Terapia gnica

La terapia gnica consiste en la insercin de elementosfuncionales ausentes en el genoma de un individuo. Serealiza en las clulas y tejidos con el objetivo de trataruna enfermedad o realizar un marcaje.La tcnica todava est en desarrollo, motivo por el cualsu aplicacin se lleva principalmente a cabo dentro deensayos clnicos controlados, y para el tratamiento de en-fermedades severas o bien de tipo hereditario o adquiri-do. Al principio se plante slo para el tratamiento de en-fermedades genticas, pero hoy en da se plantea ya paracasi cualquier enfermedad.Entre los criterios para elegir este tipo de terapia se en-cuentran:

Enfermedad letal sin tratamiento.

La causa sea un nico gen que est ya clonado.

La regulacin del gen sea precisa y conocida.

1 Aplicaciones Marcaje gnico: El marcaje gnico tiene como ob-jetivo, no la curacin del paciente, sino hacer un se-guimiento de las clulas, es decir, comprobar si enun determinado sitio del cuerpo estn presentes lasclulas especcas que se han marcado. Un ejem-plo de ello sera la puesta a punto de vectores paraensayos clnicos, permitiendo, por ejemplo, que enocasiones en las que un paciente de cncer (leuce-mia) y al que se le ha realizado un autotransplanterecae se pueda saber de donde proceden las clulas,si son de clulas trasplantadas o si son clulas quehan sobrevivido al tratamiento.

Terapia de enfermedades monognicas heredi-tarias: Se usa en aquellas enfermedades en las queno se puede realizar o no es eciente la administra-cin de la protena decitaria. Se proporciona el gendefectivo o ausente.

Terapia de enfermedades adquiridas: Entre estetipo de enfermedades la ms destacada es el cncer.Se usan distintas estrategias, como la insercin dedeterminados genes suicidas en las clulas tumoraleso la insercin de antgenos tumorales para potenciarla respuesta inmune.

2 Tipos de terapia gnica Terapia gnica somtica: se realiza sobre lasclulas somticas de un individuo, por lo que las mo-dicaciones que implique la terapia slo tienen lugaren dicho paciente.

Terapia in vivo: la transformacin celulartiene lugar dentro del paciente al que se leadministra la terapia. Consiste en admi-nistrarle al paciente un gen a travs de unvehculo (por ejemplo un virus), el cualdebe localizar las clulas a infectar. Elproblema que presenta esta tcnica es quees muy difcil conseguir que un vector lo-calice a un nico tipo de clulas diana.

Terapia ex vivo: la transformacin celu-lar se lleva a cabo a partir de una biop-sia del tejido del paciente y luego se letrasplantan las clulas ya transformadas.Como ocurre fuera del cuerpo del pacien-te, este tipo de terapia es mucho ms f-cil de llevar a cabo y permite un controlmayor de las clulas infectadas. Esta tc-nica est casi completamente reducida aclulas hematopoyticas pues son clulascultivables, constituyendo as un materialtransplantable.

Terapia gnica germinal: se realizara sobre lasclulas germinales del paciente, por lo que los cam-bios generados por los genes teraputicos seran he-reditarios. No obstante, por cuestiones ticas y jur-dicas, sta clase de terapia gnica no se lleva a cabohoy en da.

3 ProcedimientoAunque se han utilizado enfoques muy distintos, en lamayora de los estudios de terapia gnica, una copia delgen funcional se inserta en el genoma para compensar eldefectivo. Si sta copia simplemente se introduce en elhusped, se trata de terapia gnica de adicin. Si trata-mos, por medio de la recombinacin homloga, de eli-minar la copia defectiva y cambiarla por la funcional, setrata de terapia de sustitucin.Actualmente, el tipo ms comn de vectores utilizadosson los virus, que pueden ser genticamente alterados pa-

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2 4 VECTORES EN TERAPIA GNICA

ra dejar de ser patgenos y portar genes de otros organis-mos. No obstante, existen otros tipos de vectores de ori-gen no vrico que tambin han sido utilizados para ello.As mismo, el ADN puede ser introducido en el pacientemediante mtodos fsicos (no biolgicos) como electro-poracin, biobalstica...Las clulas diana del paciente se infectan con el vector (enel caso de que se trate de un virus) o se transforman con elADN a introducir. Este ADN, una vez dentro de la clulahusped, se transcribe y traduce a una protena funcional,que va a realizar su funcin, y, en teora, a corregir eldefecto que causaba la enfermedad.

4 Vectores en terapia gnicaLa gran diversidad de situaciones en las que podra apli-carse la terapia gnica hace imposible la existencia de unsolo tipo de vector adecuado. Sin embargo, pueden de-nirse las siguientes caractersticas para un vector idealy adaptarlas luego a situaciones concretas:

Que sea reproducible. Que sea estable. Que permita la insercin de material gentico sin l-mite de tamao.

Que permita la transduccin tanto en clulas en di-visin como en aquellas que no estn proliferando.

Que posibilite la integracin del gen teraputico enun sitio especco del genoma.

Que se integre una vez por clula, para poder con-trolar la dosis.

Que reconozca y acte sobre clulas especcas. Que la expresin del gen teraputico pueda ser re-gulada.

Que carezca de elementos que induzcan una res-puesta inmune.

Que pueda ser caracterizado completamente. Que sea inocuo o que sus posibles efectos secunda-rios sean mnimos.

Que sea fcil de producir y almacenar. Que todo el proceso de su desarrollo tenga un costerazonable.

Los vectores van a contener los elementos que quera-mos introducir al paciente, que no van a ser slo los ge-nes funcionales, sino tambin elementos necesarios parasu expresin y regulacin, como pueden ser promotores,

potenciadores o secuencias especcas que permitan sucontrol bajo ciertas condiciones.Podemos distinguir dos categoras principales en vectoresusados en terapia gnica: virales y no virales.

4.1 VirusTodos los virus son capaces de introducir su material ge-ntico en la clula husped como parte de su ciclo dereplicacin. Gracias a ello, pueden producir ms copiasde s mismos, e infectar a otras clulas.Algunos tipos de virus insertan sus genes fsicamente enel genoma del husped, otros pasan por varios orgnuloscelulares en su ciclo de infeccin y otros se replican di-rectamente en el citoplasma, por lo que en funcin de laterapia a realizar nos puede interesar uno u otro.Algo comn a la mayora de estrategias con virus es la ne-cesidad de usar lneas celulares empaquetadoras o virushelpers, que porten los genes que les eliminamos a nues-tros vectores y que permiten la infeccin.

4.1.1 Retrovirus

El genoma de los retrovirus est constituido por ARN decadena sencilla, en el cual se distinguen tres zonas clara-mente denidas: una intermedia con genes estructurales,y dos anqueantes con genes y estructuras reguladoras.Cuando un retrovirus infecta a una clula husped, in-troduce su ARN junto con algunas enzimas que se en-cuentran en la matriz, concretamente una proteasa, unatranscriptasa inversa y una integrasa.La accin de la retrotranscriptasa permite la sntesis delADN genmico del virus a partir del ARN. A continua-cin, la integrasa introduce este ADN en el genoma delhusped. A partir de este punto, el virus puede permane-cer latente o puede activar la replicacin masivamente.Para usar los retrovirus como vectores vricos para terapiagnica inicialmente se eliminaron los genes responsablesde su replicacin y se reemplazaron estas regiones por elgen a introducir seguido de un gen marcador.Del genoma vrico quedaban las secuencias LTR; y loselementos necesarios para producir los vectores a granescala y para transformar las clulas son aportados des-des otros vectores, bien plasmdicos o bien en lneas ce-lulares especcas. En el caso de usar vectores plasmdi-cos, estrategias como cotransformar con varios plsmi-dos distintos que codiquen para las protenas del retro-virus, y que la transcripcin de sus secuencias est some-tida a promotores eucariotas puede contribuir a minimi-zar el riesgo de que por recombinacin se generen virusrecombinantes.[1]

Actualmente se buscan estrategias como la anterior paraconseguir una mayor seguridad en el proceso. La adicinde colas de poliadenina al transgn para evitar la trans-

4.1 Virus 3

cripcin de la segunda secuencia LTR es un ejemplo deesto[cita requerida].Los retrovirus como vector en terapia gnica presentanun inconveniente considerable, y es que la enzima inte-grasa puede insertar el material gentico en cualquier zo-na del genoma del husped, pudiendo causar efectos dele-treos como la modicacin en el patrn de la expresin(efecto posicional) o la mutagnesis de un gen silvestrepor insercin.Ensayos de terapia gnica utilizando vectores retrovira-les para tratar la inmunodeciencia combinada grave li-gada al cromosoma X (X-SCID) representan la aplica-cin ms exitosa de la terapia hasta la fecha. As, msde veinte pacientes han sido tratado en Francia y GranBretaa, con una alta tasa de reconstitucin del sistemainmunitario. Sin embargo, ensayos similares fueron res-tringidos en los Estados Unidos cuando se inform de laaparicin de leucemia en pacientes.[cita requerida] Hasta hoyse conocen cuatro casos de nios franceses y uno brit-nico que han desarrollado leucemia como resultado demutagnesis por insercin de los vectores retrovirales, ytodos menos uno de estos nios respondieron bien al tra-tamiento convencional contra la leucemia. [cita requerida] Enla actualidad, la terapia gnica para tratar SCID continasiendo exitosa en Estados Unidos, Gran Bretaa, Italia yJapn.[cita requerida]

4.1.2 Adenovirus

Los adenovirus presentan un genoma de ADN bicatena-rio, y no integran su genoma cuando infectan a la clulahusped, sino que la molcula de ADN permanece libreen el ncleo celular y se transcribe de forma independien-te. Esto supone que el efecto posicional o la mutagnesispor insercin no se dan en estos vectores, lo cual no quieredecir que no tengan otros inconvenientes. Adems, debi-do al hecho de que en su ciclo natural se introducen enel ncleo de la clula, pueden infectar tanto clulas endivisin como clulas quiescentes.A los vectores de primera generacin se les elimin partedel gen E1, bsica para la replicacin, y a los de 2., seles eliminaron otros genes tempranos en el ciclo del vi-rus. En ambos casos, cuando se realiza una infeccin conuna concentracin elevada de virus, se produce la expre-sin de otros genes que provocan una respuesta inmuneconsiderable.Por ello, los ltimos vectores basados en adenovirus prc-ticamente han sido desprovistos de la mayor parte de susgenes, con la excepcin de las regiones ITR (regiones re-petidas de forma invertida), y la zona necesaria para laencapsidacin.

4.1.3 Virus Adenoasociados (AAV)

Los AAV son virus pequeos con un genoma de ADNmonocatenario. Pueden integrarse especcamente en elcromosoma 19 con una alta probabilidad. Sin embargo,el VAA recombinante que se usa como vector y que nocontiene ningn gen viral, solo el gen teraputico, no seintegra en el genoma. En su lugar, el genoma vrico re-combinante fusiona sus extremos a travs del ITR (repe-ticiones terminales invertidas), apareciendo recombina-cin de la forma circular y episomal que se predice quepueden ser la causa de la expresin gnica a largo plazo.Las desventajes de los sistemas basados en AAV radicanprincipalmente en la limitacin del tamao de DNA re-combinante que podemos usar, que es muy poco, dadoel tamao del virus. Tambin el proceso de produccin einfeccin resultan bastante complejos. No obstante, co-mo se trata de un virus no patgeno en la mayora de lospacientes tratados no aparecen respuestas inmunes paraeliminar el virus ni las clulas con las que han sido trata-dos.Muchos ensayos con VAA estn en curso o en prepara-cin, principalmente en el tratamiento de msculos y en-fermedades oculares, los dos tejidos donde el virus pa-rece ser particularmente til[cita requerida]. Sin embargo, seestn comenzando a realizar pruebas clnicas, donde vec-tores basados en el VAA son utilizados para introducirlos genes en el cerebro[cita requerida]. Esto es posible porqueVAA pueden infectar clulas que no estn en estado dedivisin, tales como las neuronas.

4.1.4 Herpes virus

Los herpesvirus son virus de ADN capaces de establecerlatencia en sus clulas husped. Son complejos gentica-mente hablando, pero para su uso como vectores tienenla ventaja de poder incorporar fragmentos de DNA ex-geno de gran tamao (hasta unas 30 kb). Adems, aunquesu ciclo ltico lo realizan en el lugar de infeccin, estable-cen la latencia en neuronas, las cuales estn implicadas ennumerosas enfermedades del sistema nervioso, y son porello dianas de gran inters.Los vectores herpesvricos puestos en marcha han usadodos estrategias principales:- La recombinacin homloga entre el genoma del viruscompleto y el contenido en un plsmido que llevaba eltransgn en la zona que codica para genes no esencialesen lo que se reere a replicacin e infeccin.- El uso de vectores con orgenes de replicacin del virusas como las correspondientes secuencias de empaqueta-miento, y su introduccin en estirpes celulares bien coin-fectadas con virus silvestres o bien portadoras del restode genes del mismo implicados en la encapsidacin y re-plicacin, para permitir la formacin de partculas viralesrecombinantes con las que realizar el tratamiento.

4 4 VECTORES EN TERAPIA GNICA

No obstante, el uso de vectores basados en el HSV (virusdel herpes simple), slo puede llevarse a cabo en pacien-tes que no hayan sido infectados previamente por l, puespueden presentar inmunidad.

4.1.5 Protena pseudotyping de vectores virales

Los vectores virales descritos anteriormente tienen po-blaciones naturales de clulas husped que ellos infectande manera eciente. Sin embargo, algunos tipos celularesno son sensibles a la infeccin por estos virus.La entrada del virus a la clula est mediada por protenasde su supercie externa (que pueden formar parte de unacpside o de una membrana). Estas protenas interaccio-nan con receptores celulares que pueden inducir cambiosestructurales en el virus y contribuir a su entrada en laclula por endocitosis.En cualquier caso, la entrada en las clulas husped re-quiere una interaccin favorable entre una protena de lasupercie del virus, y una protena de la supercie de laclula. Segn la nalidad de una determinada terapia g-nica, se podra limitar o expandir el rango de clulas sus-ceptibles a la infeccin por un vector. Por ello, se handesarrollado vectores conocidos como pseudotyped, enlos cuales la cubierta vrica de protenas silvestre ha sidoremplazada por pptidos de otros virus, o por protenasquimricas, que constan de las partes de la protena vri-ca necesarias para su incorporacin en el virin, as comolas secuencias que supuestamente a interaccionar con re-ceptores especcos de protenas celulares.Por ejemplo, el vector retrovrico ms popular para el usoen pruebas de terapia gnica ha sido el virus de la inmu-nodeciencia en simios revestido con la cubierta de pro-tenas G del virus de la estomatitis vesicular. Este vectorse conoce como VSV y puede infectar a casi todas lasclulas, gracias a la protena G con la cual este vector esrevestido[cita requerida].Se ha intentado en numerosas ocasiones limitar eltropismo (capacidad de infectar a muchas clulas) de losvectores virales.Este avance podra permitir la adminis-tracin sistemtica de una cantidad relativamente peque-a del vector. La mayora de los intentos han utilizadoprotenas quimricas para la envuelta[cita requerida], las cua-les incluan fragmentos de anticuerpos.

4.2 Mtodos no virales

Estos mtodos presentan ciertas ventajas sobre los mto-dos virales, tales como facilidades de produccin a granescala y baja inmunogenicidad. Anteriormente, los ba-jos niveles de transfeccin y expresin del gen mantenana los mtodos no virales en una situacin menos venta-josa; sin embargo, los recientes avances en la tecnolo-ga de vectores han producido molculas y tcnicas detransfeccin con eciencias similares a las de los virus.

4.2.1 ADN desnudo

ste es el mtodo ms simple de la transfeccin no viral.Consiste en la aplicacin localizada de, por ejemplo, unplsmido con ADN desnudo. Varios de estos ensayos die-ron resultados exitosos[cita requerida]. Sin embargo, la expre-sin ha sido muy baja en comparacin con otros mtodosde transformacin. Adems de los ensayos con plsmi-dos, se han realizado ensayos con productos de PCR, yse ha obtenido un xito similar o superior. Este logro, sinembargo, no supera a otros mtodos, lo que ha llevado auna investigacin con mtodos ms ecientes de transfor-macin, tales como la electroporacin, la sonicacin, o eluso de la biobalstica, que consiste en disparar partculasde oro recubiertas de ADN hacia las clulas utilizandoaltas presiones de gas.

4.2.2 Oligonucletidos

El uso de oligonucletidos sintticos en la terapia gnicatiene como objetivo la inactivacin de los genes implica-dos en el proceso de la enfermedad.Existen varias estrategias para el tratamiento con oligo-nucletidosUna estrategia, la terapia antisentido utiliza oligonu-cletidos con la secuencia complementaria al RNAm delgen diana, lo que activa un mecanismo de silenciamien-to gnico. Tambin se puede usar para alterar la trans-cripcin del gen defectuoso, modicando por ejemplo supatrn de edicin de intrones y exones.Tambin se hace uso demolculas pequeas de RNAi pa-ra activar un mecanismo de silenciamiento gnico similaral de la terapia antisentidoOtra posibilidad es utilizar oligodesoxinucletidos comoun seuelo para los factores que se requieren en la activa-cin de la transcripcin de los genes diana. Los factoresde transcripcin se unen a los seuelos en lugar de al pro-motor del gen defectuoso, lo que reduce expresin de losgenes diana. Adems, oligonucletidos de ADN mono-catenario han sido utilizados para dirigir el cambio de unnica base dentro de la secuencia de un gen mutante.Al igual que los mtodos de ADN desnudo, requieren detcnicas de transformacin para introducirse en la clula.

4.3 Cromosomas articiales

La creacin de cromosomas humanos articiales (HACs)estables es una de las posibilidades que se baraja en laactualidad como una de las formas de introducir ADNpermanentemente en clulas somticas para el tratamien-to de enfermedades mediante el uso de la terapia gnica.Presentan una elevada estabilidad, adems de permitir in-troducir grandes cantidades de informacin gentica.

4.4 Mtodos hbridos 5

4.3.1 Lipoplexes y poliplexes

El vector de ADN puede ser cubierto por lpidos forman-do una estructura organizada, como una micela o un li-posoma. Cuando la estructura organizada forma un com-plejo con el ADN entonces se denomina lipoplexe.Hay tres tipos de lpidos: aninicos, neutros, o catinicos.Inicialmente, lpidos aninicos y neutros eran utilizadosen la construccin de lipoplexes para vectores sintticos.Sin embargo, estos son relativamente txicos, incompa-tibles con uidos corporales y presentan la posibilidad deadaptarse a permanecer en un tejido especco. Adems,son complejos y requieren tiempo para producirlos, porlo que la atencin se dirigi a las versiones catinicas. s-tos, debido a su carga positiva, interaccionan con el ADN,que presenta carga negativa, de tal forma que facilita laencapsulacin del ADN en liposomas.Ms tarde, se cons-tat que el uso de lpidos catinicos mejoraba la estabi-lidad de los lipoplexes. Adems, como resultado de sucarga, los liposomas catinicos interactan tambin conla membrana celular, y se cree que la endocitosis es laprincipal va por la que las clulas absorben los lipople-xes.Los endosomas se forman como resultado de laendocitosis. Sin embargo, si los genes no pueden liberarseal citoplasma por rotura de la membrana del endosoma,los liposomas y el ADN contenido sern destruidos. Laeciencia de ese escape endosomal en el caso de liposo-mas constituidos solo por lpidos catinicos es baja. Sinembargo, cuando lpidos de ayuda (normalmente lpi-dos electroneutrales, tales como DOPE) son aadidos, laecacia es bastante mayor. Adems, ciertos lpidos (lpi-dos fusognicos) tienen la capacidad de desestabilizar lamembrana del endosoma. El uso de ciertos compuestosqumicos, como la cloroquina, permite al ADN exgenoescapar del lisosoma, si bien deben usarse con precau-cin, ya que es txico y debe usarse en dosis pequeaspara no afectar a la clula diana de transfeccin.No obstante, los lpidos catinicos presentan efectos t-xicos dependientes de dosis, lo que limita la cantidad quede ellos se puede usar y por tanto la terapia en s.El uso ms comn de los lipoplexes es la transferenciade genes en clulas cancerosas, donde los genes suminis-trados activan genes supresores del tumor en la clula ydisminuyen la actividad de los oncogenes.Estudios recientes han mostrado que lipoplexes son ti-les en las clulas epiteliales del sistema respiratorio[cita requerida], por lo que pueden ser utilizados para el trata-miento gentico de las enfermedades respiratorias comola brosis qustica.Los complejos de polmeros de ADN se denominan po-liplexes y la mayora consisten en polmeros catinicos,regulados por interacciones inicas.Una gran diferencia entre los mtodos de accin de poli-plexes y lipoplexes es que algunos poliplexes no pueden

liberar su ADN cargado al citoplasma, por lo que requie-ren de la contransfeccin con agentes que contribuyan ala liss del endosoma. Existen otros elementos formadoresde poliplexes, como el quitosano o la polietilamina, quesi son capaces de liberarse del endosoma.

4.4 Mtodos hbridos

4.5 DendrmerosUn dendrmero es una macromolcula muy ramicadacon forma esfrica o variable. Su supercie puede ser fun-cional de muchas formas y de sta derivan muchas de suspropiedades. Adems, su tamao, en la escala nano-, per-mite su uso en biomedicina.En particular, es posible construir un dendrmero catini-co, es decir, con carga supercial positiva. De esta forma,interacciona con el cido nucleico, cargado negativamen-te, y forma un complejo que puede entrar por endocitosisen la clula. Esto es til en terapia gnica, para introducirgenes exgenos.Los costes de produccin son elevados, pero se estndesarrollando tcnicas que permiten abaratarlo, puestoque se trata de una tcnica con una toxicidad muy baja,y su principal desventaja es a nivel productivo.

5 Clulas dianaLas clulas diana se seleccionan en funcin del tipo de te-jido en el que deba expresarse el gen introducido, y debenser adems clulas con una vida media larga, puesto queno tiene sentido transformar clulas que vayan a morir alos pocos das. Igualmente, se debe tener en cuenta si ladiana celular es una clula en divisin o quiescente, por-que determinados vectores virales, como los retrovirus,slo infectan a clulas en divisin.En funcin de estas consideraciones, las clulas dianaideales seran las clulas madre, puesto que la insercinde un gen en ellas producira un efecto a largo plazo. De-bido a la experiencia en transplante de mdula sea, unade las dianas celulares ms trabajadas son las clulas ma-dre hematopoyticas. La terapia gnica en estas clulases tcnicamente posible y es un tejido muy adecuado pa-ra la transferencia ex vivo. Otras dianas celulares con lasque se ha trabajado son:

Linfocitos: son clulas de larga vidamedia y fcil ac-ceso (se encuentran en la sangre perifrica). Consti-tuyen un blanco para terapias ex vivo de melanomase inmunodeciencias.

Epitelio respiratorio: son clulas de divisin muylenta y en ellas no es posible la transferencia ex vi-vo, pero s su transformacin mediante adenovirusy lipoplexes.

6 6 PRINCIPALES ACONTECIMIENTOS EN EL DESARROLLO DE LA TERAPIA GNICA

Hepatocitos: su transformacin en posible tanto exvivo (es factible cultivar las clulas y transplantar-las por la circulacin portal) como in vivo (se es-tn desarrollando receptores proteicos especcosde hepatocitos).

Fibroblastos drmicos: son clulas de fcil acceso ycultivo, y pueden transformarse tanto ex vivo comoin vivo, pero suelen tener efectos transitorios.

Clulas musculares: pueden transformarse median-te inyeccin in vivo de ADN y tambin medianteadenovirus, pero con un xito muy limitado en esteltimo caso.

6 Principales acontecimientos en eldesarrollo de la terapia gnica

6.1 2002 y anterioresLa terapia gnica apareci a partir de la dcada de 1970para intentar tratar y paliar enfermedades de carcter ge-ntico y se dieron las primeras pruebas con virus, las cua-les fracasaron. Aos ms tarde, en la dcada de 1980, seintent tratar la talasemia usando betaglobina. En este ca-so fue un xito en modelos animales aunque no se pudousar un humanos.En 1990, W. French Anderson propone el uso de clu-las de mdula sea tratadas con un vector retroviral queporta una copia correcta del gen que codica para la enzi-ma adenosina desaminasa,[2] la cual se encuentra mutada.Es una enfermedad que forma parte del grupo de las in-munodeciencias severas combinadas (SCID). Realiz latransformacin ex-vivo con los linfocitos T del paciente,que luego se volvieron a introducir en su cuerpo. Cincoaos ms tarde, publicaron los resultados de la terapia,[3]que contribuy a que la comunidad cientca y la socie-dad consideraran las posibilidades de esta tcnica.No obstante, el apoyo a la terapia fue cuestionadocuando algunos nios tratados para SCID desarrollaronleucemia.[4] Las pruebas clnicas se interrumpieron tem-poralmente en el 2002, a causa del impacto que suposoel caso de Jesse Gelsinger, la primera persona reconocidapblicamente como fallecida a causa de la terapia gni-ca. Su muerte se debi al uso del vector adenoviral parala transduccin del gen necesario para tratar su enferme-dad, lo cual caus una excesiva respuesta inmune, con unfallo multiorgnico y muerte cerebral. Existe una biblio-grafa numerosa sobre el tema, y es destacable el informeque la FDA emiti sealando el conicto de intereses dealgunos de los mdicos implicados en el caso as comolos fallos en el procedimiento. En el ao 2002, cuatro en-sayos en marcha de terapia gnica se paralizaron al desa-rrollarse en un nio tratado una enfermedad similar a laleucemia.[5] Posteriormente, tras una revisin de los pro-cedimientos, se reanudaron los proyectos en marcha.

6.2 2003

Un equipo de investigadores de la Universidad de Cali-fornia, en Los ngeles, insert genes en un cerebro uti-lizando liposomas recubiertos de un polmero llamadopolietilenglicol (PEG).[6] La transferencia de genes en es-te rgano es un logro signicativo porque los vectores vi-rales son demasiado grandes para cruzar la barrera hema-toenceflica. Este mtodo tiene el potencial para el trata-miento de la enfermedad del Parkinson.Tambin en ese ao se plante la interferencia por ARNpara tratar la enfermedad de Huntington.[7]

6.3 2006

Cientcos del NIH tratan exitosamente un melanomametastsico en dos pacientes, utilizando clulas T paraatacar a las clulas cancerosas. Este estudio constituye laprimera demostracin de que la terapia gnica puede serefectivamente un tratamiento contra el cncer.[8]

En marzo del 2006, un grupo internacional de cientcosanunci el uso exitoso de la terapia gnica para el trata-miento de dos pacientes adultos contagiados por una en-fermedad que afecta a las clulas mieloides. El estudio,[9]publicado en Nature Medicine, es pionero en mostrar quela terapia gnica puede curar enfermedades del sistemamieloide.En mayo del 2006, un equipo de cientcos dirigidos porel Dr. Luigi Naldini y el Dr. Brian Brown del Institutode San Raaele Telethon para la Terapia Gnica (HSR-TIGET) en Miln, informaron del desarrollo de una for-ma de prevenir que el sistema inmune pueda rechazar laentrada de genes.[10] Los investigadores del Dr. Naldiniobservaron que se poda utilizar la funcin natural de losmicroRNA para desactivar selectivamente los genes tera-puticos en las clulas del sistema inmunolgico. Este tra-bajo tiene implicaciones importantes para el tratamientode la hemolia y otras enfermedades genticas.En noviembre del mismo ao, Preston Nix de la Universi-dad de Pensilvania inform sobre VRX496,[11] una inmu-noterapia para el tratamiento del HIV que utiliza un vec-tor lentiviral para transportar un DNA antisentido contrala envuelta del HIV. Fue la primera terapia con un vectorlentiviral aprobada por la FDA para ensayos clnicos. Losdatos de la fase I/II ya estn disponibles.[12]

6.4 2007

El 1 demayo del 2007, el hospitalMoorelds Eye y la uni-versidad College Londons Institute of Ophthalmology,un ao despus el Hospital de Nios de Filadela anun-ciaron el primer ensayo de terapia gnica para la enfer-medad hereditaria de retina. La primera operacin (en In-glaterra) se llev a cabo en un varn britnico de 23 aosde edad, Robert Johnson, a principios de este ao.[13].

6.8 Porcentajes de ensayos de terapia gnica en la actualidad 7

Mientras que en Filadela Corey Haas fue el primer nioen obtener este tipo de terapeutica. La Amaurosis con-gnita de Leber es una enfermedad hereditaria que causala ceguera por mutaciones en el gen RPE65. Los resul-tados de la Moorelds/UCL se publicaron en New En-gland Journal of Medicine. Se investig la transfeccinsubretiniana por el virus recombinante adeno-asociadollevando el gen RPE65, y se encontraron resultados posi-tivos. Los pacientes mostraron incremento de la visin,y no se presentaron efectos secundarios aparentes.[14]Los ensayos clnicos de esta terapia se encuentran en fa-se II.[15] Una de las etapas a realizar es la determina-cin del tipo molecular que atie cada enfermedad (ohttp://es.wikipedia.org/wiki/Distrofias_de_la_retina). Anivel retiniano se realiza en Amrica Latina por la cor-poracin Virtual Eye Care MD, conocida y de renombrepor su calidad a realizar este trabajo de relacin entre fe-notipo y genotipo. www.virtualeyecaremd.com

6.5 2008

Investigadores de la Universidad deMchigan en Ann Ar-bor (Estados Unidos) desarrollaron una terapia genti-ca que ralentiza y recupera las encas ante el avance dela enfermedad periodontal, la principal causa de prdidade dientes en adultos.[16] Los investigadores descubrie-ron una forma de ayudar a ciertas clulas utilizando unvirus inactivado para producir ms cantidad de una pro-tena denominada receptor TNF. Este factor se encuentraen bajas cantidades en los pacientes con periodontitis. Laprotena administrada permite disminuir los niveles exce-sivos de TNF, un compuesto que empeora la destruccinsea inamatoria en pacientes que sufren de artritis, dete-rioro articular y periodontitis. Los resultados del trabajomostraron que entre el 60 y el 80 por ciento de los teji-dos periodontales se libraban de la destruccin al utilizarla terapia gnica[cita requerida].

6.6 2009

En septiembre de 2009, se public en Nature que unosinvestigadores de la Universidad de Washington y laUniversidad de Florida fueron capaces de proporcio-nar visin tricromtica a monos ardilla usando terapiagnica.[17]

En noviembre de ese mismo ao, la revista Sciencepublic resultados alentadores sobre el uso de terapiagnica en una enfermedad muy grave del cerebro, laadrenoleucodistroa, usando un vector retroviral para eltratamiento.[18]

6.7 2012

El 2 de noviembre la Comisin Europea autorizo a Glybe-ra, una empresa alemana(Amsterdam), a lanzar un trata-

miento para un extrao desorden gentico - la decienciade lipoproteinlipasa(LPL).

6.8 Porcentajes de ensayos de terapia gni-ca en la actualidad

7 Enfermedades y terapia gnicaSon numerosas las enfermedades objeto de la terapia g-nica, siendo las ms caractersticas las tratadas a conti-

8 7 ENFERMEDADES Y TERAPIA GNICA

nuacin:

7.1 ADAEl primer protocolo clnico aprobado por la FDA para eluso de la terapia gnica fue el utilizado en el tratamientode la deciencia en adenosn deaminasa (ADA) que pro-voca un trastorno de la inmunidad, en 1990. En estos pa-cientes no se ha podido retirar el tratamiento enzimticoexgeno necesario para su supervivencia, sino slo dis-minuirlo a la mitad y se ha detectado la persistencia en laexpresin del gen an despus de cuatro aos de iniciadoel protocolo. Aunque no se haya logrado la completa cu-racin de los pacientes (que consistira en retirar todo elaporte enzimtico exgeno) este constituye un hecho in-dito en la historia teraputica. En 2009 se hace un nuevoexperimento en el que extraen clulas hematopoyticasde la mdula sea para la introduccin del gen ADA exvivo mediante un retrovirus modicado (GIADA). Lasclulas modicadas se vuelven a introducir en el paciente.Los resultados de este experimento fueron exitosos por-que ninguno de los pacientes desarrollo leucemia (comosi haba ocurrido con el empleo de retrovirus). Adems,todos los pacientes desarrollaron una expresin correc-ta del gen ADA durante los aos de seguimiento que seles hizo y consiguieron un aumento de clulas sanguneas.De esta manera 8 de los nueve pacientes no necesita trata-miento enzimtico exgeno para complementar la terapiagnica.

7.2 CncerEl tratamiento del cncer hasta el momento ha implica-do la destruccin de las clulas cancerosas con agentesquimioteraputicos, radiacin o ciruga. Sin embargo, laterapia gnica es otra estrategia que en algunos casos halogrado que el tamao de tumores slidos disminuya enun porcentaje signicativo. Los principales mtodos queutiliza la terapia gnica en el cncer son:

1. Aumento de la respuesta inmune celular antitumoral(terapia inmunognica). Est basada en la habilidaddel sistema inmune para atacar contra el cncer. Pa-ra ello, se introducen antgenos en clulas tumoralespermitiendo que las clulas inmunes puedan reco-nocer a las clulas tumorales. As, se puede trans-formar las clulas tumorales con la protena CD80,glicoprotena de membrana de clulas presentadorasde antgenos que se une a linfocitos T potenciandola respuesta inmune.

2. Introduccin de genes activadores de drogas dentrode las clulas tumorales o terapia de genes suicidas.Consiste en la introduccin selectiva de genes en c-lulas tumorales y no en las dems, que codican pa-ra la susceptibilidad a drogas que de otra manera noseran txicas. Esto lleva a la insercin de enzimas;

como por ejemplo HSV-tk [Herpex simplex virus ti-midina kinasa]) y citosina desaminasa, que son enzi-mas inofensivas para las clulas de mamferos y con-vierten prodrogas (vg ganciclovir y 5-uorocitosina)en metabolitos citotxicos que destruyen a las clu-las tumorales en proliferacin.

3. Normalizacin del ciclo celular. Consiste en la inac-tivacin de oncogenes mutados, como el ras, o en lareexpresin de antioncogenes o genes supresores detumor inactivos como el p53. Se han llevado a ca-bo ensayos clnicos en los que se inyecta en clulastumorales retrovirus que expresan p53. El problemaes que se necesitan grandes cantidades de virus paratratar los tumores muy extendidos y los retroviruspresentan una baja eciencia de trasfeccin.

4. Manipulacin de las clulas de la mdula sea. Esutilizada principalmente en la terapia gnica de des-rdenes hematolgicos, y consiste en transferir alas clulas progenitoras hematopoyticas genes dequimioproteccin o de quimiosensibilizacin, entreotros. Este es el caso del gen MDR1 estudiado en elcncer de mama que, trasplantado en clulas precur-sora de linfocitos T y NKs ( clulas CD34 positivas),hace que las clulas transfectadas sean ms resisten-tes a altas dosis de quimioterapia.

5. Uso de ribozimas y tecnologa antisentido o anti-sense. Las ribozimas son ARN con actividad ca-taltica que actuaran incrementando la degradacindel ARN recin traducido, disminuyendo protenasespeccas no deseadas, factor que a veces se asociaa alteraciones tumorales. La tecnologa antisentidose reere a oligonucletidos de ARN que no tienenactividad cataltica, sino que son complementarios auna secuencia gnica y que pueden actuar bloquean-do el procesamiento del RNA, impidiendo el trans-porte del mRNA o bloqueando el inicio de la tra-duccin.

7.3 Sndrome de Wiskott-Aldrich (WAS)El sndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) es una enferme-dad recesiva ligada al cromosoma X caracterizada por ec-zema, trombocitopenia, infecciones recurrentes, inmuno-deciencia as como una gran tendencia a los linfomas ya las enfermedades autoinmunes. Tambin hay una ver-sin ms suave de esta enfermedad conocida como trom-bocitopenia ligada al cromosoma X o XLT caracteriza-da por microtrombocitopenia congnita con plaquetas depequeo tamao. Ambas enfermedades estn producidaspor mutaciones en el genWAS que codica para una pro-tena multidominio que slo se expresa en clulas hema-topoyticas, WASP. Por lo tanto, la mayora de los quepadecen este sndrome sufren una muerte prematura de-bido a una infeccin, hemorragia, cncer o anemia graveautoinmune. Actualmente, se han realizado tratamientosecaces en pacientes con el sndrome de Wiskott-Aldrich

9por medio de trasplantes de mdula sea o sangre del cor-dn umbilical de un donante HLA idntico o compatible.En 2010 se publica un estudio que muestra importantemejoras en dos nios diagnosticados con la enfermedad.La terapia consisti en extraer las clulas madre hemato-poyticas y volvrselas a trasferir tras integrarles el genWAS en el genoma. Tras la terapia gnica, detectaron ni-veles signicativos de la protena WASP en las diferentesclulas del sistema inmune de los pacientes. El resultadofue que los pacientes tuvieron varias mejoras signicati-vas: uno de ellos se recuper por completo de la anemiaautoinmune y el otro paciente redujo el eczema que su-fra.

7.4 Beta Talasemia

La -talasemia constituye un desorden gentico con mu-taciones en el gen de la -globulina que reduce o bloqueala produccin de esta protena. Los pacientes con esta en-fermedad padecen anemia severa y requieren trasfusionesde sangre a lo largo de toda su vida. La terapia gnicatiene como objetivo sanar las clulas madre de la m-dula sea mediante la transferencia de la -globina nor-mal o gen de -globina en clulas madre hematopoyticas(CMH) para producir de forma permanente los glbulosrojos normales. Para llevarlo a cabo se pretende emplearlentivirus porque varios estudios muestran la correccinde la -talasemia en modelos animales. Los objetivos dela terapia gnica con esta enfermedad son: optimizar latransferencia de genes, la introduccin de una gran canti-dad de CMH modicadas genticamente y reducir al m-nimo las consecuencias negativas que pueden derivarsede la integracin al azar de los vectores en el genoma.

8 Problemas de la terapia gnica yde sus aplicaciones

Un concepto muy importante del que radican algunos as-pectos de la seguridad de la terapia gnica es el de la ba-rreraWeismann. Se reere al hecho de que la informacinhereditaria slo va de clulas germinales a clulas som-ticas, y no al revs.La terapia gnica en clulas germinales es mucho mscontrovertida que en clulas somticas, pero aun as, si labarrera Weismann fuera permeable a algn intercambiode informacin, como algunos autores sealan,[19] inclu-so la terapia en clulas somticas podra tener problemasticos y de seguridad que antes no habran sido conside-rados.La naturaleza de la propia terapia gnica y sus vecto-res, implica que en muchas ocasiones los pacientes debenrepetir la terapia cada cierto tiempo porque sta no es es-table y su expresin es temporal.La respuesta inmune del organismo ante un agente ex-

trao como un virus o una secuencia de ADN exgena.Adems, esta respuesta se refuerza en las sucesivas apli-caciones de un mismo agente.Problemas relacionados los vectores virales. Podrancontaminarse tanto por sustancias qumicas como por vi-rus con capacidad de generar la enfermedad. Implicantambin riesgos de respuesta inmuneTrastornos multignicos: representan un reto muygrande para este tipo de terapia, ya que se trata de en-fermedades cuyo origen reside en mutaciones en variosgenes, y aplicar el tratamiento se encontrara con las di-cultades clsicas de la terapia multiplicadas por el nmerode genes a tratar.Posibilidad de inducir un tumor por mutagnesis. Estopuede ocurrir si el ADN se integra por ejemplo en ungen supresor tumoral. Se ha dado este caso en los ensayosclnicos para SCID ligada al cromosoma X, en los cuales3 de 20 pacientes desarrollaron leucemia.[20]

9 Terapia gnica en otros animales

El primer ejemplo de terapia gnica en mamferos fuela correccin de la deciencia en la produccin dela hormona del crecimiento en ratones.[cita requerida] Lamutacin recesiva little (lit) produce ratones enanos. Apesar de que estos presentan un gen de la hormona delcrecimiento aparentemente normal, no producen mARNa partir de este gen.El primer paso en la correccin del defecto consisti en lainyeccin de cinco mil copias de un fragmento de ADNlineal portador de la regin estructural del gen de la hor-mona del crecimiento de la rata fusionado al promotordel gen de la metalotionena de ratn, en huevos lit. Lafuncin normal de la metalotionena es la destoxicacinde los metales pesados, por lo que la regin reguladoraresponde a la presencia de metales pesados en el animal.Los huevos inyectados fueron implantados en hembras.El 1% de los ratones de la descendencia resultaron sertransgnicos, y alcanzaron mayor tamao.Se ha creado una tecnologa similar para generar va-riedades transgnicas de salmn del Pacco con unatasa rpida de crecimiento y, los resultados han sidoespectaculares.[cita requerida] Se microinyect en huevos desalmn un plsmido portador del gen de la hormona delcrecimiento regulado por el promotor de la metalotio-nena y una pequea porcin de peces resultantes fuerontransgnicos, pesando once veces ms que los no trans-gnicos.

10 11 REFERENCIAS

10 Terapia gnica en la cultura po-pular

En series de televisin como Dark Angel, el tema de laterapia gnica se menciona como una de las prcticas rea-lizadas en nios transgnicos y sus madres. Tambin enla serie Alias, aparece la terapia gnica molecular comoexplicacin a dos individuos idnticos.Es un elemento fundamental en la trama de videojuegoscomo Bioshock o Metal Gear Solid, y desempea un pa-pel importante en la trama de pelculas como Muere otroda, de James Bond o Soy leyenda, de Will Smith, entreotras muchas.

11 Referencias[1] Markowitz, D., Go, S. and Bank, A. (1988). A safe pac-

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11

2. Boztug K, Schmidt M, Schwarzer A, Banerjee PP,Dez IA, Dewey RA, Bhm M, Nowrouzi A, BallCR, Glimm H, Naundorf S, Khlcke K, BlasczykR, Kondratenko I, Mardi L, Orange JS, von Ka-lle C, Klein C. Stem-cell gene therapy for theWiskott-Aldrich syndrome. N Engl J Med. 2010Nov 11;363(20):1918.

3. Alessandro Aiuti, M.D., Ph.D., Federica Cattaneo,M.D., Stefania Galimberti, Ph.D., Ulrike Benning-ho, M.D.,Barbara Cassani, Ph.D., Luciano Calle-garo, R.N., Samantha Scaramuzza, Ph.D., GraziaAndol,Massimiliano Mirolo, B.Sc., ImmacolataBrigida, B.Sc., Antonella Tabucchi, Ph.D., FilippoCarlucci, Ph.D.,Martha Eibl, M.D., Memet Aker,M.D., Shimon Slavin, M.D., Hamoud Al-Mousa,M.D., Abdulaziz Al Ghonaium, M.D.,Alina Fers-ter, M.D., Andrea Duppenthaler, M.D., Luigi Nota-rangelo, M.D., Uwe Wintergerst, M.D.,Rebecca H.Buckley, M.D., Marco Bregni, M.D., Sarah Mark-tel, M.D., Maria Grazia Valsecchi, Ph.D., PaoloRossi, M.D.,Fabio Ciceri, M.D., Roberto Miniero,M.D., Claudio Bordignon, M.D., and Maria-GraziaRoncarolo, M.D. Gene Therapy for Immunode-ciency Due to Adenosine Deaminase Deciency.The new england journal of medicine.2009.

12 Bibliografa- Conceptos de Gentica, William S. Klug, MichaelR.Cummings y Charlotte A. Spencer. Pearson. 8. edi-cin.- Kimmelman J (2005). Recent developments in genetransfer: risk and ethics. BMJ. 2005 Jan 8;330(7482):79-82. Review.- Virus patgenos. Luis Carrasco y JoseMara Almendraldel Ro. Editorial Hlice. ISBN 84-934106-0-8

13 Enlaces externos Genes que Curan: la Terapia Gnica en el MuseoVirtual Leyendo el Libro de la Vida

Gene Therapy Clinical Trials Worldwide - Base dedatos de ensayos clnicos en terapia gnica a nivelmundial

12 14 TEXTO E IMGENES DE ORIGEN, COLABORADORES Y LICENCIAS

14 Texto e imgenes de origen, colaboradores y licencias14.1 Texto

Terapia gnica Fuente: https://es.wikipedia.org/wiki/Terapia_g%C3%A9nica?oldid=83618294 Colaboradores:Youssefsan, Gonis, Josea-perez, Moriel, Zwobot, Sms, Cookie, Cinabrium, Porao, Fmariluis, Reignerok, Yurik, Airunp, Natrix, Rembiapo pohyiete (bot), Orgullo-bot~eswiki, Caiserbot, Gerkijel, Yrbot, BOT-Superzerocool, FlaBot, Varano, Maleiva, YurikBot, Mortadelo2005, Ummowoa, Folkvanger,CEM-bot, Retama, Montgomery, Thijs!bot, Juanramon 89, JuanPaBJ16, Xavigivax, CommonsDelinker, TXiKiBoT, Plux, LauraFari-na, Ssaman, VolkovBot, Technopat, Matdrodes, DJ Nietzsche, Posible2006, Muro Bot, SieBot, Ctrl Z, Drinibot, Hu12, Sebeat, Mel 23,Manw, YHIM, Javierito92, HUB, Quijav, Eduardosalg, Leonpolanco, Petruss, Alexbot, Raulshc, Camilo, UA31, Shalbat, Armando-Martin, AVBOT, Cvicgar, Diegusjaimes, Arjuno3, Andreasmperu, Luckas-bot, William1509, Er MaKy, Majofab, ArthurBot, Jordi dome-nech~eswiki, SuperBraulio13, Xqbot, Jkbw, Marco Gerardo, BOTrychium, UPO 0809 aparrod, UPO 0809 amormor, UPO 0809 sgonher,UPO 0809 mcalocan, Botarel, AstaBOTh15, UPO 0809 mbonagu, UPO 0809 adelcan, TiriBOT, Halfdrag, Abece, Leugim1972, Gan-medes, HermanHn, Jorge c2010, Foundling, AVIADOR, Jomago, ZroBot, Allforrous, Sergio Andres Segovia, UPO666 0910 clmilneb,Alrik, UPO666 0910 cpercal, Grillitus, Waka Waka, Hauiito, UPO649 1011 clmilneb, Javimpra, Nimado, KLBot2, Sir Electron, UPO6661011 mrebama, UPO666 1011 emversiv, UPO666 1011 pcalgar, UPO666 1011 pgrofer, UPO666 1011 gvilfom, UPO666 1011 aare-dav, UPO666 1011 mtmeddom, UPO666 1011 mptolfon, Elvisor, UPO666 1112 salode, UPO666 1112 rarrhor, UPO666 1112 jmriod,Makecat-bot, UPO649 1213 sgarmar1, Prosimio, Dlarios94, Addbot, Jarould, Andrea JIbar, BenjaBot, Doublephyton17, Woooop, Ale-jandra valdes y Annimos: 165

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Aplicaciones Tipos de terapia gnica Procedimiento Vectores en terapia gnica Virus Retrovirus Adenovirus Virus Adenoasociados (AAV) Herpes virus Protena pseudotyping de vectores virales

Mtodos no virales ADN desnudo Oligonucletidos

Cromosomas artificiales Lipoplexes y poliplexes

Mtodos hbridos Dendrmeros

Clulas diana Principales acontecimientos en el desarrollo de la terapia gnica 2002 y anteriores 2003 2006 2007 2008 2009 2012 Porcentajes de ensayos de terapia gnica en la actualidad

Enfermedades y terapia gnica ADA Cncer Sndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) Beta Talasemia

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