1 g·L-1. Se preparar soluciones estándares de

de 0.01 g·L-1 a 0.1 g·L-1 de sacarosa. Realzar el procedimiento a los estándares y realizar un

análisis de regresión lineal de abrobancia contra concentración de sacarosa para obtener la

ecuación de la curva.

y = 0.1318x - 0.0016R² = 0.9966

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.1

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8Co

ncen

tració

n d

e s

acaro

sa (

g·L

-1)

Absorbancia 490nm

Azúcares totales

ANEXO: Análisis estadístico

168

13.2. Análisis estadístico (Anexo 2)

13.2.1. Crecimiento y parámetros de crecimiento de los cultivos individuales de C. glabrata

T1 y LR2

Tabla ANOVA para Población celular por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 1122.25 1 1122.25 6.52 0.1253

Intra grupos 344.5 2 172.25

Total (Corr.) 1466.75 3

Tabla ANOVA para Peso seco por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 0.0064 1 0.0064 0.66 0.5010

Intra grupos 0.0193 2 0.00965

Total (Corr.) 0.0257 3


169

Tabla ANOVA para Yx/s por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 0.00000625 1 0.00000625 0.86 0.4512

Intra grupos 0.0000145 2 0.00000725

Total (Corr.) 0.00002075 3

Tabla ANOVA para Velocidad de crecimiento por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 0.00021025 1 0.00021025 9.45 0.0915

Intra grupos 0.0000445 2 0.00002225

Total (Corr.) 0.00025475 3

Tabla ANOVA para Tiempo de duplicación por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 2.64063 1 2.64063 7.19 0.1154

Intra grupos 0.73405 2 0.367025

Total (Corr.) 3.37468 3


170


individuales

Tabla ANOVA para %Glucosa en el día de máxima producción por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 91.0116 1 91.0116 1574.60 0.0006

Intra grupos 0.1156 2 0.0578

Total (Corr.) 91.1272 3

Tabla ANOVA para %Fructosa en el día de máxima producción por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 397.006 1 397.006 4173.52 0.0002

Intra grupos 0.19025 2 0.095125

Total (Corr.) 397.196 3

Tabla ANOVA para %Galactosa en el día de máxima producción por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

Entre grupos 66.7489 1 66.7489 88.76 0.0111

Intra grupos 1.5041 2 0.75205



171

Tabla ANOVA para %Arabinosa en el día de máxima producción por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 39.5012 1 39.5012 222.39 0.0045

Intra grupos 0.35525 2 0.177625

Total (Corr.) 39.8565 3

Tabla ANOVA para %Xilosa en el día de máxima producción por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 203.348 1 203.348 230.96 0.0043

Intra grupos 1.7609 2 0.88045

Total (Corr.) 205.109 3

Tabla ANOVA para %Glucosa final de fermentación por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 0.105625 1 0.105625 0.41 0.5885

Intra grupos 0.51805 2 0.259025

Total (Corr.) 0.623675 3


172

Tabla ANOVA para %Fructosa final de fermentación por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 0.0196 1 0.0196 0.14 0.7470

Intra grupos 0.2866 2 0.1433


Tabla ANOVA para %Galactosa final de fermentación por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 15.8802 1 15.8802 30.60 0.0312

Intra grupos 1.03805 2 0.519025

Total (Corr.) 16.9183 3

Tabla ANOVA para %Arabinosa final de fermentación por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 39.5012 1 39.5012 222.39 0.0045

Intra grupos 0.35525 2 0.177625

Total (Corr.) 39.8565 3


173

Tabla ANOVA para %Xilosa final de fermentación por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 6.6049 1 6.6049 4.24 0.1757

Intra grupos 3.1149 2 1.55745


Tabla ANOVA para Velocidad de consumo de glucosa por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 0 1 0 0.00 1.0000

Intra grupos 0.000016 2 0.000008

Total (Corr.) 0.000016 3

Tabla ANOVA para Velocidad de consumo de fructosa por Cepa

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

Entre grupos 0.0000207025 1 0.0000207025 637.00 0.0016

Intra grupos 6.5E-8 2 3.25E-8

Total (Corr.) 0.0000207675 3


174

Tabla ANOVA para Velocidad de consumo galactosa por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 0 1 0 0.00 1.0000

Intra grupos 0.000017 2 0.0000085

Total (Corr.) 0.000017 3

Tabla ANOVA para Velocidad de consumo arabinosa por Cepa


Entre grupos 1.225E-7 1 1.225E-7 0.00 0.9506

Intra grupos 0.000050125 2 0.0000250625

Total (Corr.) 0.0000502475 3

Tabla ANOVA para Velocidad de consumo xilosa por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 1.E-8 1 1.E-8 0.44 0.5744


Total (Corr.) 5.52E-8 3


175

Tabla ANOVA para Etanol por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 8.55562 1 8.55562 6.62 0.1237

Intra grupos 2.58505 2 1.29253

Total (Corr.) 11.1407 3

Tabla ANOVA para Productividad máxima por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 3.18623 1 3.18623 38.06 0.0253

Intra grupos 0.16745 2 0.083725

Total (Corr.) 3.35368 3

Tabla ANOVA para Velocidad de producción etanol por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 0.00070225 1 0.00070225 19.37 0.0479

Intra grupos 0.0000725 2 0.00003625

Total (Corr.) 0.00077475 3


176

Tabla ANOVA para Yp/s por Cepa

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 0.000025 1 0.000025 0.04 0.8600

Intra grupos 0.00125 2 0.000625

Total (Corr.) 0.001275 3

13.2.3. Perfiles de asimilación de carbohidratos y parámetros de fermentación de los

cultivos mixtos CM1 y CM2

Tabla ANOVA para %Glucosa máxima producción por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 772.84 1 772.84 67496.94 0.0000

Intra grupos 0.0229 2 0.01145

Total (Corr.) 772.863 3

Tabla ANOVA para %Fructosa máxima producción por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 1033.62 1 1033.62 5602.29 0.0002

Intra grupos 0.369 2 0.1845

Total (Corr.) 1033.99 3


177

Tabla ANOVA para %Galactosa máxima producción por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 9.64103 1 9.64103 11.56 0.0767

Intra grupos 1.66765 2 0.833825

Total (Corr.) 11.3087 3

Tabla ANOVA para %Arabinosa máxima producción por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 180.499 1 180.499 2071.73 0.0005

Intra grupos 0.17425 2 0.087125

Total (Corr.) 180.673 3

Tabla ANOVA para %Xilosa máxima producción por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 1996.3 1 1996.3 4375.46 0.0002

Intra grupos 0.9125 2 0.45625

Total (Corr.) 1997.21 3


178

Tabla ANOVA para %Glucosa final de fermentación por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 28.4089 1 28.4089 138.41 0.0071

Intra grupos 0.4105 2 0.20525

Total (Corr.) 28.8194 3

Tabla ANOVA para %Fructosa final de fermentación por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 8.03723 1 8.03723 62.78 0.0156

Intra grupos 0.25605 2 0.128025

Total (Corr.) 8.29328 3

Tabla ANOVA para %Galactosa final de fermentación por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 117.506 1 117.506 4.32 0.1733

Intra grupos 54.4372 2 27.2186

Total (Corr.) 171.943 3


179

Tabla ANOVA para %Arabinosa final de fermentación por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 21.4832 1 21.4832 1.78 0.3139

Intra grupos 24.1514 2 12.0757

Total (Corr.) 45.6347 3

Tabla ANOVA para %Xilosa final de fermentación por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 155.127 1 155.127 248.71 0.0040

Intra grupos 1.24745 2 0.623725

Total (Corr.) 156.374 3

Tabla ANOVA para Velocidad de consumo glucosa por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 0.00009025 1 0.00009025 4.25 0.1755

Intra grupos 0.0000425 2 0.00002125

Total (Corr.) 0.00013275 3


180

Tabla ANOVA para Velocidad de consumo fructosa por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 0.000081 1 0.000081 32.40 0.0295

Intra grupos 0.000005 2 0.0000025

Total (Corr.) 0.000086 3

Tabla ANOVA para Velocidad de consumo galactosa por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 0.000025 1 0.000025 0.94 0.4339

Intra grupos 0.000053 2 0.0000265

Total (Corr.) 0.000078 3

Tabla ANOVA para Velocidad de consumo arabinosa por Cultivo


Entre grupos 0.00000113423 1 0.00000113423 449.20 0.0022


Total (Corr.) 0.00000113928 3


181

Tabla ANOVA para Velocidad de consumo xilosa por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 0.000025 1 0.000025 86.21 0.0114


Total (Corr.) 0.00002558 3

Tabla ANOVA para Etanol por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 161.926 1 161.926 131.10 0.0075

Intra grupos 2.47025 2 1.23513

Total (Corr.) 164.396 3

Tabla ANOVA para Productividad máxima por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 12.3201 1 12.3201 44.60 0.0217

Intra grupos 0.5525 2 0.27625

Total (Corr.) 12.8726 3


182

Tabla ANOVA para Velocidad de producción etanol por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 0.002116 1 0.002116 169.28 0.0059

Intra grupos 0.000025 2 0.0000125

Total (Corr.) 0.002141 3

Tabla ANOVA para Yp/s por Cultivo

Fuente Suma de

Cuadrados


Entre grupos 0.004225 1 0.004225 13.00 0.0691

Intra grupos 0.00065 2 0.000325

Total (Corr.) 0.004875 3


183

13.2.4. Asimilación de carbohidratos totales y parámetros de fermentación de los cultivos

mixtos CM3, CM4, CM5 y CM6

Análisis de Varianza para % de consumo máxima producción - Suma de Cuadrados Tipo

III

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

EFECTOS PRINCIPALES

A:Temperatura 320.551 1 320.551 32.42 0.0047

B:Esquema de inoculación 162.0 1 162.0 16.38 0.0155

INTERACCIONES

AB 204.829 1 204.829 20.72 0.0104

RESIDUOS 39.5514 4 9.88785

TOTAL (CORREGIDO) 726.931 7

Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual


184

Análisis de Varianza para % de consumo final - Suma de Cuadrados Tipo III

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

EFECTOS PRINCIPALES

A:Temperatura 640.283 1 640.283 90.30 0.0007


INTERACCIONES

AB 34.4865 1 34.4865 4.86 0.0921

RESIDUOS 28.361 4 7.09026



Análisis de Varianza para Velocidad de consumo azúcares - Suma de Cuadrados Tipo III


EFECTOS PRINCIPALES

A:Temperatura 0.0000119561 1 0.0000119561 5.63 0.0767


INTERACCIONES

AB 0.000110856 1 0.000110856 52.16 0.0019

RESIDUOS 0.0000085008 4 0.0000021252




185

Análisis de Varianza para Producción de etanol - Suma de Cuadrados Tipo III

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

EFECTOS PRINCIPALES

A:Temperatura 91.4628 1 91.4628 191.22 0.0002


INTERACCIONES

AB 0.127513 1 0.127513 0.27 0.6329

RESIDUOS 1.91325 4 0.478312



Análisis de Varianza para Productividad máxima - Suma de Cuadrados Tipo III

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

EFECTOS PRINCIPALES

A:Temperatura 1.33661 1 1.33661 44.72 0.0026


INTERACCIONES

AB 0.655513 1 0.655513 21.93 0.0094

RESIDUOS 0.11955 4 0.0298875




186

Análisis de Varianza para Velocidad de producción - Suma de Cuadrados Tipo III

Fuente Suma de

Cuadrados


EFECTOS PRINCIPALES

A:Temperatura 0.002048 1 0.002048 6.54 0.0628


INTERACCIONES

AB 0.0001125 1 0.0001125 0.36 0.5813

RESIDUOS 0.001253 4 0.00031325



Análisis de Varianza para Yp/s - Suma de Cuadrados Tipo III

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

EFECTOS PRINCIPALES

A:Esquema de inoculación 0.0032 1 0.0032 2.51 0.1883

B:Temperatura 0.01125 1 0.01125 8.82 0.0411

INTERACCIONES

AB 0.0072 1 0.0072 5.65 0.0763

RESIDUOS 0.0051 4 0.001275



ANEXO: Alineamiento múltiple para el diseño de oligonucleótidos

187

13.3. Alineamiento múltiple de secuencias para el diseño de oligonucleótidos para la

amplificación de un fragmento del gene XK (Anexo 3)


188


189


190


191


192

Figura A.1. Alineamiento múltiple de secuencias nucleotídicas de XK de varias cepas del género Candida para el

diseño de oligonucleótidos para la amplificación de un fragmento de un gen de XK en las cepas de C. glabrata T1

y LR2. El alineamiento se realizó usando el programa CLC Sequence Viewer versión 7.8.1. Barra gris: región

usada para el diseño de los oligonucleótidos F1-XK y F2-XK, barra naranja: región usada para el diseño de los

oligonucleótidos R1-XK y R2-XK, barra azul: región usada para el diseño de los oligonucleótidos R3-XK y R4-

XK. CR380953.1 (C. glabrata), CH672349.1 (C. albicans W0-1), AJIY01000021.1 (C. albicans P57072),

JSXP01000019.1 (C. albicans P60002), NW_139617.1 (C. albicans SC5314), FM992691.1 (C. dubliniensis),

GG692399.1 (C. tropicalis), DQ087275.1 (Candida sp.), HE681720.1 (C. orthopsilosis), HE605207.1 (C.

parapsilosis), HE792815.1 (C. sonorensis), GL996515.1 (C. tenuis).

ANEXO: Secuencias amplificadas del gene XK

193

13.4. Secuencias amplificadas del gene XK en las cepas de C. glabrata LR2 y T1 (Anexo 4)

>T1(F1R1)

GATACGATGATTCTTTGTTGGATGTGATTTCAGGCAAATTTGGTAAGGAAGACCTA

CTGAAGAAGCTAAGTGGTTCTGTTACAAAATGTAACTCTCCACAATTGATGGGAA

ACATTGCTAATTATTTTGTATCCAAATATGGATTCGATAGCGAATGTGCCATTTAT

CCATTTACTGGTGATAATTTGGCAACTAT

>LR2(F1R1)




CCATTTACTGGTGATAATTTGGCAACTAT

>T1(F1R2)

ACGATGATTCTTTGTTGGATGTGATTTCAGGCAAATTTGGTAAGGAAGACCTACTG

AAGAAGCTAAGTGGTTCTGTTACAAAATGTAACTCTCCACAATTGATGGGAAACA

TTGCTAATTATTTTGTATCCAAATATGGATTCGATAGCGAATGTGCCATTTATCCA

TTTACTGGAGACAATTTGGCAAC

>LR2(F1R2)

ACGATGATTCTTTGTTGGATGTGATTTCAGGCAAATTTGGTAAGGAAGACCTACTG

AAGAAGCTAAGTGGTTCTGTTACAAAATGTAACTCTCCACAATTGATGGGAAACA

TTGCTAATTATTTTGTATCCAAATATGGATTCGATAGCGAATGTGCCATTTATCCA

TTTACTGGAGACAATTTGGCAAC

ANEXO: Secuencias amplificadas del gene XK

194

>T1(F1R3)




CCATTTACTGGTGATAATTTGGCAACTATTTGTTCTCTACCGCTAGAAAAGAATGA

TATCTTGGTGTCTTTAGGGACAAGCACTACTATTCTAATGGTTACTGACCAGTATC

ATCCCTCTCCCAATTATCATCTATTTACCCACCCAGCAATTGCCAATTGTTACATG

GCAATGATATGCTATTGCAAT

>LR2(F1R3)




CCATTTACTGGTGATAATTTGGCAACTATTTGTTCTCTACCGCTAGAAAAGAATGA

TATCTTGGTGTCTTTAGGGACAAGCACTACTATTCTAATGGTTACTGACCAGTATC

ATCCCTCTCCCAATTATCATCTATTTACCCACCCAGCAATTGCCAATTGTTACATG

GCAATGATATGCTATTGCAAT

ANEXO: Resultados de BLASTn de las secuencias amplificadas

195

13.5. Resultados de BLASTn de las secuencias amplificadas (Anexo 5)

-Resultados para T1(F1R1) y LR2(F1R1)


196



197


ANEXO: Mapa de dominios catalíticos de las secuencias amplificadas

198

13.6. Mapa de dominios catalíticos de las secuencias amplificadas de XK de las cepas C.

glabrata T1 y LR2 (secuencias nucleotídicas) (Anexo 6)

ANEXO: Mapa de dominios catalíticos de las secuencias amplificadas

199

Figura A.2. Mapa de dominios catalíticos. Se realizó un alineamiento múltiple con las secuencias de las cepas T1

y LR2 amplificadas y una secuencia de referencia de XK de C. glabrata con la que presentaron alta similitud

(XM_446768). Se usó el programa CLC Sequence Viewer versión 7.8.1. La secuencia de referencia traducida

(XP_446768) fue usada para encontrar los dominios catalíticos usando el CD-Search del NCBI. Se localizaron las

zonas marcadas de los dominios catalíticos en la secuencia nucleotídicas de la referencia ya alineada con las

secuencias amplificadas

ANEXO: Matrices de distancia de los experimentos de REP-PCR

200

13.7. Matrices de distancia para los experimentos de REP-PCR de las cepas C. glabrata T1

y LR2 (Anexo 7)

-REP-PCR 1

Matriz de distancias de la REP-PCR 1

Banda T1-1 T1-2 LR2-1 LR2-2

1 1 1 1 1

2 1 1 1 1

3 1 1 1 1

4 1 1 1 1

5 1 1 1 1

6 1 1 1 1

7 1 1 1 1

8 1 1 1 1

9 0 0 1 1


201

-REP-PCR 2


Banda AlL-09 T1-1 LR2-1 T1-2 LR2-2

1 0 1 1 1 1

2 1 0 0 0 0

3 0 1 1 1 1

4 1 0 0 0 0

5 0 1 1 1 1

6 1 1 1 1 1

7 1 0 0 0 0

8 1 0 1 0 1

9 0 0 1 0 1

10 0 1 1 1 1

11 0 1 1 1 1

12 0 1 1 1 1

13 1 1 1 1 1

14 0 1 1 1 1

15 0 1 0 1 0

16 0 0 1 0 1


202

-REP-PCR 3


Banda AL-09 1 AL-09 2 T1-1 T1-2 LR2-1 LR2-2

1 1 1 0 0 0 0

2 0 0 1 1 1 1

3 1 1 0 0 0 0

4 0 0 1 1 1 1

5 1 1 0 0 0 0

6 0 0 1 1 1 1

7 0 0 1 1 1 1

8 1 1 0 0 0 0

9 1 1 0 0 0 0

10 0 0 1 1 1 1

11 0 0 1 1 1 1

12 0 0 1 1 1 1

13 1 1 1 1 1 1

14 0 0 1 1 1 1

15 1 1 0 0 0 0

16 0 0 1 1 1 1


203

-REP-PCR 4


Banda AlL-09 T1-1 T1-2 LR2-1 LR2-2

1 0 1 1 1 1

2 0 1 1 1 1

3 1 1 1 1 1

4 0 1 1 1 1

5 1 0 0 0 0

6 1 0 0 0 0

7 0 1 1 1 1

8 0 1 1 1 1

9 0 1 1 1 1

10 1 1 1 1 1

11 1 1 1 1 1

12 1 0 0 0 0

13 0 0 0 1 1

ANEXO: Congresos y publicaciones realizadas

204

13.8. Presentaciones en congresos y artículos publicados (Anexo 8)


205


206


207


208


209


210

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