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Federación de Sanidad de Andalucía

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TEMARIO

TÉCNICOS ESPECIALISTAS EN LABORATORIO

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TEMA 1.- GASES SANGUÍNEOS

BASES FISIOLÓGICAS BÁSICAS La función básica del pulmón es la de intercambiar gases. La medición de ellos en sangre arterial, es por lo tanto una buena guía para conocer el estado del funcionamiento pulmonar. En cada inspiración, el oxígeno atmosférico llega a los alvéolos pulmonares, desde allí, por difusión, llega a la sangre. Para transportar el oxígeno, se utiliza la hemoglobina, presente de forma abundante en los eritrocitos. Su existencia permite transportar de 30 a 100 veces más oxígeno del que se pudiera transportar disuelto en sangre. Como la presión parcial del oxígeno en los alvéolos, es mayor que en el resto del pulmón, por gradiente de presión, el oxígeno pasa desde los alvéolos a los capilares sanguíneos. Las arterias, transportan el oxígeno hasta las células donde la pO2 es menor que en la sangre arterial, produciéndose difusión en sentido a favor de las células. Con el dióxido de carbono, ocurre justamente el proceso contrario, los gradientes de presión, lo van llevando desde las células hasta el alvéolo, donde es expulsado en cada espiración. Los procesos metabólicos, por su parte producen grandes cantidades de ácidos y de dióxido de carbono; los volátiles son eliminados por el pulmón, pero los no volátiles son transportados por la sangre hasta el lugar de su eliminación, y dada su naturaleza, son capaces de alterar el equilibrio ácido-base y el pH sanguíneo. La gasometría arterial permite medir el intercambio de O2 y de CO2 entre el pulmón y la sangre, y también el estado del equilibrio ácido-base del organismo. La medición del pH, pO2, y pCO2 en sangre arterial es imprescindible en el diagnóstico y control de la insuficiencia respiratoria.

TRANSPORTE DE GASES POR LA SANGRE. TRANSPORTE DE OXÍGENO El 97% del oxígeno presente en sangre se transporta en combinación con la hemoglobina, solo el 3% del oxígeno sanguíneo se transporta en el plasma y en el citoplasma del eritrocito

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La curva de disociación de la oxihemoglobina en sangre presenta forma sigmoidal. Si la curva es modificada hacia la derecha, la hemoglobina pierde afinidad por el oxígeno y necesita una mayor pO2 para llegar a saturarse.

Son factores que modifican la curva hacia la derecha:

• El aumento de la temperatura. • El aumento de la pCO2. • La disminución del pH. • La altura.

Si la curva se modifica hacia la izquierda, la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno está aumentada y se llega a la saturación con una menor pO2. La cantidad de oxígeno unido a la Hb, no solo depende de la pO2, sino de otros muchos factores entre los que destacan, la pCO2, el pH, los fosfatos, y la altura. TRANSPORTE DE CO2 La sangre transporta dióxido de carbono en las siguientes formas:

• 70 % en forma de anión bicarbonato. • 7 % disuelto en plasma. • 23 % en forma de carbamilo-hemoglobina unido a proteínas plasmáticas.

RECOGIDA DEL ESPÉCIMEN Existen varios tipos de recipientes recomendados para la recogida de sangre arterial. Uno de los preferidos es la jeringa de vidrio, que debe ajustar perfectamente con su émbolo. Se introduce en la jeringa aproximadamente 1 ml de heparina, con la que se lubrifica el recipiente y posteriormente es expulsada. De esta forma queda el espacio muerto lleno de heparina. La aguja a utilizar puede ser del calibre 23 o superior, la jeringa de vidrio presenta los inconvenientes de su alto coste inicial, la facilidad de rotura y la necesidad de esterilización. Otros recipientes de recogida, cada vez más utilizados son las jeringas de plástico desechables, y los tubos de vacío. Las jeringas de plástico desechable presentan sobre las de cristal las ventajas, de no ser frágiles, no necesitar esterilización, son baratas y presentan perfecto ajuste émbolo-cuerpo de la jeringa. En cuanto a los tubos de vacío existen distintas opiniones, para muchos autores (la mayoría) pueden producir alteraciones en la presión parcial de los gases como consecuencia de la succión que ejercen. Otros autores los definen como recipientes satisfactorios.

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La sangre venosa, más fácil de obtener, puede dar valores correctos de pH aunque los dará incorrectos para la pCO2 alveolar y la saturación de oxígeno arterial. La sangre capilar arterializada, como la obtenida del dedo se puede emplear para determinar pH y pCO2, pero no para la pO2. MANIPULACIÓN Una vez, extraída la sangre, la jeringa es el recipiente definitivo. Para cerrarla herméticamente, se suele pinchar en un corcho. No se debe doblar la aguja, ya que presenta un riesgo innecesario y no se asegura el cierre hermético, (se le deben eliminar las burbujas de aire, previamente). Debe ser colocada rápidamente en un recipiente con hielo o en agua helada, para evitar el consumo de oxígeno y la liberación de dióxido de carbono. No debe nunca transportarse a temperatura ambiente. La muestra de sangre arterial no necesita ninguna manipulación, el estudio de gases se realiza en sangre completa, solo hay que realizar el análisis en los primeros 15 minutos, pues una mayor conservación podría modificar los gases disueltos. La determinación es muy delicada y puede ser influida por:

• El número de leucocitos. • La temperatura. • El manejo inadecuado. • El tiempo.

VALORES CRÍTICOS OXÍGENO La cantidad de oxígeno presente en sangre, al igual que la de CO2, suele expresarse en unidades de presión parcial. La pO2 mide la cantidad de oxígeno que pasa del pulmón a la sangre y hay varios factores que pueden afectarla como:

• La correcta circulación sanguínea. • La capacidad pulmonar. • El estado del aparato respiratorio.

Los valores de referencia de pO2, están influenciados, por lo tanto por todos estos factores, pero en general:

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• Para jóvenes adultos 80 mm Hg. es el límite inferior. • Para individuos de edad avanzada 70 mm de Hg. es el límite inferior.

Anoxia es el término general para la oxigenación insuficiente, hipoxemia es la oxigenación deficiente de la sangre y anoxemia u anoxihemia es la disminución del oxígeno en sangre. Cualquier grado de hipoxemia puede ser compensado temporalmente por el organismo, pero la privación total de oxígeno lleva a la muerte en pocos minutos al no poseer el organismo reserva alguna. Se han descrito casos de supervivencia con pO2 de solo 7.5 mm de Hg. DIÓXIDO DE CARBONO El CO2 es transportado desde los tejidos hasta los pulmones, donde es expulsado a través de la respiración. Con la pCO2 se refleja la eficacia de la excreción pulmonar y la cantidad de CO2 generado por el metabolismo. Los valores normales de pCO2 en sangre arterial son de 32 a 45 mm de Hg. HIPOCAPNIA Es la disminución de CO2 en sangre por debajo de los valores normales, puede ser consecuencia de:

• Fallo en el hígado. • Shock séptico y hemorrágico. • Lesión craneal. • Septicemia.

HIPERCAPNIA Es el aumento de CO2 en sangre por encima de los valores normales, puede ser consecuencia de:

• Asma. • Enfisema. • Bronquitis crónica.

La relación entre los gases presentes en el pulmón por ventilación y los que existen en sangre se representa por V/Q y recibe el nombre de cociente de ventilación-perfusión. La pO2 arterial disminuye, a la vez que la pCO2 aumenta, en los siguientes casos:

• Hipoventilación.

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• Desigualdad V/Q. • Defectos de difusión.

ESTUDIO ANALÍTICO Para medir la pCO2 se emplea el electrodo de Severinghaus. Se trata de un electrodo de pH rodeado de una solución electrolítica que está separada de la sangre por una membrana permeable al CO2. El material que compone la membrana suele ser caucho, teflón o silicona. El pH de la solución depende de la pCO2 en equilibrio con la sangre. Para determinar la pO2 se emplea el método del electrodo polarigráfico de Clark para el oxígeno. Consiste en una solución electrolítica de CLK que sumerge ánodo y cátodo, separada de la sangre por una membrana. En este sistema se aplica un voltaje de polarización constante al ánodo de plata-cloruro de plata, y al cátodo, de alambre de platino. El oxígeno se reduce en el electrodo y su reducción, modifica el potencial eléctrico, en forma proporcional a la velocidad de reducción. Esta última, claro está, varía en función de la tensión de oxígeno presente en la sangre. Los electrodos del pO2 y del pCO2, deben ser calibrados previamente con un gas o un líquido de presión parcial de oxígeno conocida. INTERPRETACIÓN La gasometría arterial puede indicar ciertas anomalías, pero no su grado de anormalidad, ni tampoco son suficientes para un diagnóstico etiológico específico. Por ejemplo, puede presentar los mismos valores de gases en sangre una persona con obstrucción crónica de las vías respiratorias que un cardiaco con edema pulmonar, un asmático que un paciente con neumonía. EQUILIBRIO ÁCIDO-BASE Los ácidos son productos que pueden ser ingeridos directamente en la dieta, o producidos endógenamente por el metabolismo (oxidación de lípidos, oxidación de aminoácidos, etc.). Los ácidos volátiles como el H2CO3, pueden ser eliminados por el pulmón en forma de CO2, pero los ácidos no volátiles, no pueden ser eliminados por el pulmón, y deben excretarse a través de la orina. El organismo, necesita por lo tanto, de mecanismos capaces de mantener constante el pH de los líquidos intra y extra celulares (de 7.35 a 7.45), sin que se altere por la presencia de esos ácidos. Esto se consigue con la presencia de tampones (ácidos débiles en solución con su base conjugada, capaces de mantener el pH en pequeños márgenes de variación).

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El principal tampón extracelular es el bicarbonato, seguido de la hemoglobina, las proteínas plasmáticas y el fosfato, todos ellos actúan de forma instantánea en la reducción del pH pero el equilibrio ácido - base final, lo realizan las células tubulares renales. ACIDOSIS Se produce cuando existe disminución del pH sanguíneo. Puede estar originado por:

• Acúmulo de CO2 en el organismo “acidosis respiratoria“. Como consecuencia de una hipoventilación. Los riñones intentan compensarlo.

• Acúmulo de ácidos fijos, como el CO2 total y tampón, es una “acidosis metabólica”. En este caso, la frecuencia respiratoria se aumenta para intentar compensarlo. Aparece en casos de shock, uremia, ingestión de tóxicos, etc.

ALCALOSIS Ocurre cuando el pH sanguíneo es superior a 7.45.

• Alcalosis respiratoria. Ocurre secundariamente a una hiperventilación, como consecuencia del aumento de la concentración de la pCO2 en sangre. Los riñones intentan compensarla, disminuyendo la secreción de ácidos fijos, o la reabsorción del CO3H-

• Alcalosis metabólica. Aparece cuando existen perdidas de ácidos fijos o ganancia de bases. Se puede deber a vómitos prolongados, aspiración nasogástrica, o ingestión excesiva de antiácidos, aunque también aparece asociado al síndrome de Cushing, o el hiperaldosteronismo. Se intenta compensar disminuyendo la frecuencia respiratoria.

pH SANGUÍNEO Podemos definir el pH como el logaritmo negativo de la concentración de protones. Sus valores normales se ven afectados por la presencia de sustancias ácidas o básicas en sangre y es de suma importancia mantenerlo dentro de unos márgenes concretos para evitar importantes modificaciones de todos los procesos metabólicos, de ahí la importancia de los tampones.

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MÉTODOS ANALÍTICOS DE MEDIDA DEL pH Para determinar el pH se utiliza sangre total o plasma, siendo adecuada para ello tanto la sangre arterial, como la venosa, o la capilar. Normalmente el pH venoso es 0.0003 unidades menor que el arterial. Cuando intentamos medir el pH en el laboratorio, es muy importante tener en cuenta:

• Almacenar las muestras en frío, pues a temperatura ambiente se agilizan los procesos metabólicos como la glucólisis que producen ácidos y disminuyen los valores del pH.

• Añadir a las muestras fluoruro sódico para evitar la actividad glucolítica de los leucocitos.

• Es preferible añadir plasma, pues la actividad anhidrasa carbónica de los eritrocitos, también modifica el pH.

• No utilizar oxalatos como anticoagulantes, pues aumentan el pH, ni tampoco citrato o EDTA, pues lo disminuyen, es preferible heparina.

MÉTODOS ELECTROMÉTRICOS Para medir el pH se usa un sistema de electrodo de vidrio, el cual presenta dos partes:

• El electrodo de referencia o de calomelanos. • El electrodo de vidrio.

El electrodo de referencia, mantiene un potencial constante, y el de vidrio desarrolla un potencial proporcional a la concentración del ión hidrógeno en la solución problema. La sangre total o el plasma problema, se colocan a un lado de la membrana de cristal, y al otro se coloca una solución estándar son concentración de hidrogeniones conocida. La técnica se basa en medir el potencial creado a través de la membrana que separa ambas concentraciones con concentración de hidrogeniones desigual. MÉTODOS DE TITULACIÓN Son poco utilizados. Para evaluar el equilibrio ácido-base, hay que cuantificar no solo el pH, sino:

• La pCO2. • La pCO2 total. • El exceso de base.

Todo esto nos dará información para evaluar el equilibrio ácido-base e identificar las causas de las posibles alteraciones.

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TEMA 2. IONOGRAMA. ESTUDIO ANALÍTICO

CONCEPTO. Los electrolitos son iones que existen normalmente en los líquidos corporales. Un ionograma es la determinación y el registro de la concentración de los diversos aniones y cationes de un líquido corporal. PRINCIPALES ELECTROLITOS. A nivel extracelular, los principales cationes son Na+ y K+, y los principales aniones Cl- y HCO3. Las concentraciones de estos electrolitos afectan al metabolismo, al estado de hidratación, al pH intra y extra celular. Además, la diferente concentración de estos electrolitos en los líquidos intra y extra celulares, regula el funcionamiento del sistema nervioso y del tejido muscular. Las concentraciones de electrolitos se pueden expresar de varias formas :

-miliequivalentes por litro = mEq/l. -milimoles por litro = mmol/l.

*Recordar que 1 mEq equivale a 1mmol, solo en el caso de iones monovalentes. SODIO, POTASIO Y AGUA. El agua constituye aproximadamente el 60% del peso corporal de un adulto, repartida como sigue:

• Líquido o extracelular 20% (LEC). o vascular 5%. o intersticial 15%.

• Líquido intracelular 40% (LIC). • Líquido transcelular 1-3%.

Lo que distingue a unos líquidos de otros, es simplemente la composición de electrolitos.

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Líquido extracelular Líquido intracelular % Na 95-98% 2-5%

Cationes Na (142 mEq /l) >Ca K (161 mEq /l )>Mg>Ca Aniones HCO3 (27 mEq /l)

Cl (101 mEq /l) Aniones orgánicos (proteínas)

* 4 veces más proteínas. pH 7.4 7.0

El LIC y el LEC, a pesar de su diferente composición electrolítica, se muestran siempre en equilibrio osmótico, regulado con la bomba Na-K-ATPasa, que extrae 3Na+ del interior celular e introduce 2K+. Los dos constituyentes el LEC (plasma y líquido intersticial), presentan una composición muy similar de electrolitos, son la presión hidrostática y la oncótica las que inducen al intercambio de Na+ y agua entre ambos espacios, que se lleva a cabo a nivel capilar. Entre LEC y el transcelular, también se intercambia agua y Na+. A nivel de tubo digestivo se intercambian de 6-8 l/día de agua cuando la [Na+] es menor que la del espacio transcelular. BIOQUÍMICA DEL SODIO Y DEL POTASIO. Los valores normales de sodio y potasio en sangre son:

-Na+: 135 a 148 mmol/l. -K+: 3.8 a 5.5 mmol/l.

El sodio se excreta en orina cuando sus valores en sangre superan los 110 mmol/l. Se excreta de 30 a 280 mmol/día. El potasio excretado en orina es de unos 25 -120 mmol/día. La función biológica más importante del sodio y el potasio, es la de regular la presión osmótica, y asegurar la integridad celular (Son cargas positivas que retienen aniones). Otra de las funciones del sodio y el potasio es la de mantener el balance de agua en el organismo. El sodio, por su parte, interviene en el equilibrio ácido-base, y el potasio, por la suya, en la propagación del impulso nervioso y por lo tanto, también en la actividad muscular.

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TÉCNICAS UTILIZADAS PARA LA DETERMINACIÓN DE SODIO Y POTASIO, ESTUDIO ANALÍTICO. FOTOMETRÍA DE LLAMA. Existen diversas técnicas para determinar el sodio y el potasio en sangre. La más rápida y simple de ellas es la fotometría de llama. La fotometría de llama se basa en que al pulverizar una solución de una sustancia sobre una llama, los electrones de los átomos de dicha sustancia se excitan y pasan a niveles de energía superiores. Este exceso de energía es cedido al ambiente en forma de color en la llama. Tras colorear la llama, los átomos pasan a un estado menor de energía. La coloración aparecida, corresponde a la emisión de rayos de una determinada longitud de onda, característica de cada elemento. La intensidad del color depende directamente de la concentración de la sustancia. En la llama se producen los siguientes colores característicos de determinados elementos:

Litio........................color rojo. Sodio......................color amarillo. Potasio....................color violeta. Magnesio ...............color azul.

En un fotómetro de llama se distinguen las siguientes partes: Atomizador: Es la parte encargada de disgregar la solución problema en gotas pequeñitas. Una vez disgregada, sus átomos pueden, más fácilmente absorber la energía térmica de la llama, y excitarse. Llama: Se encarga de excitar los electrones de los átomos de la sustancia pulverizada. Monocromador: Es la parte encargada de seleccionar la longitud de onda. Detector; es el medidor de la energía radiante emitida. Normalmente se comparan soluciones de concentración conocida del elemento (Na + o K+) con la muestra problema (suero).

• Se preparan una serie de soluciones patrón de sodio (2.5; 5.0; 7.5 y 10

microgramos /ml). • Se preparan otra serie de soluciones patrón de potasio (5; 10;15 y 20

microgramos /ml). A esta serie hay que añadir Na+ en concentración similar a la normal en el suero.

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Con las soluciones patrón se obtienen resultados que hay que trasladar a una curva de calibración (una para el sodio y otra para el potasio), colocando en abscisas las concentraciones en microgramos/ml y en ordenadas las intensidades de emisión leídas por el galvanómetro. Para la determinación del Na+ se diluye el suero, normalmente 1:500, y para la del K+ 1:20. Se leen las intensidades de emisión, y se traslada a la curva respectiva obtenida anteriormente, para de esta forma determinar la concentración en el suero problema. Los valores normales suelen ser:

-Na+ en suero ------------------------------135-155 mEq /l. -K+ en suero-----------------------------------3.6-5.5 mEq /l.

POTENCIOMETRÍA CON ELECTRODO ION -SELECTIVO. Otra técnica utilizada para detectar Na+ y K + es la de la potenciometría con electrodo ión selectivo: -Na+..............electrodo = membrana de i.iónico de vidrio. -K+................electrodo = membrana transportadora neutra de valinomicina. Las interferencias que se presentan en la aplicación de esta técnica son; la hemólisis, el heparinato, y los anticoagulantes sódicos. IONES CLORURO. El principal anión extra celular es el cloruro. El exceso de Cl- es excretado con la orina. Su concentración normal en suero es de 101 mEq /l, excretándose en orina, en condiciones normales, de 110 a 250 mmol /día. Los iones cloruro tienen una importante función en el mantenimiento del equilibrio ácido - base. Los iones cloruro son ingeridos normalmente en la dieta y se reabsorben en el intestino. ESTUDIO ANALÍTICO. Se puede medir a través de los siguientes métodos:

• Titulación mercurimétrica. • Titulación culombimétrica - amperométrica. • Colorimetría mediante Hg (SCN)2.

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• Uso de electrodos específicos de este ión. A) Titulación mercurimétrica: En ella el cloruro y el Hg++ se unen formando HgCl2. El Hg++ en exceso se combina con la difenilcarbazona dando un complejo coloreado de color azul-violeta. Un ejemplo de técnica mercurimétrica es la de Shales-Shales.

2CL- + (NO3)2Hg.........................(indicador).............Cl2Hg + 2NO3- B) Titulación columbimétrica:

Requiere pequeños volúmenes y es un método muy preciso . Se utiliza en pediatría y también para determinar los niveles de cloruro en el sudor. C) Método del tiocianato:

Muestra (Cl-) + Hg (SNC)2........................cloruro mercúrico + SNC- Libre. El tiocianato libre, reacciona con Fe 3+, formando complejos, cuya intensidad de color determina fotométricamente, es proporcional a las cantidades de cloro existentes en la muestra.

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TEMA 3.- BIOQUÍMICA CARDIACA

INTRODUCCIÓN. Aproximadamente en el 20% de los casos de cardiopatía isquémica, la primera manifestación de la enfermedad es la muerte súbita. La experiencia obtenida en países como EE.UU., Australia y Finlandia nos muestra que la Cardiopatía Isquémica es prevenible al menos en parte. En España, la mortalidad por Cardiopatía Isquémica es baja, pero en el período 1968-1977 prácticamente se duplicó, pasando de la tasa bruta de 43 a la de 80 por cien mil, existiendo una tendencia al aumento de la tasa de mortalidad estandarizada en relación con otros países europeos. Estos datos nos hacen ver la importancia de la prevención de la enfermedad así como del diagnóstico temprano, para evitar desenlaces fatales. Entre las múltiples técnicas diagnósticas con que contamos, destacaremos en este tema la valoración bioquímica-enzimática en la fase aguda de la isquemia miocárdica y en la evolución de la enfermedad en los primeros días. Las enzimas catalizadoras orgánicas responsables de la mayoría de las reacciones químicas que suceden en el organismo, se encuentran en todos los tejidos. Algunas se han identificado en el plasma, al que llegan desde las células dañadas o quizás incluso desde las células intactas. En la actualidad se han identificado en el suero más de 50 enzimas. Los niveles de muchas enzimas han sido estudiados con extensión en una gran variedad de procesos. Se han aplicado algunas pruebas de enzimas séricas con tanta amplitud en algunos problemas clínicos, que se consideran procedimientos habituales en el laboratorio. Otras, aunque muestran claramente ser un reflejo de diversas enfermedades, se llevan a cabo en relativamente pocos laboratorios clínicos, porque la prueba en sí es técnicamente diferente o porque la información facilitada se considera que ayuda muy poco. Otras pruebas tienen un interés de investigación más que clínico. El empleo de las enzimas séricas como ayuda diagnóstica ha sido muy empírico, pero los valores observados en circunstancias clínicas y experimentales permiten un análisis especulativo de los factores que controlan los niveles de las enzimas séricas en sujetos normales y enfermos. Los niveles séricos de una enzima particular crecen en las enfermedades que conducen a un aumento de su liberación por el tejido, por un aumento de la cantidad disponible para su liberación o por una disminución de esta cantidad. Un aumento de la cantidad liberada es sin duda responsable de los elevados niveles séricos de las enzimas que producen necrosis en las enfermedades hepáticas, pancreáticas y

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miocárdicas. El tipo de anormalidad de los valores de las enzimas séricas resultantes depende del contenido enzimático normal del tejido afectado y de la extensión y tipo de la necrosis. La selección de las pruebas enzimáticas para su uso clínico ha dependido de circunstancias históricas, de la experiencia ganada en la correlación de los valores con otras determinaciones patológicas y la facilidad técnica de realizar cada procedimiento respectivo. MARCADORES BIOQUÍMICOS: VALOR DIAGNÓSTICO Y EVOLUTIVO EN EL PROCESO ISQUÉMICO. En el infarto del miocardio hay unos cambios hemáticos inespecíficos que traducen la inflamación y necrosis, como son una discreta leucocitosis con desviación izquierda, que aparece en las primeras horas y dura una semana, y un aumento de la VSG, que tiene lugar a partir del cuarto o quinto día y dura varias semanas. Pero el máximo valor diagnóstico lo representan las elevaciones de ciertas enzimas (contenido fundamental de nuestro tema), liberadas en grandes cantidades a partir del tejido cardiaco necrosado. Difiere la rapidez con la cual es liberada cada enzima y su esquema temporal de liberación tiene cierta importancia diagnóstica. Transaminasa glutámico oxalacética (GOT): comienza a elevarse precozmente, a las doce horas, alcanza su máximo al segundo día y se normaliza al cuarto o quinto día. Puede elevarse hasta 10 veces su valor normal (8-20 U/L). La lista de afecciones distintas al infarto del miocardio que pueden elevar la GOT comprende:

• Insuficiencia ventricular derecha con congestión hepática • La administración de salicilatos, opiáceos o anticoagulantes • Enfermedad muscular primaria, incluyendo distrofia muscular y

traumatismo quirúrgico • Operaciones quirúrgicas • Pancreatitis aguda • Daño extenso del sistema nervioso central • Toxemia del embarazo • Crisis hemolítica • Machacamiento o quemaduras • Infarto del riñón, bazo o intestino • Hipotiroidismo.

Está presente, además, en otros tejidos: hígado, músculo, riñón, cerebro, por lo que enfermedades de estos órganos pueden producir aumentos séricos de la enzima.

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La experiencia confirma que las determinaciones de CPK y sus isoenzimas y de LDH y sus isoenzimas son indicadores más fiables para el diagnóstico de laboratorio de necrosis miocárdica. En pacientes con criterios clínicos de insuficiencia coronaria más que de infarto de miocardio pueden darse cifras elevadas de GOT en suero. No está claro si esto representa una necrosis miocárdica que no ha podido reconocerse mediante otros métodos (bastante improbable) o una liberación de la enzima al suero, incluso sin una necrosis clara del miocardio. Lactodehidrogenasa (LDH): esta enzima cataliza la oxidación reversible de lactato a piruvato. Está ampliamente distribuida en tejidos de mamíferos y es más abundante en el miocardio, riñón, hígado y músculo. Se han aplicado para su análisis métodos espectrofotométricos y colorimétricos. Los niveles séricos elevados de LDH se observan en muchas circunstancias. Los valores más altos (2 a 40 veces la normalidad) se ven en casos de anemia megaloblástica, en carcinomatosis extensa, en el shock grave y en la anoxia. Subidas moderadas (2 a 4 veces la normalidad) ocurren en enfermos de infarto de miocardio, infarto pulmonar, leucemia granulocítica, anemia hemolítica, mononucleosis infecciosa y en pacientes con distrofia muscular. Se ven ligeras elevaciones en casos de hepatitis, ictericias obstructivas o cirrosis. Son bastantes característicos los patrones de niveles séricos elevados de LDH en los casos de infarto de miocardio. En general, aumenta más tarde, a las veinticuatro horas; alcanza el pico a los tres o cuatro días y persiste elevada cuando el resto de las enzimas se han normalizado; vuelve el nivel basal a los siete o diez días, y la elevación máxima puede ser dos o tres veces los valores normales (45-90 U/L). Es menos específica, pues se encuentra prácticamente en todos los tejidos del organismo. Por ello tiene más valor determinar sus cinco isoenzimas, que aunque presentes en toda las economía, lo están a concentraciones diferentes en los diversos tejidos. Mediante electroforesis se pueden separar cinco isoenzimas comunes a la LDH. Cada una de estas isoenzimas se distingue de las otras mediante procedimientos serológicos, electroforéticos y otros varios de orden químico. Las isoenzimas de la LDH se designan en la práctica de acuerdo con su movilidad electroforética. Cada isoenzima es un tetrámero constituido por cuatro subunidades, cada una con un peso molecular de 34.000. Existen dos tipos de estas subunidades, designados respectivamente H y M, H para la cadena de péptidos del corazón y M para la cadena del músculo estriado. Los diversos tejidos difieren en cuanto a sus esquemas específicos de isoenzimas, la isoenzima que se desplaza con mayor rapidez y que es más

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abundante en el corazón, ha sido designada LDH1, en cambio, en el hígado y en el músculo estriado predominan isoenzimas de desplazamiento más lento. La LDH1 es relativamente específica del corazón, por lo que su elevación y, sobre todo, la relación LDH1/LDH2 cuando es superior a uno (LDH invertida) es muy sugerente de infarto de miocardio, aún cuando la LDH total no haya aumentado. En casos de infarto de miocardio, la LDH1 aumenta antes que la LDH total, y puede incluso aumentar sin que se note todavía ningún cambio de LDH total. Por tanto, una elevación de la LDH1 constituye un índice del infarto de miocardio más sensible que la LDH total. Cabe mencionar una sensibilidad superior a 95%. Es difícil la cuantificación de las isoenzimas, y las técnicas son demasiado incómodas para su empleo en el estudio de numerosos sueros. Sin embargo, la determinación de LDH1, la isoenzima miocárdica, puede realizarse mediante técnicas sencillas como el análisis de la actividad total de LDH. Creatinfosfoquinasa (CPK): es la enzima que más precozmente se eleva en el infarto de miocardio, ya que hay niveles altos a las cuatro o seis horas, alcanza el pico máximo a las veinticuatro-treinta horas y se normaliza al tercer o cuarto día. Puede elevarse hasta cuarenta veces su valor normal (varón 12-70 U/L; hembra 10-55 U/L). Es la más específica, pero se encuentra también en el tejido muscular y en el cerebro y además se eleva por inyecciones intramusculares, cardioversión, cirugía, etc. Reviste una importancia especial, en la clínica, el hecho de que una inyección intramuscular puede ir seguida de una elevación al doble o al triple de la cifra sanguínea de CK. Esta particularidad puede significar diagnósticos erróneos de infarto del miocardio en pacientes que recibieron inyecciones intramusculares de algún analgésico para combatir un dolor torácico que no era de origen cardiaco. Otras posibles causas de aumento de la CK pueden ser:

• la miopatía que acompaña al alcoholismo crónico. • el tratamiento con clofibrato. • el cateterismo cardiaco. • el hipotiroidismo. • las embolias cerebrales. • el ejercicio físico.

La CPK tiene tres isoenzimas, cada una constituida por dos subunidades: M (músculo) o B (cerebro); el cerebro contiene BB; el músculo esquelético MM, y el miocardio MM y MB. Pues bien, la isoenzima MB (CPK-MB) resulta específica del músculo cardiaco; su curva de elevación es similar a la de la CPK total, pero algo más precoz.

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La presencia de CPK-MB en los sueros indica una lesión de miocardio y se observa en todos los pacientes durante el período de 48 horas después de un infarto agudo de miocardio. Sin embargo, también se detecta en menor grado en individuos con angina e insuficiencia coronaria graves, pero sin indicaciones de infarto. En vista de que la elevación de la cifra sérica de CPK dura poco tiempo, quizá pase inadvertida si las primeras muestras de sangre se recogen después de transcurridas 72 horas. La actividad de la CPK-MB nunca supera el 40% de la actividad sérica total de la CPK y el resto es CPK-MM. Las determinaciones de la isoenzima de la CPK realizadas después del día 4 sólo revelarán actividad de la CPK-MM, y no podrá establecerse su origen en el corazón o músculo. Con las técnicas actuales de reperfusión precoz, utilizando la administración intravenosa de sustancias fibrinolíticas, para romper la porción fresca del trombo arterial, los niveles de CPK suben espectacularmente, alcanzando hasta mil veces su valor normal. Esto último no es indicativo de gran necrosis miocárdica, sino consecuencia de la destrucción, al menos parcial del trombo intraarterial. Se sabe desde hace mucho que el tamaño del infarto tiene cierta relación con la cantidad de enzimas liberadas. Se ha demostrado que puede conocerse la masa de músculo cardiaco infartado a partir del análisis de la curva de concentración-tiempo de la enzima en cuestión, siempre y cuando se conociera la cinética de liberación, desdoblamiento, eliminación, etc. de dicha enzima. Si se analiza una curva de tiempo de la fracción MB de la CK puede calcularse el tamaño del infarto en términos de gramos.

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En más del 95% de pacientes con un infarto del miocardio comprobado existen elevaciones características en la concentración sérica de las enzimas. Existen otros indicadores bioquímicos de infarto, como el incremento de mioglobina en suero, disminución del Zinc plasmático, etc., no tienen en la actualidad utilización en la clínica.

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TEMA 4. PRINCIPALES MARCADORES TUMORALES E

IMPLICACIÓN PRÁCTICA. INTRODUCCIÓN Con la detección y tratamiento precoces del cáncer, responsable actualmente de una gran mortalidad en la población mundial, se espera se produzca una marcada disminución en la morbilidad y mortalidad de esta enfermedad. La detección precoz mediante técnicas citológicas han dado resultados muy positivos en la detección de ciertos tumores (Ej.: cáncer cervical) aunque no detectan por sí mismas gran cantidad de tumores. Es por ello que la investigación se ha centrado en la investigación de productos tumorales en sangre, orina y otros líquidos corporales. Así, reciben el nombre de MARCADORES TUMORALES a aquellas sustancias presentes en sangre, orina u otros líquidos corporales (fundamentalmente se investiga en sangre) procedentes de la célula neoplásica, ya que por sus especiales características ésta sintetiza compuestos que se distinguen de los aportados por una célula normal, bien en su estructura, bien en su concentración en los líquidos biológicos. TUMOR, CÁNCER Y CÉLULAS TUMORALES Llamamos tumor a la neoformación o nuevo crecimiento de tejidos en que la multiplicación de las células no está totalmente controlada por los sistemas reguladores del organismo. Denominamos cáncer a un tumor maligno en general. Las características básicas de la malignidad es una anormalidad de las células trasmitidas a las células hijas, que se manifiesta por la reducción del control del crecimiento y la función celular, conduciendo a una serie de fenómenos adversos en el huésped a través de un crecimiento masivo, invasión de tejidos vecinos y metástasis. La característica principal de la célula tumoral con respecto a las células normales es fundamentalmente la pérdida de control en los procesos de crecimiento y división. Al llevarse estos de forma desorganizada, conduce a la formación de una masa tumoral que invade los tejidos circundantes rompiendo las membranas límites de las distintas estructuras. La diseminación y colonización de algunas de estas células tumorales puede dar lugar a la

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aparición de metástasis o más focos morbosos secundarios en regiones no contiguas del punto de evolución del foco primitivo. ALTERACIONES DE LAS CÉLULAS TUMORALES En las células tumorales o neoplásicas se conocen anomalías tanto estructurales como genéticas. DE LA MEMBRANA En las membranas celulares se detectan modificaciones en las glicoproteínas transmembrana y en los enlaces entre los distintos componentes moleculares que ocasionan un crecimiento desordenado del tejido, con la formación de la masa tumoral. Igualmente aparecen modificaciones en los receptores de membrana que conducen en algunos casos a facilitar el anclaje de células tumorales en otros tejidos. Aparecen además proteínas anómalas que dotan a las células neoplásicas de una gran respuesta a factores que determinan su crecimiento y multiplicación. Cabe resaltar la detección de la llamada “proteína P” que dota a las células de gran resistencia a las drogas neoplásicas utilizadas en quimioterapia. DEL NÚCLEO Respecto a las anomalías que afectan al núcleo, las más fácilmente detectables afectan al tamaño nuclear, lo que determina un índice mitótico mayor que el correspondiente a una célula normal. GENÉTICAS Las alteraciones más importantes afectan al material genético. Existen una serie de genes normales llamados prooncogenes que por acción de determinados agentes se transforman en oncogenes, lo que se traduce en la mayoría de los casos en la alteración en la composición de las proteínas que codifican o alteraciones en la cantidad induciendo a la mitosis acelerada de las células. Por este mismo mecanismo puede además desaparecer genes protectores, malignizándose igualmente la célula afectada. DEL CICLO CELULAR En un ciclo celular normal la mayor parte del tiempo lo dedican las células, una vez diferenciadas, a sintetizar productos específicos de cada tipo celular. Una vez dividida la célula puede madurar y diferenciarse para continuar de nuevo el

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ciclo celular. Dicho ciclo celular está regulado por una serie de proteínas sintetizadas por la propia célula. Cuando este ciclo se altera, las células no maduran, no se diferencian, por lo que no tienen capacidad de síntesis y se dividen a gran velocidad constituyendo rápidamente la masa tumoral. TIPOS DE MARCADORES TUMORALES ESPECÍFICOS E INESPECÍFICOS Las sustancias marcadores se pueden clasificar como específicos de un tumor o asociados a este. Los antígenos específicos del tumor se piensan que son resultado directo de la oncogénesis; pueden considerarse como neoantígenos específicos de las células tumorales. Los antígenos inespecíficos están asociados al tumor, y comprenden diversas enzimas y proteínas que aparecen en sangre y son mediadas por el propio tumor o su influencia en tejidos no afectados. EN FUNCIÓN DE SU UTILIDAD CLÍNICA Podemos clasificar los marcadores tumorales en función de su utilidad clínica en: marcadores diagnósticos, terapéuticos, de evolución y genómicos. La determinación de marcadores tumorales en sangre nos proporciona una gran información, aunque el conocimiento de la tasa de marcadores tumorales en la propia masa tumoral nos va a proporcionar también una valiosa información. Si estos son negativos, nos indica que nos encontramos frente a un tumor de células no diferenciadas incapaz de sintetizar estos marcadores, y por lo tanto de gran agresividad. Por el contrario, si los marcadores son positivos, nos indica que las células tienen la diferenciación suficiente para sintetizar, y por lo tanto de menor agresividad que en el caso anterior. Así, este tipo de determinación nos ayuda a diagnosticar y cuantificar la mayor o menor agresividad de las células tumorales, se denominan por tanto marcadores diagnósticos. La determinación basal y la cuantificación periódica de los marcadores tumorales es indicativa de la sensibilidad de la célula a una determinada terapia (marcadores terapéuticos) e indicativa igualmente de la evolución de la enfermedad y de la utilidad de la terapia elegida (marcadores de evolución).

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Existen además marcadores genómicos que permiten conocer la incidencia de las alteraciones de los prooncogenes al inicio de la enfermedad. Habitualmente se trata de proteínas codificadas por los genes alterados. CARACTERÍSTICAS DE LOS MARCADORES TUMORALES Para que un marcador tumoral sea considerado como tal debe reunir una serie de características como son: 1. Deben ser producidas por las células tumorales o bien modificar los valores

normales de un individuo sano. En el primer caso, entre los marcadores producidos por una célula neoplásica tenemos por ejemplo los antígenos oncofetales, o la gonadotropina coriónica en varones o mujeres no embarazadas. En el segundo caso, hay que fijar previamente los llamados valores de corte o valores a partir de los cuales supondremos probable la existencia de una patología.

2. Deben detectarse y cuantificarse fácilmente. 3. Deben ser de alta sensibilidad y su tasa ser reflejo del tamaño tumoral. 4. Deben ser específicos. 5. Sus niveles en individuos sanos deben ser muy inferiores a los que se

encuentran en individuos enfermos. CUALIDADES DE LOS MARCADORES TUMORALES. Como comentamos anteriormente, un marcador debe ser sensible y específico. Podemos definir los conceptos de sensibilidad y especificidad de la siguiente forma:

• Sensibilidad: Es la probabilidad de encontrar un valor positivo en una población de enfermos.

• Especificidad: Es la probabilidad de hallar un valor negativo en una población de sanos.

Si suponemos dos muestras de población, una de individuos sanos y otra de individuos enfermos, consideraremos un valor verdaderamente positivo (VP) a aquel superior al límite de normalidad en un individuo enfermo; un valor verdaderamente negativo (VN) al valor inferior al límite normal en un individuo sano; un valor falsamente positivo (FP) a un valor superior al límite de normalidad en un individuo sano y un valor falsamente negativo (FN) a un valor inferior al límite de normalidad en un individuo enfermo. En base a esto:

Sensibilidad = (VP/(FP+FN)) x 100 Especificidad = (VN/(FP+VN)) x 100

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Es por ello que se deben asociar marcadores de gran sensibilidad con otros de gran especificidad. Así, si tenemos interés en conocer que no se padece una determinada enfermedad, buscaremos una especificidad alta, donde los falsos positivos tiendan a cero; mientras que si queremos tratar una patología de gran agresividad debemos buscar técnicas de gran sensibilidad, donde los falsos negativos tiendan a cero, Podemos definir también respecto a los marcadores tumorales el Valor Predictivo, que es la probabilidad de que un sujeto investigado padezca o no la enfermedad. Así, el valor predictivo positivo es la probabilidad de que el sujeto padezca la enfermedad.

VPP = (VP/(VP+FP)) x 100 El valor predictivo negativo, por tanto, será la probabilidad de que el individuo no padezca la enfermedad.

VPN = (VN/)VN+FN)) x 100 Un marcador se puede emplear como prueba de screening en una población para detectar un determinado cáncer cuando el VVP sea alto. DETERMINACIÓN DE MARCADORES NIVELES DE MARCADORES

Los factores que determinan los niveles de marcadores en sangre son: 1. Índice tumoral de síntesis: Es la relación entre el número de células

productoras del marcador utilizado en el seguimiento y el número total de células constitutivas de la masa tumoral.

2. Localización de la masa tumoral y mecanismo de liberación que permite el

paso del marcador a la circulación general. 3. Vida media del marcador en la propia masa tumoral y en sangre periférica. 4. Factores analíticos relacionados con la técnica elegida para su determinación.

TOMA DE MUESTRAS

La obtención de la muestra es de gran importancia ya que los niveles de marcadores se pueden ver afectados por:

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1. La exploración del paciente previa a la obtención de la muestra puede provocar un aumento en la tasa de marcadores, especialmente en el caso de enfermedades prostáticas.

2. Los agentes quimioterapéuticos pueden interferir en la determinación del

marcador, por lo que debe esperarse un periodo determinado que va a depender de la vida media de la droga utilizada.

3. La necrosis celular que sigue a un tratamiento radiológico o a la quimioterapia

ocasiona la liberación de todos los componentes celulares, con la consecuente elevación de los niveles en sangre.

DETERMINACIÓN DE MARCADORES Es importante antes de iniciar cualquier tratamiento o manipulación determinar los valores basales, para poder seguir la evolución y eficacia del tratamiento elegido. Por otro lado, los marcadores inespecíficos no tienen unas tasas o valores establecidos en general, por lo que el propio paciente es su propio control, y el conocimiento de los valores basales ayudará en la interpretación de las oscilaciones que tengan dichos valores. La historia y patología de cada paciente, así como la medicación que se prescriba marcará el número y frecuencia de las determinaciones posteriores para el seguimiento del tratamiento y evolución de la enfermedad. La interpretación de las cifras de los marcadores ha de hacerse con cautela, pues están sujetos a muchas variables. La presencia de un valor elevado inesperado y no explicable por una posible manipulación, medicación, infección, etc., deberá ser cuidadosamente comprobado repitiendo la determinación e incluso la extracción. Esto es importante ya que este valor elevado nos puede indicar recidivas mucho antes que estas puedan ser detectadas por otros medios. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN Los marcadores tumorales pueden ser detectados tanto en tejidos tumorales como en líquidos biológicos. La detección en tejidos tumorales se realiza mediante técnicas inmunicitoquímicas. La determinación de marcadores tumorales en líquidos biológicos se lleva a cabo mediante técnicas inmunoquímicas, que incluyen entre otras el radioinmunoanálisis (RIA) y técnicas de enzimoinmunoanálisis (ELISA).

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Son técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo, por lo que son de gran sensibilidad, aunque van a influir en la técnica la afinidad y especificidad del anticuerpo utilizado. ASOCIACIÓN DE MARCADORES Los marcadores tumorales se suelen asociar en el estudio de una determinada enfermedad, ya que utilizados asociados aumenta la sensibilidad. Se recomienda asociar al menos dos marcadores, un marcador de celularidad, habitualmente de poca especificidad (CEA), de alteración de la respuesta inmunitaria (Neopterina) o de proliferación celular (TPS) con otro de mayor especificidad dentro de la patología estudiada, habitualmente de menor sensibilidad que los anteriores. En distintas neoplasias se emplean asociaciones de varios marcadores para el diagnóstico, seguimiento y detección precoz de recidivas. Ponemos varios ejemplos: 1. Cáncer de mama: es la primera causa de mortalidad por cáncer en las

mújeres. Se emplea como marcadores tumorales para el diagnóstico y seguimiento el CEA y el Antígeno Ca 153, como marcadores de pronóstico y terapéuticos se utilizan los receptores de estrógeno y progesterona.

2. Cáncer de próstata: Es la segunda causa de mortalidad por cáncer en el

varón de edad comprendida entre los 50 y 60 años. En el diagnóstico y seguimiento se utilizan el PSA y la fosfatasa ácida prostática (PAP).

3. Cáncer de hígado: Como marcador se emplea la alfafetoproteína, de utilidad

en el diagnóstico y en el control, e incluso con valor pronóstico para enfermos con hepatocarcinoma. En el estudio de las metástasis se emplea el antígeno carcinoembrionario, sobre todo en el seguimiento del enfermo tratado.

ESTRUCTURA DE LOS MARCADORES Los marcadores pertenecen a grupos con estructuras químicas muy variadas. Los antígenos oncofecales se detectan en sangre fetal y prácticamente después del parto se reducen a niveles no detectables. A medida que un individuo sano crece es posible que aparezcan en suero en concentraciones bajas. Dos de los antígenos oncofecales más conocidos son la alfafetoproteína (AFP) y el antígeno carcinoembrionario (CEA).

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Entre las proteínas que tienen utilidad de diagnóstico para la evaluación de pacientes con cáncer se encuentran aquellas asociadas al embarazo, tales como la gonadotropina coriónica humana. Las enzimas son marcadores útiles de procesos malignos. Muchas hormonas son producidas por los tumores: cuando el tejido no endocrino es responsable de la producción de hormonas se habla de producción hormonal ectópica. Los marcadores celulares, tales como los antígenos de las células T o B son útiles, así como los receptores de estrógenos y progesterona. En la tabla 1 aparecen los marcadores tumorales asociados a las patologías en que aparecen. MARCADORES TUMORALES MÁS UTILIZADOS ANTÍGENO CARCINOEMBRIONARIO (CEA) Se trata de una glicoproteína sintetizada en el tejido fetal, formada por varios componentes que han de tenerse en cuenta, ya que dependiendo del anticuerpo empleado en la técnica de determinación, se reconocerá uno o varios componentes, lo que se reflejará en la tasa obtenida. En pacientes adultos con diversos tipos de cáncer pueden detectar niveles elevados en las células y en plasma, aunque no es específico de ningún proceso maligno ni de tipo tumoral. El CEA puede aparecer aumentado es especial en procesos malignos del aparato digestivo, páncreas, pulmón y mama. Su mayor aplicación es el diagnóstico y seguimiento postoperatorio del cáncer colo-rectal y el estudio de las metástasis del cáncer de hígado. ALFAFETOPROTEINA (AFP) Es una glicoproteína presente en el suero de individuos sanos a bajas concentraciones. Valores aumentados se observan en hepatomas y en tumores germinales. Pequeños incrementos de AFP pueden detectarse en relación con tumores del aparato digestivo o del pulmón.

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Tabla 1: Marcadores tumorales y tumores asociados

TIPO MARCADOR TUMOR ASOCIADO Antígenos oncofetales

CEA AFP

Mama, colon Hígado, tumores germinales

Glicoproteínas Ca 153 Ca 549 Ca 125

Mama Mama Ovario

Proteínas Caseína Ferritina Osteocalcina

Mama, pulmón, gastrointestinal Leucemia Metástasis ósea

Enzimas Creatincinasa (BB) Fosfatasa ácida prostática(PAP) Fosfatasa alcalina Antíg. Especif. Prostático(PSA)

Próstata Próstata Pulmón Próstata

Receptores hormonales

De estrógeno De progesterona

Mama Mama

Marcadores celulares

Marcadores de las células T, B Linfoma

Poliaminas Espermina, espermidina, putresceina

Leucemia, linfoma, cáncer colorrectal

Hormonas Calcitonina (CT) Gonadotropina coriónica(HCG) Adrenocorticotropica (ACTH) Paratiroidea (PTH) Antidiurética (ADH) Del crecimiento (GH) Eritropoyetina Lactógeno placentario humano Estimulante del tiroides (TSH)

Metástasis óseas Tumores germinales Pulmón Riñón, pulmón, páncreas, ovario Pulmón Pulmón, estómago Cerebro, hígado Pulmón Pulmón, mama

ANTÍGENO Ca 153 Pertenece al grupo de las proteínas transmembranas, cuya estructura aún no está establecida. Existe una gran dispersión entre los valores encontrados en una población normal, en una población afectada de una patología mamaria benigna y una población que presenta una enfermedad maligna. Es por ello, que lo interesante es disponer de los valores de evolución de un mismo paciente con el fin de detectar precozmente recidivas. Sus valores están aumentados en los cánceres que afecten a tejido epitelial, fundamentalmente mamarios.

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ANTÍGENO Ca 125 Pertenece al grupo de las glicoproteínas no identificadas. Es especialmente útil su empleo en carcinomas ginecológicos (fundamentalmente de ovario) aunque también se ve aumentada sus tasas en carcinomas gastrointestinales, de mama y de pulmón. Aumenta también en el embarazo y en patologías como la diabetes y cirrosis. GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA (HCG) Es una hormona glucoproteica generalmente detectada en suero y orina durante la gestación. La hormona está compuesta de una unidad alfa y de una unidad beta. Se ha puesto de manifiesto que una subunidad aislada puede ser producida por un determinado tumor Se detecta en tumores de células embrionarias y es muy útil en el seguimiento de la evolución de las molas tras su evacuación. ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO Es una glicoproteína secretada exclusivamente por la próstata. Es por tanto un marcador específico de próstata, por lo que tiene interés en el diagnóstico, pronóstico, determinación del estadio y seguimiento del cáncer de próstata. Puede encontrarse elevado en afecciones como prostatitis aguda o adenomas. ANTÍGENO POLIPEPTÍDICO TISULAR (TPA) Es una proteína aislada de muestras tumorales y metástasis. Es considerado como un marcador de proliferación tumoral, por lo que no es específico de la patología tumoral. Tiene interés en el seguimiento terapéutico del cáncer de vejiga y en la identificación de sujetos de riesgo, siendo de gran importancia disponer de los valores basales del enfermo en particular. RECEPTORES HORMONALES Son estructuras proteicas encargadas del reconocimiento de las hormonas por sus células diana. Se emplean como marcadores tumorales dos tipos de receptores: los receptores de estrógeno y los receptores de progesterona. Se utilizan para valorar la sensibilidad de los tumores malignos de mama a la respuesta hormonal. Su determinación también permite la correcta aplicación y selección de la terapia en función de la hormonodependencia o no del tumor.

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HORMONAS COMO MARCADORES TUMORALES La determinación de la producción hormonal ectópica puede emplearse como un marcador bioquímico para la monitorización de pacientes con tumores confirmados o con sospecha. En aproximadamente dos tercios de los pacientes, la producción ectópica de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) se asocia con carcinoma pulmonar mientras que otros tumores, como los carcinoides bronquiales y los tumores pancreáticos y tímicos, son responsables del resto de los casos. El carcinoma de células renales y el carcinoma epidermoide de pulmón son responsables de aproximadamente dos tercios de los tumores productores de hormona paratiroidea (PTH) ectópica, mientras que el resto de los tumores se originan en distintas localizaciones. Los tumores responsables de la producción de hormona antidiurética (ADH) son los pulmonares y pancreáticos. La producción de hormona del crecimiento (GH) ha sido descrita solamente en asociación con unos pocos tumores, los más frecuentes de los cuales son el carcinoma broncogénico y el gástrico. En pacientes con carcinoma broncogénico se ha observado el lactógeno placentario humano (LPH) como marcador tumoral. La eritropoyetina se ha detectado en relación a la patología neoplásica renal, pero, dado que el riñón es normalmente responsable de su producción, estos tumores no pueden detectarse como síndromes ectópicos. Sin embargo, dicha sustancia ha sido secretada por hepatomas y tumores cerebelosos; los tumores pulmonares son característicos por no secretar esta hormona. La tirocalcitonina sérica (TCT) aparece aumentada en ciertos pacientes con carcinoma pulmonar, colónico, mamario, pancreático y gástrico. MARCADORES TUMORALES ANATOMOPATOLÓGICOS La cuantificación de marcadores tumorales en sangre es sencilla y práctica. Sin embargo, el conocimiento de la propia masa tumoral también nos proporciona valiosa información. Para precisar el tipo de neoplasia y su posible histogénesis: epitelial (carcinoma), mesenquimatoso (sarcoma), linfoide (linfoma) etc. e intentar determinar la localización primaria ante una neoplasia metastásica, el anatomopatólogo cuenta con una serie de marcadores que resumimos a continuación:

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A) Marcadores tumorales histoquímicos: En general los marcadores histoquímicos pueden ser muy útiles en el diagnóstico anatomopatológico de procesos metastáticos en los que no se conoce la localización del tumor primitivo.

a) Glucógeno: Tiene valor en el diagnóstico general de las neoplasias.

b) Sustancia mucoides c) Lípidos d) Pigmentos melánicos: Es un marcador diagnóstico de melanoma

maligno. B) Marcadores tumorales inmunohistoquímicos de carácter general: Las

técnicas inmunohistoquímicas aplicadas a la patología tumoral pueden contribuir a realizar el diagnóstico diferencial de los tumores, identificar probables agentes etiológicos y subclasificarlos diversos tipos de tumores.

a) Filamentos intermedios: son un componente importante del citoesqueleto celular cuya función primordial es mantener la forma calular y la organización espacial de los orgánulos citoplasmáticos.

a.1) Citoqueratinas a.2) Vimentina a.3) Desmina a.4) Proteina ácida glial fibrilar a.5) Neurofilamentos b) Proteína S-100: Se emplea en el diagnóstico de tumores

indiferenciados. En ausencia de citoqueratinas y antígeno epitelial de membrana (EMA), la positividad de esta proteína es diagnóstica de melanoma maligno.

c) Antígeno epitelial de membrana (EMA): Se emplea simultáneamente con las citoqueratinas para precisar el origen epitelial de un tumor indiferenciado.

d) Antígeno leucocitario común (ALC): Este antígeno es positivo en linfomas.

C) Otros marcadores inmunohistoquímicos a) Antígenos vasculares: Antígenos útiles en el diagnóstico de

tumores vasculares. a.1) Antígeno asociado al factor VIII a.2) Ulex europeus b) Antígenos de diferenciación neuroendocrina: Antígenos

demostrados en tumores neuroendocrinos y neuroectodérmicos. b.1) Enolasa específica neuronal b.2) Sinaptofisina b.3) Cromograninas c) Antígenos de naturaleza enzimática: Son antígenos poco útiles

debido a su baja sensibilidad que han quedado limitados a determinados tumores.

c.1) Lisozima

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c.2) Alfa-1-antitripsina c.3) Alfa-1-antiquimotripsina d) Antígenos oncofetales d.1) AFP d.2) CEA e) Antígenos específicos e.1) Prostáticos (PSA y FAP): Ambos se expresan en procesos benignos y malignos de la glándula prostática. e.2) HMB 45: detectado en melanomas y en los nevus pigmento-celulares. e.3) Alfa-lactoalbúmina: Tiene importancia en el diagnóstico de carcinoma metastásico axilar en ausencia de clínica tumoral en mama. e.4) B 72.3: Marcador de glándulas apocrinas que se demuestra en la mayor parte de los carcinomas de mama. e.5) Ca 125: Glucoproteina de superficie observada en los tumores mucinosos de ovario, aunque también se ha evidenciado en otros adenocarcinomas: endometrio, gastrointestinal y mama.

D) Marcadores ultraestructurales: la mayor parte del diagnóstico anatomopatológico de los tumores se realiza con microscopio óptico y técnicas de inmunohistoquímica, pero en ocasiones, la microscopía electrónica de transmisión contribuye notablemente a identificar algunos aspectos celulares de importancia.

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TEMA 5. LÍQUIDOS BIOLÓGICOS:

CITOLOGÍA Y BIOQUÍMICA. Bajo el término de líquidos biológicos podemos definir a todos aquellos líquidos o fluidos corporales procedentes del organismo, tales como:

• Líquido cefalorraquídeo. • Líquido pleural. • Líquido sinovial. • Líquido pericárdico. • Líquido amniótico.

A lo largo de este tema nos vamos a centrar en los que se consideran de mayor importancia, líquido cefalorraquídeo (LCR), y líquido sinovial.

LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO El LCR, es el líquido seroso contenido en los ventrículos cerebrales, espacio subaracnoideo y conducto medular. Se forma principalmente en los plexos coroideos y espacio subaracnoideo. Su volumen en adulto es de unos 150 ml y en recién nacido de 10 a 60 ml. Se renueva cada 2-4 horas y la velocidad a la que se forma es de unos 21 ml /h. Su aspecto es incoloro, claro y de baja viscosidad. No contiene apenas fibrinógeno, contiene pocas proteínas, principalmente albúmina y globulina, y su pH oscila entre 7.28 y 7.34. Se suelen obtener 2 tubos: Tubo 1: Para Microbiología.

• Centrifugar con rapidez. • Teñir el sedimento con Gram. • A la vez sembrar en medio especial. • Separar 3 ml en tubo estéril con tapón de rosca y heparina. • No conservar en frigorífico, pues algunos gérmenes se dañan.

Tubo 2: Para Citología, Bioquímica y Serología.

• Hacer estudio sin fijar y antes de que transcurran 2 horas desde la extracción.

• Centrifugar y usar el sobrenadante. • Se investiga glucosa y proteínas.

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• No conservar durante más de dos horas, pues los leucocitos consumen la glucosa.

EXAMEN FÍSICO VOLUMEN Se mide añadiendo agua a otro tubo de ensayo de las mismas características, hasta enrasar para no contaminarlo durante la manipulación. ASPECTO Normalmente limpio, claro y sin sedimento. Si se presenta turbio, puede deberse a la presencia de leucocitos. COLOR Normalmente incoloro. Si el color oscila entre rosa pálido, anaranjado o amarillento se denomina xantocromía y puede deberse a:

• Oxihemoglobina. • Metahemoglobina. • Bilirrubina. • Elevada concentración de proteínas (niveles superiores a 150 mg/dl).

Tras una hemorragia subaracnoidea (2-4 horas después) es normal la xantocromía, que desaparece tras 4 a 8 días. COÁGULOS Y SEDIMENTOS No deben aparecer coágulos al dejarlo en reposo, pero si lo hacen pueden indicar:

• Coágulos sedimentados, en caso de meningitis purulenta. • Coágulos floculantes, en caso de sífilis. • Coágulos a modo de tela de araña con películas suspendidas de la

superficie del líquido en meningitis tuberculosa. EXAMEN BIOQUÍMICO PROTEÍNAS El LCR contiene muy pocas proteínas en relación al plasma (14 -45 mg/100 ml), siendo las principales:

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Proteínas Plasma (mg/l) LCR (mg /l) Prealbúmina 238 17.3 Albúmina 36600 236 Transferrina 2040 142 Ig G 9870 802 Ig A 1750 1346 Fibrinógeno 2960 4940 Beta-lipoproteína 3726 6213

Albúminas -> prealbúminas -> globulinas. Un aumento en la concentración de proteínas del LCR puede estar causada por:

• Aumento en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica por inflamación.

• Meningitis purulenta. • Meningitis graves. • Caso de esclerosis múltiple u otras enfermedades degenerativas del SNC. • Alteraciones endocrinas, metabólicas, etc. • Aumento de la síntesis de proteínas en el SNC.

A) Proteínas totales: Los métodos utilizados para medir las proteínas totales en LCR se clasifican en: a) Procedimientos turbidimétricos.

• Ácido sulfosalicílico más sulfato sódico (SAS). • Ácido tricloroacético (TCA).

b) Espectrofotometría ultravioleta a 210 nm después de:

• Cromatografía en columna. • Ultra centrifugación.

c) Método de Lowry utilizando el reactivo de Folin-ciocalteau.

• Con blanco. • Sin blanco.

d) Procedimientos modificados del Biuret con medición a 330 nm.

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e) Fijación de colorante.

• Ponceau. • Otros colorantes.

f) Métodos inmunológicos. a) Procedimientos turbidimétricos: Son muy utilizados, en ellos hay que controlar concienzudamente la temperatura, pues existe relación lineal entre temperatura y turbidez, y la alteración de la primera daría resultados poco fiables. Son sencillos, pero se necesitan 500 microlitros de LCR, frente a los 25 - 200 microlitros necesarios para otros métodos. Presentan interferencias en la xantocromía. b) La espectrofotometría ultravioleta a 210 nm se basa en que las proteínas presentan absorbancia intensa entre 210 y 220 nm. Su precisión es mayor que la de los métodos turbidimétricos. c) El método de Lowry con el reactivo de Folin, se utiliza mucho y tiene dos fases:

1. Reacción entre las proteínas y el cobre. 2. Reducción de los ácidos fonsfotúnsgico y fosfomolíbdico, con el complejo

proteínas-cobre. Es un método más largo de realizar que los métodos turbidimétricos y presenta interferencias derivadas de los fenoles. d) Procedimientos modificados del Biuret. Son más largos y difíciles que los turbidimétricos y presentan interferencias derivadas de polipéptidos de cadena corta. f) Métodos inmunológicos. Son métodos simples y rápidos. Un aumento sensible en la concentración de proteínas totales indica hiperreactividad capilar (inflamación, neoplasia, diabetes..., etc.). Un aumento en la concentración de las globulinas puede indicar plasmocitoma del SNC o esclerosis múltiple. B) Glucosa Los valores normales de glucosa en LCR son de 40 - 80 mg/dl (50% - 80% de la concentración en sangre, con pacientes en ayunas).

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Una disminución de los niveles de glucosa puede indicar meningitis purulenta, abscesos cerebrales, tumores, etc. La determinación de la glucosa en LCR se puede hacer por los métodos espectrofotométricos de:

• Folin Wu. • Glucosa-oxidasa. • Ortotoluidina.

C) Enzimas En LCR están presentes muchas enzimas (GOT, GPT, etc.), pero solo la LDH (lactato deshidrogenasa) parece clínicamente útil. La LDH aumenta en los siguientes casos:

• Leucemia. • Hemorragia subaracnoidea. • Meningitis bacteriana. • Tumores del SNC.

CITOLOGÍA EXAMEN MICROSCÓPICO El LCR apenas presenta células, suele ser normal:

• En adulto, de 0 a 0.5 células mononucleadas (linfo y monocitos) por mm3. • En niño de 0 a 30. • La presencia de hematíes suele ser anormal.

RECUENTO CELULAR Debe efectuarse antes de 1 hora tras la extracción. Se deben rechazar las muestras con sangre a simple vista. Para el recuento se utiliza una cámara cuentaglóbulos como la de Neubauer. Un aumento anormal de células se llama pleocitosis y es causada por tumores cerebrales, meningitis tuberculosa, etc. CITODIAGNÓSTICO Recuento diferencial: El primer paso de un recuento diferencial de LCR es concentrar los leucocitos a través de distintas técnicas como:

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• Centrifugación, con tinción de Wright del sedimento resuspendido (también con May-Grumwald-Giemsa).

• Filtración con Millipore o Nucleopore, etc. El paso siguiente consiste en observar al microscopio (100X), contar las células y clasificarlas en; linfocitos neutrófilos, segmentados, células endoteliales, etc., expresando su concentración en porcentaje. Los valores normales suelen ser:

Tipo celular Adulto Recién nacido Linfocitos 62% 20% Células mesoteliales y monocitos

36% 72%

Neutrófilos 2% 3% Histocitos raros raros Eosinófilos raros raros

En las meningitis purulentas aumenta el número de neutrófilos segmentados. En las pielonefritis agudas, primero aumento el número de neutrófilos y después el de linfocitos pequeños.

LIQUIDO SINOVIAL FUNCIÓN, RECOGIDA DE MUESTRAS Y MANIPULACIÓN Es un ultrafiltrado del plasma al que se une el ácido hialurónico, elaborado por las células de la membrana sinovial. Proporciona lubricación y nutrientes a las células cartilaginosas de la articulación. Normalmente la cantidad es de 3-4 ml a no ser que exista derrame, enfermedad, etc. La técnica de extracción se denomina artrocentesis y consiste en aspirar percutáneamente todo el líquido de la cavidad sinovial, mediante jeringa de plástico estéril. El paciente preferentemente estará en ayunas 6-2 horas antes (importante para los niveles de glucosa). Puede dar información sobre:

• Sospecha de infección (artritis supurativa). • Artritis por ácido úrico (gota). • Artritis por pirofosfato cálcico (pseudogota, etc).

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Tubo 1, para serología:

• De 5-10 ml sin anticoagulante. • Centrifugar y usar sobrenadante.

Tubo 2, para bacteriología:

• Sin anticoagulante. • Si se sospecha infección por gonococos, sembrar directamente en

Tayer-Martin. Tubo 3, para citología/ bioquímica:

• Usar heparina como anticoagulante (25 U/ml). • No deben formarse coágulos, si los hay indica tardanza o mala ejecución

del mezclado. Puede conservarse a -4º C, para analizar inmediatamente y a -70º C para serología. El examen habitual del líquido sinovial incluye:

• Determinación de su aspecto. • Resultados de la prueba del coágulo de mucina. • Estudio microscópico con luz polarizada compensada. • Tinción de Gram. • Cultivo. • Nivel de glucosa.

Ninguna de estas pruebas, excepto la tinción de Gram y la identificación de cristales, puede considerarse altamente específica para determinar el tipo de artritis. EXAMEN MACROSCÓPICO El aspecto normal del líquido sinovial es transparente y de color amarillo pálido. La turbidez sugiere inflamación, aunque no necesariamente. PRUEBA DEL COÁGULO DE MUCINA Sirve para calcular la viscosidad, consiste en colocar una gota del líquido sobre el dedo pulgar y tocar con otro dedo de la mano. Al separar los dedos, el líquido debe formar un hilo de 4-6 cm. de longitud. Si el hilo se rompe antes de 3 cm.., debe considerarse viscosidad menor de la normal.

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CITOLOGÍA RECUENTO CELULAR DE LEUCOCITOS Puede hacerse con hemocitómetro, o en cámara de Fuchs-Rosenthal.

• Para microscopio óptico normal utilizar diluyente con 0.1% de azul de metileno (facilita el reconocimiento de leucocitos).

• Para microscopio de contraste de fase no es necesario colorante. • Si el líquido aparece muy manchado de sangre, es necesario lisar los

eritrocitos previamente. Son valores normales:

• 100.000 leucocitos /microlitro. • Valores normales indican infección bacteriana normalmente.

RECUENTO DIFERENCIAL Para calcular el porcentaje de neutrófilos puede utilizarse:

• Tinción de Wright (sin concentrar). • Tinción de Wright del sedimento centrifugado. • Tinción de Wright del líquido concentrado por citocentrifugación (previa

tinción de Papanicolau) La técnica microscópica elegida casi siempre es la de contraste de fase. Cuando se dan los resultados de un recuento diferencial, habitualmente solo se hace mención al porcentaje de neutrófilos. El valor normal de estos suele ser del 25%. Un porcentaje muy alto (90% o más) es indicativo de artritis bacteriana. Morfología celular:

• Células AR; son neutrófilos en cuyo citoplasma aparecen, tanto en microscopia óptica, como de fase, pequeños gránulos (de 10 a 20) citoplasmáticos oscuros con diámetro entre 0.5 y 2 micras. Los gránulos pueden identificarse claramente con contraste de fase o inmersión en aceite, y puede ser demostrada su presencia con técnicas de inmunofluorescencia. Aparecen en artritis reumatoide, gota y artritis séptica.

• Células LE; en el Lupus Eritematoso, aparecen en líquido sinovial unas

células de características particulares denominadas células LE.

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• Grandes células histiocíticas con inclusiones citoplasmáticas, aparecen al teñir con Giemsa y con Papanicolau en el síndrome de Reiter.

• Células cartilaginosas multinucleares; se presentan en la osteoartritis,

para identificarlas se tiñe con Papanicolau. Cristales; se han descrito 4 tipos asociados a las siguientes enfermedades:

Artritis cristales de apatita Gota cristales de urato monosódico dentro de los neutrófilos y

macrófagos durante el ataque de gota, y fuera de ellos en época de no ataque

Pseudogota cristales de dehidrato de pirofosfato cálcico Artritis crónica

cristales de dehidrato de talco (introducidos en una intervención quirúrgica)

EXAMEN BIOQUÍMICO. INTERVALOS DE REFERENCIA DEL LÍQUIDO SINOVIAL.

Líquido Sinovial Plasma Proteínas 1-3gr/dl 6-8 gr/dl Albúmina 55-70% 50-65% Alfa-globulina 5-7% 3-5% Beta-globulina 8-10% 8-14% Gamma-globulina 10-14% 12-22% Glucosa 70-110 mg/dl 70-110 mg/dl PH 7.3-7.4 7.38-7.44 arterial

7.36-7.42 venoso Las proteínas presentes en líquido sinovial dependen de las presentes en plasma. Si aumenta el nivel de proteínas en plasma, también lo hace en el líquido sinovial. La concentración de una proteína específica se expresa normalmente como cociente líquido sinovial/plasma. La glucosa en plasma y en líquido sinovial presenta valores muy similares. Es importante obtener la muestra en ayuno de 6 a 12 horas. También se presentan enzimas como la fosfatasa ácida, LDH y transaminasas, pero su determinación parece tener escaso valor clínico. La determinación de pH y de lactato proporciona un índice útil de la inflamación, pero es inespecífico de la etiología.

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TEMA 6. ANÁLISIS CUALITATIVO DEL SEDIMENTO URINARIO

INTRODUCCIÓN El examen del sedimento urinario comprende la investigación e interpretación de una serie de estructuras de distinto origen y composición que pasaremos a ver detenidamente en este tema. Realizado en las debidas condiciones el examen microscópico del sedimento urinario proporciona una ayuda indiscutible en el estudio del diagnóstico y evolución de las enfermedades renales.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA El examen del sedimento urinario es más seguro cuando la orina está concentrada. Si la muestra está demasiado diluida y los elementos celulares lisados, la cantidad del sedimento obtenida incluso después de centrifugación puede no ser representativa. El examen microscópico se hace generalmente con el sedimento obtenido por centrifugación de la orina. Un sedimento puede prepararse de la siguiente forma (la técnica, en la actualidad, no se encuentra totalmente estandarizada):

1. Mezclar bien la muestra de orina y transferir un volumen aproximadamente de 10 ml a un tubo de centrífuga cónico.

2. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos. 3. Decantar la muestra. Volver a suspender el sedimento en unas gotas de

orina. 4. Colocar la gota de sedimento sobre un porta y taparla con un cubre. La

gota no ha de ser demasiado grande, debiendo evitarse la formación de burbujas.

5. Examinar la preparación antes de que se produzca evaporación. 6. Examinar en primer lugar un área grande con poco aumento. Luego

reducir la intensidad de luz al mínimo y examinar varios campos en busca de cilindros. Finalmente, enfocar con mayor aumento (40x). Examinar varios campos para evaluar células y otros.

El sedimento obtenido mediante centrifugación de la orina contiene todos aquellos materiales insolubles (denominados también elementos formes) que se han acumulado en la orina durante el proceso de formación (células,

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microorganismos, cilindros, etc.) contiene también cristales de distintas formas y tamaños dependiendo del pH de la orina, y generalmente (salvo excepciones) de poca importancia clínica. Muchos laboratorios utilizan la microscopía de contraste de fases para la interpretación del sedimento urinario, en especial la observación de cilindros.

IDENTIFICACIÓN DE ELEMENTOS ESPECÍFICOS EN EL SEDIMENTO Clasificación: Sedimento organizado Hematíes Leucocitos Células epiteliales

o Células escamosas o Células de transición o Células renales

Microorganismos o Bacterias o Levaduras o Protozoos o Parásitos

Espermatozoides Cilindros

o Hialinos o Epiteliales o Granulosos o Eritrocitarios o Leucocitarios o Céreos o Cilindroides

Sedimento no organizado Cristales

o pH ácido § Uratos § Ácido úrico

o pH alcalino § Fosfatos triples § Fosfatos amorfos § Carbonato cálcico

o pH variable § Oxalato cálcico § Cistina

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§ Colesterol § Tirosina § Leucina

GLÓBULOS ROJOS Aparecen en el sedimento como formas circulares, carecen de núcleo y refractan un poco la luz. Presenta aspecto de disco transparente. Son de menor tamaño que los leucocitos y las células epiteliales.

No debe considerarse patológica la aparición de 2/3 hematíes por campo, en el estudio del sedimento. Cuando la orina contiene un número elevado de hematíes y aparezcan además cilindros hemáticos hay que considerar que la hematuria es de origen renal. El aumento de glóbulos rojos en orina se conoce como hematuria. GLÓBULOS BLANCOS Son más grandes que los rojos. Contienen uno o más núcleos. Su presencia en

orina indica generalmente inflamación. Son valores normales en el hombre menos de 3/campo y en la mujer menos de 5/campo. En la mayoría de los trastornos renales o del tracto urinario se produce un incremento de la cifra de leucocitos en orina, que afecta principalmente a los neutrófilos. También puede observarse un aumento temporal en caso

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de fiebre y después de un ejercicio intenso. Si su presencia va acompañada de cilindros leucocitarios o que contengan leucocitos y células epiteliales, la elevación de la cifra de leucocitos presentes en la orina se considera de origen renal. Su aumento en orina se conoce como Leucocituria o piuria. CÉLULAS EPITELIALES Son varias veces más grandes que los glóbulos rojos o blancos. Según su origen tienen diferentes formas, pero la identificación del origen de estas células puede ser en ocasiones dificultoso. Cuando la distinción es posible, podemos encontrar: Células epiteliales escamosas. Proceden de la porción distal del tracto urinario inferior y del tracto genital femenino. Son las de mayor tamaño. Se trata de células planas con un gran citoplasma y núcleo simple. Son poco significativas, a menos que su presencia sea muy abundante. Células de transición (pelvis renal). Su forma es redondeada u oval. En ocasiones parecen tener una proyección en forma de cola (células en raqueta) La orina normal puede contener cierto numero de estas células como resultado del proceso normal de descamación. Cuando aparecen en gran número indica la existencia de un proceso patológico causante de exfoliación anormal.

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• Células renales (pelvis y túbulos renales). Son células pequeñas y redondeadas. La presencia de más de dos células epiteliales del túbulo renal por campo de gran aumento indica un daño activo o una lesión tubular renal.

MICROORGANISMOS Bacterias. La orina normal fresca no contiene microorganismos. Debemos tener en cuenta que si la orina no ha sido recogida en condiciones adecuadas puede tener contaminación. Además si la orina permanece a temperatura ambiente durante algún tiempo, las bacterias pueden proliferar rápidamente y se ven en gran número. Una orina muy alcalina con muchas bacterias y muy pocos glóbulos blancos es característica de muestras contaminadas. La bacteriuria puede informarse como escasa, moderada o intensa. Generalmente en caso de que aparezca debe realizarse un estudio microbiológico de la orina. Levaduras. La más común en el sedimento es la Cándida Albicans. Frecuentemente su presencia en mujeres es consecuencia de una contaminación de la orina. Las levaduras se diferencian de los hematíes en que no se pueden teñir con eosina. Parásitos. La presencia de parásitos en la orina suele indicar contaminación genital o fecal. El flagelado Trichomonas Vaginalis es el parásito más común hallado en la orina. La incidencia de este tipo de parasitismo es muy elevada en las mujeres y puede ser causa de vaginitis intensa.

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ESPERMATOZOIDES La presencia de espermatozoides en la orina es un hecho bastante frecuente y carece de significación patológica. Están formados por una cabeza ovoide y por una larga cola. CILINDROS Son conglomerados alargados de material proteico formados en los túbulos renales o en los conductos colectores. La formación de cilindros es mayor cuando el pH es bajo y existe obstrucción de la nefrona provocada por restos celulares o células. Normalmente el sedimento urinario no contiene cilindros, aunque su detección no indica forzosamente la existencia de una patología renal. Sin embargo, generalizando, podríamos decir que la presencia numerosa de cilindros en un sedimento urinario es indicativa de enfermedad renal. El tamaño y la forma de los cilindros dependen del lugar en que se forman. Los más grandes proceden de los túbulos dilatados, los más finos de los túbulos comprimidos o se deben a una desintegración. A veces son contorneados y ocasionalmente muestran ramificaciones. Hialinos. Se trata de cilindros compuestos fundamentalmente de proteínas sin inclusiones. Son pálidos y transparentes. Difíciles de visualizar. Su aparición en grandes cantidades puede indicar una alteración importante del parénquima renal.

Epiteliales. Son más cortos que los hialinos y más fáciles de ver. Indican inflamación aguda del riñón. Contiene dentro células epiteliales. En las unidades de trasplante, estos cilindros son uno de los criterios más fiables para el diagnóstico de rechazo agudo a partir del tercer día después de la intervención.

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Granulosos. Pueden ser debidos a una evolución de los cilindros de células epiteliales en los que ha existido una degeneración celular. Presentan un aspecto granular con granulaciones más o menos finas (cilindros granulosos finos o gruesos). Su presencia implica un trastorno crónico del riñón.

Eritrocitarios. Contienen glóbulos rojos en su interior. Tienen un aspecto muy variable. Suelen ser indicativo de glomerulonefritis por causa diversa.

Leucocitarios. Se caracterizan por la aparición de leucocitos identificables en el interior de la matriz proteica. Acompaña a las infecciones del tracto urinario. Su presencia exige una investigación bacteriológica de la orina.

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Céreos. Se caracterizan por un alto índice de refracción y una coloración amarillenta. Su composición no es bien conocida. Se ven asociados a procesos crónicos.

Cilindroides, fibrina, células epiteliales, leucocitos, eritrocitos o bacterias pueden agruparse dando formas semejantes a los cilindros. Generalmente se distinguen de los cilindros verdaderos por sus contornos variables e irregulares. No se conoce con exactitud su lugar de procedencia ni la causa de su formación.

CRISTALES Cristales de muy diferentes formas y tamaños se ven habitualmente en la orina, aunque solo ocasionalmente su presencia tiene algún significado. La cristaluria puede ser asintomática o ir asociada a la formación de cálculos, dando lugar a las manifestaciones clínicas que acompañan a una obstrucción completa o parcial del flujo urinario. El pH de la orina tiene importancia en la aparición de los distintos tipos de cristales.

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pH ácido: Uratos Ácido úrico pH alcalino: Fosfatos triples Fosfatos amorfos Carbonato cálcico pH variable: Oxalato cálcico Cistina Colesterol Tiroxina Leucina Uratos. Los uratos amorfos aparecen como granulaciones oscuras, dando al sedimento una coloración rosada, amarillenta o anaranjada. Pueden proceder de la alimentación aunque tambien aumentan en estados febriles.

Cristales de Urato

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Ácido úrico. Toma formas diferentes como pesa, prisma, roseta, placas irregulares. No poseen significación clínica a menos que se presenten en gran cantidad en orinas recién emitidas. Los cálculos de ácido úrico o de uratos se encuentran aproximadamente en el 16% de los pacientes con gota.

Fosfatos. Los cristales de fosfato triple (amónico, magnésico y cálcico) son incoloros y presentan forma típica de ataúd. Se encuentran en orinas alcalinas. Los cristales de fosfato cálcico son amorfos o tienen forma de prisma, roseta, aguja etc.

Los fosfatos amorfos aparecen como granulaciones que confieren al sedimento una coloración blanquecina. Pueden aparecer tras la ingestión de determinados alimentos como la fruta.

Cristales de Fosfato amónico-magnésicoCristales de Fosfato

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Carbonato cálcico. Su forma característica es la de pesa, ocho, esfera. No tienen interés clínico.

Oxalato cálcico. Suelen aparecer en forma de octaedro y presentan un característico cuadrado cruzado diagonalmente (se dice que tienen forma de sobre). Pueden producirse en caso de dietas ricas en oxalato (tomates, repollo espárragos, naranjas...) El oxalato cálcico, muchas veces mezclado con sales de fosfato, está presente en una gran parte de los cálculos urinarios.

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Cistina. Son placas hexagonales. Su presencia es poco habitual y son indicativos de cistinuria (error metabólico congénito poco frecuente).

Colesterol. Aparecen como placas transparentes de forma irregular. Su presencia es rara. Pueden aparecer en nefritis e infecciones graves del tracto urinario. Leucina y tirosina. Los cristales de estos dos aminoácidos suelen aparecer juntos en la orina como consecuencia generalmente de una grave enfermedad hepática. Suelen ser de color amarillento debido a la presencia de bilirrubina (ictericia). Un conjunto de material no significativo puede formar parte del sedimento urinario. Son los desechos o artefactos. A veces se debe a material de vejiga o uretra, pero otras se debe a contaminación. Es frecuente encontrar hilos mucosos, pelos, fibras diversas, etc. Su presencia puede sugerir una recogida defectuosa.

SEDIMENTO NORMAL El sedimento normal no está libre de células o cilindros, pero contiene un número limitado de elementos formes. Una definición precisa de la normalidad es difícil de obtener, pero la presencia de uno o más glóbulos rojos por campo de alto poder, uno o dos leucocitos y algunas células epiteliales no se considerarán necesariamente anormales. La orina de mujeres maduras puede tambien contener un gran número de células epiteliales escamosas procedentes de las paredes vaginales.

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TEMA 7. ESTUDIO DE HECES: DIGESTIÓN, SANGRE OCULTA Y

CUERPOS REDUCTORES. INTRODUCCIÓN Las materias fecales están constituidas en unas tres cuartas partes por agua. Las sustancias sólidas del cuarto restante comprenden:

• 30% de bacterias muertas. • 10 - 20% de grasa. • 2 - 3% de proteínas. • 10 - 20% de sustancias inorgánicas. • 30% de restos no digeribles, componentes sólidos del jugo digestivo como

pigmentos biliares y detritus celulares. El estudio de laboratorio de muestras fecales de origen humano, permite obtener datos que nos sirve para determinar: 1.- La situación del funcionalismo digestivo. 2.- Infecciones intestinales causadas por virus, bacterias y hongos. 3.- Infecciones causadas por parásitos intestinales. Este estudio tiene su máxima indicación en las diarreas crónicas, y comprende la observación macroscópica y microscópica de las heces, así como su análisis químico, bacteriológico y parasitológico.

ESTUDIO DEL FUNCIONALISMO DIGESTIVO Con este estudio procuramos saber la digestión de los principios inmediatos. La digestión es el conjunto de fenómenos mecánicos y bioquímicos que transforman los constituyentes orgánicos más o menos complejos de los alimentos en sustancias simples directamente asimilables. Los alimentos son triturados en la boca sufriendo una división física. Luego comienza una disgregación química mediante fermentos digestivos y elementos bacterianos, siendo absorbidas, las sustancias transformadas, por la mucosa intestinal y por último los residuos no aprovechables de la digestión son expulsados fuera del organismo.

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ALIMENTACIÓN PREVIA AL ANÁLISIS Se debe seguir con el régimen habitual de comidas, pero hay que añadir aquellos elementos que nos pueden suministrar una base para el diagnóstico, como son:

• Carne: Se investiga el tejido conjuntivo y fibras musculares. Debe comerse lo más cruda posible.

• Patatas: Se investiga la digestión de almidón. • Grasa: Se tomará en forma de leche, mantequilla o carne.

Este plan se sigue durante 3 días y luego se recoge la muestra de heces.

TOMA DE MUESTRA Se recogerán las heces en un frasco limpio con cierre hermético, no es necesaria la esterilidad. El análisis se hará en las 12 horas siguientes a la deposición, guardando la muestra en el frigorífico a 4-10º C. Si el análisis se pospone más de 24 horas se añadirá un volumen igual al de las heces de una solución acuosa al 5% de formol comercial. CARACTERES ORGANOLÉPTICOS

A) OLOR:

a) Según la ingesta:

o Inodoro: Meconio. o Aumentado: Comidas ricas en carne y pescado. o Débil: Dieta vegetariana y láctea. o Ligeramente agrio: Niños de pecho.

b) Fecaloide normal. c) Pútrido (olor a amoniaco) Debido a la flora proteolítica aumentada. Provoca diarreas de

putrefacción (heces alcalinas y gases). d) Agrio penetrante o rancio Debido a la flora sacarolítica aumentada. Provoca diarreas de

fermentación (heces ácidas y gases). e) Nauseabundo Debido a la descomposición de tejidos, ocasionada por carcinoma,

úlceras...

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B) COLOR:

a) Marrón: Es el color habitual. b) Verde: Puede ser debido a la ingesta (verduras, medicamentos...) o a la

presencia de biliverdina (rapidez del tránsito intestinal, diarreas infantiles).

c) Rojo: Debido a la ingesta (remolacha) o a la existencia de hemorragias

próximas al ano. d) Negro: Debido a la ingesta (sangre, morcilla, espinacas), a los medicamentos

(carbón, hierro, bismuto) o a hemorragias internas (heces pastosas, melenas).

e) Blanco: Debido a la ingesta (leche, bario, caolín...) o a la ausencia de bilis

fundamentalmente. f) Amarillo: Debido a la ingesta (régimen lácteo) o a diarreas de fermentación

hidrocarbonada. C) CONSISTENCIA: Puede ser dura, normal, pastosa, líquida... D) FORMA: Varía con la consistencia

a) Cilíndrica: Es la normal. b) Laminada o en cinta: Debido a papilomas. c) Bolitas secas y duras: Estreñimiento. d) Bolitas en masas: Se presenta en la Salmonelosis. e) Bola maleable del tamaño de un puño: Se presenta en la atonía del

recto (personas ancianas).

E) VISCOSIDAD: Se determina tocando las diferentes partes de las heces con un agitador

de vidrio.

a) Viscosas (pastosas): Se adhieren al agitador. b) Poco viscosas: No se adhieren al agitador. c) Grasas: Tienen gran maleabilidad moldeándose en ellas el agitador,

como tierra amasada.

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EXAMEN MACROSCÓPICO Para este examen se tritura ligeramente en un mortero con agua una cantidad de heces del tamaño de una nuez. Luego se pasa a una placa de Petri y colocamos esta sobre una cartulina blanca y negra. Los fragmentos de carne aparecen de color gris o marrón. El tejido conectivo tiene forma de membranas o paquetes filamentosos. Se puede confundir con moco. Para diferenciarlo se añadirá ácido acético al 30% y si desaparece es tejido conectivo. El moco se puede presentar de varias formas: amorfo, transparente, opaco (con restos celulares) y membranoso (en forma de paquetes o moldes de la mucosa). La presencia de moco es importante, salvo en los recién nacidos, y siempre deberá resaltarse en el informe.

SI OBSERVAMOS PUEDE SER INDICATIVO

FRAGMENTOS DE CARNE

INSUFICIENCIA GÁSTRICA: - Falta de secreción. - Tránsito acelerado. INDIVIDUO GASTRECTOMIZADO

FRAGMENTOS DE FÉCULAS (PATATAS, REMOLACHA)

INSUFICIENCIA GÁSTRICA Y PANCREÁTICA ESCASA PERMANENCIA EN EL COLON

TEJIDO CONJUNTIVO

INSUFICIENCIA GÁSTRICA

MOCO INFLAMACIÓN DE LA MUCOSA INTESTINAL MOCO AMORFO, SANGRE, PUS

COLITIS ULCEROSA DISENTERÍA BACILAR

MOCO MEMBRANOSO

ENTEROCOLITIS PSEUDOMEMBRANOSA MIXORREAS NERVIOSAS

FALSAS MEMBRANAS ARTEFACTOS: Piel de embutidos, chicle...

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ANÁLISIS MICROSCÓPICO Nos aporta datos más fidedignos acerca de los trastornos de la digestión. Para ello habrá que instaurar la alimentación explicada anteriormente, si no se hace así la significación del estudio es muy limitada. Para este estudio se hace una suspensión de heces en agua destilada o suero fisiológico.

1. Se coge una cantidad de heces, del tamaño de una castaña, y se coloca en un mortero, copa, vaso de precipitado o tubo de ensayo.

2. Se añade agua o suero fisiológico y mezclar con una varilla hasta formar una papilla homogénea y fina, ni muy fluida ni muy espesa.

3. Se coloca una gota de esta suspensión en un portaobjetos y se pone un cubreobjetos encima, cuidando que se extienda formando una capa delgada, homogénea, sin burbujas de aire. No se debe aplastar el cubre.

Se observará con el objetivo de x10 aumentos, obteniendo una visión de conjunto, y luego se enfoca con el de x40 aumentos. Cuando se trata de heces líquidas, se debe hacer una mezcla homogénea y se coloca una gota directamente al portaobjeto. Podremos observar:

A) CÉLULAS: Normalmente epiteliales de las últimas porciones del intestino. No son patológicas.

B) LEUCOCITOS: Se observarán deformados. Si se encuentran en poca

cantidad no es patológico. Se observan mejor mezclando la gota de la suspensión fecal con otra de azul de metileno de Loefler.

C) HEMATÍES: Es muy raro observarlos ya que se digieren. Si aparecen

será a causa de evacuación muy rápida o hemorragias en tramos intestinales bajos.

D) CRISTALES: Presentan el mismo aspecto que en el sedimento urinario.

Hay unos, característicos del parasitismo intestinal, llamados cristales de Charcot-Leyden, presentando una forma típica de agujas de brújula.

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E) FIBRAS MUSCULARES: Se pueden observar de diferentes formas

dependiendo del grado de digestión:

a) Mal digeridas: Fragmentos rectangulares estriados, débilmente amarillos. Las estrías

son transversales y longitudinales. Los bordes del rectángulo son rectos.

b) Parcialmente digeridas: Trozos más pequeños con los bordes redondeados y las estrías

longitudinales.

c) Bien digeridas: Trozos muy pequeños con los bordes redondeados y sin estrías.

La presencia de fibras musculares mal digeridas se llama CREATORREA. Se puede deber a una insuficiencia gástrica o pancreática.

F) TEJIDO CONJUNTIVO. Se observa como fibras o filamentos que se reúnen en fascículos y se entremezclan entre si. Son incoloros y no poseen estriación. Se podría confundir con el moco, pero se distinguen porque se transparentan al añadirle ácido acético al 30 %.

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G) ALMIDÓN. Para su investigación se añade a la gota de emulsión fecal una gota de lugol. Los gránulos de almidón tomarán un u otro dependiendo del grado de digestión. También podrán estar dentro de células o aislados:

a) No digeridos: Azul oscuro, casi negro.

b) Parcialmente digeridos: Rojo o rosa.

c) Digeridos: Amarillos o color arenilla.

El tejido muscular, al añadir almidón a la preparación toma un color rojo-caoba. La presencia de almidón no digerido en las heces se llama AMILORREA.

H) LÍPIDOS. Para observarlas mejor usaremos el reactivo Sudam III. Una gota de este

colorante se mezclará con una gota de la suspensión fecal. Los lípidos o grasas se encuentran en las heces en forma de:

a) Ácidos grasos: Tienen aspecto cristalino,

en forma de escamas o agujas finas rectas o curvadas. Difícilmente se tiñen.

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b) Grasa neutra: Aparece como gotitas de color rojo o naranja

Si la temperatura es fría (< 20º C) las gotas se transforman en masas o placas algo amarillentas o rojas.

c) Jabones: Difíciles de reconocer al microscopio. No se tiñen. Se presentan

como masas amorfas o cristales en forma de agujas cortas. En la observación lo mas importante son las grasa neutras. Se informa positivamente a partir de 15-20 gotas/campo (objetivo x40). El aumento patológico de grasas en heces se llama ESTEATORREA. Si en el microscopio se observa mas de 60 gotas /campo es seguro esteatorrea

. Algunas veces, para observar las grasas se calienta el portaobjetos

suavemente a la llama. De esta forma todas las grasas (ácidos grasos, neutros y jabones) se transforman en gotitas de color rojo-anaranjado (con Sudam III). En el estudio de las grasas en heces puede inducirnos a error, los supositorios, los enemas oleosos y los portaobjetos y cubreobjetos mal desengrasados.

ANÁLISIS MICROSCÓPICO

SI OBSERVAMOS INDICA

Bien digeridas. DIGESTIÓN NORMAL DE PRÓTIDOS

Medianamente digeridas

ALTERACIÓN INTESTINAL MEDIANA

FIBRAS MUSCULARES

Poco o nada digeridas ALTERACIÓN INTENSA

TEJIDO CONJUNTIVO

Unido o no a fibras musculares INSUFICIENCIA GÁSTRICA

Células desgastadas sin granos de almidón.

DIGESTIÓN NORMAL DE GLÚCIDOS

CÉLULAS AMILÁCEAS

Células sin digerir llenas de almidón.

TRANSITO INTESTINAL ACELERADO O INSUFICIENCIA PANCREÁTICA

Neutras. INSUFICIENCIA PANCREÁTICA

Ácidos grasos. INSUFICIENCIA BILIAR O MALA ABSORCIÓN GRASAS

Jabones. PRESENCIA de Ca y Mg en EL INTESTINO

MOCO, LEUCOCITOS, HEMATÍES, EPITELIO

ALTERACIONES DE LA MUCOSA

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ESTUDIO FÍSICO-QUÍMICO pH Varía entre 6,8 y 7,2 dependiendo del régimen alimenticio. Los valores normales se van a modificar según el proceso digestivo. La medición se hace impregnando un papel indicador con una varilla de vidrio que contenga heces. La lectura se efectúa por el reverso del papel. SANGRE También se llama este análisis investigación de hemorragias ocultas. Se puede observar sangre en heces, de color rojo, proveniente de fisuras anales o hemorroides. Esto no se considera importante. Cuando proviene de hemorragias gástricas, duodenales, cáncer de colon, etc., la sangre se digiere, tomando las heces un color oscuro, casi negro. Esta sangre si es importante. Para este análisis es importantísimo que el paciente durante los 2-3 días anteriores a la toma de muestras se someta a un régimen riguroso (“blanco”), sin carne, pescados, embutidos, lentejas, espinacas, plátanos etc., es decir alimentos ricos en peroxidasas. Tampoco deberá tomar medicamentos que contengan hierro o hemoglobina, o que puedan provocar pérdidas sanguíneas como salicilatos o esteroides. La alimentación permitida consiste en: Huevos, patatas, cebolla, arroz, garbanzos, pan y leche. La mayoría de las pruebas para detectar hemorragias ocultas en heces se basan en la determinación de peroxidasas como indicativo del contenido de hemoglobina. Las más importantes son:

A) REACCIÓN DE LA BENCIDINA: Sobre un papel de filtro manchado de heces, se ponen unas gotas de

bencidina y agua oxigenada de 10 volúmenes. Si el resultado es (+), como resultado de la presencia de peroxidasa, se formará un halo de color verde-azulado en torno a la mancha.

B) REACCIÓN DE WEBER O DEL GUAYACO: La prueba es igual que la anterior pero en lugar de poner bencidina se

pone guayaco. La reacción es la siguiente:

HEMOGLOBINA + H2O2 ⇒⇒ H2O + O2↑↑ BENCIDINA

O2 + o ⇒⇒ Color Azul-verdoso

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GUAYACO Estas pruebas son muy inespecíficas y dan habitualmente falsos positivos. La reacción de la bencidina es más sensible que la del guayaco.

Actualmente existe una técnica que no se basa en la peroxidasa:

C) PRUEBA DEL CROMO RADIOACTIVO: Tiene más sensibilidad y especificidad que las anteriores. Se basa en la

capacidad del Cr radioactivo (Cr51) para ser fijado por los hematíes y por el hecho de no ser reabsorbido en el tracto gastrointestinal. Así pues, es excretado por las heces en las que puede ser medido por espectrofotometría de rayos ã.

PIGMENTOS BILIARES Investigaremos en las heces la presencia de bilirrubina y estercobilinógeno mediante 2 métodos:

A) PRUEBA DEL SUBLIMADO: Más sensible para Estercobilina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo:

• Dilución de heces.................................... 5 ml. • Sublimado (ClHg).................................... 5 ml.

Se agita y se incuba a 37º C durante 1-2 horas y se observan los resultados:

• ROJO.............................. ESTERCOBILINA o ESTERCOBILINÓGENO • VERDE............................ BILIRRUBINA.

• BLANCO......................... Ausencia de Pigmentos.

B) PRUEBA DE GRIGAUT: Más sensible para bilirrubina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo:

• ClH concentrado...................................... 5 ml. • Cl3Fe (10%)............................................. 2 gotas. • Dilución de heces.................................... 5 ml.

Se agita y se calienta ligeramente observando los resultados:

• VERDE..................................... BILIRRUBINA. • ROJO........................................ ESTERCOBILINÓGENO.

Las 2 pruebas se hacen simultáneamente, debido a su diferente sensibilidad, y los resultados se interpretan así:

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SUBLIMADO GRIGAUT ESTERCOBILINOGENO + + Heces normales

BILIRRUBINA + + Tránsito intestinal acelerado

ESTERCOBILINÓGENO + - Tránsito intestinal medianamente acelerado

BILIRRUBINA - -

+ -

Obstrucción biliar

ENZIMAS PROTEOLÍTICAS: Se intenta comprobar la presencia de Tripsina, Quimiotripsina, etc. Las heces normales (hasta una dilución 1/100) licuan la gelatina. La prueba se realiza aplicando una gota de diferentes diluciones (1/5, 1/10, 1/50, 1/100) de la heces a estudiar de heces sobre una película de gelatina. Se considera un resultado positivo si la gelatina queda disuelta en ½ hora.

• Positivo hasta una dilución 1/100........................... Digestión normal. • Positivo hasta una dilución 1/50............................. Digestión media. • Positivo hasta una dilución 1/10..............................Digestión deficiente.

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE GRASA EN HECES Una persona normal digiere y reabsorbe casi toda la grasa de su dieta. Para valorar cuantitativamente esta grasa tendremos que pesar las heces del paciente durante varios días. El paciente debe llevar una dieta estricta durante seis días. Hay varios métodos.

A) REACCIÓN DE AZUL DE NILO PARA GRASA FECAL: Técnica: 1. Diluir en un tubo de ensayo una porción de muestra con 9 volúmenes de

agua. 2. Añadir:

• 1 ml. de esta suspensión fecal. • 1 ml. de agua. • 3 gotas de ClH al 10 %. • 3 gotas de Oxalato amónico saturado.

3. Calentar a ebullición durante unos segundos. Enfriar. 4. Echar el líquido en un vaso de precipitado. 5. Lavar el tubo de ensayo con 2,5 ml. de solución de CO3Na2 al 20 % y

añadirlos al contenido del vasito.

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6. Agregar 15 ml. de agua y 1 ml. de solución de Azul de Nilo (0,05 % en agua) dejando resbalar por las paredes.

7. Leer los resultados inmediatamente:

NEGATIVO: Rosado que vira a gris (aproximadamente < 7 g./día) DUDOSO: Gris azulado. POSITIVO: Azul (aproximadamente > 7 g./día) Cuando la reacción de azul de Nilo es negativa, la grasa fecal no excede nunca de 5% en peso. Una reacción claramente positiva corresponde a más del 5 % de grasa.

B) MÉTODO DE VAN DE KAMER:

Se separan los lípidos de las heces mediante tratamiento de estas con

una solución de hidróxido potásico alcohólico y que contenga pequeñas cantidades de alcohol amílico. De ésta manera se produce la formación de jabones.

Posteriormente se hidrolizan los jabones con ClH y se convierten en

ácidos grasos, extrayéndose estos a continuación con éter de petróleo. Por último se titulan los ácidos grasos con NaOH 0,1 N

Peso total de heces x Vol. cc. NaOH g. de grasa =

Peso de la muestra

CUERPOS REDUCTORES O AZÚCARES REDUCTORES EN HECES Las heces deben de ser recientes, no debe dejarse pasar más de una hora desde que son emitidas hasta que se realiza el examen. Hay que diluir una parte de heces en dos partes de agua destilada, mezclar bien y centrifugar a un número bajo de revoluciones (1.500 rpm.). Se toman 15 gotas del sobrenadante, se colocan en un tubo de vidrio y se le añaden dos gotas de ClH 1 N. Luego calentamos para desdoblar la sacarosa. Una vez que ha enfriado el líquido anterior, se añade una tableta de CLINITEST (Ames) para azúcares reductores y se deja disolver. A continuación comparamos con la escala de colores que lleva el reactivo. El resultado se da en g./litro. El resultado será negativo si es inferior a 2,5 g./l. Entre 2,5 y 5 es dudoso y será positivo si es mayor de 5 g./l.

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TEMA 8.- HEMOGRAMA. RECUENTO CELULAR Y FÓRMULA

LEUCOCITARIA. RECUENTOS CELULARES Y VALORES HEMATOLÓGICOS NORMALES. Glóbulos rojos:

Neonatos.................4.0-5.6x1012/l. Hombres.................4.5-6.5x1012/ l. Mujeres...................3.8-5.6x1012/l.

Plaquetas:

150-400 x109 / l. Leucocitos:

Niños de un año.........6-18x109/l. Adultos....................4-10x109/l.

Recuento leucocitario diferencial:

Relativo Absoluto por 7000 leucocitos

Adultos: Neutrófilos..................40-75%..................................2800-5250. Linfocitos...................20-45%...................................1400-3150. Monocitos..................2-10%.....................................1400-3150. Eosinófilos..................1-6%.......................................70-420. Basófilos.....................<1%.........................................0-70.

DEFINICIONES. En caso de aparición de citopenia en el hemograma, el autoanalizador utilizado nos lo indica. La citopenia puede ser general, pancitopenia, o de algún tipo celular concreto: Leucopenia; recibe este nombre la disminución del número de leucocitos en sangre por debajo de los valores normales, es decir, por debajo de 5000/mm3.

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Considerando cada tipo de leucocito:

Neutropenia. Eosinopenia. Basopenia. Monocitopenia.

Puede aparecer leucopenia en los siguientes casos:

• infección vírica (rubéola, varicela, gripe). • infección bacteriana (brucelosis). • intoxicación por metales pesados (bismuto). • intoxicación medicamentosa por benzol, sulfamidas, terapia

citostática. • comienzo de una mononucleosis. • consecuencia de exposición a material radiactivo....etc.

Oligocitemia; recibe este nombre la disminución del número de glóbulos rojos sobre las cifras normales.

En hombre valores menores de 4.5x1012/l. En mujeres valores menores de 3.8x1012/l.

La disminución del número normal de glóbulos rojos es frecuente en anemias carenciales posthemorrágicas, hemolíticas, etc. Trombopenia; recibe este nombre la disminución del número de plaquetas por debajo de los valores normales, es decir, valores inferiores a 150000/ mm3. Es frecuente la aparición de trombopenia asociada a:

• la acción tóxica de medicamentos. • radiación. • infecciones víricas (paperas, varicela, rubéola) • infecciones bacterianas (meningitis meningocócica). • alcoholismo agudo.

REVISIÓN DE LAS TÉCNICAS. Ante la aparición de algún tipo de citopenia en el recuento hematológico, hay que comprobar, en primer lugar el utillaje y las técnicas utilizadas, prestando especial atención en contadores electrónicos a:

• comprobar que no ha habido bloqueo parcial del orificio de contaje (100 micras).

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• comprobar que se ha realizado el recuento de leucocitos después de completarse la hemólisis, pero en un periodo inferior a 30 minutos.

• la recogida y manipulación de sangre ha sido la adecuada (no hay coágulos).

• el electrodo exterior estará completamente inmerso en líquido. • se lava correctamente el tubo entre sucesivas mediciones. • no hay pequeñas burbujas de aire en el propio tubo. • el manómetro estará limpio interiormente.

Si en la técnica manual, el recuento de leucocitos nos da valores inferiores a 3000/mm3, hay que volver a repetir el contaje, pero en vez de diluir 1:20, como es habitual, la dilución se hará 1:10. En pacientes anémicos, para el recuento de hematíes en cámara, la dilución en vez de hacerse al 1:200, se hará al 1:100. Igualmente si en el contaje de plaquetas, por ejemplo por el método de Rees-Ecker, se sospecha una cifra muy reducida, la dilución, en vez de 1:200 se hará al 1:100 y se repetirá el recuento. PREPARACIÓN DE UN FROTIS. Tras comprobar lo anterior, y ante la persistencia de citopenia en el hemograma, el siguiente paso a realizar, es la preparación de un frotis.

El frotis se puede realizar por una de las siguientes técnicas:

• técnica del portaobjetos. • técnica del cubreobjetos.

TINCIÓN. Para la tinción del frotis, en los estudios de sangre, suelen utilizarse colorantes de anilina de dos tipos:

-básicos como las tiacinas (azul de metileno). -ácidos como la eosina.

El método de Romanowsky se basa en combinar colorantes ácidos y básicos que tiñen diferencialmente las estructuras sanguíneas. En general utilizan eosinatos de tiacinas. Entre los métodos de este tipo más conocidos destacamos:

• La tinción de Wright.

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• La tinción de Giemsa (ideal para teñir parásitos y protozoos del paludismo).

• La tinción de May-Grümwald. PATOLOGÍAS DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS. En el estudio de la extensión sanguínea se buscan anormalidades que ayuden a indicar la naturaleza de la citopenia, sea del tipo que sea. Toda célula sanguínea que no coincida con los modelos de normalidad, debe considerarse atípica. La mayor variabilidad en la morfología de las células hemáticas tiene lugar en las degeneraciones neoplásicas. ALTERACIONES EN LA SERIE ROJA. VARIACIONES DE TAMAÑO. En general se conocen bajo el término de anisocitosis.

• Macrocitosis; hematíes con tamaño de 8 a 11 micras (déficit de vitamina

B12 y de ácido fólico). • Microcitosis; hematíes con tamaño <6 micras (anemia perniciosa). • Megalocitosis; hematíes con tamaño > 11 micras (fisiológico en recién

nacidos y también en anemia perniciosa). ALTERACIONES DE COLOR.

• Anisocromía; desigual distribución de a hemoglobina (trasfusiones).

• Hipocromía; mucha zona pálida central por disminución de la concentración de hemoglobina (anemia ferropénica).

• Hipercromía; aumento de la intensidad del color por aumento de la concentración de hemoglobina.

• Policromasía; anormal coloración (azul, gris, rosa) indica inmadurez por producción acelerada.

ALTERACIONES DE FORMA.

• Acantocitos; hematíes esféricos con prominencias que les dan aspecto de erizo

• (Uremia, acantocitosis ) • Dacriocitos; forma de lágrima (alteraciones eritropoyéticas) • Dianocitos; aspecto de diana por acúmulo de hemoglobina en el centro

(talasemia).

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• Drepanocitos o células falciformes; forma de hoz o de media luna (anemia falciforme).

• Eliptocitos; forma oval o en elipse. • Esquizocitos; restos de hematíes tras su ruptura. • Estomatocitos; presentan hendidura en parte central. • Hematíes crenados; forma de sierra o rueda dentada.

ALTERACIONES ESTRUCTURALES, PRESENCIA DE INCLUSIONES INTRAERITROCITARIAS. Punteado basófilo; son acúmulos de ARN que se tiñen de azul con Giemsa (saturnismo). Corpúsculos de Heinz; son zonas de hemoglobina desnaturalizada, de más de 3 micras que se tiñen de:

• azul oscuro con sulfato de Nilo. • azul claro con azul cresil brillante. • púrpura oscura con cristal violeta.

Se presentan en alfa-talasemia y también en anemias tóxicas. Anillos de cabot; son restos de membrana nuclear que toman forma de anillo. Se observan en anemia perniciosa e intoxicaciones con plomo. Granulación azurófila; pueden ser restos del núcleo tras su destrucción, o eritroblastos. Se tiñen violeta púrpura. Corpúsculos de Howell-Jolly; son restos de cromatina que se tiñen con Giemsa de rojo brillante. Indican anemia megaloblástica u otra forma anormal de eritropoyesis. SERIE BLANCA. POLIMORFONUCLEARES NEUTRÓFILOS.

Los neutrófilos sufren alteraciones morfológicas cualitativas, algunas de las cuales son adquiridas y desaparecen después que el estímulo que las provoca lo ha hecho. Aumento de los lóbulos nucleares; (anemia). Núcleo en anteojo (Pelger-Huet); núcleo con dos segmentos. Es una alteración autosómica dominante.

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Corpúsculos de Döhle; son restos de ribosomas libres, o del R.E.R. que se tiñen de color azul pálido en el citoplasma. Granulaciones tóxicas; son gránulos citoplasmáticos de mayor volumen y con coloración más intensa de lo normal, que aparecen asociados a procesos infecciosos severos. Gránulos violeta; son gránulos citoplasmáticos azurófilos que están presentes en la anomalía de Alder-Reilly. LINFOCITOS. Linfocito activado, presenta mayor tamaño y basofília clara, sin gránulos (estimulación linfocitaria). Célula Turk; linfocito hiperbasófilo (infección vírica). MONOCITOS. A veces aparecen con núcleo grande escotado y presentan vacuolas donde está lo que han fagocitado, otras veces se presentan degenerados. Puede deberse a los anticoagulantes. A veces se observan otras células como:

Células de Reider. Células de Turk. Células en cesto, etc.

SERIE TROMBOCÍTICA.

A. Alteraciones de tamaño, podemos encontrar:

• microtrombocitos. • macrotrombocitos. • megacariocitos.

B. Alteraciones de forma o dismorfias plaquetarias, aparecen en las

trombopatías.

C. Alteraciones de distribución:

• satelitismo plaquetario; fenómeno en el que se presentan varias plaquetas rodeando a los segmentados. Se da a veces al utilizar EDTA como anticoagulante.

• agregados plaquetarios; son el comienzo de un trombo.

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OTROS TIPOS ANORMALES DE CÉLULAS. CÉLULAS “LE “, O DE HARGRAVES. Son leucocitos polimorfonucleares neutrófilos que presentan un gran cuerpo de inclusión, que desplaza su propio núcleo. Este cuerpo de inclusión es otro núcleo leucocitario destruido por una Ig G o factor LE. Aparecen entre otras enfermedades en el Lupus Eritematoso. SIDEROCITOS. Son hematíes que contienen gránulos de hemosiderina. Estos hematíes son normales en las células precursoras de los hematíes de médula ósea, pero no deben aparecer en sangre periférica. Su presencia en un frotis de sangre indica proceso patológico.

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FÓRMULA LEUCOCITARIA SANGUÍNEA: DIFERENCIACIÓN CELULAR Y RECUENTOS INTRODUCCIÓN Nos podemos encontrar diferentes tipos de leucocitos o glóbulos blancos en sangre según sus características morfológicas: A) Polimorfonucleares o granulocitos a) Neutrófilos b) Eosinófilos c) Basófilos B) Mononucleares o agranulocitos a) Linfocitos b) Monocitos El estudio del porcentaje de cada uno de ellos es lo que se denomina fórmula leucocitaria. A partir de ella y conociendo el número total de leucocitos por milímetro cúbico de sangre se puede calcular el numero de cada tipo de leucocitos por volumen de sangre. La fórmula leucocitaria o recuento diferencial leucocitario se puede hacer de forma manual o de forma automática. MORFOLOGÍA DE LOS LEUCOCITOS Vamos a estudiar la morfología de los leucocitos sobre una extensión sanguínea teñida. La figura 1 es una representación arbitraria de un frotis de sangre periférica, siendo el número de leucocitos con relación a los eritrocitos y trombocitos mayor de lo que suele observarse en un campo microscópico real. En la figura aparecen las siguientes células: A: Eritrocitos B: Linfocito grande C y E: Neutrófilos segmentados D: Eosinófilo F: Monocito

Figura 1. Tipos de células en un frotis de sangre periférica.

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G: Trombocitos H: Linfocito I: Neutrófilo en banda J: Basófilo. NEUTRÓFILOS, POLIMORFONUCLEADOS NEUTRÓFILOS (PMN), GRANULOCITOS NEUTRÓFILOS. Son células redondeadas de aproximadamente 12 micras de diámetro, más pequeños que los monocitos y eosinófilos y ligeramente mayores que los basófilos. El citoplasma es abundante y se tiñe de color rosado. En él hay numerosas granulaciones neutrófilas que se tiñen de color rosa-azulado y son de pequeño tamaño. El núcleo se tiñe intensamente de azul, es irregular y polilobulado, variando el número de lóbulos de 2 a 5. Con frecuencia parece que hay varios núcleos separados, pero un análisis detallado permite observar los finos hilos de cromatina que los une. Esta sería la morfología de un neutrófilo segmentado. El estadío anterior es el neutrófilo en banda o cayado, en los que el núcleo no está todavía lobulado y presenta aspecto de S o C. Puede aparecer en sangre, aunque no con frecuencia, algún metamielocito, que es el estadío anterior al cayado. Es de mayor tamaño y el núcleo presenta forma arriñonada. Lo normal es que en la fórmula aparezca un 0%. Se puede hacer un recuento de las lobulaciones, de forma que las proporciones normales son: Células con 1 lóbulo: 6% Células con 2 lóbulos: 34% Células con 3 lóbulos: 41% Células con 4 lóbulos: 17% Células con 5 lóbulos: 2% Cuando aumenta el número de células con núcleos polilobulados se habla de una desviación a la derecha, mientras que cuando aumentan las formas en cayado, metamielocitos o incluso estadios anteriores, se habla de una desviación a la izquierda. El neutrófilo se origina en la médula ósea y después de diferentes estadios de maduración pasa al torrente circulatorio, donde permanecen unas pocas horas (aproximadamente siete) antes de pasar a los tejidos donde realizan su función y mueren.

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La función principal de los neutrófilos es la defensa del organismo contra las infecciones mediante el fenómeno de fagocitosis (motivo por el cual la membrana del neutrófilo emite pseudópodos) La neutrofilia o leucocitosis neutrofílica constituye un aumento del resultado absoluto, mientras que la neutropenia representa una disminución. EOSINÓFILOS, POLIMORFONUCLERES EOSINÓFILOS (PME), GRANULOCITOS EOSINÓFILOS. Los eosinófilos tienen un diámetro medio de 13 micras. La estructura de estas células se parece a la de los neutrófilos segmentados, pero con algunas diferencias. El núcleo se tiñe algo menos y tiene 2 ó 3 lóbulos, normalmente 2 dispuestos de forma característica. Las granulaciones citoplasmáticas son de mayor tamaño, redondas u ovaladas, y con gran afinidad por los colorantes ácidos, tiñéndose por tanto de color rojo-anaranjado con un colorante que contenga eosina. Los gránulos poseen numerosas enzimas, entre las que destaca la mieloperoxidasa. Los eosinófilos se forman en la médula ósea y después de diferentes estadios de maduración pasan a sangre periférica donde sólo permanecen algunas horas (aproximadamente ocho), ya que la mayor parte de la población corporal de eosinófilos se encuentra bajo la capa epitelial en los tejidos expuestos al ambiente externo, como son los conductos nasales, piel y vías urinarias. El papel biológico de estas células es el de modular las reacciones anafilácticas y las reacciones antígeno-anticuerpo en el proceso alérgico. También intervienen en el control de la infestación por ciertos parásitos, cuyo ataque no se hace por fagocitosis, sino por adherencia y subsiguiente citotoxicidad al segregar diversas sustancias nocivas. La disminución de los eosinófilos o eosinopenia sólo puede detectarse por recuento de gran número de células. Un aumento en los valores de eosinófilos representa una eosinofilia.

BASÓFILOS, POLIMORFONUCLEARES BASÓFILOS (PMB), GRANULOCITOS BASÓFILOS.

En general, los granulocitos basófilos son semejantes en tamaño a los anteriores. El núcleo es menos irregular y ligeramente lobulado. Las granulaciones del citoplasma son grandes y muy abundantes. Tienen gran afinidad por los colorantes básicos, apareciendo de color azul oscuro o prácticamente negro. Recubren normalmente toda la célula, por lo que el núcleo resulta difícil de distinguir.

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Los basófilos son los menos numerosos de los leucocitos en la sangre normal. Los basófilos se originan en la médula ósea y, después de diferentes procesos de maduración, pasan a la sangre periférica donde realizan su función. Los basófilos que se encuentran en los tejidos se denominan células cebadas o mastocitos y presentan ciertas diferencias en la composición de sus gránulos con respecto a los basófilos sanguíneos. La función de los basófilos es actuar como mediadores en las respuestas inflamatorias, en especial las de hipersensibilidad. El aumento del número absoluto de basófilos lo constituye una basofilia o leococitosis basofílica, mientras que el menor recuento absoluto de basófilos lo constituye una basopenia. LINFOCITOS

Los linfocitos son células mononucleadas pequeñas, de aproximadamente 10 micras de diámetro, que carecen de gránulos citoplasmáticos específicos. El linfocito típico presenta un núcleo bien definido que contiene bloques pesados de cromatina. El núcleo ocupa prácticamente toda la célula y tiene forma redonda o un poco dentada. Se tiñe de color azul oscuro. El citoplasma es escaso y se tiñe de un color azul pálido, exceptuando una zona perinuclear clara, pudiendo aparecer en algunas granulaciones de color rojizo. Se pueden observar linfocitos de mayor tamaño, de 12 a 15 micras de diámetro, con núcleos menos densos y citoplasma más abundante, especialmente en la sangre de los niños, y puede ser difícil de distinguir de los monocitos. Los linfocitos son las principales células implicadas en la respuesta inmunitaria, reconociendo por sus receptores de membrana los determinantes antigénicos con la colaboración de otras células, como los macrófagos. Un aumento de los valores absolutos se denomina linfocitosis, mientras que una disminución de estos valores se denomina linfocitopenia.

MONOCITOS

El monocito es la célula de mayor tamaño de la sangre normal con un diámetro medio de 16 micras. Contiene un único núcleo, generalmente excéntrico y con forma redondeada, lobulada o en forma de herradura. Se tiñe de un azul más débil que los linfocitos. El citoplasma es abundante y se tiñe de un color azul grisáceo conteniendo a veces gránulos finos de color entre rojo y púrpura, menos diferenciados y

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pequeños que los gránulos de los leucocitos neutrófilos. Ocasionalmente pueden detectarse gránulos de color azul. Los monocitos se producen en la médula ósea para después pasar a sangre periférica, donde permanecen entre 4 y 10 horas antes de migrar a los tejidos, convirtiéndose en ellos en las células llamadas macrófagos o histiocitos, donde cumplen su función. La función principal de los monocitos y macrófagos es la fagocitosis, que realiza de manera semejante a los neutrófilos. Actúan como defensa contra microorganismos, en el proceso de la formación antigénica y en la eliminación de células viejas, dañadas o tumorales. Además, el sistema monocito-macrófago desempeña un papel principal en la iniciación y regulación de la respuesta inmunitaria. El aumento y disminución de sus valores se denominan monocitosis y monocitopenia respectivamente. VALORES DE REFERENCIA. El número total de leucocitos oscila en condiciones normales según la edad, variando desde el nacimiento hasta los 16 años, a partir de los cuales las cifras se estabilizan dentro de unos márgenes de normalidad. Asimismo, el porcentaje normal de los distintos tipos de leucocitos varía también con la edad (Tabla 1) RN 1 MES 4 AÑOS 6 AÑOS ADULTO Neutrófilo 37-57% 25-35% 25-45% 45-50% 50-65% Cayados 0-4% 0-4% 0-4% 0-4% 0-4% Eosinófilos 1-5% 1-5% 1-5% 1-5% 1-5% Basófilos 0-2% 0-2% 0-2% 0-2% 0-2% Monocitos 4-10% 4-10% 4-10% 4-10% 4-10% Linfocitos 25-35% 45-65% 40-60% 40-45% 25-40% Leucocitos/mm3 9.000-

30.000 5.000-21.000

5.500-15.500

5.000-14.500

4.000-10.000

Tabla 1. Valores de leucocitos en sangre periférica. FÓRMULA LEUCOCITARIA O RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO (RDL)

El recuento diferencial leucocitario se puede realizar de forma manual al microscopio o de forma automática.

RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO MANUAL

Consiste en determinar el porcentaje de cada tipo de leucocitos por observación directa al microscopio de un frotis sanguíneo teñido. Cuanto mayor sea el número de células contadas, mayor será la exactitud del resultado.

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Se entiende por frotis o extensión sanguínea la formación de una fina película de sangre sobre una superficie, generalmente un portaobjetos, de forma que pueda ser observada al microscopio sin que las células se superpongan entre sí. Una vez preparado y secado el frotis, debe ser fijado y teñido para poder diferenciar los distintos tipos celulares. Los colorantes más comúnmente utilizados para las tinciones hematológicas son los derivados de la anilina, colorantes de Romanowsky, que pueden combinar colorantes ácidos (eosina), básicos (azul de metileno) y neutros. Las distintas estructuras celulares se teñirán con el colorante de pH antagónico. Así, los colorantes ácidos teñirán las estructuras básicas como la hemoglobina o los gránulos de los leucocitos eosinófilos y los colorantes básicos teñirán estructuras ácidas como el ADN o los gránulos citoplasmáticos basófilos. Las estructuras neutrófilas serán aquellas que tienen afinidad por ambos tipos de colorantes. Existen diversos métodos de tinción, como por ejemplo: el método de Wright, el método de Giemsa, el método de May-grümwald-Giensa o el método del panóptico rápido. A la hora de hacer el recuento diferencial de leucocitos hay que tener en cuenta que la distribución de las células no es uniforme. Las células grandes (monocitos y neutrófilos) se sitúan en los bordes, mientras que las células pequeñas (linfocitos) lo hacen en el centro de la extensión. Por esta razón, en el recuento se debe seguir una trayectoria que cubra todas las partes de la extensión. Antes de comenzar el recuento se evalúa si la extensión ha sido bien realizada, si la distribución de las células es uniforme, y su tinción, satisfactoria. Se examina la extensión al microscopio con bajo aumento, para observar si la distribución celular y la tinción es buena; se cambiará a un objetivo de inmersión para la identificación de los distintos tipos celulares. El registro de los distintos tipos de leucocitos se puede realizar utilizando aparatos registradores específicos para fórmulas leucocitarias o bien manualmente, anotando cada una de las células aparecidas en un papel. A medida que se va viendo un leucocito, éste se clasifica, hasta haber contado un número determinado de leucocitos. Cuanto más elevado es este número, mayor es la precisión, aunque por razones prácticas normalmente se realizan recuentos de 100 ó 200 células. Todos los leucocitos que no puedan clasificarse deberían agruparse conjuntamente en un grupo no identificado. En algunas alteraciones, especialmente en la leucemia, pueden detectarse muchos de estos leucocitos no identificados. Con el número total de leucocitos por mm3 y el tanto por ciento de cada tipo, se puede hallar el valor absoluto para cada uno de ellos.

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RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO AUTOMATIZADO El recuento diferencial leucocitario es una de las determinaciones más solicitadas al laboratorio de análisis clínicos, por ello, unos resultados exactos y precisos son de vital importancia. Actualmente, la automatización permite mejorar la especificidad, la exactitud, disminuir los errores y abaratar los costes de los recuentos diferenciales de leucocitos En los sistemas disponibles hasta la fecha, se han utilizado dos principios generales:

a) los sistemas de elaboración digital de la imagen, que identifican por ordenador las células sobre extensiones sanguíneas teñidas.

b) los sistemas de flujo continuo, que analizan las células suspendidas en un líquido y utilizan la medida de diferentes propiedades de los leucocitos. Se basan en:

• Medida de la impedancia y de la conductividad celular que informarán sobre el tamaño de la partícula y su estructura celular interna.

• Medida de la dispersión de la luz láser o halógena. • Utilización de técnicas citoquímicas sobre la suspensión

leucocitaria y estudio de las distintas poblaciones leucocitarias por métodos ópticos.

ANÁLISIS DIGITAL DE IMAGEN Se basa en la identificación de los leucocitos mediante análisis con ordenador de las imágenes, de frotis sanguíneos teñidos, obtenidas al microscopio. La extensión de sangre, uniformemente teñida, se coloca sobre la platina de un microscopio. El movimiento de la platina es controlado mediante ordenador. De esta forma se recorre la superficie del frotis y el ordenador detiene el movimiento cuando encuentra un leucocito en su campo de visión. Las imágenes ópticas (tamaño, color, gránulos citoplasmáticos, etc.) son registradas por una cámara de televisión y digitalizadas por el ordenador, que compara las características de la célula con una memoria en la que se incluyen las características correspondientes a los distintos tipos celulares. Si las características “coinciden”con las de un tipo celular normal, se identifica como tal; de lo contrario, se clasifica como desconocido. Las coordenadas de estas últimas células son archivadas, para que el técnico las pueda clasificar. Los leucocitos son clasificados en cinco categorías: polinucleares neutrófilos (segmentados y no segmentados), linfocitos, monocitos, polinucleares eosinófilos y polinucleares basófilos. Algunos sistemas son capaces de captar

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otros elementos celulares que eventualmente pueden aparecer en sangre periférica como mielocitos, metamielocitos, promielocitos, células plasmáticas, linfocitos atípicos o blastos. Estos sistemas identifican los leucocitos en base a aspectos morfológicos, por lo que además de requerir células perfectamente conservadss necesitan una muy pequeña variación tintorial para evitar la clasificación errónea de células. Es por ello de gran importancia el empleo de sistemas de realización de frotis sanguíneos adecuados, para la obtención de preparaciones homogéneas y con la mayor similitud tintorial. Se recomienda, por ello, la utilización de sistemas automáticos de tinción. Junto a la fórmula leucocitaria, muchos de estos contadores proporcionan además información sobre morfología de glóbulos rojos y cuantificación de plaquetas. Este método es el más parecido al método microscópico convencional, pero tiene grandes inconvenientes como su bajo rendimiento, tanto por el número de células analizadas, como por su escasa velocidad en la clasificación de las mismas, aunque actualmente se están consiguiendo velocidades aceptables. SISTEMAS DE FLUJO CONTINUO El recuento y análisis de células sanguíneas se hacen en aparatos cuyo principio de funcionamiento se basa en uno o en los dos principios que señalamos: a) Resistencia eléctrica por impedancia. Con el método de la resistencia eléctrica, las células en suspensión pasan a través de una apertura situada entre dos electrodos, entre los que existe una corriente eléctrica continua de intensidad constante; cada célula al pasar produce un incremento momentáneo de la resistencia eléctrica que se traduce en un impulso eléctrico. El número de pulsos generados es proporcional al de células que pasan. La amplitud de cada pulso es proporcional al volumen celular (Figura 2.)

Figura 2. Dispositivo de recuento por impedancia

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b) Difracción de la luz en citometría de flujo, con o son citoquímica. El método de la difracción de la luz en citometría de flujo se basa en iluminar con un haz de luz láser o halógena un flujo por el que pasan alineadas una suspensión celular. El paso de las células dispersa la luz. La medida de la dispersión de la luz en dos ángulos diferentes hace posible la determinación del volumen celular (Figura 3.)

Figura 3. Métodos de dispersión de la luz.

Todos los aparatos, sea cual fuere el método de medida empleado, están dotados de un sistema de preparación de las muestras: realizan una aspiración de sangre total (0,2-0,3 �l) que es alicuotada, diluida y distri buida en dos circuitos independientes: uno para el análisis de hematíes y plaquetas y otro para leucocitos y hemoglobina. El recuento de leucocitos se realiza al medir en el circuito correspondiente, con los hematíes lisados, los volúmenes de las partículas y en algunos instrumentos también al medir la actividad mieloperoxidasa. Vamos a estudiar a continuación los siguientes sistemas de flujo continuo:

a) Sistemas de análisis del volumen leucocitario b) Métodos de difracción de la luz en citometría de flujo c) Analizadores que incorporan modificaciones de una o ambas

tecnologías d) Analizador NE-800

SISTEMAS DE ANÁLISIS DEL VOLUMEN LEUCOCITARIO

Los autoanalizadores diferenciales basados en este principio pueden obtener las poblaciones leucocitarias por análisis de los volúmenes del núcleo previa eliminación del citoplasma mediante un agente lisante (Sistemas Coulter) o mediante análisis de los volúmenes de las células intactas (serie ELT de Ortho).

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Generalmente, el histograma de distribución de los glóbulos blancos no representa el volumen de los leucocitos en la sangre circulante, sino el resultante tras la acción de un agente lisante. Este agente actúa al mismo tiempo sobre la membrana y el citoplasma de las células, lo que provoca alteraciones diferentes según el tipo de célula. Los linfocitos aparecen más pequeños que los monocitos y estos más pequeños que los granulocitos. De hecho, la posición de las células en la curva de distribución viene determinada por la morfología del núcleo:

a) A la izquierda las células con un núcleo esférico: los linfocitos. b) En la zona central los monocitos, cuyo núcleo suele presentar una o

varias hendiduras. c) A la derecha, los granulocitos con el núcleo menos segmentado

seguido de los polinucleares. En el histograma de distribución pueden diferenciarse tres picos, cada uno de los cuales corresponden a un tipo celular. De aquí que se les conozca también como sistemas de tres poblaciones (Figura 4).

a) Linfocitos: en el pico comprendido entre 35 y 90 fl. b) Mononucleares: entre 90 y 160 fl. c) Granulocitos: entre 160 y 450 fl. El aparato proporciona una cifra global

de granulocitos, ya que no puede distinguir entre neutrófilos, eosinófilos y basófilos.

Esta fórmula de tres poblaciones puede considerarse como una fórmula orientativa. Cuando el aparato advierte una distribución celular anómala, lo indica señalando unas alarmas.

Figura 4. Histograma normal de la serie blanca.

METODOS DE DIFRACCION DE LA LUZ EN CITOMETRIA DE FLUJO Los aparatos que usan este procedimiento son los denominados H1, H2 y H3 de la casa Technicon. Estos sistemas obtienen el análisis diferencial de leucocitos de acuerdo con su tamaño, su comportamiento citoquímico ante determinados colorantes y su actividad mieloperoxidasa. Estos aspectos son analizados y comparados por la parte informática del aparato para producir unos resultados precisos, exactos y fiables.

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De estos parámetros se obtienen los datos referentes a cuatro poblaciones leucocitarias: linfocitos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos. Y adicionalmente dos poblaciones más: las grandes células inmaduras (LUC) y los linfocitos atípicos (Figura 5.)

Figura 5. Citograma de peroxidasa.

En la figura 5 aparece un citograma de peroxidasa, donde en la casilla A aparecen los linfocitos, los más pequeños y desprovistos de actividad peroxidasa. En la casilla B se encuentran los monocitos, ligeramante mayores y con ligera actividad peroxidasa. En la casilla C se encuentra la población más numerosa, los neutrófilos, mayores y cargados de peroxidasa. Los eosinófilos, de menor tamaño y muy cargados de peroxidasa se encuentran en la casilla D. Y por último, en la casilla E aparece un tipo celular adicional, son los LUC o grandes células no teñidas: son células normalmente presentes en la sangre en una pequeña proporción, como linfocitos grandes hiperactivos y todas las células patológicas sin actividad peroxidasa (linfoblastos, mieloblastos, tricoleucocitos,…) Los basófilos son detectados en un canal independiente (canal de lobularidad). Mediante un reactivo lisante, son destruidas las membranas de todos los leucocitos excepto las de los basófilos (Figura 6.)

Figura 6. Citograma de basófilos La peroxidasa es una enzima contenida en el citoplasma de todos los leucocitos, en cantidad variable, excepto en los linfocitos, y esta característica es utilizada para la obtención de la fórmula leucocitaria clásica.

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Para la correcta comprensión de los histogramas por esta tecnología, se ha de tener en cuenta que las células linfoides son peroxidasa negativas y de volumen pequeño. Los monocitos son mayores que los linfocitos y más ricos en peroxidasa. Los neutrófilos son mayores que los linfocitos y con mucha peroxidasa. La peroxidasa aparece en los promielocitos y aumenta progresivamente conforme se completa la maduración de la serie mieloide. Los eosinófilos poseen mucha peroxidasa. Los basófilos son peroxidasa negativos. En el citograma de peroxidasa los linfocitos se sitúan abajo y a la izquierda. Los monocitos arriba de los linfocitos y hacia la derecha. Los neutrófilos ocupan la parte central del citograma. Los eosinófilos se sitúan debajo de los neutrófilos. Las células LUC ocupan la zona superior izquierda del citograma. En el citograma de basófilos en la zona derecha se sitúa los neutrófilos. En la zona izquierda los mononucleares y en la zona de arriba los basófilos. Las células blásticas se situarían a la izquierda de las mononucleares. ANALIZADORES QUE INCORPORAN MODIFICACIONES DE UNA O AMBAS TECNOLOGÍAS Es el caso del analizador Coulter STKS, que mide:

1. Volumen celular por el principio de la variación de la impedancia 2. Conductividad celular por medio de una corriente de alta frecuencia 3. Estructura celular por la difracción de la luz láser monocromático 4. Estos tres parámetros son integrados y analizados conjuntamente en

un sistema de tres ejes.

De esta manera se consigue una diferenciación celular en cinco poblaciones: linfocitos, monocitos, basófilos, neutrófilos y eosinófilos, así como detectar poblaciones anormales: blastos, linfocitos atípicos, granulocitos inmaduros, bandas,… La tecnología VCS mantiene los leucocitos en un estado casi nativo y efectúa una lectura en tres dimensiones. Los resultados se pueden examinar en tres planos: DF1, DF2 y DF3, siendo el más usado el DF1, por ser donde se visualizan mejor todas las poblaciones. En la figura 7 se aprecian los resultados vistos desde tres ángulos, donde 1: Neutrófilos, 2: Linfocitos, 3: Monocitos, 4: Eosinófilos y 5: Basófilos.

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Figura 7. Resultados vistos desde tres ángulos

La localización de poblaciones anormales se aprecia en la figura 32.8,

donde: 1: Sospecha de blastos; 2: Granulocitos inmaduros, 3: Neutrófilos envejecidos, 4: Plaquetas gigantes, 5: Eritroblastos, 6: Linfocitos atípicos, 7: Sospecha de blastos, 8: Linfocitos no definidos y 9: Sospecha de blastos.

Figura 8. Localización de poblaciones anormales.

ANALIZADOR NE-800

En el analizador NE-800 se sustituye el haz de luz por una corriente eléctrica, bien directa o de radiofrecuencia. Este analizador utiliza tres canales y tres hemolizantes diferentes, específicos para separar cinco poblaciones celulares. Estas células son analizadas por los métodos de Radio Frecuencia (RF) y Corriente Directa (CD) que realiza un scattegrama tridimensional que se visualiza en pantalla, expresándose los datos de RF en el eje de ordenadas y los de CD en el de abcisa, discriminándose las poblaciones celulares de los hematíes lisados y separándose tres poblaciones: linfocitos, monocitos y granulocitos. La determinación de neutrófilos y basófilos se hacen por canales independientes, utilizándose hemolizantes diferentes y selectivos para cada una de estas poblaciones, controlándose el tiempo y temperatura de la reacción con el hemolizante. Los neutrófilos se determinan mediante la fórmula:

Neutrófilos = granulocitos - (eosinófilos + basófilos).

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Los hematíes y plaquetas se analizan mediante el método de corriente directa. Este analizador proporciona de cada muestra un mensaje positivo o negativo. El mensaje negativo significa que todos los parámetros de cada muestra están dentro de los límites considerados normales, no necesitando la muestra ninguna verificación adicional. Un mensaje positivo indica que la muestra excede los límites aceptables y requiere posterior investigación y estudio El analizador proporciona un scattegrama, donde se representan los linfocitos, monocitos, granulocitos y células anormales, en áreas diferentes, según la figura 8 donde:

L: Linfocitos normales M: Monocitos G: Granulocitos 1. Blastos: por debajo de la situación normal de linfocitos y granulocitos 2. Granulocitos inmaduros: por debajo y hacia la derecha de la situación

normal de los granulocitos. 3. Cayados: por debajo y hacia la derecha de los granulocitos normales. 4. Eritroblastos: en la zona de los estromas de los hematíes. 5. Linfocitos atípicos: entre la zona de linfocitos normales y monocitos. 6. Agregados plaquetarios: Siguiendo, por arriba, la línea divisoria del

scattegrama.

Figura 8. Analizador NE-800

Junto al scattegrama, también nos presenta tres histogramas: de WBC, de eosinófilos y de basófilos.

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TEMA 9. COAGULACIÓN:

REALIZACIÓN TÉCNICA Y MEDICIÓN DEL TIEMPO DE PROTROMBINA, TIEMPO DE TROMBOPLASTINA

PARCIAL ACTIVADA Y FIBRINÓGENO INTRODUCCIÓN CONCEPTO DE HEMOSTASIA La hemostasia es el proceso encargado de prevenir la extravasación sanguínea espontánea, evitar la hemorragia excesiva a nivel de los vasos lesionados y mantener la fluidez de la sangre circulante. El mantenimiento de una hemostasia normal requiere el correcto funcionamiento de cuatro factores: a) pared vascular; b) función plaquetaria; c) coagulación sanguínea; y d) fibrinolisis. La alteración de uno sólo de ellos es siempre causa de patología. De forma resumida, el proceso de la hemostasia es como sigue: Al producirse la lesión vascular, el vaso afectado se contrae transitoriamente, disminuyendo el paso de sangre a su través (reacción vascular). A continuación, las plaquetas circulantes se adhieren al colágeno del tejido subendotelial, que queda expuesto debido a la lesión, y liberan adenosín-difosfato (ADP), lo que facilita la agregación y formación de un trombo plaquetario (función plaquetaria). Este trombo detiene momentáneamente la hemorragia, siendo primero reforzado y luego sustituido por la formación de fibrina (coagulación sanguínea o plasmática). Finalmente se inicia la cicatrización de la herida vascular, a la vez que la fibrina es degradada por un sistema enzimático (fibrinolisis). COAGULACIÓN PLASMÁTICA El proceso de coagulación sanguínea consiste en una serie de reacciones enzimáticas donde cada factor de la coagulación es la enzima del inmediatamente inferior y el sustrato del inmediatamente superior (reacción en cascada). Este proceso continua hasta que el fibrinógeno se transforma en fibrina, lo que provoca la modificación del estado físico de la sangre, que pasa de un estado líquido a un estado de gel (la red de fibrina insoluble encierra entre sus mallas a los elementos formes de la sangre y refuerza el trombo plaquetario para detener de forma definitiva la hemorragia).

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En la coagulación sanguínea se pueden distinguir tres grandes etapas: a) activación de la protrombina; b) formación de la trombina; y c) formación de la fibrina. El activador de la protrombina es un complejo lipoprotéico formado por el factor X, el factor V, el factor 3 plaquetario (fosfolípido) y los iones Ca++. La activación previa del factor X puede realizarse a través de 2 vías diferentes: vía extrínseca y vía intrínseca. VÍA INTRÍNSECA VÍA EXTRÍNSECA

La coagulación se limita a la zona de la lesión vascular gracias a la existencia de inhibidores fisiológicos, que neutralizan a los factores de la coagulación activados. Los más importantes son antitrombina III o cofactor de la heparina, α2-macroglobulina, α1-antitripsina, y proteínas C y S. Fibrinolisis Una vez que el trombo de fibrina ha cumplido su función hemostática, es destruido mediante la fibrinolisis, proceso fisiológico que se realiza gracias a la plasmina, proteasa activa que se origina a partir de un precursor plasmático inactivo: el plasminógeno.

TROMBOPLASTINA TISULAR

FVII FVIIa

FX

FXa

F II

FOSFOLÍPIDOS

F XIIa

FXI

F XII

FXIa

FIX FIXa

F IIa PROTROMBINA TROMBINA

FIBRINÓGENO FIBRINA

Ca++

FVII

FV

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EXPLORACIÓN DE LA COAGULACIÓN PLASMÁTICA Toda trastorno de la hemostasia primaria, debido generalmente a una plaquetopenia, estando el tiempo de sangría excesivamente alargado. Si el recuento de plaquetas y el tiempo de sangría son normales, hay que considerar la posible existencia de hemorragia es el resultado de una alteración vascular, plaquetaria o de los factores plasmáticos de la coagulación. En el diagnóstico de los trastornos hemorrágicos es fundamental la orientación clínica, que dirigirá la exploración hacia uno de los factores citados. Ante un paciente que sangra se debe pensar en la existencia de un defecto en algún factor de la coagulación. La exploración de la coagulación sanguínea se basa en la realización de dos pruebas globales: el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), que se complementan con una valoración de la fibrinoformación mediante la determinación funcional del fibrinógeno o la realización del tiempo de trombina (TT). Sobre la base de los resultados de estas

Plasmina Productos de degradación de la Fibrina. (D-D)

FIBRINA

t-

u-

Plasminógeno

Plasmina

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pruebas podemos realizar una aproximación diagnóstica, cuya confirmación puede requerir la determinación específica de factores de la coagulación. Aunque actualmente la casi totalidad de las pruebas de coagulación se realizan mediante coagulómetros semiautomáticos, las técnicas las describiremos de una forma general aplicable a cualquier método. Todas ellas se realizan a partir del plasma, en el que se ha bloqueado el desarrollo de la coagulación mediante un agente capaz de eliminar el Ca++: citrato u oxalato. Las pruebas se inician mediante la adición de la suficiente cantidad de Ca++ y del agente activador de la coagulación correspondiente a la etapa de ésta que se desee explorar, midiendo el tiempo necesario para la formación del coágulo. Una anomalía en alguna de estas pruebas básicas puede deberse a dos tipos de causas: presencia de un anticoagulante circulante y/o déficit de uno o varios factores de la coagulación. OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS PARA PRUEBAS DE COAGULACIÓN

1. La toma de sangre se realizará por punción venosa limpia, no debiendo existir un éxtasis prolongado por torniquete.

2. Se puede emplear jeringuilla o dispositivos para tubos al vacío. Si hay que

extraer más de una jeringuilla o tubo, se aconseja que el destinado al estudio de la coagulación no sea el primero.

3. Se utilizarán tubos de plástico o de vidrio siliconado que contengan citrato

sódico a concentración de 0,1 mol/L, una parte de citrato por cada 9 partes de sangre. Una vez introducida la sangre, se mezclan suavemente sin producir espuma.

4. La sangre anticoagulada se centrifuga durante 10-15 minutos a 3.000

r.p.m. El plasma sobrenadante se pipetea cuidadosamente en otro tubo de plástico o siliconado.

5. Debe analizarse en las 2 horas siguientes a la extracción (aunque puede

conservarse hasta 4 horas a 4º C). Si no, congelar a -20º C hasta su procesamiento. La conservación prolongada a temperatura ambiente conlleva una inactivación parcial de los factores V y VIII, mientras que la refrigeración prolongada activa el factor VII.

Normas generales para la realización manual de las pruebas de coagulación:

A) MATERIAL

1. Baño María a 37º C muy preciso. 2. Tubos estándar de hemólisis de plástico (70 × 10 mm).

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3. Pipetas automáticas de 100 y 200 µL. 4. Cronómetros contrastados.

B) REALIZACIÓN DE LA PRUEBA

1. Introducir el plasma en dos tubos de hemólisis e incubar 2 minutos a

37º C en el baño María. 2. Añadir los reactivos en el orden y con los intervalos que señalen las

técnicas concretas, agitando suavemente el tubo para su mezcla. 3. La adición del último reactivo a la mezcla debe ser brusca e

instantánea, poniendo simultáneamente en marcha el cronómetro. Inmediatamente agitar suavemente para mezclar y dejar el tubo en el baño un breve tiempo, variable según la duración normal de la prueba; luego mover rítmicamente el tubo, bajo una correcta fuente de luz, hasta ver aparecer la fibrina, momento en el que se detiene el cronómetro.

4. Las pruebas se realizarán por duplicado y la diferencia entre dos

determinaciones será siempre inferior a 1 segundo; de lo contrario se realizará una nueva determinación.

5. Simultáneamente a la valoración de la muestra debe realizarse la de

un plasma control obtenido de una mezcla de plasmas frescos de 15 - 20 sujetos sanos o de una mezcla similar liofilizada (comercial).

Causas de error

A) EN LA OBTENCIÓN DEL PLASMA:

a) Éxtasis venoso demasiado prolongado. Favorece la fibrinolisis local. b) Punción venosa inadecuada. c) Dilución errónea del plasma. Proporción sangre-anticoagulante

inexacta. d) Tiempo de centrifugación inadecuado. e) Presencia de hemólisis en el plasma. f) Conservación muy prolongada del plasma antes de realizar la prueba.

B) EN LA REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA:

a) Errores de pipeteo b) Empleo de reactivos inadecuados o caducados c) Empleo de reactivos mal preparados d) Empleo de una temperatura inadecuada e) Tiempos de incubación inexactos f) Empleo de agua no destilada

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g) Errores en la realización de la técnica TIEMPO DE PROTROMBINA: Valoración global de la vía extrínseca:

A) PRINCIPIO El tiempo de Quick o de protrombina (TP) es el tiempo necesario para la

coagulación de un plasma recalcificado en presencia de un exceso de tromboplastina hística. Explora fundamentalmente la función de la vía extrínseca de la coagulación (específicamente el factor VII y también los factores V y X), así como la función de la protrombina (factor II) y del fibrinógeno (Factor I).

B) MATERIAL

a) Tromboplastina cálcica comercial. b) Plasma citratado del paciente. c) Plasma citratado control. d) Coagulómetro o equipo para la determinación manual.

La tromboplastina hística se prepara a partir de extractos de cerebro o pulmón humanos o de tejidos animales, fundamentalmente de conejo. Existen muchas tromboplastinas comerciales preparadas a partir de tejidos animales, cuya sensibilidad suele variar según la firma comercial que la prepara, por lo que la OMS elaboró un patrón de referencia internacional a partir de cerebro humano (actualmente considerado como patrón primario), y también patrones a partir de tejidos bovino y de conejo. Estos últimos deben utilizarse para verificar la calidad y sensibilidad de los diferentes preparados comerciales, en los que además debe venir indicado su índice internacional de sensibilidad (ISI), calculado en relación al del patrón de referencia internacional, que se considera de 1,0. El Índice Internacional de Sensibilidad (ISI) es el valor de la recta de regresión de los tiempos de protrombina de pacientes anticoagulados obtenidos con la tromboplastina comercial y con la tromboplastina de referencia internacional. Para los estudios de carácter diagnóstico es conveniente utilizar una tromboplastina simple de buena sensibilidad (ISI cercano a 1). Para el control del tratamiento anticoagulante esta recomendación se hace imperativa, existiendo tromboplastinas simples o combinadas (aportan fibrinógeno y factor V) de muy alta sensibilidad.

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C) MÉTODO Precalentar la tromboplastina reconstituida, a 37º C durante 10-15 minutos. Introducir 0,1 mL (100 µµL) de PPP del paciente en un fibrotubo, y 0,1 mL de PPP control en otro fibrotubo, e incubar 2 minutos a 37º C.

*Añadir 0,2 mL de tromboplastina cálcica, a la vez que se dispara el cronómetro.

Medir en segundos el tiempo que tarda en aparecer el coágulo.

D) INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO Los resultados se expresan en segundos, acompañados del TPNM, y se

aconseja añadir la razón o cociente “tiempo del paciente /TPNM”, para una más fácil interpretación. El Tiempo de Protrombina Normal Medio (TPNM) es el valor correspondiente al plasma control.

También es conveniente indicar la marca de la tromboplastina utilizada

por la gran variabilidad en la sensibilidad entre dos distintos reactivos comerciales. Cuando la tromboplastina tiene una calidad idónea, debe suministrar un tiempo de Quick para plasmas normales (plasma testigo) de 12 a 14 segundos.

La aplicación de la prueba a un número elevado de sujetos

presuntamente libres de alteraciones de la coagulación, como ocurre en los grandes laboratorios, permite corregir ligeras desviaciones en el TPNM. Para ello se toma el valor de la razón de un mínimo de 50 individuos sin patología coagulativa, se eliminan los resultados que se hallen fuera de ± 2DE, se establece de nuevo la media y se calcula el número por el cual ésta debería multiplicarse para que su valor fuera exactamente 1,0.

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10 20 30 40 50 60

1

2

3

4

5

6

Tiempo de coagulación (segundos)

Va

lor

inve

rso

de

la

s d

iluci

on

es

Act

ivid

ad

de

Pro

tro

mb

ina

(%

)

20

25

33

50

100

Figura 1

Este número es el factor por el que deberán multiplicarse todos los resultados que se obtengan (mientras no se cambien las condiciones de trabajo o el lote del reactivo) para que realmente se adapten a la población atendida en dicho laboratorio. Para expresar el resultado en porcentaje de actividad hay que elaborar una curva de calibración (Figura 1) a partir de diluciones en tampón citratado del plasma testigo, considerando como 100% el plasma sin diluir (Tabla 1). El tiempo en segundos obtenido del plasma problema se lleva a la curva de calibración y obtenemos la actividad global en % (actividad protrombínica). El plasma testigo empleado para realizar la curva está generalmente constituido por una mezcla de plasmas normales obtenidos a partir de 15 a 20 donantes sanos. La curva debe volver a realizarse cada vez que se emplee un nuevo lote de tromboplastina, ya que ésta puede hacer variar ligeramente el valor de los testigos.

concentración 100 % 50 % 25 % 12,5 % suero fisiológico o tampón Owren

0 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL

plasma control 1 mL 0,5 mL 0,5 mL de la dilución anterior

0,5 mL de la dilución anterior

Tabla 1: Llevando los tiempos y las concentraciones a un papel semilogarítmico se obtiene una recta (Curva de calibración: Figura 1). La determinación del TP se utiliza: Para comprobar la normalidad de la vía extrínseca y común de la coagulación.

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Como indicador de la función hepática (ya que la mayor parte de los factores de la coagulación son de síntesis hepática). Para controlar los tratamientos con anticoagulantes orales. Si el TP está alargado, se realiza un TP de la mezcla a partes iguales de plasma del paciente con plasma control. Si “corrige” (es decir, si el TP se normaliza), indica un déficit de factores. Si “no corrige” indica la presencia de anticoagulante (heparina, endógena o exógena, o PDF). TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA: Valoración global de la vía intrínseca:

A) PRINCIPIO El tiempo de cefalina o TTP es el tiempo necesario para la coagulación de

un PPP recalcificado en presencia de cefalina (mezcla de fosfolípidos). Si además de la cefalina se añade una sustancia que facilite la activación del sistema de contacto (caolín, celite u otras), se le denomina tiempo de cefalina activado o TTPA.

El TTPA explora la vía intrínseca y común de la coagulación (factores XII,

XI, IX, VIII, V, X y II). B) MATERIAL

a) Cefalina activada (extracto fosfolipídico para la realización del TTPA

que contiene un activador del sistema de contacto: silicato en suspensión o ácido elágico).

b) Solución de cloruro cálcico 25 mmol/L. c) Plasma citratado del paciente. d) Plasma citratado control (mezcla de 10 ó más plasmas de donantes

sanos) preparado en el laboratorio o comercial. e) Coagulómetro o equipo para la determinación manual.

C) MÉTODO

En dos tubos de hemólisis se introducen 0,1 mL de PPP del paciente y del control, respectivamente. A continuación se añaden 0,1 mL de la suspensión de cefalina y la mezcla se deja incubar durante 2 ó 3 minutos a 37º C (según las instrucciones del reactivo).

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Finalmente se añaden 0,1 mL de CaCl2 (equilibrado a 37º C) a la vez que se dispara el cronómetro Se mide el tiempo necesario para el inicio de la formación del coágulo.

D) INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO Se da el resultado del tiempo en segundos de paciente y control y se

aconseja acompañarlo del cociente paciente/control para una más fácil interpretación, especialmente cuando se destina al control del tratamiento con heparina.

El tiempo normal varía según la mezcla de cefalina-activador utilizado y

generalmente oscila entre 30 y 35 segundos para el plasma normal. Para corregir pequeñas desviaciones en el valor del plasma control se procede de forma similar a como se indicó en el TP.

El TTPA se utiliza:

Para el estudio global de la coagulación, junto al TP. Para valorar la existencia de déficit de factores de la coagulación: Un alargamiento respecto al control indica una alteración de los factores antihemofílicos (VIII y IX), de los del sistema de contacto (XI y XII) o de los factores pertenecientes a la vía común (V, X y II). Para monitorización de la terapia con heparina. Si el TTPA está alargado, hay que realizar un nuevo TTPA de una mezcla apartes iguales de plasma del paciente y plasma control. Si “no corrige” significa la presencia de heparina o anticoagulante circulante. Si “corrige” indica un déficit factorial, y entonces hay que valorar conjuntamente TP y TTPA:

TP TTPA Factor deficitario Normal Alterado VIII, IX, XI, XII Alterado Normal VII Alterado Alterado X, V, II

Si el TP y el TTPA están alargados, hay que valorar el Nº de plaquetas y el fibrinógeno para descartar una coagulopatía de consumo. Dosificación del fibrinógeno: Puede realizarse mediante tres procedimientos: ponderal, precipitación por el calor y medida del tiempo de coagulación. Este último es el más preciso y el más utilizado, valorando el fibrinógeno funcional.

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La determinación inmunológica por inmunodifusión radial ofrece una buena precisión y existen dispositivos comerciales que hacen muy simple la prueba. La valoración turbidimétrica a partir del coágulo obtenido en el TP, que ofrecen algunos coagulómetros, proporciona resultados aceptables en el screening, especialmente dentro del intervalo de normalidad. MÉTODO PONDERAL: PRINCIPIO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Se coagula el fibrinógeno contenido en un volumen determinado de plasma. El coágulo se lava, se seca y se pesa, obteniéndose la cifra de fibrinógeno en g/L. La cifra normal de fibrinógeno varía entre 2 y 4 g/L, considerándose que existe hipofibrinogenemia cuando es inferior a 1,5 g/L, e hiperfibrinogenemia si es superior a 6 g/L. MÉTODO DE LA PRECIPITACIÓN MEDIANTE CALOR: PRINCIPIO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS El fibrinógeno humano precipita a 56º C. La medida de la altura del precipitado después de su centrifugación es proporcional a su concentración en el plasma. Es un método poco preciso, pero rápido y orientativo. Es importante tener en cuenta que los productos de degradación de la fibrina (PDF) precipitan también a 56º C y pueden falsear los resultados. MÉTODO DE LA MEDIDA DEL TIEMPO DE COAGULACIÓN (Método de Von Clauss)

A) PRINCIPIO En presencia de concentraciones elevadas de trombina y baja

concentración de fibrinógeno, el tiempo de coagulación es proporcional a la tasa de fibrinógeno.

B) MATERIAL

a) PPP del paciente (sangre total con citrato sódico 0,1 mol/L,

centrifugada 10-15 min. a 3.000 r.p.m.). Se puede guardar refrigerada no más de 3-4 horas.

b) Tampón veronal-acetato, pH 7,35 (Tampón de Michaelis), o tampón de Owren.

c) Solución de trombina bovina liofilizada a concentración de 100 NIH/mL.

d) Solución de CaCl2 mol/L. e) Plasma citratado control con tasa de fibrinógeno previamente

conocida.

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f) Coagulómetro o equipo para la determinación manual. La lectura manual de esta prueba es difícil por simple observación de la formación del coágulo y requiere el uso de un gancho o asa de platino. Todos los coagulómetros de lectura mecánica y la mayoría de los modelos modernos de lectura óptica son adecuados para la realización de la prueba.

C) MÉTODO

Diluir el plasma problema en tampón de Michaelis o en tampón Owren (dilución 1/10). Introducir en la cubeta del fibrómetro 0,2 mL de la dilución 1/10 y esperar 2 minutos para equilibrar la muestra (37º C). Añadir 0,1 mL de la solución de trombina concentrada, al mismo tiempo que se dispara el cronómetro del fibrómetro. Determinar el tiempo necesario para la coagulación. Las cifras obtenidas se transforman en valores de concentración de fibrinógeno (g/L) mediante el empleo de una curva de calibración elaborada previamente: se determina el fibrinógeno de un plasma control por otro método (preferentemente ponderal) y se mide el tiempo de coagulación correspondiente a diferentes diluciones de este plasma (1/5, 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50) en presencia de una solución de trombina (según lo indicado anteriormente).

Tampón 0,8 mL 0,9 mL 1,9 mL 2,9 mL Patrón 0,2 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL Dilución 1/5 1/10 1/20 1/30

En la línea de abscisas se colocan las concentraciones de fibrinógeno en g/L y en la de ordenadas los tiempos de coagulación obtenidos (en segundos) (Figura 2).

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D) INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS En las hipofibrinogenemias, la dilución 1/10 es prácticamente

incoagulable; mientras que en las hiperfibrinogenemias hay que aumentar el número de diluciones hasta entrar en la zona de sensibilidad de la recta de calibración.

Si la tasa de fibrinógeno es superior a 500 mg/dL, se hace una dilución

1/20 (0,1 mL de plasma problema y 1,9 mL del tampón), se realiza una nueva determinación y el resultado se multiplica por 2 para obtener la cifra real de fibrinógeno. Si la cifra de fibrinógeno es inferior a 100 mg/dL se realiza la prueba en plasma diluido 1/5 (0,1 mL de plasma y 0,4 mL de tampón, y el resultado se divide por 2.

La presencia de un inhibidor de acción antitrombina (heparina o PDF)

pueden falsear los resultados por alargamiento del tiempo de coagulación, independientemente de la tasa de fibrinógeno.

TIEMPO DE TROMBINA Es el tiempo que tarda en coagular un PPP citratado al añadir un exceso

de trombina. El valor normal oscila entre 12 y 16 segundos. Si el TT excede más de 3 segundos al tiempo control (que se realiza simultáneamente), hay que sospechar patología del fibrinógeno. La prueba se alarga también por la presencia de heparina, PDF o fibrinógeno anormal, por lo que ante un tiempo de trombina largo se recomienda la realización de un tiempo de Reptilase, y si éste está también alargado, deben dosificarse el fibrinógeno y los PDF.

Figura 2

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TIEMPO DE REPTILASE Mide el tiempo que tarda en coagular un PPP citratado al añadir reptilase

(derivado del veneno de víbora), que actúa directamente sobre el fibrinógeno, escindiendo el fibrinopéptido A por un mecanismo independiente de la trombina, por lo que no se altera por la presencia de heparina.

El tiempo de reptilase permite diferenciar si el alargamiento del tiempo de trombina se debe a un trastorno en la formación de fibrina o a la presencia de heparina.

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TEMA 10. GRUPOS SANGUÍNEOS: ABO Y RHO. REALIZACIÓN, TÉCNICA E

INTERPRETACIÓN. TÉCNICA DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA (COOMBS DIRECTO): PRINCIPIO, REALIZACIÓN

TÉCNICA E INTERPRETACIÓN. ESTUDIO DE LA COMPATIBILIDAD SANGUÍNEA: PRUEBA CRUZADA MAYOR, FASES DE LECTURA E

INTERPRETACIÓN

ABO Y RHO. REALIZACIÓN, TÉCNICA E INTERPRETACIÓN. INTRODUCCIÓN En épocas anteriores al siglo XX se habían realizado transfusiones entre seres humanos e incluso entre animales de otras especies y el hombre, aunque los resultados adversos frecuentes se consideraban ocasionados por enfermedades transmitidas del donante al receptor. Hasta 1901 con Landsteiner, no se inicia un estudio riguroso al mezclar plasma y hematíes de diferentes personas, analizando la existencia o no de aglutinación, llegando a clasificar las sangres en los diferentes grupos. En 1928, la Comisión de Higiene de la Sociedad de Naciones acepta la nomenclatura que hoy en día se utiliza para el sistema ABO, conocido también comúnmente como grupo sanguíneo. A partir de entonces, se va avanzando en el conocimiento de otros componentes antigénicos de la membrana del hematíe, estableciéndose numerosos sistemas eritrocitarios que, hoy en día, nos permiten evitar cualquier reacción de incompatibilidad al poner en contacto dos tipos de sangre. CONCEPTOS GENERALES Un antígeno eritrocitario es toda aquella sustancia presente en la membrana del hematíe que reúne las características necesarias de tamaño, complejidad, accesibilidad, etc... para que, al ponerse en contacto con las células inmunocompetentes de un sistema inmunitario, de lugar a la activación de dichas células, siendo una de las respuestas la formación de anticuerpos; estos

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anticuerpos formados se unen a los antígenos correspondientes, iniciándose la destrucción de la célula portadora. La destrucción de la célula se consigue por activación del complemento y/o por fagocitosis Los antígenos eritrocitarios pueden estar pegados a la membrana del hematíe o formando parte de ella. Si forman parte integral de la membrana, suelen estar menos accesibles para conectar con los receptores específicos de los antígenos de las células inmunocompetentes, disminuyendo por este motivo su capacidad antigénica. La capacidad antigénica va a depender, por tanto, del número de veces que se repite el antígeno en la membrana del hematíe. Esta característica se denomina densidad de puntos antigénicos. A los antígenos eritrocitarios se les pueden denominar factores. Cuando varios factores son regulados por una serie de genes interrelacionados, forman un sistema (ABO, Rh...) SISTEMA ABO SUSTANCIAS QUE COMPONEN EL SISTEMA El sistema ABO está formado por los antígenos A y B, que pueden estar presentes en la membrana del hematíe, en otras células y en las secreciones (saliva, líquido amniótico, líquido seminal...) dependiendo su existencia y localización de un control genético. Las sustancias A y B empiezan a formarse en las primeras semanas del desarrollo fetal, pero no adquieren toda su potencia inmunológica hasta pasados varios meses, incluso 18-20 meses después del parto. Esto es debido a que el número de veces que se repite la sustancia en la membrana del hematíe al principio es reducido, adquiriendo la densidad máxima de una forma progresiva. La densidad de estos puntos antigénicos puede llegar, para las sustancias A y B, hasta casi un millón por célula. La localización de estas sustancias es extramembranosa y en su composición podemos diferenciar dos partes: Oligosacáridos: donde se presentan las variaciones antigénicas y, otra menos conocida; Glucoproteínas (o soporte): cuando está fijado a la membrana de hematíes, leucocitos u otras células epiteliales o endoteliales.

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FORMACIÓN Y CONTROL de LAS SUSTANCIAS A y B Antígenos. Los antígenos que componen el sistema ABO y el sistema Lewis proceden de sustancias precursoras muy similares. Hay dos tipos de sustancias precursoras: tipo I y tipo II, La sustancia precursora tipo I posee todas las uniones entre sus monosacáridos por los carbonos que se encuentran en las posiciones 1 y 3, y el soporte está formado por glucoproteínas. La sustancia precursora tipo II posee todas las uniones entre sus monosacáridos por los carbonos que se encuentran en posición 1 y 3, excepto entre la N-acetilglucosamina y la galactosa final, que se produce entre los carbonos en posición 1 y 4. El soporte está formado por glucolípidos. Sobre estas sustancias van a actuar un conjunto de transferasas, controladas por genes que se encuentran en el brazo corto del cromosoma 9, dando lugar a los distintos componentes de los sistemas ABO y Lewis. Los genes que controlan el sistema ABO son el H, A, B y Se. Los genes A y B son codominantes entre sí y dominantes sobre el O. La sustancia precursora tipo II es el origen de los antígenos A y B unidos al eritrocito y otras células. El proceso se desarrolla de la siguiente forma: el gen H controla la formación y la acción de una fucosil-transferasa, que cataliza la unión de una fucosa a la galactosa final de la sustancia precursora tipo II, formándose la sustancia H. A continuación, si el gen A está presente, controlará la formación y la acción de una N-acetilgalactosaminil-transferasa, catalizando la unión de una N-acetil-galactosamina a la sustancia H; formándose la sustancia A. En cambio si es el gen B el presente, controla la formación y la acción de una galactosil transferasa, uniéndose una galactosa a la sustancia H, formándose la sustancia B. Si en la dotación genética se encuentran los genes A y B, sobre el hematíe aparecen las dos sustancias A y B y si en la dotación genética no se encuentran los genes A y B, por ser homocigótico OO, sobre el hematíe no habrá sustancia ni A ni B. El gen O se considera un “gen mudo” ya que no controla ninguna transferasa que actúe sobre la sustancia H. Los hematíes que tienen los antígenos A y B poseen menos cantidad de sustancia H en su membrana que los hematíes carentes de dichos antígenos, ya que parte de la sustancia H se utiliza en la formación de los antígenos A y B.

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En la especie humana, siempre que no haya alteraciones genéticas, las sustancias precursoras y la sustancia H son isoantígenos, ya que las poseen todos los individuos de la especie. Sin embargo, las sustancias A y B son aloantígenos porque no se encuentran en todos los individuos de dicha especie. Hay determinados casos, aunque poco frecuentes, en los que el hematíe no presenta en su membrana la sustancia H; como consecuencia de ello tampoco hay en la membrana del hematíe sustancias A y/o B, aunque en la dotación genética estén los genes A y/o B. Esto puede ser debido a varias causas: La persona posee el genotipo homocigoto hh y, por lo tanto, no forma la sustancia H ni en el hematíe ni en las secreciones. Esta sangre se tipifica como Bombay. El gen H está parcialmente reprimido, formándose muy poca sustancia H, que resulta insuficiente para actuar como sustrato para las enzimas controladas por los genes A y B, no produciéndose, por tanto, las sustancias correspondientes. Este tipo de sangre se denomina para-Bombay serie 1ª. Hay un fallo en los genes reguladores que mantienen fijas las sustancias H, A y B al hematíe. El individuo posee sustancia H y las sustancias A y B que le correspondan genéticamente, pero no fijadas al hematíe. Esta sangre se tipifica como para-Bombay serie 2ª. Esta alteración genética hace que, para las personas con sangre tipificada como Bombay, la sustancia H sea un aloantígeno. No sucede así en los casos de sangre para-Bombay series 1ª y 2ª, ya que las personas que poseen este tipo de sangre tienen sustancia H (en poca cantidad o fuera del hematíe) siendo por lo tanto isoantígeno para ellas. El último gen regulador es el Se (ya sea de forma homocigótica: Se/Se ó heterocigótica Se/se), este gen controla la formación y acción de una fucosiltransferasa, permitiendo la unión de una fucosa a la galactosa final de la sustancia precursora tipo I. Así se forma la sustancia H, sobre la que pueden actuar los genes A y/o B con formación de sustancias A y B en secreciones. Por lo tanto, para que un individuo sea secretor de sustancias A o B necesita poseer el gen Se de forma homocigótica o heterocigota. La frecuencia de los diferentes tipos de sangre en personas de raza blanca es la siguiente: O (43-47%), A1 (34-41%), A2 (10%), B (8-9%) y AB (3%) Anticuerpos del sistema ABO. Al nacer, una persona posee en la membrana de sus hematíes los antígenos que le corresponden dependiendo de su dotación genética. En su plasma no existe ningún tipo de anticuerpos respecto a las sustancias A o B, pero de forma

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progresiva, se inicia la formación de anticuerpos contra los antígenos hemáticos que ella no posee. Estos anticuerpos se denominan naturales. Hoy en día se piensa que estos anticuerpos se forman como respuesta a sustancia que se encuentran en la membrana de determinadas bacterias, neumococos o que forman parte de algunos jugos vegetales. Estas sustancias son muy parecidas a los antígenos que componen el sistema ABO. Los anticuerpos naturales reaccionan con antígenos A o B por reacción cruzada. Estos anticuerpos son preferentemente de tipo IgM y no atraviesan la placenta. Se les denomina también completos o aglutinantes porque al unirse al hematíe lo aglutinan con facilidad en medio salino. Los títulos de anticuerpos naturales anti-A o anti-B pueden variar a lo largo de la vida. En términos generales, sangres tipificadas como O, tienen títulos de anti-A y anti-B naturales más altos que las de los grupos A y B. Cuando los hematíes tipificados como A, B o AB se transfunden a otra persona que no posea algunos de estos antígenos, el sistema inmunocompetente de ésta se estimula formando anticuerpos contra el antígeno desconocido. Este tipo de anticuerpos se denominan inmunológicos ya que el estimulante es perfectamente conocido (el antígeno hemático) y la unión antígeno-anticuerpo no tiene lugar por reacción cruzada. La mayoría de estos anticuerpos inmunológicos son de tipo IgG, atraviesan la placenta y se les denomina también incompletos porque para detectarlos en el laboratorio es necesario facilitar la aglutinación de diferentes formas, ya que en medio salino no se consigue. Es importante diferenciar entre anticuerpos anti-A y anti-B naturales e inmunológicos. La existencia de anticuerpos inmunológicos anti A y anti B pueden ser causa de anemia hemolítica en el recién nacido. Sangre con títulos altos de anticuerpos naturales y/o inmunológicos no es adecuada para realizar transfusiones. Grupos y subgrupos del sistema ABO. El sistema ABO está formado por cuatro grupos diferentes

Grupo sanguíneo Antígenos hemáticos Anticuerpos en suero A B AB O

A B A y B Ninguno

Anti-A Anti-B Ninguno Anti-A y Anti-B

Cada grupo presenta en el hematíe, en otras células y en secreciones (si está presente el gen Se), el antígeno correspondiente a la denominación del grupo, y en el plasma, el anticuerpo contra el antígeno que no posee.

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En grupo AB, al tener los dos antígenos, no presenta ni anti-A ni anti-B (se conoce tradicionalmente como receptor universal) En el grupo O, al no tener ninguno de los dos antígenos, presenta anti-A y anti-B, expresando toda la sustancia H sin utilizar (se conoce tradicionalmente como donante universal) Se conocen algunas variaciones antigénicas que dan lugar a diferentes subgrupos, solo los subgrupos A1, A2, A1B y A2B tienen interés, ya que el resto son muy poco frecuentes y sus antígenos tienen muy poca capacidad antigénica. Los fenotipos-genotipos del sistema son los siguientes:

Fenotipos Genotipos O OO A1 A1A1

A1A2 A1O

A2 A2A2 A2O

B BB BO

A1B A1B A2B A2B

El gen A1 es dominante sobre el gen A2, siendo los genes A y B codominantes y dominantes sobre el O. Características del sistema ABO

Grupo Ag hemáticos Ac plasma A1 A1 y A Anti-B A2 A Anti-A1 y anti-B B B Anti-A1 y anti-A A1B A1, A, B - A2B A y B Anti-A1 O - Anti-A1, anti-A y anti-B

El subgrupo A1 es mucho más frecuente que el A2, siendo su capacidad antigénica más elevada. Una persona con sangre A2, si recibe hematíes A1, es posible que forme anticuerpos anti-A1 En cambio los anticuerpos anti-A1 procedentes de sangres A2 y A2B suelen ser débiles y por lo tanto poco útiles para su utilización in vitro para tipificar hematíes A1.

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Determinación del grupo ABO. La tipificación de la sangre con respecto al grupo ABO es la más importante a realizar debido a las graves consecuencias que puede tener un error en su realización en caso de transfusiones. Esta importancia va a radicar en la existencia de anticuerpos naturales muy potentes que diferencian este sistema de otros (por ejemplo el Rh), provocando una incompatibilidad desde la primera transfusión (el Rh necesita una transfusión sensibilizante previa). Tipos de muestra y conservación: Sangre total con ácido cítrico, citrato y dextrosa (ACD): se conserva unos 21 días a 2-10º C. Sangre total con etilen-diamino-tetraacético (EDTA): se conserva 48 horas a 2-10º C. Sangre coagulada: se conserva 5 días a 2-10º C. La toma de muestra por punción dactilar o en el lóbulo de la oreja no es aconsejable, ya que en caso de duda no permite la comprobación por medio de otra técnica. Tipos de suero: La mayoría de los sueros para el diagnostico son de origen humano, preparándose de mezclas de sueros seleccionados. Los sueros son: anti-A, anti-B y anti-AB. Este último se utiliza de sangre de paciente de grupo O, y se utiliza para confirmar los resultados obtenidos con los anti-A y anti-B o bien cuando la respuesta obtenida es muy débil. Para diferenciar los grupos A1, A2, A1B y A2B se utiliza principalmente el suero anti-A1, compuesto por una lectina de las semillas del Dolichus biflorus y para la identificación de la sustancia H un suero anti-H vegetal (lectina del Ulexz europaeus). También pueden emplearse sueros formados por anticuerpos monoclonales de origen murino (hibridación de células B productoras de anticuerpos con células de mieloma de ratón) o humano (hibridación de células B infectadas con EBV y células de mieloma). Los anticuerpos policlonales captan mejor los antígenos débiles que los monoclonales.

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Técnicas. Prueba en porta.

o En un porta colocar una gota de sangre problema y una gota de suero anti-A y en otro diferente otra gota de sangre con suero anti-B.

o Mezclar. Aunque la aglutinación debe ser inmediata, conviene mover dos

minutos a temperatura ambiente para poder captar los antígenos débiles.

o Si no aglutina ni con anti-A ni con anti-B el grupo es el O (se puede confirmar con la negatividad de la prueba al anti-AB).

o Si aglutina con anti-B es B y si lo hace sólo con el anti-A será A. En este

ultimo caso se deberá diferenciar el grupo A1 del A2. Si aglutina con los dos, el grupo será el AB.

En aquellos casos en los que el paciente tenga la VSG elevada o el plasma sea lipémico, es posible que existan dudas en la interpretación de la prueba. Para solucionarlo deben lavarse los hematíes o bien realizar la prueba en tubo. Prueba en tubo.

o Lavar aproximadamente 0.2 ml de sangre con solución salina isotónica 2-3 veces. Centrifugar y eliminar el sobrenadante.

o Tomar 0.1 ml del concentrado de hematíes y mezclar con 2 ml de solución

salina isotónica (concentración aproximada: 4%), a continuación depositar una gota de la dilución en dos tubos, añadiendo a uno suero anti-A y al otro anti-B. Mezclar y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm, resuspender y comprobar la aglutinación.

EL SISTEMA RHESUS (Rh) En 1940 Landsteiner descubre otro antígeno en los hematíes, que era el responsable de que los recién nacidos de madres que no tenían ese antígeno en sus hematíes pero si el anticuerpo correspondiente en su plasma, murieran dentro del útero durante el embarazo o padecieran una enfermedad muy grave tras el nacimiento (enfermedad hemolítica del recién nacido). A este antígeno lo denominó “Rh” por haberse realizado los primeros descubrimientos en el mono “MACACO RHESSUS”. Observó que al introducir hematíes humanos a estos monos, estos fabricaban un anticuerpo que era capaz de “aglutinar” los hematíes del 85% de la población blanca. Llamó “ Rh positivos “ a los hematíes que eran aglutinados por ese anticuerpo, (llevaban el antígeno Rh en su superficie) y “Rh negativos” a los que no eran aglutinados (no tenían antígeno Rh en su superficie).

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El sistema Rhesus está constituido por unos cuarenta antígenos distintos cinco de los cuales revisten una importancia especial. Para designar los diferentes antígenos del sistema Rh existen dos nomenclaturas principales que se utilizan indistintamente la de Fisher-Race y la de Wiener. La terminología de Fisher-Race se basa en la suposición de que se heredan de cada progenitor tres genes situados en loci muy próximos. Los alelos más comunes que pueden ocupar dichos loci se designan con los símbolos D y d, C y, E y e. Cada gen (con excepción del d) codifica un antígeno específico, que puede ser detectado en la membrana del hematíe. Es posible que sea una alelo silencioso. La presencia o ausencia del antígeno D es la que determina si un individuo es Rh positivo o negativo. La nomenclatura de Wiener se basa en la herencia de un solo gen procedente de cada progenitor. Cada gen tendría una estructura en mosaico, que comprendería un número variable de antígenos sanguíneos. Así, el gen R1 codificaría factores que corresponderían a C, D, y e de la nomenclatura de Fisher-Race. El gen reproduciría los antígenos c y e pero no D, C ni E. El 85% de los individuos caucasoides expresan el antígeno D y se les denomina Rh positivos. Si el antígeno D no se expresa se denomina al individuo Rh negativo, estos heredan los antígenos C o E pero no el D. El genotipo de la mayoría de los individuos Rh negativos es rr (dce/dce). El antígeno D es un potente inmunógeno. Aproximadamente el 70% de los individuos Rh negativos producen anti-D si reciben sangre Rh positiva. Los antígenos C y E no son tan inmunógenos.

TEORIA DE FISHER-RACE TEORIA DE WIENER

3 GENES ESTRECHAMENTE UNIDOS, HEREDADOS

DE CADA PROGENITOR

1 GEN Rh HEREDADO DE

CADA PROGENITOR

GEN EN MOSAICO QUE CODIFICA MULTIPLES FACTORES SANGUÍNEOS

Finalmente, Rosenfield, tan solo propone una nomenclatura, en la cual cada uno de los diversos antisueros Rh recibe un número Rh1, Rh2, etc. Este sistema hace posible una determinación del fenotipo basada tan solo en los resultados observados con los antisueros empleados.

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NOMENCLATURA ANTIGENOS DEL SISTEMA Rh

FISHER-RACE WIENER ROSENFIELD

D Rh Rh1 C rh Rh2 E rh” Rh3 C hr Rh4 E hr” Rh5

Tabla 1.

ANTÍGENOS DEL SISTEMA Rh Los antígenos del sistema Rh son proteínas que forman parte integrante de la membrana de los eritrocitos únicamente. (No se encuentran en otras células o en las secreciones. A parte del antígeno D, que permite clasificar a los individuos en Rh positivos y Rh negativos, existen otros antígenos en el sistema Rh. De estos los principales son C, c, E, e. Anticuerpos hacía cualquiera de estos antígenos pueden ser producidos por un individuo cuyos glóbulos rojos carecen de los mismos. EL D El D es una variante débil del antígeno D poco frecuente entre los individuos caucasoides, pero común entre los individuos de raza negra (22%). Los hematíes D generalmente dan reacciones débiles o negativas con el anti-D, siendo generalmente detectados gracias a la prueba indirecta de la antiglobulina (prueba D). Los hematíes D pueden ser clasificados en tres categorías. D ADQUIRIDO. La herencia del gen C en posición trans con relación al gen D (dce/DcE) tiene como resultado una expresión débil del antígeno D en los hematíes (D). Los individuos que representan estas características no producen anti-D si reciben sangre Rh positiva. D DEPRIMIDO

GENOTIPO Dce/dce Dce/dCe

C en posición cis con respecto a D

C en posición trans con respecto a D

Expresión normal del antígeno D Fenotipo como D

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VARIANTE D. El antígeno D presenta una estructura que consta como mínimo de cuatro partes. Si faltan una o más partes del antígeno el resto de este puede tener una expresión débil. Un individuo con la variante D puede producir aloanticuerpos contra la parte del antígeno D que le falta. Estos deben ser transfundidos con sangre Rh negativa.

VARIANTE D

Antígeno D Normal

Variante D falta parte del antígeno D

D HEREDITARIO. Algunos individuos D no pueden ser clasificados como D adquirido ni como variante D, puesto que, si bien poseen el antígeno D completo, éste está débilmente expresado, desconociéndose la causa de este hecho.

Antígeno D Normal

D Hereditario

HEMATÍES CON DELECCIÓN Rh (- D -) y Rh nulo De los hematíes que no poseen los antígenos dependientes de los loci C ni E se dice que presentan delección (- D -). El número de lugares antigénicos D está muy aumentado en estos hematíes y por tanto el anti-D de tipo IgG puede aglutinarlos. De los individuos que no expresan ninguno de los antígenos del sistema Rh en sus hematíes se dice que tiene Rh nulo (- - -). Los hematíes de éstos tienen alterado el transporte de sodio y potasio. Esto da lugar a una anemia hemolítica caracterizada por estomatocitosis, esferocitosis y aumento de la fragilidad osmótica. ANTICUERPOS DEL SISTEMA Rh Los anticuerpos del sistema Rh son casi siempre IgG, siendo estimulada su producción por transfusión o por embarazo (Enfermedad hemolítica del recién nacido). No activan el complemento debido a que la situación de los antígenos Rh de la membrana del hematíe no permite la formación de dobletes de IgG necesarios para la activación del mismo. Los anticuerpos anti-D se emplean para prevenir la inmunización de las personas Rh negativas que han recibido hematíes Rh positivos a través de una transfusión o de un embarazo. La administración antes de 72 horas de inmunoglobulina anti-D consigue destruir los hematíes Rh positivos circulantes antes de que el sistema inmune del receptor se active.

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GENOTIPO El término Rh positivo se refiere tan sólo a la presencia del antígeno D en los glóbulos rojos. No indica si la formación genética de la persona es homocigota (D/D) o heterocigota (D/d). En cualquier persona puede determinarse el genotipo presuntivo. DETERMINACION DEL Rho TIPOS DE MUESTRAS Y CONSERVACIÓN: Ver el apartado referido a la determinación del grupo ABO. TÉCNICAS: Se emplean anticuerpos anti-D de tipo IgG conseguidos a partir de una mezcla de sueros humanos obtenida de donantes inmunizados. Prueba en porta.

• Se toman dos portaobjetos convenientemente rotulados. En uno ponemos una gota de suero anti-D, en el otro una gota del CD (Control negativo).

• Añadimos dos gotas de sangre total, a cada uno de los dos portas. • Se mezcla bien la sangre y el reactivo con distintos palillos

mezcladores. • Se colocan los portas sobre el visualizador precalentado.

• Conviene mover el visualizador durante dos minutos. A continuación

se observa macroscópicamente la presencia de aglutinación. La lectura de cada uno de los portaobjetos admite dos posibilidades.

o Reacción negativa: no hay ningún signo visible de aglutinación, debe ser confirmada con la prueba del D.

o Reacción positiva: la sangre con anti-D muestra aglutinación visible, y el

control negativo no. Prueba en tubo.

• Rotular dos tubos, uno para el anti-D, y el otro para el control negativo (CD).

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• Preparar una suspensión de hematíes del paciente al 5%. Lavar tres veces con salino, centrifugando durante un minuto a 3.500 r.p.m.

• En el tubo del D poner una gota de anti-D, y añadir una gota de la

suspensión de hematíes, en el tubo del control poner una gota del control negativo y una gota de la suspensión de hematíes.

• Agitar ligeramente los dos tubos y centrifugar 15 segundos.

• Leer los resultados macroscópicamente en el visualizador.

Siempre que resulte, el control del D, positivo, hacer test de Coombs Directo. A todo Rho negativo se le efectuará un D y un CDE. TEST PARA EL D

1. Incubar a 37° C durante media hora, el mismo tubo en el que se haya realizado el anti-D, que dio negativo.

2. Lavamos 3 veces, los hematíes con solución salina isotónica.

Decantamos el último sobrenadante.

3. Se añade una gota e suero antiglobulina humana y se mezclan.

4. Se centrifuga durante 30 segundos. Leemos macroscópica y microscópicamente.

5. Si no hay aglutinación se dará como D (-) y D (-).

6. Si hay aglutinación se hará un anti-D salino, para ello:

o Echar en un tubo 1 gota de anti-D salino, más una gota de

suspensión de hematíes al 5%.

o Incubar a 37° C durante 15 minutos.

o Centrifugar y leer macroscópicamente. Sólo si el anti-D salino da negativo se considera D positivo. En caso contrario se dará como D positivo.

CDE

1. Rotular un tubo CDE y poner en el mismo una gota de anti-CDE.

2. Añadirle una gota de suspensión de hematíes al 5% del paciente.

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3. Incubar a 37° C durante 15 minutos.

4. Centrifugar 15 segundos y leer microscópicamente si hay aglutinación. GENOTIPO

1. Rotular cuatro tubos: C, E, c, e. 2. Preparar una suspensión de hematíes al 5% del sujeto a genotipar. 3. Poner en cada tubo, una gota de la suspensión de hematíes, y una gota

del antisuero correspondiente. (anti-C, anti-E, anti-c, anti-e).

4. Incubar durante 15 minutos, los cuatro tubos, a 37° C en baño María.

5. Centrifugar 15 segundos a 3.500 r.p.m., y leer macroscópicamente.

6. Apuntar resultados, ver en tablas genotipo correspondiente.

Rho positivo

D C E c e Genotipo Símbolo

+ + - + + Dce/dce Rr

Rho negativo

D C E c e Genotipo Símbolo

- + - - + dCe/dCe rr Tabla. 2

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TÉCNICA DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA (COOMBS DIRECTO) PRINCIPIO, REALIZACIÓN TÉCNICA E INTERPRETACIÓN PRINCIPIO

La fijación de anticuerpos de tipo IgM a los hematíes generalmente produce aglutinación, a diferencia de los anticuerpos IgG (denominados anticuerpos “bloqueantes” o “incompletos”), que no suelen producir aglutinación. La prueba de Coombs sirve para poner de manifiesto estos anticuerpos incompletos. Esta prueba puede aplicarse básicamente de dos formas: directa e indirecta. Ambas tienen el mismo fundamento: las dos detectan el anticuerpo o el complemento unido a la célula. La Prueba Directa de la Antiglobulina es positiva cuando los hematíes han sido sensibilizados en su propio organismo (sensibilización in vivo). La Prueba Indirecta de la Antiglobulina detecta la existencia de anticuerpos antieritrocíticos en el suero de un enfermo, que provocan la sensibilización de hematíes in vitro, por lo que aglutinan al añadirles el suero de Coombs. En ambos casos, el anticuerpo sensibilizante o el complemento actúan como antígeno para el reactivo antiglobulina humana (suero de Coombs). Dicho reactivo se prepara inmunizando animales (conejos generalmente) con IgG y complemento (C3) humanos. La aglutinación se produce porque el anti-IgG y el anti-C3 se unen al antígeno correspondiente (IgG y C3, respectivamente), que a su vez está unido a hematíes colindantes, actuando así como puente (Fig. 1). REALIZACIÓN TÉCNICA Se llama “directa” porque los hematíes se toman directamente del paciente y son examinados sin manipulación intermedia. Antes del examen es importante lavar los glóbulos rojos para que queden libres de proteínas plasmáticas, que podrían reaccionar con el suero antiglobulina y dar falsos positivos. MATERIAL

• Centrífuga. • Tubos de hemólisis (12 × 75 mm). • Pipetas de Pasteur. • Solución salina fisiológica. • Sangre del paciente anticoagulada con EDTA. • Eritrocitos control (Coombs-control).

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Suero antiglobulina (suero de Coombs) estandarizado. Algunos anticuerpos de tipo IgG y la mayoría de los IgM pueden fijar el complemento a los hematíes in vivo. El componente del complemento detectado en dichos hematíes es C3d, razón por la cual el reactivo antiglobulina utilizado para la prueba de Coombs directa debe contener anti-IgG y anti C3d. MÉTODO

a) Centrifugar la sangre del paciente 5 minutos a 3.000 r.p.m. y separar el plasma.

b) Lavar cuatro veces los eritrocitos con solución salina fisiológica, teniendo cuidado de decantar completamente después de cada lavado.

c) Preparar una suspensión de eritrocitos al 2-5 % en un tubo de hemólisis. d) Colocar una gota de los eritrocitos del paciente y una gota del suero

antiglobulina humana. e) Mezclar y centrifugar 1 minuto a 1.000 r.p.m. f) Resuspender suavemente el botón de células (sin sacudir, usando sólo

una suave agitación por medio de un suave temblor del tubo) y girar los tubos cuidadosamente para la lectura macroscópica.

Fig. 1: Test de Coombs directo

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Una reacción positiva mostrará aglutinados visibles macroscópicamente (Fig. 1). Una reacción negativa se reconocerá por la suspensión homogénea de todos los hematíes. Las reacciones negativas deben leerse también microscópicamente después de hacer una extensión en porta.

Puntuación de las aglutinaciones:

Símbolo Aglutinados Puntuación C Un único aglutinado 12 +++ Varios aglutinados grandes 10 ++ Aglutinados más pequeños 8 + Gránulos 5 (+) Gránulos pequeños 3 w Lectura microscópica; aglutinados

pequeños 1

o Lectura microscópica: negativa 0 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Una prueba de Coombs directa positiva suele significar la presencia de inmunoglobulinas fijadas en la superficie de los eritrocitos, del tipo:

1. Autoanticuerpos contra antígenos intrínsecos de los hematíes (con o sin anemia hemolítica autoinmune).

2. Aloanticuerpos en un receptor reciente de una transfusión que reacciona con los hematíes transfundidos.

3. Anticuerpos presentes en el plasma del donante que reaccionan con antígenos de los hematíes del receptor (poco frecuente).

4. Aloanticuerpos maternos que atraviesan la placenta y se fijan a los hematíes del hijo (suelen provocar EHRN).

Sin embargo, esta prueba no sólo puede ser positiva en presencia de anticuerpos antieritrocitarios, sino que también puede indicar:

a) Adsorción sobre la superficie eritrocitaria de complejos inmunes formados por ciertos medicamentos y su correspondiente anticuerpo (penicilina, quinidina, fenacetina).

b) Alteración de la superficie eritrocitaria por efecto de ciertos medicamentos como la cefalotina, la metildopa y otros.

c) Fijación inespecífica de inmunoglobulinas a los hematíes en pacientes con hipergammaglobulinamia (por ejemplo: cirróticos) o en pacientes tratados con dosis altas de Ig vía IV.

Por tanto, la prueba de Coombs está indicada siempre que exista sospecha clínica o biológica de hemólisis por mecanismo inmune:

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1. Anemia hemolítica autoinmune (hematíes sensibilizados por autoanticuerpos).

2. Anemia hemolítica inducida por fármacos. 3. Enfermedad hemolítica del recién nacido (hematíes sensibilizados por

anticuerpos anti-Rh producidos por la madre). 4. Reacción hemolítica postransfusional.

Cuando la prueba de Coombs sea positiva, debe procederse a investigar si lo que recubre la superficie eritrocitaria es una inmunoglobulina, el complemento o ambos simultáneamente. Asimismo, debe investigarse la naturaleza del autoanticuerpo existente (IgG, IgM). Por otra parte, no hay que olvidar la posibilidad de errores capaces de enmascarar el resultado de la prueba de Coombs, dando lugar en la práctica a falsos positivos y falsos negativos, cuyas causas generales son: 1. Falsos positivos:

• Sensibilización eritrocitaria in vitro por efecto de anticuerpos naturales o del complemento cuando se mantiene la sangre durante cierto tiempo a 4 º C antes de su análisis.

• Lavado insuficiente de los hematíes. • Fijación inadecuada de suero antiglobulínico que contiene anticuerpos

capaces de unirse a hematíes no sensibilizados. • Reacción con la sílice coloidal de los tubos de cristal. • Elevada reticulocitosis en la muestra de sangre analizada.

2. Falsos negativos:

• Tiempo insuficiente de incubación, que no permite alcanzar la aglutinación eritrocitaria.

• Dilución incorrecta del suero antiglobulina. • Suero antiglobulina de mala calidad. • Cuando el antisuero es de naturaleza IgA (debido a que los sueros

antiglobulina normalmente empleados carecen de anti-IgA). • Alteración del suero antiglobulina debido a mala conservación o

contaminación bacteriana. • Lavado inadecuado de los hematíes, que facilita la neutralización de los

anticuerpos fijados sobre ellos por las inmunoglobulinas plasmáticas o el complemento.

• Eliminación de los anticuerpos fijados sobre la superficie eritrocitaria mediante el lavado.

• Empleo de sangre caducada. • Empleo de placas o portaobjetos sucios, húmedos o con residuos de

jabón.

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El denominado Coombs-control se utiliza para detectar los falsos negativos. Consiste en hematíes sensibilizados con IgG, que se añaden a los tubos con resultado negativo (sin aglutinación). Dichos hematíes control sólo serán aglutinados si el suero de Coombs está libre (lo que confirma la negatividad del test). Si los tubos negativos no aglutinan con el suero Coombs-control, el test no es fiable y hay que repetirlo. Un test de Coombs positivo no indica necesariamente un acortamiento de la supervivencia de los hematíes. Este acortamiento que aparece cuando existe hemólisis se demuestra mediante el correspondiente estudio eritropatológico: haptoglobina, recuento de reticulocitos, determinación de bilirrubina y LDH, etc. El resultado de estas pruebas es lo que confirmará la existencia o no de hemólisis. PRUEBA DE COOMBS DIRECTO EN TARJETA Las tarjetas son un moderno método de rutina utilizado actualmente en los bancos de sangre para los estudios pretransfusionales. El sistema está formado por tarjetas que llevan varias microcolumnas, que constan de: Una zona superior donde se depositan los hematíes con o sin los sueros o antisueros (según la técnica), y en la que se originará la reacción de aglutinación. Una zona inferior que contiene un gel filtrante de dextrano (donde va el suero de Coombs o los antisueros específicos, según la técnica), que durante la centrifugación permitirá el paso de los hematíes libres, pero no el de los aglutinados, que serán retenidos por su mayor tamaño. Cuanto mayor sean los aglutinados, menos hematíes atravesarán el gel, lo que indica una mayor intensidad de reacción, que se expresa en cruces. Existen varios tipos de tarjetas:

a) Tarjetas que llevan un medio salino inerte con o sin enzimas (se utilizan para estudio ABO, pruebas cruzadas en frío, etc) y

b) Tarjetas que llevan suero antiglobulina humano, también denominado de Liss-Coombs (el medio tiene un potencial iónico bajo que facilita la sensibilización), y que se utilizan para el Coombs directo, para pruebas cruzadas en fase de Coombs indirecto, etc.

Material

• Tarjetas de Liss-Coombs. • Diluyente 2 ó Liss.

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Procedimiento

• Se diluyen 10 µL del sedimento de la sangre del paciente (anticoagulada con EDTA) en 1 mL del diluyente 2 y se mezcla.

• Coger 50 µL de la mezcla y echar en un microtubo. • Incubar 2 minutos a temperatura ambiente. • Centrifugar y leer. • Si es positivo, montar la técnica con sueros monoespecíficos (anti-IgG,

anti-IgM, anti-IgA, anti-C3). Interpretación La misma que la de la técnica en tubo.

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ESTUDIO DE LA COMPATIBILIDAD SANGUÍNEA: PRUEBA CRUZADA MAYOR, FASES DE LECTURA E INTERPRETACIÓN INTRODUCCIÓN La inmunohematología es la parte de la hematología que estudia los procesos inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relación con los elementos sanguíneos. Uno de los aspectos más importantes comprende el estudio y la cuantificación de los llamados grupos sanguíneos eritrocitarios (componentes antigénicos presentes en la superficie de los eritrocitos) ya que están relacionados directamente con la terapéutica transfusional y la prevención de accidentes hemolíticos graves secundarios a ella. Todas las pruebas pretransfusionales intentan detectar reacciones antígeno-anticuerpo potenciales antes de que la sangre sea transfundida. Para descartar incompatibilidades entre el donante y el receptor, las premisas generales son las siguientes:

1. Asegurar la compatibilidad ABO. Pueden usarse concentrados de hematíes ABO-compatibles si no se dispone de sangre ABO-específica.

2. Utilizar sangre del mismo grupo Rh0 (D), lo que es especialmente

importante en mujeres antes de la menopausia. En una gran emergencia puede transfundirse sangre Rh0 (D) positiva a un paciente Rh0 (D) negativo no sensibilizado, pero ésta es una decisión que debe tomar el director médico y el clínico del banco de sangre, porque existe un 60-70 % de riesgo de formar anti-Rh0 (D). Puede darse inmunoglobulina anti Rh0 (D), sobre todo si el paciente es una mujer en edad fértil. Cuando el donante y el receptor pertenecen al mismo grupo ABO y RH0 (D), la transfusión será compatible en el 98 % de los casos.

3. Para asegurar la compatibilidad del 2 % restante, son fundamentales:

a) El estudio de anticuerpos irregulares clínicamente importantes en el suero del receptor.

b) La prueba de compatibilidad directa entre el suero del receptor y los hematíes del donante.

No debe olvidarse que la identificación inequívoca de las muestras de sangre, tanto del receptor como del componente o componentes a transfundir, es un aspecto fundamental, dado que la mayor parte de las reacciones hemolíticas tienen su origen en errores de identificación y/o de trascripción. Por ello, el banco

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de sangre debe disponer de un sistema que garantice la identificación correcta del paciente y el etiquetado correcto de la sangre que ha sido objeto de la prueba cruzada. La clasificación ABO, las pruebas Rh0 (D) y la detección de anticuerpos irregulares se hacen con cada nueva muestra de paciente. No es posible confiar en registros anteriores para esta información, aunque todos los resultados de pruebas de laboratorio deben conservarse para poder comparar los actuales con los anteriores. Cualquier discrepancia debe resolverse antes de entregar la sangre al paciente. Mientras las pruebas cruzadas se están realizando, aplicar a la unidad de sangre un rótulo con los datos de identificación del posible receptor, y colocarla en la zona del refrigerador reservada a “sangre de pruebas cruzadas”. Las pruebas de compatibilidad se efectúan antes de transfundir la sangre, para asegurarse de que los hematíes del donante son compatibles con el paciente. Comprende las siguientes determinaciones:

1) Tipaje correcto del grupo ABO y Rh del receptor. El grupo sanguíneo y Rh de una persona no cambian, pero siempre existe el peligro de identificación incorrecta de las muestras sanguíneas.

2) Determinación de anticuerpos irregulares en el suero del receptor, para poder administrar sangre solamente de aquellos donantes que carecen de los antígenos específicos.

3) Tipaje correcto de los grupos ABO y Rh del donante. 4) Realización de un autocontrol de los hematíes del receptor. Si es positivo

(los hematíes autólogos en diluyente Liss muestran aglutinación), se realiza un Coombs directo con los hematíes del receptor.

5) Pruebas cruzadas. Son el último estudio que se realiza en busca de incompatibilidad entre la sangre del donante y del receptor. Aún cuando no es posible efectuar un estudio completamente exhaustivo en busca de incompatibilidad antes de cada transfusión, la prueba cruzada debe ser lo más completa posible, a fin de proteger al paciente. Hay que tener en cuenta que, excepto en las transfusiones entre gemelos univitelinos y en las transfusiones autólogas, ninguna sangre puede ser 100 % compatible.

PRUEBA CRUZADA MAYOR Las pruebas cruzadas son importantes, ya que confirman “in vitro” que la transfusión prevista será bien tolerada y probablemente eficaz. Se distinguen:

a) Prueba cruzada mayor: Consiste en enfrentar suero del paciente con hematíes del donante bajo condiciones óptimas para la actividad de los anticuerpos en el laboratorio. Se realiza para demostrar la posible existencia en el suero del paciente de anticuerpos hemolizantes, de

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revestimiento (incompletos) y/o aglutinantes contra los hematíes del donante.

b) Prueba cruzada menor: El suero del donante se enfrenta con los hematíes

del paciente. Debido al empleo generalizado de concentrados de hematíes, esta prueba ya no se utiliza en muchos hospitales. Y aunque toda unidad con investigación de anticuerpos irregulares positiva es rechazada por el banco de sangre, puede ocurrir que posea anticuerpos a bajo título o de baja incidencia no detectados por los reactivos habituales, por lo que cuando se administre un gran volumen de plasma es aconsejable la realización de esta prueba cruzada menor, para detectar la posible existencia en el donante de estos anticuerpos contra los hematíes del receptor.

Para la prueba cruzada debe utilizarse suero del receptor y no plasma, ya que la mayoría de los anticoagulantes actúan quelando los iones calcio, lo que impide la activación del complemento, por lo que algunos anticuerpos que fijan el complemento no podrán ser detectados si se emplea sangre anticoagulada. Además las muestras de sangre deben estar completamente coaguladas, pues si no los restos de fibrina atrapan los hematíes del donante y la diferenciación entre coágulos y aglutinados es difícil de establecer. Para preparar la suspensión de hematíes del donante se debe usar sangre de los segmentos herméticamente sellados derivados de la bolsa hemática (tubo colector). Los hematíes y el suero han de ser incubados durante el tiempo suficiente para que puedan reaccionar incluso los anticuerpos muy poco potentes. En general, sólo los anticuerpos reactivos a 37º C y/o en fase de antiglobulina serán importantes desde el punto de vista clínico. Por ello es necesario añadir suero antiglobulina después de la incubación, para detectar los anticuerpos que recubren a los hematíes pero que no llegan a aglutinarlos. La prueba debe comprobarse mediante controles. Es muy importante para la sensibilidad de la prueba el cociente suero/células, por lo que siempre que sea posible la proporción debe ser de 4 volúmenes de suero por cada volumen de la suspensión de hematíes al 2-5 % en suero salino isotónico. La prueba cruzada mayor puede hacerse usando uno o dos tubos. Cuantos menos tubos se usen en el procedimiento sanguíneo cruzado, menos son las posibilidades de confusión y error. La prueba debe ser lo más sencilla posible para evitar las equivocaciones.

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Debe usarse en todo el banco de sangre una forma única de clasificación de los resultados en grados, para facilitar su comparación. Un sistema comúnmente utilizado es el siguiente:

4+ 1 agregado sólido 3+ Varios agregados grandes 2+ Agregados de tamaño mediano con fondo claro 1+ Agregados pequeños con fondo rojizo W+ Agregados diminutos, con fondo rojizo turbio 0- Suspensión lisa sin agregados H Hemólisis, que debe interpretarse como reacción positiva

También puede hacerse una “prueba cruzada titulada” empleando diluciones dobles progresivas.

REALIZACIÓN

1. Colocar en un tubo de hemólisis rotulado 2 gotas de suero del paciente y 1 gota de la suspensión salina al 5 % de los hematíes del donante (Fig. 1).

2. Incubar a temperatura ambiente (22 - 24 ºC) durante 15 minutos. Centrifugar a unas 1.500 r.p.m. durante 1 ó 2 minutos.

Fig. 1: Prueba cruzada mayor.

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3. Leer la reacción (fase salina) con ayuda de un espejo de aumento iluminado, rotando suavemente las células del botón de hematíes, y registrar los resultados en ese mismo momento (no confiar en la memoria, pues aumenta las posibilidades de error).

4. Agregar 2 ó 3 gotas de albúmina bovina 20 -30 % al tubo anterior. 5. Incubar a 37º C durante 30 minutos. Centrifugar. 6. Leer (fase albuminosa) y registrar los resultados como en el punto 3. 7. Lavar 3 ó 4 veces los hematíes con solución salina isotónica y

después del último lavado decantar completamente. 8. Agregar 2 gotas de suero antiglobulina al tubo. Centrifugar. 9. Leer (fase de antiglobulina o fase de Coombs) y registrar los

resultados como en el punto 3. Si la prueba cruzada es negativa: 10. Agregar una gota de hematíes de control de Coombs a cada tubo

negativo. Centrifugar, leer y registrar. Pueden aplicarse diversas modificaciones de la Prueba Indirecta de la Antiglobulina para favorecer la detección de anticuerpos: Hematíes tratados con enzimas: Los hematíes que se utilizan en la fase de antiglobulina de las pruebas cruzadas pueden tratarse con enzimas proteolíticas (papaína, ficina, bromelina o tripsina), que separan de la membrana del hematíe las proteínas portadoras de ácido siálico, cargado negativamente. Por ejemplo, la bromelina resulta útil como prueba cruzada “adicional” en el estudio de receptores que han sufrido reacciones transfusionales. Esto favorece la sensibilización y la aglutinación por algunos anticuerpos clínicamente significativos (como Rhesus y Kidd). Algunos antígenos (como M, N, S y Duffy) son destruidos por el tratamiento enzimático, por lo que sus anticuerpos no son detectados. El tratamiento enzimático también aumenta la reacción de algunos autoanticuerpos de frío que clínicamente carecen de importancia, como el anti-I. Solución salina de bajo potencial iónico (LISS): Cuando la técnica de la antiglobulina se efectúa con los hematíes del donante suspendido en solución salina normal, se necesita un tiempo de incubación de 30-60 minutos para lograr un máximo de fijación de los anticuerpos a los antígenos de los hematíes. Si los hematíes se suspenden en una solución LISS, el período de incubación puede reducirse a 5-10 minutos. Albúmina: La adición de albúmina a los hematíes suspendidos en medio salino normal aumenta la tasa de sensibilización, permitiendo un tiempo de incubación más corto. Después de completar las pruebas sanguíneas cruzadas, si hay compatibilidad consignarlo en el rótulo de la unidad y completar el registro de compatibilidad. Este rótulo o etiqueta debe permanecer unido a la bolsa de sangre hasta completar la transfusión.

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INTERPRETACIÓN La aglutinación indica que algún anticuerpo del suero del receptor se ha unido a hematíes del donante, por lo que se dice que la prueba cruzada es incompatible. La prueba cruzada es compatible si no existe aglutinación, pues indica que no hay anticuerpos eritrocitarios en el suero del receptor. Como ya se ha indicado, todas las pruebas de antiglobulina negativas deben ser comprobadas para asegurar que la técnica se ha realizado correctamente. Si los resultados son correctos, los hematíes del control de Coombs deben ser aglutinados; si esto no ocurre, la prueba no es válida y debe repetirse. Entre las causas de una prueba falsamente negativa están: Olvidarse de añadir el suero antiglobulina humana. Reactivo de antiglobulina carente de anticomplemento. Lavado incorrecto de los hematíes reaccionantes (se dejan residuos de proteínas plasmáticas humanas que neutralizan el suero antiglobulina, invalidándolo). Uso de suero viejo. La muestra empleada no debe tener más de 48 horas, conservada en refrigeración. Uso de una suspensión celular densa (debe ser del 2-4 %). Centrífugas mal calibradas. Incubador a temperatura inapropiada.

Investigación de anticuerpos

irregulares

Prueba cruzada

Causa de la aglutinación

Compatible para la

transfusión +

_

*El Ac reacciona con algún Ag de los hematíes reactivo, pero no reacciona con los hematíes del donante

Posiblemente (fenotipar los hematíes del donante para confirmar la compatibilidad)

_

+

*El Ac reacciona con un Ag de baja incidencia *Los hematíes del donante son Coombs directo positivo *Error de técnica→ repetir

No

+

+

*El Ac reacciona con algún Ag de los hematíes del donante y de los hematíes reactivo

No

_

_

*No se detecta Ac

Sí

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Los anticuerpos solamente serán detectados mediante la prueba cruzada si los hematíes del donante poseen el antígeno correspondiente. Para asegurar la detección de todos los anticuerpos clínicamente significativos, el suero del paciente se incuba con 2 ó 3 muestras seleccionadas de sangre del grupo 0, que expresen los antígenos más corrientes de los principales sistemas de grupos sanguíneos. Esto se denomina investigación de anticuerpos irregulares. La aglutinación de alguna de las muestras de hematíes reactivo empleadas significa la presencia de un anticuerpo específico. Dicho anticuerpo puede identificarse enfrentando el suero del receptor con un panel de hematíes fenotipados (el mismo procedimiento que se utiliza en la prueba cruzada, pero sustituyendo los hematíes del donante por hematíes del grupo 0 extensamente fenotipados). Los anticuerpos dirigidos contra antígenos de baja frecuencia que no están en los hematíes reactivo, no serán detectados. Si los hematíes del donante en potencia poseen dicho antígeno de baja frecuencia, la incompatibilidad sería detectada en la prueba cruzada. OBSERVACIONES GENERALES SOBRE LAS PRUEBAS CRUZADAS: Un factor que puede confundir las pruebas cruzadas es el fenómeno “rouleaux”, donde los hematíes aparecen formando como pilas de monedas. Para comprobar que no se trata de una aglutinación, se usa la técnica del reemplazo salino:

1. Después de incubación y resuspensión, volver a centrifugar la mezcla suero-células y remover el suero.

2. Reemplazar el suero con 2 gotas de solución salina y mezclar. 3. Centrifugar la mezcla de células salinas. 4. Volver a suspender la mezcla de células salinas y observar la

aglutinación. Los rouleaux se dispersan pero la verdadera aglutinación permanece.

Una prueba cruzada negativa no asegura una supervivencia normal de los eritrocitos después de transfundir la unidad. Los pacientes pueden tener anticuerpos muy débiles (concentración menor del nivel de detección) en el momento de la prueba cruzada, pero al transfundir, el antígeno específico queda expuesto al sistema inmune, y a menudo el anticuerpo reaparece con título y avidez mayores (respuesta inmune secundaria), y la supervivencia de los glóbulos rojos se acorta después de la transfusión. Cada vez que un paciente es transfundido existe la posibilidad de que esos hematíes produzcan una estimulación secundaria. Por ello, tras 24 horas de la transfusión, si se precisa otra, se debe extraer una nueva muestra de sangre del receptor y realizar una nueva prueba cruzada. Con esto se podrá poner en evidencia cualquier anticuerpo recién adquirido, a la vez que se asegura la presencia de complemento en la prueba cruzada (los niveles de complemento en suero viejo son muy bajos, por lo que las reacciones Ag-Ac que fijen el

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complemento no podrán ponerse de manifiesto, y esa incompatibilidad no será detectada). Como medida de precaución, se deben conservar en el refrigerador muestras del donante y del receptor al menos hasta 4 días después de la transfusión. Las pruebas realizadas en fase salina a temperatura ambiente son capaces de descubrir varios tipos de incompatibilidades en el sistema ABO, anticuerpos anti-P, anti-MNSs, anti-Lewis y algunos otros anticuerpos aglutinantes fríos. Las pruebas realizadas en fase albuminosa a 37 ºC se realizan tras la de temperatura ambiente si ésta ha sido negativa. Estas pruebas permiten evitar “in vivo” reacciones debidas a anticuerpos aglutinantes de los sistemas Rhesus y Lewis fundamentalmente. Las pruebas en fase de antiglobulina detectan anticuerpos de clase IgG, es decir, inmunoglobulinas no aglutinantes. Esta prueba detecta prácticamente la totalidad de anticuerpos Rhesus y algunos otros anticuerpos dirigidos contra antígenos de los sistemas Duffy, Kell y Kidd. La responsabilidad final de la calidad de la sangre que se transfunde recae en la persona que efectúe la prueba cruzada. Por ello es muy importante recordar: Leer cuidadosamente las etiquetas. No utilizar nunca muestras contaminadas o de fechas atrasadas. Examinar siempre la unidad de sangre que se va a transfundir, para descartar la presencia de coágulos, ictericia, turbidez anormal y hemólisis (cualquiera de estas situaciones es causa de rechazo de la bolsa hemática, por lo que no podrá transfundirse). Indicar el nombre del receptor en la etiqueta, de modo que pueda leerse sin confusión.

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TEMA 11. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO. PRINCIPIOS,

TÉCNICAS Y UTILIDAD. INTRODUCCION Inmunología es la rama de la ciencia que estudia la inmunidad. Esta se considera como la resistencia del organismo a las agresiones que pueda sufrir, sean de microorganismos, venenos, etc. El hombre, como cualquier otro animal, posee unos sistemas que ante la invasión de sustancias extrañas al organismo, generalmente microorganismos, las reconoce y posteriormente las destruye. Los animales vertebrados tienen dos grandes tipos de sistemas que confieren la resistencia o el estado de inmunidad frente a los agentes patógenos:

A) Uno, del que forman parte elementos celulares como fagocitos (macrófagos), células NK (natural killer o asesinas naturales), factores humorales bactericidas o bacteriostáticos (lisozima, PCR, complemento, interferón).

• Este sistema es natural, es decir, sus componentes están siempre presentes y dispuestos para actuar inmediatamente sin requerir ningún fenómeno que induzca su generación.

• Carece de especificidad, es decir actúan sobre gran variedad de microorganismos sin que posean un mecanismo de reconocimiento que les permita distinguir selectivamente unos de otros.

• Tampoco presenta memoria, es decir que no aumentan su eficacia al responder al mismo microorganismo en un segundo contacto con él.

B) El segundo sistema inmunitario es mas complejo y eficaz. Son

responsables de este sistema los linfocitos y los anticuerpos. Aquellos se unen a las sustancias extrañas (Antígenos) provocando su destrucción. Asimismo producen unas sustancias, llamadas anticuerpos, que también se unen a las sustancias extrañas provocando una serie de reacciones tendentes a eliminar el antígeno del organismo.

• Este segundo sistema tiene la capacidad de memoria. Es decir que en un futuro contacto con el mismo antígeno, se repite el mismo proceso inmunitario pero con mayor intensidad y en un tiempo mucho más corto.

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• También es específico, es decir, las células y las sustancias (Ac.) que forman parte de él, reconocen a las sustancias extrañas (antígenos) actuando sobre ellas. Es decir tienen receptores específicos por cada uno de los antígenos que puedan existir.

• Finalmente, y al contrario que el primer sistema, los anticuerpos necesitan un estímulo antigénico para que se produzcan en el organismo.

Los dos sistemas el innato y el adaptativo no actúan separadamente sino que interaccionan ayudándose uno a otro REACCION ANTIGENO - ANTICUERPO Las técnicas inmunológicas se basan, casi todas, en las reacciones Ag.-Ac. y enlas manifestaciones que de dicha reacción se derivan. Definiremos los conceptos de antígeno y anticuerpo. ANTÍGENO: Es una sustancia extraña al organismo capaz de inducir una respuesta inmunitaria, es decir, capaz de provocar la aparición de anticuerpos o de células que actúan sobre ella. En la superficie del antígeno existen unas estructuras, trozos o fragmentos moleculares, que son las que verdaderamente van a reaccionar con el anticuerpo y con las células que las van a atacar. Estos fragmentos se llaman determinantes antigénicos o epítopos. Un Ag. es más inmunogénico cuanto mayor número de determinantes antigénicos posea. Puede haber en un Ag. varios determinantes antigénicos del mismo tipo o diferentes. Pueden reaccionar todos con el Ac. o Acs. o no. El nº de determinantes antigénicos presentes en un Ag. es la valencia total del antigeno. El nº de moléculas de Ac. que se pueden unir al mismo tiempo con el Ag., o lo que es lo mismo, el nº de determinantes antigénicos expuestos, es la valencia efectiva o funcional del antígeno. La composición química del Ag. puede ser variada. En general son proteínas, aunque también pueden ser lípidos o glúcidos, pero tienen menor poder antigénico o inmunogénico. Los antígenos particulados, como virus, bacterias o hematíes extraños, son altamente inmunogénicos.

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A) FACTORES QUE AFECTAN LA ANTIGENICIDAD: Naturaleza química: Dependiendo de si son proteinas, hidratos de carbono o lípidos, son mas o menos antigénicos. Tamaño: Cuanto mayor sea la molécula de antígeno mas poder inmunogénico tendrá. Ejemplo, si el Ag. tiene 25 aminoácidos será mas inmunogénico que si tiene 6. Complejidad: Cuanto mas complejo sea el antígeno mayor poder inmunogénico. Ej., Si el Ag. está formado por cadenas polipeptídicas de un sólo aminoácido, será menos inmunogénico que las de varios aminoácidos diferentes. Conformación: La configuración espacial (tridimensional), es decir, la estructura 3º de las moléculas influyen en su antigenicidad. Ej. Ags. que químicamente son iguales tienen diferente poder antigénico cuando varía la situación espacial de algunos determinantes antigénicos. Accesibilidad: Cuanto mas soluble es un Ag. mas poder antigénico tendrá, ya que será mas accesible a todas las partes del organismo. Concepto de extraño: Generalmente las sustancias extrañas son las que provocan respuestas inmunes. Serán mas inmunogénicas las sustancias mas distantes, evolutivamente hablando, entre el Ag. y el huesped. Ej., si la albúmina de un ratón se inyecta a un hombre tendrá más poder inmunogénico que si inyectamos la albúmina de un primate. Genética: La respuesta inmune está bajo control genético. Ej., a ratones se le inyecta un Ag., y responden fuertemente, a otros ratones, con otra base genética, al inyectarle ese mismo Ag. no responden de la misma forma o no responden. Modo de administrar los antígenos: El hecho de que un Ag. induzca una respuesta inmunitaria depende de la dosis y de la forma de administración. B) HAPTENOS: Hay sustancias de estructura química muy simple que son capaces de unirse a los Acs., una vez formados estos, ya que por si mismas son incapaces de provocar su formación. Son los llamados HAPTENOS. Para que sean inmunogénicas (que provoquen la producción de Acs.) hay que unirlas a otras sustancias más complejas, generalmente proteínas. Estas sustancias se denominan transportadores o "carrier".

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ANTICUERPOS: Son moléculas sintetizadas por los linfocitos B, en respuesta a un estímulo antigénico, que tienen la propiedad de unirse específicamente al Ag. que indujo su formación. Son proteínas de peso molecular elevado a las que se les llama Inmunoglobulinas (Ig.), ya que migran en la electroforesis a la fracción globulínica. Existen 5 tipos de Igs.: Ig. G, Ig. A, Ig. M, Ig. D, Ig. E. Dentro de estos tipos existen una gran variedad de subtipos, clases, subclases etc. Difieren según su carga, tamaño, composición de aminoácidos, contenido en carbohidratos, enlaces entre cadenas, etc. Dado que un animal puede fabricar Acs. específicos contra todas las moléculas que existen en la naturaleza, el nº de Acs. específicos que puedan hallarse en un momento dado puede ser del orden de varios millones. Los Acs. pueden encontrarse libres y circulante por el plasma, pero algunos, como las Ig.E se encuentran asociadas a células. Normalmente el organismo no desarrola Acs. contra sus propios componentes. Cuando lo hace estamos ante una enfermedad autoinmune. Cuando un Ac. entra en contacto con un Ag. contra el que está dirigido, ambos se unen formándose un complejo Ag-Ac o complejo inmune o inmunocomplejo. Esta unión es reversible y su permanencia depende del grado de adaptación entre ambas moléculas y de la fuerza y estabilidad de los enlaces que las unen. Una característica de la reacción Ag.-Ac. es la especificidad. Cuando un Ac. solo es capaz de reaccionar contra un Ag., se dice que ese Ac. es muy específico. La reacción Ag.-Ac. puede mostrar un alto grado de especificidad distinguiendo pequeñas variaciones de la estructura del Ag., carga, configuración óptica, conformación espacial, etc. METODOS SEROLOGICOS Se llaman así porque el suero sanguíneo es el vehículo habitual de los Acs. Estos métodos están basados generalmente en la reacción Ag.-Ac. Otros métodos se basan en el aislamiento de las diferentes poblaciones linfocitarias. Son muy útiles ya que podemos estudiar un Ag. disponiendo de su Ac. correspondiente o viceversa. Las pruebas serológicas se caracterizan por su:

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A) Especificidad: Es la capacidad que presenta la prueba de distinguir entre Ags. o Acs. (depende de lo que busquemos) de estructura muy similar. B) Sensibilidad: Es la cantidad de Ag. o Ac. (depende de lo que busquemos) que es capaz de detectar. Fines de las pruebas serológicas: A) Cualitativos: Cuando sólo se persigue conocer si en una muestra existe o no Ag. o Ac., no nos interesa la cantidad. B) Cuantitativos: Cuando pretendemos saber la cantidad de Ag. o Ac. presente en la muestra. Lo podemos saber:

• Semicuantitativamente: Se logra saber de manera aproximada la cantidad de Ag. o Ac. presente en la muestra. Esto se consigue mediante el título de Ac.: La inversa de la máxima dilución de la muestra que enfrentada a una cantidad standard del Ag. sigue manifestando positividad.

• De una manera exacta: o cuantitativas propiamente dichas, en los que el resultado se expresa de una manera exacta. Se dará en mg, ml, ìg, ìl. etc.

INMUNOANALISIS CON MARCADORES Se basan en utilizar moléculas indicadoras unidas al Anticuerpo o al Antígeno con el fin de demostrar que ha tenido lugar la reacción Ag- Ac., es decir demostrar la existencia del Ag. o el Ac. buscado. Estas pruebas se caracterizan por:

• Utilizar cantidades pequeñas de reactivos, se decir son microtécnicas.

• Ser muy rápidas en ofrecer los resultados (desde minutos a horas, generalmente menos de 24 horas.

• Poseen una máxima sensibilidad, es decir detectan cantidades muy pequeñas de Ac. o Ag.

• Son automatizables. Se clasifican según las moléculas indicadoras utilizadas:

• ENZIMOINMUNOANALISIS ( E.L.I.S.A. o E.I.A.): Se usa una enzima. • INMUNOFLUORESCENCIA (I.F.): Se usa un fluorocromo (colorante

fluorescente) • RADIOINMUNOANALISIS (R.I.A.): Se usa un isótopo radioactivo.

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INMUNOFLUORESCENCIA (I.F.) Son pruebas que utilizan sustancias fluorescentes (fluorocromos) unidas al Ac o al Ag. para demostrar que ha tenido lugar la reacción Ag.- Ac., es decir para demostrar que existe el Ac. o el Ag. buscado. Los fluorocromos son sustancias que sometidas a una fuente luminosa absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten luz a una longitud de onda mayor. Absorben luz ultravioleta y emiten fluorescencia (luz visible). Los fluorocromos usados habitualmente son:

• Fluoresceína: emiten fluorescencia de color verde. • Rodamina: " " " " anaranjada.

Para detectar la fluorescencia emitida se usarán:

• Microscopio de fluorescencia. • Fluorímetros.

TIPOS DE REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA: A) INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA: Se utiliza para la detección de Antígenos con ayuda de un Ac. marcado. Se usa para identificar microrganismos en un material clínico (líquidos, tejidos, etc.). Fases:

1.- Fijación de la muestra (Ag.) en un portaobjetos. 2.- Se cubre la preparación con el Ac. específico marcado. 3.- Se lava para eliminar el exceso de Ac: fluorescente. 4.- Se observa al microscopio de fluorescencia.

La observación de microorganismos fluorescentes indica que se ha producido la reacción Ag.- Ac.

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Es una técnica rápida, pero su uso está limitado por la necesidad de disponer de un Ac. específico marcado por cada Ag. que queramos detectar. Se usa esta técnica en la detección de diferentes gérmenes en las muestras biológicas. Ejemplo para el bacilo de Koch. B) INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA: Se utiliza para la identificación de Ac. libres presentes en el suero. Fases:

1. 1. Fijamos en una fase sólida (portaobjetos) Ags. específicos de los Acs. que buscamos.(Estos portaobjetos se obtienen en el mercado con sus correspondientes Ags.)

2. Se añade la muestra problema (Ac buscado). 3. Se añade Antisuero marcado (Antiglobulina marcada) uniéndose

de esta forma con el Ac. de la muestra causando la fluorescencia del Ag.

Este método es mas sensible que el anterior y además tiene la ventaja de que para la investigación de Acs. en suero humano solo requiere un Ac. marcado, la antiglobulina marcada. Tiene muchísimas aplicaciones. Ejemplo, para detectar Acs. contra los toxoplasmas, contra el virus de Epstein-Barr (mononucleosis infecciosa),para el diagnóstico de la sífilis, etc. C) MÉTODO SANDWICH: Se usa para detectar Acs. unidos a células. Fases:

1.- Se fija el material clínico en un portaobjetos.

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2.- Se añade el Ag. específico del Ac. buscado. 3.- Se añade un Ac., igual al buscado, pero marcado. 4.- Observación al microscopio de fluorescencia.

Este último método, al igual que otro que usa el complemento, no se usa frecuentemente. ENZIMOINMUNOANALISIS (ELISA) Son pruebas que se basan en la detección de la reacción Ag.-Ac. mediante el empleo de Ags. o Acs. marcados con una enzima. La presencia de la enzima en el inmunocomplejo es detectada por una reacción coloreada que se produce al añadir un sustrato. Una sola molécula de enzima puede convertir millones de moléculas de sustrato en moléculas de producto. De ahí la alta sensibilidad de este procedimiento. Las enzimas usadas habitualmente como marcadoras son: peroxidasa, glucosa oxidasa, fosfatasa, etc. La medición de los cambios de color, como resultado de la conversión enzimática del sustrato a producto, se lleva a cabo habitualmente mediante un espectrofotómetro. Actualmente, al ser casi todas las técnicas automatizadas, se utilizan lectores de placas que llevarán un espectrofotómetro incorporado. Se pueden dividir los ensayos de ELISA en: * ELISA homogéneos, en los que la interacción antígeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima por lo que no hay que separar los componentes marcados enzimáticamente de los no marcados.

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* ELISA heterogéneos, en los que la reacción antígeno-anticuerpo no modifica la actividad del marcador enzimático. Estos métodos requieren la separación física del inmunocomplejo Ag.-Ac. de los constituyentes no fijados. Son los más usados Aunque se pueden hacer estas pruebas en fase líquida casi siempre se harán en fase sólida, es decir se utilizará un soporte para fijar el Ac. o el Ag. Los soportes pueden ser placas de microtiter, tubos de plástico, perlas de vidrio, etc. TIPOS DE REACCIONES DE ELISA EN FASE SÓLIDA: I) METODOS PARA DETECTAR ANTIGENOS: A) MÉTODO SANDWICH: Sirve para detectar Ags. grandes ( virus de la hepatitis, gonococo ...). Tienen que ser polivalentes ya que se tienen que unir a dos moléculas de Ac. Habrá varias etapas:

1. Se fija el Ac. específico del Ag. buscado en un soporte. 2. Se añade la muestra problema (con o sin el Ag. buscado). 3. Se añade el Ac. específico del Ag. buscado pero marcado con una

enzima. 4. Se añade un sustrato incoloro, específico de la enzima empleada,

y se mide el cambio de color producido al transformarse el sustrato en producto.

La intensidad del color medido será directamente proporcional a la cantidad de Ag. que haya en la muestra.

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Los resultados se compararán con soluciones patrones. B) MÉTODO DE UNIÓN COMPETITIVA: Se utiliza para detectar drogas, hormonas, etc, en líquidos biológicos. Etapas:

1. Se fija el Ac. específico del Ag. buscado a un soporte: 2. Se añade una mezcla que contiene la muestra problema (Ag.

buscado) y una solución con Ag.( igual al que queremos estudiar) marcado con una enzima

3. Se mide la cantidad de Ag. marcado que se ha fijado al Ac. unido al soporte, mediante la adición de un sustrato:

La concentración del Ag. problema será inversamente proporcional a la intensidad del color medido. Se compararán los resultados con soluciones patrones. II) METODOS PARA DETECTAR ANTICUERPOS: A) MÉTODO INDIRECTO: Etapas:

1. Fijamos a un soporte el Ag. específico del Ac. que buscamos. 2. Se añade la muestra problema( tendrá o no el Ac. buscado). 3. Se añade la antiglobulina marcada con una enzima. 4. Se mide el cambio de color producido al añadir un sustrato incoloro.

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La intensidad del color medido será directamente proporcional a la cantidad de Ac. presente en la muestra. Los resultados se compararán con soluciones patrones. Es la técnica de mayor aplicación para detectar Acs. por su elevada sensibilidad y especificidad, a la vez que por su posibilidad de automatización. Se utiliza, por ejemplo, para diagnosticar la rubéola, SIDA, citomegalovirus, etc. B) MÉTODO SANDWICH: Etapas:

1.- Se fija al soporte una antiglobulina del Ac que buscamos. 2.- Se añade la muestra problema (con o sin el Ac que buscamos). 3.- Se añade un Ag. específico del Ac. que buscamos. 4.- Se añade un Ac., igual al buscado pero marcado con una enzima. 5.- Se mide el cambio de color al añadir un sustrato incoloro.

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La intensidad del color medido será directamente proporcional a la cantidad de Ac. presente en la muestra. Se compara los resultados con soluciones patrones. C) MÉTODO DE UNIÓN COMPETITIVA: Se usan sobre todo para detectar Ac del tipo Ig.M. Etapas:

1. Se fija a un soporte el Ag. específico del Ac. que buscamos. 2. Se añade el suero problema (con el Ac. buscado) mezclado con

Ac. (igual al buscado) marcado con enzima:

3. Se mide la cantidad de Ac. marcado que se ha fijado al Ag., midiendo la cantidad de color que se forma cuando se añade un sustrato incoloro.

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La concentración de Ac. en la muestra será inversamente proporcional al color medido por el espectrofotómetro. Se compararán los resultados con soluciones patrones. RADIOINMUNOENSAYO (R.I.A.) Son pruebas que detectan el complejo Ag. - Ac. formado mediante el marcaje con isótopos radiactivos del Ag. o del Ac. Los isótopos radiactivos usados habitualmente son:

- Carbono 14 (14C), Fósforo 32 (32P), Tritio (3H). Emiten radiación â. - Iodo 125 (125I), Iodo 131 (131I), Cobalto 57 (57Co). Emiten radiación ã.

Los aparatos detectores de la reacción son los contadores de centelleo de rayos ã o â, según el radioisótopo usado como marcador. Estos aparatos miden la radiactividad. Aunque son las pruebas más sensibles, presentan una serie de desventajas:

o Hay que manipular radioisótopos, con el peligro que esto conlleva.

o Hay que tener una serie de normas de seguridad muy estrictas. No todos los laboratorios pueden aplicarlas..

o El instrumental que hay que utilizar es complicado y caro. o La vida media de los isótopos usados habitualmente es muy

corta, en comparación a la de las enzimas. 57Co: 271,3 días, 125I: 60 días.

Hay métodos en los que se inmoviliza el Ag. o el Ac. en una fase sólida y otros en los que no (fase líquida). Los más utilizados son los primeros.

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Los métodos del RIA son los mismos del ELISA, los que mas se utilizan son los de unión competitiva. REACCIONES DE PRECIPITACION. Son unos métodos serológicos que se basan en detectar la reacción Ag.-Ac. por la formación de un precipitado visible y reversible. Es decir, si existe el Ag. o el Ac. buscado se produce la unión del Ag. con el Ac. y como consecuencia de esta unión se forma el precipitado. Es un efecto "in vitro" de la reacción Ag.-Ac., es decir solo se produce en el laboratorio para poner de manifiesto la reacción Ag.-Ac. Para que se produzca la reacción de precipitación es necesario que los Ags. y los Acs. sean multivalentes, ya que se tiene que formar una malla o red que finalmente precipita. Habrá unos Acs. que precipiten mejor que otros. El Ag. tiene que ser soluble, no particulado, por lo que se tendrá que formar una gran red antes de que el precipitado sea visible, requiriendo esto una gran cantidad de anticuerpos. Es pues una reacción poco sensible. Sin embargo es una prueba muy específica. Si a una solución con exceso de Acs. le vamos añadiendo concentraciones crecientes de Ag., y se representa el porcentaje de precipitación frente a la cantidad de Ag., se obtiene la curva siguiente:

Vemos que existen 3 zonas bien diferenciadas:

1. Prozona (Exceso de Ac.): Inicialmente no se forma precipitado. Se forman uniones Ag.-Ac. pero son altamente solubles debido al exceso de Acs. Cada molécula de Ag. está saturada de Acs. La formación de precipitado aumenta conforme aumenta la concentración de Ag.

2. Zona de equivalencia: Es la zona de máxima precipitación. Cada Ag. está

ligado a un Ac., que a su vez está ligado por su otra(s) valencia(s) a otro Ag. formándose de esta forma una gran red que precipita.

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3. Postzona (Exceso de Ag.): La adición continuada de Ag. da como

resultado la solubilización del precipitado debido a la formación de pequeños complejos con exceso de Ag. Cada molécula de Ac. está saturada de Ag., se une con varias moléculas de Ag., tantas como valencia tenga el Ac.; por tanto no se puede formar la malla necesaria para que se produzca la precipitación.

Para una mejor cuantificación del Ac. o Ag. es conveniente que la zona de equivalencia sea lo mas estrecha posible. Esto se conseguirá utilizando Ags. fácilmente solubles, así como que la muestra no tenga una mezcla excesiva de Acs. similares, ya que si no se producen diferentes uniones Ag.-Ac. ensanchando la zona de equivalencia. Aparte de la relación de proporción Ag.-Ac., existen otros factores que pueden afectar la precipitación:

- Especificidad y afinidad del Ac. - pH y la fuerza iónica del buffer en el que se desarrolle la reacción. - temperatura a que se incube la reacción. - peso molecular de los reactantes.

TIPOS DE REACCIONES DE PRECIPITACION: Las reacciones de precipitación se pueden realizar en un medio sólido o en medio líquido. Atendiendo a este criterio las vamos a clasificar. PRECIPITACION EN MEDIO LÍQUIDO: A) PRUEBA DEL ANILLO: La mezcla de un Ag. soluble y su Ac. correspondiente en un tubo da lugar a un precipitado visible unicamente si la proporción de Ag. y Ac. son las apropiadas. Se puede hacer la prueba de una manera cualitativa o cuantitativa. Cualitativa: Nos permite identificar un Ag. disponiendo de su Ac. específico, y viceversa. Las etapas de la reacción son:

1.- Colocar el Ac. en el fondo del tubo

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2.- Añadir el Ag. problema 3.- Reacción de precipitación

En caso de que exista el Ag. problema se formará, en la interfase de ambos líquidos, un disco de precipitado de color blanquecino. Esta reacción se usa para detectar la PCR, identificación de los grupos de Lancefield de los Streptococcus. La prueba cuantitativa se hace de la misma forma pero utilizando varios tubos con Ac y añadiendo a ellos cantidades crecientes de Ag. Se mide la cantidad de precipitado que se forma en cada tubo. Los resultados se llevan a una gráfica, como la anterior. En el tubo donde aparezca más cantidad de precipitado se cuantifica el Ag. problema, tubo que corresponde, en la gráfica a la zona de equivalencia. PRECIPITACION EN MEDIO SÓLIDO: Los Ags. y los Acs. pueden incorporarse a un medio gelificado (sólido) donde podrán difundir. En el lugar donde se encuentren en sus proporciones óptimas aparecerá una línea de precipitado. Se utiliza, fundamentalmente, para el estudio de Ags, disponiendo de Acs adecuados. Cada unión Ag.- Ac. da una línea de precipitado diferente e independiente. Se pueden hacer las pruebas de una manera cualitativa o cuantitativa. Las más importantes son: A) INMUNODIFUSIÓN SIMPLE EN TUBO (MÉTODO DE OUDIN): 1. El Ac., específico del Ag. que buscamos, se incorpora al agar fundido a 45ºC. Se introduce en tubos de pequeño diámetro donde solidifica. 2. Se deposita encima una solución adecuada del Ag.. 3. El Ag. difunde a traves del agar encontrandose con el Ac., que está repartido por todo el medio. En la zona donde el Ag. y el Ac. se encuentren en las proporciones adecuadas aparecerá una línea de precipitado.

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Es una prueba cualitativa. B) INMUNODIFUSIÓN RADIAL SIMPLE (MÉTODO DE MANCINI): Es una prueba cuantitativa. Las etapas son:

1. Se incorpora el Ac., específico del Ag. que buscamos, al agar fundido, que se deposita en placas de Petri o en láminas de vidrio. Una vez solidificado, se realiza sobre el agar diferentes pocillos.

2. Se añaden a los pocillos el Ag. a determinar. Se añadirán varios

Standard y las muestras problemas. El Ag. difundirá por el medio

sólido. 3. Donde se encuentren el Ac. (que está repartido por todo el medio)

y el Ag. en las proporciones adecuadas se producirá una línea de precipitado circular (anillo de precipitado).

El diámetro del anillo, su cuadrado, será proporcional a la cantidad de Ag. presente en cada pocillo. Se hará una curva de referencia con los Standards. En el eje de abcisa pondremos el cuadrado del diámetro de los anillos, y en el eje de ordenadas la concentración del Ag. Una vez hecha la curva se calcula la concentración de Ag. de la muestra problema. Se usa para cuantificar las diferentes proteínas plasmáticas. C) INMUNODIFUSIÓN RADIAL DOBLE (MÉTODO DE OUCHTERLONY): Este método cualitativo se realiza tambien en placa, pero a diferencia del anterior, donde solo se desplazaba el Ag., se desplazan tanto el Ag. como el Ac. en el medio soporte (agar).

1. Añadir a una placa o lámina de vidrio una capa de agar virgen fundido.

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Una vez solidificado se le hacen 2 pocillos adecuadamente separados, uno para el Ac. y otro para elAg.

2. El Ag. y el Ac. difunden radialmente en el seno del agar. Donde se encuentren en las proporciones adecuadas se formará una línea de precipitado.

La precipitación se produce en el punto de equivalencia Ag.- Ac.

La posición y forma de la línea de precipitado están dictadas por la concentración y el ta-maño del Ag. y del Ac.. La línea estará mas cerca del pocillo con el reactante de menor concentración, ya que la distancia recorrida es directamente proporcional a la concentración. Se suele utilizar para la detección de infecciones por Candidas y Aspergillus. D) ELECTROINMUNODIFUSIÓN SIMPLE O INMUNOELECTROFORESIS EN COHETE (ROCKET): Este método se basa en la aplicación de la corriente eléctrica a la inmunodifusión simple, obteniéndose resultados que también se pueden cuantificar. Un medio gelificado que contenga Acs. se introduce en un campo eléctrico, perpendi-cularmente al sentido de la corriente eléctrica se disponen pocillos que contienen las muestras problemas y los Standards. La difusión electroforética del Ag. a través del gel que contiene el Ac. permite la aparición de líneas de precipitado en forma de conos o cohetes. La distancia entre el pocillo y la punta del cono (altura del cohete) esm directamente proporcional al logaritmo de la concentración de Ag. que haya en la muestra.

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E) ELECTROINMUNODIFUSIÓN DOBLE El Ac. y el Ag. se colocan en pocillos próximos, como en una inmunodifusión doble. A continuación se aplica una corriente eléctrica de tal forma que el Ag. vaya a encontrarse con el Ac. Si se utiliza un pH óptimo (8) y un bajo voltaje permite que el Ac se desplace linealmente hacia el cátodo arrastrado por la fuerza endosmótica, en una dirección contraria a la corriente eléctrica, encontrándose con el Ag. que migra hacia el ánodo arrastrado por la fuerza eléctrica. En la zona donde el Ag. y el Ac. se encuentren en las proporciones optimas se formará una línea de precipitado. Es un método cualitativo muy rápido y más sensible que la inmunodifusión radial doble. F) INMUNOELECTROFORESIS: Es un procedimiento que se utiliza para identificar diferentes Ags. de una muestra. Esta técnica consta de 2 fases: 1º.- Electroforesis: Separación de los diferentes componentes (Ags.) de una muestra a estudiar, por su migración diferencial cuando se somete la muestra a un campo eléctrico. La diferente velocidad de migración dependerá de la carga de la partícula, pH del tampón, fuerza iónica del tampón, tamaño y forma de la partícula y el potencial del campo eléctrico aplicado. 2º.- Inmunodifusión: Los Ags separados se enfrentarán a sus Acs. específicos en el mismo medio soporte donde se han separado. Difundirán ambos; donde se encuentren en las proporciones optimas, se formarán tantas líneas de precipitado como uniones Ag.-Ac. haya.

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Pasos a seguir: 1. Colocar la muestra en un medio soporte

y separarla electroforéticamente. 2. Colocar los Acs., específicos de los Ags.

buscados, paralelamente al eje de migra-ción de los Ags.

3. Difusión de los Ags. y los Acs. Donde se encuentren en las proporciones óptimas se formarán las líneas de precipitado, que revelarán la presencia de los Ags buscados.

Se usa esta técnica, sobre todo, para identificar anomalías cualitativas de proteínas específicas o para analizar la composición de una mezcla de proteínas en líquidos biológicos. G) INMUNOELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL: Este método se utiliza como técnica de investigación para la separación analítica de Ags. estrechamente relacionados, con propiedades electroforéticas afines (variantes genéticas de algunas proteínas, heterogeneidad del factor VIII de coagulación etc.). Este procedimiento se realiza en 2 etapas y en ambas se emplea la electroforesis.

1. La mezcla de Ags., normalmente suero, orina, LCR, se somete a electroforesis en agarosa para separar sus componentes según su carga.

2. La tira de agarosa que contiene las proteínas separadas se transfiere a

una placa de soporte mayor. Sobre esta se vierte agarosa líquida que llevará disuelta Acs. contra todos los Ags. a analizar, haciendo contacto en un extremo con la tira de agarosa que contienen los Ags.

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3. Una vez solidificada la agarosa que contiene los Acs. se aplica una corriente eléctrica en dirección perpendicular a la primera separación electroforética a fin de que los Ags. migren hacia la agarosa que contiene los Acs. Se obtienen de esta forma unos arcos de precipitado nítidos, en forma de picos.

REACCIONES DE AGLUTINACIÓN Es una reacción serológica que comprende la agregación de una suspensión de Ags particulados cuando se unen a sus Acs. específicos. Es un método secundario ya que primero se une el Ag. y el Ac. que van formando agregados, estos empiezan a aumentar y finalmente se depositan. Cuando los Ags. que intervienen en la reacción son particulados "per se" la reacción se llama: aglutinación directa o activa. Como ejemplos de estos Ags. están las bacterias y los hematíes. Cuando los Ags., para que se produzca la reacción de aglutinación, tienen que ser acoplados a la superficie de células o partículas inertes (látex, bentonita...) la reacción se llama: aglutinación indirecta o pasiva. Cuando un Ac. se une a su Ag. particulado específico y se produce la aglutinación, se llama: Anticuerpo completo. Cuando un Ac. se une a su Ag. específico particulado y no se produce aglutinación se llama: Anticuerpo incompleto. Características de las reacciones de aglutinación:

o Son bastantes sensibles, ya que detectan cantidades pequeñas de Ag. o Ac.

o Son menos específicas que las reacciones de precipitación. o Son métodos cualitativos o semicuantitativos. o Son pruebas muy útiles, ya que se puede acoplar el Ag. o el

Ac. deseado a una partícula y así detectar su Ac. o Ag. específico.

o Se pueden observar a simple vista. Factores que influyen en la reacción de aglutinación: * Carga de las partículas: Las partículas poseen en suspensión una carga superficial negativa (potencial zeta) repeliéndose entre ellas. La unión con el Ac. ayuda a establecer puentes de unión entre las diferentes partículas produciéndose la aglutinación. Algunas veces no es suficiente y habrá que emplear diferentes sistemas para disminuir el potencial zeta. Uno de ellos es aumentar la viscosidad añadiendo sustancias como la albúmina. Otro es el tratamiento con enzimas proteolíticas cuando las partículas son hematíes.

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Tambien el buffer empleado puede disminuir las cargas (-) superficiales de las partículas. * Tipo de anticuerpo: Las Inmunoglobulinas del tipo Ig.M, debido a su tamaño, siempre van a aglutinar. Las del tipo Ig.G podrán aglutinar o no dependiendo de la subclase o de otros factores. En caso de no aglutinar se llamarían Acs. incompletos. * Concentración de electrolitos: Ya hemos comentado la influencia del buffer en las cargas (-) superficiales de las partículas. Para una mejor aglutinación será conveniente que la fuerza iónica del buffer sea lo mas baja posible. * pH: Debe ser el mas próximo al fisiológico. * Viscosidad: Cuanto mas viscoso sea el medio mejor se produce la reacción de aglutinación. Esto se puede conseguir añadiendo sustancias como la albúmina o el dextrano. * Antígenos: Un Ag. con un solo determinante antigénico nunca podrá aglutinar. Cuantos más determinantes antigénicos posea un Ag. la aglutinación se producirá mejor. * Temperatura y tiempo de incubación: La temperatura debe ser lo mas próxima a la fisiológica, aunque hay algunos casos en que la tª optima es 4º C. El tiempo de incubación será el mayor posible. * Agitación: Las técnicas que facilitan el contacto Ag. -Ac. como la agitación o la centrifugación facilitan la aglutinación. Tipos de reacciones de aglutinacion: A) AGLUTINACION DIRECTA: Se produce cuando se unen el Ac. y su Ag. específico particulado "per se", es decir de forma natural.

Se puede utilizar esta reacción de manera cualitativa o cuantitativa.

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a) Cualitativa: Se realiza en un portaobjetos o en un tubo, enfrentando un Ac. a una suspensión de Ags., de los que uno de ellos es desconocido. Tras una breve agitación se observa si hay aglutinación. Es una reacción de uso común para la identificación de bacterias y la determinación de grupos sanguíneos. b) Cuantitativa: Nos permite una estimación aproximada de los Acs. presentes en el suero, mediante la determinación del título de Ac. Esta técnica de utiliza habitualmente para el diagnóstico serológico de las infecciones por Brucella y Salmonella. Hay que tener en cuenta el efecto zona, es decir, cuando hay un exceso de Acs. en el suero problema se puede solubilizar el aglutinado. Esto se evitará empleando una batería amplia de tubos. B) AGLUTINACION INDIRECTA: Es la reacción de los Acs. con sus Ags. específicos solubles pero que han sido acoplados a la superficie de partículas. Se usan con frecuencia eritrocitos, humanos o no, bacterias, partículas inertes como látex o bentonita. Así un Ag. soluble al adsorberse en una partícula convierte la reacción Ag.-Ac. de precipitación a aglutinación, incrementándose enormemente la sensibilidad de la prueba. Son más sensibles las pruebas que usan como partículas portadoras de Ags. los eritrocitos que las que usan látex o bentonita. También se puede utilizar esta reacción de manera cualitativa o cuantitativa. Para detectar antígenos solubles se utiliza una variación de esta técnica, la aglutinación indirecta inversa, en la que en lugar de acoplar el antígeno a la +partícula acoplamos el anticuerpo específico del antígeno buscado. Esta técnica es la más utilizada en serología, por su bajo coste, su rapidez y su buena sensibilidad. Tiene el inconveniente de ser poco específica, por lo que ofrecerá falsos positivos. Pruebas típicas basadas en este método son: las pruebas reumáticas (Proteína C reactiva, Factores reumatoides, Waale- Rose, Singer-plotz, Antiestreptolisina), la RPR, la VDRL y la TPHA, que se usan en el diagnóstico de la sífilis, la del látex Criptococo etc.

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C) INHIBICION DE LA AGLUTINACION: Los Acs. reconocen y reaccionan con sus Ags. específicos. Puede suceder que en la muestra problema el Ag. esté en forma soluble (no unido a una partícula) por lo que se producirá la reacción Ag.-Ac. pero no se observará la aglutinación. Esta prueba es una adaptación de las reacciones de aglutinación que nos permite la detección y cuantificación de los Ags. solubles. La prueba se realiza en varias etapas: 1. Se añade a la muestra problema (Ag. soluble buscado) el Ac. específico del Ag. buscado. Si no se produce aglutinación puede deberse a 2 causas: a) Que no exista el Ag. buscado:

b) Que exista el Ag. buscado, pero que esté en forma soluble:

Para saber si existe el Ag. en forma soluble o no existe el Ag. buscado, se hace la 2ª etapa: 2. Se añade a la mezcla anterior partículas recubiertas con el Ag. buscado en la muestra problema. Puede ocurrir: a) Que se produzca una aglutinación:

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Esto significa que no existe el Ag. buscado, ya que los lugares de unión del Ac. añadido en la 1ª etapa (específico del Ag. buscado) estaban libres y han reaccionado en la 2ª etapa con las partículas añadidas que tenían el Ag. recubriéndolas. b) Que no se produzca la aglutinación: Esto significa que existe el Ag. soluble que estamos buscando, ya que los lugares de unión del Ac. añadido en la 1ª etapa (específico del Ag. buscado) estaban ocupados por el Ag de la muestra problema y por tanto no ha podido reaccionar, el Ac añadido, con el Ag. particulado añadido en la 2ª etapa.

Esta prueba, de inhibición de la aglutinación también se puede realizar cuantitativamente. Para ello utilizaremos diferentes diluciones de la muestra problema. Una aplicación de esta prueba es el diagnóstico del embarazo, en el que se detecta la hormona GCh, antígeno soluble. D) TEST DE COOMBS O ANTICUERPOS NO AGLUTINANTES: Algunos tipos de IgG pueden unirse a los Ags. fijados a las partículas, pero no aglutinarlos. Son los llamados Acs. incompletos. Esta prueba detecta estos Acs. no aglutinantes mediante la adición de antiglobulinas-IgG (antiinmunoglobulinas), que ayudarán a formar puentes de unión entre las partículas.

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Hay 2 tipos de pruebas: a) Prueba de coombs directa: Ayuda a detectar Acs. unidos a partículas. Ej. los hematíes en el recién nacido con enfermedad hemolítica por incompatibilidad Rh están sensibilizados por Acs. no aglutinantes (IgG materna). La adición de antiglobulinas humanas permite el establecimiento de puentes entre los hematíes a través del Ac. anti-IgG y hace posible la aglutinación.

b)- Prueba de coombs indirecta: Detecta Acs. no aglutinantes libres en el suero. Se realiza e 2 fases: a) Se añade a la muestra problema (Ac. no aglutinante buscado) Ags. específicos particulados. No se producirá la aglutinación b) Se añade antiglobulinas (anti-IgG) a la mezcla anterior. Las antiglobulinas se unirán a los Acs.no aglutinantes fijados y provocarán la aglutinación de las partículas.

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Se usa esta prueba para el diagnóstico serológico de la brucelosis crónica. También para detectar los Acs. no aglutinantes maternos en el caso de incompatibilidad Rh. REACCIONES CON INTERVENCION DEL COMPLEMENTO Son procedimientos muy sensibles, pero actualmente han sido superados por el RIA, el IF. y el ELISA. Todavía hay técnicas, que usan la fijación del complemento para el diagnóstico de enfermedades fúngicas, víricas y parasitarias. El término COMPLEMENTO se usa para designar una serie de proteínas plasmáticas, cerca de 20, que son activadas en secuencia (en cascada) después de producirse la reacción Ag.-Ac. La primera proteína del complemento que se activa se une a un sitio del interior del Ac. que seria inaccesible si el Ac. no ha reaccionado con el Ag. Después de esta reacción hay cambios conformacionales en la molécula del Ac. de tal manera que hace que la región de articulación se abra quedando expuesta al sitio de fijación del complemento. Las proteínas del complemento tienen la capacidad de lisar las células cuando la reacción Ag-Ac. se produce con Ags. situados en las superficies celulares.

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PRUEBAS DE FIJACION DEL COMPLEMENTO: Se pueden utilizar, como todas las pruebas serológicas, para detectar Ags. o Acs. Se basan en que los complejos Ag.-Ac. formados al fijar el complemento impiden la hemólisis que ese mismo complemento produciría sobre un sistema hemolítico incompleto ( hematíes (Ag.)- Acs. hemolíticos.). La prueba se realiza en 2 etapas: 1º.- Se pone en contacto el Ag. y el Ac., de los cuales uno es conocido y el otro no, en presencia de complemento.

2º.- Se investiga la presencia de complemento libre por la adición de un sistema hemolítico incompleto (hematíes + hemolisinas) Podremos observar 2 resultados:

a) Que exista el Ag. o el Ac. buscado:

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b) Que no exista el Ag. o el Ac. buscado:

INMUNOTURBIDIMETRIA Y INMUNONEFELOMETRIA Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión, sufre una serie de fenómenos, parte de la luz es transmitida, parte absorbida, parte reflejada, y por último parte es dispersada.

INMUNOTURBIDIMETRIA Esta técnica se basa en la medición de la luz que no se ha transmitido a través de una suspensión cuando sobre ésta incide un rayo de luz colimado. Es por tanto la medida de la disminución de la intensidad de la luz incidente (causada por dispersión, reflexión y absorción de la luz). Se puede medir como %T o como absorbancia. Cuando un antígeno y un anticuerpo se unen en un medio líquido, se forman inmunocomplejos que quedan en suspensión, dando una turbidez al líquido que es proporcional a la cantidad de antígeno o anticuerpo de la muestra.

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INMUNONEFELOMETRIA Se basa en la medición de la luz dispersada por las partículas de una suspensión cuando sobre ésta incide una luz colimada. Se mide la luz desviada en un determinado ángulo (de 15º A 90º), con respecto a la dirección del rayo incidente. La formación de inmunocomplejos antígeno-anticuerpo es capaz de dispersar la luz que atraviesa la solución donde se desarrolla la reacción. Por tanto mediante esta técnica podremos determinar la existencia de antígenos o anticuerpos en una muestra. REACCIONES DE TRANSFERENCIA O INMUNOBLOTTING Se basan en la transferencia de una sustancia desde un gel, donde se hayan separado sus diversos componentes, a un soporte fácilmente manejable. Las sustancias a estudiar se separan en un gel de poliacrilamida mediante la electroforesis. Una vez separadas todas las sustancias se realiza la transferencia, por capilaridad o por electroforesis (electrobotting), a una membrana, generalmente de nitrocelulosa. Esta membrana tiene una gran capacidad para fijar las proteínas. También se pueden bloquear fácilmente los sitios de unión libres. Las diferentes sustancias que se han transferido se podrán estudiar por diferentes métodos, fundamentalmente ELISA o RIA, añadiendo a la membrana los anticuerpos específicos de las sustancias a estudiar. Es una técnica cualitativa y los resultados se observaran en forma de unas bandas correspondientes a cada una de las sustancias estudiadas presentes en la muestra problema. La técnica se llama Western blot

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Actualmente tiene una gran aplicación como técnica para confirmar la infección por VIH (SIDA), ya que a una buena sensibilidad, comparable al ELISA, une una gran especificidad, eliminándose de esta forma los falsos positivos. Se haría de la siguiente forma:

o Fraccionamiento, mediante electroforesis en un gel de poiacrilamida, del virus VIH desorganizado y parcialmente purificado. Las diferentes proteínas víricas se separarán según su peso molecular.

o Transferencia a una membrana de nitrocelulosa de las proteínas separadas, que actuarán como antígenos.

o Se añade la muestra problema (suero con sospecha de tener anticuerpos contra el VIH) a la membrana anterior. Si existen los anticuerpos se unirán a sus antígenos correspondientes.

o Se añade antiglobulina conjugada con un marcador que se unirá a los complejos Ag.-Ac. formados anteriormente.

o Se visualiza según el método empleado (ELISA o RIA) o Se compara el resultado con un control.

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También se utiliza este método para la determinación de ácidos nucleicos. Si determinamos DNA la técnica se llamará Southern blot, y si es RNA se llamará Northern blot. METODOS TERCIARIOS Están basados en los efectos biológicos que siguen a la unión Ag-Ac. o a las consecuencias derivadas de dicha unión. Algunos de estos efectos son:

a.- Fagocitosis. b.- Opsonización: preparación del Ag. para ser fagocitado. c.- Adherencia inmunitaria: facilita la fagocitosis. d.- Desgranulación celular. e.- Bacteriolisis. f.- Inmovilización de microorganismos. etc.

Casi todos estos efectos biológicos están basados en la actividad del complemento. PRUEBAS MÁS IMPORTANTES: A) PRUEBAS DE PROTECCIÓN: Estudian, mediante pruebas "in vivo", los Acs. protectores, que son los responsables de la inmunidad adquirida, y sus Ags. correspondientes. Pueden ser activas o pasivas: a) Activas: Sirven para determinar la capacidad vacunante de una preparación antigénica. Para ello se administra ésta a un lote de animales y tras un periodo de tiempo (para que pueda fabricar Acs.), se les inocula el germen virulento. La protección se medirá por la supervivencia de los animales. b) Pasivas: Se usan para medir el poder protector de un suero inmune. Para ello se administra el suero a un lote de animales y, tras un periodo de tiempo se inocula el germen virulento. La protección se medirá, al igual que antes por la supervivencia de los animales. B) PRUEBAS DE NEUTRALIZACIÓN: Cuando un Ag. se une a su Ac. correspondiente puede perder su capacidad patógena, tóxica, hormonal, enzimática etc., de que está dotado el Ag. Esto se manifestará por la posterior inoculación de la unión Ag.-Ac. a un animal de experimentación, a un cultivo, etc. Ejemplo: si unimos una toxina con su correspondiente antitoxina se neutralizará el efecto tóxico. Esto se demuestra inoculando a un animal de experimentación la mezcla.

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C) TEST DE NELSON: Prueba utilizada en el diagnóstico de la sífilis. Entre los métodos 3º también podemos encontrar las pruebas que pueden ayudarnos a determinar la hipersensibilidad de un individuo a diferentes sustancias como medicamentos, pólenes, productos químicos, polvo de la casa, alimentos etc. Se entiende por hipersensibilidad a la respuesta inmunitaria que causa daño en el individuo que la produce. Las pruebas más comunes son: D) TEST CUTÁNEOS POR INTRADERMOREACCIÓN DEL ALERGENO: Consiste en inyectar bajo la piel las sustancias a estudiar, como alergenos, y observar la reacción que se produce al cabo de poco tiempo E) PARCHES CUTANEOS: Se escarifica la piel y posteriormente se coloca un parche impregnado con la sustancia a estudiar en la zona escarificada. Tras un periodo de tiempo se observa los resultados. F) PRUEBAS DE PROVOCACIÓN: Las sustancias o alergenos se administran por vía natural (inhalación, vía oral etc.) para provocar la reacción alérgica. G) TEST DE PRAUSNITZ-KUSTNER O DE ANAFILAXIA CUTÁNEA PASIVA: El suero de un paciente alérgico se inyecta en la piel de un individuo sano. A las 24 horas se inocula en el mismo lugar el alergeno. Si existe el Ac., se origina una reacción alérgica (prurito, eritema, edema). H) PRUEBA DE MANTOUX O DE LA TUBERCULINA: Consiste en inyectar intradérmicamente en el brazo una preparación de tuberculina. Tras un periodo de 48-72 horas se observará una inflamación en el lugar de la inyección. Se medirá el diámetro de la inflamación para dar como (+) o (-) la prueba. ESTUDIO DE LAS DIFERENTES POBLACIONES LINFOCITARIAS En los métodos inmunológicos no solo hay que estudiar la reacción antígeno-anticuerpo y sus consecuencias correspondientes, a veces hay que estudiar las diferentes células pertenecientes a la inmunidad celular, en concreto los linfocitos T y B.

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Hay técnicas que permiten el aislamiento de los linfocitos del resto de los componentes de la sangre. Se basan generalmente en la velocidad de sedimentación o en la centrifugación en gradiente de densidad. También hay métodos que permite la identificación de las diferente subpoblaciones linfocitarias como la prueba de la formación de rosetas E. Se basa en la capacidad que tienen los linfocitos T de formar rosetas de manera espontánea con los glóbulos rojos de carnero, sin la intervención de inmunoglobulinas. En algunas ocasiones hay que determinar la capacidad funcional de los linfocitos, parámetro más adecuado para valorar el estado inmunológico del individuo que su cantidad. Se valora la capacidad de producción de anticuerpos, la respuesta a los mitógenos etc. Entre las técnicas más importantes están: la transformación linfoblástica, el cultivo mixto de linfocitos, y la proliferación de linfocitos frente a diversas sustancias, como por ejemplo las lecitinas vegetales.

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TEMA 12.- ESTUDIOS DE PATERNIDAD POR ADN.

¿Cómo se hace un estudio de paternidad por ADN?

La molécula de ADN (ácido desoxirribonucleico) es la portadora de toda la información genética que pasa de una generación a la siguiente y contiene todas las instrucciones necesarias para la formación de un organismo nuevo, así como para el control de todas las actividades de las células durante el tiempo de vida del organismo. Está presente en todos los organismos vivos desde virus y bacterias hasta plantas y animales.

En organismos superiores el ADN es único para cada individuo de cada especie e invariable durante el periodo de vida del organismo. Esta característica es lo que se conoce como "huella genética" y es la base de los estudios de identificación genética de individuos.

Salvo unas pocas excepciones (glóbulos rojos en mamíferos, etc.), todas las células de un organismo vivo tienen ADN. Gracias a ello es posible extraer el ADN a partir de cualquier muestra biológica (sangre, pelo, semen, huesos etc.) e incluso a partir de muestras degradadas.

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Mediante la técnica del PCR o "reacción en cadena de la polimerasa", es posible amplificar la molécula de ADN de forma exponencial en el laboratorio. Para realizar un análisis genético se necesita muy poca cantidad de muestra ya que a partir de una simple molécula de ADN se pueden obtener millones de copias.

Desde un punto de vista estructural, el ADN está formado por una sucesión de moléculas simples llamadas nucleótidos, compuestos por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada, que puede ser púrica (Adenina o Guanina) o pirimidímica (Citosina o Timina). Los nucleótidos aparecen unidos entre sí mediante enlaces químicos de forma específica (una adenina siempre se aparea con una timina y una citosina con una guanina) creando una hebra de longitud variable. La naturaleza física de estas moléculas hace que dos hebras se asocien de forma complementaria formando una doble cadena helicoidal. Mediante el proceso de secuenciación, y empleando unos aparatos muy sofisticados llamados secuenciadores automáticos, es posible conocer la secuencia exacta de nucleótidos que forman cada molécula de ADN.

Dentro de las células el ADN sufre un proceso de plegamiento y empaquetamiento dando lugar a los cromosomas. Los humanos poseen 46 cromosomas, 23 procedentes de la madre y 23 procedentes del padre. Esta es la base de los análisis de paternidad ya que estudiando una serie de marcadores genéticos situados en los diferentes cromosomas (los STRs o "secuencias cortas repetidas en tandem") es posible determinar de forma inequívoca la paternidad de un individuo.

La molécula de ADN tiene una gran estabilidad lo que facilita su transporte y almacenamiento. Así, es posible mantener congeladas muestras de ADN durante mucho tiempo para realizar con ellas estudios genéticos posteriores.

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UN POCO DE HISTORIA

La demostración por parte de Avery y colaboradores en la década de los 40 de la existencia del DNA como la estructura sobre la que recae toda la información genética y el posterior descubrimiento en los años 50 de la estructura de doble hélice del DNA por Watson y Crick (pulse aquí para ver una copia del trabajo original de Watson y Crick), dieron lugar a toda una serie de trabajos experimentales en las décadas de los años 60 y 70 encaminados a la elucidación de las claves de la codificación genética que nos han conducido a la revolución científica que se vive actualmente en el campo de la genética y la biología molecular.

Posteriormente, el descubrimiento de la "reacción en cadena de la polimerasa" (PCR) por K. Mullis en 1987 permitió la amplificación in vitro de fragmentos de DNA de interés, abriendo todo un nuevo abanico de posibilidades en la manipulación del DNA que se completó posteriormente en los años 90 con el desarrollo de la secuenciación automática de DNA por el método de Sanger con reactivos fluorescentes en lugar de radiactivos, permitiendo conocer exactamente el orden de los nucleótidos en la secuencia del fragmento de DNA en cuestión. En la actualidad, las técnicas de PCR y de secuenciación automática de DNA son totalmente rutinarias en la mayoría de los laboratorios de Bioquímica y Biología Molecular.

En fechas recientes, el inicio del denominado Proyecto Genoma Humano por parte de diferentes laboratorios de todo el mundo, está permitiendo la ordenación y asignamiento de diferentes segmentos de DNA a localizaciones conocidas dentro de los cromosomas, lo que está facilitando el descubrimiento continuo de los denominados marcadores genéticos, localizaciones físicas y perfectamente identificables en un cromosoma cuyo paso hereditario de generación en generación puede ser monitorizado. Estos marcadores genéticos pueden ser regiones de DNA que se expresan en forma de proteínas, o segmentos de DNA sin función codificante pero con un patrón hereditario que puede ser determinado.

El PCR permite la amplificación específica de una secuencia requerida de DNA cientos de millones de veces en un tiempo de pocas horas, independientemente de su origen (virus, bacterias, plantas, animales o humanos). Esta técnica es especialmente valiosa y prácticamente insustituible teniendo en cuenta su alta especificidad, fácil automatización y alta capacidad para amplificar insignificantes cantidades de muestra de DNA. El PCR también puede ser utilizado para detectar la existencia de una secuencia definida en una muestra de DNA.

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Durante mucho tiempo la aplicación de estas técnicas de Bioquímica y Biología Molecular han estado prácticamente restringidas al ámbito académico e investigador. Sin embargo, en los últimos años estas técnicas se están convirtiendo en una herramienta fundamental e imprescindible en muchas áreas como la biomedicina, biología forense, agricultura, ganadería, tecnología de alimentos, etc. Como ejemplo, en biología forense, la utilización de PCR es prácticamente insustituible debido a que las características ambientales, de almacenamiento, etc. de las muestras, pueden llevar a la degradación del DNA y llegar a impedir la utilización de otras técnicas alternativas. En países como Estados Unidos o el Reino Unido, la aplicación de este tipo de técnicas se lleva a cabo de forma continua y rutinaria en diversos campos de la ciencia. Sin embargo, en España es un campo nuevo y de reciente implantación.

Extracción del ADN:

La muestra biológica (sangre, uñas, hisopados o cualquier otro tejido que contenga células humanas con núcleo) se somete a la acción de detergentes, que disuelven los lípidos; y enzimas proteolíticas, que cortan las proteínas.

Luego de incubar la mezcla una noche a 60 grados centígrados, se produce la ruptura de la estructura celular liberando todo su contenido a la solución.

La mezcla se limpia mediante sucesivos lavados con solventes orgánicos (fenol, cloroformo), que coagulan proteínas y extraen los lípidos, y finalmente el ADN se separa por precipitación con alcohol en medio salino.

Eventualmente, en los casos de manchas antiguas o huesos, se realizan purificaciones posteriores por diálisis o adsorción a soportes sólidos.

Existen métodos alternativos en los cuales la muestra sanguínea se deposita sobre un papel especial, que la mantiene inalterada por años a temperatura ambiente. Previo al análisis, se cortan con un sacabocados pequeño fragmentos del papel (alrededor de 1 mm) y se extraen las impurezas mediante lavados. El papel así procesado, con el ADN adherido, se analiza directamente colocándolo en la mezcla de amplificación.

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Análisis del ADN:

Existen dos metodologías diferentes:

a) Corte con enzimas de restricción, corrimiento electroforético en geles de agarosa, transferencia a una membrana de nylon o celulosa y tratamiento con sondas de locus múltiple o de locus específico. Estas técnicas han caído en desuso, por lo cual no serán tratadas aquí.

b) Amplificación mediante PCR o reacción en cadena de la polimerasa: es un proceso que consiste en imitar una actividad normal de la célula: la copia de ADN, aunque en este caso limitado a pequeños fragmentos, en los cuales están ubicadas las regiones variables.

Para ello, se coloca en cada tubo una porción del ADN extraído de cada persona y una mezcla que contiene nucleótidos, sales, una enzima que "copia" ADN (denominada polimerasa) y los "primers" que reconocen la zona variable.

La mezcla se somete a variaciones de temperatura en un ciclador térmico, que produce sucesivamente tres temperaturas diferentes: una que desnaturaliza o separa las cadenas del ADN, otra que facilita que los "primers" reconozcan y se adhieran a la región a copiar, y la tercera que permite la extensión de la cadena copiada, mediante la unión de los nucleótidos que se encuentran en la solución, con la ayuda de la polimerasa.

Luego, los amplificados se someten a un campo eléctrico en el interior de un soporte semisólido o gel (electroforesis). Como el ADN está cargado negativamente, se dirige hacia el polo positivo, los fragmentos pequeños más rápido que los grandes, produciendo su separación.

Finalmente, los fragmentos separados se visualizan mediante diferentes métodos:

• Radiactivos: si uno de los nucleótidos estaba marcado radiactivamente, basta poner el gel en contacto con una película radiográfica, que se revela para observar las variantes.

• Tinción con plata: se trata el gel con sales de plata, que por su carga positiva son atraídas por la carga negativa de los fragmentos de ADN, y se revela de modo similar a una fotografía.

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Tanto los métodos radiactivos como los de tinción con plata están cayendo en desuso, y en la actualidad son empleados solamente por laboratorios que poseen un escaso volumen de trabajo.

• Sistemas automatizados: son los de última generación, en los cuales al proceso de electroforesis lo efectúa un secuenciador automático, que lee mediante un rayo laser los "primers", marcados con un fluorocromo, adheridos a las zonas variables. Una computadora permite determinar qué variantes son las que se encuentran en cada muestra.

Interpretación de los resultados:

Según las metodologías empleadas, los resultados se visualizan como "bandas" (en los formatos radiactivos o de tinción) o como "picos" en un gráfico (sistemas automatizados). Dado que la interpretación es idéntica, en los ejemplos utilizaremos los gráficos obtenidos de un secuenciador automático.

Considerando que cada individuo hereda una variante de su madre y la otra de su padre biológico, supongamos los siguientes resultados para un hipotético "sistema A":

Es evidente que el hijo comparte una variante con su madre y la otra con su padre alegado, por lo cual podría ser hijo de ambos. Sin embargo, esa situación puede darse por azar, ya que hay muchos individuos de la población general que presentan esa variante compartida.

Entonces, repetimos el estudio con otro sistema, que analizará una zona

variable diferente. El resultado para ese "sistema B" podría ser:

Y se confirmaría la inclusión. Para que el estudio resulte suficientemente creíble, se acepta a nivel mundial que deben analizarse un mínimo de 12 sistemas de microsatélites, por supuesto, con

Madre:

Hijo:

Padre alegado:

Madre:

Hijo:

Padre alegado:

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inclusión en todos los casos. Para las técnicas actuales automatizadas, ello no presenta ningún inconveniente, ya que existen métodos de amplificación de 15 regiones variables en una sola reacción.

El estudio completo, con sistemas de última generación, se vería así:

Madre:

Hijo:

Padre alegado:

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Madre:

Hijo:

Padre alegado:

Madre:

Hijo:

Padre alegado:

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En el ejemplo anterior, se observan 15 sistemas variables y además el denominado "amelogenina", que sirve para determinación de sexo: en lo varones se aprecian dos picos ("XY") y en las mujeres, sólo uno ("XX"). Los números debajo de cada variante indica el número de repeticiones que posee la secuencia "core" que define al sistema cuyo nombre se coloca en la parte superior del registro gráfico (ej.: D5S818, D13S317, etc).

Otra posibilidad para el sistema B sería:

Que indicaría la exclusión del padre alegado como padre biológico (obsérvese que la variante 11 está en el hijo pero no en la madre ni en el padre alegado). Para asegurarse que no se deba a una falsa exclusión debida a una mutación, se sugiere continuar el estudio hasta observar al menos tres situaciones como ésta, de no compartición de variantes entre padre e hijo alegado.

Las variantes mencionadas se codifican por convención mediante un número (ubicado en el esquema en la parte inferior de cada pico), que expresa el número de veces que está repetida la secuencia que caracteriza al sistema. Así, en nuestro hipotético "sistema A", los resultados se expresarían

como:

Madre: 8-12.

Hijo: 8-13.

Padre alegado: 12-13.

Cualquier otro estudio, realizado en cualquier lugar del mundo, del mismo "sistema A", debe necesariamente arrojar los mismos resultados numéricos. Si eso no ocurre, alguno cometió un error.

Finalmente, se realiza un cálculo estadístico de la probabilidad de paternidad e índice de paternidad, basándose en análisis efectuados previamente de las variantes observadas en individuos no relacionados de la población general.

Madre:

Hijo:

Padre alegado:

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Cuanto menos frecuentes en la población sean las variantes obtenidas, mayores serán la probabilidad y el índice de paternidad.

Habitualmente, para individuos vivos, la "probabilidad de paternidad" es superior al 99,99%. Por ejemplo, un "índice de paternidad" de 1,2 x 106 indica que 1 de cada 1200000 individuos de la población general podrían ser asignados como padres biológicos del hijo en cuestión, sin serlo, es decir, por azar.

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TEMA 13.- MÉTODOS ÓPTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

INTRODUCCIÓN Cuando se establece el diagnóstico clínico de una enfermedad infecciosa, con frecuencia es crucial el poder identificar rápida y provisionalmente el agente etiológico con el fin de poder instaurar las adecuadas medidas terapéuticas y en ocasiones epidemiológicas; en todo caso siempre es conveniente llegar a la confirmación bacteriológica. En realidad las técnicas utilizadas actualmente han variado muy poco desde el inicio de la era bacteriológica; más o menos sofisticadamente, se continúa con la identificación de los gérmenes por visualización directa, por técnicas de cultivo y en ocasiones por inoculación animal. VISUALIZACION DIRECTA O EXAMEN MICROSCÓPICO El estudio microscópico directo de una muestra no permite por sí solo, más que en raras ocasiones, la identificación precisa del microorganismo observado. No obstante, nunca se debe prescindir de él como orientativo, salvo en algunos casos, en relación con la naturaleza de la muestra examinada, cuando no existe probabilidad de obtener ninguna información. El examen microscópico sirve de pauta para el uso de técnicas complementarias de cultivo o de estudio bioquímico y evita, muchas veces, incurrir en errores graves. Este examen permite obtener información respecto a la presencia de bacterias y su abundancia, observar su morfología y disposición (por ejemplo los Streptococcus se disponen en cadena y los Staphylococcus en forma de racimos), determinar sus características de tinción, la reacción celular, e incluso conocer la citología del material examinado. Si se parte de un cultivo, la información puede ampliarse aún más y apreciarse mejor la forma, tamaño, disposición y las peculiaridades de tinción.

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El examen microscópico comporta habitualmente dos modalidades diferentes: examen en fresco y mediante tinción. EXAMEN EN FRESCO También conocido como montaje húmedo, consiste en colocar el material a examinar entre un porta y un cubreobjetos; si se trata de un producto sólido, se realizará previamente una suspensión del mismo en agua destilada o s.s.f estériles. Para la observación se coloca el condensador bajo y el objetivo seco fuerte (40X).La microscopía de contraste de fases y la de campo oscuro facilitan la observación de estructuras con bajo índice de refracción que pasarían inadvertidas con el microscopio de campo claro; sus indicaciones son muy precisas (por ejemplo, la identificación de espiroquetas). El examen en fresco se dirige principalmente a la detección de microorganismos directamente en las muestras, a cuantificar su concentración, a obtener alguna información sobre su morfología y, con frecuencia, a determinar la movilidad de una especie aislada. Además, tambien permite observar otro tipo de células (hematíes, leucocitos, células epiteliales), cristales y algunas estructuras que ayudan para la valoración clínica de determinadas muestras. El examen en fresco puede ayudarse de recursos que facilitan la visualización de ciertos microorganismos:

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• La simple adición de azul de metileno u otro colorante favorece la diferenciación de elementos celulares.

• La preparación con tinta china (método de Burri) o nigrosina permite la

evidenciación de la cápsula microbiana. Se utiliza para el diagnóstico de infección por Cryptococcus.

• El montaje con potasa al 10% en caliente o con azul de lactofenol es de

gran utilidad para el estudio de estructuras fúngicas, sobre todo de hongos dermatofitos.

• La preparación con solución yodada(lugol) es de elección para la

identificación de algunas parasitosis intestinales. EXAMEN POR TINCIÓN El examen del material teñido, ya sea directamente a partir de muestras clínicas o del desarrollo en los cultivos, es el método más útil para la identificación presuntiva de las bacterias y de ciertos virus y para la identificación definitiva de la mayoría de los parásitos y de muchos hongos. Las preparaciones teñidas se visualizan al microscopio con el condensador alto y el objetivo de inmersión de gran aumento (100X). De forma resumida podemos decir que la coloración o tinción es un proceso mediante el cual un elemento toma color bajo la acción de una sustancia colorante. Un colorante es una sustancia capaz de comunicar su color a otros cuerpos. Pueden ser: ácidos (tiñen a estructuras básicas; ejemplos: Eosina, ácido Pícrico,Aurantina.), básicos (tiñen estructuras ácidas). Son colorantes nucleares. Ejemplos: Azul de metileno, Verde malaquita, Fuchina, Violeta de genciana, Safranina,...) y neutros (son capaces de teñir tanto las estructuras ácidas como básicas. Ejemplos: Eosinato de Azul de metileno. En Microbiología se utilizan sobre todo colorantes básicos o nucleares debido a la gran basofilia del citoplasma bacteriano, rico en ARN. Estos colorantes se presentan generalmente asociados a un mordiente (ácido fénico) para reforzar su acción, aunque algunas técnicas de tinción aplican, además, otro mordiente suplementario (lugol en la tinción de Gram). Preparación de un frotis. Todas las técnicas de tinción exigen una preparación previa del frotis antes de proceder a la tinción en sí. Los pasos a seguir son :

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Extensión

• Cuando el producto a teñir es líquido se depositará con asa de Pt, previamente flameada, una gota del mismo sobre el portaobjetos y se extenderá formando una capa fina y uniforme de aproximadamente 1,5 cm. de lado.

• Cuando se parte de un medio sólido o semisólido se depositará una gota

de agua destilada o s.s.f. en el porta y, utilizando asa de Pt previamente flameada, se suspenderá en ella una pequeña cantidad de cultivo. Se extiende de la misma forma que en el caso anterior. Hay que cuidar no poner demasiada masa de microorganismo, pues se formaría una capa gruesa que dificultaría la observación.

• Cuando se trata de una muestra tomada con escobillón se pueden

extender directamente o se suspenden en 2 c.c. de suero fisiológico estéril contenidos en un tubo. Se deposita una gota de la suspensión en el centro del portaobjetos y se extiende.

Desecación. Se deja secar al aire o manteniendo el portaobjetos alto por encima de la llama. Fijación. Cuando la extensión está bien seca hay que proceder a fijarla. Tiene por objeto adherir los gérmenes al portaobjetos para que al lavar no se arrastre. Se consigue mediante la coagulación de las proteínas de los gérmenes. En Microbiología, el agente fijador que se suele emplear es el calor: una vez seca la extensión, se pasa el portaobjetos dos o tres veces por la llama del mechero con la extensión hacia arriba. El portaobjetos debe notarse caliente pero no quemar cuando se coloca en el dorso de la mano. Una vez fijada la preparación se dejará enfriar antes de proceder a la coloración ya que de lo contrario precipitaría el colorante. También se puede realizar la fijación mediante el empleo de fijadores químicos tales como el alcohol metílico o etílico, dejándolos en contacto dos o tres minutos, eliminando después el exceso. Una vez preparada y fijada la extensión, el siguiente paso sería la tinción.

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TIPOS DE TINCIONES TINCIÓN SENCILLA. Se realiza utilizando un sólo colorante. Se puede emplear cualquier colorante básico, preferiblemente azul de metileno o fucsina.

Técnica:

1. Extensión. 2. Desecación. 3. Fijación. Dejar enfriar. 4. Tinción: Se cubre la preparación con el colorante (azul de metileno)

durante 1-2 minutos. 5. Lavado: Se lava con abundante agua para eliminar el exceso de

colorante. Lo idóneo es usar agua destilada, pero tambien se puede usar agua corriente (esto puede causar errores, como por ejemplo depósitos de cal).

6. Secado: Se secará primeramente entre papel de filtro, evitando presionar directamente sobre la extensión. Se limpiarán los restos de colorante que queden en el portaobjetos fuera de la extensión y se dejará que acabe de secarse al aire.

7. Observación al microscopio. Se observarán las bacterias con su forma y agrupación característica, teñidas de azul.

TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM Se estudia con esta coloración la morfología de las bacterias y su forma de agrupación y a la vez tiene interés taxonómico ya que se emplea para diferenciar los dos tipos clásicos de microorganismos: Gram (+) y Gram (-). Las bacterias que son capaces de retener el primer colorante usado (Cristal violeta o Violeta de genciana) aun después de la decoloración son las denominadas Gram (+). Las bacterias Gram (-) pierden el colorante al ser tratadas con el decolorante. Como se ha indicado la diferencia entre los dos tipos reside en la pared celular: Las Gram (+) tienen una pared muy gruesa, con una malla bien engarzada, reteniendo bien el colorante durante la coloración. La pared de las Gram (-) es mas delgada y su malla es más floja, por lo que el decolorante destiñe a este tipo de bacterias. Además las Gram (+) tienen en su pared celular un contenido de lípidos (1-4 % ) menor que en las Gram (-) ( 11-20 % ). Estos lípidos van a ser disueltos por el

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decolorante orgánico empleado, aumentando la permeabilidad de la membrana y eliminando el colorante, decolorándose con facilidad las Gram (-). El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más adecuadas y también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar un tratamiento inicial; en otras ocasiones el diagnóstico puede considerarse prácticamente cierto, como ocurre en el caso de la uretritis gonocócica aguda masculina, la meningitis purulenta por meningococo o neumococo, etc. Técnica:

1. Extensión. 2. Desecación. 3. Fijación. Dejar enfriar. 4. Coloración: Se cubre la preparación con Violeta de Genciana o Cristal

violeta y se deja actuar durante 1,5 o 2 minutos. 5. Lavar ligeramente con agua para eliminar el exceso de colorante o

simplemente volcar el portaobjetos y escurrir el colorante. A continuación se cubre la preparación con Lugol (mordiente) durante 2 minutos. El mordiente produce una unión mas intima entre el colorante y la estructura a colorear. La función de mordiente la tiene el Iodo; el Ioduro potásico se utiliza para favorecer la disolución del Iodo metálico en el agua.

6. Decoloración: Escurrir la solución de Lugol, lavar con agua y sosteniendo el portaobjetos entre el pulgar y el índice decolorar con Alcohol-acetona hasta apenas arrastrar colorante violeta. Al añadir cristal violeta se tiñen todas las bacterias, pero al decolorar solo las G (-) pierden el colorante.

7. Lavar con agua abundante a fin de detener la decoloración. 8. Coloración de contraste: Se cubre la preparación con Fucsina fenicada

diluida o con Safranina (preferentemente) y se deja actuar durante 1-2 minutos.

9. Lavar con agua. 10. Secado. 11. Observación al microscopio. Las bacterias gram positivas se observan de

color azul violeta y las gram negativas de color rosa. Existe una variante de la tinción de Gram ideada para daltónicos en la que en lugar de usar Safranina o Fucsina fenicada como colorante de contraste, se emplea el marrón de Bismarck durante 30-60 segundos. Las bacterias G (-) se observarán, en este caso, de color pardo-amarillento. Hay ciertos grupos de bacterias que pierden sus características tintoriales cuando envejecen, pasando de G (+) a G (-); a estas bacterias se les denomina Gram lábiles o Gram variables. Se recomienda realizar la tinción de Gram a cultivos de 24 horas.

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TINCIONES PARA ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES Existen una serie de microorganismos que poseen en su pared celular ciertos lípidos complejos, que dificultan la penetración de los colorantes en la célula. Solamente utilizando colorantes enérgicos como la fucsina fenicada, y forzando su acción mediante la aplicación de calor o prolongando el tiempo de contacto, estos microorganismos logran retener el colorante. Y lo hacen de tal manera, que incluso decolorantes muy enérgicos como el alcohol-ácido no consiguen decolorarlos. Por esto se denominan ácido- alcohol resistentes. Los géneros Mycobacterium, Nocardia, y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium, se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. Estas tinciones constituyen una importante ayuda para la búsqueda del bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis).Entre ellas podemos citar: la tinción de Zhiehl-Neelsen y la de Kinyoun. TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN Los colorantes y reactivos usados en esta tinción son:

o Fucsina fenicada. o Alcohol-ácido (decolorante). Alcohol de 961: 97 ml.; ClH : 3 ml. Hay

que añadir lentamente el ácido al alcohol ya que puede haber desarrollo de calor.

o Azul de metileno o Verde de malaquita. Técnica:

1. Extensión. 2. Desecación. 3. Fijación. Dejar enfriar. 4. Coloración: Cubrir la preparación con fucsina fenicada y calentar el

portaobjetos o bien directamente sobre el mechero o bien utilizando un algodón impregnado en alcohol, hasta la emisión de vapores por parte de la preparación. Cuando se observa la emisión de vapores se retirará el foco calorífico, volviéndolo a aplicar 2 0 3 veces de modo que se mantenga dicha emisión durante 5 minutos. Hay que evitar la ebullición del colorante y que en ningún momento la preparación quede sin colorante. También se puede realizar la coloración cubriendo la preparación con un rectángulo de papel de filtro y añadiendo el colorante de modo que quede perfectamente impregnado el papel de filtro. A continuación se irá calentando manteniéndose la emisión de vapores durante 5 minutos sin dejar que se seque el papel de filtro.

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5. Se dejará enfriar y se lavará con agua. En el caso de utilizar papel de filtro se retirará este mediante unas pinzas y a continuación se lavará con agua.

6. Decoloración: enérgicamente con alcohol-clorhídrico hasta que la preparación quede con un ligero tinte rosa. A continuación se lavará con agua.

7. Coloración de contraste: Cubrir la preparación con azul de metileno durante 2-3 minutos.

8. Lavar con agua. 9. Secar y observar el microscopio.

Los microorganismos ácido-alcohol resistentes se observarán de color

rojo y los restantes de color azul. Si como colorante de contraste en vez de azul de metileno se hubiera empleado verde malaquita, los microorganismos no ácido-alcohol resistentes se observan de color verde. TINCIÓN DE KINYOUN Es una tinción ácido-alcohol resistente, modificación de la de Ziehl-Neelsen, llamada tambien como método frío debido a que en lugar de emplear calor para facilitar la penetración del colorante se aumenta la proporción ed fenol y fucsina en la fórmula del colorante con respecto a la fucsina de Ziehl. Técnica:

1. Extensión. 2. Desecación. 3. Fijación. Dejar enfriar. 4. Coloración: Cubrir la preparación con la fucsina de Kinyoun y dejar actuar

durante 5-7 minutos-min., sin calentar. 5. Lavar con agua o simplemente escurrir el colorante. 6. Decolorar con alcohol-HCl. 7. Lavar con agua. 8. Coloración de contraste: azul de metileno durante 2-3 min. 9. Lavar, secar y observar al microscopio.

La observación será similar a la expuesta en la tinción de Ziehl-Neelsen. Cuando se observa una tinción AAR se recomienda hacer una valoración cuantitativa de los bacilos presentes en la muestra. El objetivo se ha de colocar en el extremo de la preparación y se recorre toda una línea (100 campos en objetivo de inmersión) contando los bacilos AAR encontrados. Una forma de informar número de BAAR observados en frotis teñidos es la siguiente:

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N1 de BAR observados Informe del método CDC 0

Negativo para BAR (-)

1 - 2/300 F N1 visto (�)

1 - 9/100 F N1 promedio/100 F (1+)

9 - 9/10 F N1 promedio/10 F (2+)

1 - 9/F N1 promedio/F (3+)

> 9/F > 9/F (4+)

Estos datos se refieren a observación en microscopio con objetivo de inmersión. Existen factores para establecer una equivalencia entre estos datos y los correspondientes a la observación con objetivo 25X o 40X. TINCIONES ESTRUCTURALES Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto distintas estructuras bacterianas. TINCIÓN DE ESPORAS. MÉTODO DE WIRTZ-CONKLIN Algunos microorganismos tienen la propiedad de formar esporas, que son formas de resistencia. Su formación se debe a una concentración de protoplasma bacteriano. Pueden ser de forma esférica u oval y de diverso tamaño. Pueden ser de localización central, subterminal, o terminal. También pueden salir al exterior. La pared de las esporas es bastante impermeable, por lo que cuesta trabajo teñirlas, de modo que en las preparaciones teñidas por los métodos corrientes, las esporas aparecen como cuerpos incoloros y refringentes. Pero si se fuerza la coloración mediante el calor, el colorante llegará a teñir las esporas. Debido a la citada impermeabilidad de la pared de las esporas, durante el periodo de decoloración, se decolorará toda la célula bacteriana excepto las esporas. Se necesitan cultivos de al menos 48 horas, para que el microorganismo haya tenido tiempo suficiente de formarlas. Técnica:

1. Extensión. 2. Desecación. 3. Fijación. Dejar enfriar. 4. Coloración: Cubrir la preparación con verde malaquita al 5% en solución

acuosa, manteniéndola a emisión de vapores durante 5 min, teniendo las

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mismas precauciones que las especificadas en la tinción de Ziehl-Neelsen.

5. Dejar enfriar. 6. Lavar con abundante agua. La espora sigue teñida de verde y la célula

vegetativa pierde el colorante. 7. Colorante de contraste: Safranina y dejar actuar durante 1 min. 8. Lavar con agua. 9. Secar y observar al microscopio. Las esporas se verán de color verde y

las células vegetativas se observarán de color rosa. La disposición y tamaño de las esporas tiene gran interés en taxonomía.

Existe otra tinción de esporas, el método de Moeller, que utiliza como reactivos: solución acuosa de ácido crómico, fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen, solución acuosa de clorhidrato de anilina, azul de metileno y alcohol absoluto. TINCIÓN DE FLAGELOS Para su observación, se debe partir de cultivos jóvenes, de entre seis y doce horas. Se prepara una suspensión del germen en agua destilada, mezclando suavemente hasta obtener una suspensión lechosa. Si se sospecha que el germen es patógeno, se debe utilizar agua formolada al 5-10%. Se deposita unas gotas de la suspensión en un extremo del portaobjetos inclinado, de forma que las gotas se extiendan a lo largo del cristal. Se dejará secar al aire sin aplicar calor. A) MÉTODO DE RHODES

o Se cubre la extensión con el mordiente de Rhodes durante 3-5 min. Lavar cuidadosamente con agua destilada, mejor por inmersión.

o Cubrir con la solución de nitrato de plata amoniacal, calentándolo

hasta casi ebullición y dejándolo actuar de 3-5 min.

o Lavar con agua destilada y secar. Se observa con objetivo de inmersión, directamente o bajo un cubreobjetos. Los flagelos podrán observarse gracias al precipitado de nitrato de plata que se deposita en torno suyo.

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B) MÉTODO DE TRIBONDEAU

o Se fija el frotis con alcohol y se cubre con la mezcla formada por 5 ml del mordiente de Tribondeau y 0,5 ml de cristal violeta previamente sometida a ebullición. Se deja actuar durante 20 segundos.

o Se lava rápidamente con agua, sin volcar previamente el colorante,

se seca y se observa al microscopio con objetivo de inmersión. Los flagelos se verán de color castaño. C) MÉTODO DE LEIFSON

o Se cubre la preparación con el colorante de Leifson y se deja actuar durante unos 10 minutos.

o Se lava con agua, sin volcar el colorante, se seca y se observa al

microscopio con objetivo de inmersión. Los flagelos se observan de color rojo oscuro a azul negruzco. TINCIÓN DE CÁPSULAS La cápsula es una capa mucosa, más o menos gruesa, que envuelve la pared celular de algunas bacterias. A) MÉTODO DE HISS

o Realizar un frotis espeso de una mezcla de suspensión bacteriana con solución fisiológica y suero sanguíneo. Secar a temperatura ambiente y fijar al calor.

o Cubrir la preparación con solución de cristal violeta al 1% y calentar con vapor fluyente durante un minuto.

o Lavar con solución de sulfato de cobre al 2%, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

Las cápsulas se colorean de azul pálido y las bacterias de color púrpura. B) MÉTODO DE LA TINTA CHINA

o Sin fijar el frotis, se cubre con fucsina diluida durante dos minutos. Lavar con agua destilada y secar al aire.

o Se colocan en un extremo del porta dos gotas de nigrosina o de tinta china y se hace una extensión por el método de los dos portaobjetos. Se deja secar y se observa al microscopio con objetivo de inmersión.

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El fondo aparecerá negro, las bacterias teñidas de rojo y la cápsula como un halo blanco que las envuelve. TINCIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS El género Corynebacterium presenta unos gránulos de reserva de fosfato, llamados gránulos o corpúsculos metacromáticos. A) MÉTODO DE ALBERT

o Se fija el frotis al calor, se cubre con el colorante de Albert, se deja actuar durante 15 minutos y se lava con agua destilada.

o Se cubre la preparación con lugol durante un minuto, lavar con agua, secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersión.

Los corpúsculos metacromáticos se tiñen de color azul oscuro. B) MÉTODO DE LOEFFLER

o Fijar el frotis con calor, cubrir con el colorante de Loeffler y dejar actuar durante tres minutos.

o Lavar con agua destilada, dejar secar y observar con objetivo de inmersión.

Los gránulos se verán de color azul intenso. C) MÉTODO DE ERNST-NEISSER

o Fijar el frotis al calor, cubrir con azul acético y dejar actuar durante 10 min, calentando hasta emisión de vapores los primeros minutos.

o Lavar con agua destilada y cubrir con una solución de vesuvina durante un minuto.

o Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión. TINCIONES DIFERENCIALES PARA PARÁSITOS Diversas coloraciones diferenciales son empleadas para mejorar la visualización y destacar la estructura interna de quistes, trofozoitos u otras formas de parásitos, especialmente de los que se encuentran en heces. Entre éstas podemos destacar la de Wheatley-tricromo y la de hierro hematoxilina. La coloración con toluidina O, se emplea para el examen rápido de material del tracto respiratorio con el fin de determinar la presencia de Pneumocystis carinii. Una modificación rápida de la coloración de Gomori con metenamina-plata ha demostrado ser muy valiosa para el diagnóstico de P. carinii en lavados bronquiales y otras muestras.

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TINCIONES DIFERENCIALES PARA FROTIS DE SANGRE Y CORTES DE TEJIDOS Los parásitos que circulan en la sangre con frecuencia se encuentran dentro de los eritrocitos o libres en el plasma. Se han desarrollado diversas coloraciones que permiten diferenciar estos parásitos de los componentes celulares normales. Las dos coloraciones que se emplean más comúnmente son la de Wright y la de Giemsa. La tinción de Giemsa también se emplea para visualizar inclusiones virales o de otro origen en las células infectadas que se obtienen directamente de materiales clínicos, como la base de vesículas que se supone son herpéticas o raspados de córnea en casos sospechosos de conjuntivitis por Chlamydia trachomatis. También puede detectarse mediante la coloración de Giemsa la presencia de otros parásitos como toxoplasma en tejido cerebral. Ni la tinción de Wright ni la de Giemsa teñirán en forma regular los elementos fúngicos o bacterianos, de modo que deben usarse junto con otras coloraciones si se desconoce totalmente la etiología de la supuesta infección. Se conocen otras tinciones que son empleadas para propósitos especiales, como la coloración con yodo para detectar la presencia de inclusiones en monocapas celulares infectadas con clamidias, la de Sellers para cuerpos de inclusión en tejidos infectados con el virus de la rabia y la de Giménez para Chlamydia y Legionella. TINCIONES PARA HONGOS Los elementos de los hongos pueden visualizarse en materiales fijados por diversas coloraciones. La coloración con ácido preyódico-Schiff (PAS) es probablemente una de las mejores tinciones generales ya que la mayoría de los hongos presentes en materiales clínicos (esputo, tejidos, etc.) tomarán la coloración. La metenamina-plata, además de teñir a ciertos parásitos, también colorea las paredes de las células micóticas de marrón oscuro-negro. El polisacárido capsular de ciertos hongos, especialmente Cryptococcus neoformans, toma un color rosa brillante con la coloración de mucicarmín, que ha demostrado ser muy útil para diferenciar este hongo en los tejidos.

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TINCIONES FLUORESCENTES Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta). A medida que las moléculas excitadas regresan a su estado normal, liberan el exceso de energía en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiación excitante. Esta propiedad se denomina fluorescencia. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, según el color del colorante usado. En la figura anterior se representa un diagrama de un microscopio de fluorescencia. TINCIÓN FLUORESCENTE CON AURAMINA-RODAMINA Es una tinción muy usada para micobacterias, cuando el volumen de muestras a examinar es elevado. Se fundamenta en la afinidad que poseen los ácidos micólicos de la pared celular de las micobacterias por los colorantes fluorescentes o fluorocromos Auramina y Rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo oscuro. Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramina es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. Técnica:

1. Extensión. 2. Desecación. 3. Fijación. Dejar enfriar. 4. Coloración: Cubrir la preparación con el colorante auramina-rodamina

previamente filtrado. Mantenerlo así durante 15 min. No hay que calentar. 5. Lavar con agua destilada. 6. Decoloración con alcohol -HCl. Cubrir la preparación con el decolorante y

dejar actuar de 3 a 4 minutos. 7. Lavar con agua destilada. 8. Añadir permanganato potásico al 0,5% en agua destilada y dejar actuar

de 2 a 4 minutos. El permanganato se utiliza para eliminar la fluorescencia residual de los desechos de fondo. Pero debe evitarse el

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tratamiento excesivo con el contracolorante porque puede rebajar la intensidad fluorescente de los bacilos coloreados.

9. Lavar con agua destilada. 10. Secar al aire y observar con el microscopio de fluorescencia.

El agudo contraste entre las micobacterias coloreadas brillantemente y el fondo oscuro ofrece las grandes ventajas de una fácil, rápida y completa observación. Puede usarse un objetivo de 25X (100X en la tinción de Ziehl-Neelsen y similares), para observar el frotis, lo que permite la inspección de un área extensa en poco tiempo. Otras ventajas son el mejor contraste, el mínimo esfuerzo visual y la relativa falta de importancia de la agudeza para el color del observador. TINCIÓN FLUORESCENTE CON NARANJA DE ACRIDINA Se basa en la tinción de los ácidos nucleicos de los microorganismos por el fluorocromo naranja de acridina. Esta tinción se utiliza principalmente para el estudio de microorganismos en hemocultivos y líquido cefalorraquídeo. La técnica es muy simple:

o Cubrir la preparación ya fijada con solución de naranja de acridina durante 2 min.

o Lavar con agua destilada. o Dejar secar. o Observar al microscopio de fluorescencia. Las bacterias se

observan de color naranja fluorescente. TINCIÓN FLUORESCENTE CON BLANCO DE CALCOFLÚOR Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa. TINCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA Estas tinciones se basan en el uso de colorantes conjugados con anticuerpos. Se emplean con profusión en el laboratorio los anticuerpos monoclonales, que son muy específicos, conjugados con isotiocianato de fluoresceína. Sus indicaciones son de dos tipos:

o La tinción de inmunofluorescencia directa (IFD) es útil para el

diagnóstico de Legionella, Neisseria gonorrhoeae y

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microorganismos difíciles de cultivar como Treponema, Pneumocystis, Chlamydia, y virus Herpes.

o La tinción de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se utiliza

preferentemente para el diagnóstico de algunas viriasis, investigando los anticuerpos en el suero (virus Epstein-Bar).

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA El microscopio electrónico emplea electrones en vez de luz para visualizar objetos pequeños. Mediante el empleo del microscopio electrónico se han descubierto muchas características morfológicas de las bacterias, componentes bacterianos, hongos y parásitos. La microscopía electrónica permite efectuar el diagnóstico directo presuntivo de diversas infecciones víricas, en particular las gastroenteritis e infecciones por herpes simple.

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TEMA 14.- TÉCNICAS DE CULTIVO Y

AISLAMIENTO DE PATÓGENOS INTRODUCCIÓN. Para estudiar las reacciones metabólicas de las bacterias es necesario cultivarlas en medios de cultivo, que son mezclas de sustancias que proporcionan en forma asimilable todos los elementos necesarios para su crecimiento y multiplicación. Los medios de cultivo deben incluir los elementos indispensables para la vida bacteriana, tales como carbono, nitrógeno, hidrógeno y oxígeno, elementos minerales (fósforo, azufre, calcio, magnesio e hierro), micronutrientes o elementos traza (Zn, Co, Cu, Mn,...) y factores de crecimiento (vitaminas, bases púricas y pirimidínicas, aminoácidos,...) COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. COMPONENTES BÁSICOS:

• Agua: Para asimilar los alimentos, las bacterias necesitan agua. También da condiciones de humedad necesaria para la vida. El agua será destilada ya que la del grifo contiene calcio y magnesio que pueden formar precipitados con otros compuestos del medio de cultivo.

• Peptonas: proteínas parcialmente hidrolizadas. Principalmente son fuente

de nitrógeno, y también de carbono, azufre...

• Extracto de carne: Constituye una fuente de carbono, nitrógeno, sales inorgánicas y factores de crecimiento.

• Cloruro sódico: Tiene como fin proporcionar un adecuado equilibrio

osmótico. Incrementa la presión osmótica del medio para evitar la lisis de las bacterias.

• Agentes solidificantes: Los contienen los medios sólidos y semisólidos.

El agar es el más usado; la gelatina y la albúmina se usan escasamente. OTROS COMPONENTES:

• Sustancias inhibidoras de crecimiento: Son sustancias que impiden el crecimiento de los microorganismos que no nos interesan que se desarrollen. Entre éstas podemos citar colorantes como el cristal violeta,

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el verde brillante que inhiben a gram positivos; sales biliares que también inhiben a gram positivos; antibióticos, etc.

• Indicadores: Se utilizan para detectar variaciones en la acidez o

alcalinidad del medio causadas por el metabolismo bacteriano. Estas variaciones se aprecian por el cambio de color del indicador.

• Sustancias enriquecedoras: Son sustancias que se añaden para

favorecer el crecimiento de ciertos microorganismos que son más exigentes. Ej.: suero, leche, sangre, huevo.

• Agentes reductores: Se añade a los medios para promover la

anaerobiosis. Entre los más empleados están: tioglicolato sódico, cisteína, ác. ascórbico.

• Hidratos de carbono: sobre todo mono y disacáridos. Se pueden

adicionar con fines de nutrición o para realizar pruebas de identificación bioquímica.

• Sales minerales: sulfatos y fosfatos de calcio, potasio, magnesio, hierro,..

• Tampones estabilizadores del pH: ya que éste puede variar durante el

proceso de preparación del medio o como consecuencia de la acumulación de los productos del metabolismo bacteriano.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO. NORMAS GENERALES. Los medios de cultivo se comercializan desecados, en forma de polvo, para su disolución y esterilización. Actualmente se pueden adquirir también medios sólidos ya preparados, dispuestos en frascos, que se licuan mediante ebullición y se dispensan en placas; medios en tubos y medios sólidos en placa, listos para su inoculación. Aunque esta última práctica se ha extendido enormemente facilitando el trabajo rutinario, conviene conocer las operaciones necesarias para preparar un medio de cultivo en buenas condiciones. Para ello seguiremos los siguientes pasos: A) PESADA DE LOS COMPONENTES: Debe ser lo más precisa posible. Como hemos dicho anteriormente, actualmente los medios vienen deshidratados y no habría que pesar uno por uno cada componente.

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B) DISOLUCIÓN DE LOS COMPONENTES: Siempre se hace en agua destilada, salvo indicación contraria. El agua desionizada no se aconseja. Los recipientes deben ser de vidrio y estar limpios. El calor favorece o es imprescindible para la disolución de algunos productos, pero debe limitarse al estrictamente necesario, sin llegar a la ebullición prolongada. Para evitar el desborde por ebullición, los envases con soluciones que deben ser esterilizadas en el autoclave, sólo deben contener dos tercios de su volumen total de líquido. C) AJUSTE DEL pH: Es muy importante para la calidad del medio. Se realiza con tiras indicadoras y soluciones de ácidos y bases. Normalmente se ajustan a pH neutro. D) REPARTO EN RECIPIENTES: Si el medio preparado se va a utilizar en tubos o frascos, se repartirá en éstos con ayuda de un dosificador, se les pondrá un tapón y una vez rotulados se dispondrán en gradillas o cestillos de autoclave y se procederá a su esterilización. Si el medio se fuera a repartir en placas de Petri, se esterilizará en el matraz donde se hubiese preparado y posteriormente se repartirá ante mechero en placas estériles. E) ESTERILIZACIÓN: Se suele realizar en el autoclave a 1 atm. de sobrepresión (121º C), durante 15-20 min..En caso de medios de cultivo que no se puedan esterilizar a estas temperaturas, se recurrirá a la filtración esterilizante o bien a la tindalización. Una vez que el ciclo de esterilización ha finalizado, debe reducirse lentamente la presión dentro del autoclave. El medio no debe permanecer dentro de éste una vez que se ha equilibrado la presión, ya que el calentamiento prolongado puede alterar alguno de los componentes. F) CONSERVACIÓN DE LOS MEDIOS: Deben conservarse en el refrigerador (las placas, invertidas e introducidas en bolsas de plástico; los tubos, convenientemente tapados). Transcurrido un mes, no se debe usar ningún medio. Si se quiere comprobar la esterilidad del medio, se incuban las placas o tubos a 37º C durante 48 h. y se comprueba si hay crecimiento. La calidad final del medio de cultivo preparado depende de la forma en que se prepara, por lo que es de real importancia que se sigan las normas expuestas anteriormente.

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CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. Se pueden clasificar atendiendo a distintos criterios: ATENDIENDO A SU ESTADO FÍSICO:

• Líquidos: favorecen mucho el desarrollo y multiplicación de las bacterias porque al difundirse estas por todo el medio encuentran fácilmente las sustancias que necesitan para nutrirse. No contienen agar.

• Sólidos: contienen de 15 a 17 g de agar por litro. Las bacterias crecen

con mayor dificultad; no obstante, son de gran utilidad para el estudio de las características de crecimiento, de la producción de hemólisis y otras peculiaridades.

• Semisólidos: se utilizan mucho para observar la movilidad de los microorganismos. Contienen agar en una proporción de 3 a 5 g. por litro.

ATENDIENDO A SU UTILIDAD: GENERALES O COMUNES: Son apropiados para el cultivo de la mayoría de los microorganismos por la facilidad con que se desarrollan en ellos. Se usan para cultivar bacterias poco exigentes. Entre ellos podemos citar el caldo nutritivo, el TSB, el agar nutritivo y el TSA. MEDIOS ESPECIALES: Conocidos también como específicos, van dirigidos al cultivo de determinadas especies bacterianas o son utilizados con fines de diferenciación. Entre éstos tenemos: A) MEDIOS ENRIQUECIDOS: son medios generales a los que se les añade ciertos productos (sangre, suero, glucosa,...), favoreciendo así el crecimiento de ciertos microorganismos muy exigentes. Ejemplos: agar-glucosa (agar nutritivo añadido de glucosa), agar sangre (agar nutritivo añadido de sangre), agar chocolate, etc. B) MEDIOS SELECTIVOS: estos medios contienen componentes que inhiben el desarrollo de ciertos microorganismos, lo cual permite aislar el microorganismo que se busca. Entre estos medios podemos citar: agar Salmonella-Shigella (agar SS, selectivo para Salmonellas y Shigellas), agar MacConkey (se utiliza para el aislamiento de Enterobacterias), agar de Thayer-Martin (selectivo para Neisseria), agar Manitol salado (Chapman, selectivo de Estafilococos coagulasa positivos), agar de Lowenstein-Jensen (selectivo para el cultivo de

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micobacterias, especialmente Mycobacterium tuberculosis, agar de Sabouraud (para el cultivo de la mayoría de las levaduras y hongos patógenos). C) MEDIOS DIFERENCIALES: son aquéllos en los que además de crecer las bacterias, al actuar éstas sobre alguno de los componentes específicos del medio, demuestran alguna de sus propiedades bioquímicas. Contienen azúcares e indicadores, concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida (si la bacteria es capaz de fermentar el azúcar que lleva el medio, se producirá una acidificación del medio con el consiguiente viraje de color del medio por el cambio de pH). Ejemplos:Agar hierro de Kligler, Agar de MacConkey (diferencia los bacilos entéricos fermentadores y no fermentadores de la lactosa. Fermentadores de lactosa---> colonias rosas; No fermentadores de lactosa (lactosa negativos) ---> colonias incoloras). D) MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: son medios líquidos que favorecen o permiten la multiplicación de unas bacterias, inhibiendo parcial o totalmente la de otras. Ejemplos: agua de peptona alcalina (favorece la multiplicación de Vibrio cholerae), caldo selenito (favorece el crecimiento de Salmonellas y Shigellas, fundamentalmente Salmonellas). E) MEDIOS DE TRANSPORTE: se utilizan para asegurar la viabilidad de las bacterias desde el momento de la toma de las muestras hasta su posterior siembra en el laboratorio o para su envío de unos laboratorios a otros. Actualmente los medios de transporte más utilizados son los de Stuart, Amies, y el medio de Cary-Blair. F) MEDIOS DE CONSERVACIÓN: son una variación de los medios de transporte. Aseguran las características morfológicas y fisiológicas de las bacterias por un periodo largo de tiempo. Ejemplo: agar de tripticasa y soja. Un gran número de medios de cultivo utilizados en el laboratorio de microbiología se podrían englobar en varios de los grupos anteriormente expuestos. Ej.: agar sangre, es un medio enriquecido y diferencial. CONDICIONES NECESARIAS PARA EL DESARROLLO DE LOS PATÓGENOS. Para que las bacterias y hongos puedan desarrollarse en un medio artificial, además de tener los nutrientes necesarios, se deben cumplir una serie de condiciones:

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CONDICIONES ATMOSFÉRICAS: Los microorganismos patógenos pueden ser aerobios, anaerobios, microaerófilos, anaerobios facultativos y capnófilos. Aerobios; es decir, utilizan el oxígeno como aceptor terminal de electrones y presentan un desarrollo abundante en una atmósfera con la concentración normal del aire. Anaerobios: relativamente intolerantes a la presencia de oxígeno. Microaerófilos: crecen bien en atmósferas con menor presión de oxígeno. Anaerobios facultativos: pueden crecer en condiciones aerobias o anaerobias. Capnófilos: crecen mejor en una atmósfera con mayor concentración de CO2 que la ambiental. Los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos pueden ser incubados en una concentración de aire ambiental sin mayor dificultad. Los microorganismos capnófilos pueden ser cultivados en una estufa de incubación con puertas selladas, en una atmósfera de 5-10% de CO2.Una mezcla adecuada de gas, contenido en cilindros cercanos, penetra automáticamente en la estufa. Como rutina debe controlarse la concentración de CO2. El sistema más comúnmente usado para crear una atmósfera específica anaerobia o capnófila es la jarra anaerobia. Las que se encuentran en el comercio son la GasPak y las de Scott Laboratories y Oxoid U.S.A. Ambos sistemas utilizan una jarra de plástico transparente, pesada, con una abrazadera para evitar pérdidas. Existen modelos que presentan en la tapadera un manómetro y válvulas para hacer el vacío y para introducir la mezcla gaseosa que proporciona la anaerobiosis. En la cara interior de la tapadera hay una especie de "clip" para sujetar la bolsa que lleva el catalizador. Las jarras para anaerobiosis se emplean principalmente para cultivos en placas.

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La atmósfera anaerobia en el interior de estas jarras se puede conseguir según varios procedimientos: A) TÉCNICA DE EVACUACION/REEMPLAZO: En este procedimiento se precisa primero crear el vacío mediante una bomba de vacío y una vez hecho ésto se introducirá la mezcla gaseosa que suele estar constituida por un 10% de H2 , 5% de CO2 y 85% de N2 . Se usa un indicador redox que nos permite controlar si se ha producido o no la atmósfera anaerobia. B) TÉCNICA QUE EMPLEA UN SISTEMA GENERADOR DE H2 Y CO2: En este sistema utilizaremos: * Generador descartable de H2-CO2, que consiste en una envoltura sellada de papel de aluminio que contiene dos tabletas, una de las cuales contiene a su vez ácido cítrico y bicarbonato sódico y la otra borohidruro de sodio. Cuando se introduce agua en este sobre, la primera tableta libera CO2 y la segunda libera H2. El H2 producido, en presencia del catalizador, reaccionará con el oxígeno presente, produciendo agua.

2H2 + O2 ------> 2H2O Existen sobres generadores de atmósferas especiales requeridas por determinados microorganismos. * Indicador de anaerobiosis: los hay de tipo bacteriológico y químico. Los bacteriológicos consisten en introducir en la jarra un cultivo de un aerobio estricto; si éste crece, indica un fallo en el establecimiento de la atmósfera de anaerobiosis. El inconveniente de estos indicadores es que los resultados no son conocidos hasta el final del período de incubación. Por ello, son más usados los indicadores químicos, los cuales se decoloran cuando están reducidos. En el mercado existen indicadores químicos como son

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las tiras de azul de metileno y tiras de resazurina. El azul de metileno es azul cuando está oxidado y la resazurina es rosa. * Catalizador en "frío": consta de unas bolitas de alúmina recubiertas de paladio. Este catalizador se inactiva por el SH2 y otros productos metabólicos volátiles producidos por las bacterias, así como por el exceso de humedad. Se asegura una actividad óptima del catalizador reemplazándolo por uno nuevo cada vez o bien "reactivándolo" después de cada utilización, lo cual se consigue calentándolo en el horno a 160-170ºC durante 2 horas, y manteniéndolo en recipiente seco y limpio después del calentamiento. El proceso a seguir en esta técnica es el siguiente:

1. Reemplazar el catalizador por uno nuevo o "reactivado." 2. Colocar los materiales a incubar en la jarra; si son placas se colocaran en

el portaplacas de forma invertida 3. Abrir el sobre del indicador y exponer unos 10 mm de la tira. 4. Añadir 10 ml de agua al sobre generador. 5. Cerrar la jarra herméticamente y meterla en estufa para incubación. 6. Se puede comprobar el buen desarrollo del proceso por los siguientes

datos:

a. La tapadera, con el catalizador en su superficie interna, debe estar caliente al tacto.

b. Debe aparecer en el interior de la jarra agua de condensación a los 15-30 minutos de haber añadido el agua al generador.

c. El indicador cambiará de color a las dos o tres horas. d. Si la jarra lleva manómetro, se puede observar el buen desarrollo

del proceso mediante la evolución de los cambios de presión: la producción de gas origina una presión positiva de aproximadamente 0,3 bar. La presión bajará en un período de 30-40 minutos a 0,1 bares aproximadamente.

C) TÉCNICA QUE EMPLEA UN SISTEMA GENERADOR DE CO2: En este sistema se utiliza el generador descartable de CO2 y un indicador de anaerobiosis (igual al descrito anteriormente.) El generador descartable de CO2 consiste en un sobre que contiene como principio activo el ácido ascórbico. Cuando este sobre se coloca en una jarra cerrada, el oxígeno atmosférico de la jarra es rápidamente absorbido con la generación simultánea de dióxido de carbono. Este método difiere del anterior en que la reacción continúa sin producción de hidrógeno, y por tanto no requiere un catalizador. Tampoco es necesaria la adición de agua para activar la reacción. Precauciones: tan pronto como la bolsita es expuesta al aire se inicia la reacción. Es por tanto esencial colocar ésta en la jarra y cerrar ésta última en menos de un minuto.

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Las condiciones anaerobias estrictas que exigen algunos microorganismos pueden obtenerse en sistemas cerrados como una caja con guantes anaerobios o cámara anaerobia, que consiste en una cámara de gas sellada con puertas en forma de guantes y una cerradura para la transferencia de materiales dentro y fuera de la cámara. El operador coloca sus manos y brazos dentro de los guantes para manejar los materiales de cultivo que se han colocado dentro. Para crear la atmósfera de anaerobiosis se usa un sistema similar al descrito en la técnica de evacuación/reemplazo en la jarra de anaerobiosis. Con objeto de eliminar el oxígeno residual que haya podido quedar se hace circular H2 a través de un catalizador de paladio. Los medios se incuban dentro de una incubadora colocada dentro de la cámara o bien manteniendo toda la cámara a 35º C. TEMPERATURA: La temperatura óptima de incubación para la mayoría de los patógenos humanos está próxima a la corporal (35-37º C), pero existen variaciones. Algunos no pueden soportar esta Tª, y otros tienen un margen más amplio. Determinados hongos y levaduras dermatofitos, crecen mejor a temperatura ambiente, próxima a los 30ºC. Es muy importante que la Tª de incubación se mantenga en los límites establecidos durante todo el proceso .La humedad puede ser controlada de forma automática si se hace llegar agua desde una fuente externa a medida que el sistema lo necesita o manualmente si se coloca un recipiente con agua en el estante inferior de la estufa. TIEMPO DE INCUBACIÓN: Será de 18-24 h, en términos generales. Algunas bacterias necesitan una incubación adicional para desarrollarse bien y han de mantenerse hasta 48-72 h. A veces será necesario más tiempo, como por ejemplo las que crecen a Tª < 17º (psicrófilas) se mantienen 5 días a 17º C.; 15 días para los hongos dermatofitos. pH DEL MEDIO : Las bacterias se desarrollan habitualmente a pH próximo a la neutralidad, aunque algunas exigen un pH específico distinto. PRESIÓN OSMÓTICA: Debido a la composición de la pared celular bacteriana, las bacterias se adaptan bien a las variaciones de la presión osmótica; sin embargo, "in vitro", los medios de cultivo se preparan en condiciones de isotonía.

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CARACTERISTICAS DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS CON MAYOR FRECUENCIA. Existen en el mercado una extensísima variedad de medios de cultivo, útiles para su empleo en el laboratorio de Microbiología clínica, con lo que se van a considerar solamente aquellos de mayor interés para el diagnóstico general. AGAR NUTRITIVO Composición: extracto de carne, peptona, cloruro sódico, agar y agua destilada. Es un medio de cultivo general.Sirve como base para la preparación de otros medios enriquecidos y selectivos. CALDO DE TRIPTICASA Y SOJA ( TSB ) Composición: tripticasa, soja y agua destilada. Es un medio de uso general. Se puede adicionar de agar para obtener un medio sólido que, dispuesto en tubos inclinados, es de utilidad para el mantenimiento de microorganismos. Si se le añade cistina se obtiene un medio más reducido y capaz de conservar microorganismos que requieren bajas concentraciones de oxígeno. INFUSION DE CEREBRO Y CORAZON( BHI ) Composición: infusión de cerebro y corazón, peptona, glucosa, cloruro sódico, fosfato disódico y agua destilada. Es un medio enriquecido. Es un excelente caldo para hemocultivo. CALDO DE TIOGLICOLATO Composición: caseína, extracto de levadura, cloruro sódico, glucosa, tioglicolato sódico, L-cistina, resazurina, agar y agua destilada. Es el caldo de enriquecimiento más comúnmente usado en microbiología clínica. Este medio lleva agentes reductores (tioglicolato y L-cistina) que disminuyen el cociente de óxido-reducción y favorece el desarrollo de anaerobios. La resazurina actúa como indicador (presenta color rosa en estado oxidado).La pequeña proporción de agar (0,75 g/l) que contiene el medio tiene como finalidad evitar que las corrientes de convección transporten el oxígeno atmosférico a toda la masa de caldo.

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AGAR DE STUART Composición: ácido tioglicólico, glicerofosfato sódico, cloruro cálcico, agar y agua destilada. Es un medio especialmente creado para el transporte de muestras. Va dispuesto en tubos, en estado semisólido y con una profundidad adecuada, para conseguir el fin que pretende. AGAR DE MUELLER-HINTON Composición: infusión de carne, aminoácidos, almidón, agar y agua destilada. Es un medio enriquecido, utilizado como medio de elección para realizar pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (antibiograma). AGAR SANGRE Composición: extracto de carne, peptona, cloruro sódico, sangre, agar y agua destilada. Es un medio enriquecido utilizado para el cultivo de microorganismos exigentes, así como para estudiar la actividad hemolítica. El medio base utilizado con mayor frecuencia para la fabricación de agar sangre es el TSA (agar tripticasa soja), al que se adiciona sangre desfibrinada de carnero, conejo o caballo en una proporción del 5-10%.La sangre se añade al agar esterilizado y enfriado a 45-50º C, evitando la formación de burbujas. La sangre humana procedente de banco tiene el inconveniente de contener citrato, que puede inhibir el crecimiento de algunos microorganismos. AGAR SANGRE PARA ANAEROBIOS Se trata del mismo medio de agar sangre, al que se adicionan antibióticos para el aislamiento selectivo de anaerobios. Los aminoglucósidos y la vancomicina son los más empleados. El medio toma el nombre del antibiótico que lleva incorporado: ejemplo agar kanamicina-vancomicina. Medios enriquecidos muy utilizados son los de Schaedler y Wilkins-Chalgren. AGAR CHOCOLATE Composición: extracto de carne, peptona, cloruro sódico, sangre, agar y agua destilada. Lleva como base agar nutritivo, al que se agrega sangre desfibrinada cuando el medio está a una temperatura de aproximadamente 80º C. El calentamiento

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tiene como fin la liberación de los factores X ( hemina) y V (difosfo-piridín-adenín-nucleótido), necesarios para el desarrollo de algunos microorganismos. Está especialmente indicado para Neisseria y Haemophilus. AGAR CLED Composición: extracto de carne, peptona, triptona, L-cistina, lactosa, azul de bromotimol, agar y agua destilada. Utilizado para el aislamiento y recuento de microorganismos en la orina. La deficiencia en electrolitos logra inhibir la invasión o swarming del género Proteus. La lactosa permite diferenciar los microorganismos fermentadores por el viraje del indicador a amarillo. AGAR MAC CONKEY Composición: peptona, lactosa, cloruro sódico, sales biliares, cristal violeta, rojo neutro, agar y agua destilada. Es el medio primario selectivo y diferencial que se emplea más a menudo para el aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos gram negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Las sales biliares y el cristal violeta actúan como inhibidores de gram positivos. Las bacterias que fermentan la lactosa producen colonias de color rojo que pueden estar rodeadas de una zona opaca debida a la precipitación de las sales biliares; las no fermentadoras dan colonias incoloras más o menos transparentes. AGAR DE LEVINE O EOSINA AZUL DE METILENO (EMB) Composición: peptona, fosfato dipotásico, lactosa, eosina, azul de metileno, agar y agua destilada. Es un medio selectivo y diferencial que se usa para el aislamiento, el cultivo y diferenciación de bacilos entéricos gram negativos. Las colonias fermentadoras de la lactosa presentan un tono violeta más o menos intenso. AGAR XLD (Xilosa-Lisina-Desoxicolato sódico) Composición: extracto de levadura, xilosa, lactosa, sacarosa, lisina, desoxicolato sódico, cloruro sódico, tiosulfato sódico, citrato férrico-amónico, rojo fenol, agar y agua destilada. Se considera un medio de selectividad moderada recomendado para el aislamiento de Shigella (colonias transparentes no fermentadoras) y Salmonella (colonias transparentes y negras no fermentadoras). El citrato y tiosulfato permiten la visualización de microorganismos productores de sulfhídrico como

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colonias con centros negros. El desoxicolato sódico actúa como agente selectivo. AGAR DE HEKTOEN Composición: extracto de levadura, peptona, lactosa, sacarosa, salicina, sales biliares, fucsina ácida, cloruro sódico, hiposulfito sódico, citrato férrico-amónico, azul de bromotimol, agar y agua destilada. Es un medio diferencial y altamente selectivo para Salmonellas y Shigellas. Al igual que el agar XLD, no necesita ser esterilizado en el autoclave antes de verterlo en las placas, debido a que son tan pocos los microorganismos que pueden desarrollar en él. AGAR S-S (SALMONELLA-SHIGELLA) Composición: extracto de carne, peptona, lactosa, sales biliares, citrato sódico, citrato férrico, tiosulfato sódico, verde brillante, rojo neutro, agar y agua destilada. Es un medio diferencial selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonellas y Shigella. El desarrollo de otros bacilos gram negativos y de cocos gram positivos está inhibido por el verde brillante, las sales biliares y las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato. CALDO DE SELENITO Composición: triptona, fosfato disódico, lactosa, selenito sódico y agua destilada. Se utiliza para el enriquecimiento de Salmonella. El selenito presente en el medio inhibe a otras bacterias entéricas en las primeras horas de incubación. CALDO GN Composición: triptona, glucosa, manitol, citrato sódico, desoxicolato sódico, cloruro sódico, fosfato dipotásico, fosfato monopotásico y agua destilada.

Se emplea como caldo de enriquecimiento selectivo para el cultivo de Salmonellas y Shigellas. CALDO DE TETRATIONATO Composición: peptona de soja, hidrolizado trípsico de caseína, cloruro sódico, carbonato cálcico, bilis, tiosulfato sódico y agua destilada. Es un medio selectivo utilizado para el enriquecimiento de Salmonella.

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AGAR CIN Composición: extracto de levadura, peptona, manitol, sales biliares, cefsulodina, irgasán, novobiocina, rojo neutro, cristal violeta, agar y agua destilada. Es un medio selectivo para Yersinia. AGAR MANITOL SALADO (CHAPMAN) Composición: extracto de carne, peptona, cloruro sódico, manitol, rojo fenol, agar y agua destilada. Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Staphylococcus, basado en la tolerancia que poseen a una alta concentración de cloruro sódico (7,5%). Sirve también como medio diferencial de cepas fermentadoras del manitol. Staphylococcus aureus en condiciones anaerobias es la única especie del género que produce esta fermentación. AGAR DE THAYER MARTIN Tiene como base el agar chocolate, suplementado por la adición de extracto de levadura y otros factores de enriquecimiento. También lleva añadidos antibióticos tales como vancomicina, colimicina y nistatina, lo que le confiere un carácter altamente selectivo. El medio de Thayer Martin permite el crecimiento de cepas exigentes de Neisseria, tales como Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis. AGAR NEW YORK CITY(NYC) Es un medio muy similar al anterior, usado con los mismos fines. Además de los tres antimicrobianos del agar de Thayer-Martin, lleva añadido trimetoprim para hacerlo más selectivo. AGAR GARDNERELLA Composición: extracto de carne, peptona, cloruro sódico, sangre humana, tween 80, ácido nalidíxico, colimicina, anfotericina B, agar y agua destilada.

Permite el crecimiento rápido de Gardnerella vaginalis. AGAR GRANADA Composición: proteosa peptona, almidón, glucosa, piruvato sódico, fosfato disódico, MOPS hemisódico, metotrexato, colimicina, metronidazol, cristal violeta, suero de caballo, agar y agua destilada.

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Es un medio especial y selectivo para el aislamiento, detección e identificación de Streptococcus agalactiae (grupo B).Para que el medio ofrezca un rendimiento del 100% debe incubarse en anaerobiosis. AGAR DE BORDET-GENGOU Composición: infusión de patata, proteosa peptona, cloruro sódico, glicerol sangre, agar. Es un medio enriquecido que se utiliza para el aislamiento de las especies del género Bordetella. MEDIO DE LOEFFLER Composición: suero de buey, caldo glucosado, polvo de huevo. Se utiliza para el cultivo de Corynebacterium y otros microorganismos exigentes. Asimismo en él se pone en evidencia la cromogénesis y poder proteolítico de ciertas bacterias. AGAR SABOURAUD Composición: peptona, glucosa, agar y agua destilada. Este medio se adapta particularmente al cultivo de la mayoría de levaduras y hongos patógenos. El medio contiene una cantidad mínima de nutrientes y un pH ácido (5,6) que lo hace selectivo. Suele adicionarse de antibióticos (gentamicina, cloranfenicol) para potenciar su selectividad. AGAR DE LOWENSTEIN-JENSEN Composición: fosfato monopotásico, sulfato magnésico, citrato magnésico, asparagina, fécula de patata, glicerina, verde malaquita, huevo y agua destilada. Es un medio utilizado para el cultivo de Mycobacterium. En este medio también pueden crecer y diferenciarse las especies del género Nocardia. Se debe esterilizar por tindalización. AGAR CAMPYLOBACTER (PRESTON) Composición: caldo nutritivo, carbón activado, hidrolizado de caseína, desoxicolato sódico, sulfato ferroso, piruvato sódico, cefoperazona, agar y agua destilada. Ha sido especialmente preparado para el cultivo y diferenciación de especies del género Campylobacter a partir de muestras fecales. La incubación a temperatura elevada (42ºC) limita mucho el crecimiento de la flora acompañante.

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Otro medio también utilizado para el aislamiento de Campylobacter es el agar Skirrow. AGAR COLUMBIA Composición: mezcla de peptonas, almidón, cloruro sódico, agar y agua destilada. Es un medio enriquecido que se utiliza para el cultivo de microorganismos exigentes y como base para la preparación de agar sangre y agar chocolate. AGAR TCBS Composición: peptona de caseína, peptona de carne, extracto de levadura, citrato sódico, tiosulfato sódico, agar y agua destilada. El agar TCBS es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Vibrio. TECNICAS DE AISLAMIENTO EN PLACA O INOCULACION POR ESTRIAS Y RECUENTO DE PATOGENOS Para el aislamiento, por lo general el inóculo se extiende sobre la superficie de las placas según un modelo o patrón estandarizado, de modo que el desarrollo bacteriano pueda ser determinado en forma semicuantitativa o relativa. Un modelo útil de estrías se presenta en la figura.

Hay otras técnicas de estriación, con ligeras modificaciones, que persiguen fines concretos: estriación de 3/4 de la placa para muestras con alto contenido microbiano, estriación de varias placas en cadena para muestras con flora mixta difícil de separar (aislamiento por agotamiento), descarga central con estriaciones laterales para muestras con escaso contenido microbiano, estriación libre, según las preferencias. Cuando se trabaja con muestras muy espesas, como esputo, y con algunos medios muy selectivos, como los agares para heces, se obtienen mejores aislamientos si se lleva el asa varias veces al área de inoculación original durante la etapa de siembra inicial. Consideremos que para la mayoría de las muestras no es necesario quemar el asa entre dos áreas de siembra, pero

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puede ser beneficioso cuando el inóculo original proviene de una colonia bacteriana en crecimiento. Para facilitar el recuento de las colonias debe sembrarse la placa con una cantidad medida de inóculo con un asa calibrada y siguiendo la técnica de siembra masiva, como se muestra en la figura.

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TEMA 15.- MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

INTRODUCCIÓN En clínica la rápida y correcta identificación del microorganismo o microorganismos causantes de una infección puede ser trascendental para la implantación del tratamiento adecuado. De ahí la importancia de las pruebas que se seleccionen para llegar a dicha identificación. El método más extendido para llegar a la identificación de microorganismos se basa en la realización de una batería de pruebas bioquímicas, a través de las cuales se va a detectar el metabolismo del microorganismo, enzimas que posee, características de resistencia a determinadas sustancias, etc... La identificación es tanto mejor cuanto mayor es el número de caracteres investigados. Para realizar correctamente las pruebas bioquímicas es fundamental tener colonias perfectamente aisladas, es decir, partir de cultivos puros. Por otro lado, se debe realizar un control periódico de medios y reactivos mediante el empleo de microorganismos positivos y negativos. CLASIFICACIÓN DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS Las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana las podemos clasificar atendiendo a varios criterios: PROCESOS RESPIRATORIOS QUE UTILIZAN LAS BACTERIAS PARA LA OBTENCIÓN DE ENERGÍA A) PRUEBA DE LA CATALASA * Fundamento: se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima catalasa, capaz de descomponer el peróxido de hidrógeno o agua oxigenada (H2O2) en H2O y O2, que se desprende en forma de burbujas en el medio. El H2O2 se forma como un producto terminal oxidativo de la descomposición aeróbica de los azúcares; si se acumulara sería tóxica para la bacteria. * Reactivo: H2O2 de 10 volúmenes (3%).

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* Técnica: Con un asa o hilo de inoculación, recoger el centro de una colonia pura de 18-24 h. y colocarla sobre un portaobjetos limpio. A continuación agregar una gota de agua oxigenada de 10 volúmenes sobre el microorganismo del portaobjetos. No invertir el orden del método pues pueden registrarse falsos positivos especialmente si se utilizan hilos o asas que contengan hierro. Si se están utilizando asas o hilos de platino también se puede caer en este error ya que el platino puede producir un resultado falsamente positivo. El nicrom no ocasiona estos problemas. No es necesaria la mezcla del cultivo y el agua oxigenada con la aguja o el asa de inoculación. Si el microorganismo es catalasa [+] se observará de inmediato la aparición de burbujas (liberación de gas). También se puede realizar esta prueba agregando directamente el agua oxigenada a un cultivo puro de agar en pico de flauta o en placa (sobre colonias aisladas en este caso). * Precauciones:

• Se debe evitar la utilización de agar-sangre como medio de cultivo ya que los eritrocitos contienen la enzima catalasa y podemos obtener falsos positivos.

• El H2O2 al 30% (100 volúmenes ) es una solución bastante cáustica.

• No se deben usar cultivos excesivamente viejos, ya que con el tiempo

pueden perder la actividad catalásica, pudiéndose obtener falsos resultados negativos.

• No utilizar asas o hilos de platino, ni que contengan vestigios de hierro.

* Interés: diferenciación de los géneros:

- Streptococcus [-], Micrococcus [+] y Staphylococcus [+] - Clostridium [-] y Bacillus [+].

B) PRUEBA DE LA OXIDASA * Fundamento: se investiga la presencia de la enzima citocromooxidasa en el microorganismo, la cual oxida al dimetil-parafenilen-diamina (reactivo incoloro) dando un producto de color.

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El sistema citocromooxidasa se encuentra, por lo general, en microorganismos aerobios. * Reactivos: Dimetil-p-fenilendiamina o tetrametil-p-fenilendiamina impregnado sobre tiras o discos de papel de filtro. * Técnica. Lectura e interpretación de resultados:

1. Colocar una tira o disco impregnado de reactivo en un porta.

2. Tomar una colonia con el asa y depositarla sobre la tira o disco. 3. La aparición de un color azul oscuro indica la existencia del enzima

citocromooxidasa (prueba positiva). * Precauciones:

o Proteger el reactivo de la luz ya que se altera con ella.

o Guardar en frío.

o Los medios que contienen colorantes pueden interferir la reacción.

o Algunas asas de cultivo metálicas pueden interferir la reacción. Se ha comprobado que la presencia de un simple vestigio de hierro puede por sí solo catalizar la oxidación del reactivo, dando una falsa reacción positiva. Por ello deben utilizarse asas desechables o bastoncillos.

* Interés: ayuda a la identificación de los géneros Pseudomonas (por lo general positivo) de las Enterobacterias [-], entre otros. C) PRUEBA DE ÓXIDO-FERMENTACIÓN * Fundamento: mediante esta prueba se va a determinar si la utilización de los hidratos de carbono por parte de un microorganismo se realiza por vía oxidativa (proceso aeróbico, presencia de oxígeno) o por vía fermentativa (proceso anaeróbico, ausencia de oxígeno). * Medio de cultivo: Medio de Huhg y Leifson: es un medio semisólido en tubo que lleva incorporado el azúcar y azul de bromotimol como indicador. Se esteriliza a 112º 30 minutos. La concentración de agar empleado (3 g/l) permite también la observación de la movilidad, además de la capacidad oxidativa o fermentativa de un microorganismo.

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La glucosa es el hidrato de carbono más comúnmente empleado en el medio base de O/F. Sin embargo, un microorganismo puede no metabolizar la glucosa y sí otros hidratos de carbono. Convendría emplear una batería en la que se incluyeran otros hidratos de carbono como lactosa, sacarosa,... El azul de bromotimol es un indicador de pH, que a pH ácido presenta color amarillo; a pH básico, color azul y a pH neutro color verde. * Técnica: se inocula por picadura y por duplicado, cubriendo uno de los tubos con parafina líquida para crear condiciones de anaerobiosis. La positividad se traduce por el viraje amarillo del indicador. Se incuban los tubos durante 3 o 4 días a 37º C, ya que algunos microorganismos producen reacciones lentas o débiles. La observación de los resultados será diaria. * Lectura e interpretación de resultados: mediante la utilización de este medio se pueden apreciar tres caracteres:

o Movilidad: +, cuando el microorganismo no limita su crecimiento a la línea de la siembra.

o Producción de gases: se detecta por la aparición de burbujas en el

medio.

o Vía oxidativa o fermentativa para la utilización del hidrato de carbono:

tubo abierto tubo cerrado vía utilizada amarillo verde oxidativa amarillo amarillo fermentativa verde verde no utilizan el hidrato de carbono

* Interés: generalmente para diferenciar géneros intestinales no Enterobacterias Gram (-) de las Enterobacterias. Ej.: Enterobacterias fermentan la glucosa; Pseudomonas oxida la glucosa. Esta prueba ayuda también a la diferenciación de los géneros de la familia Micrococcaceae (Micrococcus, por lo general oxida la glucosa; Staphylococcus la fermenta). Otras pruebas incluidas en este apartado son:

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D) PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE NITRATOS (para diferenciar especies de Haemophilus, así como para identificar Enterobacterias, generalmente positivas. E) TEST DE BRAUM O PRUEBA DEL CIANURO POTÁSICO (para diferenciación de Enterobacterias). F) PRUEBA DE LOS CALDOS FECALES ( FK Y SF ), para diferenciar Streptococcus. PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO GLUCÍDICO La mayoría de las bacterias son capaces de metabolizar la mayoría de los hidratos de carbono, ya sea por vía oxidativa o fermentativa. Incluiremos las siguientes pruebas: A) PRUEBA DE LA â-GALACTOSIDASA (ONPG) * Fundamento: demostrar la presencia en el microorganismo de la enzima â-galactosidasa, utilizando el orto-nitro-fenil-â-D-galacto-piranósido (ONPG). Si el microorganismo posee esta enzima, el ONPG que es incoloro, es hidrolizado, produciéndose orto-nitrofenol que presenta una coloración amarilla cuando se encuentra en solución neutra o alcalina; en condiciones ácidas es incoloro. Los microorganismos fermentadores de la lactosa poseen dos enzimas: la enzima permeasa (que regula la entrada de la lactosa en la bacteria) y una enzima â-galactosidasa (que desdobla la lactosa en glucosa más galactosa). Los microorganismos que fermentan la lactosa poseen las dos enzimas; los no fermentadores carecen de ambas enzimas. Hay microorganismos denominados "fermentadores tardíos de la lactosa" que poseen la â-galactosidasa pero no la permeasa. Cuando se utiliza una determinada concentración de lactosa, estos microorganismos producen después de cierto período de tiempo (48 horas a varios días o semanas) algunas células mutantes que poseen permeasa, observándose la fermentación tardía de la lactosa, lo que indica que poseen la enzima â-galactosidasa. * Medio de cultivo: caldo ONPG: Este caldo se distribuye asépticamente en tubos estériles. El ONPG se puede encontrar comercialmente impregnado en discos.

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* Técnica: Mediante la utilización de discos de ONPG:

o Realizar una suspensión bacteriana densa del microorganismo

objeto de estudio en un tubo que contenga unos 0,5 ml de S.S.F. estéril.

o Colocar en el tubo un disco de ONPG.

o Incubar a 37º C desde 1-24 horas, dependiendo del inóculo.

* Lectura e interpretación de resultados:

o prueba [+]: aparición de un color amarillo estable por liberación del o-nitrofenol.

o prueba [-]: incoloro después de 24 horas.

A la hora de hacer la lectura hay que tener en cuenta el pH dada la influencia que tiene en la aparición del color amarillo. En caso de un aparente resultado negativo se puede alcalinizar ligeramente el medio para comprobar que no se trata de un falso resultado negativo. * Interés: diferenciar los microorganismos fermentadores lentos de la lactosa de los lactosa -. Ej. E.coli +, Citrobacter +, Salmonella -, Proteus -, Shigella -. Algunas especies de Pseudomonas son ONPG [+] y otras [-]. B) PRUEBA DEL ROJO DE METILO * Fundamento: mediante esta prueba se va a comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Es una prueba cualitativa para la producción de ácidos y requiere microorganismos que produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico), a partir de la glucosa, por la vía de fermentación ácido mixta. Todos los miembros de las Enterobacteriaceas son, por definición, fermentadores de la glucosa. En el caldo RM/VP, después de 18-24 horas de incubación, la fermentación resultante da productos secundarios metabólicos ácidos; por lo tanto inicialmente todas las enterobacterias darán una reacción RM[+]. Sin embargo, después de más tiempo de incubación, como lo exige la realización de la prueba (2-5 días), aquellos microorganismos que son realmente RM[+] continúan produciendo más ácidos y dan como resultado un bajo pH

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terminal, venciendo al sistema amortiguador de fosfato y manteniendo un medio ácido (pH 4,2 o menos). Aquellos microorganismos que presenten la prueba RM [-] continúan metabolizando los productos iniciales de la fermentación, produciendo compuestos neutros, elevando el pH hacia la neutralidad (pH=6 o más). * Medio de cultivo: Medio de Clark y Lubs (caldo RM/VP).Se reparte en tubos.

* Reactivo: se utiliza solución alcohólica al 0,2% de rojo de metilo. * Técnica: sembrar con asa el medio líquido con el microorganismo objeto de estudio e incubar a 37º C de 2-5 días. * Lectura e interpretación de resultados: después de dos días de incubación se añaden unas 5 gotas de reactivo al medio, observándose un viraje a rojo si es positivo y una coloración amarilla si es negativa. Si aparece un color anaranjado indica una reacción retardada. Tanto si la prueba es negativa como si aparece el color anaranjado se continuará la incubación hasta 5 días y se repetirá la prueba. Si continúa color amarillo o anaranjado será prueba negativa. Se ha desarrollado una microtécnica rápida (método de Barry) que ha permitido disminuir el período de incubación con relación al método común (2-5 días). Se ha demostrado que utilizando menores volúmenes de caldo para la prueba, los microorganismos en estudio sufrían una mejor exposición al oxígeno atmosférico, que hacía que los microorganismos RM [-] revirtieran al pH neutro inicial con mayor rapidez. * Interés: diferenciación de Enterobacterias. C) PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER * Fundamento: observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía butanodiólica. Si es así, se forma un producto intermedio (acetoína) que forma un complejo de color rojizo con el á-naftol. * Medio de cultivo: Medio de Clark y Lubs o lo que es lo mismo caldo RM/VP. * Reactivos:

o á-naftol al 5% en alcohol absoluto.

o KOH al 40%. * Técnica: sembrar el medio (en tubos) e incubar de 24 a 48 horas a 37º C.

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* Lectura e interpretación de resultados: según el volumen de medio se añade un volumen determinado de la solución de á-naftol y de la de potasa (0,6 ml y 0,2 ml respectivamente cuando el tubo contiene unos 2 ml de medio). Se agita para exponer el medio al oxígeno atmosférico para que se de la reacción:

o Coloración rosa-rojiza en menos de una hora: VP [+]

o Color amarillo en la superficie del medio: VP [-] * Interés: diferenciación de Enterobacterias. D) PRUEBA CON AGAR HIERRO DE KLIGLER * Fundamento: mediante esta prueba vamos a poder determinar:

a. La capacidad de un microorganismo de atacar un hidrato de carbono específico (en este caso glucosa, lactosa o ambas) incorporado en un medio de crecimiento básico.

b. Producción o no de gases: CO2 e H2 como productos finales del

metabolismo de los hidratos de carbono.

c. Producción de ácido sulfhídrico (SH2). El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la lactosa. Existe otro medio, el TSI, que posee un tercer hidrato de carbono, la sacarosa; los fundamentos bioquímicos de ambos son los mismos, por lo que nos vamos a referir solamente al medio de Kligler. * Medio de cultivo: Agar hierro de Kligler. Se esteriliza a 112º durante 30 min. y se deja enfriar en planos inclinados y profundos. La lactosa (incluida en el medio) está presente en una concentración 10 veces superior a la glucosa. El sulfato de hierro se adiciona al medio para detectar la formación de SH2 por la bacteria, originándose sulfuro ferroso que es de color negro. El indicador de pH rojo fenol (que lleva el medio) es amarillo a un pH ácido, rojo a pH alcalino y anaranjado-rojizo a pH inicial del medio 7,4. * Técnica: la inoculación del medio se realiza en picadura hasta unos 0,6 cm. del fondo. Esta distancia se debe respetar a fin de evitar la entrada de aire en la parte profunda y una alteración en el medio anaerobio. Se retira el hilo por el mismo

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camino de entrada y, sin volver a cargar el hilo, se siembra en estrías la superficie del pico de flauta. Se incuban los tubos inoculados a 35-37º C durante 18-24 h. Es importante respetar estos tiempos de incubación, ya que lecturas de menor o mayor incubación pueden dar resultados falsamente positivos o negativos. * Lectura e interpretación de los resultados: a) Utilización de los hidratos de carbono:

• Fermentación de la glucosa y no de la lactosa: pico alcalino (rojo) y fondo ácido (amarillo), K/A. Ejemplo de no fermentadores de lactosa y sí de glucosa: Shigella, Proteus, Salmonella.

• Fermentación tanto de la glucosa como de la lactosa: Pico ácido

(amarillo), fondo ácido (amarillo). A/A. Ejemplos de microorganismos fermentadores de lactosa y glucosa son Escherichia coli, Klebsiella y Enterobacter.

• No hay fermentación ni de glucosa ni de lactosa: Pico alcalino

(rojo) y fondo alcalino (rojo). K/K. En ausencia de fermentación de hidratos de carbono no se forman ácidos, y la utilización de las peptonas con la consiguiente producción de grupos básicos hace que todo el medio aparezca de color rojo. Las bacterias que producen este tipo de fermentación son conocidas como "no fermentadoras" y es una importante indicación de que el microorganismo no pertenece a las Enterobacterias. Ej.: Pseudomonas aeruginosa (bacilo no Enterobacteriaceae Gram (-)).

b) Producción de gas: Los gases producidos son el CO2 y el H2 , productos finales del metabolismo de la glucosa. Se pueden apreciar por la aparición de burbujas en la parte inferior del medio, por la producción de grietas en su interior o incluso por la elevación del medio, que se separa del fondo. c) Producción de ácido sulfhídrico (SH2): El sulfhídrico es incoloro y su presencia se detecta a través de la formación de sulfuro ferroso, que es negro. Debido a que se requiere un medio ácido para que un microorganismo produzca sulfhídrico, un fondo negro debe leerse como ácido aún cuando el color amarillo esté oscurecido por el precipitado negro. Cuando se interpreta un resultado en el medio de Kligler puede observarse la combinación de cualquiera de las reacciones características, debiendo anotarse de la siguiente manera:

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a) Fermentación de hidratos de carbono: como ya se ha indicado. b) Producción de gases: se registra con un círculo alrededor del símbolo que indica la acidez o basicidad en la parte inferior del tubo. c) Producción de SH2: se indica con una "S" junto al símbolo que indica la acidez o alcalinidad de la parte inferior del tubo. * Interés: Se utiliza primariamente para identificar géneros de Enterobacterias. Reacciones de las Enterobacterias más frecuentes aisladas en clínica en agar hierro Kligler

Alc/A gas

Alc/A

no gas

A/A gas

Alc/A SH2

A/A SH2

Especies

+

+

+

-

-

E. Coli

+

+

-

-

-

Morganella sp. Providencia sp. Serratia sp.

+

-

+

-

-

Enterobacter sp.

+

-

+

+

+

Citrobacter sp.

+

+

-

+

-

Salmonella sp.

-

+

-

-

-

Shigella sp.

-

+

+

-

-

Yersinia sp.

-

-

+

-

-

Klebsiella sp.

-

-

-

+

+

Proteus sp.

alc= alcalino o rojo. a= ácido o amarillo.

Otras pruebas incluidas en este apartado son: E) PRUEBA DE LA FERMENTACIÓN DE AZÚCARES (para diferenciación de Enterobacterias; todas las Enterobacterias fermentan la glucosa. Algunas además fermenta la lactosa.)

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F) PRUEBA DE LA HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA (para diferenciar los Estreptococos del grupo D, que tienen esta propiedad, de otros Estreptococos, que no pertenecen a dicho grupo. PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO PROTÉICO Se investiga la presencia en los microorganismos de enzimas con actividad proteolítica. Incluiremos las siguientes pruebas: A) PRUEBA DE LA COAGULASA * Fundamento: se pretende comprobar la facultad de un microorganismo de coagular el plasma por acción de la enzima coagulasa. La coagulasa se puede encontrar en dos formas: libre y fija o ligada (unida a la pared bacteriana). La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo visible. * Medios y reactivos: No se debe emplear sangre citratada pues los microorganismos que utilizan citrato, como por ej. Streptococcus faecalis, pueden dar una falsa reacción positiva.

* Técnica: Se pueden seguir dos tipos de técnicas: 1.- Prueba del portaobjetos: pone de manifiesto la coagulasa ligada:

o Colocar una gota de agua destilada o solución salina fisiológica estéril sobre un portaobjetos.

o Emulsionar suavemente una gota de suspensión del

microorganismo en estudio de 24 horas en un caldo enriquecido (Ej.: BHI) en la gota de agua, utilizando un asa o una varilla. La prueba puede hacerse también partiendo directamente de una colonia obtenida en una placa de aislamiento.

o Añadir una gota del plasma y mezclar bien. o Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado.

2.- Prueba en tubo de hemólisis: pone de manifiesto la coagulasa ligada y la libre:

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o Añadir asépticamente 0,5 ml de plasma a 0,5 ml de un cultivo puro de 18 a 24 h. en un caldo enriquecido.

o Mezclar por rotación suave del tubo, evitando agitar el contenido.

o Incubar a 37º C, preferiblemente en un baño de agua, observando

periódicamente el tubo. * Lectura e interpretación de resultados: 1.- Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se detecta en 15 a 20 segundos por la formación de grumos blancos. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinación en 2 a 3 minutos. Todos los resultados negativos deben verificarse mediante la prueba en tubos debido a que algunas cepas de Staphylococcus aureus producen coagulasa libre que no reacciona en la prueba en portaobjetos. 2.- Prueba en tubo:

o La reacción se considera positiva ante cualquier grado de coagulación visible dentro del tubo. La reacción se observa mejor inclinando el tubo. Si es positiva, el coágulo permanece en el fondo del tubo.

o Reacción negativa: ausencia de coágulo tras 24-48 horas de incubación.

* Interés: se utiliza de manera específica para diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otras especies de Staphylococcus. B) PRODUCCIÓN DE HEMÓLISIS * Fundamento: los microorganismos, cuando se cultivan "in vitro" sobre medios que contienen sangre, pueden producir alrededor de las colonias unas zonas de hemólisis variables, según se origine una destrucción parcial o total de los eritrocitos. Las sustancias responsables de estos fenómenos son exotoxinas, liberadas por las bacterias al medio, llamadas hemolisinas. * Medio de cultivo: Agar-sangre, constituido por un medio básico (Ej.: agar nutritivo o TSA) adicionado de un 5% de sangre desfibrinada de carnero o de caballo, preferentemente la del primero, ya que las hemólisis se visualizan mejor. * Técnica: inocular siguiendo la técnica de aislamiento. Incubar durante 24-48 horas a 37º C. * Lectura e interpretación de resultados: podemos hablar de á, â, o ã hemólisis.

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La á-hemólisis es una hemólisis parcial, en la que los hematíes son parcialmente dañados. Se observa por una estrecha zona verde alrededor de la colonia. La â-hemólisis se caracteriza por una zona clara e incolora que rodea a la colonia, debido a la destrucción total de los glóbulos rojos. Es una hemólisis total. En la ã-hemólisis no se observa ninguna variación alrededor de las colonias ni actuación sobre los glóbulos rojos. * Interés: esta prueba se emplea fundamentalmente para determinar las diferentes especies de Streptococcus: por ej. S. pyogenes es â-hemolítico; S. pneumoniae es á-hemolítico. C. PRUEBA DEL INDOL * Fundamento: se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima triptofanasa o triptofanodesaminasa, capaz de desdoblar el triptófano (aminoácido) en indol más alanina. Se detecta la presencia de esta enzima mediante la reacción del indol producido con el reactivo p-dimetilaminobenzaldehido. * Medio de cultivo: Agua de peptona:

* Reactivo: Reactivo de Kovacs:

- Alcohol amílico o isoamílico o butílico... 75 ml - p-dimetilaminobenzaldehido............... 5 mg - HCl concentrado............................. 25 ml

* Técnica: sembrar con asa de platino el medio con el microorganismo objeto de estudio (tubos de hemólisis). Incubar a 37º C durante 24-48 horas. * Lectura e interpretación de resultados: se agregan unas gotas del reactivo de Kovacs directamente sobre el tubo incubado y se agita. En caso de que la prueba sea positiva, es decir, en caso de que se haya producido indol, éste reaccionará con el p-dimetilaminobenzaldehido, apareciendo un anillo de color rojo en la superficie del tubo. El HCl tiene como

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función bajar algo el pH, favoreciéndose así la reacción, y el alcohol amílico concentra el color en la superficie. Puede también utilizarse el reactivo de Erlich para realizar la lectura. C) PRUEBA DE LA FENILALANINA-DESAMINASA * Fundamento: comprobar si el microorganismo posee esta enzima. Si la poseen, estos gérmenes transforman la fenilalanina en ácido fenilpirúvico, el cual forma un complejo de color verde al reaccionar con el tricloruro de hierro. * Medio de cultivo: medio de fenilalanina. El medio se reparte en tubos, se esteriliza y se deja solidificar en pico de flauta. * Reactivo: Tricloruro de hierro (CL3Fe) al 10% en agua destilada. * Técnica: sembrar en tubos inclinados e incubar a 37ºC durante 24-48 h. * Lectura e interpretación de resultados: añadir 4 o 5 gotas del reactivo sobre la superficie del medio una vez incubado. Hacer rotar suavemente el tubo. En el término de 1 a 5 minutos, si la reacción es positiva aparece un color verde en el pico de flauta así como en el líquido en contacto con él. * Precauciones: la interpretación de positiva o negativa debe hacerse dentro de los primeros 5 minutos después de haber añadido el reactivo porque el color verde se desvanece con bastante rapidez. * Interés: para diferenciar los géneros Proteus y Providencia [+] del resto de los géneros de las Enterobacterias [-]. E) PRUEBA DE LA UREASA * Fundamento: mediante esta prueba determinamos la capacidad del microorganismo de desdoblar la urea en CO2 y amoníaco por acción de la enzima ureasa. Se visualiza el proceso debido a que la alcalinidad que se produce origina un cambio de color en el indicador que lleva incorporado el medio. Esta prueba se puede realizar en tubo con medio sólido o sobre discos de papel de filtro. 1.- Prueba en tubo * Medio de cultivo: Medio de Christensen:

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El medio se esteriliza en el autoclave. Se deja enfriar hasta 50-55ºC y a esta temperatura se le añaden 100 ml de solución de urea al 20% en agua destilada, esterilizada por filtración. Se distribuye el medio asépticamente en tubos estériles y se deja enfriar en posición inclinada. * Técnica: sembrar el pico de flauta con un inóculo denso e incubar a 35-37ºC durante 1-6 días, observando las primeras 6 horas y luego cada 24 horas. * Lectura e interpretación de resultados: Se considera la prueba [+], es decir, el microorganismo será ureasa [+] si debido a la alcalinización del medio, éste toma una coloración roja-rosácea. * Interés: todas las especies del género Proteus dan positiva esta reacción dentro de las 6 primeras horas, virando la superficie del medio a color rojo-rosáceo. Se puede así diferenciar el género Proteus de otros microorganismos ureasa [+] retardados como especies de Klebsiella o Enterobacter, así como de microorganismos ureasa [-] como E.coli. 2.- Prueba en discos de papel de filtro * Técnica: con una solución de urea se impregna un disco de papel de filtro colocado en una placa de Petri; se toma una colonia del microorganismo a estudiar y se frota sobre el disco húmedo. * Lectura e interpretación de resultados: Si el disco vira a rosado o rojo en los dos minutos siguientes indica positividad de la prueba. * Interés: todas las especies del género Proteus dan positiva esta prueba. F) PRUEBA DE LA DNasa * Fundamento: se basa en la capacidad que poseen ciertas bacterias para hidrolizar enzimáticamente el ADN produciendo una mezcla de mono y polinucleótidos. * Medio de cultivo: se utiliza el agar-DNA: Preparar el medio, esterilizar en autoclave y distribuir en placas. * Reactivo: ácido clorhídrico 1N. * Técnica: sembrar una colonia del microorganismo a investigar sobre una placa de agar DNA de forma que después de la investigación quede una estría superficial o un botón de crecimiento denso. Incubar 24 horas a 37º C.

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* Lectura e interpretación de resultados: cubrir la placa con ClH 1N. En caso de que el microorganismo sea productor de DNasa, se observa una zona clara alrededor del crecimiento; en caso negativo, el medio permanece opaco. * Interés: diferenciar S. aureus (DNasa +) de otras especies de Staphylococcus. Otras pruebas incluidas en este apartado: G) PRUEBA DE LA HIDRÓLISIS DE LA GELATINA (diferencia especies de Staphylococcus, dando positivo S. aureus. H) INVESTIGACIÓN DE DESCARBOXILASAS (para determinar grupos bacterianos entre las Enterobacterias.) PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO LIPÍDICO A) PRUEBA DE LA LIPASA Se lleva a cabo por cultivo sobre agar enriquecido con tween 80.La existencia de lipasa se traduce por la aparición de un halo opaco alrededor de las colonias. Esta prueba se utiliza para diferenciar ciertas Micobacterias. B) PRUEBA DE LA LECITINASA Se realiza por cultivo sobre un medio con yema de huevo (lecitina). Las colonias productoras de lecitinasa, forman una zona opaca a su alrededor. PRUEBAS BASADAS EN CARACTERES DE RESISTENCIA A CIERTAS SUSTANCIAS A) TEST DE LA OPTOQUINA * Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la optoquina. * Medio de cultivo: agar sangre * Reactivo: discos impregnados de optoquina. * Técnica: sembrar masivamente una colonia del microorganismo a investigar sobre una placa de agar sangre y colocar en la superficie de la placa los discos de optoquina. Incubar a 37º durante 24 horas.

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* Lectura e interpretación de los resultados: en caso de que el microorganismo sea sensible a la optoquina, se observa un halo de inhibición alrededor del disco. * Interés: diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otras especies de Streptococcus alfahemolíticos (resistentes). B) TEST DE LA BACITRACINA * Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la bacitracina. * Medio de cultivo: placas con agar sangre. * Reactivo: discos impregnados con bacitracina. * Técnica: sembrar masivamente una colonia del microorganismo a investigar en una placa de agar sangre y colocar sobre la placa los discos de bacitracina. Incubar a 37º durante 24 horas. * Lectura e interpretación de los resultados: una zona de inhibición del crecimiento alrededor del disco, aunque sea pequeña, indicará la sensibilidad. * Interés: diferenciar Streptococcus pyogenes (grupo A de Lancefield), sensible a la bacitracina, de otras especies de Streptococcus betahemolíticos (grupos B, C, D, F, G) que son resistentes. También podemos incluir en este apartado la prueba de SOLUBILIDAD EN BILIS (para diferenciar Streptococcus Pneumoniae, que tiene esta propiedad, de otras especies de Streptococcus alfahemolíticos. INVESTIGACIÓN DE SUSTANCIAS ENERGÉTICAS NUTRITIVAS A) PRUEBA DE LA UTILIZACIÓN DE CITRATOS * Fundamento: mediante esta prueba se determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono. El medio incluye citrato de sodio como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato como única fuente de carbono también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoníaco, llevando a la alcalinización del medio. El medio lleva un indicador, el azul de bromotimol, que es amarillo a pH ácido, verde a pH neutro y azul a pH alcalino.

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* Medio de cultivo: Medio de citrato de Simmons. El medio se reparte en tubos de ensayo y una vez estériles se inclinan en pico de flauta. * Técnica: sembrar en pico de flauta el microorganismo obtenido en medio sólido (los caldos pueden aportar elementos nutritivos que pueden falsear los resultados), procurando no tocar con el asa el medio, porque sustancias nutritivas de éste podrían igualmente falsear los resultados. Incubar a 37º C de 24-48 horas. * Lectura e interpretación de resultados:

o Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta tras 24-48 horas de incubación.

o Prueba negativa: no se observa crecimiento ni cambio de color (el

medio permanece de color verde.)

o Si se observa crecimiento sin cambio de color, se confirmará la positividad de la prueba incubando el tubo 24 horas más, durante las que suele aparecer el color azul.

* Interés: esta prueba junto con las de Indol, Rojo de Metilo y Voges Proskauer constituyen el IMViC y sirven, junto con otras pruebas para la diferenciación de los géneros de las Enterobacteriaceas. La prueba del TUBO DE GERMINACION o TEST DE FILAMENTACION, aunque estrictamente hablando no se trata de una prueba bioquímica, ha de ser nombrada dado el gran valor que posee para la identificación rápida y presuntiva de Candida Albicans y Candida stellatoidea, que son las dos únicas especies del género Candida capaces de producir tubos germinales. Para diferenciar anaerobios, si no se utiliza el método de cromatografía gas-líquido o IFI, se debe introducir una batería bioquímica que investigue: indol, urea, gelatina, catalasa, fermentación de hidratos de carbono, hidrólisis de almidón y esculina, comportamiento en medio de infusión cerebro-corazón con hemina, menadiona y sangre de cordero adicionada de diversas sustancias (como sales biliares, verde brillante o antibióticos), reducción de nitratos, lipasa y lecitinasa. SISTEMAS MULTIPRUEBAS En los últimos años han aparecido en el mercado numerosos sistemas o equipos multipruebas con el fin de facilitar la identificación de algunas bacterias, sobre todo Enterobacterias, cocos G (+), microorganismos anaerobios y levaduras. Estos sistemas proporcionan mayor comodidad y rapidez, pueden ser más baratos, pero no carecen de problemas si se manejan de forma incorrecta.

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Todos exigen unas condiciones muy precisas de concentración del inóculo, de inoculación, de incubación y de lectura, que si no se observan pueden dar lugar a importantes errores. Estos sistemas pueden ser manuales y automatizados. SISTEMAS COMERCIALES MANUALES: A) SISTEMA API Se trata de una tarjeta de material plástico dividida en pequeños pocillos que contienen diferentes substratos deshidratados, en los cuales se inocula una suspensión del microorganismo a estudiar. La lectura de los resultados se efectúa directamente, interpretando el color de cada reacción, o tras la adición de reactivos reveladores. Con los resultados se establece un código numérico que corresponde a una determinada especie reflejada en unas tablas. Existe disponible para la identificación de Enterobacterias, Estafilococos, Estreptococos, anaerobios, levaduras y algunas bacterias exigentes. Los resultados presentan una correlación con las pruebas clásicas superior al 90%.Su principal inconveniente radica en la incapacidad de detectar reacciones débiles. B) SISTEMA ENTEROTUBE Consiste en un tubo de plástico dividido en compartimentos que contienen sustratos en forma de agar. La inoculación se realiza directamente a partir de la colonia, por picadura y arrastre a través de los diferentes sustratos. La lectura e interpretación no difieren del sistema anterior. Existe comercializado para Enterobacterias y bacterias no fermentadoras. Los problemas de este sistema son más considerables en cuanto al inóculo, que no siempre es uniforme, y a la conservación de los sustratos. C) OTROS SISTEMAS a) MICRO-ID: consta de 15 cámaras de reacción en las que hay discos de papel impregnados de sustratos y reactivos correspondientes a cada prueba bioquímica a ensayar. b) MINITEK: es un sistema semejante al anterior. Actualmente hay más de 30 discos de sustratos diferentes.

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SISTEMAS COMERCIALES AUTOMATIZADOS: Estos suponen un importante progreso técnico, pero no están libres de problemas. Además no es aconsejable que estos sistemas utilizados por alguien que no está preparado y que confía ciegamente en el sistema sin adoptar una actitud crítica respecto a los resultados ofrecidos por éste. Suelen consistir en paneles en los que además de encontrarse los sustratos para el desarrollo de diversas pruebas bioquímicas, se encuentran diversos antimicrobianos a distintas concentraciones, con lo que se realiza simultáneamente la identificación y antibiograma del microorganismo objeto de estudio. Existen distintos paneles para distintos grupos de microorganismos. La inoculación y la lectura de estos paneles se suele hacer de forma automática, incorporándose los datos obtenidos en un ordenador, el cual proporciona con un índice alto de fiabilidad la identificación del microorganismo. Es obvio que ningún sistema automatizado puede ser mejor que el método de referencia, pues ante cualquier discrepancia este último se supone correcto. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS Una reacción de hibridación es el proceso por el que dos monocadenas de ADN, ARN o una de ADN y otra de ARN, de distinto origen y que muestran complementariedad de bases se unen formando una molécula estable, que recibe la denominación de híbrido. La técnica de hibridación se basa en el apareamiento del ácido nucleico a estudiar con una molécula de ADN o ARN conocida y llamada sonda. Esta reacción puede ponerse de manifiesto gracias a la incorporación de un sistema indicador bien radioactivo o no radioactivo (colorimétrico o fluorimétrico). En la reacción de hibridación, la unión sonda-diana se produce gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre bases complementarias (adenina-timina, guanina-citosina.) Hoy día estas técnicas se están introduciendo poco a poco en la rutina de los grandes Laboratorios de Microbiología, utilizándose con relativa frecuencia para la detección de patógenos humanos. En estos casos, las muestras se procesan para la inmovilización del ácido nucleico sobre un soporte sólido y posteriormente se realiza la hibridación con sondas específicas para el microorganismo causal de la infección. Además, la posibilidad de poder construir sondas frente a cualquier región del genoma de los microorganismos permite el diagnóstico diferencial de subtipos. Otra gran aplicación de la hibridación es que mediante ella se pueden detectar genes de resistencia a antibióticos directamente en el producto patológico, ofreciendo una alternativa al antibiograma.

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Para incrementar aún más la sensibilidad ha aparecido en la actualidad un método que permite incrementar específicamente una secuencia determinada de ácidos nucleicos hasta un número de copias que pueda ser detectado mediante la hibridación; es el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Este método permite la detección de aquellos microorganismos que se encuentran en pequeño número en la muestra y, aunque por el momento está limitado a laboratorios de investigación debido a su complejidad y alto coste económico, parece que en un futuro aparecerán equipos comerciales que contribuirán a su difusión.

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TEMA 16. ANTIBIOGRAMAS. TIPOS. INTRODUCCIÓN. Una vez aislado e identificado un microorganismo como probable agente causal de un proceso infeccioso, se ha de estudiar que susceptibilidad presenta a los agentes antimicrobianos. Se entiende por antibiograma la "técnica que permite el estudio "in vitro" de la sensibilidad de los microorganismos a los agentes antimicrobianos (antibióticos y quimioterápicos). Tiene por objeto proporcionar datos útiles para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, aportando una información valiosísima para el establecimiento de la terapéutica antiinfecciosa, aunque para el mayor rendimiento de ésta se deben considerar también las características del antimicrobiano, la clínica del proceso y al propio paciente que lo padece. Independientemente del tipo de antibiograma que se realice, es fundamental partir de cultivos puros para obtener resultados fiables. En general, se debe realizar siempre un aislamiento y trabajar con colonias de un solo tipo de microorganismo. Las técnicas realizadas a partir de cultivos mixtos casi nunca tienen valor y pueden conducir a errores terapéuticos graves. TIPOS DE ANTIBIOGRAMA. Existen diversos métodos siendo los más importantes los de:

• Difusión: se realizan en medio sólido; habitualmente son cualitativos, clasificando a los microorganismos en sensibles, intermedios o resistentes a un determinado antimicrobiano.

• Dilución: son los métodos de referencia. Se pueden realizar en medio

líquido o en medio sólido. Proporcionan resultados cuantitativos, destacando la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), que es la concentración más baja de antimicrobiano que inhibe el crecimiento del microorganismo.

Existen algunas técnicas rápidas para acortar los estudios de eficacia de antimicrobianos, pero si es posible deben evitarse. En caso de infecciones muy peligrosas o si, por examen microscópico del producto patológico, se sospecha una infección monomicrobiana, puede ser conveniente intentar determinar la susceptibilidad relativa del microorganismo directamente en la muestra; pero, realmente, no hay ningún método adecuado que pueda obviar el cultivo de la muestra, la identificación del posible agente etiológico y la realización de pruebas convencionales de susceptibilidad, aunque se retrase el resultado más tiempo.

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Hay dos puntos clave a tener en cuenta a la hora de realizar las pruebas de sensibilidad antimicrobiana. En primer lugar, es muy importante que se realicen de modo estandarizado ya que los resultados pueden variar mucho en función de las condiciones de trabajo (inóculo, medio de cultivo, concentración, pH); por este motivo se deben aplicar las normas publicadas en relación a este tipo de pruebas. Sin embargo, hay que señalar que estas normas solo se aplican a las bacterias aerobias y anaerobias, no habiéndose estandarizado métodos de prueba para hongos, parásitos y virus, y no puede asegurarse la reproductibilidad de los resultados del mismo laboratorio o la comparabilidad con los de laboratorios diferentes. En segundo lugar, los resultados de las pruebas para las bacterias se obtienen en el ambiente del laboratorio, que es muy diferente al medio interno del huésped. ANTIBIOGRAMA AEROBIO. MEDIO DE CULTIVO. Debe cumplir las siguientes condiciones:

• Ser de amplio espectro nutritivo, para que permita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos. En algunas ocasiones será necesario añadir sangre desfibrinada o achocolatada para microorganismos muy exigentes, pero normalmente no es aconsejable, ya que las proteínas que llevan incorporadas ligan a los antimicrobianos, disminuyendo su acción.

• Ser de pH estable (7,2-7,4): la acidez y la alcalinidad modifican la

actividad de determinados antimicrobianos.

• No debe contener inhibidores de antimicrobianos: Ej.:

o Las sales de Ca y Mg que forman complejos con tetraciclinas y betalactámicos.

o Los glúcidos, que en medios mal tamponados podrían dar lugar a disminución del pH.

o La sangre, ya comentada. o Las peptonas, que inactivan a derivados sulfamídicos.

El medio de cultivo que mejor reúne las anteriores condiciones y que es apto para cualquier tipo de antibiograma aerobio es el de Müeller-Hinton, que se utiliza tanto en caldo como en forma sólida. Previamente, antes de sembrar en el medio, hay que hacer la preparación de inóculo.

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PREPARACIÓN DEL INÓCULO. Se prepara sembrando 4-5 colonias iguales en 5 ml de solución salina fisiológica estéril o en caldo nutritivo o en TSB, e incubando de 2-6 horas a 35-37ºC, hasta que el crecimiento produzca una turbidez semejante a la del estandar número 0,5 de la escala de MacFarland, el cual se prepara adicionando 0,05 ml de Cl2Ba 0,048M (1% P/V; 1,175% P/V de Cl2Ba.2H2O) a 9,95 ml de H2SO4 0,36N (1% V/V). Si la turbidez fuera mayor que la del estándar, se diluye con solución salina fisiológica estéril o con el caldo y si fuera menor se deja más tiempo incubando. Cuando se consigue esta turbidez, equivale a una concentración de microorganismos de aproximadamente 1,5 x 108 microorganismos/ml. Si las circunstancias lo precisan también se puede obtener el inóculo deseado suspendiendo directamente en 5 ml de solución salina fisiológica estéril algunas colonias procedentes de un cultivo joven, homogeneizando bien y ajustando después la turbidez. ANTIMICROBIANOS A ELEGIR. Se utilizan productos de calidad con una actividad perfectamente conocida (en microgramos o UI/ml). Los antimicrobianos utilizados en cada prueba de sensibilidad se seleccionan según el tipo de microorganismo aislado o que se sospeche y el interés terapéutico; se recomienda elegir un solo representante de los antibióticos con estructura química similar y resistencia cruzada. A continuación se expone una relación donde se indican los antimicrobianos a elegir según el tipo de microorganismo, incluyendo los indicados para microorganismos anaerobios. Cada laboratorio seleccionará dentro de esos grupos los que considere más apropiados.

• Antibiograma de Staphylococcus.

Amicacina Ampicilina o Amoxicilina Ampicilina-sulbactam o Amoxicilina-clavulánico Cefalosporina de primera generación (Cefalotina) Cefalosporina de tercera generación (Cefotaxima) Clindamicina Cloxacilina (en Müeller-Hinton salino) Cotrimoxazol (Sulfametoxazol-trimetoprim) Eritromicina Fosfomicina Nitrofurantoína (en infecciones urinarias) Norfloxacina o Ciprofloxacina (en infecciones urinarias) Tetraciclina

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Tobramicina Vancomicina o Teicoplanina

• Antibiograma de Enterobacterias

Amicacina Ampicilina o Amoxicilina Ampicilina-sulbactam o Amoxicilina-clavulánico Cefotaxima Cefoxitina Ceftazidima Cefuroxima Ciprofloxazina Cloranfenicol (para Salmonella) Colistina (con fines taxonómicos) Cotrimoxazol Fosfomicina Imipenem Nitrofurantoína (en infecciones urinarias) Norfloxacina (en infecciones urinarias) Piperacilina Tobramicina Ticarcilina

• Antibiograma de Pseudomonas y afines.

Amicacina Azlocilina Aztreonam Cefotaxima Ceftazidima Ceftriaxona Ciprofloxacina Colistina Fosfomicina Imipenem Gentamicina Ofloxacina Norfloxacina (en infecciones urinarias) Piperacidina Ticarcilina Tobramicina

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• Antibiograma de Streptococcus y otros microorganismos delicados.

Ampicilina Cefalotina Cefotaxima o Ceftriaxona Ciprofloxacina Cloranfenicol Cotrimoxazol Eritromicina Fosfomicina Imipenem Tetraciclina Vancomicina

• Antibiograma de anaerobios

Cefoxitina o Cefmetazol Clindamicina Cloranfenicol Eritromicina Imipenem Metronidazol Penicilina

INCUBACIÓN: Para todos los antibiogramas aerobios, 35-37º C durante 18-24 horas. La lectura e interpretación de resultados se verán en cada tipo de antibiograma. CONTROL DE CALIDAD. Debido al gran número de variables que pueden afectar los resultados, es muy importante realizar un riguroso control de calidad periódicamente con cepas patrón de sensibilidad conocida. ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN EN MEDIO SÓLIDO (MÉTODO DE BAUER-KIRBY). Se trata de un método de fácil ejecución, exacta reproducción, facilidad de lectura y fiabilidad de resultados. Por todo ello es el que se realiza rutinariamente en la mayor parte de los pequeños laboratorios, recurriéndose también a él, en los grandes laboratorios, cuando los resultados obtenidos por el método de dilución en microplacas no son de total fiabilidad. Para ello se requiere que todos los detalles del procedimiento estén cuidadosamente controlados y sean uniformes.

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Existen distintas técnicas que aplican el método de difusión en medio sólido, siendo una de las más utilizadas la de Bauer-Kirby. Este método consiste en inocular una placa de agar Müeller-Hinton con el microorganismo problema y colocar sobre la superficie del medio unos discos que contengan concentraciones determinadas de los antimicrobianos a ensayar. El antimicrobiano difunde por el medio, produciendo un gradiente de concentración. Esta difusión se puede pensar como una serie de anillos concéntricos, donde la concentración del antimicrobiano disminuye a medida que aumenta la distancia al centro del disco. Después de la incubación, el microorganismo se desarrolla en toda la placa excepto alrededor de los discos cuyas concentraciones son inhibitorias. La distancia en la que se inhibe el crecimiento del microorganismo inoculado en el medio se denomina halo de inhibición, se mide en milímetros y es inversamente proporcional a la CMI. MEDIO DE CULTIVO. Se emplea el agar Müeller-Hinton, repartido en placas de modo que el medio alcance en la placa un espesor uniforme de 4 mm; si es más fino, los antimicrobianos tienden a difundir más en dirección lateral, aumentando el tamaño de las zonas de inhibición; si el agar es de más de 4 mm. de espesor, se produce una mayor difusión hacia abajo, con tendencia a estrechar artificialmente las zonas de inhibición. Antes de utilizar las placas se debe comprobar que no posean agua de condensación y se deben dejar a temperatura ambiente hasta que alcancen la del laboratorio. INÓCULO. La densidad del inóculo es uno de los factores que más influye en el diámetro del halo de inhibición, existiendo una relación inversa entre la concentración del inóculo bacteriano y dicho halo. Por esto se debe estandarizar su preparación, lo cual se consigue ajustando la turbidez al 0,5 de la escala de MacFarland, tal y como ya se ha descrito. SIEMBRA. La inoculación se debe hacer dentro de los primeros 15 minutos después de preparado el inóculo. Existen varios métodos de inoculación; el de Bauer-Kirby consiste en introducir un escobillón en el inóculo ajustado, eliminar el exceso presionando suavemente sobre las paredes del tubo y sembrar la placa por estriación masiva en superficie, lo más homogénea posible. Antes de colocar los discos se deja secar la superficie. No debe transcurrir más de 10 minutos entre la siembra y la colocación de los discos.

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COLOCACIÓN DE LOS DISCOS. Los discos utilizados son de papel de filtro estériles de 6 mm de diámetro y contienen diferentes antimicrobianos desecados a la concentración convenientemente expresada (expresada en ìg/ml o en UI, atendiendo a las normas de la OMS). Se suelen comercializar en tubos de 50 unidades, algunos de los cuales llevan un dispositivo que ayuda a la dispensación de los discos. De todas formas, suele ser más cómodo y seguro colocar los discos sobre la placa con pinzas estériles y frías (se mantienen en alcohol y se flamean y enfrían antes de su uso), presionando un poco sin tocar con las pinzas el medio de cultivo. Antes de su uso se sacan del frigorífico y se dejan a temperatura ambiente unos 30 minutos. Una vez colocados en la placa, los discos deben quedar a unos 15 mm de distancia entre si y del borde de la placa para que no se interfieran los halos de inhibición. En las placas de 9 centímetros de diámetro se colocaran 6-8 discos y en las placas de 14 cm 12 discos; para microorganismos que suelan dar halos de inhibición muy grandes, como Haemophilus sp., se deben colocar menos discos por placa. Se debe evitar que los discos rueden por el medio al colocarlos, ya que el antimicrobiano difundiría incontroladamente. Existen dispensadores automáticos de discos, que llevan acoplado un tipo especial de cartucho y que permiten la dispensación de tantos discos a la vez como cartuchos sea capaz de albergar. Antes de incubar las placas se deben dejar reposar a temperatura ambiente unos 10 minutos para que los antimicrobianos hagan una predifusión. A continuación se incuban a 35-37ºC durante 18-24 horas. LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS. Después del período de incubación aparecen los halos de inhibición alrededor de los discos que contienen antimicrobianos a los cuales es sensible el microorganismo en estudio. Utilizando una regla, se medirá el diámetro del halo de inhibición en mm. Con la medida obtenida nos vamos a unas tablas que nos van a indicar si el microorganismo es "sensible", "moderadamente sensible" o "resistente". Para la interpretación de los resultados ha de tenerse en cuenta la concentración del disco, el microorganismo en cuestión y el medio de cultivo empleado, entre otros factores. La categoría "sensible" indica que la cepa estudiada es afectada por concentraciones normales de antimicrobianos, alcanzadas en el organismo administrando dosis habituales.

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La categoría de "sensibilidad intermedia" indica que para actuar sobre el microorganismo se debe forzar la dosis, lo cual no siempre es posible, debido a los efectos tóxicos. La categoría de "resistente" indica que la concentración máxima de antimicrobiano que se puede conseguir en el lugar de la infección no es suficiente para afectarle. La tendencia actual es a hacer una interpretación binaria, clasificando los microorganismos en sensibles o resistentes, según el diámetro de la zona de inhibición sea mayor o menor que el establecido. Las respuestas intermedias quedan incluidas dentro de las resistentes para no inducir a errores terapéuticos. A la hora de realizar la lectura hay que tener una serie de precauciones en casos concretos:

• Con algunos antibióticos, como las sulfamidas, aparecen bordes borrosos del halo de inhibición y se debe medir el diámetro teniendo en cuenta la parte exterior de dicho borde.

• En los Proteus se puede presentar invasión de la zona interior del halo de inhibición, observándose sin embargo un borde neto. Esta invasión no hay que tenerla en cuenta en las lecturas y el diámetro se mide considerando dicho borde neto.

• Staphylococcus aureus presenta resistencia cruzada a todos los betalactámicos; esta resistencia se estudia mediante discos de oxacilina de 1 ìg o de meticilina de 5 ìg, con incubación a 30ºC, o sobre Müeller-Hinton salino; las cepas resistentes a estos antibióticos deben considerarse resistentes al grupo.

LIMITACIONES DEL MÉTODO y CAUSAS DE ERROR. Pueden clasificarse en dependientes de: * Medio: mal estado, sin ajuste de pH, volumen inadecuado de la placa. * Antimicrobianos:

• Para los antimicrobianos que difunden lentamente en el agar los resultados pueden no ser fidedignos y se deben usar controles, aún cuando se utilicen discos de elevado contenido para contrarrestar en cierta medida la difusibilidad lenta.

• Causas de error: mala conservación de los discos (deben conservarse en frigorífico, en recipientes herméticamente cerrados y con desecador), caducidad de los mismos y tiempo de demora al inocularlos.

* Microorganismos: • Las técnicas de difusión no son aplicables a microorganismos de

desarrollo lento; si se requiere una incubación prolongada para lograr suficiente desarrollo y obtener una zona de inhibición detectable, el

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antibiótico puede llegar a deteriorarse hasta el punto de producir lecturas imprecisas.

• Estas técnicas tampoco dan buenos resultados con microorganismos muy exigentes.

• Los métodos de difusión no son aplicables a la determinación de susceptibilidad de anaerobios. El largo período de incubación necesario para la recuperación de muchos anaerobios ha hecho difícil establecer esquemas interpretativos fiables.

• Causas de error: lo más habitual es el exceso de inóculo. También puede conducir a errores la utilización de cultivos viejos, la inoculación de más de un microorganismo (colonias distintas o cultivos contaminados), la excesiva demora en la siembra y las condiciones de incubación.

* Observador: errores de lectura o excesiva demora en la misma y errores de trascripción o interpretación de resultados. ANTIBIOGRAMA POR DILUCIÓN. Como ya hemos dicho, se pueden realizar en medio líquido o en medio sólido. Mediante este tipo de antibiograma se determina la "CMI": menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir totalmente el crecimiento bacteriano "in vitro". EN MEDIO LÍQUIDO. Consiste en preparar una batería de tubos con distintas diluciones (concentraciones crecientes) del antimicrobiano, depositar en cada tubo un inóculo de densidad celular conocida y, tras incubación, ver en que tubos hay crecimiento y en cuales no. El tubo cuya concentración de antimicrobiano sea menor y en el que no haya crecimiento corresponde a la CMI.

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A) MEDIO DE CULTIVO: se utiliza el caldo de Müeller-Hinton o el de tripticasa soja para aquellos microorganismos que no pueden crecer en Müeller-Hinton. B) TÉCNICA:

• Preparar el inóculo correspondiente al 0,5 de la escala de Mac Farland. Realizar una dilución 1/100 del inóculo, lo que equivale a 105 microorganismos/ml aproximadamente.

• Añadir 1 ml de este inóculo a una batería de tubos que contengan 1 ml de

caldo de Müeller- Hinton que lleva incorporado el antimicrobiano a concentraciones crecientes.

• Incubar a 37º C durante 18-24 horas.

• El tubo cuya concentración de antimicrobiano sea menor y no presente

crecimiento, corresponde a la CMI. Se debe inocular un tubo de Müeller-Hinton que se guardará en frigorífico a 4º C como control de siembra.

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C) LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: se considera concentración mínima inhibitoria (CMI) la del tubo con menor concentración (mayor dilución) de antimicrobiano que no presente aumento de turbidez respecto al tubo testigo guardado en el frigorífico. MICROTÉCNICA DE DILUCIÓN EN CALDO. Hoy día, en los laboratorios con un alto volumen de trabajo, se suele utilizar la microtécnica de dilución en caldo, cuyo fundamento es el mismo que el del método que acabamos de describir, diferenciándose en que la sensibilidad de los microorganismos a distintos antimicrobianos se prueba en una serie de "pocillos" moldeados en una placa de plástico. Cada placa puede contener 80 o más pocillos según el número de hileras horizontales y verticales. Ej.: una microplaca que contenga 80 concavidades dispuestas en 10 hileras verticales y 8 horizontales, permite el estudio de 10 antimicrobianos diferentes, cada uno a 8 diluciones seriadas. La microplaca se prepara colocando el volumen adecuado de las distintas diluciones de antimicrobianos en los pocillos, si bien existen ya en el mercado microplacas con los antimicrobianos liofilizados, preparadas para su uso inmediato

A B C D E F G H I J

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128 ìg/ml 64 ìg/ml 32 ìg/ml 16 ìg/ml 8 ìg/ml 4 ìg/ml 2 ìg/ml 1 ìg/ml Una vez preparadas dichas microplacas e incubadas se observará el crecimiento bacteriano como un botón en el fondo del pocillo. Estudiaremos a continuación el ejemplo de la página anterior: Cada hilera vertical corresponde a un antimicrobiano distinto. Las hileras horizontales corresponden a diferentes diluciones del antimicrobiano.

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• Observamos que en la hilera "A" con un antimicrobiano determinado [A]

hay crecimiento bacteriano en todas las concavidades. Esto significa que el microorganismo en estudio es resistente al antimicrobiano [A] en todas las concentraciones ensayadas, o bien, que la CMI es superior a 128 ìg/ml.

• Observamos que en la hilera "B" hay crecimiento bacteriano en las seis últimas concavidades. Esto significa que la CMI del antimicrobiano [B] para el microorganismo en estudio es 64 ìg/ml.

EN MEDIO SÓLIDO. Este método permite también la investigación de la CMI. Tiene la ventaja de ser de más fácil y mejor manipulación que la técnica en medio líquido. Además permite realizar el estudio de varias cepas distintas por placa y descubre mejor una contaminación. Este método implica el uso de una serie de placas de agar Müeller-Hinton, cada una con una diferente concentración del antimicrobiano a probar. Las diluciones de antimicrobiano suelen oscilar entre unos límites establecidos, que van desde 0,25 ìg/ml hasta 128 ìg/ml, para la mayoría de los antimicrobianos, sin excepciones. El antimicrobiano se añadirá al medio de cultivo después de esterilizarlo y una vez que se haya enfriado hasta aproximadamente 50º C, en proporción 1/10 (V/V).Se procurará una distribución lo más homogénea posible, evitando la formación de burbujas. Paralelamente se preparan placas control sin antimicrobiano. Las placas solidificadas se guardan refrigeradas y deben utilizarse antes de una semana. A) MEDIO DE CULTIVO: agar Müeller-Hinton suplementado con un 5% de sangre en caso necesario. B) TÉCNICA:

• Preparar las placas de agar Müeller-Hinton con las distintas diluciones de antimicrobiano.

• Preparar el inóculo ajustándolo al 0,5 de la escala de MacFarland y diluyéndolo al 1/10.

• Inocular: la inoculación se realiza en "gota" (sin extender) mediante un asa calibrada que dispense 1 o 2 microlitros o con un dispositivo multidispensador que deposite este volumen de muestra, del tipo del replicador de Steers. En ambos casos, una gota de 5-8 mm de diámetro contiene la misma concentración microbiana. Se comienza inoculando las placas de menor concentración, dejando las placas control las últimas con el fin de comprobar que hubo microorganismos viables en todo el procedimiento y ausencia de contaminación. La posible invasión de

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Proteus se evita presionando un cilindro de vidrio en el agar que rodea la gota.

• Las placas inoculadas se dejan reposar hasta que las gotas del inóculo se absorben completamente, y luego se incuban a 35-37ºC durante 18-24 horas.

C) LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: la CMI viene dada por la placa con menor concentración de antimicrobiano que evite el crecimiento de la cepa investigada.

La interpretación clínica de estos resultados se traduce en que se debe lograr alcanzar en el lugar de la infección una concentración de antimicrobiano al menos igual a la C.M.I.. SISTEMAS AUTOMATIZADOS PARA PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD. Estos sistemas aportan un resultado que se puede clasificar en susceptible, intermedio o resistente o en una concentración mínima inhibitoria. Algunos

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sistemas se limitan a hacer automáticos métodos tradicionales, mientras que otros pueden dar lecturas tras pocas horas de incubación. La mayoría utilizan un procedimiento mecanizado de inoculación de caldo sobre las diferentes concentraciones de atimicrobiano, congelado o liofilizado, y una fase de lectura y procesamiento de resultados; otros sistemas inoculan placas de agar con diferentes diluciones de antimicrobiano, de forma similar a la que se utiliza con el replicador de Steers. La mayoría de los sistemas se basan en la comparación del crecimiento microbiano después de un determinado tiempo de incubación en presencia del antimicrobiano y el obtenido durante el mismo tiempo en su ausencia. La cantidad de crecimiento puede determinarse utilizando transmisión o dispersión de la luz, efectuándose los cálculos por ordenador. Para la determinación de la CMI se emplean diferentes concentraciones del antimicrobiano. ANTIBIOGRAMA ANAEROBIO. Los estudios de sensibilidad frente a los gérmenes anaerobios no tienen una eficacia y reproductibilidad igual que los destinados a los gérmenes aerobios (los vistos hasta ahora). Por este motivo hay investigadores que recomiendan la no utilización sistemática de estos métodos y que el tratamiento se establezca según criterios terapéuticos previamente establecidos, basados en el conocimiento de los patrones de sensibilidad de los distintos grupos de anaerobios, y en la probable etiología según el tipo y lugar de la infección. Hay ocasiones, sin embargo en las que la gravedad del proceso o su larga duración aconsejan su realización. Se sigue una metodología similar a la descrita para los microorganismos aerobios, siendo de elección el método de dilución, tanto en medio líquido como en sólido, utilizando un medio de cultivo enriquecido en incubando en condiciones anaerobias durante 24-72 horas. Como ya se ha comentado anteriormente, el método de Bauer-Kirby no presenta la utilidad que tiene en ambiente aerobio ya que las condiciones de este método no son totalmente reproducibles en ausencia de oxígeno; así, el medio de Müeller-Hinton no sirve para el crecimiento de muchos anaerobios, y tiene que utilizarse suplementado con sangre de cordero o de caballo, falseando esta inclusión el diámetro del halo de inhibición producido por algunos antibióticos. Además, no existe una estricta correlación entre los citados halos y las CMIs. Otra dificultad que presenta el método es que sólo es válido para microorganismos de crecimiento rápido y la mayoría de los anaerobios no lo son. Señalaremos, a continuación, una serie de factores a tener en cuenta antes de efectuar estudios de sensibilidad para microorganismos anaerobios:

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MEDIO DE CULTIVO. Para los antibiogramas anaerobios en caldo se puede utilizar el caldo infusión cerebro corazón, el caldo Schaedler, el caldo Brucella o el tioglicolato, siendo probablemente este último el que mejores resultados da. Estos medios deben ir suplementados con hemina y vitamina K1 (factores de crecimiento para Bacteroides fragilis). También se les puede adicionar extracto de levadura, que aportará vitaminas, purinas y pirimidinas. Para las técnicas en medios sólidos se suelen utilizar, además de los ya citados previa adición de agar, el Eugón agar, el Müeller-Hinton agar suplementado con un 5% de sangre de cordero o de caballo o el medio de Wilkins y Chalgren, específicamente recomendado para la prueba de dilución en agar. ATMÓSFERA DE INCUBACIÓN: La más recomendable es la que está compuesta por un 5% de CO2, 10% de H2 y 85% de N2. La cantidad de CO2 no debe exceder del 10%, pues puede disminuir la acción de algunos antibióticos como lincomicina, macrólidos y aminoglicósidos. Además, en los medios sólidos influye rebajando el pH superficial, con la consecuente alteración del efecto de beta-lactámicos y aminósidos. INÓCULO. Es prácticamente imposible precisar la cifra ideal de microorganismos para el inóculo del antibiograma anaerobio. Sin embargo, con el fin de estandarizar, se considera el inóculo más apropiado el que presenta una turbidez igual a la mitad del 1 de la escala de MacFarland. En la práctica se llega a la citada turbidez suspendiendo directamente un cultivo joven, con menos de 72 horas, en caldo recientemente regenerado. A continuación se diluye al 1/200, con el fin de obtener una concentración bacteriana situada entre 105 y 106 UFC/ml (unidades formadoras de colonias /ml). La manipulación puede hacerse en condiciones aerobias dentro de la primera media hora, sin que el germen anaerobio pierda viabilidad. PRUEBAS ESPECIALES. Ocasionalmente una determinada situación clínica puede justificar la solicitud al laboratorio de una prueba no habitual respecto a fármacos antimicrobianos. A continuación se describen las pruebas no habituales que se solicitan con más frecuencia. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDA. A partir de la técnica de antibiograma por dilución en medio líquido (macro y microtécnica) se puede calcular la "CMB" (Concentración Mínima Bactericida)

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que se define como la "menor concentración de antimicrobiano que mata por lo menos el 99,9% del inóculo original". Se pone de manifiesto sembrando con asa masivamente en una placa de agar Müeller-Hinton los tubos que no hayan presentado turbidez e incubando a 37ºC durante 18-24 horas. En la práctica la CMB vendrá dada por la concentración del tubo con menor concentración de antimicrobiano que impida el crecimiento sobre el medio sólido. La determinación de la CMB está especialmente indicada en casos en que las defensas del enfermo están seriamente comprometidas, prefiriéndose administrar drogas bactericidas o fungicidas. La endocarditis ha sido y sigue siendo una de las principales indicaciones para estas pruebas. La determinación de la CMB es también una prueba frecuentemente solicitada para pacientes de trasplante y quimioterapia del cáncer. PRUEBA DE LA BETALACTAMASA. El grupo de fármacos betalactámicos engloba las penicilinas y cefalosporinas. El mecanismo de resistencia más frecuente frente a este tipo de fármacos es la producción de una enzima bacteriana (betalactamasa) que inactiva el fármaco al romper el anillo betalactámico. La prueba de la betalactamasa constituye un método rápido de establecer si un germen que se ha aislado produce betalactamasa. En la práctica diaria se realiza de forma rutinaria in vitro para investigar, de forma más rápida que con el antibiograma, la producción de betalactamasa por Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza y Neisseria gonorrhoeae. Sin embargo, hay que recordar que a veces las bacterias son resistentes a los fármacos betalactámicos por mecanismos que no tienen nada que ver con la producción de betalactamasa. Por lo tanto, un resultado positivo indica una resistencia, mientras que un resultado negativo no garantiza la sensibilidad. La prueba se realiza exponiendo un substrato de prueba batalactámico al germen durante un período que oscila, dependiendo del microorganismo y el método de prueba, entre los 10 segundos y los 60 minutos. Existen tres métodos de uso general: el método acidométrico, el método yodométrico y el método de la cefalosporina cromógena, pudiendo realizarse tanto con un substrato líquido como con papeles de filtro impregnados. Quizás de estos tres métodos el más utilizado sea el de la cefalosporina cromógena; la prueba se lleva a cabo añadiendo una suspensión concentrada del germen en estudio a un substrato cromógeno amortiguado (en esta prueba, una cefalosporina cromogénica como la nitrocefina), incubándolo durante diez minutos a temperatura ambiente y observando si se produce cambio de color, que se originaría por la ruptura de los anillos betalactámicos de la cefalosporina cromogénica. ESTUDIO DE SECUENCIAS DE ADN PORTADORAS DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANA: Mediante el estudio del ADN, por sondas y actualmente

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mediante tratamiento previo con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), puede identificarse la presencia de secuencias responsables de resistencia a distintos antimicrobianos; por ejemplo, la secuencia TEM-1 es responsable de la resistencia frente a penicilinas y cefalosporinas. PRUEBAS DE SINERGIA ANTIMICROBIANA. Cuando se administran dos o más fármacos antimicrobianos a un paciente, el efecto de la combinación puede ser:

• Aditivo: cuando la actividad antimicrobiana de la combinación es la que cabría prever sumando las actividades que presentan los fármacos por separado.

• Antagónico: cuando la actividad de la combinación es notablemente inferior a la suma de las actividades individuales.

• Sinérgico: cuando la actividad de la combinación es considerablemente superior a la suma de las actividades individuales.

En la mayor parte de los casos la administración de fármacos de forma combinada se realiza sobre la base de la experiencia descrita anteriormente. Solo en casos muy concretos, cuando un resultado sea esencial para el tratamiento de un paciente, es aconsejable estudiar el efecto de una combinación frente al germen aislado en el propio paciente. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL SUERO. En la actualidad el estudio de la actividad antibacteriana del suero es una prueba que se realiza en pacientes con septicemia, endocarditis, osteomielitis y meningitis para conocer la validez de la terapia establecida y modificarla en el caso de que los niveles sanguíneos (séricos) sean bajos. El propósito de esta técnica es determinar el título de actividad antimicrobiana de la combinación suero-antibiótico contra el microorganismo aislado del proceso infeccioso en el paciente estudiado. La prueba bactericida del suero se realiza con muestras de suero obtenidas inmediatamente antes de la administración del antimicrobiano (muestra en el mínimo) y 30-90 minutos de después de la misma (según la vía de administración y el fármaco de que se trate) (muestra en el máximo). Se diluyen los sueros utilizando como diluyente medio de cultivo líquido (BHI, caldo de Müeller-Hinton suplementado con Ca++ y Mg++) o preferiblemente suero humano acumulado carente de antimicrobianos ya que permite mantener una concentración constante de las proteínas séricas en cada tubo. A continuación se añade una suspensión de turbidez estandarizada del germen aislado en el paciente a cada tubo de dilución de suero y a un tubo control que no contiene actividad antimicrobiana.

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La densidad de microorganismos en cada tubo debe ser de aproximadamente 5x105 UFC/ml. Los tubos se incuban a 35ºC durante 20 horas en una atmósfera apropiada para el germen, se agitan para exponer a los microorganismos a la actividad antimicrobiana que pueda haber escapado a la exposición previa al adherirse a las paredes del tubo, y se vuelven a incubar otras cuatro horas. En este punto se determina el título inhibitorio del suero, identificando la dilución máxima del suero que inhibe el crecimiento visible del microorganismo. Los tubos que no presentan crecimiento visible se subcultivan en agar sangre o agar chocolate y se incuban durante 24 horas. Se cuenta el número de colonias de cada subcultivo y se determina el título bactericida del suero, identificando la máxima dilución del suero que provoca la muerte de al menos el 99,9% del inóculo original. Actualmente, de forma general, se considera adecuada una dosificación de antibiótico que de un título bactericida máximo ≥32 y mínimo ≥8. DETERMINACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DE ANTIMICROBIANOS EN LOS LÍQUIDOS DEL ORGANISMO. La determinación del nivel de antimicrobiano en el suero u otro líquido corporal está indicada en los siguientes casos:

• Fármacos antimicrobianos (ej.: aminoglucósidos, cloranfenicol) que tienen unos márgenes de concentraciones terapéuticas-tóxicas estrechos o se acumulan rápidamente hasta alcanzar concentraciones tóxicas en los pacientes con disfunciones renales o hepáticas.

• Pacientes donde no se ha demostrado el efecto clínico previsto; el fracaso del tratamiento podría deberse a comportamiento particular del antimicrobiano en ese paciente o a efectos del paciente, microorganismo o antimicrobiano que pueden desviar o anular la acción del antimicrobiano.

• Tratamiento de infecciones locales severas. • Situaciones donde la enfermedad subyacente del paciente es tal que

puede suponerse que el antibiótico debe hacer algo más que eliminar rutinariamente el microorganismo.

La mayoría de las determinaciones de los niveles de antimicrobianos se realizan con inmunoensayos instrumentados rápidos. Los inmunoensayos desarrollados para el control de las drogas son mucho más específicos que los bioensayos y además tienen la ventaja de proporcionar los resultados en unas pocas horas, sin requerir una incubación hasta el día siguiente.

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DIÁMETRO ESTANDAR Y CORRELACIÓN APROXIMADA CON LA CMI ANTIMICROBIANO

Carga

Diámetro en milímetros

Correlación con CMI en mcg/ml

R

MS

S

R

S

A. nadilíxico y pipemídico

30 mcg

≤ 13

14-18

≥ 19

≥ 32

≤ 12

Amicacina

30 mcg

≤ 14

15-16

≥ 17

≥ 32

≤ 12

Ampicilina (Enterobacterias)

10 mcg

≤ 11

12-13

≥ 14

≥ 32

≤ 8

Ampicilina para enterococos

10 mcg

≤ 16

-

≥ 17

≥ 16

≤ 4

Ampicilina para estafilococos

10 mcg

≤ 28

-

≥ 29

âlactamasa

≤ 0,2

Ampicilina para estreptococos

10 mcg

≤ 21

22-29

≥ 30

≥ 4

≤ 0,1

Ampicilina para haemophilus

10 mcg

≤ 19

-

≥ 20

≥ 4

≤ 2

Azlocilina

75 mcg

≤ 14

15-17

≥ 18

≥ 256

≤ 64

Aztreonan

30 mcg

≤ 17

-

≥ 26

≥ 32

≤ 8

Cafaclor para haemophilus

30 mcg

≤ 18

19-23

≥ 24

≥ 32

≤ 8

Cefalosporinas

30 mcg

≤ 14

15-17

≥ 18

≥ 32

≤ 8

Ciprofloxacina

5 mcg

≤ 16

17-20

≥ 21

≥ 4

≤ 1

Clindamicina

2 mcg

≤ 14

15-16

≥ 17

≥ 2

≤ 1

Cloranfenicol

30 mcg

≤ 12

13-17

≥ 18

≥ 25

≤ 12

Cloranfenicol (haemophilus)

30 mcg

≤ 25

26-28

≥ 29

≥ 8

≤ 4

Colistina

10 mcg

≤ 8

9-10

≥ 11

≥ 4

-

Cotrimoxazol

25 mcg

≤ 10

11-15

≥ 200

≥35

Eritromicina

15 mcg

≤ 13

14-17

≥ 18

≥ 8

≤ 2

Fostomicina

50 mcg

≤ 11

12-14

≥ 15

-

-

Gentamicina

10 mcg

≤ 12

13-14

≥ 15

≥ 8

≤ 6

Imipenem

10 mcg

≤ 14

-

≥ 16

≥ 16

≤ 4

Meticilina

5 mcg

≤ 9

10-13

≥ 14

-

≤ 3

Netilmicina

30 mcg

≤ 12

13-14

≥ 15

≥ 32

≤ 8

Nitrofurantoína

300mcg

≤ 14

15-16

≥ 17

≥ 100

≤ 25

Norfloxacina

10 mcg

≤ 14

-

≥ 17

≥ 16

≤ 4

Ofloxacina

5 mcg

≤ 14

-

≥ 16

≥ 8

≤ 2

Oxacilina

1 mcg

≤ 10

11-12

≥ 13

-

≤ 1

Oxacilina para neumococos

1 mcg

≤ 19

-

≥ 20

-

≤ 0,06

Penicilina para estafilococos

10 UI

≤ 28

-

≥ 29

âlactamasa

≤ 0,1

Penicilina para estreptococos

10 UI

≤ 19

20-27

≥ 28

≥ 4

≤ 0,1

Piperacilina (Enterobacterias)

100mcg

≤ 14

15-17

≥ 18

≥ 256

≤ 64

Piperacilina para pseudomonas

100mcg

≤ 17

-

≥ 18

≥ 128

≤ 64

Rifampicina

5 mcg

≤ 16

17-19

≥ 20

≥ 4

≤ 1

Tetraciclina

30 mcg

≤ 14

15-18

≥ 19

≥ 16

≤ 4

Ticarcilina para enterobacterias

75 mcg

≤ 14

15-19

≥ 20

≥ 128

≤ 16

Ticarcilina para pseudomonas

75 mcg

≤ 14

-

≥ 15

≥ 128

≤ 64

Tobramicina

10 mcg

≤ 12

13-14

≥ 15

≥ 8

≤ 6

Vancomicina

30 mcg

≤ 9

10-11

≥ 12

-

≤ 5

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TEMA 17.- CONTROLES DE CALIDAD INTERNOS Y EVALUACIÓN EXTERNA DE LA CALIDAD.

INTRODUCCIÓN En un sentido amplio, el control de calidad en los laboratorios debe hacerse siempre extensivo a cualquiera de sus aspectos clínico y de laboratorio, ya que en la práctica resulta difícil considerarlos de forma aislada o independiente. Debe procurarse ante todo una correcta recogida de los especímenes de sangre, su adecuada manipulación y el empleo de los métodos más fiables. Ello obliga, por tanto, al mantenimiento periódico de los instrumentos analíticos y a una verificación sistemática de la calidad de las técnicas y sus correspondientes reactivos mediante la ayuda de especímenes y muestras control adecuados y de procedencia garantizada. Finalmente, el laboratorio debe también velar por la claridad y corrección en la forma de expresar los resultados al objeto de facilitar en todo momento su interpretación clínica. En los laboratorios, el empleo cada vez más extendido de autoanalizadores ha contribuido de manera decisiva no sólo a incrementar la rapidez en la obtención de los análisis, sino fundamentalmente a mejorar la exactitud y precisión de los resultados. Asimismo, la posibilidad de obtener de forma sistemática parámetros que, por el carácter engorroso de su determinación manual, sólo se suministraban esporádicamente ha significado una gran mejora en el diagnóstico diferencial de numerosas situaciones patológicas. Como contrapartida, tales instrumentos precisan una atención técnica permanente, por cuanto un fallo en su calibración o pequeñas variaciones intrínsecas del sistema pueden repercutir de manera decisiva sobre un número muy elevado de resultados. El control de calidad en los laboratorios tiene especial importancia para todas aquellas técnicas fundamentales en el diagnóstico clínico en general. Aunque estos parámetros, hoy día, son determinados de forma sistemática por diversos autoanalizadores, alguno de ellos a partir de una misma muestra de sangre, los laboratorios con reducido volumen asistencial continúan empleando los métodos convencionales o manuales donde el colorímetro, la centrífuga y el microscopio ocupan aún un lugar destacado.

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Este instrumental, aunque simple y reducido, precisa, al igual que los autoanalizadores, un control de calidad periódico, por lo que en modo alguno debe confundirse control de calidad con automatización. CONCEPTOS BÁSICOS La realización de controles de calidad en el laboratorio clínico presupone el conocimiento de una terminología básica sin la cual resulta difícil interpretar el significado de los resultados obtenidos. Exactitud. Es la aproximación de una medida a su valor real. Un método exacto es, por tanto, aquel que suministra una medida correcta o real del parámetro analizado. Lo contrario es la inexactitud. El valor real de una medida se obtiene cuando se emplean métodos de referencia seleccionados por su calidad en comparación con otros, de acuerdo con unos criterios emitidos por organismos internacionales y reactivos de calidad garantizada. Precisión. Se define como la aproximación del valor de una medida a sí mismo, cuando se realizan varias determinaciones de la misma empleando el mismo método. Para conocer la precisión de una medida no es necesario conocer su valor real, ya que lo único que interesa es el grado de variación obtenido después de realizar varias determinaciones de la misma (reproductibilidad de la medida). Error. Es la desviación de una medida con respecto a los criterios de exactitud y precisión. La inexactitud no debe acompañarse forzosamente de imprecisión y viceversa. Así, un método puede ser exacto pero impreciso, o preciso pero inexacto o ambas cosas a la vez (Figura 1). El error puede ser de dos tipos: aleatorio o sistemático. El error aleatorio obedece a causas difíciles de determinar, que casi siempre surgen de forma esporádica (fallo técnico al tomar una medida). Por el contrario, el error sistemático suele obedecer a causas fáciles de identificar, por cuanto se repite siempre de la misma manera (deficiente calibración de los instrumentos analíticos, errores sistemáticos en la preparación de reactivos y otros). Dispersión. Corresponde a la variabilidad de una medida alrededor de su valor medio. La dispersión de una medida se determina mediante dos parámetros: media aritmética ( ) y desviación estándar (DE). La media aritmética es el cociente entre la suma de todos los valores individuales (X) y el número total de los mismos (N). Ejemplo: Si para una medida se obtienen 10 valores diferentes, 5, 8, 6, 6, 7, 8, 7, 7, 9 y 7, la media aritmética de la misma será:

5 + 8 + 6 + 6 + 7 + 8 + 7 + 7 + 9 + 7 = = 7

10

X

X

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El valor de se conoce simplemente como media o valor medio de un conjunto de valores y debe diferenciarse de la moda y la mediana. La moda corresponde al valor de conjunto que se repite con mayor frecuencia. En el ejemplo anterior la moda es 7. La mediana es el valor situado en medio de una serie de valores ordenados numéricamente. En el ejemplo anterior, las cifras ordenadas numéricamente son 5, 6, 7, 8 y 9, por lo tanto la mediana es 7. Cuando, como en el ejemplo citado, la media aritmética, la moda y la mediana tienen el mismo valor, se dice que la población estudiada presenta una distribución normal o gaussiana. La desviación estándar (DE) es la raíz cuadrada de la varianza (V), siendo ésta el cociente entre la suma de los cuadrados de las diferencias entre cada valor individual (Xi) y la media aritmética y los grados de libertad (número de observaciones menos uno).

X

Exactitud y precisión

Situación ideal

Inexactitud y precisión

Error sistemático

Exactitud e imprecisión

Error aleatorio

Inexactitud e imprecisión

Error aleatorio

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Así, en el ejemplo anterior, el valor de la DE sería de 1,15, y el de la varianza (V) de 1,33:

Prueba Xi Xi-X (Xi-X)2

1 5 -2 4 2 8 +1 1 3 6 -1 1 4 6 -1 1 5 7 0 0 6 8 +1 1 7 7 0 0 8 7 0 0 9 9 +2 4 10 7 0 0

N = 10 �Xi = 70 �(Xi-X)2= 12

70 X = = 7 10 �(Xi-X)2 12 V= = = 1,33 N – 1 9 DE = V = 33,1 = 1,15 Coeficiente de variación. Corresponde al valor de la desviación estándar (DE) expresada en tanto por ciento de la media. DE x 100 CV (%) = X En el ejemplo anterior, el valor de CV sería: 1,15 x 100 CV = = 16,4 % 7 Histograma. Es la representación gráfica del número de valores obtenidos para un determinado parámetro y proporciona una imagen de la distribución de

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frecuencias (Figura 2). Cuando el número de valores es muy elevado, el histograma se transforma en una curva continua (curva de distribución). Intervalo de confianza. El intervalo de confianza se define como un conjunto de valores dentro de los cuales está situada la media verdadera. En general, el intervalo de confianza mínimo corresponde al 95 %, es decir, la probabilidad de que el valor medio sea el verdadero es del 95 % o uno de cada veinte valores obtenidos puede hallarse fuera de los límites de confianza. En una distribución normal el límite de confianza mínimo corresponde a todos los valores incluidos dentro de las dos desviaciones estándar de la media (2 DE). Patrones, muestra de referencia y controles. Un patrón es una sustancia cuyas características han sido analizadas mediante procedimientos físicos o químicos y a la cual se le ha asignado un determinado valor. Los patrones pueden ser de dos tipos: a) nacionales y b) internacionales. Los patrones internacionales son elaborados únicamente por la Organización Mundial de la Salud (OMS) o el Comité Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH). La finalidad de los patrones internacionales es suministrar un valor de referencia, con el cual se contrasta el valor de los patrones

0

10

20

30

40

50

60

70

80

10 30 50 70 90

Actividad Enzimática

Fre

cuen

cia

(%)

Figura 2. Histograma.

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elaborados por las diferentes organizaciones nacionales de control de calidad (patrones nacionales). Una muestra de referencia es una sustancia estable elaborada de acuerdo con las características de un patrón nacional o internacional y que normalmente es utilizada para controlar la exactitud de una determinada técnica. Cuando la muestra de referencia se emplea para calibrar un instrumento analítico o para ajustar una medida a su valor verdadero, recibe el nombre de calibrador. Un control es una muestra con características similares a los especímenes problemas que se emplean para verificar la precisión o reproductibilidad de un método o técnica y ocasionalmente pueden servir para calibrar instrumentos, si se conoce el valor verdadero de la medida que se quiere controlar. En hematología es muy común el empleo de controles constituidos por suspensiones de células sanguíneas (humanas o de animales) para la calibración de los analizadores destinados a la determinación de los parámetros básicos (recuentos, hemoglobina, hematocrito e índices eritrocitarios secundarios). En general, dichas suspensiones celulares tienen propiedades físicas similares a los especímenes de sangre total humana y son preparadas por diferentes firmas comerciales, que las recomiendan para la calibración de sus propios instrumentos. Dado que estas muestras control comerciales vienen convenientemente valoradas, es decir, se conoce el valor de los parámetros que hay que controlar, son normalmente utilizadas para verificar no sólo la precisión, sino también la exactitud de los autoanalizadores (calibración). Esta función hace que normalmente se las conozca también como “calibradores”, aunque en realidad tal denominación sea incorrecta debido a la inexistencia de un patrón de referencia internacional de sangre total estabilizada. SISTEMÁTICA DE CONTROL DE CALIDAD EN LOS LABORATORIOS El control de calidad en un laboratorio clínico debe considerar siempre la doble vertiente: interna y externa. El control de calidad interno ser realiza diariamente en cada laboratorio mediante empleo de especímenes control propios o comerciales y tiene como finalidad asegurar la fiabilidad de los métodos e instrumentos. El control de calidad externo se realiza periódicamente (en general cada mes) y en él participan otros muchos laboratorios, que al analizar un mismo espécimen controlan así la exactitud de los métodos que emplean en la realización de las técnicas. CONTROL DE CALIDAD INTERNO El control de calidad interno tiene como finalidad verificar la exactitud y precisión de los diferentes métodos o técnicas diagnósticas empleadas. Para ello es necesario el uso de controles y patrones.

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Debe hacerse extensivo no sólo a la metodología empleada en la realización de las diferentes técnicas, sino también a todo el proceso que se extiende desde la preparación del material que hay que utilizar y la extracción y manipulación de las muestras de sangre hasta su procesamiento y entrega de resultados. Asimismo, debe incluir el control periódico de los reactivos, recipientes e instrumentos que se emplean tanto para las técnicas manuales como para las automatizadas. Para controlar la fiabilidad de las técnicas utilizadas para determinar los parámetros básicos, se suelen emplear muestras control comerciales. Este tipo de controles son en la actualidad ampliamente utilizados para la calibración de autoanalizadores, por lo que se denominan también calibradores. Con todo, los controles comerciales, pese a su indudable utilidad, presentan diversos inconvenientes:

• No controlan la metódica utilizada en la extracción y preparación de los especímenes de sangre que hay que utilizar.

• Son fácilmente reconocidos por el personal técnico del laboratorio, por lo que suelen recibir un tratamiento especial y, por tanto, distinto al de los restantes especímenes del día.

• Son relativamente caros, lo que hace difícil su adquisición para determinados laboratorios.

Por todo lo mencionado, los controles comerciales pueden ser sustituidos por muestras control elaboradas en el mismo laboratorio. En este caso, el valor verdadero de los parámetros que hay que controlar debe determinarse previamente mediante los llamados métodos de referencia. En general, el control de calidad interno de parámetros básicos se consigue mediante el empleo combinado de muestras control comerciales y especímenes propios que se utilizan como controles. Los primeros son utilizados para verificar la calibración de los autoanalizadores y la exactitud de los valores suministrados por los mismos métodos u otros a lo largo del día. Los especímenes control propios deben ser elegidos al azar y se utilizan para verificar la reproductibilidad de los resultados correspondientes. Si tales especímenes no han de ser utilizados para verificar la exactitud de los métodos, no es indispensable la determinación del valor real de los parámetros que hay que controlar. CONTROL DE CALIDAD EXTERNO Gracias a la labor de diferentes organismos internacionales, la práctica de controles de calidad interlaboratorios o externos mejoran la exactitud de los resultado suministrados por los diferentes laboratorios. En Europa existen varios programas de control de calidad externo que se aplican a nivel local, regional y nacional, permitiendo apreciar de una manera mucho más precisa las posibilidades o limitaciones de cada laboratorio participante en

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relación a los restantes que intervienen en el mismo programa y comprobar su propio nivel metodológico dentro del conjunto. La complejidad de estos programas de control de calidad viene dada por la multiplicidad de técnicas e instrumentos que pueden emplearse en la determinación de un mismo parámetro y por el número de parámetros evaluados.

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TEMA 18.- RECOGIDA DE LA MUESTRA. MÉTODOS DE

IDENTIFICACIÓN. Como requisitos mínimos la muestra que llega al laboratorio deberá contener la siguiente información: * Nombre y apellidos * Fecha de nacimiento * Número de identificación de la muestra, o del paciente o de la hoja de petición * Número de la sala (remitente, nombre del médico peticionario) * Fecha y hora de la toma de la muestra (día, hora, min.) Todas las personas involucradas en los procedimientos diagnósticos son conscientes del problema de la identificación de las muestras. La confusión en los nombres, peticiones, muestras o resultados de las pruebas de los pacientes puede tener serios efectos sobre el tratamiento del paciente y podría, por lo tanto, considerarse como una «mala praxis». Este capítulo resume brevemente la situación actual en la identificación de muestras y pacientes durante la fase preanalítica. ¿Nombre o número? Cuando un paciente es admitido en un hospital, tiene que ser identificado por mucha gente, incluyendo enfermeras, facultativos, técnicos y otras personas. Lo mismo ha de ser válido para cualquier muestra tomada del paciente y trasladada al laboratorio del propio hospital u otro laboratorio externo. La comunicación entre todas las partes del proceso diagnóstico requiere la transferencia de esta identificación del paciente. El uso del nombre y apellidos para identificar un individuo ha demostrado ser insuficiente para asegurar la transferencia correcta de la identidad. El nombre, apellidos y la fecha de nacimiento es la combinación de información usada más frecuentemente para la identificación. A fin de reducir la cantidad de información manejada, en muchos hospitales se destina al paciente un número. Este número no puede ser utilizado para ningún otro individuo. Idealmente, este número se imprime junto con el nombre sobre cualquier pedido, muestra e informe. Los números de la sala, habitación y cama pueden ser una ayuda adicional. Esto es especialmente útil si la extracción de muestras no se hace por la misma persona que pide los exámenes de laboratorio clínico.

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Alternativamente, un paquete de etiquetas autoadhesivas preimpresas con la identificación del paciente pueden facilitarse en el momento de la admisión al hospital. Los métodos de identificación A la llegada al laboratorio, el paciente ha de ser identificado a partir de la información facilitada. Esto puede hacerse visualmente leyendo el nombre y sala de la etiqueta y de la hoja de petición, transfiriendo esta información a las planillas de laboratorio y a todas las alícuotas de la muestra. La fase siguiente requiere la generación de un sistema de subnumeración que vincule al individuo y el día de la obtención de las muestras (comúnmente no más largo de tres de dígitos). Muchas instituciones, sin embargo, usan medios electrónicos para transferir datos de identificación: esto puede hacerse en línea usando el sistema informático del hospital, que transfiere los datos básicos del paciente junto con la petición directamente al sistema informático del laboratorio. En este caso, las muestras que llegan al laboratorio tienen que estar vinculadas a una hoja de petición determinada por el código de barras o un sistema de código alternativo fijado a las muestras. Recientemente, se han sugerido sistemas más sofisticados que se utilizarán ampliamente en el futuro: un código de barras bidimensional, código de puntos o chips fijados a la muestra que pueden contener toda la información necesaria incluyendo la petición y la información sobre el paciente. Identificación de la muestra en el laboratorio, forma directa respecto a la indirecta La identidad del paciente se vincula inequívocamente al recipiente de la muestra en el punto de extracción o recolección de la misma, siempre que la muestra primaria se mantenga a lo largo de todo el proceso analítico. Esto necesita separadores suero/plasma para mantener la muestra de trabajo (plasma o suero) en el tubo de muestra primario (sangre) y de esta forma ser identificado directamente por el lector del analizador. Si el lector no está disponible o se hacen alícuotas la muestra original, puede usarse un dispositivo que automáticamente defina las posiciones de cada muestreo en cada uno de los analizadores utilizados. Este tipo de identificación se llama identificación indirecta (por localización). Mientras que los mecanismos directos de identificación permiten identificar la muestra en cualquier momento y posición, la identificación indirecta por la posición puede hacerse únicamente con la ayuda de una lista numerada de posiciones o un sistema informático de laboratorio.

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Además, cualquier porción alícuota tiene el peligro inherente de una confusión adicional entre muestras. Recomendación:

• Cualquier muestra deberá identificarse inequívocamente antes de ser procesada.

• Los procedimientos de identificación directa de muestras primarias deberían usarse preferentemente a la identificación indirecta y subdivisión de la muestra en alícuotas, para reducir los errores en la identificación.

• Cualquier muestra cuya identidad y origen no esté suficientemente documentada deberá separarse a una forma estable (suero, plasma), guardarla en el refrigerador y completar la información omitida antes de procesarla.

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TEMA 19.- TRANSPORTE DE MUESTRAS. EFECTOS DEL TIEMPO

Y TEMPERATURA DURANTE EL TRANSPORTE.

Los efectos del tiempo y temperatura durante el transporte El traslado de muestras al laboratorio clínico puede realizarse de diferentes maneras. Normalmente, los tiempos de traslado son cortos cuando el laboratorio se ubica cerca, o en las mismas instalaciones clínicas y no representa ningún problema.

Figura 1 Efecto del tiempo y la temperatura de almacenamiento sobre la concentración de diversos componentes del suero de sangre coagulada sin anticoagulante. (•) 4° C, (•) 23 ° C, (•) 30 ° C

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Sin embargo, el tiempo transcurrido desde la extracción de la sangre a la centrifugación, no debería exceder de una hora. Algunos procedimientos de medida requieren aditivos especiales tales como fluoruro de sodio/oxalato para medir la concentración de lactato o borato de sodio serina EDTA para medir la concentración de amonio. La medición de la concentración de hemoglobina en el plasma requiere la manipulación cuidadosa de la muestra de con EDTA. El traslado al laboratorio puede realizarse bien mediante un mensajero, o bien mediante un sistema de reparto por tubo neumático. Los adelantos actuales en los sistemas de este último tipo aseguran un traslado cuidadoso con el fin de evitar la hemólisis. Tales muestras pueden usarse para medir magnitudes bioquímicas, hematológicas o para la realización de gasometrías. Si por alguna razón técnica se requiere un traslado de la muestra a larga distancia (p. ej. por correo o mensajeros de laboratorio), debería evitarse hacerlo con las muestras de sangre. La Figura 1 muestra la influencia de la temperatura y duración del almacenamiento de muestras de sangre coagulada sobre algunas magnitudes La liberación de ión potasio desde los eritrocitos es mínima a temperatura ambiente debido a la actividad de la ATPasa intercambiadora de Na+/K+ dependiente de la temperatura. Este efecto aumenta tanto a 4° C como por encima de 30º C. Las concentraciones de glucosa disminuyen con el aumento de temperatura, mientras que con el fosfato se observa el fenómeno opuesto, ya que las fosfatasas del plasma y los eritrocitos aumentan la concentración de este compuesto. Como se ha demostrado en la Figura 1, la duración del almacenamiento a una temperatura determinada es un factor importante. Si una muestra de sangre se almacena durante 2 h a 23° C, las concentraciones de glucosa disminuyen aproximadamente un 10 por ciento. En las muestras patológicas los efectos de tiempo y temperatura comúnmente observados pueden presentar desviaciones. La disminución dependiente del tiempo de la concentración de glucosa en las muestras de sangre es mayor en las leucocitosis. Del mismo modo, el aumento de la concentración de amonio dependiente del tiempo está más acentuado en muestras con la concentración catalítica de ã–glutamiltransferasa elevada. Los anticuerpos pueden alterar las concentraciones de las células sanguíneas en función de la dependencia de la temperatura que tengan dichos anticuerpos.

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Las concentraciones de muchos componentes bioquímicos tales como electrólitos, sustratos o enzimas no resultan afectados por un tiempo de transporte de envío de hasta cuatro días. Las concentraciones de hemoglobina y de eritrocitos son también estables. Se observan diferencias importantes en la fracción de volumen de los eritrocitos en la sangre («hematocrito»), el volumen entítico de los eritrocitos (VCM) y la concentración de bilirrubina en el plasma. Un examen fiable de los distintos leucocitos requiere que la preparación de la extensión de sangre se realice dentro de las 3 horas siguientes a la toma de la muestra. Transporte de muestras Cuando es necesario enviar sangre u otros fluidos corporales humanos a un laboratorio distante, se han de cumplir ciertas normas de seguridad. Además, tiene que conservarse la integridad de la muestra para asegurar su correcto examen. Las muestras deben enviarse en recipientes que «sean resistentes a la filtración, golpes y cambios de presión, y otras condiciones que puedan incidir en la manipulación ordinaria que se realiza en el transporte». La Asociación Internacional de Transporte Aéreo (IATA) requiere que en el exterior de paquete se escriba «Muestras diagnósticas». En los Estados Unidos, las regulaciones de la Occupational Safety and Health Administration (OSHA) (Administración de Salud y Seguridad Laboral) requieren que se adhiera al paquete una etiqueta de biorriesgo. Las muestras deberán empaquetarse de una manera tal que puedan resistir las condiciones ambientales (temperatura y presión) a que puedan ser sometidas durante el transporte.

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Debe evitarse la exposición de muestras a la luz directa con el fin de proteger a los componentes sensibles a la luz, tal como la bilirrubina. Idealmente, deberían llevar varias capas de embalaje, con un recipiente primario con cierre que debería introducirse en un recipiente secundario que a su vez debería ponerse dentro un recipiente exterior, como se representa en la Figura 2. Debe ponerse siempre un material absorbente entre los recipientes primario y secundario para asegurar que se absorba cualquier derrame durante el transporte. Se debe utilizar una bolsa impermeable para asegurar que los documentos que acompañen esa muestra no serán dañados por cualquier filtración o derrame de la misma. Las muestras de sangre seca sobre papel de filtro deberán enviarse en una envoltura de papel recio introducido en un sobre con precinto sellado para asegurar que los manipuladores del envío estén protegidos de la exposición a la sangre seca, además de asegurar la integridad de la muestra durante el transporte.

Figura 2. Empaquetado de muestras para el transporte Para enviar muestras congeladas y refrigeradas, son adecuados materiales aislantes tales como un recipiente de poliestireno. Para la congelación puede utilizarse hielo seco. LEAKAGE, NOTIFY Deben tomarse precauciones para asegurar que el recipiente empaquetado con hielo seco sea capaz de liberar el dióxido de carbono gaseoso para evitar una sobrepresión que podría ocasionar el estallido del paquete.

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TEMA 20.- EL ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS EN EL

LABORATORIO. SISTEMAS DE CONSERVACIÓN.

10 reglas y algunas recomendaciones

1. El procedimiento está regido por la estabilidad de los componentes de la muestra. Las causas más importantes que pueden ocasionar alteraciones en la calidad de la muestra son:

• Metabolismo de las células sanguíneas • Evaporación o sublimación • Reacciones químicas • Descomposición microbiológica • Procesos osmóticos • Efecto de la luz • Difusión de gases

2. Un transporte rápido y un corto tiempo de almacenamiento mejoran la

fiabilidad de los resultados de laboratorio. 3. Las muestras se conservan más tiempo almacenadas en frigorífico (¡pero

hay notables excepciones!). 4. Las muestras deberían almacenarse siempre en recipientes cerrados

(¡evaporación!). 5. El peligro de evaporación también existe en los refrigeradores

(condensación de humedad sobre los elementos de enfriamiento). 6. Los problemas de almacenamiento se reducen si se usan sistemas

desechables de tomar muestras. 7. Los agentes de separación (p. ej. Geles separadores) mejoran los

rendimientos de suero o plasma y permiten que estos puedan mantenerse en los tubos originales encima de la sangre (89).

8. Evite sacudir los recipientes de muestra (¡sistemas de distribución de tubo neumático!): riesgo de hemólisis.

9. Almacenar siempre verticalmente los recipientes de muestra que contienen sangre; el proceso de la coagulación se acelera.

10. Etiquete el material infeccioso y manéjelo con especial cuidado.

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8 reglas especiales y algunas recomendaciones más útiles

1. Evite el almacenamiento de la sangre. Las muestras de sangre deberían llegar al laboratorio dentro de los 45 min siguientes a su recolección, a fin de asegurar que la centrifugación y separación de la muestra se efectúa dentro de la primera hora.

2. Evite la glicólisis para mantener estables las concentraciones de glucosa

y de lactato y el pH. La glicólisis puede evitarse por la adición de un inhibidor junto con un anticoagulante.

3. Evite el efecto de la luz de otra manera habrá una disminución en las

concentraciones de bilirrubina, ascorbato, porfirinas, creatinacinasa y folatos.

4. Reduzca el contacto con el aire tanto como sea posible. Si no se hace

esto, la evaporación o la sublimación darán como resultado un aumento aparente en la concentración de todos los componentes no volátiles. Este es particularmente el caso cuando el volumen de la muestra es relativamente pequeño y el área de superficie es relativamente grande.

5. La sangre no debería almacenarse en el refrigerador. Cuando la orina se

enfría, las sales pueden precipitar (fosfato de magnesio y calcio, urato).

6. Para ciertos componentes, las muestras no deberían congelarse. Esta congelación puede redundar en resultados erróneos para los siguientes componentes:

Ejemplos de componentes de la sangre y la orina que no deben

almacenarse congelados

Muestra Componentes

Suero o plasma: Lipoproteínas (fracciones electroforéticas Lipoproteína X Apolipoproteína A-I y B Colesterol de LDL (prevenida por la adición de glicerol) Monómeros de fibrina en el plasma

Sangre con EDTA Células sanguíneas Orina IgG

Sedimento Urato (¡precipitaciones!)

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7. Una descongelación adecuada. La homogeneización inadecuada de las muestras congeladas después de la descongelación es una fuente muy común de error. Durante la descongelación se producen gradientes de concentración que van desplazándose desde las soluciones concentradas que primero funden hacía las capas inferiores por las paredes del recipiente. Por tanto, después de la descongelación, la muestra deberá invertirse varias veces, evitando la formación de espuma. Con especial atención sobre los materiales no disueltos, disolviéndolos por calentamiento suave si fuera necesario.

8. El almacenamiento de las muestras después de su examen se debe

realizar de tal manera que permita la confirmación de los resultados, la comprobación de la identidad de las muestras o la realización de exámenes adicionales por razones médicas o legales.

Tiempo y condiciones de almacenamiento recomendadas para muestras tras ser examinadas

Muestra para Tiempo almacenamiento

Temperatura

Bioquímica: 1 semana Refrigerador Inmunología: 1 semana Refrigerador Hematología: 2 días Temperatura ambiente Coagulación: 1 día Refrigerador Toxicología: 6 semanas Refrigerador Grupo sanguíneo: 1 semana Refrigerador

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TEMA 21.- PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS. PROCESADO Y

CENTRIFUGACIÓN.

¿Qué ha de hacerse a la llegada de una muestra? Centrifugación La centrifugación de la sangre coagulada para obtener suero debería realizarse después de haberse asegurado de que la sangre ha coagulado. Normalmente, el tiempo de espera para que la sangre coagule es aproximadamente de 30 min. Sin embargo, los pacientes que están con una terapia anticoagulante, o aquellos con deficiencias en la coagulación tendrán una coagulación retrasada. La centrifugación de sangre coagulada para obtener suero o de sangre anticoagulada para obtener plasma se realiza típicamente entre 1000 y 1200 g durante 10 a 15 min. En las pruebas de coagulación, la sangre citratada debería centrifugarse a 2000 g durante 15 min. La centrifugación se realiza comúnmente entre 20 y 22° C. Sin embargo, para algunos componentes que son lábiles durante la centrifugación a temperatura ambiente, especialmente si durante la centrifugación aumenta la temperatura, las muestras deberían centrifugarse a temperatura refrigerada (4° C). Sin embargo,

la refrigeración puede conducir a la filtración de ión potasio desde la célula, aumentado el valor de su concentración en el plasma. Las muestras no deberán volverse a centrifugar después de la obtención de suero o plasma. La alteración de la relación entre el agua plasmática y la celular puede afectar la concentración de los componentes, y así, introducir errores. Las muestras con una barrera de gel nunca deben volverse a centrifugar.

Figura 1

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El tiempo y la fuerza centrífuga aplicada al sedimento de sangre heparinizada debería ser tal que no deje plaquetas en la capa de plasma. Un fracaso al conseguir la sedimentación completa de plaquetas producirá aumentos inadecuados en la concentración de ión potasio, lactato-deshidrogenasa, fosfatasa ácida y fosfato procedentes de las plaquetas remanentes en el plasma (Figura 1) de la muestra. La Figura 2 muestra el control visual del plasma después de la centrifugación a diversas velocidades. Los tubos de micromuestra con o sin anticoagulantes pueden centrifugarse para obtener suero o plasma en una microcentrífuga con un adaptador que acepte estos tubos. La centrifugación de tales tubos de recolección de micromuestras se realiza a velocidades que van desde las 6000 a las 15000 g durante un mínimo de 90 s.

Figura 2

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TEMA 22.- ASPECTOS DE SEGURIDAD EN EL MANEJO DE

MUESTRAS BIOLÓGICAS. Los pasos para garantizar la seguridad son primordiales para la protección de la salud pública de los trabajadores. En este capítulo, se discute específicamente la eliminación de muestras, agujas, tubos, y productos químicos. Eliminación de agujas y otros objetos cortantes La eliminación de todos los objetos cortantes y punzantes tales como agujas se realiza mediante su colocación en recipientes herméticos, resistentes a la punción, con las etiquetas y el código de color apropiados.

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Deberá evitarse reenfundar los objetos punzantes, así como doblar y romper las agujas. Sin embargo, si fuese necesario el reencapuchar, deberá usarse o bien una espátula de un solo uso, o preferentemente, un dispositivo para reencapuchar. Están disponibles dispositivos simples de reencapuchar, que permiten al flebotomista reenfundar la aguja con un riesgo mínimo de daño por punción.

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Eliminación de tubos y muestras Los tubos de recolección de la muestra que contienen sangre y que son destinados a su eliminación deberán colocarse en bolsas de biorriesgo que puedan resistir procesos de esterilización en autoclave. Estas bolsas deberían ponerse en recipientes a prueba de fugas que luego deben cerrarse de forma hermética. Los fluidos corporales voluminosos tales como orina, vómitos, heces y otros fluidos corporales pueden ser eliminados por vertido al inodoro. Los recipientes de fluidos, tales como bolsas de sangre, deberán incinerarse después de colocarlos en recipientes de desechos biopeligrosos.

Productos Químicos Los residuos químicos pueden ser inflamables, corrosivos, reactivos y tóxicos. Ejemplos de residuos químicos inflamables incluyen líquidos volátiles combustibles tales como solventes orgánicos (p. ej., etanoles, acetona, xileno, tolueno, etc.), oxidantes tales como peróxidos y sales de nitrato y gases combustibles tales como butano, silano e hidrógeno. Estos materiales deben marcarse con las etiquetas apropiadas de tóxicos y peligrosos.

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No está recomendada la eliminación de disolventes combustibles a través de un fregadero o el inodoro. Si tales solventes son fácilmente solubles en agua, podrían, ser eliminados en pequeñas cantidades por vertido a un desagüe, seguido por grandes cantidades de agua. Lo mejor es recoger los disolventes inflamables en bidones de seguridad y almacenarlos en una cabina de almacenamiento previo a la recolección por un gestor de residuos autorizado. El éter y los disolventes clorados se deberán recoger en latas separadas. Los otros disolventes pueden combinarse en una sola.

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Ejemplos de disolventes corrosivos son los ácidos fuertes tales como ácido sulfúrico, clorhídrico, y fosfórico y bases tales como hidróxido de amonio. No deben usarse productos químicos tóxicos, corrosivos e inflamables como conservantes en la fase preanalítica. Nunca se ha de agregar orina a ácidos concentrados. Dichos ácidos deberán ser diluidos añadiéndolos lentamente, dejándolos resbalar por las paredes del contenedor de orina. La eliminación de ácidos fuertes y materiales corrosivos deberá hacerse preferentemente por vertido al fregadero, dejando correr el agua fría del grifo, a continuación, en cantidades abundantes contaminación para la capa de agua. Para estar bien informado sobre los productos químicos peligrosos, cada laboratorio deberá tener un archivo de hojas de datos de seguridad del material que enumere las propiedades peligrosas de cada producto químico, y que pueden consultarse fácilmente en casos de emergencia o cuando haya duda con respecto a la naturaleza del riesgo.

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TEMA 23. GESTIÓN DE RESIDUOS SANITARIOS.

CLASIFICACIÓN, TRANSPORTE, ELIMINACIÓN Y TRATAMIENTO.

Los avances tecnológicos en el campo de la atención al paciente, tiene como contrapunto un incremento notable del volumen y diversidad de residuos sanitarios. La clasificación, transporte, eliminación y tratamiento y su gestión han planteado a nuestras organizaciones sanitarias numerosos problemas. Hoy, los centros sanitarios gestionan de forma diversa y con desigual oportunidad los residuos clínicos y no cabe duda de que una parte considerable de forma poco justificada (normativas legales escasas, contradictorias y confusas).

¿Qué situación tiene nuestro país respecto a los Residuos sanitarios?

En España carecemos en el ámbito estatal de un marco legal actualizado que regule la eliminación de residuos sanitarios. Así la Ley 42/75 sobre desechos y residuos sólidos indica que los residuos generados como consecuencia de las actividades sanitarias en hospitales, clínicas y ambulatorios deben ser consideradas como residuos sólidos urbanos; por tanto, su recogida y su tratamiento son competencia de los Ayuntamientos, dejando a cada administración local la decisión de los reglamentos, clasificación y el tratamiento de los residuos generados. En 1986, esta ley fue modificada por el Real Decreto legislativo 1163/1986 para adaptarse a la Directiva Comunitaria 75/442/CEE de 1975. Posteriormente el Real Decreto 833/88 por el que se aprueba el Reglamento para la ejecución de la Ley 20/86 de residuos tóxicos y peligrosos, completó la mencionada ley 42/75. En España, desde los años 90, se ha realizado un gran esfuerzo, al menos legislativo, en la regulación de los residuos sanitarios. Hoy 12 de las 17 Comunidades Autónomas, han preparado decretos específicos referentes a ellos. Debe también mencionarse, aunque son anteriores, los intentos llevados a cabo por diferentes Ayuntamientos como Madrid, Barcelona, Burgos, etc. con sus Ordenanzas Municipales, y los realizados por el SAS con sus Manual de Gestión Interna de Residuos Sanitarios, así como proyectos llevados acabo por la iniciativa privada (Proyecto Clinhos, Instituto Cerdá), para organizar y tratar de dar una coherencia a la gestión de estos residuos, por lo que podemos afirmar que, aún faltando una legislación nacional, se ha tratado de regularizar este tipo de residuos.

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Riesgos de los Residuos Sanitarios La aproximación al hipotético riesgo infeccioso de los residuos sanitarios, exige, al menos, la consideración acerca de los de los factores necesarios para producir la enfermedad entre los que se encuentran: carga microbiana, la resistencia del huésped, la puerta de entrada del agente patógeno y la virulencia o la capacidad real del patógeno de producir una enfermedad. Los riesgos de transmisión de enfermedades infecciosas a través de los residuos procedente de estos enfermos infecciosos, requieren buscar las evidencias epidemiológicas de tal riesgo. Los riesgos son remotos. Evidencias epidemiológicas El riesgo para el profesional sanitario que usa equipos o instrumental en el campo de la atención al paciente y el riesgo para el personal que manipula el residuo sanitario, es decir ese material ya desechado, es distinto. Existen datos en la literatura científica que confirman la existencia de casos de transmisión ocupacional, principalmente Hepatitis B, C y VIH/ SIDA, adquiridos por TAS (Trabajador de Atención a la Salud - enfermería, médicos, técnicos de laboratorio, etc.) como consecuencia de un accidente durante la atención medica a un paciente fuente positiva de tales enfermedades.

Tabla. Casos definidos de transmisión ocupacional de VIH/SIDA declarados a nivel mundial.

País

Número

%

E.E.U.U 49 58,34 Francia 10 11,90 España 5 5,95 Italia 4 4,76 Reino Unido 4 4,76 Alemania 2 2,38 Bélgica 2 2,38 Confederación Helvética

1 1,19

Otros países 7 8,34 TOTAL

84

100,0

Tomada y adaptada de: De Andrés R y Nájera R: Algunos aspectos de la exposición ocupacional a VIH en la atención de salud en el mundo. 1996

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De igual forma, se conocen, las diferentes categorías profesionales, el tipo de exposición y los instrumentos que han intervenido en la transmisión ocupacional de esta enfermedad. Los pinchazos con agujas son los mas frecuentes (91,4%); cortes con escalpelo o bisturí representan el 4,3%, cortes con vidrio (material de laboratorio) el 2,9%, siendo en un caso desconocido. Tabla. Casos definidos de infección por VIH-1 adquirida ocupacionalmente. Distribución

por tipo de ocupación o categoría profesional.

Categoría Profesional u Ocupación Nº (%)

Personal de enfermería 40 46,62

Médico clínico (no cirujano) 7 8,34

Médico cirujano 1 1,19

Técnico de laboratorio clínico 17 20,24

Técnico de laboratorio no clínico 3 3,57

Técnico de cirugía (instrumentista) 2 2,38

Técnico de diálisis 1 1,19

Terapeuta respiratorio 1 1,19 Auxiliar de enfermería/auxiliar de salud

1 1,19

Gobernanta/personal de lavandería/mozo/personal de mantenimiento

3 3,57

Otros, sin especificar 8 9,52 TOTAL 84 100,00

Fuente: De Andrés R y Nájera R: Algunos aspectos de la exposición ocupacional a VIH en la atención de salud en el mundo. 1996 Tabla Instrumentos de Transmisión Ocupacional de VIH. EE.UU.(*) y EUROPA (Abril 1996)**

INSTRUMENTO EE.UU. EUROPA

Agujas 39 25 (Pinchazo)

Escalpelo 1 1 (Corte con objeto agudo)

Vidrio 2 -

Desconocido? 1 - *Cardo, D. Comunicación Personal. Mayo 1996. (Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. Georgia) ** De Andrés R y Nájera R: Algunos aspectos de la exposición ocupacional a VIH en la atención de salud en el mundo.

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Así, podemos concluir que:

• La transmisión de la enfermedad no se ha producido por contacto con objetos no punzantes o cortantes (sábanas, guantes, etc.).

• No existe ningún caso en la literatura científica de infección VIH/SIDA

adquirida por manipulación de residuos sanitarios. • Es muy importante resaltarse el hecho de que más del 95% de los

portadores de VIH/SIDA no están hospitalizados y que el material potencialmente contaminado procedente de estos pacientes (jeringuillas, agujas, etc.), se elimina sin protección, incluidos en los residuos sólidos urbanos, comportando pues, mayor riesgo de transmitir VIH/SIDA y cualquier otra enfermedad ya que por lo general el número de portadores (personas sin la enfermedad clínica pero con la misma capacidad infectiva que un enfermo y por lo tanto más peligrosos desde el punto de vista sanitario), es mayor que el de enfermos, llegando a veces a la relación 10/1 (10 portadores por 1 enfermo) e incluso mayor.

• No conocemos en la literatura científica ninguna evidencia o caso

publicado de infección asociada a la manipulación de residuos entre los trabajadores de las empresas externas que se dedican a la gestión de este tipo de residuos.

Un segundo aspecto relacionado en la búsqueda de la evidencia de los riesgos de los residuos sanitarios lo aportan los distintos estudios microbiológicos de carga microbiana en los residuos sanitarios versus residuos domésticos: Diferentes estudios científicos, en los que se han estudiado las cargas bacterianas o recuentos de bacterias totales, han puesto en evidencia que en los residuos sanitarios procedentes de hospitales grandes y pequeños, recogidos en diferentes unidades de hospitalización, así como en clínicas privadas, comparados con los residuos domésticos, dan como resultado que la carga bacteriana, (concentración de bacterias), es mayor en los residuos domésticos que en los hospitalarios, con independencia de su procedencia. Media aritmética de la concentración total por tipo de hospital y consulta privada en residuos sanitarios y residuos domésticos. (colonias / gramo de residuo)

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FUENTE

Microorganismos

Totales

HOSPITAL GRANDE:

C.I. Quirúrgicos

1,5 x 106

Hospitalización Quirúrgica 6,3 x 106 Hospitalización Médica 8,5 x 106 Pediatría 5,9 x 106 Quirófano 6,3 x 105 HOSPITAL PEQUEÑO:

C.I.Quirúrgicos 7,4 x 105

Hospitalización Quirúrgica 1,8 x 107 Hospitalización Médica 2,7 x 106 Quirófano 2,9 x 104 CONSULTAS PRIVADAS:

Médico General

1,3 x 106

Dermatología 1,9 x 107 Pediatría 1,0 x 107 Dentista 1,5 x 104 RESIDUO DOMÉSTICO O URBANO

3,0 x 108

Esta mayor concentración de bacterias en los residuos domésticos se mantenía incluso cuando se diferenciaban los diferentes grupos de bacterias que componían los residuos en: aerobios, coliformes, E. Coli, Gram positivos, estreptococos grupo D y anaerobios facultativos.

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Tabla. Media aritmética de la concentración total y por tipo de microorganismos en residuos sanitarios y residuos domésticos. (colonias / gramo de residuo)

Gérmenes

Totales

Bacterias

Gram Negativas

Estreptococos

Grupo D

Hongos

Y Levaduras

HOSPITAL GRANDE

C.I. Quirúrgicos

1,5 x 106 1,5 x 105 4,4 x 103 2,3 x 103

Hospitalización Quirúrgica

6,3 x 106

1,8 x 106

2,9 x105

2,8 x103

Hospitalización Médica

8,5 x 106

1,2 x 106

8,3 x 104

1,2 x 102

Pediatría 5,9 x 106 6,9 x 106 1,3 x 106 1,8 x 103 Quirófano 6,3 x 105 1,3 x 104 6,9 x 103 8,1 x 102 HOSPITAL PEQUEÑO

C.I. Quirúrgicos

7,4 x 105 2,4 x 104 1,5 x 104 4,0 x 102

Hospitalización Quirúrgica

1,8 x 107

1,7 x 104

6,1 x 105

8,3 x 103

Hospitalización Médica

2,7 x 106

1,4 x 104

5,5 x 104

7,9 x 103

Quirófano 2,9 x 104 8,5 x 104 2,8 x 102 2,5 x 103 RESIDUO DOMESTICO O URBANO

3,0 x 108

6,3 x 107

6,9 x 106

6,5 x 105

Por lo tanto puede concluirse que:

• Los casos documentados transmisión profesional se han producido dentro de los centros sanitarios, como consecuencia de la atención sanitaria directa a pacientes.

• No existe ningún caso documentado de VIH/SIDA se ha debido a la manipulación de residuos sanitarios.

• Los casos de infección recogidos en la literatura científica se han producido por material punzante.

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• El riesgo de infección por residuos sanitarios, sin objetos punzantes, es prácticamente inexistente.

• La carga bacteriana, por tanto el potencial patógeno, de los residuos sanitarios es menor que el de los residuos domésticos.

• No existe ninguna evidencia de que los residuos sanitarios sean una amenaza para la salud pública en general.

• El mayor riesgo proviene de la utilización privada de jeringuillas (ADVP, diabéticos, asistencia domiciliaria, etc.).

• En la literatura científica no hay evidencias de casos de infección por manipulación de residuos sanitarios entre los trabajadores de empresas externas que se dedican a la gestión de los mismos.

Por lo tanto. La mejora de la gestión los residuos sanitarios, exige:

1. Homogeneizar la denominación, clasificación y definición de los residuos sanitarios.

2. Facilitar la segregación, envasado, almacenamiento y transporte interno. 3. Unificar los criterios de gestión extracentro: (transporte y eliminación o

tratamiento). 4. Establecer un plan de gestión de los residuos en los centros sanitarios y

no sanitarios. A cada una de estas propuestas que reflejan los aspectos prioritarios a tener en cuenta a la hora de gestionar este tipo de residuos.

CLASIFICACIÓN Y DEFINICIÓN DE LOS RESIDUOS SANITARIOS.

Residuo sanitario es el que se genera como resultado o a consecuencia de una actividad sanitaria bien médica, farmacéutica o veterinaria en cualquiera de sus ámbitos: asistenciales, docentes o investigadores. Se consideran incluidos, entre otros, hospitales, centros de especialidades, centros de salud, clínicas públicas y/o privadas, consultorios, consultas, centros universitarios y / o de formación, farmacias, laboratorios clínicos (biológicos, anatomopatológicos, microbiológicos), laboratorios farmacéuticos, laboratorios industriales y cualquier centro en el que se realice actividad sanitaria médica, farmacéutica o veterinaria. CLASIFICACION Definición: Grupo I o Clase A) Residuos Generales o Urbanos. Sin ningún tipo de contaminación específica, están regulados por la Ley 42/75 sobre desechos y residuos sólidos urbanos y el RD 1163/86 que la adapta a la

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directiva Comunitaria 75/422/CEE. Son pues aquellos generados en donde no se realiza actividad propiamente sanitaria, tales como oficinas, comedores, cocina, cafetería, salas de espera, almacenes etc. Incluyen papel, cartón, vidrio, restos de comida, restos de jardinería, mobiliario, metales etc. Grupo II o Clase B) Residuos Biosanitarios Asimilables a Urbanos (RBU) Son aquellos que no pueden eliminarse mediante sistemas propios de los residuos sólidos urbanos, sino con tratamiento de incineración o desinfección. Incluye a todos aquellos que no estén definidos en el Grupo biosanitarios especiales o Específicos. Está constituido por residuos tales como material de curas, yesos, filtros de hemodiálisis, vendajes, gasas, tabuladuras, guantes y otros desechables quirúrgicos, bolsas de sangre vacías etc. Grupo III o Clase C) Residuos Biosanitarios especiales (RBE) Son los productos biológicos y todo material de contacto con estos productos, con excepción de las aguas residuales. En esta clase se incluyen aquellos residuos con capacidad potencial de producir contagio y/o toxicidad para los trabajadores sanitarios o por razones de ética y estética. Están constituidos por residuos de pacientes con infecciones altamente virulentas y erradicadas, Residuos de pacientes con infecciones de transmisión oral-fecal, Residuos de pacientes con infecciones de transmisión por aerosoles, filtros de diálisis de pacientes infecciosos, residuos punzantes o cortante, independientemente de su origen, cultivos y reservas de agentes infeccioso, residuos de animales infecciosos de experimentación, cantidades importantes de líquidos corporales, especialmente sangre humana, residuos anatómicos humanos reconocibles Grupo IV o Clase D) Residuos Químicos Residuos tipificados en normativas especiales: Residuos Químicos aquellos contemplados en la Ley 20/1.986 Básica de Residuos Tóxicos Peligrosos. Es el material de desecho contaminado con productos químicos que le confieren el carácter de residuo tóxico y peligroso. Se gestión queda regulada por el RD 833/1988. Los más importantes están constituidos por los Citotóxicos o cistostáticos en los que importante recordar que debe ser diferenciada su eliminación final y por su importancia cuantitativa y su especificidad sanitaria. También se sitúan en este grupo el formaldehido, compuestos de revelado, disolventes, mercurio, medicamentos caducados, reactivos de laboratorio y un amplio grupo como son: compuesto oxidante, desinfectante, pilas, gases de anestesia, aceites lubricantes, pinturas, lámparas fluorescentes, pesticidas, fibras de amianto, estabilizadores de material médico, etc.

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Grupo V o Clase E) Residuos Radiactivos Son residuos Radiactivos aquellos contaminados por sustancias radiactivas cuya eliminación es competencia exclusiva de la Empresa Nacional de Residuos Radiactivos (ENRESA), de acuerdo con el Real Decreto 1522/84. Grupo VI o Clase F) Restos anatómicos y humanos de entidad Los cadáveres y los restos humanos de entidad suficiente, procedentes de abortos, mutilaciones y operaciones quirúrgicas. Su gestión queda regulada por el RD 2263/1974 sobre Policía Sanitaria Mortuoria Grupo VII o Clase G) Aguas Residuales Son líquidos que por su composición pueden ser vertidos a la red de saneamiento. Las ordenanzas municipales establecen las condiciones que deben reunir las aguas que se vierten a la red de saneamiento. SEGREGACION, ENVASADO, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE INTERNO El criterio que debe priorizarse es el de la correcta separación-segregación en los centros, que se realizará sobre la base de la clasificación de los grupos definidos. Residuos Grupos Urbanos y Biosanitarios asimilables a urbanos: pueden acumularse en un mismo envase ambos tipos de residuos. Deberán separarse de todas las demás clases de residuos. Los envases para estos residuos deben cumplir las especificaciones oportunas (Normas Europeas): Bolsas con opacidad, impermeabilidad, resistencia etc. Si se utilizan bolsas de plástico serán de galga mínima 200, volumen no superior a 70 litros. Color negro. (Iguales que las utilizadas para la recogida doméstica). Estos residuos se podrán compactar etc. Los residuos Biosanitarios Especiales: Acumulación separada de todas las demás Clases o Grupos y en envases o contenedores rígidos exclusivos de un solo uso de color amarillo y sin posibilidad de apertura una vez cerrados, etiquetados con el Pictograma BIORIESGO. Los Residuos Grupo Químicos Para Citostáticos utilizar envases similares de color rojo y que contengan únicamente este tipo de residuos (Citostáticos), por tanto deben separarse del resto de los residuos de este tipo III, etiquetados con el Pictograma CITOTÓXICO), deben prepararse en un local destinado a tal efecto y con las medidas de seguridad adecuadas. Otras características de los envases: Cumplir con las Normas Europeas, volumen máximo 60 litros de capacidad, estanqueidad, opacidad, resistencia etc. Para contener agujas,

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bisturís, objetos cortantes etc, podrán tener diferentes volúmenes de capacidad en función de las necesidades de cada área. Transporte Interno Cada centro productor establecerá dentro de su programa de gestión los circuitos más acordes con sus necesidades, así como las características de los carros de transporte, su limpieza periódica, horarios de recogida etc., minimizando el riesgo para la salud de los pacientes, personal y de los visitantes. Almacenamiento En un local adecuado de fácil limpieza, ventilación adecuada, estanco, señalizado, con capacidad suficiente de acuerdo al volumen de producción, la frecuencia, características y condiciones de la recogida. GESTIÓN EXTRACENTRO ( TRANSPORTE Y ELIMINACIÓN O TRATAMIENTO) Corresponde a la Consejería de Medio Ambiente de cada comunidad autónoma que debe regular, autorizar y supervisar el correcto cumplimiento de las normas establecidas para cada una de las operaciones que forman parte de la gestión en el exterior de los centros sanitarios. A.- Transporte Externo de los Residuos Biosanitarios Asimilables a Urbanos La recogida y el transporte externo de los Residuos Urbanos y Biosanitarios asimilables a urbanos, podrán acumularse juntos, deberá efectuarse, como mínimo, con las mismas precauciones que son de aplicación a los residuos sólidos urbanos. Los Ayuntamientos están obligados a su recogida, transporte y eliminación externa, en las condiciones que estipula la Ley 42 / 1.975 de Desechos y Residuos Sólidos Urbanos. B.- Transporte Externo de los Residuos Biosanitarios Especiales En vehículos autorizados que cumplan la normativa vigente sobre transporte de mercancías por carretera. Los gestores de estos residuos deben tener la/s autorizaciones correspondientes para su transporte según la normativa del Ministerio de Medio Ambiente y las que cada Comunidad Autónoma establezca como propias.

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C.- Tratamiento y Eliminación Grupo o Clases Residuos Generales y Residuos Biosanitarios Asimilables a Urbanos. Su tratamiento y eliminación deberá respetar, como mínimo, los mismos requisitos técnicos, operativos y de seguridad que la normativa vigente exija con carácter general para los Residuos urbanos. Grupo o Clase Residuos Biosanitarios Especiales Dada la particularidad de este tipo de residuos, sería oportuno que su tratamiento y eliminación cumpla con los siguientes criterios:

• Que no se incluyan en ningún programa de reciclado, neutralización o valorización.

• Deberán ser obligatoriamente incinerados, esterilizados o desinfectados. Las modernas tecnologías que aparezcan y que garanticen la correcta eliminación de estos residuos, deberán estar validadas y autorizadas por los organismos competentes.

• La incineración de los Residuos Biosanitarios Especiales deberá cumplir la normativa vigente sobre la incineración de este tipo de residuos. En su defecto deberá cumplir los siguientes requisitos mínimos:

o La carga del horno se realizará sin que exista ninguna manipulación directa de los residuos por parte de los operarios, y sin que se produzca la rotura de los envases que contienen los residuos, de forma que no exista contacto directo de los residuos con ningún elemento mecánico exterior al horno. Deben introducirse directamente en la tolva de la carga del horno, sin pasar por la fosa de recepción.

o Deberán cumplirse todas las especificaciones técnicas y operativas establecidas en la normativa vigente sobre incineración de residuos sólidos urbanos en instalaciones de más de tres toneladas por hora de capacidad.

o Ser de funcionamiento continuo. o Tener una capacidad superior a tres toneladas por hora. o El contenido de inquemados en las escorias propias de la

incineración de residuos sólidos urbanos no debe ser superior al 3 por 100.

o La carga de los residuos biosanitarios especiales debe hacerse durante el funcionamiento normal del horno. Deben excluirse, por tanto, las fases de encendido en enfriamiento del horno.

o Para los citotóxicos se alcanzarán temperaturas de 1.200º C. o El funcionamiento de estas plantas de incineración será autorizado

por el órgano autonómico competente.

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Se entiende por desinfección de residuos sanitarios especiales aquella tecnología que garantice: la eliminación de las formas vegetativas de bacterias, micobacterias, hongos y esporas de hongos que elimine los virus y que elimine las esporas del Bacillus Antracis. La tecnología aplicada en todo proceso de desinfección cumplirá los objetivos definidos en este apartado. Será autorizado por el órgano autonómico competente. Al menos, trimestralmente deben ser realizadas pruebas de control microbiológico para comprobar el grado o eficacia de la desinfección y de la esterilización en toda la masa del residuo según normas UNE. Los resultados de estos análisis deberán quedar reflejados en un documento de control y seguimiento y siempre disponible a requerimiento de las autoridades competentes. Grupo o Clase Residuos Químicos Citotóxicos Dado el problema que plantea la neutralización química y el riesgo que para los manipuladores externos y el medio ambiente, acompaña a este tipo de residuos, como ya he comentado, se propone la incineración como forma obligada de eliminación en las condiciones descritas en el apartado anterior sobre incineración de Residuos Sanitarios Específicos. Grupo o Clase Restos Anatómicos y Cadáveres Este tipo de restos serán gestionados según lo establecido en el Reglamento de la Policía Sanitaria Mortuoria en el Decreto 2263/1974 y según las normativas autonómicas existentes al respecto de restos anatómicos y cadáveres. En perjuicio de lo establecido por la legislación especial vigente sobre obtención de piezas anatómicas por trasplante y utilización de cadáveres para fines científicos y de enseñanza, el destino final de todo cadáver será uno de los tres siguientes:

• Enterramiento en lugar autorizado. • Incineración. • Inmersión en alta mar.

También tendrán uno de los destinos expresados en el párrafo anterior, los restos humanos de entidad suficiente y procedente de abortos, mutilaciones y operaciones quirúrgicas, sin otro requisito en el orden sanitario, que el certificado facultativo en que se acredite la causa y procedencia de tales restos. Cuando el médico que lo extienda deduzca la existencia de posibles riesgos de contagio, lo pondrá inmediatamente en conocimiento de la Dirección Provincial

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de Sanidad de la Consejería de Salud correspondiente, que adoptará las medidas oportunas. PLAN DE GESTIÓN DE LOS RESIDUOS EN LOS CENTROS SANITARIOS (Y NO SANITARIOS): Todo Centro Sanitario debe disponer de: A.- Plan General de minimización en el que se definan los tipos de residuos, su clasificación, separación, acondicionamiento, circuito de transporte interno, almacenamiento y tratamiento si lo realiza individualizado, así como acciones a tomar para implantar esta minimización. El término reducción en muchas ocasiones se utiliza como minimización y aunque la más simple y eficaz medida para reducir el volumen de residuos es introducir una clasificación o definición de los mismos que sea clara y fácil de entender así como establecer y aplicar criterios comunes referidos especialmente a aquellos residuos que por sus especiales características requieran un envasado, transporte y tratamiento diferenciado, en nuestra opinión la minimización de residuos es prioritaria e inaplazable ya que la política de Residuos de la Unión Europea lo contempla en la Directiva 75/442, el 5º Programa de Medio Ambiente, la Directiva 91/C 190/ 01 relativa a los Envases y sus residuos, así como la Directiva 94/62, DOCE L, 365. La minimización debe entenderse en el concepto más amplio de “prevenir la generación de residuos“ y este nuevo enfoque, para los residuos sanitarios, incluye actuaciones a llevar a efecto por el hospital, por los proveedores o fabricantes y por el Estado o Comunidad Autónoma. B.- Plan de Contingencia y medidas de prevención de riesgos para todo el personal (manipulador y no manipulador) Se deberá contemplar un Plan de Contingencia y Medidas de Prevención de Riesgos, según los establecido mediante la Ley 31/95 del 8 de Noviembre de Prevención de Riesgos Laborales. La Ley de Prevención de Riesgos Laborales tiene por objeto promover la seguridad y la salud de los trabajadores mediante la aplicación de medidas y el desarrollo de las actividades necesarias para la prevención de riesgos derivados del trabajo. Esta Ley establece los principios generales relativos a la prevención de los riesgos profesionales para la protección de la seguridad y de la salud, la eliminación o disminución de los riesgos derivados del trabajo, la información, la consulta, la participación equilibrada y la formación de los trabajadores en materia preventiva.

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La Ley de Prevención de Riesgos Laborales regula las actuaciones a desarrollar por las Administraciones Públicas, así como por los empresarios, los trabajadores y sus respectivas organizaciones representativas. Por tanto debe existir una normativa acorde con lo establecido en la Ley de prevención de Riesgos Laborales y con este Plan en donde estén recogidas y escritas las medidas que han de ponerse en práctica ante determinadas circunstancias, (Roturas, salpicaduras, inoculaciones etc.), y otras tales como actuación inmediata en suelos y superficies, registros, protocolos de control y seguimiento, profilaxis etc. del trabajador que sufra algún accidente o incidente con este tipo de residuos, así como la dotación y equipamiento para la protección individual y las vacunaciones obligatorias de este personal que, al menos deberían ser, frente a tétanos y hepatitis B. C.- Se deberá contemplar un Plan de Gestión de Envases y Residuos de Envases Farmacéuticos, clínicos y hospitalarios. Atendiendo al objeto y ámbito de aplicación de la Ley de envases y residuos de envases (BOE Nº 99 de 25/4/97), hay que tener en cuenta que hay que prevenir y reducir el impacto sobre el medio ambiente de los envases y la gestión de los residuos de envases a lo largo de todo su ciclo de vida. Para alcanzar los anteriores objetivos se establecen medidas destinadas, como primera prioridad, a la prevención de la producción de residuos de envases, y en segundo lugar, a la reutilización de los envases, al reciclado y demás formas de valorización de residuos de envases, con la finalidad de evitar o reducir su eliminación. Quedan dentro del ámbito de aplicación de la Ley de envases y residuos de envases a aquellos puestos en el mercado y generados, respectivamente, en el territorio del Estado. Lo establecido en la Ley de envases y residuos de envases lo será sin perjuicio de las disposiciones de carácter especial referentes a seguridad, protección de la salud e higiene de los productos envasados, medicamentos, transportes y residuos peligrosos. D.- Participación del personal en el Plan Propuesto Los profesionales sanitarios, y en general todos los empleados, son los miembros del Hospital que están más en contacto con los residuos y emisiones que éste genera y su manera de trabajar puede influir en su generación, por lo que ocupan una posición privilegiada para identificar problemas y plantear posibles soluciones. Es importante que comprendan los motivos del plan que se desea implantar, que se familiaricen con los cambios que se propongan y se sientan parte importante

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del programa en marcha, lo que puede lograrse mediante la formación y el reconocimiento de sus aportaciones. La formación puede proporcionarse organizando seminarios donde incluyan medios audiovisuales que pueden servir para presentar ejemplos prácticos de situaciones que aparezcan en las plantas: manipulaciones incorrectas, clasificaciones diferentes, etc. Mediante reuniones del equipo responsable del Plan de minimización hospitalaria con los operarios, es posible informarles de los objetivos del Plan y de las mejoras que se espera alcanzar por la gestión del hospital y la de los propios trabajadores. Estas reuniones permiten resolver las dudas que los operarios pueden tener y conseguir que comenten los problemas que hayan identificado. En estas reuniones se debe prestar especial atención al personal implicado en acciones con impacto directo en la generación de residuos y emisiones y que pueden identificar oportunidades de minimización: DUE/ATS, Facultativos médicos, auxiliares, personal interno, mantenimiento, etc. La formación de los operarios debe mantenerse mientras dure la elaboración e implantación del Plan, pues siempre hay nuevos empleados que desconocen las técnicas de minimización. Además sirve para mantener el interés de todos los trabajadores y para informarles sobre los resultados del programa en marcha. En los grandes hospitales puede hacerse con ayuda de un boletín interno o utilizando planes de anuncios instalados en las zonas de paso; en los pequeños hospitales o clínicas mediante reuniones periódicas. El procedimiento de las aportaciones de los operarios se logra por medio de una política diseñada al efecto, que puede incluir regalos y primas por las ideas de minimización que proporcionan buenos resultados, premios y nominaciones a las mejoras ideas. E.- Sistema de Evaluación y Registro. Es necesario estar en constante evaluación de los objetivos planteados en este plan para continuar con el mismo, si los objetivos se alcanzan, o para corregir las anomalías o desviaciones que se detecten. Para finalizar consideramos que la promulgación de una normativa estatal no debe obligar a la creación de normativas específicas por parte de las Comunidades Autónomas que carezcan de ella. Sin embargo, la promulgación de una normativa estatal debería establecer los requisitos mínimos que todas las Comunidades Autónomas deberían considerar en la gestión de los residuos sanitarios, homogeneizando todos los aspectos aquí considerados.

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