Tesis 2013 Luis Enrique Reynoso Rojas.pdf
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Centro de Desarrollo de Productos Bióticos Departamento de Biotecnología EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA Y FUNCIONAL DE HIDROLIZADOS ENZIMÁTICOS DE PROTEÍNAS DE SOYA Y DE PESCADO T E S I S Que para obtener el grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos PRESENTA Luis Enrique Reynoso Rojas Directoras de tesis: Dra. Silvia Evangelista Lozano M. en C. María Isabel Cortés Vázquez Yautepec de Zaragoza, Morelos; Julio 2013
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos
Departamento de Biotecnología
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA Y FUNCIONAL DE HIDROLIZADOS ENZIMÁTICOS DE
PROTEÍNAS DE SOYA Y DE PESCADO
T E S I S
Que para obtener el grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos
PRESENTA
Luis Enrique Reynoso Rojas
Directoras de tesis:
Dra. Silvia Evangelista Lozano
M. en C. María Isabel Cortés Vázquez
Yautepec de Zaragoza, Morelos; Julio 2013
El presente trabajo se llevó al cabo en el Departamento de Biotecnología del Centro
de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la
dirección de la Dra. Silvia Evangelista Lozano y la M. en C. María Isabel Cortés
Vázquez. En el Laboratorio de Enzimas Vegetales (LENZIVEG) y en el Laboratorio
de Propagación ex vitro. Para la realización de los estudios se obtuvo el apoyo
económico de la beca CONACYT No. 412417, y beca del Programa Institucional de
Formación de Investigadores (PIFI), proyectos20113169, 20121017 y 20131767.
La investigación fue financiada por los proyectos: FOMIX Campeche-126515.
Aprovechamiento industrial de especies vegetales de Campeche. Procesos de
bioseparación para la obtención de enzimas y subproductos. Director M. en C.
Roberto Briones Martínez y Preparaciones enzimáticas obtenidas por extracción
bifásica acuosa. Cinética de hidrólisis de sustratos sintéticos (SIP-IPN-20113169)
Directora M. en C. María Isabel Cortés Vázquez y por el proyecto: Propagación y
manejo agronómico de plantas con interés medicinal, ornamental, frutícola e
industrial (SIP-IPN-20130606) proyecto bajo la dirección de la Dra. Silvia Evangelista
Lozano.
AGRADECIMIENTOS
A la Maestra Isabel Cortés y al Maestro Roberto Briones por permitirme formar parte
de su grupo de trabajo y por todas sus aportaciones para lograr este objetivo.
A la Dra. Silvia Evangelista, por su incondicional apoyo en todo momento, y por su
dedicación a este trabajo.
A los demás miembros del comité tutorial: Dra. Kalina Bermúdez, Dr. Federico
Castrejón y a la Dra. Martha Lucía, por tu tiempo en la revisión de la tesis y sus
acertados comentarios siempre en bien de mi formación.
A la Dra. Edith Agama que me permitió trabajar en su laboratorio con suma
confianza.
Al grupo de apoyo de la Dra. Silvia: Elvira, Maricela, Uriel y Don Gil, por su ayuda
durante el trabajo en el invernadero.
A Don Alex y a Glenda, personal de Desarrollo tecnológico, por las facilidades
prestadas al trabajar en el laboratorio de la Dra. Edith.
A Sarahi Gamarra mi compañera desde hace años, quien con su amor y cariño me
ayudo en todo momento.
A mis compañeros de generación, quienes en su momento aportaron en algo a mi
formación.
DEDICATORIA
A Dios, por permitirme llegar a este punto y poner en mí la fortaleza para seguir
adelante.
A mi madre, quien es mi amiga, mi consuelo, mi apoyo y mi motivo para cada día
tratar de ser mejor persona. Gracias mamá todo esto es por ti.
A mi padre, que a pesar de que se fuera al cielo hace poco tiempo, me enseño a
reírme aun en los momentos difíciles.
A mi hermano Mario, quien siempre ha estado a mi lado apoyándome y dándome
una palabra de aliento, al igual que mi cuñada Sarai.
A mi hermana Karen, con la que he aprendido a no depender de lo material para ser
feliz.
A mi tía Sonia, por sus consejos y sus recomendaciones, quien al ir por el mismo
camino conoce y sabe lo que se encuentra uno.
A mi familia, quienes de algún modo, me han ayudado a seguir por este camino.
A mi novia, Sarahi… Quien en más de 4 años me ayudo a no dejar este reto que nos
planteamos, y que seguiremos buscando lo mejor para ambos, te amo y gracias por
todo. Además gracias a tu familia quienes también me han ayudado.
A mis amigos, los cuales siempre tiene un espacio para escucharme y compartir un
tiempo conmigo, ayudándome a distraerme.
INDICE
índice de figuras i
índice de cuadros iii
Lista de abreviaturas iv
Resumen vi
Abstract vii
I INTRODUCCIÓN 1
II ANTECEDENTES 2
2.1 Hidrólisis enzimática de proteínas 2
2.1.1 Hidrólisis enzimática de proteínas de soya 2
2.1.2 Hidrólisis enzimática de proteínas de pescado 3
2.2 Enzimas 4
2.3 Enzimas proteolíticas 4
2.3.1 Proteasas cisteínicas 5
2.3.2 Proteasas de plantas mexicanas 5
2.3.3 Mexicaína 6
2.4 Fuentes de proteína susceptibles de aprovechamiento 7
2.5 Uso de los hidrolizados enzimáticos 9
2.5.1 Hidrolizados con propiedades funcionales modificadas 10
2.6 Hidrolizados enzimáticos como fertilizantes 11
2.6.1 Biofertilizante-Bioestimulante 12
2.7 Modelo de estudio, frijol (Phaseolus vulgaris) 13
2.8 Clorofila como evidencia de absorción de nutrientes 14
III JUSTIFICACIÓN 15
IV HIPÓTESIS 15
V OBJETIVOS 15
5.1 Objetivo general 15
5.2 Objetivos específicos 15
VI MATERIALES Y METODOS 16
6.1 Materiales 16
6.1.1 Sustratos 16
6.1.2 Proteasa vegetal 17
6.1.3 Cultivo modelo de frijol 17
6.2 Determinación de nitrógeno amínico (Kjeldahl) en harina de
pescado
17
6.3 Obtención de hidrolizados de proteínas de soya y de
pescado por la acción de mexicaína refinada
18
6.4 Caracterización bioquímica de los hidrolizados enzimáticos 18
6.4.1 Determinación de la distribución de peso molecular aparente 18
a) Electroforesis unidimensional 18
b) Electroforesis bidimensional 19
6.4.2 Separación de péptidos por cromatografía 20
a) Cromatografía por exclusión de tamaño molecular 20
b) Cromatografía por intercambio catiónico 21
6.4.3 Propiedades funcionales 21
a) Solubilidad en función del pH 21
b) Solubilidad en función del pH (Proteína por Lowry) 22
c) Actividad emulsionante de proteínas de soya y de pescado 22
d) Determinación de la estabilidad de la emulsión 23
6.5 Evaluación del efecto biológico de los hidrolizados
enzimáticos en plantas de frijol azufrado
23
6.5.1 Variables a evaluar en las plantas tratadas 24
a) Grosor del tallo 24
b) Altura 24
c) Determinación de clorofila (Método de Lichtenthaler, 1978) 24
d) Rendimiento de fruto 25
6.5.2 Mantenimiento del cultivo de frijol 25
6.6 Análisis estadístico 26
VII RESULTADOS Y DISCUSIÓN 27
7.1 Contenido de proteína en los sustratos proteínicos 27
7.2 Caracterización de la hidrólisis por acción de mexicaína
refinada
27
7.3 Caracterización bioquímica de los hidrolizados enzimáticos 29
7.3.1 Distribución de peso molecular aparente 29
7.3.2 Separación e identificación de péptidos por cromatografía 32
a) Cromatografía por exclusión de tamaño 32
b) Cromatografía por intercambio catiónico 34
7.3.3 Propiedades funcionales 37
a) Solubilidad en función de pH 37
b) Actividad emulsionante 39
c) Estabilidad de la emulsión 41
7.4 Evaluación del efecto biológico de los hidrolizados
enzimáticos en plantas de frijol azufrado
44
7.4.1 Variables evaluadas en las plantas tratadas 45
a) Grosor del tallo y altura de las plantas 45
b) Contenido de clorofila “a” y “b” 46
c) Rendimiento de fruto 47
VIII CONCLUSIONES 50
IX PERSPECTIVAS 51
X BIBLIOGRAFÍA 52
XI ANEXOS 61
Anexo 1 Ficha técnica de Turba (PINDSTRUP SPHAGNUM®) 61
Anexo 2 Ficha técnica de Agrolita (agroLITA®) 62
Anexo 3 Ficha técnica de Vermiculita (agroLITA®) 63
ÍNDICE DE FIGURAS
Número Figura Pagina
1 Pileus mexicanus (cuaguayote ó bonete) planta y fruto fuente de
mexicaína
7
2 Phaseolus vulgaris (frijol) creciendo en maceta a los 30 días de
germinación
13
3 Diagrama experimental 16
4 Cultivo experimental de frijol azufrado bajo condiciones de
invernadero
26
5 Curso de la hidrólisis de proteínas de soya por efecto de
mexicaína refinada
28
6 Curso de la hidrólisis de proteínas de pescado por efecto de
mexicaína refinada
29
7 Separación por electroforesis unidimensional de proteínas de
soya
30
8 Separación por electroforesis unidimensional de proteínas de
pescado
30
9 Perfil electroforético bidimensional del aislado de soya (AS) 31
10 Perfil electroforético bidimensional del hidrolizado de soya (HS) 32
11 Separación cromatográfica en Sephadex G-120 de proteínas de
Soya
33
12 Separación cromatográfica en Sephadex G-120 de proteínas de
pescado
34
13 Separación por cromatografía de intercambio catiónico (CMC) de
proteínas de soya. Gradiente de NaCl (0.2 M – 1.6 M)
35
14 Separación por cromatografía de intercambio catiónico (CMC) de
proteínas de pescado. Gradiente de NaCl (0.2 M – 1.6 M)
36
15 Perfil de solubilidad de proteínas de soya (a) y de proteínas de 37
I
pescado (b) en relación con el pH (As 280 nm).
16 Perfil de solubilidad de proteínas de soya (a) y de proteínas de
pescado (b) en relación con el pH (Proteína por Lowry).
39
17 Actividad emulsionante de proteínas de soya (a) y de proteínas
de pescado (b).
40
18 Perfil de estabilidad de la emulsión para proteínas de soya. a)
Aislado de soya (AS) y b) Hidrolizado de soya (HS)
41
19 Perfil de estabilidad de la emulsión para proteínas de pescado. a)
Harina de pescado (SP) y b) Hidrolizado de pescado (HP)
43
II
ÍNDICE DE CUADROS
Número Cuadro Página
1 Ventajas de los hidrolizados enzimáticos en la mejora de las
propiedades funcionales
10
2 Producción de frijol en América Latina 13
3 Fuentes de proteína de sustratos proteínicos 16
4 Tratamientos experimentales 24
5 Contenido de proteína en sustratos 27
6 Actividademulsionante y estabilidad de la emulsión de proteínas
de soya
42
7 Actividademulsionante y estabilidad de la emulsión de proteínas
de pescado
43
8 Contenido de proteína en las preparaciones proteínicas
(tratamientos)
44
9 Efecto de los hidrolizados enzimáticos en el grosor del tallo y la
altura de las plantas de frijol
46
10 Contenido de clorofila “a” y “b” 47
11 Rendimiento de fruto de frijol 48
III
LISTA DE ABREVIATURAS As Absorbancia
AS Aislado de soya
AE Actividad Emulsionante
CMC Carboximetilcelulosa
cm Centímetro
EE Estabilidad de la Emulsión
F Factor Kjeldahl
°C Grados Centígrados
g Gramos
HS Hidrolizado de soya
HP Hidrolizado de pescado
Ha Hectárea
h Hora
kD Kilo Daltones
Kg Kilogramos
L Litro
MPM Marcador de Peso Molecular
mA miliAmper
mm Milímetro
Meq Miliequivalente
mL Mililitro
M Molar
N Normalidad
nm Nanómetro
PSA Persulfato de amonio
PM Peso Molecular
PCs Proteasas Cisteínicas
PI Punto Isoeléctrico
rpm Revoluciones por minuto
IV
SDS Dodecil Sulfato de Sodio
SP Harina de pescado
T Testigo
TM Toneladas Métricas
UAE Unidades de Actividad Emulsionante
µL Microlitro
V
RESUMEN
Se evaluaron las propiedades funcionales y la actividad biológica de hidrolizados de
proteínas, de un aislado de soya y de proteínas de un concentrado de harina de
pescado, con la proteasa cisteínica mexicaína, preparación refinada aislada de frutos
dePileus mexicanus. Las condiciones de reacción fueron pH 8 y temperatura de 35
ºC y se analizaron en la fracción soluble de las mezclas de reacción, la solubilidad,
actividad y estabilidad emulsionante en función del pH entre 3-11. La actividad
biológica se determinó en plantas de frijol de la variedad azufrado (peruano)
cultivadas en invernadero.
Los hidrolizados presentaronmás proteína soluble que los sustratos sin tratamiento.
El mayor contenido de proteína soluble se obtuvocon el hidrolizado de soya a pH 5,
mientras que en el de pescado fue en pH 7. En ambos casos la dependencia con el
pH fue moderada. La actividad emulsionante del hidrolizado de soya mejoró en pH
ácido. El hidrolizado de proteínas de pescado, en cambio, comparativamente con las
proteínas sin tratamiento, no mejoró la actividad emulsionante, observándose que
aumentó al aumentar el pH. La estabilidad de emulsión fue mayor en pH 11 en el
hidrolizado de soya, mientras que en las proteínas de pescado, en pH 5. El efecto de
los hidrolizados descritos en las plantas de frijol, mostró que la aplicación de
dispersiones de las proteínas no tratadas enzimáticamente como de los hidrolizados,
produjo mejoras significativas en el crecimiento y desarrollo de las plantas, con
respecto a las testigos. No obstante, entre los cuatro tratamientos no se observaron
diferencias.
En suma, se demostró que la actividad y modo de acción de la preparación refinada
de mexicaína modificólas proteínas en estudio, con altos niveles de grado de
hidrólisis que propiciaron cambios significativos en la solubilización de proteína. La
mexicaína refinada, generó productos de reacción con propiedades fisicoquímicas
que se tradujeron en mejoras de funcionalidad. Por otra parte, los ensayos
exploratorios del efecto de la aplicación de hidrolizados en plantas de frijol, con el
diseño experimental probado, mostraron resultados con buenas perspectivas a
discernir en investigaciones futuras.
VI
ABSTRACT
We evaluated the functional properties and biological activity of the protein
hydrolysates of an isolated soy and protein concentrate fishmeal with mexicain
cysteine protease, refined preparation isolated from fruits Pileus mexicanus. The
reaction conditions were pH 8 and temperature of 35 ° C and analyzed in the soluble
fraction of the reaction mixtures, the solubility, emulsifying activity and stability in
function of pH 3-11. The biological activity was determined in bean plants variety
sulfur (Peruvian) cultivated in greenhouses.
The hydrolysates had more soluble protein than the untreated substrates. The high
content of soluble protein was obtained with soy hydrolyzate at pH 5, while the
fishhydrolysate was at pH 7. In both cases the pH dependency was moderated. The
emulsifying activity of soy hydrolysate improved with acid pH.The emulsifying activity
of the fish protein hydrolysate,did not improve but was higher as the pH increased.
The emulsion stability for the hydrolyzed soy was better at pH 11, while the best
stability for fish hydrolyzatewas found at pH 5. The application of hydrolysates and
their corresponding untreated protein on bean plants produced significant
improvements in the growth and development of plants.
Herein the achieved results show an activity and mode of action for refined mexicain
on soy and fish proteins that produced an increase in the solubility. The refined
mexicain generated reaction products with physicochemical properties that resulted in
improved functionality. It remains to be evaluated the effect of insoluble hydrolysates
on the same system.
VII
I. INTRODUCCIÓN
Las enzimas son macromoléculas presentes en todas las formas de vida, y las
enzimas vegetales son aquellas provenientes de plantas como la papaína y la
bromelaína que han sido utilizadas para la modificación y transformación de
sustratos hacia la generación de nuevos productos con valor agregado.Una nueva
enzima, la mexicaína, posee un gran potencial por su ampliaactividad catalítica, ya
que tiene igual o mayor actividad proteolítica que la papaína, enzima de amplio uso
industrial. Con base en las experiencias obtenidas en el CEPROBI, se elaboraron
hidrolizados a partir de aislado de soya y harina de pescado, utilizando una
preparación de mexicaína refinada, cuyo procedimiento de obtención se desarrollo
en elLENZIVEG,con el fin de caracterizarlos y determinar su efecto biológico sobre
plantas de frijol azufrado (cultivado experimentalmente en macetas), y a su vez
analizar el efecto de la modificación enzimática producida por el modo de acción de
la mexicaína en algunas propiedades funcionales tales como la solubilidad, la
actividady estabilidad emulsionante.
El uso de los hidrolizados enzimáticos ha generado gran información,y es así como
se encuentran antecedentes importantes en los que se ha demostrado que los
hidrolizados enzimáticos de proteínas, constituidos por péptidos de bajo peso
molecular, pueden afectan de forma positiva a las plantas como bioestimulantes, ya
que no solo pueden ser un aporte nutritivo sino que también ayudan a su
crecimiento y desarrollo. Por lo que en el presente trabajo se evaluaron las
propiedades funcionales yla actividad biológicade las especies peptídicas generadas
por la hidrólisis enzimáticade proteínas de soya y pescado, evaluando su efecto en
un sistema de estudio con frijol azufrado.
- 1 -
II. ANTECEDENTES
2.1 Hidrólisis enzimática de proteínas
Los hidrolizados enzimáticos se han producido de manera exponencial, gracias a que
los productos generados han dado respuesta a muchas necesidades tanto en el área
farmacéutica como alimentaria, así la biotecnología ha hecho uso de las enzimas
desde la época prehispánica, con la generación de diversos productos, como el pan,
la cerveza y el vino (Cortés-Vázquez y Briones-Martínez, 2008). Las enzimas
trabajan bajo condiciones muy estrictas de pH y temperatura, su selectividad
catalítica por los sustratos les provee una herramienta eficiente para el desarrollo de
productos específicos (Benítez et al., 2008). La modificación enzimática de sustratos
o materias primas dan como resultado productos con nuevas propiedades
funcionales como: mayor solubilidad de proteína, mejor actividad emulsionante y
espumante, así como mayor actividad antioxidante (Jamdaret al., 2010).Los enlaces
peptídicos que unen a los aminoácidos que conforman las proteínas pueden ser
hidrolizados por proteasas, que son enzimas que rompen este enlaces liberando así
péptidos de diferentes masas moleculares (Chalamaiahet al., 2010). Existen varios
ejemplos de fuentes de proteínas de origen animal, las cuales están consideradas
como residuos, las proteínas encontradas en estos residuos pueden ser modificadas
por enzimas para generar nuevas especies moleculares (Clemente, 2000).
2.1.1 Hidrólisis enzimática de proteínas de soya
En los últimos años el uso de las proteínas de soya se ha aumentado gracias a las
características que presentan en comparación con proteínas de otro origen, y los
aislados de soya son los más usados dado su alto contenido de proteína disponible
que es alrededor de un 90 % (Nielsen, 1985); las proteínas nativas de soya están
compuestas de una mezcla de albúminas y globulinas, el 90% de las cuales son
proteínas de almacenamiento principalmente β-conglicinina (7S) y glicinina (11S)
(Nielsen, 1985). Los usos más comunes de las proteínas contenidas en los aislados
de soya se basan en propiedades funcionales, como agentes emulsionantes o - 2 -
gelificantes (Liuet al., 1999; Molina et al., 2001). Sin embargo la estructura compacta
de las proteínas de soya, dada por los puentes de hidrogeno y disulfuro, han
provocado que tengan una menor flexibilidad para lograr una buena capacidad
emulsionantecomparadas con proteínas como las de la leche (Molina et al., 2001;
Roesch y Corredig, 2003). Por lo cual se ha buscado que mediante hidrólisis
enzimática se den modificaciones estructurales que permitan una mayor flexibilidad
conformacional de la proteína de soya y pueda mejorar sucapacidad para estabilizar
espumas y emulsiones, así como aumentar su solubilidad (Pusky, 1975; Kim y
Kinsella, 1985; Martínezet al., 2009).
2.1.2 Hidrólisis enzimática de proteínas de pescado
Las limitaciones de orden ambiental y económico en la producción de alimento de
origen animal ha propiciado que se enfoque la atención a la necesidad de utilizar sus
subproductos; un volumen importante de residuos son obtenidos de la acuacultura, la
pesca y la elaboración de productos a base de pescado, ya que los residuos pueden
llegar a constituir un 70 % de su peso inicial, sin considerar las pérdidas que son
generadas por la manipulación, almacenamiento y procesamiento (Chalamaiah et al.,
2010).Existen diferentes géneros de pescadoque a partir de sus residuos se han
generado hidrolizados enzimáticos con propiedades funcionales modificadas entre
los cuales se encuentran Clupeasp(arrenques) (Hoyle yMerritt,1994; Sathivel et al.,
2003), Selaroidessp(chicharro banda dorada) (Klompong et al., 2007),
Mallotussp(capelín) (Shahidi et al., 1995), yMerluccius sp(merluza) (Benjakul y
Morrissey, 1997).Diversas enzimas se han usado para la elaboración dehidrolizados
a partir de proteínas de pescado,con el fin de mejorar sus propiedades
funcionales(Sugiyama et al., 1991; Briones-Martínez et al., 1994; Shahidi et al.,
1995; Benjakul y Morrissey, 1997;); siendo las proteínas de bacalao y salmón las
más usadas para este fin (Liaset et al., 2003; Aspmoet al., 2005;Slizyte et al., 2005)
ya que son superiores a los que hay de otra variedad de pescado
(Ruttanapornvareesakul et al., 2006).
- 3 -
2.2 Enzimas
En su mayoría las enzimas son entidades proteicas, y su actividad catalítica depende
de la integridad en su conformación estructural (Lehningeret al., 2005). La catálisis
enzimática de las reacciones es esencial para los sistemas vivos, en condiciones
normales las reacciones sin catalizar tienden a ser lentas; la mayoría de las
moléculas biológicas son muy estables al pH neutro, temperaturas estables y
ambiente acuoso presente en el interior de las células (Aunstrup, 1980).
2.3 Enzimas proteolíticas
Las enzimas proteolíticas o proteasas, son aquellas que actúan rompiendo los
enlaces peptídicos de las proteínas que son catalizadas (Palma et al., 2002), como
son las fitoproteasas o proteasas vegetales. Entre algunas de ellas están la papaína
(endoproteasa cisteínica obtenida de la papaya) y la bromelaína (endoproteasa
cisteínica obtenida de la piña) y su uso se ha reportado como ablandadores de
carne, así como para mejorar algunas funcionalidades de proteínas como las de
soya, o para resaltar el sabor en ciertos alimentos (Briones-Martínez y Cortés-
Vázquez, 2008). Entre algunas de las actividades de las enzimas proteolíticas se
encuentran, la modificación de las propiedades funcionales de proteínas de
importancia alimentaria, la cual es llevada al cabo por la hidrólisis de diversos
sustratos, a diversos niveles, para obtenerdiversos grados de hidrólisis de las
proteínas, teniendo así control del tamaño molecular de los hidrolizados (Palma-
Rodríguez, 2008). Con esto la funcionalidad de los hidrolizados de proteínas que se
obtengan está influenciada por el grado de hidrólisis, la especificidad de la enzima y
las condiciones de hidrólisis. Los productos obtenidos pueden ser incorporados en
alimentos para proveer un valor nutricional agregado (Briones-Martínez et al.,
1997).El producto de reacción de una hidrólisis enzimática de proteínas siempre
tendrá características que estarán determinadas por: la enzima que sea utilizada, el
sustrato que se emplee, el grado de hidrólisis y el tiempo de reacción, por lo cual se
debe analizar las propiedades que se requieren en el producto, para así emplear las
condiciones que nos lleven a obtenerlo (Benítez et al., 2008). - 4 -
Las enzimas proteolíticas han sido reportadas de varios tipos,su clasificación está
basada en el sitio donde realicen la hidrólisis; un tipo son las exoproteasas, que han
sido diferenciadas de acuerdo a su especificidad como aminopeptidasas, estas
proteasas son capaces de romper el enlace peptídico en el amino terminal; así como
en el grupo carboxilo, esto es, en los extremos de la proteína blanco; las
endoproteasas por el contrario realizan la hidrólisis dentro de la cadena de la
proteína nativa, generando polipéptidos (González-Rábade et al., 2011). Según la
base de datos MEROPS se tienen siete familias de proteasas, entre las que se
encuentran: aspárticas, cisteínicas, glutámicas, metaloínicas, arparagínicas,
serínicas y treonínicas; en plantas, son cinco los tipos de endoproteasas que se han
reportado: serínicas, cisteínicas, aspártico, metalo y treonina (Rawlingset al.,
2010).Las proteasas constituyen el grupo más importante de las enzimas que son
usadas en la industria, por su alta especificidad y la modificación de sustratos
(Walsh, 2002).
2.3.1 Proteasas cisteínicas
Las proteasas cisteínicas (PCs) también conocidas como tiol-proteasas, están
ampliamente distribuidas entre los organismos vivos, que se encuentran tanto en
procariotas como en eucariotas (González-Rábade et al., 2011). El mecanismo
catalítico de estas enzimas implica un grupo cisteína en su sitio activo,las PCs
comprenden una familia de enzimas, entre ellas la papaína y otras proteasas de
plantas como la caricaína, la bromelaína, la ficina, entre otras (Turk et al., 1997). Las
plantas ofrecen una atractiva alternativa para la obtención de enzimas proteolíticas
gracias a la gran cantidad que se genera; así como, por su gran poder catalítico
(González-Rábade et al., 2011).
2.3.2 Proteasas de plantas mexicanas
Las proteasas son importantes en todos los aspectos del ciclo de vida de las plantas
que van desde la movilización de las proteínas de reserva durante la germinación de
las semillas, hasta la iniciación de la muerte celular y la senescencia de diversas vías
(Schaller, 2004).Las proteasas han sido identificadas y estudiadas a partir del látex
de varias familias de plantas tales como: Asteraceae, Caricaceae, Moraceae, - 5 -
Asclepiadaceae, Apocynaceae y Euphorbiaceae (Domsalla y Melzig, 2008). La
mayoría de estas proteasas obtenidas de plantas se han identificado como proteasas
cisteínicas, y pocas de ellas como proteasas aspárticas (Rawlingset al., 2010). Las
enzimas proteolíticas derivadas de plantas son muy usadas debido a que mantienen
su actividad en un amplio intervalo de temperatura y pH (Uhlig, 1998). Existe una
serie de procesos industriales que implican la ruptura de proteínas por proteasas,
algunas de los cuales son extraídas de plantas;las preparaciones de enzimas
procedentes de extractos de plantas se han utilizado en aplicaciones industriales por
un largo tiempo, incluso antes de que se supiera mucho sobre la naturaleza y
propiedades de las enzimas;la gran mayoría de las enzimas comerciales se han
obtenido principalmente a partir de fuentes microbianas, pero las enzimas de las
plantas se están volviendo cada vez más importantes, con aplicaciones en los
procesos industriales, la biotecnología y la farmacología. Las proteasas como la
papaína, la bromelaína y la ficina se emplean en diferentes procesos industriales y
en medicina (Uhlig, 1998).De cuatro especies de bromeliáceas mexicanas se
aislaron y caracterizaron cuatro nuevas proteasas cisteínicas de interés práctico y
científico: karatasina, hemisfericina, palmerina y silvestrisina (Garduño et al., 1974;
Briones-Martínez et al., 1994).
2.3.3 Mexicaína
La mexicaína es otra fitoenzima monomórfica del tipo de proteasas cisteínicas que
ha sido aislada y caracterizada, fue encontrada en el látex de Pileus mexicanusA.
DC.(Figura 1)(Castañeda-Agulló et al., 1942) y presenta una amplia estabilidad a
diferentes temperaturas y pH, manteniendo una alta actividad proteolítica mayor que
la papaína (Gavira et al., 2007; Oliver-Salvador et al., 2011); ofreciendo así una
alternativa en su uso en la industria de los alimentos, la medicina, entre otras
(Briones-Martínezet al., 1994).
- 6 -
Figura 1.Pileus mexicanus(cuaguayote ó bonete) planta y fruto fuente de mexicaína
2.4 Fuentes de proteínassusceptibles de aprovechamiento
La fuente proteínica que es usada para generación de hidrolizados enzimáticos es
denomina sustrato, y estepueden ser de origen vegetal o animal; entre los sustratos
de origen vegetal que más se usan destacan la harina de trigo, arroz y soya; y los
sustratos de origen animalmás usados están los de pescado que provienen en su
mayoría de subproductos de la industria pesquera (Belén et al., 2007). En general
cuando se analiza la elección de un tipo de sustrato a utilizar, se debe tener en
cuenta el producto que se espera y las características que se desean en él, un
ejemplo de ello, es la producción de hidrolizados con propiedades gelificantes o con
capacidad de formar geles transparentes, por lo general se ocupan proteínas como la
colágena y gelatina (Adler-Nissen et al., 1979). También se ha extendido el uso
proteínas de origen animal como; de huevo, de carne, de sangre y de vísceras, e
incluso de proteínas vegetales como las obtenidas de los cereales; cuando la
finalidad del hidrolizado, es su uso como fuente de nitrógeno, se emplean proteínas
de pescado y proteínas microbianas en alimentación animal (Bhaskaret al., 2008), y
proteínas de soya y lácteas en alimentación humana (Kong et al., 2007).
Una fuente de proteína que puede ser potencialmente aprovechada, es el residuo
que se obtienen después de la extracción del aceite de maíz, este ha sido sometido a
hidrólisis enzimática para la producción de peptonas, además de que se mejoran las - 7 -
propiedades de las proteínas (Parrado et al., 1991). Los hidrolizados obtenidos
mejoran su valor biológico,así también se ha visto que mejoran sus propiedades
funcionales, siendo estas superiores a las de la proteína original (Romero et al.,
2007). Las proteínas de semillas oleaginosas son utilizadas para la elaboración de
hidrolizados, ya que mejoran las propiedades funcionales,tales como la capacidad
emulsionante y la formación de espuma(Khalilet al., 1985).La extracción de aceite de
ciertas semillas como el maíz, la aceituna y la soya dejan como residuo productos
con grandes cantidades de proteína, que pueden ser sometidas a hidrólisis
enzimática, ya sea para la elaboración de alimentos funcionales, así como para
mejorar las propiedades funcionales (Aluko y Monu, 2003; Spellmanet al., 2005).
Otra fuente de proteínas poco usual para ser sometida a hidrólisis enzimática y
generar así nuevos productos, es el uso de proteína de microalgas que por lo general
son destinadas a la alimentación de animales (Spolaoreet al., 2006), ya que las
proteínas representan un 30-60% del peso total de biomasa de microalgas
(Rebolloso-Fuentes et al., 2001). En la actualidad se ha visto que mediante hidrólisis
enzimática se generan concentrados de aminoácidos libres a partir de las proteínas
que se extraen de la biomasa de microalgas (Romero-García et al., 2012).
Por ejemplo: el residuo que queda después de la separacióndel mosto durante el
proceso de elaboración de la cerveza, es rico en proteínas y fibra, y generalmente es
destinado solamente a la alimentación de animales; se ha buscado aumentar su
aplicación en otras áreas para hacer uso de las proteínas insolubles que tiene y esto
se ha hecho, con la elaboración de hidrolizados enzimáticos (Celuset al., 2009). La
hidrólisis enzimática de proteínas de granos destinados a la elaboración de cerveza
mejora las propiedades funcionales de estas como la actividad emulsionante y la
formación de espuma (Celuset al., 2007).
Así también con el propósito de mejorar la rentabilidad de la pesca de cangrejo, así
como cumplir con los reglamentos ambientales, se ha buscado en la industria
pesquera una forma de optimizar los subproductos que se generan;estos residuos
son importantes fuentes de proteínas, que pueden ser extraídos de los demás
componentes por hidrólisis enzimática, con el uso de proteasas comerciales;el - 8 -
empleo de la hidrólisis enzimática se ha propuesto con este fin, ya que sustituye a
otras técnicas másagresivas que utilizandisolventes y generan así productos no
deseados, además de que la hidrólisis forma productos que eventualmente pueden
ser de interés comercial (Beaulieuet al., 2009).
2.5 Usosde los hidrolizados enzimáticos
Las enzimas tienen un amplio campo de aplicación y uno de ellos ha sido la industria
alimentaria; el uso de las enzimas se ha dado gracias a las características que
poseen, ya que ayudan reduciendo procesos en la industria, así como evitar
productos secundarios no deseados, y finalmente por las cualidades que le proveen
al producto final; además las enzimas ayudan a la reducción de costos, ya que con
una poca cantidad de enzima, se pueden procesar grandes cantidades de sustrato;
la introducción de la tecnología enzimática endiversos procesos industriales, se ha
estudiado ampliamente; ya que de esta forma, se pueden controlar las propiedades
de los productos deseados (Cortés-Vázquez y Briones-Martínez, 2008). Entre las
enzimas proteolíticas más usadas en la industria se encuentran las cisteínicas, que
poseen propiedades únicas como la hemisfericina y la mexicaína, y que no son
encontradas en otras enzimas, estas dos últimas enzimas se han utilizado para la
generación de alimentos con valor agregadocomo aquellos con ingredientes
funcionales, nutricionales y bioactivos(Briones-Martínez et al., 1997).
En el área agrícola, para mejorar la calidad nutrimental del suelo por medio de la
mineralización de la materia orgánica y disponibilidad de macro y micronutrientes,
además de la activación de la comunidad microbiana del suelo (Tejada et al., 2013),
se han desarrollado productos estimulantes a partir de hidrolizados enzimáticos
(Romero et al., 2007; Parrado et al., 2008). Tal es el caso de los hidrolizados con
potencial fertilizante, de las proteínas de los residuos de calamar (cabeza, vísceras,
tendones, tentáculos y pequeñas partes musculares), estos subproductos
constituyen el 50% del total de su peso, y frecuentemente son desechados,
convirtiéndose en un problema económico y ambiental; se ha visto que a través de
hidrólisis enzimática se pueden modificar estos residuos y generar un producto
- 9 -
orgánico probado en Arabidopsis thaliana como fertilizante, y con esto contribuir a
una agricultura orgánica emergente (Peña-Cortez et al., 2010).
2.5.1 Hidrolizados con propiedades funcionales modificadas
Mediante la hidrólisis enzimática ocurren cambios en las características moleculares
de la proteína blanco, que pueden dar lugar a un comportamiento modificado en las
propiedades funcionales del hidrolizado resultante cuando se le compara con la
proteína intacta, cambios que se reflejan en la solubilidad, la actividady estabilidad
emulsionante, la capacidad de retención de agua y su propiedad espumante (Benítez
et al., 2008). La utilización de enzimas proteolíticas es a menudo un medio atractivo
para mejorar las propiedades funcionales de proteínas que están siendo modificadas
(Clemente, 2000). La solubilidad proteínica es una de las propiedades funcionales
más importantes en los hidrolizados (Kristinsson y Rasco, 2000), ya que se busca
que exista una alta solubilidad de las proteínas en los hidrolizados que seránecesaria
para diversas aplicaciones funcionales, como lo es la capacidad de formar
emulsiones, espumas y geles (Chalamaiahet al., 2010).En relación al uso de nuevas
proteasas vegetales en hidrolizados enzimáticos se han desarrollado procesos para
la producción de hidrolizados de proteínas vegetales con preparaciones refinadas de
hemisfericina y mexicaína que resultaron en modificaciones importantes de su
funcionalidad (Briones-Martínez et al., 1997).Los hidrolizados enzimáticos de
proteínas presentan aminoácidos libres y péptidos de cadena corta que muestran
varias ventajas en las propiedades funcionales (Cuadro 1).
Cuadro 1. Ventajas de los hidrolizados enzimáticos en la mejora de las propiedades
funcionales.
Hidrolizados enzimáticos
Péptidos de cadena corta y
aminoácidos libres.
Mayor solubilidad
Estabilidad térmica
Capacidad de retención de agua
Aumento de la actividad emulsionante Fuente: Ruttanapornvareesakul et al., 2006.
- 10 -
Las emulsionesmás frecuentes son las que usan aceite-agua (Panyam y Kilara,
1996). Por lo cual se ha visto que los hidrolizados de proteínas de subproductos de
pescado suelen tener altas actividades emulsionantes, esto debido a que se mejora
su naturaleza anfifílica, que se da porque mediante la hidrólisis se exponen más
grupos hidrófilos e hidrófobos que permiten la orientación en la interfase aceite-agua
(Klompong et al., 2007).
2.6 Hidrolizados enzimáticos como fertilizantes
Los aminoácidos libres son sustancias nutritivas de fácil absorción y asimilación tanto
por vía radicular como foliar, transportándose rápidamente a los órganos del vegetal
en los que existe una mayor demanda debido a su metabolismo; los aminoácidos
tienen una importante actividad biocatalizadora, ya que activan la síntesis de
fitohormonas, así también juegan un importante papel como nutriente directo de fácil
asimilación que no es necesario metabolizar por la planta (Peña-Cortés et al., 2010).
Las transformaciones de aminoácidos que son obtenidos por la planta, en nuevos
aminoácidos, así como otras reacciones bioquímicas, son reguladas por hormonas y
principalmente por las enzimas que juega el papel de catalizadores biológicos; los
hidrolizados de proteínas tanto de origen animal como vegetal, afectan de algún
modo positivo a estos mecanismos (Parrado et al., 2008). Los aminoácidos libres y
los hidrolizados de proteína, no solo constituyen un nutriente, sino que de acuerdo a
Parrado et al. (2008) son un factor regulador del crecimiento debido a su:
- Rápida absorción y traslación de los aminoácidos por las partes de la planta.
- Fácil metabolización.
- Función alimenticia y poder catalizador y regulador del crecimiento actuando en los
mecanismos enzimáticos fundamentales.
- Mejora la polinización de los frutos.
- Resistencia de las planta a estrés hídrico, heladas y sequias.
Los hidrolizados enzimáticos contienen proteínas de bajo peso molecular, péptidos y
aminoácidos, que son directamente absorbidos por las plantas, generando así que la
planta tenga un ahorro en la cantidad de energía en elproceso absorción. Con esto
- 11 -
se sabe que los hidrolizados no solo son una fuente de nutrientes sino que también
afectande modo positivo no sólo al crecimiento, sino también a la calidad y la
producción de frutos o granos cosechados (Parrado et al., 2008).
En los últimos años se ha dado un incremento en la producción de hidrolizados
enzimáticos a partir de sustratos orgánicos, los cuales se han enfocado en su
aplicación como biofertilizantes en cultivos de interés comercial y bioestimulantes en
suelos pobres (Romero et al., 2007; Parrado et al., 2008; García-Martínez et al.,
2010; Tejada et al., 2013).
2.6.1 Biofertilizante- Bioestimulante Los biofertilizantes o bioestimulantes son productos orgánicos que han sido
obtenidos de diferentes fuentes orgánicas, generalmente mediante hidrólisis (Parrado
et al., 2008). Estos bioestimulantes o biofertilizantes están compuestos de proteínas,
péptidos y aminoácidos que son absorbidos directamente por las plantas, aunque la
absorción es diferente en cada planta (García-Martínezet al., 2010).Los hidrolizados
enzimáticos se han propuesto como biofertilizantes o bioestimulantes gracias a su
composición química, la cual aporta un contenido nutrimental importante que
contribuye al desarrollo de los tejidos vegetales, estimulan el metabolismo de la
planta, reduce en estrés, entre otras, esto gracias al contenido de péptidos de bajo
peso molecular así como aminoácidos libres que se ha visto se dirigen rápidamente
una vez absorbidos a los órganos de crecimiento de las plantas (Kristinsson y Rasco,
2000; Parrado et al., 2008). Sin embargo también se ha visto que los hidrolizados
enzimáticos utilizados como biofertilizantes tienen diferentes mecanismos de acción
según el cultivo, así como también dependen de las condiciones particulares en las
que se encuentre la planta, como lo puede ser cuando se encuentra en pleno
crecimiento, floración, producción de frutos, o factores ambientales (García-Martínez
et al., 2010; Tejada et al., 2013).
2.7 Modelo de estudio, frijol (Phaseolus vulgaris)
Las leguminosas son una de las fuentes más valiosas de proteínas en la dieta de los
seres humanos. El frijol (P. vulgaris) es un alimento básico proporcionando más del
- 12 -
70% de la proteína en la dieta (América y África Oriental), es la segunda leguminosa
consumida por los seres humanos en todo el mundo; el frijol (Figura 2) se consume
como verdura (ejotes) y granos (Broughtonet al., 2003), en México el frijol ocupa el
segundo lugar por superficie cultivada y el sexto por valor de la producción (Celis-
Velazquez et al., 2010)
Figura 2.Phaseolus vulgaris (frijol) creciendo en maceta a los 30 días de germinación.
La producción total supera 23 millones de toneladas métricas(TM) (Cuadro 2), de los
cuales 7 millones de toneladas, se producen en América y África.
Cuadro 2. Producción de frijol en América Latina.
País/Región Superficie (ha×10 −3)
Producción (TM ×10 −3)
Brasil 5092 3055
México 2259 1300
Centroamérica (Guatemala, Honduras, El Salvador,
Nicaragua, Costa Rica, Panamá)
526 337
Sudamérica (Chile, Argentina, Paraguay 357 398
Andino (Venezuela, Colombia, Ecuador, Perú, Bolivia) 299 265
Caribe (Cuba, Haití, República Dominicana) 157 141 Fuente: Broughtonet al., 2003
(Foto: Reynoso, 2013)
- 13 -
2.8 Clorofila como evidencia de absorción de nutrientes
El estudio del contenido de clorofila en las hojas de las plantas es un parámetro
importante para conocer su estado nutrimental (Peterson et al., 2003) ya que ciertos
elementos esenciales como el calcio, magnesio, azufre y nitrógeno, forman parte de
este pigmento y de otras proteínas, además tienen efecto importante en varias vías
metabólicas para la síntesis de carbohidratos y ácidos nucleicos, así al medir el
contenido de clorofila del tejido vegetal, da un reflejo de contenido nutrimental
(Resh, 1992; Gil, 1995; Taiz y Zeiger, 2006).
- 14 -
III. JUSTIFICACIÓN
Mediante hidrólisis enzimática con mexicaína refinada se pueden transformar
sustratos proteínicos para la generación de productos con valor agregado que
presentenpropiedades funcionales mejoradas y una actividad biológica potencial
como biofertilizantes en cultivos de interés comercial, contribuyendo así a generar
una tecnología agrícola más limpia, como alternativa, al manejo que se recomienda
actualmente. El uso de sustratos de origen vegetal como el aislado de soya y de
origen animal como la harina de pescado, son propuestos en este trabajo debido a
que existen diversos procesos industriales donde los residuos suelen ser
considerados un problema tanto ambiental como económico.
IV. HIPÓTESIS
Mediante la modificación vía enzimática con mexicaína de proteínas de soya y de
pescado, se espera una diversidad de especies peptídicas de diferentes tamaños
moleculares con características funcionales y biológicas de interés en un modelo
experimental de frijol.
V. OBJETIVOS
5.1 Objetivo General
Caracterizar la actividad biológica y funcional de las especies peptídicas generadas
por hidrólisis con mexicaína de proteínas de soya y de pescado, y analizar su
potencial biológico en plantas de frijol (modelo experimental).
5.2 Objetivos específicos
1. Obtener hidrolizados de proteínas de soya y de pescado por la acción de
mexicaína refinada.
2. Caracterizarlas propiedades funcionales de solubilidad, actividad emulsionante
y estabilidad de la emulsión delos hidrolizados enzimáticos.
3. Evaluar el efecto biológico de los hidrolizados enzimáticos en un modelo de
frijol azufrado.
- 15 -
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
Con el fin de cumplir con los objetivos que se plantearon en este trabajo, se describe el siguiente diagrama experimental:
Figura 3. Diagrama experimental
6.1 Materiales
6.1.1 Sustratos Se utilizaron dos fuentes de proteínas, una de origen vegetal y otra de origen
animalpara los sustratos (Cuadro 3).
Cuadro 3. Fuentes de proteína de sustratos proteínicos.
Fuente proteica Presentación Origen Especificaciones
Soya Aislado de proteína Vegetal PRO FAM 646, ADM®
- 16 -
Pescado Harina Animal Sistema Productos
Pelágicos Menores de
Baja California Sur, A.C.
(sin especificaciones).
6.1.2 Proteasa vegetal Se usó la proteasa cisteínica mexicaína refinada, la cual es una proteína proteolítica
obtenida del látex de Pileus mexicanus mediante el procedimiento del Laboratorio de
Enzimas Vegetales del CeProBi-IPN (Briones-Martínez et al., 1994 y 1997)
6.1.3 Cultivo modelo de frijol El modelo experimental fue el frijol azufrado (frijol peruano), que fue mantenido en
macetas de 10 L, en mezcla CeProBi (Turba: PindstrupSphagnum®*/Agrolita:
agroLITA®*/Vermiculita: agroLITA®*) en relación 60/20/20.
*Anexos: 1, 2 y 3.
6.2 Determinación de nitrógeno amínico (Kjeldahl) en harina de pescado El contenido de proteína de la harina de pescado fue determinado por el método de
Kjeldahl (1883), para lo cual se pesó1 g de harina de pescado (por triplicado), que
secolocaron en los tubos para digestión, se agregaron 15 ml de ácido sulfúrico,
además de 10 g de sulfato de potasio y 1 g de sulfato cúprico para efectuar
unaoxidación de la muestra orgánica y la transformación del nitrógeno orgánico a
amoníaco. Se colocaron los tubos sobre el equipo de digestión (BüchiDigestionUnit
K-424) que a su vez estaba conectado al equipo de captación de gases
(BüchiScriubber B-414), durante 2 h, hasta que las muestras presentaron un color
azul turquesa que indica que la digestión fue completa. Una vez trascurrido el tiempo
las muestras se retiraron del equipo de digestión, y se dejaron enfriar por 15
min.Antes de que las muestras se enfriaran completamente, se agregaron 10 ml de
H2O destilada. Los tubos se colocaron ahora en el equipo para su neutralización con
NaOH y su destilación, el amoníaco destilado se recuperó en un matraz con 100 ml
- 17 -
de ácidobórico 1 M. Posteriormente se titularon las muestras con HCl 0.1 M.La
cuantificación del porcentaje de nitrógeno se obtuvo mediante la ecuación:
% N= mLAc. * N * meq * F (6.25) * 100
%N= Porcentaje de nitrógeno
mL Ac= ml de ácido gastado
N= Normalidad del ácido
Meq = Miliequivalentes del ácido utilizado
F= 6.25Factor Kjeldahl (Adler-Nissen, 1986)
6.3 Obtención de hidrolizadospor la acción de mexicaína refinada La hidrólisis se hizo bajo condiciones de pH constante (pH 8) según Briones-Martínez
et al. (1994), el aislado de proteína de soya y la harina de pescado se usaron a una
concentración del 5% (p/v), empleando la preparación proteolítica de mexicaína
refinada al 0.2% (p/v) en regulador de fosfatos pH 8, durante 5 h a 35 °C en
presencia de cisteína como activador catalítico, posteriormente se centrifugaron las
mezclas de reacción y se obtuvo el sobrenadante que contiene las especies
peptídicas solubles.
6.4 Caracterización bioquímica de los hidrolizados enzimáticos
6.4.1 Determinación de la distribución de pesos moleculares aparentes
a) Electroforesis unidimensional
Previamente a la determinación se preparó el regulador de corrida (Tris 0.3 %, glicina
0.14 % y dodecil sulfato de sodio (SDS) 0.1%). Para la preparación de los geles de
acrilamida, primeramente se preparó el gel separador al 12 % (Acrilamida, regulador
del gel pH 8.8, agua destilada, SDS 10%, persulfato de amonio (PSA) 10% y
N,N,N´,N´-tetrametilen-diamina (TEMED)) y posteriormente el gel concentrador al 5
- 18 -
% (acrilamida, regulador del gel pH 6.8, agua destilada, SDS 10 %, PSA 10% y
TEMED). La preparación de la muestra se hizo de la siguiente forma: en un tubo
eppendorf de 1.5 ml, se colocaron 15µl de la muestra y se añadieron 10 µl del
regulador de muestra (glicerol 50%, SDS 10%, 1% de azul de bromofenol al 1 % y
Tris 1 M 0.6%), se incubó durante 5 min en agua en ebullición, cada muestra se dejó
enfriar a temperatura ambiente, para ser inyectadasen los carriles de los geles de
poliacrilamida. La corrida se llevó al cabo durante 2 h a 20 mA por gel. Este método
se realizó según lo reportado por Schägger y Von Jagow (1987) en una cámara de
electroforesis Mini PROTEAN 3 cell (BIO-RAD) (Tiselius 1930).
b) Electroforesis bidimensional
• Primera dimensión Primeramente, las proteínas se separan con base en su punto isoeléctrico (PI) en
gradientes de pH (3 a 10) inmovilizados (IPGs). El primer paso para realizar este
ensayo es la hidratación de la muestra con la tira de gradiente de pH (IPG) de una
longitud de 11 cm de un intervalo de pH de 3 a 10 poniendo la tira en la charola de
hidratación que este en contacto con 0.625 µl del regulador IPG pH3 a 10 más 0.5 ml
del regulador de hidratación durante 12 h a 30°C. Se añadieron aproximadamente
2.5 ml de aceite mineral para evitar la evaporación de la solución.Posteriormente las
tiras se retiraron de lacharola de hidratación y se colocaron sobre la charola de
cerámica previamente puesta en el equipo de isoelectroenfoque (EttanIPGphor 3, GE
Healthcare) y nivelada. Se colocaron los protectores una vez humedecidos en agua
destilada en los extremos de la tira para evitar su movimiento. Se agregó aceite
mineral a toda la charola. Se colocaron los electrodos sobre los protectores, y se
aseguraron los electrodos con las compuertas haciendo contacto con la placa de oro
del equipo. Se programó el equipo de isoelectroenfoque en el protocolo 4 con uso de
75 mA.Se removieron las tiras del equipo y se colocaronen un tubo de plástico de 15
ml, para proceder con la segunda dimensión.
- 19 -
• Segunda dimensión (Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes)
Se realizaron 2 lavados a las tiras, el primero con una solución 10 mg/mlde ditiotreitol
(DTT) en regulador de equilibrio SDS (Urea 6M, Tris-HCl 74 mM, Glicerol 87 %, SDS
2%, Azul de bromofenol 1%, H2O destilada) durante 15 min con agitación moderada.
El segundo lavado se realizó con una solución 25 mg/ml de iodoacetamidaen
regulador de equilibrio SDS durante 15 min con agitación moderada.Se puso la tira
sobre el gel de acrilamida (12 %) previamente preparado y se fijó con agarosa, la
electroforesis se llevó a cabo durante 2 h con 40 mA.Terminada la corrida de
electroforesis se tiñeron los geles con azul de coomassie (Bio-Safe Coomassie, BIO-
RAD) durante 30 min y se realizaron 3 lavados con exceso de agua destilada.
6.4.2 Separación de péptidos por cromatografía Con la finalidad de separar las especies proteínicas presentes en los hidrolizados
enzimáticos, se usóSephadex G-120 (Sigma) para su separación por peso molecular
y carboximetil celulosa (CMC), como intercambiador catiónico.Las fracciones que se
colectaron, fueron leídas en un espectrofotómetro marca Shimadzu UV-160 a 280
nm. Los resultados fueron reportados en cromatogramas mostrando el perfil de
absorbancia contra el número de fracción.
a) Cromatografía por exclusión de tamaño molecular Se usó Sephadex-120 (Sigma) en una columna de 26 cm de longitud por 1.5 cm de
diámetro, que fue sometido a un pre tratamiento, para lo cual se hicieron 3 lavados
con agua destilada a 40 °C durante 1 h cada uno, manteniendo una agitación
constante y moderada. Al término de los 3 lavados se dejó en reposo durante 2 h. Se
realizaron 2 lavados más con exceso de agua destilada a 40 °C durante 30 min cada
uno, y al término se dejó 1 h en reposo. Se decantó el agua que no fue absorbida por
el Sephadex. Se hizo el mismo procedimiento pero ahora con uso de un regulador de
citratos 20 mM pH 4.9, en lugar del agua destilada con el fin de acondicionar el gel.
Se procedió a empacar la columna y se dejo su empaquetamiento durante 2 h y se
hicieron pasar 3 volúmenes del regulador de citratos 20 mM pH 4.9. La muestra a
- 20 -
analizar se colocóen la columna y se eluyó con un volumen de regulador de citratos,
se colectaron fracciones manualmente de 1.5 ml cada minuto que fueron leídas a
280 nm. Se realizó la curva de las fracciones colectadas para realizar los
cromatogramas y visualizar los picos de las especies peptídicas.
b) Cromatografía por intercambio catiónico Para la cromatografía de intercambio catiónico por lotese utilizó la resina carboximetil
celulosa (CMC), se hizo un pre tratamiento, para lo cual se llevaron al cabo lavados
con una solución de cisteína 0.002 M por 2 h a la CMC, posteriormente se filtró y se
efectuó otro lavado con una solución de NaOH 0.5 M + NaCl 0.5 M, después se
hicieron dos lavados con exceso de agua destilada, y finalmente se hizo el
acondicionamiento de la CMC, el cual consistió en mantener 2 h con regulador de
citratos 20 mM pH 4.9. La cromatografía se realizó en un vaso de precipitados donde
la muestra a analizarse mezcló con la CMC, y se mantuvo en agitación durante 30
min, se procedió a hacer una filtración para retirar el sobrenadante, y posteriormente
3 lavados con el regulador de citratos pH 4.9 con el fin de retirar la muestra que no
fue retenida por el intercambiador catiónico (CMC), después de esto se llevaron dos
lavados más, con cada una de las soluciones del gradiente de NaCl (0.2, 0.4, 0.8, 1.2
y 1.6 M), después de cada lavado se recuperó el sobrenadante el cual fue leído a
280 nm.
6.4.3 Propiedades funcionales
a) Solubilidad en función del pH
Para determinar la solubilidad de proteína en función del pH se siguió el método de
Kabirullah y Wills (1982), el cual consistió en ajustar el pH de las muestras a 3, 5, 7,
9 y 11, posteriormente se agitó durante 30 min y se centrifugaron a 9000 rpm durante
15 min y se midió la absorbancia de los sobrenadantes a 280 nm (As 280 nm). Los
datos de As obtenidos fueron usados para elaborar los perfiles de solubilidad de
cada hidrolizado comparado con los sustratos no tratados enzimáticamente. b) Solubilidad en función del pH (Proteína por Lowry)
- 21 -
Se utilizó el mismo método y se determinó el contenido de proteína soluble mediante
el método de Lowry et al. (1951).
La muestra (200 µl) se colocó en un tubo de vidrio para añadir 50 µl del reactivo A y
posteriormente 2.5 ml del reactivo C, esta mezcla se homogeneizo durante 1 minuto
y se dejó en reposo por 10 min más, al finalizar el tiempo se adicionaron 250 µl del
reactivo D, se mezcló perfectamente y se dejó en reposo por 30 min, transcurrido el
tiempo se midió la absorbancia a 600 nm.
Reactivo A: Solución al 2 % de Na2CO3 en NaOH 0.1 N.
Reactivo B: Solución al 0.5 % de CuSO45 H2O en citrato de sodio al 1 %.
Nota: El agua tiene que hervirse antes de preparar las soluciones
Reactivo C: 1 ml de reactivo B + 50 ml de reactivo A (preparar al momento)
Reactivo D: Reactivo de Folin-Ciocalteau con dos volúmenes de agua destilada.
c) Actividad emulsionante de proteínas de soya y de pescado
Las propiedades emulsionantes de las dispersiones se determinaron mediante el
método de Pearce y Kinsella(1978) con modificaciones en el pH, en un intervalo de
pH de 3, 5, 7, 9 y 11. Las fracciones proteínicaspreviamente ajustada a los diferentes
pH, se mezclaron con aceite de maíz en una proporción de 3:1 y se sometieron a
agitación durante 1 min. Inmediatamente después de la homogeneización se
tomaron cuidadosamente del fondo del tuboalícuotas de 0.25 ml y se diluyeron con 5
ml de una solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 2% en regulador de fosfatos
0.1 M pH 7.4, para medir su absorbancia contra un blanco de regulador a 500 nm en
un espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu UV-160). Los análisis se realizaron por
triplicado.
Las Unidades de Actividad Emulsionante (UAE/mL) se calcularon como lo reporta
Palma-Rodríguez (2008).
UAE/mL = As X * 20 / mL X
- 22 -
As X: Absorbancia a 500 nm
20: Factor de dilución
mL X: Volumen del aceite (ml)
d) Determinación de la estabilidad de la emulsión
La estabilidad relativa de las emulsiones preparadas en este estudio se midió por el
método de Pearce y Kinsella (1978), se tomaron alícuotaspor triplicado de 0.25 ml a
tiempos de 0, 1, 3, 5, 10 y 15 min después de la homogeneización, agregando5 ml
de dodecil sulfato de sodio (SDS) 2% y se leyó la absorbancia a 500 nm. Para
comparar la estabilidad de las emulsiones de cada pH, se hizo mediante el cálculo
del tiempo medio de estabilidad de la emulsión (Tm),mediante la siguiente formula:
Am= ((Ai – Af)/2) + Af
Dónde:
Am= Absorbancia media
Ai: Absorbancia inicial
Af= Absorbancia final
Una vez obtenido el valor de Am para cada tratamiento se interpola para conocer el
Tm.
6.5 Evaluación del efecto de los hidrolizados enzimáticos en plantasde frijol azufrado
Para la evaluación el efecto de los hidrolizados enzimáticos en las plantas de frijol se
establecieron 5 tratamientos experimentales cada uno con 5 unidades
experimentales (Cuadro 4). Se efectuaron 3 aplicaciones de 20 ml del sobrenadante
a las plantas de frijol, a los 12, 17 y 22 días después de la emergencia de la semilla.
- 23 -
Cuadro 4.Tratamientos experimentales
Tratamiento Contenido Abreviatura
Hidrolizado de soya Sobrenadante con especies
peptídicas solubles
HS
Aislado de soya Sobrenadante con proteínas no
hidrolizadas
AS
Hidrolizado de
pescado
Sobrenadante con especies
peptídicas solubles
HP
Harina de pescado Sobrenadante con proteínas no
hidrolizadas
SP
Testigo Agua destilada T
6.5.1 Variables a evaluar en las plantas tratadas Con el fin de conocer el efecto que tuvieron los hidrolizados enzimáticos de proteínas
de soya y de pescado en el desarrollo y crecimiento de las plantas de frijol, se
midieron 4 variables las cuales fueron:
a) Grosor del tallo
Con un vernier, se midió el grosor del tallo de la planta al nivel del cuello del tallo,
cada 7 días y el resultado se reportó en milímetros (mm).
b) Altura de las plantas
Se midió la altura de las plantas con una regla,del cuello al ras del sustrato hasta la
hoja más alta, y se reportó el resultado en centímetros (cm). Esta medición se hizo
cada 7 días después del día cero (12 días después de la emergencia de la semilla).
c) Determinación de clorofila (Método de Lichtenthaler, 1978)
Se prepararon extractos de 0.5 g de hojas con acetona al 80 % para después
centrifugar a 9000 rpm durante 10 min y medir la absorbancia del sobrenadante a
- 24 -
una longitud de onda de 663 nm para la clorofila “a” y 646 nm para la clorofila “b” en
un espectrofotómetroUV-Vis (Shimadzu UV-160). Los resultados fueron reportados
como µg de pigmento por gramo de hoja.
d) Rendimiento de fruto Se colectaron y se pesaron las vainas de frijol cuando se observó una coloración
amarillo limón, que indica que el fruto está maduro, el rendimiento se reportó en
gramos por planta (g/planta), así como gramos por lote (g/lote).Se estimó un
rendimiento de kilogramos de fruto por hectárea (kg/ha)de acuerdo con
recomendaciones de INIFAP (2002 y 2011), para el cálculo de plantas por hectárea.
6.5.2 Mantenimiento del cultivo de frijol
El cultivo de las plantas de frijol azufrado fue mantenido en condiciones de
invernadero como se observa en el Figura 4, bajo malla negra. De modo comparativo
se observan diferencias entre la altura de las plantas y la coloración de las hojas,
demostrando de forma esquemática los efectos de los tratamientos sobre el modelo
experimental. Para un análisis comparativo se realizaron la evaluación de las
variables antes descritas.
- 25 -
Figura 4. Cultivo experimental de frijol azufrado bajo condiciones de invernadero
6.6 Análisis Estadístico Se realizó un análisis de varianza de una víautilizando el programa SigmaPlot
(versión 11.0) y la prueba de comparación de medias de Tukey (P<0.05).
- 26 -
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1 Contenido de proteína en sustratos
El contenido de proteína en la harina de pescado determinado por el método de
Kjeldahl y el contenido en el aislado de soya se muestran en el Cuadro 5.
Cuadro 5. Contenido de proteína en sustratos
Fuente proteica Contenido de proteína
Aislado de soya 90 % *
Harina de pescado 63.43 % ±0.43 *Fuente: PRO-FAM 646, ADM®
Los resultados del contenido de proteína muestran que el aislado de soya presenta
una mayor cantidad de proteína, dado que es un producto comercial el cual ya fue
tratado mediante métodos fisicoquímicos para eliminar componentes como
oligosacáridos, grasa, entre otros, para purificar la proteína de soya, la
determinación fue realiza por el método de Kjeldahl (PRO-FAM, ADM®, 2010),
mientras que la harina de pescado tieneun menor contenido de proteína al no recibir
ningún tratamiento de purificación para concentrar la proteína, y no fue caracterizado
por el productor (Sistema Producto Pelágico Menores de B.C.S. A.C. 2011). Estos
resultados muestran que el aislado de soya presenta más proteína disponible para
ser hidrolizado por la mexicaína en comparación con la harina de pescado, además
de que por su alto contenido de proteína es menor el porcentaje de compuestos no
deseados que puedan interferir en la hidrólisis como en el caso de la harina de
pescado que puede contener aceites y cenizas.
7.2 Caracterización de la hidrólisis por acción de mexicaína refinada
La evolución de la hidrólisis de las proteínas de soya se observa en la Figura 5,
donde de modo comparativo también se puede ver la curva del aislado de soya la
cual se mantuvo bajo las mismas condiciones que el hidrolizado pero sin efecto de la
- 27 -
mexicaína. Los valores en la absorbancia con respecto al tiempo fueron mayores en
el hidrolizado de soya comparado con la proteína no hidrolizada (aislado); lo que
refleja el rompimiento de los enlaces peptídicos que unen a las proteínas blanco del
sustrato de soya, por lo cual se infiere que hay una modificación en las proteínas por
efecto de la mexicaína, y esto va en aumento tras el paso del tiempo de hidrólisis,
existiendo una generación de especies peptídicas por acción de la proteasa.
Figura 5. Curso de la hidrólisis de proteínasde soya por efecto de mexicaína refinada
En la Figura 6 se observa la curva dehidrólisis de las proteínas de pescado con
respecto al tiempo,se aprecia que conforme transcurren los minutos de hidrólisis hay
la aparición de nuevos péptidos de bajo peso molecular por la presencia de picos
que son apreciados por una mayor absorbancia en comparación con el testigo
(harina) como se aprecia en el minuto 190; además aumentan los productos de
reacción que absorben a 280 nm, residuos de aminoácidos con grupos aromáticos,
indicando que las proteínas de pescado fueron susceptibles a modificación por efecto
de la mexicaína.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 50 100 150 200 250 300 350
As
(280
nm
)
Tiempo (min)
Hidrolizado de soya
Aislado de soya
- 28 -
Figura 6.Curso de la hidrólisis de proteínas de pescado por efecto de mexicaína refinada
7.3 Caracterización bioquímica de los hidrolizados enzimáticos
7.3.1 Distribución de peso molecular aparente
Se analizó la fracción soluble de los hidrolizados, donde se encontraron péptidos de
bajo peso molecular en el hidrolizado de soya, comparado con el aislado de soya no
tratado enzimáticamente, que presenta al menos 3 bandas que representan diversos
pesos molecularesque van desde 30, 28 y 26 kD (Figura 7), y en el hidrolizado de
soya solo se aprecia una banda que está por debajo de los 27 kD, este cambio de
pesos moleculares de las proteínas del aisladocon respecto a las nuevas presentes
en el hidrolizado es un efecto de la mexicaína, la cual por su modo de acción generó
nuevas especies peptídicas de bajo peso molecular en el HS. Los resultados de la
separación electroforética de las proteínas de pescado se muestran en la Figura 8,
donde el sustrato de pescado en la electroforesis unidimensional, manifiesta que la
mexicaína modificó el peso molecular de las proteínas nativas, viéndose una
disminución en el tamaño molecular, ya que en el hidrolizado de pescado solo se
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 50 100 150 200 250 300 350
As
(280
nm
)
Tiempo (min)
.
Hidrolizado de pescado
Harina de pescado
- 29 -
aprecia una banda de alrededor de 48 kD, mientras que en la harina de pescado se
aprecian 2 bandas, la mayor de alrededor de 50 kD y la segunda de 48 kD (Figura 8).
Figura 7.Separación por electroforesis unidimensional de proteínas de soya.
(MPM: Marcador de Peso Molecular; HS: Hidrolizado de soya; AS: Aislado de soya)
Figura 8.Separación por electroforesis unidimensional de proteínas de pescado.
(MPM: Marcador de Peso Molecular; HP: Hidrolizado de pescado; SP: Harina de pescado)
- 30 -
El análisis por electroforesis bidimensional del hidrolizado de soya, mostró un cambio
de peso molecular en el aislado con respecto al hidrolizado que ya se comprobó por
la electroforesis unidimensional;pero además se pudo demostrar mediante esta
técnica un cambio químico en los péptidos resultantes, ya que el punto isoeléctrico
(PI) se vio modificado de las proteínas no tratadas enzimáticamente a los péptidos
del hidrolizado de soya. En el hidrolizado de soya se observa la presencia de
proteínas o péptidos de bajo peso molecular (menor a 30 kD) con un PIentre 3 y 4
(Figura 9), mientras que las proteínas no modificadas presentes en el aislado de
soya (Figura10) tienen un PI de alrededor de 4 a 6, esto muestra que la mexicaína no
solo tuvo efecto en el tamaño molecular de las proteínas, infiriéndose que también
hizo un cambio en la estructura, que afecta de modo directo las características
químicas de los péptidos, en este caso en particular reflejado como un cambio en su
PI.
Figura 9. Perfil electroforético bidimensional del hidrolizado de soya (HS)
(MPM: Marcador de Peso Molecular)
- 31 -
Figura 10. Perfil electroforético bidimensional del aislado de soya (AS)
(MPM: Marcador de Peso Molecular)
7.3.2 Separación e identificación de péptidos por cromatografía
a) Cromatografía por exclusión de tamaño molecular En la Figura 11se observa que el aislado de soya presentó al menos dos
componentes mayoritarios, el primero de ellos de mayor peso molecular, pero menos
abundante que el segundo ya que presentó valores de absorbancia de 0.2, el
segundo componente se infiere es de menor peso molecular por la velocidad se
salida y más abundante que el primero en relación al valor de absorbancia obtenido
que fue de 0.505,estos componentespudieran representar las proteínas β-
conglicinina y glicinina(Nielsen, 1985) por las fracciones obtenidas. Al hacer el uso
de la mexicaína se ven modificadas las proteínas nativas de la soya, ya que en el
hidrolizado se generó un pico mayoritario aparentemente homogéneo con una
absorbancia máxima de 0.659 entre las fracciones 40 y 70, y se puede sugerir que
son moléculas de menor peso molecular que las presentes en el aislado por el
número de fracción donde aparece.
- 32 -
Figura 11.Separación cromatográfica en Sephadex G-120 de proteínas de soya
Los resultados obtenidos de la separación cromatográfica de las proteínas de
pescado se muestran en la Figura 12, se aprecia que en la harina de pescado se
eluyeron al menos dos componentes de diferentes tamaños moleculares, el primero
de ellos obtenido en las fracciones 10 a la 15, y el segundo a partir de la fracción 40
hasta la 60, sin embargo ambos fueron muy bajos en concentración teniendo una
absorbancia máxima de 0.158, de modo comparativo en el hidrolizado de pescado
se concentraron 2 componentes, el primero que se presenta se cree de mayor peso
molecular por encontrarse en la fracción 5, pero poco abundante con un valor de
absorbancia de 0.151, mientras que el segundo componente se aprecia
aparentemente más homogéneo encontrado en la fracción 15 a la 25
presuntivamente de menor peso molecular que el primero por el número de fracción
que se encuentra, y además es más abundante con una absorbancia máxima de
0.798, las diferencias encontradas entre sí, muestran que la mexicaína tiene un
importante efecto en cambiar el tamaño molecular de las proteínas blanco de la
harina de pescado.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
As
(280
nm
)
No. de Fracciones
Hidrolizado de soya
Aislado de soya
- 33 -
Figura 12.Separación cromatográficaen Sephadex G-120 de proteínasde pescado
Estos resultados sugieren quela modificación de las proteínas del aislado de soya y
de la harina de pescado dio como respuesta una distribución de tamaños
moleculares de péptidos muy semejante en los dos casos que se analizaron el la
fracción soluble de las mezclas de reacción, provocando que se generara una alta
proporción de péptidos de bajo peso molecular, esto apoyado por la desaparición de
proteínas de alto peso molecular que se observó en los perfiles electroforéticos
(Braskaret al., 2007, Chalamaiah et al., 2010).
b) Cromatografía por intercambio catiónico
El perfil de absorbancia obtenido mediante cromatografía por intercambio catiónico
por lote de las proteínas de soya muestra que hay un fracción importante de péptidos
que presentan una fuerza iónica bajaesto porque se presentaron al usar el NaCl de
0.2 M y sus valores de absorbancia fueron de 0.422 para el AS y de 0.389 para HS,
otras fracciones de péptidos fueron extraídos en menor cantidad pero con un mayor
gradiente del eluyente que fue desde 0.4, 0.8 y 1.2 M, finalmente se aprecia que
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
As
(280
nm
)
No. de Fracciones
Hidrolizado de pescado
Harina de pescado
- 34 -
aunque en menor abundanciase encuentran componentes aun con el NaCl de 1.6 M,
con valores de absorbancia 0.145 para el AS y de 0.143 para el HS, estos últimos
péptidos encontrados en este lugar se infiere que presentaron una fuerte atracción
con el soporte (CMC) (Figura 13), como conclusión se aprecia que el carácter
químico de las proteínas extraídas es diverso, no solo se concentra en una región,
además estos resultados muestran que no hay cambios relevantes en las
características químicas de los péptidos obtenidos mediante la hidrólisis enzimática
con mexicaína al compararlos con su testigo.
Figura 13. Separación por cromatografía de intercambio catiónico (CMC) de proteínasde soya.
---Gradiente de NaCl (0.2 M – 1.6 M).
Los cambios que resultaron de las proteínas o péptidos del hidrolizado de pescado
(HP) fueron analizados por cromatografía de intercambio catiónico, y asu vez se
comparó con su testigo (SP), donde se observó quela mexicaína tuvo un efecto
importante en modificar las características químicas de las proteínas de pescado, ya
en el HP se presentaron componentes que necesitaron una fuerza iónica alta de 1.4
y 1.6 M (NaCl) del gradiente para hacer la obtención de estas fracciones que tenían
- 35 -
mayor afinidad por el intercambiador, mientras que para el SP los componentes más
abundantes fueron extraídos con una fuerza iónica baja de 0.2 M (NaCl), y solo una
pequeña cantidad fue obtenida en la mayor fuerza iónica del eluyente. Se apreció
una diferencia en las fracciones extraídas del hidrolizado pescado con respecto a las
obtenidas de la harina pescado (Figura 14). Estos cambios fueron mayores que en el
caso de las proteínasde soya, ya que en el pescado puede haber ciertos
componentes del hidrolizadoque presentan mayor afinidad y fuerza con la que se
unen a la fase estacionaria, y por lo tanto requieren de una mayor fuerza iónica para
ser removidos, mientras que este mismo perfil no se muestra con las proteínas no
sometidas a hidrólisis, donde los componentes que se obtuvieron tienen una carga
química menor.
Figura 14. Separación por cromatografía de intercambio catiónico (CMC) de proteínas de pescado.
---Gradiente de NaCl (0.2 – 1.6 M).
- 36 -
7.3.3 Propiedades funcionales a) Solubilidad en función de pH
El perfil de solubilidad (Figura 15) muestra un incremento enespecies peptídicas
solubles para el hidrolizado de soyarespecto a las proteínas no modificadas (AS) en
el intervalo de pH con un pico a pH de 5, además se puede ver que la solubilidad no
es dependiente del pH, ya que no hay cambios importantes según el pH en el que se
encuentren los péptidos (Figura 15a). La mejor solubilidad fue encontrada en el
hidrolizado de soya en el pH 5, con un valor de absorbancia de 1.8, mientras que
para el aislado de soya a ese mismo pH la absorbancia fue de 1.1. Las proteínas del
hidrolizado de pescado (HP) presentan una mayor solubilidad que las proteínas de la
harina de pescado no hidrolizadas (Figura 15b), y que esta propiedad funcional no se
está viendo afectada por un cambio en el pH en el HP, la mayor solubilidad para el
hidrolizado de pescado fue en el pH 7 con valor de absorbancia de 1.08, mientras
que para el SP para el mismo pH el valor de absorbancia fue de tan solo
0.51.Aunque menor fue la solubilidad del HP con respecto al HS, si hay un aumento
importante en las especies solubles en los hidrolizados con respecto a sus sustratos
no tratados enzimáticamente, mostrando que la mexicaína al degradar las proteínas
de alto peso molecular a péptidos de menor peso molecular da como resultado
productos más solubles tal como lo reporta Linderet al. (1996) y Gbogouri et al.
(2004).
Figura 15. Perfil de solubilidad de proteínasde soya(a) y de proteínas depescado (b) en relación con
el pH (As 280 nm) (HS: Hidrolizado de soya, AS: Aislado de soya; HP: Hidrolizado de pescado, SP: Harinade pescado)
pH
2 4 6 8 10 12
As
280
nm
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
HPSP
pH
2 4 6 8 10 12
AS
280
nm
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
HSAS
a) b)
- 37 -
Los resultados de solubilidad con respecto al contenido de proteína se muestran en
la Figura 15. Las proteínas del hidrolizadode soya en comparación con el aislado,
mostró un perfil muy interesante, ya que los resultados del contenido de proteína se
ven similares en el pH 3, mientras que en el pH 5 hay una diferencia muy importante
ya que el AS mostró un contenido de proteína de 22.4 mg/ml menor al HS el cual fue
de 5.5 mg/ml esto puede correlacionarsecon los resultados de la electroforesis
bidimensional; esto se puede atribuir a que las proteínas del AS presentan puntos
isoeléctricos de alrededor de 4 a 6, y al encontrarse a este intervalo de pH se
precipitan y por lo cual el resultado es el menor en relacióna los demás valores de pH
estudiados (Figura 16a) (Tsumura et al., 2005), también se muestra que la mexicaína
refinada por su modo de acción modifico las proteínas generando productos
proteínicos con cambios en su PI, mejorando con ello la solubilidad en el pH acido,
estos resultados coinciden con lo reportado por Chalamaiah et al., (2010) que la
hidrólisis enzimática provoca cambios en las cargas químicas de los péptidos
resultantes, y afectan directamente el punto isoeléctrico de los productos, de forma
general el HS fue más soluble que el AS.
El resultado de solubilidad para las proteínas de pescado con respecto al contenido
de proteína, muestra quela harina de pescadosin hidrolizar es poco soluble, mientras
que haciendo uso de la mexicaína se producen péptidos enel hidrolizado de pescado
que son más solubles (Figura 16b). La harina de pescado presentó un contenido de
proteína muy cercano a cero en toda la escala de pH medido, mientras que en el HP
el contenido de proteína alcanzo su máximo en el pH 7 siendo de 14.3 mg/ ml,
mientras que para el testigo a ese mismo pH el contenido de proteína fue de tan solo
1.31 mg/ml, además de que la solubilidad se mantiene mayor en el HP independiente
del pH.
. - 38 -
Figura 16.Perfil de solubilidad de proteínas de soya (a) y de proteínas de pescado (b) en relación con
el pH (Proteína por Lowry).(HS: Hidrolizado de soya, AS: Aislado de soya;HP: Hidrolizado de pescado, SP:
Harinade pescado).
Estos resultados muestran que la mexicaína refinadamodifica de modo importante a
las proteínas de los sustratos, dando como resultadoproductos más solubles
comparados con sus testigos,tal como lo reporta Chalamaiah et al. (2010). Esta
propiedad funcional muestra las características de hidrofilicidad de las proteínas
hidrolizadas, ya que la hidrólisis enzimática no solo cambió el tamaño molecular de
las proteínas de los sustratos, sino también su estructura y se infiere provocó que
grupos amino y carboxilo queden expuestos y sean ionizados (Mutilangiet al., 1996)
generándose una alta solubilidad.
b) Actividad emulsionante de proteínas de soya y de pescado
En los resultados en la actividad emulsionante (AE) de las proteínas de soya (Figura
17a), se observa que según el pH donde se encuentren las proteínas determinarán
su AE; se observó que en el intervalo de pH ácido (3 y 5),la actividad emulsionante
es menor con respecto al pH alcalino (9 y 11), siendo la región de pH alcalina donde
se encuentra la mayor actividad emulsionante tanto en el HS como en el AS. El AS
mostró una menor actividad emulsionante que el HS en el medio ácido, siendo de 8.1
UAE/mL para el pH 3 y de 5.5 UAE/mL para el pH 5, pero mayor en el medio alcalino
de 18.5 UAE/mL para el pH 9 y de 16. 4UAE/mL para el pH 11, siendo el pH 9 el que
mostró la mayor AE para el AS, mientras que para el HS la mayor AE se encontró en
a) b) pH
2 4 6 8 10 12
Con
teni
do d
e pr
oteí
na (m
g/m
l)
0
5
10
15
20
25
HPSP
pH
2 4 6 8 10 12
Con
teni
do d
e pr
oteí
na (m
g/m
l)
0
5
10
15
20
25
HSAS
- 39 -
el pH 11 con 13.86 UAE/mL; lo que muestra que mediante la hidrólisis enzimática
con mexicaína se modificaron las propiedades hidrofóbicas de las proteínas,
teniendo menor actividad emulsionante en el hidrolizado en la región alcalina y mayor
en la región acida, además de que el pH también tuvo una importante participación al
alterar las cargas de las proteínas (Gbogouriet al., 2004; Wang et al., 2006).
pH
2 4 6 8 10 12
Cap
acid
ad e
mul
sion
ante
(UA
E/m
L)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
HSAS
pH
2 4 6 8 10 12
Cap
acid
ad e
mul
sion
ante
(UAE
/mL)
0
5
10
15
20
HPSP
Figura 17. Actividad emulsionante de proteínas de soya (a) y de proteínas de pescado (b). (HS: Hidrolizado de soya, AS: Aislado de soya;HP: Hidrolizado de pescado, SP: Harina de pescado)
Los resultados de la actividad emulsionante del HP y SP, muestran que se mantiene
una tendencia al aumento de actividad emulsionante al ir incrementando el pH de 3 a
11, ya que a pH ácidos (3 y 5) la actividad emulsionante (AE) es menor, que va de
1.7 UAE/mL en el HP y de 0.8 UAE/mL en el SP para pH 3, y conforme se hace un
aumento en el pH se aumenta la AE teniendo en el pH 11 los valoresmáximos de
12.09 UAE/mL para el HP y de 12.11 UAE/mL para el SP (Figura 17b) (Wuet al.,
2009), con esto último se muestra que la hidrofobicidad de las proteínas es
susceptible a los cambios de pH (Wang et al., 2006), así también se observa que no
hubo cambios relevantes en la hidrofobicidad de las proteínas tratadas
enzimáticamente (HP) con las respecto al testigo de la harina de pescado. Las
proteínas de ambos sustratos demostraron tener características hidrofobicas e
hidrofilicas en su superficie que permiten una buena interacción con las fases que
a) b)
- 40 -
tiene como resultado una mayor actividad emulsionante en el intervalo de pH alcalino
(Kristinsson y Rasco, 2000; Gbogouriet al., 2004;Klompong et al., 2007).
c) Estabilidad de la emulsión
La tendencia estabilidad de las emulsiones (EM) de las proteínasde soyase estudió
en la escala de pH de 3 a 11 (Figura 18). Los resultados de tiempo medio (TM)
muestran que las proteínas del aislado de soya (AS) a pH 9 son las que presentan
mayor estabilidad emulsionante en comparación con los demás pH estudiados,
seguido por el pH 11, 7, 3 y 5, este último fue el que presentó la menor estabilidad y
actividad emulsionante (Cuadro 6). Para el caso del hidrolizado de soya el pH que
mostró mayor estabilidad emulsionante fue el pH 11, el cual obtuvo también la mayor
AE, mientras que el pH 5 fueron las que tuvieron menor EM. Finalmente se puede
ver que dentro de los dos tratamientos con soya (AS e HS)el que obtuvo la mayor AE
fue el AS a pH 9, mientras que la muestra que obtuvo la mayor EM fue el HS a pH
11, estos resultados coinciden con lo reportado por Jamdaret al., (2010) quien
encontró una mayor AE y EM en hidrolizados de proteína de maní en la región
alcalina de pH.
Tiempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
As 5
00 n
m
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11
Tiempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
As 5
00 n
m
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH11
Figura 18.Perfil de estabilidad de la emulsiónde proteínas de soya. a) Aislado de soya (AS) y b)
Hidrolizado de soya (HS).
a) b)
- 41 -
Cuadro 6. Actividad emulsionante y estabilidad de la emulsión de proteínas de soya.
Tratamiento Actividad emulsionante
(UAE/mL)
Estabilidad de la emulsión (Tm)
(min)
AS (pH 3) 5.76 0.8
AS (pH 5) 2.63 0.65
AS (pH 7) 15.02 1
AS (pH 9) 18.59 4.7
AS (pH 11) 16.46 1.8
HS (pH 3) 8.1 2.4
HS (pH 5) 5.51 1
HS (pH 7) 10.5 3.7
HS (pH 9) 9.67 2.2
HS (pH 11) 13.86 10.5
Los resultados de la tendencia de estabilidad emulsionante de las proteínas de
pescado con respecto al pH se muestran en la Figura 19. El análisis comparativo de
los tiempos de EE en las proteínas no hidrolizadas de la harina de pescado (SP),
muestran que hay una estrecha relación entre todos los pH estudiados, encontrando
que el máximo valor de EM se observó en el pH 11, el cual también mostró la mayor
AE (Cuadro 7). Para el caso del hidrolizado de pescado el máximo en EM fue visto
en el pH 5, y el mínimo en los pH 9 y 11, a pesar de que estos dos últimos fueron los
que mostraron la más alta AE en la escala de pH estudiado.
- 42 -
Tiempo(min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
As 5
00 n
m
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11
Tiempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
As 5
00 n
m
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11
Figura 19.Perfil de estabilidad de la emulsión de proteínas de pescado. a) Harina de pescado (SP) e
b) Hidrolizado de pescado (HP)
Cuadro 7. Actividademulsionante y estabilidad de la emulsión de proteínas de pescado.
Tratamiento Actividad emulsionante
(UAE/mL)
Estabilidad de la emulsión (Tm)
(min)
SP (pH 3) 0.8 1
SP (pH 5) 4.22 5
SP (pH 7) 5.4 5.6
SP (pH 9) 8.26 5.1
SP (pH 11) 12.11 6.2
HP (pH 3) 1.78 2
HP (pH 5) 3.82 5.7
HP (pH 7) 5.64 5
HP (pH 9) 7.25 2.5
HP (pH 11) 12.09 2.5
a) b)
- 43 -
Las diferencias encontradas entre los resultados de EE de los hidrolizados con
respecto a los sustratos no modificados, muestran que la mexicaína modifico las
superficies hidrofobicas de los proteínas, y que de igual manera la AE pudo verse
afectada, estos dos procesos son evidencia de que los cambios ocurridos son
dependientes de la estructura y características químicas de los péptidos o proteínas
que se usen (Walstra y Smulders, 1997).
7.4 Evaluación del efectobiológico de los hidrolizados enzimáticos en plantas de frijol azufrado
Los resultados de la cuantificación de los tratamientos que fueron aplicados a las
plantas de frijol se muestran en el Cuadro 8.
Cuadro 8. Contenido de proteína en las preparaciones proteínicas (tratamientos).
Tratamiento Contenido de proteína (mg/ml)
Proporción
Aislado de soya 14.86±0.25b 0.765
Hidrolizado de soya 19.4±0.65ª 1
Harina de pescado 1.31±0.04c 0.067
Hidrolizado de pescado 13.49±0.32b 0.069
Testigo 0 0 Cada valor de la tabla fue la media de 3 repeticiones ± el eem, N=3
Misma letra indica que no hay diferencia significativa (Tukey, P<0.05).
Con el contenido de proteína de cada tratamiento, se utilizó el de mayor cantidad
para determinar las proporciones de cada uno. El tratamiento que contenía mas
proteína fue el HS, posteriormente el AS, entre los cuales hay diferencia significativa,
entre el HP y SP el que contiene mayor proteína es el hidrolizado, y hay una
diferencia importante entre este y la harina de pescado. Estos contenidos de proteína
pudieran ser no relevantes en el efecto que causan sobre las plantas de frijol, más
- 44 -
bien la respuesta a la aplicación de los tratamiento pudiera estar influenciada por
algún componente bioactivo como aminoácidos libres en un caso específico la
glutamina que aunque no fue medido presenta una actividad biológica potencial
como activador del crecimiento vegetativo (Majerowiczet al., 2000), o también como
otros autores lo reportan, péptidos de bajo peso molecular pueden estar presentes
en los 4 tratamientos y producir un efecto similar (Parrado et al., 2008; Romero-
García et al., 2012).
7.4.1 Variables evaluadas en las plantas tratadas
a) Grosor del tallo y altura de las plantas Grosor: Los resultados muestran que las plantas testigofueron las que mostraron el
menor grosor de tallo, además de que comparados con los 4 tratamientos hay
diferencia significativa (Cuadro 9). En los tratamientos con soya se encontró que no
hay diferencia significativa entre el hidrolizado y el aislado, cabe mencionar que si
hay diferencia significativa entre el grosor de las plantas del hidrolizado de pescado y
el hidrolizado de soya, viéndose un mayor en este último. Con respecto al
tratamiento de con proteínas de pescado no existe diferencia significativa entre el
hidrolizado y la harina.
Altura:La altura de las plantas también fue otro parámetro considerado en el análisis
de los cambios ocurridos en las plantas por efecto de los hidrolizados (Cuadro 10).
Al igual que en el grosor del tallo, en esta variable se pudo ver que las plantas testigo
que no recibieron tratamiento alguno son las de menor tamaño, y existe una
diferencia significativa entre los 4 tratamientos restantes. En los tratamientos con
soya no diferencia significativa entre el hidrolizado y el aislado, sin embargo estas
plantas de ambos tratamientos son casi el doble en tamaño que las testigo; entre el
hidrolizado de pescado y soya, son diferentes significativamente, siendo el HS el
que presenta las plantas más altas. Las plantas tratadas con las proteínas de
pescado no hay diferencia significativa entre el HP y el SP, pero se observó que son
- 45 -
plantas con mayor altura que las plantas testigo, mostrando que si beneficia la
aplicación de proteínas de pescado al crecimiento de las plantas de frijol.
Cuadro 9. Efecto de los hidrolizados enzimáticos en el grosor del tallo y la altura de las
plantas de frijol. Tratamientos
experimentales Grosor del tallo (mm) Altura (cm)
Aislado de Soya 6.8 ±0.14cd
29.2 ±0.37cd
Hidrolizado de Soya 7 ±0.06d 28 ±0.71cd
Harina de Pescado 6.4 ±0.1bc
27 ±0.71bc
Hidrolizado de Pescado 6.2 ±0.06b
25.1 ±0.25b
Testigo 5.1 ±0.1a
14.6 ±0.62a
Cada valor de la tabla fue la media de 5 repeticiones ± el eem, N=5
Misma letra indica que no hay diferencia significativa (Tukey, P<0.05).
b) Contenido de clorofila Se colectaron hojas de cada planta para realizar la cuantificación de clorofila (Cuadro
10), como indicador de contenido nutrimental de las plantas tratadas (Resh, 1992;
Peterson et al., 1993). Analizando primeramente el contenido de clorofila “a”, se
encontró que las plantas testigo tiene diferencia significativa con los demás
tratamientos, siendo estas las que muestran el menor contenido con 351.34 µg/g de
hoja. Por otro lado los tratamientos con soya no presentaron diferencia significativa
entre el hidrolizado y el aislado, pero esto dos tratamientos son los que muestran los
contenidos más altos. En los tratamientos con pescado si hay diferencia significativa
entre la harina y el hidrolizado, siendo este último mayor que el sustrato no
hidrolizado (SP). Los análisis de los hidrolizados de soya y de pescado, si hay una
diferencia significativamente importante, viéndose mayor el contenido de clorofila en
las plantas que recibieron el HS con 665.87 µg/g de hojaque en las plantas que
recibieron el HP con 504.33 µg/g de hoja.
- 46 -
Para el contenido de clorofila “b” el testigo no tiene diferencia significativa con el HP,
pero si con los otros 3 tratamientos. El tratamiento que obtuvo mayor contenido de
clorofila “b” es el AS con 239.09 µg/g de hoja. Estos resultados muestran el efecto de
los tratamientos con proteínas de soya y de pescado en el contenido de estos
pigmentos fotosintéticos como lo es la clorofila “a” y la “b”, tal como lo reportan otros
autores (Asenjo et al., 2000)
Cuadro 10. Contenido de clorofila “a” y “b”
Tratamientos experimentales Clorofila “a” (µg/g de hoja)
Clorofila “b” (µg/g de hoja)
Aislado de Soya 687.62 ± 10.48d 239.09 ± 19.37bc
Hidrolizado de soya. 665.87 ± 10.47d 263.85 ± 9.42c
Harina de Pescado 403.51 ± 4.98c 207.2 ± 12.12b
Hidrolizado de Pescado 504.33 ± 5.7b 199.1 ± 7.29ab
Testigo 351.34 ± 2.28a 147.98 ± 8.32a
Cada valor de la tabla fue la media de 5 repeticiones ± el eem, N= 5.
Misma letra indica que no hay diferencia significativa (Tukey, P<0.05).
c) Rendimiento de fruto
Los resultados muestran que las plantas testigo fueron las que presentaron menor
rendimiento, y estas no tienen diferencia significativa con el rendimiento del
hidrolizado de pescado, este último tampoco reportó diferencia significativa con los
resultados de la harina de pescado (Cuadro 11). Los tratamientos con soya entre si
tampoco tuvieron diferencia significativa, pero estos dos (HS y SP) fueron los que
presentaron el mayor rendimiento de todos los tratamientos, los que muestra el
efecto positivo al hacer la aplicación de proteínas de soya en las plantas de frijol
azufrado, esto pudiera deberse a que en el aislado hay variedad de proteínas y
péptidos de bajo peso molecular como se observó en los resultados de las
electroforesis y la cromatografía de tamices moleculares, los cuales pudieran estas
- 47 -
afectando de un modo positivo el rendimiento tal como lo reporta Parrado et al.,
2008.En los rendimientos por lote, es decir los promedios de todas las plantas en
cada tratamiento se vio un efecto positivo en todos los tratamientos de soya y de
pescado, esto con respecto al testigo, ya que el aumento de rendimiento fue mayor
en estos 4 que en el testigo. A pesar de que en esta variable el hidrolizado de
pescado no fue significativamente diferente al testigo, se puede ver un aumento
hasta del 35 % que nos indica que aunque menor que los demás tratamientos, el
hidrolizado de pescado si tiene un efecto positivo en aumentar la producción de
frutos en las plantas de frijol, tal como lo reporta Peña-Cortés et al. (2010).
Cuadro 11. Rendimiento de fruto de frijol.
Tratamientos
experimentales Rendimiento
(g/planta) Rendimiento
(g/lote) Rendimiento
(Kg/ha)*
Aislado de Soya 8.49 ± 0.36c 42.44 ± 4.37 1049.5
Hidrolizado de soya 8.78 ± 0.33c 43.93 ± 1.24 1098.5
Harina de Pescado 6.33 ± 0.39b 31.67 ±2.28 759.65
Hidrolizado de Pescado 4.88 ± 0.37ab 24.38 ±1.18 610
Testigo 3.5 ± 0.38a 17.52 ± 1.67 396.5 Cada valor de la tabla en rendimiento (g/panta) fue la media de 5 repeticiones ± eem, N=5
*Estimado(INIFAP, 2002 y 2011)
Misma letra indica que no hay diferencia significativa (Tukey, P<0.05).
En resumen los resultados muestran que lostratamientos con los sustratos de soya y
de pescado, al contener una variedad de péptidos de bajo peso molecular, afectan
en modo positivo en el desarrollo y crecimiento de las plantas, esto visto en la altura
y el grosor de las plantas, como un aumento en el contenido de clorofila indicativo de
un mayor contenido de nutrientes (Resh, 1992; Peterson et al., 1993) y esto
finalmente se refleja en la productividad del fruto comparado con el testigo (Ordoñez
et al., 2001; Tejada y González, 2004). Estos resultados se asemejan con lo
reportado por Parrado et al. (2008) y Peña-Cortés et al. (2010), que los productos de - 48 -
reacción que presentan péptidos de bajo peso molecular, así como algunos
aminoácidos libres, actúan como activadores del crecimiento vegetativo, ayudan a la
uniformidad en la madurez de los frutos e incrementan la cantidad de frutos por
planta.
- 49 -
VIII. CONCLUSIONES
• Se obtuvieron hidrolizados de proteínas de soya y de pescado con la enzima
proteolítica mexicaína refinada, presentando una abundante proporción de
péptidos de bajo peso molecular en el sobrenadante.
• La mexicaína mejoró la solubilidad de las proteínas de soya y de pescado, en
toda la escala de pH estudiado.
• Los hidrolizados de proteínas de soya y de pescado, mostraron una mejora en
la actividad emulsionante en la región de pH alcalina.
• Los resultados en el crecimiento y desarrollo de las plantas de frijol por efecto
de la aplicación de los tratamientos con proteínas de soya y de pescado,
muestran que tuvieron mejoras significativas, comparativamente con la plantas
testigoque solo recibieron agua destilada.
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IX. PERSPECTIVAS
• El análisis de las fracciones insolubles de los hidrolizados producidos por
efecto de la mexicaína, y una búsqueda del efecto biológico en plantas de
interés.
• Elaboración de hidrolizados enzimáticos con grados de hidrólisis bajo, medio y
alto, para su evaluación biológica y funcional.
- 51 -
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XI. ANEXOS.
Anexo 1. Ficha técnica de Turba (PINDSTRUP SPHAGNUM)
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Anexo 2. Ficha técnica de Agrolita (agroLITA®).
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Anexo 3. Ficha técnica de Vermiculita (agroLITA®).
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