Aplicacion PCR

Amplificacin de cidos nucleicos in vitro.

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Amplificacin de cidos nucleicos in vitro.El principal objetivo de las tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos in vitro, es mejorar la sensibilidad de los test basados en cidos nucleicos y simplificarlos mediante el uso de la automatizacin y la incorporacin de sistemas de deteccin no radiactivos. La tecnologa subyacente a las tcnicas de amplificacin es diversa y en continua transicin, por lo que se hace necesario una clasificacin de las mismas; una de esas clasificaciones divide los mtodos de amplificacin de los cidos nucleicos en tres grandes categoras: sistemas de amplificacin de la diana, que incluye la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), la autorreplicacin de la secuencia (3SR) y la amplificacin por desplazamiento de la hebra (SDA) Sistemas de amplificacin de la sonda, que incluye la replicasa Q o la reaccin en cadena de la ligasa (LCR) Sistemas de amplificacin de la seal, en los cuales la seal generada por cada sonda es aumentada. Son mtodos in vitro que amplifican enzimticamente una molcula diana hasta niveles a los cuales pueden ser fcilmente detectados. Mediante estos mtodos se puede realizar la identificacin de un patgeno al mismo tiempo que se obtiene una rplica exacta de la secuencia diana que posteriormente podr ser caracterizada y secuenciada; esta es la propiedad que diferencia estos mtodos de otros mtodos de amplificacin. Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). Desde 1983, ao en el que se describi por primera vez la tcnica por cientficos de la empresa Cetus Corporation, la PCR se ha convertido en una tcnica fundamental en la mayora de los laboratorios de Biologa Molecular. La tcnica se basa en la repeticin de ciclos de sntesis de DNA dirigida por oligonucletidos para realizar la replicacin in vitro de secuencias diana de cidos nucleicos (figura 1). Estos oligonucletidos, cuya secuencia viene determinada por el cido nucleico diana, se sintetizan para ser complementarios de sus zonas de annealing dentro de las dos diferentes hebras (hebra + y -) de la secuencia diana. La distancia entre los primers se determina empricamente y depende de numerosos factores; el intervalo habitual entre primers para ensayos diagnsticos es entre 50 y 1.500 bases. En su forma ms bsica, cada ciclo de PCR consta de tres pasos: Etapa de desnaturalizacin. En ella, el DNA diana se incuba a elevada temperatura ( 94C) de tal manera que las hebras se separan quedando accesibles a la hibridacin de los primers. Etapa de annealing. En ella, la mezcla de reaccin se enfra ( 55 65C) para permitir que los primers hibriden con la secuencia complementaria. Etapa de extensin. Se suele realizar a 72C y en ella los primers se extienden mediante una DNA polimerasa, utilizando el DNA diana como molde, realizndose entre 30 y 50 ciclos en cada reaccin. Durante todos los ciclos de amplificacin, las reacciones de extensin de los primers finalizan a diferentes distancias de los primers, originando productos de amplificacin de diferentes longitudes. No obstante, despus del segundo ciclo de amplificacin, los "productos cortos" empiezan a acumularse y rpidamente se convierte en el producto predominante. El punto de partida ptimo del proceso de identificacin de una secuencia diana para la deteccin de un determinado patgeno o agente infeccioso es la literatura. La relativa facilidad con la que actualmente se puede clonar y secuenciar los cidos nucleicos ha originado una explosin de informacin de secuencias disponibles y la tendencia de depositar dicha informacin de las secuencias directamente en bancos de datos de cidos nucleicos como el GenBank (Los lamos, N.M.) y el European Molecular Biology Laboratories - EMBL (Heielberg, Alemania).

Mtodos de Amplificacin de la Diana.

Fig. 1. En el primer ciclo, se utiliza como molde una secuencia de dsDNA. Las dos hebras se desnaturalizan por calor ( 94C) y los dos oligonucletidos sintticos (primers) hibridan con sus respectivas secuencias en direccin 5' 3' (los extremos 3' de ambos primers quedan enfrentados). La Taq DNA polimerasa inicia la sntesis en el extremo 3' de cada primer (por lo tanto, en direccin 5' 3') originando nuevos sitios de unin para los primers. El resultado neto despus del primer ciclo de amplificacin es dos copias "degeneradas" (de diferente longitud) del DNA original, de tal forma que al final de todos los ciclos, se obtiene una acumulacin de dichos "productos cortos".

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La eleccin de los primers es un elemento crtico para el desarrollo de los sistemas de deteccin basados en la amplificacin de cidos nucleicos y hay que tener en cuenta muchas consideraciones para disearlos: Longitud del primer. Viene determinada por la conservacin de la secuencia, tamao y composicin de la secuencia diana. Si se elige una secuencia altamente conservada, el tamao de la sonda es menos restrictiva; por el contrario, si se elige para la amplificacin una secuencia muy polimrfica, las zonas que muestren suficiente conservacin limitaran el tamao de la sonda o la regin de la secuencia entre la que se puede seleccionar la sonda. Para la PCR, los primers usados para la reaccin de amplificacin varan entre 15 y 30pb; los primers ms cortos pueden no proporcionar la adecuada especificidad y los ms largos no incrementan la especificidad y son ms caros de sintetizar. La longitud del primer tambin influye en la capacidad del sistema para tolerar errores. La longitud total del primer es la suma de la regin especfica de la diana ms la de los nucletidos no especficos de la diana, como por ejemplo, zonas de reconocimiento para endonucleasas de restriccin, que se aaden al extremo 5'. La adicin de nucletidos sin diana al extremo 5' de la sonda puede alterar significativamente las caractersticas de hibridacin del primer y, por lo tanto, el rendimiento. Durante los primeros ciclos de amplificacin, los primers complejos hibridan con la diana por la mayora del extremo 3', mientras que la cola 5' no participa en la hibridacin. Sin embargo, en los posteriores ciclos de amplificacin se acumulan los productos cortos, lo que permite que se una el primer entero; el efecto neto es una elevacin en la temperatura de melting del primer. Por lo tanto, para primers con extensiones en el extremo 5', un incremento de la temperatura de annealing despus de los primeros 5-10 ciclos pueden resultar en un mayor rendimiento de la reaccin de amplificacin. Temperatura de melting del primer. Se define la temperatura de melting (Tm) de un primer unido a su cido nucleico diana como la temperatura a la cual el 50% de los primers estn unidos y el 50% estn en solucin. La Tm es dependiente de la concentracin de primer, la composicin de la secuencia y de la composicin del solvente y es diferente de la temperatura de disociacin. Los primers pequeos tienen una Tm inferior que los grandes aun teniendo la misma composicin; sin embargo, cuando el tamao de los primers se aproxima a las 20-25pb el efecto de la longitud sobre la Tm disminuye, por lo que en los primers normalmente utilizados en la amplificacin, el principal efecto sobre la Tm viene dado por la composicin del primer. Existen en la literatura numerosas frmulas para el clculo de la Tm. El mtodo ms simple y ms ampliamente utilizado se basa en asignar 2C por cada A o T y 4C por cada G o C y, aunque se consiguen buenas aproximaciones con l, la precisin disminuye bastante cuando se incrementa la longitud del primer (por ejemplo, la Tm para un 20mer con igual contenido en A+T y G+C sera de 60C, que se aproxima bastante a la realidad; sin embargo, para un 40mer de la misma composicin, la Tm sera un valor totalmente absurdo de 120C). Tm = [2 (A + T ) + 4 (G + C )] 5 Los mtodos ms precisos para el clculo de la Tm se basan en el estudio de las interacciones con los "vecinos" dentro de la doble hebra de DNA; este anlisis asigna un peso de la temperatura a diferentes combinaciones de pares de bases y la media de pesos de la temperatura es lo que determina la Tm, por lo que al basarse en una media en lugar de una suma, el anlisis no se ve sesgado por laopt longitud del primer. Una frmula til para calcular la temperatura de annealing ptima ( Ta ) y que se basa en estudios empricos de

primers es la siguiente:opt primer producto + 0,7 Tm 14,9 Ta = 0,3 Tm

primer : T calculada del par " primer - template" menos estable Tm m producto Tm : Tm del producto de PCR

Los valores de Tm calculados para los dos primers usados en la amplificacin deberan ser lo ms prximos posible, para evitar la "unin asimtrica" de los mismos, es decir, que una de los primers se una a su secuencia diana con mayor afinidad que el otro bajo las mismas condiciones de hibridacin. La unin asimtrica se observa cuando la temperatura de annealing se encuentra entre las Tm de dos primers con muy diferentes Tm. Para la PCR, generalmente es aconsejable escoger primers con temperaturas ptimas de annealing entre 55C y 65C, ya que temperaturas inferiores pueden ocasionar una baja especificidad y sensibilidad de la diana por competicin entre productos especficos e inespecficos.Secuencia. La composicin de nucletidos de los primers utilizados en el protocolo de amplificacin determina directamente la temperatura de annealing a usar en el mismo. Para ello hay que tener en consideracin algunos puntos importantes:

Deben evitarse las repeticiones largas del mismo nucletido, ya que pueden disminuir la especificidad de la diana. El contenido G+C de los primers debe aproximarse o superar ligeramente al contenido de G+C de la diana, ya que los primers deficientes en G+C que flanquean dianas ricas en G+C pueden no competir efectivamente por la unin, lo que origina una baja eficiencia de amplificacin. Hay que tener en consideracin muy especialmente el extremo 3' de los primers, ya que es el extremo que reconocen las polimerasas. Una elevada proporcin de residuos G+C en el extremo 3' puede originar una baja especificidad por la diana debido a la tendencia de estas regiones a proporcionar uniones muy estables con secuencias inespecficas (no pertenecientes a la diana). Tambin se ha demostrado en la literatura que los primers que terminan en un residuo de T3' son mas tolerantes a la incorporacin de errores que otros nucletidos. Para regiones codificadoras de protenas, hay que tener en cuenta la posicin del extremo 3' del primer con respecto al origen de replicacin (Open Reading Frame; ORF) de la diana (ver el apartado de la localizacin de la secuencia diana). En la tabla I se muestran los parmetros que favorecen las uniones especficas e inespecficas de los primers a sus respectiva dianas:Tabla I. Parmetros de tolerancia de las sondas. Probabilidad de uniones inespecficas Longitud de la sonda entre 25 y 35pb Elevada [dNTP] (0,8 4,0mM) Baja temperatura de annealing Elevado nmero de ciclos Mal apareamiento en o prximo al extremo 5' Residuo de T en el extremo 3' Probabilidad de uniones especficas Longitud de la sonda entre 14 y 18pb Baja [dNTP] ( 50M) Elevada temperatura de annealing Bajo nmero de ciclos Mal apareamiento en o prximo al extremo 3' Residuo de A, G C en el extremo 3'

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Caractersticas fsicas. Debe evitarse el auto-annealing (formacin de horquillas o lazos) ya que reduce la concentracin efectiva de los primers al producirse una competencia entre la unin de los primers entre s y a la diana. Adems, debe evitarse muy especialmente la complementariedad en el extremo 3' del primer, ya que reduce drsticamente la concentracin efectiva del mismo. Interacciones primer-primer. El trmino "primerdimer" o dmeros de primers se refiere a la acumulacin de productos pequeos de PCR y que miden aproximadamente igual que dos primers unidos uno a continuacin de otro. Incluso en reacciones muy optimizadas, se pueden obtener pequeas cantidades de estos artefactos, pero en elevadas cantidades pueden disminuir la sensibilidad de la reaccin al competir por los componentes de la misma.

Normalmente, estos artefactos se pueden evitar eliminando la complementariedad en los extremos 3' (aunque sea en un solo nucletido) de los dos primers utilizados para la amplificacin (especialmente si son residuos G-C).Localizacin en la secuencia diana. Como se ha comentado anteriormente, cuando se va a amplificar secuencias codificadoras, hay que tener especial consideracin con la posicin del extremo 3' de la sonda en relacin al ORF (origen de replicacin). La presin de seleccin por mantener la secuencia dentro del ORF se refiere generalmente al aminocido y debido a la degeneracin del cdigo gentico, hay varios codones que pueden codificar el mismo aminocido, lo que permite variar la secuencia de nucletidos manteniendo la presin de seleccin a nivel de las protenas.

En el codn, la posicin con mayor variabilidad (o bamboleo) es la tercera, por lo que una aproximacin bastante adecuada es disear las sondas de tal forma que los nucletidos del extremo 3' se apoyen en la primera o segunda base de un codn conservado. Para dianas que no codifiquen protenas (regiones reguladoras o rRNA) la presin de seleccin hacia la conservacin de la secuencia es a nivel de secuencia de nucletidos, por lo que a la hora de disear primers para detectar estas dianas no se debe tener en cuenta su posicin con respecto al ORF. Todas las tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos, independientemente del tipo que sea, necesitan elevadas concentraciones de primers especficos de la diana. En los ltimos aos se han desarrollado numerosos instrumentos para automatizar la compleja qumica de sntesis de estos oligonucletidos y producir grandes cantidades de oligonucletidos relativamente puros. La qumica de la sntesis de DNA es relativamente sencilla: un P3' de un nuclesido se une qumicamente al extremo hidroxilo 5' de otro nuclesido unido a un soporte slido. A partir de este momento se necesitan otras tres reacciones qumicas para preparar el nucletido para el siguiente ciclo de unin: "sellado" (capping), oxidacin y desbloqueo (detritilacin); en la actualidad, el rendimiento de dicha unin es mayor del 99% en cada ciclo, por lo que la pureza del producto final es dependiente del nmero de ciclos de sntesis (cuanto ms largo sea el primer, menor rendimiento).P

Despus de la eleccin de los primers, el siguiente paso para incrementar la sensibilidad y especificidad de la reaccin es la optimizacin de todos los parmetros de la misma; dichos parmetros no tienen la misma importancia ni peso sobre la reaccin de amplificacin, pero puesto que la variacin de cada uno de ellos influye en el resto, no hay acuerdo en la literatura sobre qu parmetros deben optimizarse primero y cuales despus:Temperatura de annealing. Como se ha comentado anteriormente, la temperatura de annealing de los primers se puede calcular con diferentes frmulas, pero la temperatura ptima debera determinarse empricamente.

La optimizacin de la temperatura de annealing es particularmente importante segn aumenta la complejidad gentica de la muestra. Una mayor complejidad favorece el annealing inespecfico y bajo condiciones no muy estrictas la baja especificidad puede provocar la amplificacin de productos inespecficos que se observan en los geles como bandas de pesos moleculares superiores o inferiores a los esperados. La temperatura ptima de annealing para un determinado protocolo a menudo es superior que la predicha por las frmulas matemticas. Como regla general, conviene empezar por la temperatura obtenida de dichas frmulas e irla incrementando varios grados; a la primera seal de prdida de sensibilidad se debe elegir la temperatura inmediatamente inferior.Concentracin de Mg2+. El aumento de la [Mg2+] tiene el efecto neto de disminuir la severidad de la unin de los primers y, por lo tanto, una baja especificidad de la reaccin; las bajas [Mg2+] pueden originar una pobre eficiencia de la reaccin.

La [Mg2+] debe calcularse como funcin de la concentracin de nucletidos; para la mayora de protocolos, debe probarse un rango de [Mg2+] entre 0,5 y 3,0mM por encima de la concentracin de nucletidos. Puesto que las soluciones de MgCl2 tienden a precipitar despus de los ciclos de congelacin-descongelacin, la solucin stock de MgCl2 debe mantenerse a 4C y aadirse a la master mix justo antes de la amplificacin.Desoxinucletidos Trifosfato (dNTPs). La concentracin ptima de dNTPs debe determinarse empricamente y conjuntamente con la [Mg2+]. De forma general, la [dNTPs] vara entre 20 y 200mM, teniendo en cuenta que concentraciones demasiado elevadas pueden originar una menor especificidad y concentraciones demasiado bajas pueden provocar un bajo rendimiento de los productos de amplificacin. Eleccin y concentracin de la enzima. Las concentraciones de las diferentes polimerasas utilizadas en la PCR varan significativamente, pero para la Taq polimerasa vara entre 1,0 y 2,5U por cada 100L de reaccin. Para optimizar la concentracin de enzima, se debe testar empricamente el protocolo variando la concentracin entre 0,5 y 5,0U por cada 100L de reaccin.

Cuando la concentracin de enzima es muy elevada se produce la unin inespecfica de los primers y cuando es demasiado baja se obtiene una baja eficiencia de amplificacin. En los ltimos aos han aparecido una elevada cantidad de polimerasa comerciales que se diferencian en diversos parmetros como son la estabilidad trmica, actividad exonucleasa, procesividad, tasa de incorporacin de errores y actividad transcriptasa inversa.Concentracin de los primers. Si la concentracin de primers es baja puede ocasionar un pobre rendimiento de la reaccin. Si es demasiado alta puede ocasionar una disminucin de la especificidad que se manifiesta por un incremento en los productos de amplificacin inespecficos; adems, puede favorecer la formacin de dmeros de primers. Aditivos. La formamida y el dimetil sulfxido son tolerados a bajas concentraciones en la reaccin de PCR y pueden ayudar a amplificar dianas ricas en G+C, ya que, probablemente, facilitan la separacin de las hebras y, por lo tanto, mejoran la accesibilidad del template a las sondas y la polimerasa.

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El efecto del glicerol en la mejora del rendimiento de los productos de PCR no se conoce con exactitud, pero, presumiblemente, ayuda a estabilizar la Taq polimerasa. La adicin de glicerol puede ser necesaria si se est utilizando el mtodo de inactivacin fotoqumica con isopsoralen1, ya que la inhibicin de la PCR por elevadas concentraciones de isopsoralen puede ser solventada por la adicin de un 10% de glicerol.Tanto los psoralens como los isopsoralens y sus derivados son reactivos tricclicos planos que se intercalan entre los pares de bases de los cidos nucleicos; contienen dos dobles enlaces reactivos que, cuando son excitados, se unen covalentemente a los cidos nucleicos formando aductos de ciclobutano con las bases pirimidnicas. Los amplicones modificados son refractarios a nuevos ciclos de amplificacin ya que los aductos bloquean la reaccin de extensin dependiente de template llevada a cabo por la Taq polimerasa. Las longitudes de onda utilizadas para el proceso de inactivacin varan entre 300 y 400nm ya que minimizan el dao a los nucletidos de los amplicones.1

Fig. 2. Estructura del psoralen y del isopsoralen. En el momento de la preparacin, se colocan el cido nucleico diana y los reactivos de PCR en un tubo de microcentrfuga junto con el reactivo fotoqumico; se cierra el tubo y se realiza la amplificacin. Despus de la misma, pero antes de abrir nuevamente el tubo y que los productos de amplificacin entren en contacto con el aire, se activa el reactivo fotoqumico exponindolo a la luz entre 300 y 400nm (los tubos de polipropileno utilizados normalmente en las reacciones de PCR son transparentes a estas longitudes de onda y permiten la fotoactivacin). Despus de completar el proceso fotoqumico, se abre el tubo y se detectan los productos de PCR modificados de forma habitual (en geles de agarosa para dsDNA o mediante hibridacin con sondas complementarias para ssDNA). La inactivacin fotoqumica puede disearse de forma que virtualmente todos los amplicones sean inactivados. Sin embargo, dicho proceso de inactivacin es estadstico y se puede dar la inactivacin parcial. El nmero absoluto de aductos por amplicn no es constante y la fraccin de amplicones que escapan de la modificacin fotoqumica y, por lo tanto, no son inactivados, viene determinado por la longitud y secuencia del amplicn y por la concentracin del reactivo de inactivacin: un producto de PCR de 115 nucletidos es mucho ms difcil de inactivar que uno de 500 nucletidos bajo las mismas condiciones. Debido a que las secuencias ricas en A+T son ms reactivas con los psoralens, la eleccin de primers que generen productos grandes (mayores de 200-300pb dependiendo del contenido en G+C) o ricos en A+T facilitarn el proceso de inactivacin. La eficiencia de inactivacin tambin se puede incrementar aumentando la concentracin de isopsoralen (la concentracin ms efectiva est entre 25 y 200g/mL).

Fig. 3. Pasos del mtodo de inactivacin fotoqumica

Recientemente, se ha observado que la adicin de protenas de unin a DNA monocatenario (Single Strand Binding Proteins; SSBs) puede reducir las amplificaciones inespecficas, mejorar el rendimiento de los productos de reaccin y ayuda a solventar las inhibiciones; se cree que el mecanismo es porque secuestran los primers durante el periodo de organizacin de la reaccin, evitando las uniones inespecficas de stos.Protocolos "Hot Start". En una reaccin tpica de PCR, todos los componentes de la reaccin se mezclan en la llamada "master mix" y se mantienen a 4 25C antes de dispensarlos en los tubos de reaccin. En ese momento, se aade el DNA diana a la mezcla de reaccin y se colocan en el termociclador.

Durante el tiempo que se tarda en preparar la reaccin antes de poner los tubos en el termociclador y durante el primer ciclo de calentamiento, la Taq polimerasa es capaz de elongar los complejos sondatemplate formados bajo condiciones de hibridacin poco estrictas. Aunque las posteriores temperaturas de annealing no caigan nunca por debajo de los 5560C los productos inespecficos originados durante ese periodo pueden afectar a la sensibilidad y especificidad de la reaccin. La tcnica del "hot start" evita la formacin de estos productos inespecficos manteniendo un componente esencial de la reaccin (los nucletidos, el Mg2+, los primers o la polimerasa) separado de la diana durante los momentos en los que las condiciones son muy poco estrictas y aadindolo a la mezcla de reaccin una vez se hayan alcanzado temperaturas elevadas ( 95C). En ese momento la mezcla de reaccin se enfra a la temperatura adecuada de annealing, permitiendo la unin especfica de la sonda a su diana para iniciar la sntesis. Entre los diferentes mtodos existentes para realizar una hot start, estn la utilizacin de bolas de cera que contienen uno de los componentes de la reaccin y que no se derriten hasta alcanzar los 95C, retener la adicin de la Taq polimerasa hasta que los tubos estn en el termociclador, la utilizacin del mtodo de la UNG2 o la utilizacin de anticuerpos monoclonales contra la Taq que inhiben su actividad hasta alcanzar temperaturas que desnaturalizan el anticuerpo dejando libre la enzima.2

La Uracil-N-glicosilasa (UNG) es una enzima reparadora del DNA que se encuentra en una amplia variedad de especies bacterianas. La funcin normal de esta enzima es eliminar los residuos de uracilo (desoxiuracilo) que se crean por la desaminacin espontnea de los residuos de citosina en el dsDNA (figura 4). Un fallo en la capacidad del microorganismo de reconocer y eliminar los residuos de uracilo, origina una elevada frecuencia de mutaciones por cambios C-T al incorporarse residuos de adenina en los templates.

Fig. 4. Inactivacin de productos de PCR inespecficos (amplificados previamente) mediante el mtodo de la UNG.

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En 1990, Longo et al. publicaron un mtodo que utilizaba la UNG para inactivar los productos de amplificacin por PCR. Durante la amplificacin, los TTPs son sustituidos por dUTPs que sirven como substrato para la Taq polimerasa en lugar de los TTPs, por lo que los productos de amplificacin contienen residuos de desoxiuracilo; esto sirve para distinguir qumicamente los productos de PCR del template original, ya que slo los productos sintetizados contendrn desoxiuracilo. Si en la mezcla de reaccin existen productos de PCR con dUTP como contaminantes, la adicin de UNG a la mezcla provocar la eliminacin de los mismos del DNA y el producto de reaccin es entonces susceptible de hidrlisis alcalina a elevadas temperaturas. La UNG se aade a la mezcla de reaccin antes de la amplificacin; durante una corta incubacin previa a la amplificacin, los productos de PCR inespecficos con dUTP que puedan haberse formado son rotos por la UNG, inactivndolos como templates, por lo que en los ciclos iniciales de PCR, la sntesis de DNA ocurre exclusivamente sobre el template original que se encuentra a salvo de la accin de la UNG (fig. 5).

Fig. 5. Protocolo del mtodo de inactivacin por UNG. Otra consideracin a tener en cuenta es que si se va a utilizar el mtodo de inactivacin de la Uracil-N-glicosilasa (UNG), las temperaturas de annealing de los primers no deben estar por debajo de los 55C ya que la UNG puede reactivarse a bajas temperaturas, lo que origina una menor eficiencia de amplificacin por la degradacin de los productos de amplificacin segn se van sintetizando.

Multiplex PCR. En esta modificacin de la PCR se incluyen dentro de la misma reaccin de amplificacin mltiples pares de primers especficos para diferentes dianas, por lo que se produce una coamplificacin de diferentes dianas; esta modificacin tiene las siguientes ventajas:

se pueden testar grandes regiones de la secuencia del DNA en busca de alteraciones o modificaciones. se pueden testar segmentos no relacionados del genoma diana. se pueden incluir controles internos de amplificacin de la muestra. se puede testar una misma muestra contra diferentes patgenos. Deteccin de Mutaciones Puntuales. El ARMS (Amplification Refractory Mutation System) utiliza primers de PCR con errores en el extremo 3' y una polimerasa que carece de la 5' para detectar errores especficos en la secuencia de nucletidos. Como se sabe, la elongacin de una sonda actividad exonucleasa 3' depende del apareamiento estable del extremo 3' del primer; cuando se produce un mal apareamiento, la elongacin y, por consiguiente, el proceso de PCR, a menudo se ve imposibilitado.

El ARMS utiliza la amplificacin selectiva basada en malos apareamientos en el extremo 3' para identificar mutaciones especficas, demostrando la presencia de una secuencia de nucletidos que no puede ser amplificada con los primers "salvajes", pero que s puede serlo con primers que contienen la mutacin esperada. Determinacin de la Secuencia. La determinacin directa de la secuencia de nucletidos es especialmente til para identificar la composicin de secuencias diana con alta variabilidad y que son amplificadas mediante primers de "amplio espectro". Para facilitar la secuenciacin por el mtodo de terminacin dideoxi de la cadena, se pueden generar templates de cadena sencilla mediante la amplificacin asimtrica o mediante la captura de afinidad de ssDNA utilizando primers biotinilados y bolas magnticas recubiertas de avidina.

Recientemente se ha descrito la tcnica de la secuenciacin cclica en la cual, la Taq polimerasa se utiliza para realizar la amplificacin y la secuenciacin simultneamente; una reaccin de secuenciacin cclica necesita solamente femtomoles de diana para la determinacin de cadenas de cientos de bases de longitud. Nested Amplification. En esta modificacin de la PCR se utilizan sets de primers anidados, de tal forma que se realiza una primera ronda de amplificacin con uno de los pares de primers (15-30 ciclos) obtenindose el producto habitual de amplificacin, el cual se transfiere a un segundo tubo para una segunda ronda de amplificacin (otros 15-30 ciclos) con el segundo par de primers especficos para una secuencia interna amplificada por el primer par de primers; despus de la segunda amplificacin, los productos amplificados se detectan de forma habitual mediante electroforesis.

Esta modificacin de la PCR posee bastantes ventajas:03.2006 www.cultek.com Pgina 5 de 12

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la sensibilidad es extremadamente alta ya que habitualmente se puede detectar una sola copia de la diana sin necesidad de hibridar con sondas marcadas. la reamplificacin con el segundo par de primers internos sirve para verificar la especificidad de la primera ronda de amplificacin. la transferencia de los productos de reaccin a un segundo tubo sirve para diluir los posibles inhibidores que puedan estar presentes en inicialmente en la muestra. Tambin hay alguna desventaja, ya que no es muy recomendable la apertura del primer tubo de amplificacin (sobre todo en laboratorios de diagnstico clnico), ya que durante la transferencia se produce, inevitablemente, la contaminacin de la muestra con aerosoles y el producto de la primera amplificacin no puede ser inactivado por mtodos convencionales ya que tiene que servir de molde para la segunda amplificacin.

Para solucionar estas desventajas, se han desarrollado algunas alternativas al mtodo original para realizar la Nested sin transferir la muestra de un tubo a otro tras la primera amplificacin: colocar el segundo par de primers (los internos) en buffer en la parte inferior del tubo y justamente encima, separado por una fina capa de aceite mineral la mezcla de reaccin con el primero de las sondas. Despus de la primera ronda de amplificacin, se saca el tubo del termociclador y se le da un pulso de centrfuga, de forma que se mezclan la capa superior (ya amplificada) y la inferior (que posee los primers internos), al mismo tiempo que se diluyen los componentes de la primera ronda de amplificacin; de esta forma se puede realizar la segunda ronda de amplificacin.

la segunda alternativa se basa en las diferentes temperaturas de annealing del primer y segundo set de primers (los internos) y las diferentes temperaturas de desnaturalizacin de los productos de amplificacin grandes y pequeos; la temperatura de annealing del primer set de primers es inferior que el del segundo, ya que sta contiene colas ricas en G+C.

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Segn esto, la primera ronda de amplificacin de realiza a una temperatura de annealing inferior lo que favorece la unin de la primera de las sondas y, posteriormente, se eleva la temperatura de annealing, con lo que se favorece la unin de la sonda interna y se realiza la segunda ronda de amplificacin. Deteccin y amplificacin de dianas de RNA. Algunas dianas genmicas estn presentes slo como RNA (virus de la Hepatitis C, de la Influenza, Picornavirus, etc.) y no sufren transcripcin inversa a un intermediario de DNA durante su ciclo de vida. La deteccin del RNA puede ser tambin til para la identificacin de microorganismos superiores como bacterias y hongos, ya que contienen miles de molculas de mRNA o tRNA. Incluso, la deteccin especfica del RNA se ha demostrado til para la monitorizacin de algunas terapias antimicrobianas, debido a la mayor produccin de RNAs o para el estudio de determinados estados patognicos asociados con la expresin gnica.

Se pueden detectar los templates de RNA por PCR, si el RNA extrado es copiado previamente a cDNA mediante la utilizacin de una transcriptasa inversa retroviral, inicialmente aislada del virus de la mieloblastosis aviar. No obstante, esta enzima presentaba una serie de dificultades entre las que destacan el ser trmicamente lbiles, por lo que no podan usarse a temperaturas superiores a 42C. Posteriormente, se describi la actividad transcriptasa inversa dependiente de Mn2+ en la DNA polimerasa termoestable de Thermus thermophilus, lo que implica que esta enzima es capaz de copiar RNA a DNA a 72C en presencia de Mn2+. Una vez se ha realizado la copia de RNA a DNA (cDNA), la adicin de Mg2+ y EGTA [cido etilen glicol-bis(-aminoetil eter)-N,N,N',N' tetraactico] como quelante de los cationes Mn2+ a la mezcla de reaccin, hace que la DNA polimerasa de T.thermophilus cambie su especificidad de RNA a DNA, es decir, utilice como template DNA en lugar de RNA. Gracias a esta doble actividad, una sola enzima es capaz de copiar RNA en cDNA y amplificarlo mediante PCR mediante un simple cambio en el buffer de reaccin.

Fig. 6. Esquema general de la amplificacin de una RNA mediante transcripcin inversa del RNA a cDNA y posterior PCR con la DNA polimerasa de Thermus thermophilus.

TAS (Transcripcion-based Amplification System). El primer sistema de amplificacin no basado en la PCR fue descrito en 1989 por Kwoh et al. y se basa en la amplificacin mediante transcripcin in vivo. Cada ciclo de TAS consiste en dos partes:

sntesis de una molcula de DNA que es complementaria del cido nucleico diana. transcripcin in vivo utilizando el cDNA recin sintetizado como molde. 03.2006 www.cultek.comPgina 7 de 12

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La sntesis del cDNA se realiza mediante primers especialmente diseados: un extremo del primer consiste en una secuencia especfica de la diana y el otro extremo contiene un promotor para la RNA polimerasa del fago T7. En el primer paso, se produce una molcula de ssDNA a partir de cada molde de DNA o RNA por la accin de la transcriptasa inversa. Despus de la desnaturalizacin trmica de las dobles hebras de RNA-DNA o DNA-DNA se sintetiza una segunda hebra mediante la transcriptasa inversa, de tal forma que el dsDNA resultante contiene el promotor de T7 en uno de ambos extremos. A continuacin, se aade la RNA polimerasa del fago T7 a la mezcla con el cDNA, producindose hasta 40 molculas de RNA a partir de cada molcula de cDNA template, es decir, la accin de la T7 polimerasa proporciona el paso de amplificacin. La doble hebra de cDNA sirve de molde para la sntesis de una gran cantidad de moles de RNA, las cuales pueden ser nuevamente utilizadas como substrato para el prximo ciclo de TAS. Con este mtodo, puede detectarse hasta una clula infectada por HIV-1 en una poblacin de 106 clulas sin infectar. Uno de los inconvenientes de esta tcnica es la necesidad de desnaturalizar trmicamente los hbridos RNA-DNA durante cada ciclo de amplificacin, porque ninguna de las enzimas utilizadas en la TAS son termoflicas y deben ser reemplazadas al final de cada ciclo. 3SR (Self-sustaining Sequence Replication) NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amplification). Una alternativa para solventar los inconvenientes de la TAS es la utilizacin de la RNasa H de E.coli en lugar de la desnaturalizacin trmica del hbrido RNA-DNA para obtener el molde de ssDNA. Esto dio lugar a una tcnica de amplificacin isotrmica (no requiere cambios en la temperatura de incubacin) que se basa en las actividades enzimticas simultneas de tres enzimas: RNasa H de E.coli, transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar y la RNA polimerasa del fago T7.

Inicialmente, con la 3SR se consigui una amplificacin de 10 veces cada 2,5min durante los primeros 15min, por lo que despus de 1h se consigui una amplificacin del RNA diana de 107 veces. Posteriormente, la optimizacin de la concentracin de substratos, fuerza inica, pH, temperatura y la adicin de cosolventes (dimetil sulfxido y sorbitol) ha permitido conseguir amplificaciones de 108 veces en tan solo 30min.

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Fig. 7. Esquema de amplificacin de cidos nucleicos mediante 3SR.

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Strand Displacement Amplification (SDA). Esta tcnica se basa en la capacidad de las DNA polimerasas de iniciar la sntesis de DNA a partir de una mella en la dsDNA y de desplazar la hebra mellada durante la sntesis de DNA. De esta forma, las molculas de hebra sencilla desplazadas sirven de molde para la siguiente ronda de corte y desplazamiento, lo que origina una acumulacin geomtrica isotrmica de copias de cadena doble y sencilla de la secuencia diana.

Fig. 8. Esquema de la reaccin SDA.

La tecnologa en la que se basa el SDA es la generacin de cortes especficos por la endonucleasa de restriccin; estas enzimas normalmente producen el corte en las dos hebras del DNA (lo cual no proporcionara un molde adecuado para el SDA). Sin embargo, si se utilizan nucletidos -tio-substituidos para la sntesis del dsDNA, la hebra recin sintetizada estar hemifosforotiolada y la endonucleasa de restriccin cortar una sola hebra. Los primers utilizados en el SDA constan de dos regiones funcionales: una regin complementaria de la diana de aproximadamente 15-20pb. otra regin que incorpora la diana de restriccin. 5' y los nucletidos dGTP, Despus de la incubacin con el DNA diana, se aade la polimerasa deficiente en la actividad exonucleasa 3' dCTP, dTTP y desoxiadenosina 5'-(-tio)-trifosfato. La elongacin del primer por la polimerasa, resulta en la sntesis de una hebra -tiolada. Una vez que se ha formado la mella por la accin de la endonucleasa de restriccin, el extremo 3' originado en el punto de corte inicia la sntesis de DNA al mismo tiempo que desplaza la hebra recin sintetizada. La hebra desplazada participa en una nueva ronda de corte, polimerizacin y desplazamiento lo que origina, teorticamente, el doble de secuencias diana despus de cada ronda de sntesis. Como en la 3SR, las reacciones en el SDA son isotermas y simultneas. No son necesarios los ciclos de amplificacin porque las dos hebras de DNA se desnaturalizan enzimticamente. No obstante, el SDA tiene desventajas: el tamao de las dianas que se pueden amplificar es limitado, ya que la procesividad de la mayora de las DNA polimerasas es menor para moldes de dsDNA (en los que se requiere el desplazamiento de una de las hebras) que para moldes de ssDNA (en los que no se requiere es desplazamiento de una de las hebras). la necesidad de cortar con una endonucleasa de restriccin el DNA genmico antes de la amplificacin para dejar libre el extremo 3' de la secuencia diana y poder iniciar la sntesis. Si se pierde una de las dos dianas de restriccin que flanquean el DNA diana por alguna03.2006 www.cultek.com Pgina 9 de 12

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mutacin, se obtendr una acumulacin lineal y no geomtrica de productos amplificados. Esto ocasiona la necesidad de seleccionar cuidadosamente las secuencias diana ya que deben ser regiones altamente conservadas. la secuencia diana no debe contener dianas de restriccin para la endonucleasa utilizada en el SDA.

Mtodos de Amplificacin de la Sonda.Una alternativa para detectar dianas muy raras es amplificar la sonda misma. La amplificacin de la sonda no origina la incorporacin de la informacin de la diana, aparte de la que esta presente al iniciarse la reaccin. En lugar de ello, el producto final de la reaccin es una versin amplificada de los componentes originales utilizados para detectar la diana. Estos mtodos pueden ser tiles en escenarios en los cuales la informacin de la secuencia derivada de la diana no es necesaria, tales como la deteccin de la secuencia nucleotdica caracterstica dentro del genoma de un patgeno. Amplificacin de sondas de RNA con la Q replicasa. La Q replicasa es una RNA polimerasa de 215kD que replica el RNA genmico del fago Q; est formada por varias subunidades y reconoce especficamente la estructura secundaria del RNA formada por el apareamiento de bases intramolecular del genoma de RNA del fago.

La tcnica se basa en que despus de que la sonda se haya unido especficamente a su diana y la sonda no unida y unida inespecficamente haya sido lavada, la sonda es enzimticamente replicada in vitro hasta niveles que pueden ser fcilmente detectados. Uno de los principales problemas de esta tcnica es el background provocado por la hibridacin inespecfica de la sonda a secuencias diferentes de la diana o por el fallo en la eliminacin completa de la sonda no unida. Las sondas de RNA se producen por transcripcin in vitro de DNA recombinantes; la sonda posee una estructura secundaria similar al substrato silvestre, excepto que porta extensiones especficas de la diana en uno de los lazos de la estructura o en los extremos 5' 3'. Las molculas se incuban con la replicasa Q purificada; la replicacin de las molculas quimricas puede aproximarse a 109 veces en una incubacin de 30min.

Fig. 9. Esquema de la amplificacin de sondas de RNA con la Q replicasa.

Despus de que se ha alcanzado un cierto nivel de amplificacin (aproximadamente 107 copias), la Q replicasa se satura y la cintica logartmica de la reaccin se transforma en lineal y la acumulacin del RNA replicado se hace estrictamente dependiente del tiempo. Esta propiedad permite ampliar el rango dinmico cuantitativo del ensayo porque permite establecer una relacin lineal entre el nmero de sondas introducidas en el sistema y el producto amplificado. El principal obstculo para conseguir un ensayo sensible es la disminucin del background; una posibilidad para intentar conseguirlo es hacer la sonda amplificable dependiente de la conformacin, es decir, que slo las sondas unidas a la diana sean reconocidas por la polimerasa. Una posibilidad es incluir en la sonda una diana para la RNasa III dependiente de hibridacin, es decir, que cuando la sonda se encuentre unida a su diana no sea reconocida por la RNasa III porque no se forma el substrato de dsRNA de reconocimiento de la enzima. En ausencia de unin a la diana, la sonda forma estructuras secundarias de dsRNA y pueden ser eliminados por la RNasa III selectivamente. Reaccin en Cadena de la Ligasa (LCR). Esta tcnica alternativa a las tcnicas de amplificacin dependientes de polimerasa, fue descrita por primera vez en 1989 por Wu y Wallace (Genomics 4: 560-569). El mtodo utiliza la DNA ligasa para unir dos pares de sondas complementarias despus de que stas se hayan unido a la secuencia diana in vitro. El xito de dicha ligacin depende del posicionamiento contiguo y perfecto apareamiento de bases en los extremos 3' y 5' de las sondas en el DNA diana.

Una vez que las sondas se han ligado, el producto de ligacin mimetiza perfectamente la doble hebra original, puede servir de molde para la ligacin de sondas complementarias. Los componentes se desnaturalizan por calor y se permite que nuevas sondas complementarias hibriden con ambas hebras. Uno de los principales problemas de esta tcnica es el background ocasionado por la ligacin por los extremos romos de las propias sondas, el relativamente largo tiempo de reaccin, la probabilidad bastante elevada de carryover y la poca relativa severidad de las condiciones de annealing. Recientemente, se ha descrito una modificacin de esta tcnica que utiliza una DNA ligasa termoflica aislada de Thermus aquaticus y que, por lo tanto, permanece activa durante los ciclos de desnaturalizacin trmica y que permite incrementar la temperatura de annealing, lo cual evita, a su vez, los problemas de autoligacin de las sondas.

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Fig. 10. Esquema de la reaccin en cadena de la ligasa (LCR)

Este mtodo, ya sea slo o en combinacin con diferentes mtodos de amplificacin de la diana, son potencialmente muy tiles para la deteccin de mutaciones puntuales, ya que las sondas pueden ser diseadas para que el punto de ligacin caiga justamente sobre un nucletido del que se sabe que puede estar mutado. De esta forma, la ligacin efectiva y posterior deteccin del producto de ligacin slo ocurre cuando los extremos de las sondas son perfectamente complementarios a la secuencia diana.

Mtodos de Amplificacin de la Seal.Una alternativa a la duplicacin o ligacin enzimtica de los cidos nucleicos para incrementar la sensibilidad de las tcnicas basadas en la hibridacin es incrementar la propia seal originada por la sonda. Teorticamente, es posible incrementar la seal generada por la sonda si el grupo indicador se puede unir en gran nmero a la sonda o si se puede incrementar la seal generada por cada grupo indicador. Los mtodos de amplificacin de la seal no originan un producto replicable, por lo que son menos propensos a la contaminacin, pero la sensibilidad que se puede conseguir (entre 104 y 105) generalmente es menor que con los mtodos de amplificacin enzimtica. Sondas compuestas. La tcnica de las sondas compuestas consta de dos componentes funcionales:

una sonda primaria que reconoce la secuencia diana y contiene mltiples sitios de unin para la sonda secundaria. las sondas secundarias, cada una de las cuales contiene un grupo indicador. La incubacin de estos componentes con la secuencia del DNA diana ocasiona la formacin de una red de compuestos en los que la sonda primaria est unida al DNA diana por la regin complementaria especfica, quedando una parte de su secuencia libre para unir la sonda secundaria. El rbol de sondas que se genera puede tener diferentes formas lineales o circulares aunque el resultado en todos los casos es el mismo: la capacidad de generar seal de la sonda se incrementa significativamente. El principal problema de esta tcnica es que tambin se incrementa la seal de las sondas unidas inespecficamente, originando unos elevados niveles de background. Sondas ramificadas (Branched DNA; bDNA). Esta modalidad de amplificacin fue desarrollado por la empresa Chiron Corporation y utiliza DNAs ramificados para proporcionar mltiples sitios de hibridacin para una molcula indicadora unida a una enzima. Las molculas precursoras de estos multmeros de amplificacin se sintetizan qumicamente; la columna vertebral de la estructura en peine se construye con anlogos de nuclesidos ramificados que pueden incorporarse a intervalos regulares durante la sntesis del oligonucletido. Cada sitio ramificado es entonces alargado con un pequeo fragmento oligonucleotdico al cual se puede unir una regin especfica de la diana.

La amplificacin de la seal mediante bDNA incorpora muchos pasos de hibridacin simultneos. Despus de la lisis del organismo diana, se utilizan las sondas complementarias de la diana para capturar el cido nucleico diana a un soporte slido (sondas de captura). Un segundo set de sondas especficas (sondas de extensin) hibrida con secuencias contiguas y, al mismo tiempo, sirven como sitio de unin (mediante extensiones en el extremo 5') para el multmero de amplificacin ramificado. Dichas ramas dirigen la unin de mltiples oligonucletidos marcados con fosfatasa alcalina (se pueden incorporar hasta 3.000 molculas de fosfatasa alcalina por cada DNA diana). La especificidad de esta tcnica es muy elevada, ya que es muy rara la hibridacin inespecfica de ambas sondas (la de captura y la de extensin). Adems el bDNA posibilita una deteccin cuantitativa a lo largo de varios rdenes de magnitud, por lo que puede utilizarse para monitorizar, por ejemplo, la respuesta teraputica al -interfern en el caso de infecciones por Hepatitis B o C, a la azidotimidina en el caso de infeccin por HIV o al ganciclovir en el caso de infeccin por Citomegalovirus.

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Fig. 11. Esquema de la amplificacin de la seal mediante la tcnica de branched DNA (bDNA)

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