Terapia Con Virus

TERAPIA CON VIRUS

Los virus son verdaderos expertos a la hora de importar material genético al interior de un organismo infectado. Esta particularidad es la que se explota en la terapia génica, en la que los genes se introducen en las células de un paciente para tratar enfermedades o defectos genéticos.

INTEGRANTES:

Cayo Gonzales, Carmen Galloso Sánchez, Paola Herrera Egoavil, Pilar Moreno Rodríguez, Diana Pinchi Dávila, Xiomy Rengifo Faifer, Cristina Sánchez Vendezú, Pamela

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[ ] 6 de julio de 2013

Palabras clave:

Seminario N°7

TERAPIA CON VIRUS

RESUMEN

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INDICE

INTRODUCCIÓN 3CAPITULO I 4

¿Cómo funcionan las vacunas? 4

Clasificación microbiológica de las vacuna 4

Vacunas de microorganismos vivos atenuados 5

Vacunas de microorganismos muertos o inactivados 5

Vacunas y ADN recombinante 7

Perspectivas 8

CAPITULO II 9

Tipos de terapia génica 9

Terapia génica somática………………………………………………………………………………………….…9

Terapia génica germinal………………………………………………………………………………………..…10

Sistemas de transferencia…………………………………………………………………………………………….11

Vectores virales…………………………………………………………………………………………………...………11

Grupos virales utilizados en terapia génica……………………………………………..…………….………12

Retrovirus 12

Lentivirus 12

Adenovirus 15

Adenoasociados

BIBLIOGRAFIA 18

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INTRODUCCIÓN

Durante la última década se ha producido una importante revolución científica en

el campo de la biología molecular que, junto con un mejor conocimiento del Genoma

Humano, ha permitido una mayor comprensión de la función celular a nivel molecular.

Se han abierto importantes expectativas en la sociedad y en el mundo científico, que han

hecho creer que todas las enfermedades son susceptibles de tratarse y de prevenirse

mediante la terapia génica.

Los virus son verdaderos expertos a la hora de importar material genético al

interior de un organismo infectado. Esta particularidad es la que se explota en la terapia

génica, en la que los genes se introducen en las células de un paciente para tratar

enfermedades o defectos genéticos.

La terapia génica en los últimos años se ha enfocado a la búsqueda de nuevos

vectores para el transporte de genes, los cuales tengan una mayor eficacia en la

transferencia génica, mayor persistencia en la expresión del material transferido, así como

una alta especificidad al tipo celular que se desea transferir. Una de las características más

importantes es que deben ser seguros e inocuos, que despierten en el paciente una

respuesta inmune casi nula.

En la búsqueda de los vectores más adecuados se han utilizado diferentes especies

de virus cada uno con características específicas. En este momento, gracias a los

mencionados desarrollos biotecnológicos, la terapia génica es una opción terapéutica

viable para varias enfermedades crónico-degenerativas.

En este informe vamos a realizar una revisión de la literatura sobre la aplicación de

los virus en la terapia génica y en la inoculación de vacunas.

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CAPITULO I

VACUNAS

Desde que Jenner y Pasteur iniciaron en los siglos XVIII-XIX las primeras estrategias de vacunación, se han sucedido numerosos intentos dirigidos a ampliar el número de enfermedades susceptibles de prevención y a su vez, conseguir para cada una de ellas el tipo de vacuna ideal.

De las distintas definiciones que se han hecho de las vacunas, es de destacar la que las considera como "suspensiones de microorganismos atenuados o inactivados (muertos), o sus fracciones, que se pueden administrar a personas sanas susceptibles a determinadas enfermedades, con objeto de inducirles inmunidad activa protectora contra las mismas".

1. ¿Cómo funcionan las vacunas?

Las vacunas le enseñan al cuerpo cómo defenderse cuando los microorganismos, como virus o bacterias, lo invaden.

Las vacunas lo exponen a uno a una cantidad muy pequeña y muy segura de virus o bacterias que han sido debilitados o destruidos.

Su sistema inmunitario aprende luego a reconocer y atacar la infección si uno está expuesto a ella posteriormente en su vida.

Como resultado, uno no resultará infectado o tendrá una infección más leve. Ésta es una forma natural de hacerle frente a las enfermedades infecciosas.

2. Clasificación microbiológica de las vacunas

Salvo excepciones, las vacunas disponibles en la actualidad, tienen su origen en los propios agentes infecciosos contra los que se vacuna, los cuales son sometidos a diferentes modificaciones para eliminar su poder patógeno pero manteniendo su capacidad inmunógena. Las excepciones son la vacuna contra la viruela, cuyo componente es el propio virus de la vacuna (enfermedad de las vacas), que posee inmunidad cruzada con el virus de la viruela e inmuniza a los humanos contra la enfermedad, y la vacuna contra la hepatitis B empleada en la actualidad, que es obtenida por recombinación genética.

Ilustración 1 Virus sometidos a modificaciones

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De ahí que bajo este criterio se clasifiquen a las vacunas en víricas y bacterianas (solo nos centraremos de las víricas); y a su vez, cada una de ellas se dividen en dos grupos: a) vacunas de microorganismos vivos atenuados y b) vacunas de microorganismos muertos o inactivados. Estas últimas a su vez se clasifican en enteras, cuando contienen el virus completo y de subunidades, cuando lo que contienen son antígenos secretados o fracciones víricas de distinta naturaleza.

Tabla 1. Clasificación microbiológica de las vacunasVivas atenuadas Inactivas (muertas)

Víricas Varicela RabiaVirus enteros Fiebre amarilla

Polio oral SarampiónRubéolaParotiditis

GripePolio parenteralHepatitis AEncefalitis japonesa

Subunidades GripeHepatitis B

1. Vacunas de microorganismos vivos atenuados.

Las vacunas vivas consisten en preparaciones de microorganismos que pueden replicar“in vivo” en el huésped de forma similar al microorganismo nativo, originando una infección inaparente o con síntomas mínimos, provocando con ello una respuesta inmune, celular y humoral, similar aunque algo inferior a la provocada por la infección natural. La atenuación del microorganismo, mediante pases sucesivos en diferentes huéspedes animales o medios de cultivo, es lo que garantiza la eliminación de la capacidad de inducir enfermedad; pero su gran inmunogenicidad provoca generalmente protección a largo plazo y con un mínimo de dosis (las dosis de refuerzo se administran en las vacunas vivas para evitar el riesgo de fallo en la primera dosis, no para reactivar la respuesta inmune, como ocurre con las vacunas inactivadas). La excepción la constituye la vacuna antipoliomielítica oral trivalente tipo Sabin, de la que es necesario administrar varias dosis, para evitar los fenómenos de interferencia que pueden producirse con otros virus existentes en el tracto digestivo y los propios virus vacunales. Como inconveniente tienen el ser vacunas más inestables, más difíciles de producir, más reactógenas y el que, en determinadas circunstancias, pueden provocar la enfermedad en el huésped o incluso propagarse a otro sujeto.

Tabla 2. Características de una vacuna viva (atenuada)Se replica en el huésped pero con virulencia atenuadaVentajas:Induce respuesta celular y humoralMenor número de dosisProtección de mayor duraciónInconvenientes:Posibilidad de reversiónPuede ser más reactógenaLa infección puede ser transmisible desde la persona vacunadaDificultad de fabricación

2. Vacunas de microorganismos muertos o inactivados

Las vacunas muertas o inactivadas se componen de microorganismos inactivados, térmica o químicamente, o bien se trata de fracciones o subunidades de los mismos, incapaces de reproducirse, y por ello incapaces de producir la enfermedad en el huésped o de transmitirse a otro sujeto. Son vacunas generalmente bien toleradas, menos reactógenas que las vacunas vivas, muy seguras y de más fácil fabricación. Desde el punto de vista

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inmunológico son menos inmunógena que las vacunas vivas, precisando adyuvantes, la administración de varias dosis para la primovacunación y posteriormente varias dosis de refuerzo para que la protección obtenida sea a largo plazo. Por lo general estimulan fundamentalmente la inmunidad humoral y preparan la memoria inmunológica e incluso en algunos casos, sobre todo cuando se administran con adyuvantes o sistemas de liberación, pueden estimular la inmunidad mediada por linfocitos T citotóxicos.

Tabla 3. Características de una vacuna inactivada (muerta)• Incapaz de replicarse en el huésped• No produce la enfermedad• Ventajas:• Menos reactógena• No transmisible a otro sujeto no vacunado• Fabricación más sencilla• Inconvenientes:• Escaso estímulo de la inmunidad celular• Necesidad de varias dosis iniciales y posteriores refuerzos para una protección completa y prolongada

Dentro de las vacunas atenuadas e inactivadas se pueden distinguir vacunas de gérmenes enteros o de células enteras, y vacunas de subunidades como los toxoides o anatoxinas, los antígenos purificados y los polisacáridos capsulares.

Vacunas de células enteras. En ellas los microrganismos obtenidos a partir de cultivos se atenúan por pases sucesivos en animales o en medios de cultivo (sarampión, rubéola, varicela y otras víricas o bacterianas de este grupo); o bien se inactivan mediante el calor o agentes químicos diversos como el fenol o el formol (gripe, hepatitis A, antipertusis y otras).Vacunas de subunidades o fracciones. Las vacunas de fracciones o subunidades son preparaciones purificadas o sintetizadas de determinados componentes (proteínas, péptidos, carbohidratos, toxinas, etcétera) de microorganismos. Tienen las mismas ventajas e inconvenientes generales que las vacunas inactivadas, pero se caracterizan por una menor reactogenicidad (derivada de la ausencia de otros componentes no deseados del patógeno completo inactivado) y, por su simplicidad, mayor facilidad para generar mejoras (modificaciones estructurales, conjugaciones, moléculas recombinantes, etcétera).

Ilustración 2 Estrategias actuales de generación de vacunas víricas atenuadas e inactivas

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Dentro de la clasificación microbiológica de las vacunas y según el método de obtención del antígeno, se pueden diferenciar las vacunas clásicas o no recombinantes, en las que no se utilizan las técnicas de recombinación de ADN para su obtención, y vacunas en las que se utilizan dichas técnicas.

3. Vacunas y ADN recombinante.

Dentro de estas vacunas se diferencian dos variedades: las recombinantes y las sintéticas.

En las vacunas recombinantes la vacuna está compuesta por partículas proteicas producidas en células huésped, generalmente levaduras, en las que se ha insertado por técnicas de recombinación de ADN el material genético responsable de su codificación. Es el caso de la vacuna recombinante contra la hepatitis B, en la cual la recombinación del gen S que codifica el HBsAg en las células del huésped, permite obtener partículas de HBsAg casi idénticas a las que circulan en el plasma de personas infectadas. Son vacunas por tanto de genes clonados y expresados.

Las vacunas sintéticas se elaboran a partir de polipéptidos que copian la secuencia primaria de aminoácidos de los determinantes antigénicos del microorganismo. Este tipo de vacunas ha tenido un escaso desarrollo, ya que uno de sus principales obstáculos parece ser la escasa inmunogenicidad de estos péptidos sintéticos, que precisarían el concurso de proteínas transportadoras capaces de aumentar su antigenicidad.

Otras vacunas basadas en técnicas de ADN recombinante, como las vacunas de genes expresados en vectores o las vacunas de ADN desnudo están en fase experimental, aunque son en general muy prometedoras por su capacidad de proporcionar una protección a largo plazo y ser relativamente estables en diversas situaciones. Sin embargo se cuestiona su seguridad en relación a la inducción de tumores o fenómenos de autoinmunidad.Igualmente están en fase experimental las llamadas vacunas antiidiotipo, contra moléculas peligrosas como endo o exotoxinas, y otras.

Ilustración 3 Estrategias actuales de vacunación de fragmentos

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3. Perspectivas.

Los nuevos usos de las vacunas incluyen no solo la cura de la infección o su prevención, sino la prevención de secuelas serias que se presentan como resultado de dicha enfermedad, la vacuna de VHB es un buen ejemplo, ya que su uso está motivado también por la prevención del cáncer hepático. Además se trabaja en la fabricación de vacunas contra el Helicobacter pylori, agente involucrado en la aparición de cáncer de estómago y del Papillota virus, agente altamente relacionado con el cáncer cérvico-uterino respectivamente.

Se propone que otra aplicación de estas vacunas será prevenir enfermedades debidas a problemas de autoinmunidad o bien a inmunidad hiperreactiva como la que propicia el asma y las alergias.

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CAPITULO II

TERAPIA GÉNICA

La definición de terapia génica ha cambiado a lo largo del tiempo, y hoy en día no existe una comúnmente aceptada. En este informe vamos a basarnos en la propuesta por un grupo de expertos noruego1. Así, la terapia génica (TG) se puede definir como la transferencia de material genético, ADN o ARN, a células diana con fines terapéuticos.

1. Tipos de terapia génica

Terapia génica somática (“somatic cell gene therapy”) Implica la corrección de defectos genéticos en cualquiera de las células del paciente, excepto las de la línea germinal, lo que significa que tal corrección del defecto genético no se transmite a los descendientes, ya que la línea germinal del paciente tratado no está manipulada. La terapia génica somática ha centrado sus actuaciones sobre enfermedades hereditarias bien definidas cuyo defecto genético reside en un único gen, las llamadas enfermedades monogénicas. Estas podrían ser del tipo de las hemofilias, fenilcetonuria, deficiencia de ADA (adenosina desaminasa), fibrosis quística, distrofia muscular, hipercolesterolemia familiar, etc. Enfermedades hereditarias cuyo defecto genético es fácilmente confirmable en los portadores, y altera el funcionamiento de un tipo celular concreto y más o menos accesible a los genes terapéuticos externos. Las enfermedades provocadas por la alteración de más de un gen, o por la falta de coordinación de varios genes, las llamadas poligénicas, son lógicamente más complejas de abordar y de momento se desestima la terapia génica para su posible tratamiento.

La terapia génica somática se puede dividir en 4 niveles:101. Terapia génica con integración, en la que el gen es incorporado en el ADN2. Terapia génica sin integración, en la que el gen no se incorpora en el ADN3. Empleo de pequeños oligonucleótidos sintéticos, también denominados moléculas ribozima/anti-sentido, sin elementos regulatorios que modifiquen la expresión génica.4. Vacunas de ADN terapéuticas.

La terapia génica somática se puede dividir en tres categorías:

Esta clasificación de la terapia génica responde al lugar donde se produce la manipulación genética de las células.

Ex vivo: Consiste en la recuperación de células del organismo, su tratamiento con el vector portador del ADN terapéutico y el regreso de las células modificadas genéticamente al organismo. Esta opción se ha empleado en células sanguíneas y de la piel. Este proceso es más fácil con células del sistema hematológico. La obtención de médula ósea, purificación de células madre, su manipulación en el laboratorio, y la introducción de la célula madre con la versión funcional de un gen de vuelta en el paciente ha servido por ejemplo para el tratamiento de la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) por deficiencia de ADA. La introducción del gen ADA funcional en las células progenitoras del sistema inmunológico han curado ya a niños con SCID, los conocidos como niños burbuja, en unos ensayos clínicos.

1 SMELAND E, PRYDZ H, ORSTAVIK KH, FROLAND S, AAMDAL S, MYKLEBOST O ET AL. Gene Therapy: status and potential in clinical medicine. The Norwegian Centre for Health Technology Assessment (SMM) 2000 (SMMReport7/2000)

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In situ: Consiste en la colocación del vector portador del ADN terapéutico dentro del tejido en el que el gen funcionará. Esto se ha probado en las vías aéreas y en los pulmones en la fibrosis quística y en algunos tipos de cáncer. In vivo: Aquí el vector portador del ADN terapéutico puede ser, por ejemplo, inyectado en el torrente sanguíneo para ser captado por las células diana. Por ejemplo, la modificación de células pulmonares o hepáticas con una versión correcta del gen de la alfa-1 antitripsina en pacientes con enfisema pulmonar o cirrosis fruto de esta deficiencia, o en la introducción del gen de la distrofina en tejidos musculares en pacientes de distrofia muscular.

Ilustración 4 In vivo – ex vivo

Terapia génica germinal (“germ-line gene therapy”) Implica la corrección de defectos genéticos en las células de la línea germinal (células reproductoras). Estos cambios genéticos se transmitirán a las futuras generaciones. Ésta no se ha realizado en humanos porque la legislación actual lo prohíbe. Existe consenso nacional e internacional de prohibir la terapia génica germinal, mientras no se disponga de conocimientos que permitan realizarlo con seguridad suficiente.

Ilustración 5 Terapia génica somática vs germinal

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2. Sistemas de transferencia

Para que los genes o fragmentos de genes puedan ser empleados en el tratamiento de enfermedades son necesarios buenos sistemas de transferencia a células diana donde el nuevo ADN pueda ser expresado como ARN y/o proteína. Hasta ahora, el desarrollar sistemas de transferencia seguros y eficientes es el principal obstáculo para explotar el gran potencial de tratamiento que representa la terapia génica.

El gen o el fragmento de gen que interesa es habitualmente insertado en un vector (a menudo un ADN o ARN virus o un plásmido de ADN) que es una parte fundamental del sistema de transferencia (vehículo de transporte). El ADN terapéutico se inserta en el vector en una localización donde a menudo reemplaza ADN que no es esencial para la transferencia o multiplicación del virus.

Los sistemas de transferencia pueden ser:• Vectores viralesARN virus: Retrovirus (los más utilizados)ADN virus AdenovirusVirus adenoasociadosVirus herpes simple

• Otro mecanismo de transferenciaSe han desarrollado diversos sistemas de transferencia. Así, se han utilizado plásmidos (ADN desnudo), liposomas catiónicos o liposomas con anticuerpos contra la superficie de la célula diana, cromosomas humanos artificiales...

3. Vectores virales

Entendemos por vectores a los sistemas que utilizamos como ayuda en el proceso de transferencia de un gen exógeno al interior de la célula. Ellos facilitan la entrada y biodisponibilidad intracelular del material genético a transducir y, por consiguiente, su funcionamiento correcto. Se ha utilizado una gran variedad de vectores con fines experimentales y de forma genérica los podemos clasificar en: vectores no virales y vectores virales. (Tabla 4)

Tabla 4. Vectores utilizados en terapia génicaVectores no virales Vectores virales

Físicos Químicos RetrovirusAdenovirusVirus asociados a adenovirusHerpes simples

BiobalísticaElectroporaciónMicroinyección

Fosfato cálcicoLiposomasReceptores

Hasta hace unos años, cuando pensábamos en los virus nos imaginábamos un agente infeccioso responsable de numerosas enfermedades o unas partículas extremadamente pequeñas que sólo pueden observarse gracias al microscopio electrónico y que, aunque presentan material genético propio, son incapaces de replicarse por sí mismos.Sin embargo, hoy día este concepto empieza a cambiar y los virus empiezan a ser considerados como herramientas de trabajo, vectores, que sirven para introducir material genético con fines terapéuticos en las células diana.

Los virus no pueden ser utilizados directamente como se encuentran en la naturaleza, necesitan ser modificados para poder ser utilizados como vectores. Es necesario convertirlos en entes deficientes en replicación en el interior de la célula diana. Se trata, por tanto, de producir una anulación parcial del genoma viral.

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Los principales tipos de vectores virales usados hasta ese momento en protocolos de terapia génica, es decir, vectores retrovirales, adenovirales, adenoasociados y basados en Herpesvirus.

4. Grupos virales utilizados en terapia génica

RETROVIRUS

Los retrovirus son un grupo ampliamente desarrollado. Son virus cuyo material genético está constituido por una molécula de ARN. Esto los obliga a realizar el proceso de retrotranscripción para su replicación. Tienen la capacidad de integrarse en el genoma del huésped, con lo que ofrecen la ventaja de una expresión persistente del transgén, lo que los hace útiles para su uso en enfermedades hereditarias y/o crónicas. Sin embargo, la integración en el genoma del huésped es aleatoria, presentando el riesgo (aunque extremadamente bajo) de mutagénesis insercional debido a la posibilidad de alterar un gen vital o un gen supresor de tumor y por lo tanto interrumpir su expresión, o bien insertarse en un protooncogén induciendo su activación a oncogén. La gran desventaja que presenta este tipo de vectores es que sólo son capaces de infectar células en división. Los retrovirus recombinantes más usados son los derivados del virus de la leucemia murina, los cuales se modifican para hacerlos deficientes de replicación, con lo que se suprime su capacidad de formar partículas virales2.

La falta de especificidad de diana de los retrovirus se ha estudiado con retrovirus quiméricos derivados de virus humanos y virus de otras especies animales. Por ejemplo, la especificidad de infección reside en las proteínas de la cubierta del virus, y éstas son sustituibles en el cromosoma del virus. Así, se ha conseguido sustituir una proteína de la cubierta del virus de la leucemia del ratón (MLV) por la del virus de la estomatitis vesicular humana (HVSV) y cambiar la especificidad del MLV por células humanas. En la actualidad se están probando vectores basados en estas quimeras víricas, sobre la base de que le MLV no produce enfermedades conocidas en el hombre y que los niveles de fabricación de proteína a partir de un gen terapéutico insertado en su genoma pueden ser regulables y apropiados para su uso en terapias.

LENTIVIRUS

Son un tipo de retrovirus con capacidad de integración estable tanto en células en reposo como en división. Sin embargo, la mayoría de ellos derivan de la familia del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), por lo que los aspectos referentes a la seguridad biológica para su uso en protocolos clínicos deberán ser considerados antes de su aplicación.

Lentivirus y entrada en el núcleoEn la citada revisión del 20003 se concluía que la entrada en el núcleo del complejo de preintegración del VIH venía posibilitada por la existencia de señales de localización nuclear en las diferentes proteínas que forman, junto con el ADN viral recién transcrito, el complejo de reintegración. Nuevos estudios completaron esta visión, al observarse que tanto en el VIH como en otros lentivirus existe una estructura de ADN tricatenario hacia la zona central del ADN, que contiene una secuencia rica en purinas (PPT) análoga a la que normalmente está presente en la zona subterminal del ARN viral y que sirve, durante la transcripción inversa, de cebador de la síntesis de la segunda cadena (cadena +) del ADN4.

2 Vassilopoulos G, Stamatoyannopoulos G. The basics of gene therapy vectors. Haema 2000; 3: 214-28.3 Talavera A, Liras A, Fuentes L, Sánchez H. El VIH y otros retrovirus complejos en la terapia génica de células en reposo. Virología 2000; 7:2-15.

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Esta secuencia, llamada «segunda PPT» sirve de cebador independiente de un ADN+, y está situada antes de la señal de terminación (CTS) del ADN+ normal, por lo que se da un solapamiento entre ambos ADN+, que da cuenta de la región de tres cadenas (Ilustración 6). La conformación impuesta por esta estructura es lo que permite al ADN la entrada al núcleo a través de los poros nucleares. Como era de esperar, poco tiempo después de la descripción de este elemento apareció en la literatura su aplicación a nuevos vectores basados en lentivirus.

Ilustración 6 Estructura de la parte central del ADN del VIH

Empaquetamiento transitorioLa tecnología que conduce a la obtención de retrovirus recombinantes o transductores se basa en la coexistencia en una célula, en un momento determinado, de dos elementos genéticos:

a) Un provirus artificial que en el que los genes estructurales del retrovirus han sido sustituidos por el transgén que se desea transducir; el ARN transcrito a partir de este provirus ha de conservar, entre otros elementos retrovirales, la capacidad de ser encapsidado.

b) Genes que expresen las proteínas virales necesarias para la formación de cápsidas donde el ARN del provirus artificial puedan ser encapsidadas.

Sin embargo, los ARNs mensajeros correspondientes a estos genes deben ser incapaces (o haber sido activamente incapacitados) para pasar a formar parte de las cápsidas virales que sus genes contribuyen a formar, ya que ello daría lugar a la aparición, junto a los deseados retrovirus transductores incapaces de formar nueva progenie, de retrovirus normales, que no sólo seguirían propagándose una vez que infectasen las células blanco, sino que ayudarían a los virus transductores a propagarse con ellos, situación no deseada en el contexto de la terapia génica, cuyo objetivo es transportar el gen curativo a las células diana y no a sus vecinas.

Normalmente, el primero de los elementos se halla en un plásmido retroviral genómico que contiene los LTR y otras regiones de control propias de un provirus, y en el que se ha insertado el transgén. Este plásmido se introduce en una estirpe celular, llamada empaquetadora (Ilustración 7) en la que previamente, y de forma estable, se ha introducido el segundo de los elementos, generalmente en dos plásmidos independientes, uno de ellos portador de los genes estructurales de la cápsida y nucleocápsida retroviral (genes gag y pol) y el otro portando los genes que dan lugar a las proteínas de la envuelta

4 Talavera A, Martín F, Sánchez H. Los virus en la terapia génica. Publicación Oficial de la Sociedad Española de Virología 1996; 4:3-15.

La cadena negativa del ADN presenta un tracto de polipurina extra (2ª PPT), del que se origina una cadena positiva de ADN (ADN+ secundario). Otra cadena positiva, originada en la PPT normal (fuera de los límites del esquema), termina su síntesis en la región CTS, ulterior a la 2ª PPT, la zona del ADN comprendida entre ambas regiones de origen y terminación es, por lo tanto, tricatenaria.

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viral (gen env). La fracción de células empaquetadoras que han recibido el plásmido con el transgén, y que ahora pueden ya llamarse células productoras de retrovirus recombinantes, han de seleccionarse [usando para ello un gen selector que comúnmente acompaña al transgén], y ser usadas como población general para la producción de virus o, de manera óptima, ser clonadas para elegir los clones que producen más cantidad de partículas virales recombinantes, producción que depende, entre otros factores, del locus de la célula empaquetadora en el que el vector retroviral ha quedado integrado.

Ilustración 7 Técnica clásica de preparación de retrovirus recombinantes

Todo el proceso arriba indicado es tedioso y extenso en el tiempo. La aplicación de genes selectores de acción rápida, como el gen de la proteína verde fluorescente (EGFP) de la medusa Aequorea victoria5, ha posibilitado la preparación de células productoras mediante la técnica conocida como transfección transitoria, que consiste en la introducción simultánea en una población celular de todos los elementos necesarios para la producción de virus recombinantes (Ilustración 8), cuya expresión transitoria es suficiente para la preparación, durante un tiempo limitado, de virus recombinantes con títulos útiles para la mayoría de los experimentos. La cantidad de la transfección puede ser determinada, por medio de citometría, en una fracción de las células transfectadas al cabo de 24 o 48 horas después de la misma, de manera que si la proporción de células transfectadas (fluorescentes) resultara ser reducida (lo que sería indicativo de una baja producción de virus) se procedería a una nueva transfección sin la larga espera inherente al procedimiento de transfección estable. Para la transfección transitoria se utilizó en un primer momento la electroporación. Sin embargo, se ha determinado que para la preparación de células empaquetadoras por transfección transitoria es más conveniente usar el procedimiento «clásico» de introducción de material genético en células animales, es decir, la coprecipitación de ADN con fosfato cálcico, ya que produce menos mortalidad celular.

5 Prasher DC y cols. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 1992;111:2

El vector retroviral genómico se introduce en las células empaquetadoras, que expresan estable y constitutivamente los genes estructurales del retrovirus. Las células obtenidas producen partículas de virus que empaquetan el ARN que contiene el transgén.

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Ilustración 8 Empaquetamiento transitorio de retrovirus recombinantes

PseudotipajeLa formación de partículas de retrovirus recombinantes exige la participación de un gen que codifique las proteínas de la envuelta viral. La tecnología primitiva utilizaba los genes env correspondientes a las estirpes ecotrópica (capaz de infectar exclusivamente ratones y ratas) o anfotrópica (capaz de infectar un rango más amplio de huéspedes, entre los que se cuenta la especie humana) del virus de la leucemia murina de Moloney, dependiendo, en líneas generales, del destino último pensado para los vectores y de la seguridad respecto al experimentador de que se les deseaba dotar. La fragilidad que presentan las envueltas que contienen este tipo de proteínas hacía imposible la concentración de virus por métodos mecánicos, tales como la precipitación y centrifugación. Este inconveniente, unido al desarrollo posterior de vectores basados en el VIH, condujo a la producción de partículas virales que contenían envueltas propias de otros virus, procedimiento al que (tomando la terminología propia de un fenómeno natural conocido durante largo tiempo, merced al cual el virus de determinado tipo serológico adquirían, independientemente de su genoma, características inmunológicas de un tipo diferente) se le conoce como pseudotipaje. El gen normalmente elegido es el correspondiente a la proteína G de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular, que confiere a las partículas virales la resistencia mecánica suficiente para que puedan ser sometidas a concentración por los métodos anteriormente apuntados6.

ADENOVIRUS

Los adenovirus (Ad) son virus de ADN ampliamente desarrollados en terapia génica; su aislamiento en 1953 a partir de tejidos adenoides de niños dio origen a su nombre. A los adenovirus recombinantes usados como vectores se les han eliminado regiones de su genoma con la finalidad de inhibir su replicación. Debido a que no se integran en el genoma del huésped, estos virus sólo expresan el transgén en forma temporal durante su estancia en la célula. Los adenovirus deben su uso exitoso al hecho de su seguridad biológica, porque en forma natural en el humano sólo se les ha relacionado con padecimientos de vías respiratorias. Existen más de 40 serotipos de adenovirus, de los cuales los tipos 2 y 5 (Ad2 y Ad5) son los más utilizados como vectores génicos. Su

6 Sepiegel M y cols. Pseudotype formation of Moloney murine leukemia virus with Sendal virus glycoprotein. FJ Virol 1998; 72:5296-5302.

Una estirpe celular normal se cotransfectan con el vector retroviral genómico y con plásmidos que contienen los genes virales estructurales. Las células cotransfectadas expresan transitoriamente los productos de todos los genes introducidos, produciendo partículas virales con el ARN recombinante requerido.

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producción es relativamente sencilla, lo que ha facilitado una administración eficiente in vivo.Estos virus tienen además la capacidad de infectar un amplio espectro de células eucariotas, tanto en reposo como en replicación, siendo su principal órgano blanco el hígado (cuando es administrado por vía sistémica), en el cual logra transducciones de 80-90% en hígados de rata sanos y alrededor de 40% en hígados cirróticos por el modelo de intoxicación por CCl. El principal inconveniente para su utilización en el envío de genes a órganos o tejidos específicos, es la vigorosa respuesta inmunológica que despiertan, caracterizada por una intensa inflamación, así como por activación de linfocitos T citotóxicos. En un intento por aminorar la intensidad de la respuesta inmune despertada en el huésped por el adenovirus se han escindido extensas porciones en el genoma viral produciendo así los llamados adenovirus gutless que expresan menos proteínas virales; despertando por ende una menor respuesta inmunológica.

A lo largo de los últimos años se han desarrollado nuevas generaciones de vectores adenovirales:

a) Vectores con genes inactivados, también denominados vectores de primera generación, fue el primero en ser desarrollado con esta clase de virus. En la anterior revisión se trató de la base del diseño de vectores adenovirales de esta generación, consistente, originalmente en la deleción de la región temprana E1 del genoma. Más tarde se añadieron deleciones en otras regiones tempranas, principalmente la región E3, para aumentar la seguridad de estos vectores.

b) Vectores vacíos. Las deleciones citadas resultaron no ser suficientes para evitar el elevado riesgo de inmunotoxicidad de estos vectores, debido a la expresión remanente de proteínas virales. Consecuentemente se desarrollaron los denominados vectores vacíos en los que sólo se mantienen las secuencias necesarias en cis, incluyendo los dos orígenes de replicación en los extremos del genoma, así como las secuencias de empaquetamiento. La producción de estos vectores requiere el uso de adenovirus auxiliares, que pueden ser separados mediante técnicas biofísicas gracias a su diferente contenido en ADN. Un mecanismo adicional de seguridad que evita la producción de éstos consiste en el flanqueamiento de la región de empaquetamiento de los virus con la secuencia IoxP, que, en presencia de la recombinasa Cre se escinde, evitando la encapsidación del genoma del virus auxiliar (Ilustración 9). En la actualidad, se están llevando a cabo mejoras en las líneas productoras de estos vectores que permitan su producción a gran escala en biorreactores.

La eficacia de estos vectores está siendo evaluada en tratamientos tan diversos como la disfunción eréctil, mediante la transferencia del gen de la sintetasa de NO neuronal (nNOS) en el pene de ratas envejecidas, o la hemofilia A con un vector que contiene el gen del factor de coagulación VIII y cuya administración intravenosa en ratones permite una expresión mantenida durante nueve meses frente a los tres obtenidos con un vector de primera generación, así como la pérdida visual debida a retinopatías de origen diabético tras la inyección intraocular de adenovirus vacíos que expresan el gen de la endostatina, un inhibidor de la vascularización coroidal.

c) Adenovirus oncolíticos. El descubrimiento en 1996 de que ciertas estirpes de adenovirus con mutaciones en la zona E1B del genoma (gen que codifica una proteína capaz de inactivar el gen supresor de tumor p53), podían replicar y lisar células humanas deficientes en p53, condujo al desarrollo de nuevas estrategias antitumorales. Los éxitos obtenidos con este nuevo tipo de virus denominado ONYX-015 en ensayos clínicos de fase I y II ha permitido la realización de ensayos clínicos en fase III para el tratamiento de carcinoma de células escamosas de cuello y cabeza.

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Sin embargo, no todos los protocolos clínicos ensayados han tenido el éxito que cabría esperar. Una de las razones de ello estriba en la ausencia de un receptor celular adecuado para estos vectores en las células tumorales. Entre los tratamientos que sí parecen estar funcionando, cabe destacar los protocolos en fase II aprobados para pacientes de cáncer colorrectal, con tumores hepatobiliares, o con carcinomas pancreáticos no extirpables.

Ilustración 9 Empaquetamiento de seguridad de adenovirus recombinante

En la tabla 5 se resumen las ventajas y desventajas presentadas por los vectores virales utilizados en terapia génica entre los que destacaremos los retrovirus, adenovirus y el herpes simple.

Tabla5. Características de los vectores biológicos utilizados en terapia génicaVector Ventajas Desventajas

Retrovirus – Integración estable– Fácil manejo– No provocan respuesta inmune– Transducción eficiente

– Bajo título– Posible mutación insercional– Extinción del transgén in vivo– Requieren proliferación celular

Adenovirus – Células en reposo o replicación– Episomales– Estables in vivo– Títulos altos

– Respuesta inmune e inflamatoria– Direccionabilidad difícil– Difícil manejo

Adenoasociados – Células en reposo o replicación– Posible integración específica– Poco inmunogénicos– Títulos altos– No son patógenos en humanos

– Poca longitud del transgén– Difíciles de producir en gran cantidad– No parecen transducir a todotipo de células in vivo– Posible mutación insercional

Herpes virus – Células en reposo– Episomales– Adecuados para el sistemanervioso

– Patogenicidad– Difícil manejo

La estirpe celular 293Cre se transfecta con un plásmido que contiene el transgén flanqueado por los extremos del ADN de adenovirus, incluyendo las ITR y las secuencias de empaquetamiento, además de secuencias de ADN no expresable cuya misión es que la distancia entre los extremos sea la apropiada para que el tamaño del ADN permita su encapsidación, las células transfectadas se infectan con un adenovirus auxiliar cuyo ADN aporta todos los genes virales necesario para la formación de las cápsidas, pero cuya zona de empaquetamiento está contenida entre dos regiones IoxP. La recombinasa Cre expresada por las células promueve la recombinación entre ambas regiones IoxP, eliminando la región de empaquetamiento del ADN auxiliar, que no puede entrar a formar parte de la progenie. En cambio, el ADN que contiene el transgén el empaquetado normalmente para dar lugar a partículas de virus recombinante.

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