REPORTE DE LABORATORIO N°3

CROMATOGRAFÍA Y ELECTROFORESIS

1. DATOS GENERALES

Nombres:

Alvizuri Gómez, Claudia Frisancho Morales, Luis Enrique Gonzales Salcedo, Albert Fernando

Profesor responsable:

MSc. Olga Timoteo Pedroso

Curso: Bioquímica y biología celular

2. INTRODUCCIÓN

3. RESULTADOS3.1. Experimento 1

En este experimento se buscó separar hemoglobina de una solución compuesta por ella y dicromato de potasio, a través de la cromatografía de filtración en gel, la cual nos permite separar moléculas de acuerdo al tamaño de estas. Para calcular el volumen muerto se hizo eluir azul de dextrano a través de la columna, pues debido a su enorme masa y tamaño, a manera de embolo desplaza el volumen muerto presente en la columna, permitiendo así cuantificarlo. La absorbancia de los volúmenes eluidos correspondiente a 410 y 530 nm para la estimación del volumen muerto son las siguientes:

TablaI. Volumenes Eluidos de azul de dextrano y absorbancia

1

Grupo: 3

Fecha: 27 / 04 / 2011

Grupo en el laboratorio: 5

Facultad de Medicina Alberto Hurtado2do año de Medicina - Promoción 2016Bioquímica y biología celular

Nº tubo

Absorbancia 405nm (D.O)

Absorbancia 530nm (D.O)

1 0,023 0.0282 0,053 0,0423 0,056 0,014 0,161 0,1365 0,123 0,0856 0,02 0,015

A partir de esta información se procederá a realizar el cálculo del volumen muerto. Para esto debemos tener en cuenta que a medida que la absorbancia aumente, la concentración del azul de dextrano también lo hará, así para saber el volumen que desplace el azul de dextrano, se considerará el volumen eluido desde que se empezó a verter el azul de dextrano en la columna hasta el momento de máxima concentración de azul de dextrano en la elución (pico de absorbancia).

De este modo el cálculo seria así:Como en cada tubo de elución se colectaron volúmenes constantes de 1ml, el volumen eluido hasta el pico de absorbancia sería: 4(1ml)= 4ml

Posteriormente se realizó la elución de la solución a separar (hemoglobina y dicromato de potasio). El resultado de la absorbancia medida a 405 y 530nm sobre los volúmenes eluidos son los siguientes:

TablaI. Volúmenes Eluidos de La solución a separar y su absorbancia

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Nº tubo 405nm 530nm

1 0,018 0,0112 0,018 0,0153 0,009 0,0034 0,446 0,2165 1,53 0,146 1,725 0,1497 1,358 0,1138 0,974 0,0789 0,655 0,062

10 0,723 0,02111 1,507 0,01512 1,846 0,01213 1,85 0,00514 1,718 0,00215 1,233 0,00316 0,695 0,00917 0,347 0,01818 0,199 0,291

Con esta información se procederá a calcular en el apartado de Cuestionario los coeficientes de partición tanto de la hemoglobina como del dicromato.

3.2. Experimento 2

4. DISCUSIÓN4.1. Experimento 1

4.2. Experimento 2

5. CONCLUSIONES5.1. Experimento 1

5.2. Experimento 2

6. RECOMENDACIONES

Al momento de ingresar las soluciones a eluir en la columna de gel, realizar la operación con sumo cuidado y para evitar perturbar la superficie del gel, realizar esta operación lo mas cercana a esta supercifie, siempre orientando la pipeta a los bordes.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.- Bárcena J.A, 2008. Caracterización cinética de la fosfatasa alcalina, Rev.Rabanales 3(3): 14-20

2.-Nelson DL, Cox MM (2009): Lenhinger “Principios de Bioquímica”, 3ª ed. Editorial Omega España. 183-185p.

3.- Peña L.2004. Bioquímica. Grupo Noriega editores. México. 194- 197 p.

4.-Gonzáles A.2010. Principios de bioquímica clínica y patología molecular. Elsevier España. España. 194 p.

5.-Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): “Bioquímica”, 5ª ed. Editorial Reverté (Barcelona, España), pp 577-580.

6.- Berk PD, Korenblat KM. Approach to the patient with jaundice or abnormal liver test results. In: Goldman L, Ausiello D, eds. Cecil Medicine. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007:chap 150.

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7.- Drezner MK. Osteomalacia and rickets. In: Goldman L, Ausiello D, eds. Cecil Medicine. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007:chap 265.

8. CUESTIONARIO EXPERIMENTO 18.1. Calcule los coeficientes de partición de la hemoglobina y el dicromato de potasio

Hay más de una manera de denominar la gráfica Velocidad vs. Concentración de sustrato, la cual describe el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima. Una opción para la denominación de esta curva es “Curva de saturación de una enzima”, ya que expresa lo que sucede si la enzima es saturada producto de un aumento de la concentración de sustrato. Así también, la gráfica puede ser denominada como “Tasa de variación de la velocidad por concentración de sustrato”. Esta gráfica muestra una curva de tipo hipérbola rectangular con una asíntota horizontal en V0 = Vmax.

8.2. Grafique en papel milimetrado log10PM (ordenadas) vs Kav (abcisas)

Km se usa para referirse a la constante de Michaelis- Menten, y esta se interpreta de manera práctica como la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima posible al saturar la enzima con sustrato. La importancia que tiene es debida a que indica la razón de formación de reactivos y productos entre la formación del complejo enzima-sustrato; con lo cual, cuando la formación de producto es limitante, el Km se iguala al Kd, representando así una medida de afinidad de la enzima por su sustrato en el complejo.

8.3. ¿Qué significa Kav < 1 , Kav = 1 , Kav > 1 ?

La utilidad que tiene el conocer los parámetros cinéticos de la actividad enzimática radica en poder predecir cómo es que reaccionará frente a cada situación, ya sea en interacción con algún agente externo (en el caso que hayan inhibidores) como sin interacción alguna, prediciendo de esta manera y por las particularidades de cada contexto, las consecuencias de cada reacción.Así por ejemplo, se puede determinar la afinidad de la enzima por determinado sustrato, y de qué manera variará la reacción al cambiar algún parámetro.

8.4. Aplicaciones de la cromatografía de filtración en gel

Además de utilizarse para la separación de sustancias de distintos pesos moleculares o para la purificación de proteínas, se emplea para la determinación de pesos moleculares de proteínas. Para una gran variedad de tipos de geles se ha comprobado que existe una relación lineal entre el volumen de elución y el logaritmo del peso molecular de las proteínas. Por lo tanto, es suficiente medir el volumen de elución de una proteína desconocida para llevarlo a una recta de calibrado (preparada con proteínas puras de peso molecular conocido) y deducir aproximadamente su peso molecular.

Esta técnica puede también proporcionar un método para el tratamiento de una proteína con un determinado reactivo. Este será uno de los aspectos a ensayar en el presente experimento

8.5. Comparando los valores obtenidos por otros grupos con G100 y G150, ¿qué puede concluir usted sobre la importancia del tipo de matriz utilizada?

8.6. ¿Sus resultados cambiarán si las dimensiones de la columna utilizada fueran diferentes?

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