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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL Centro de Desarrollo de Productos Biticos

Departamento de Biotecnologa

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD BIOLGICA Y FUNCIONAL DE HIDROLIZADOS ENZIMTICOS DE

PROTENAS DE SOYA Y DE PESCADO

T E S I S

Que para obtener el grado de Maestra en Ciencias en Desarrollo de Productos Biticos

PRESENTA

Luis Enrique Reynoso Rojas

Directoras de tesis:

Dra. Silvia Evangelista Lozano

M. en C. Mara Isabel Corts Vzquez

Yautepec de Zaragoza, Morelos; Julio 2013

El presente trabajo se llev al cabo en el Departamento de Biotecnologa del Centro

de Desarrollo de Productos Biticos del Instituto Politcnico Nacional bajo la

direccin de la Dra. Silvia Evangelista Lozano y la M. en C. Mara Isabel Corts

Vzquez. En el Laboratorio de Enzimas Vegetales (LENZIVEG) y en el Laboratorio

de Propagacin ex vitro. Para la realizacin de los estudios se obtuvo el apoyo

econmico de la beca CONACYT No. 412417, y beca del Programa Institucional de

Formacin de Investigadores (PIFI), proyectos20113169, 20121017 y 20131767.

La investigacin fue financiada por los proyectos: FOMIX Campeche-126515.

Aprovechamiento industrial de especies vegetales de Campeche. Procesos de

bioseparacin para la obtencin de enzimas y subproductos. Director M. en C.

Roberto Briones Martnez y Preparaciones enzimticas obtenidas por extraccin

bifsica acuosa. Cintica de hidrlisis de sustratos sintticos (SIP-IPN-20113169)

Directora M. en C. Mara Isabel Corts Vzquez y por el proyecto: Propagacin y

manejo agronmico de plantas con inters medicinal, ornamental, frutcola e

industrial (SIP-IPN-20130606) proyecto bajo la direccin de la Dra. Silvia Evangelista

Lozano.

AGRADECIMIENTOS

A la Maestra Isabel Corts y al Maestro Roberto Briones por permitirme formar parte

de su grupo de trabajo y por todas sus aportaciones para lograr este objetivo.

A la Dra. Silvia Evangelista, por su incondicional apoyo en todo momento, y por su

dedicacin a este trabajo.

A los dems miembros del comit tutorial: Dra. Kalina Bermdez, Dr. Federico

Castrejn y a la Dra. Martha Luca, por tu tiempo en la revisin de la tesis y sus

acertados comentarios siempre en bien de mi formacin.

A la Dra. Edith Agama que me permiti trabajar en su laboratorio con suma

confianza.

Al grupo de apoyo de la Dra. Silvia: Elvira, Maricela, Uriel y Don Gil, por su ayuda

durante el trabajo en el invernadero.

A Don Alex y a Glenda, personal de Desarrollo tecnolgico, por las facilidades

prestadas al trabajar en el laboratorio de la Dra. Edith.

A Sarahi Gamarra mi compaera desde hace aos, quien con su amor y cario me

ayudo en todo momento.

A mis compaeros de generacin, quienes en su momento aportaron en algo a mi

formacin.

DEDICATORIA

A Dios, por permitirme llegar a este punto y poner en m la fortaleza para seguir

adelante.

A mi madre, quien es mi amiga, mi consuelo, mi apoyo y mi motivo para cada da

tratar de ser mejor persona. Gracias mam todo esto es por ti.

A mi padre, que a pesar de que se fuera al cielo hace poco tiempo, me enseo a

rerme aun en los momentos difciles.

A mi hermano Mario, quien siempre ha estado a mi lado apoyndome y dndome

una palabra de aliento, al igual que mi cuada Sarai.

A mi hermana Karen, con la que he aprendido a no depender de lo material para ser

feliz.

A mi ta Sonia, por sus consejos y sus recomendaciones, quien al ir por el mismo

camino conoce y sabe lo que se encuentra uno.

A mi familia, quienes de algn modo, me han ayudado a seguir por este camino.

A mi novia, Sarahi Quien en ms de 4 aos me ayudo a no dejar este reto que nos

planteamos, y que seguiremos buscando lo mejor para ambos, te amo y gracias por

todo. Adems gracias a tu familia quienes tambin me han ayudado.

A mis amigos, los cuales siempre tiene un espacio para escucharme y compartir un

tiempo conmigo, ayudndome a distraerme.

INDICE

ndice de figuras i ndice de cuadros iii Lista de abreviaturas iv Resumen vi Abstract vii I INTRODUCCIN 1 II ANTECEDENTES 2 2.1 Hidrlisis enzimtica de protenas 2 2.1.1 Hidrlisis enzimtica de protenas de soya 2 2.1.2 Hidrlisis enzimtica de protenas de pescado 3 2.2 Enzimas 4 2.3 Enzimas proteolticas 4 2.3.1 Proteasas cistenicas 5 2.3.2 Proteasas de plantas mexicanas 5 2.3.3 Mexicana 6 2.4 Fuentes de protena susceptibles de aprovechamiento 7 2.5 Uso de los hidrolizados enzimticos 9 2.5.1 Hidrolizados con propiedades funcionales modificadas 10 2.6 Hidrolizados enzimticos como fertilizantes 11 2.6.1 Biofertilizante-Bioestimulante 12 2.7 Modelo de estudio, frijol (Phaseolus vulgaris) 13 2.8 Clorofila como evidencia de absorcin de nutrientes 14 III JUSTIFICACIN 15 IV HIPTESIS 15 V OBJETIVOS 15 5.1 Objetivo general 15 5.2 Objetivos especficos 15

VI MATERIALES Y METODOS 16 6.1 Materiales 16 6.1.1 Sustratos 16 6.1.2 Proteasa vegetal 17 6.1.3 Cultivo modelo de frijol 17 6.2 Determinacin de nitrgeno amnico (Kjeldahl) en harina de

pescado

17

6.3 Obtencin de hidrolizados de protenas de soya y de pescado por la accin de mexicana refinada

18

6.4 Caracterizacin bioqumica de los hidrolizados enzimticos 18 6.4.1 Determinacin de la distribucin de peso molecular aparente 18 a) Electroforesis unidimensional 18 b) Electroforesis bidimensional 19 6.4.2 Separacin de pptidos por cromatografa 20 a) Cromatografa por exclusin de tamao molecular 20 b) Cromatografa por intercambio catinico 21 6.4.3 Propiedades funcionales 21 a) Solubilidad en funcin del pH 21 b) Solubilidad en funcin del pH (Protena por Lowry) 22 c) Actividad emulsionante de protenas de soya y de pescado 22 d) Determinacin de la estabilidad de la emulsin 23 6.5 Evaluacin del efecto biolgico de los hidrolizados

enzimticos en plantas de frijol azufrado

23

6.5.1 Variables a evaluar en las plantas tratadas 24 a) Grosor del tallo 24 b) Altura 24 c) Determinacin de clorofila (Mtodo de Lichtenthaler, 1978) 24 d) Rendimiento de fruto 25 6.5.2 Mantenimiento del cultivo de frijol 25 6.6 Anlisis estadstico 26 VII RESULTADOS Y DISCUSIN 27

7.1 Contenido de protena en los sustratos protenicos 27 7.2 Caracterizacin de la hidrlisis por accin de mexicana

refinada

27

7.3 Caracterizacin bioqumica de los hidrolizados enzimticos 29 7.3.1 Distribucin de peso molecular aparente 29 7.3.2 Separacin e identificacin de pptidos por cromatografa 32 a) Cromatografa por exclusin de tamao 32 b) Cromatografa por intercambio catinico 34 7.3.3 Propiedades funcionales 37 a) Solubilidad en funcin de pH 37 b) Actividad emulsionante 39 c) Estabilidad de la emulsin 41 7.4 Evaluacin del efecto biolgico de los hidrolizados

enzimticos en plantas de frijol azufrado

44

7.4.1 Variables evaluadas en las plantas tratadas 45 a) Grosor del tallo y altura de las plantas 45 b) Contenido de clorofila a y b 46 c) Rendimiento de fruto 47

VIII CONCLUSIONES 50 IX PERSPECTIVAS 51 X BIBLIOGRAFA 52 XI ANEXOS 61 Anexo 1 Ficha tcnica de Turba (PINDSTRUP SPHAGNUM) 61 Anexo 2 Ficha tcnica de Agrolita (agroLITA) 62 Anexo 3 Ficha tcnica de Vermiculita (agroLITA) 63

NDICE DE FIGURAS

Nmero Figura Pagina

1 Pileus mexicanus (cuaguayote bonete) planta y fruto fuente de

mexicana

7

2 Phaseolus vulgaris (frijol) creciendo en maceta a los 30 das de

germinacin

13

3 Diagrama experimental 16

4 Cultivo experimental de frijol azufrado bajo condiciones de

invernadero

26

5 Curso de la hidrlisis de protenas de soya por efecto de

mexicana refinada

28

6 Curso de la hidrlisis de protenas de pescado por efecto de

mexicana refinada

29

7 Separacin por electroforesis unidimensional de protenas de

soya

30

8 Separacin por electroforesis unidimensional de protenas de

pescado

30

9 Perfil electrofortico bidimensional del aislado de soya (AS) 31

10 Perfil electrofortico bidimensional del hidrolizado de soya (HS) 32

11 Separacin cromatogrfica en Sephadex G-120 de protenas de

Soya

33

12 Separacin cromatogrfica en Sephadex G-120 de protenas de

pescado

34

13 Separacin por cromatografa de intercambio catinico (CMC) de

protenas de soya. Gradiente de NaCl (0.2 M 1.6 M)

35

14 Separacin por cromatografa de intercambio catinico (CMC) de

protenas de pescado. Gradiente de NaCl (0.2 M 1.6 M)

36

15 Perfil de solubilidad de protenas de soya (a) y de protenas de 37

I

pescado (b) en relacin con el pH (As 280 nm).

16 Perfil de solubilidad de protenas de soya (a) y de protenas de

pescado (b) en relacin con el pH (Protena por Lowry).

39

17 Actividad emulsionante de protenas de soya (a) y de protenas

de pescado (b).

40

18 Perfil de est