Master en Ingeniería Química

• En 1910, el botánico ruso M. Tswett describió por vez primera esta técnica, que fue aplicada a la separación de pigmentos de plantas, dándole el nombre de cromatografía en referencia a las bandas coloreadas de pigmentos que se separaban por su adsorción selectiva sobre columnas de yeso ("chroma" (color) y "graphein" (escribir)).

• Tras su descubrimiento, la cromatografía quedo prácticamente olvidada hasta 1930, año en que fue redescubierta por Kuhn y Lederer, quienes la aplicaron para la separación de carotenoides; a partir de este momento, el uso de esta técnica se fue extendiendo cada vez más, al tiempo que se desarrollaban diferentes versiones de la misma: cromatografía de reparto, de papel, de capa fina, etc.

• Un hito importante en el desarrollo de la cromatografía lo constituyó el desarrollo de la cromatografía gas-líquido.

• Hoy en día casi no hay campo de la química, biología, medicina, etc. en el que no se utilice la cromatografía en alguna de sus formas, tanto en su vertiente preparativa como en la analítica; por otra parte el desarrollo sobre el uso conjunto de la cromatografía con otras técnicas analíticas, así como el desarrollo de otros tipos de cromatografía, como es por ejemplo la de fluidos supercríticos, hace previsible una extensión aún mayor de su uso.

• La cromatografía es esencialmente un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una inmóvil (fase estacionaria), y otra móvil (fase móvil) la cual percola a través de la primera.

• El proceso cromatográfico se da como resultado del movimiento de los componentes de la mezcla arrastrados por la fase móvil a lo largo de la fase estacionaria (elución), produciéndose la separación debido a las diferencias en las constantes de distribución de los componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la móvil.

• A la distribución final de los componentes en función de su posición sobre el lecho estacionario, o del tiempo en que eluyen se le denomina cromatograma.

Ejemplo: Se utiliza una columna rellena de CaCO3, en la que se introduce un extracto de hojas

verdes en éter de petróleo, y seguidamente se añade disolvente puro (éter de petróleo)

(eluyente), con el objetivo de separar tres componentes, clorofila, carotenos y xantofilas.

En esta separación, la fase estacionaria es el relleno (CaCO3), la fase móvil es el éter de petróleo y

los componentes a separar, los distintos pigmentos vegetales, los cuales se encuentran sometidos

a dos fuerzas contrarias: el disolvente tiende a arrastrarlos hacia la salida y el CaCO3 a retenerlos.

Como este último efecto es diferente para los distintos pigmentos, éstos se mueven a diferente

velocidad y emergen de la columna a distintos tiempos. Cuando se mide la concentración de cada

componente a la salida de la columna y se representa en función del volumen de fase móvil, o del

tiempo transcurrido desde la introducción de la muestra, se obtiene una gráfica denominada

"cromatograma".

• Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y la móvil

un líquido.

• Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido anclado a

un soporte sólido y la fase móvil un líquido.

• Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no volátil

impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas.

• Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un

gas.

Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil

• Pueden distinguirse dos categorías: plana y en columna.

• En cromatografía plana, la fase estacionaria puede estar constituida por una hoja de papel (cromatografía en papel) o por una capa de un sólido distribuido uniformemente sobre una lámina de vidrio, plástico o aluminio (cromatografía de capa fina).

• En cromatografía en columna, la fase estacionaria está contenida en una columna. Cuando la fase estacionaria es un líquido, éste debe inmovilizarse sobre un soporte sólido inerte, o sobre la propia columna.

• La cromatografía plana está limitada al uso de fase móvil líquida, debido a las dificultades inherentes para confinar un gas o un fluido supercrítico en una superficie plana. Sin embargo, la cromatografía en columna puede utilizarse en las modalidades de líquidos, gases y fluidos supercríticos.

• En el caso de la cromatografía líquida en columna existen dos modalidades, que pueden denominarse en función de su desarrollo cronológico como cromatografía clásica en columna y cromatografía de alta resolución (CLAR o HPLC:High Performance Liquid Chromatography).

Dependiendo del soporte o técnica utilizada para desarrollar el cromatograma

Cromatografía de adsorción

• La separación depende de los equilibrios de adsorción/desorción de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria sólida (adsorbente) y la fase móvil líquida o gaseosa.

• La fuerza con que es adsorbido un componente depende de: la polaridad del componente, la actividad del adsorbente y la polaridad de la fase móvil.

• En general cuanto más polar es un compuesto más fácilmente será adsorbido.

• La cromatografía de adsorción, es una técnica apropiada para la separación de compuestos de polaridad baja y media. La separación de compuestos muy polares requiere, debido a la gran retención que ofrecen, la utilización de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos químicos previos para la preparación de la muestra a fin de reducir su polaridad.

• Una característica importante del adsorbente es el tamaño de partícula. La retención es proporcional al área superficial, la cual, a su vez, depende del tamaño de partícula y de la estructura interna de las partículas de adsorbente. Cuanto menor sea el tamaño de partícula, mayor será el área superficial del adsorbente y, en consecuencia, mayor el número de centros activos disponibles para la adsorción.

Dependiendo del mecanismo de separación

Cromatografía de reparto

• Está basada en la separación de una mezcla de sustancias mediante el

reparto existente entre la fase móvil (líquido o gas) (por ejemplo un

líquido no polar como el hexano) y la fase estacionaria (líquida)

(generalmente un líquido polar como por ejemplo etilen-glicol), soportada

o ligada sobre un sólido adecuado (gel de sílice, celulosa, tierra de

diatomeas, poli-estireno, etc.).

• La mayor o menor migración de un compuesto en este tipo de

cromatografía, será función del coeficiente de reparto de éste entre la fase

estacionaria y la fase móvil.

• La cromatografía de reparto es utilizable para la separación de mezclas de

compuestos de polaridad media y alta.

Dependiendo del mecanismo de separación

Cromatografía por tamaño molecular

• También llamada de permeación de gel, de tamiz molecular o de exclusión.

• Consiste en la separación de las moléculas basándose en su tamaño en lugar de en su solubilidad o polaridad.

• Las fases estacionarias empleadas para este tipo de cromatografía son inorgánicas (zeolitas), o geles orgánicos compatibles con disolventes acuosos (agarosa, poliacrilamida) u orgánicos (copolímeros estireno/divinilbenceno).

• Estas fases estacionarias poseen cavidades en las cuales las moléculas de los compuestos a separar pueden penetrar y ser retenidas, siendo las moléculas mayores las eluidas.

• El rango de trabajo de estas fases estacionarias, se define como el intervalo de pesos moleculares que pueden ser separados; otro parámetro que caracteriza a este tipo de fases, es su límite de exclusión, que se define como el peso molecular a partir del cual los compuestos pasarán a través del lecho estacionario sin experimentar retención.

Dependiendo del mecanismo de separación

Cromatografía de cambio iónico

• Las separaciones por intercambio iónico, se llevan a cabo con materiales insolubles y de textura porosa, los cuales presentan grupos reactivos asociados a iones capaces de intercambiarse con los del medio que les rodea, por lo que este tipo de cromatografía ha de realizarse en medio líquido.

• Se utiliza para la separación de sustancias iónicas, tanto inorgánicas como orgánicas y están basadas en los diferentes equilibrios de reparto de los iones de la mezcla entre el material cambiador y la disolución.

• En general, se utilizan tres tipos de materiales: resinas, geles y celulosas. La diferencia fundamental entre ellos reside en su microestructura ya que, generalmente, las resinas presentan un tamaño de poro mucho menor, siendo apropiadas para la separación de sustancias de pequeño volumen molar.

• Otras diferencias existentes entre los materiales son debidas a la naturaleza de los grupos cambiadores (fuerza del grupo cambiador) y al número de estos por unidad de peso de material (capacidad de cambio).

Dependiendo del mecanismo de separación

Dependiendo del mecanismo de separación

Resumen de los tipos de cromatografía (Separation Process Principles, 3rd Edition; J. D. Seader (University of

Utah); Ernest J. Henley (University of Houston); D. Keith Roper).

� Los sorbentes (fases estacionarias pueden venir en muchas formas y composiciones químicas

debido a las diversas formas que se aplica la cromatografía.

� La mezcla a separar, después de la inyección en el fluido portador para formar la fase móvil,

puede ser un líquido (cromatografía líquida) o un gas (cromatografía de gases). A menudo, la

mezcla es inicialmente un líquido, pero se vaporiza por el gas portador, dando una mezcla de

gases como fase móvil.

� Los gases portadores son inertes y no interactúan con el sorbente o alimento. Los líquidos

portadores pueden interactuar y deben ser seleccionados cuidadosamente.

� La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido soportado o unido a un sólido, o un gel.

� Con un adsorbente poroso sólido, el mecanismo de separación es la adsorción. Si el mecanismo

deseado es el intercambio iónico, se utiliza una sustancia cambiadora de iones, polimérica o

sintética. Con un gel de polímero o un sólido microporoso, es posible una cromatografía del tipo

exclusión.

� En columnas de relleno (> 1 mm de diámetro interno), los sorbentes son en forma de partículas.

� En las columnas capilares (<0,5 mm diámetro interior), el sorbente es la pared interior o un

revestimiento sobre esa pared.

� Cada tipo de sorbente se puede aplicar a hojas de vidrio, plástico, o aluminio para su uso en

cromatografía de capa fina (o plana) o a una hoja de material de celulosa para uso en

cromatografía de papel.

� Si se utiliza una bomba en lugar de la gravedad para pasar una fase móvil líquida a través de una

columna de relleno, se utiliza la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

� Los dos adsorbentes más comunes utilizados en la cromatografía son alúmina porosa y gel de

sílice poroso. De menor importancia son carbono, óxido de magnesio, y carbonatos.

Ejemplo: Seleccionar un modo de cromatografía para la separación de las

siguientes mezclas:

a) mezcla de gases, O2, CO, CO2 y SO2

b) mezcla vaporizada de antraceno, frenantreno, pireno y criseno

c) solución acuosa conteniendo Ca+2 y Ba+2.

Solución:

• Cromatografía gas-sólido, en la que la fase móvil es un gas y la fase

estacionaria un sólido-adsorbente.

• Cromatografía gas-líquido, en la que la fase móvil es un gas y la fase

estacionaria un líquido soportado en un sólido.

• Cromatografía de intercambio de ión, en la que la fase móvil es un líquido y la

fase estacionaria una resina polimérica.

Existen diferentes formas de operar en cromatografía.

• Análisis por elución: es la técnica utilizada en casi todas las separaciones

cromatográficas. En ella, el paso de la fase móvil se continúa indefinidamente hasta que

los componentes separados de la mezcla emergen al final del lecho cromatográfico.

Esta técnica presenta la desventaja de que los compuestos con retenciones muy altas

pueden no ser observados.

• Análisis por desarrollo: el cromatograma se desarrolla hasta que el frente del

disolvente alcanza el final del lecho , de forma que los constituyentes de la mezcla una

vez separados permanecen sobre el lecho al finalizar la separación. La técnica de

análisis por desarrollo presenta la ventaja de que es analizable la totalidad de la

muestra, incluyendo los compuestos de muy baja o muy alta retención.

• Análisis frontal: basado en la diferencia de afinidad del adsorbente por cada una de las

sustancias a separar. Se utiliza una pequeña columna, que es saturada sucesivamente

por cada una de las sustancias a separar, emergiendo de ella el primer componente

puro hasta que la columna se satura del segundo componente, momento en el que

empezará a emerger éste mezclado con el primero.

• Análisis por desplazamiento: se añade una sustancia desplazante que va incorporada

dentro de la fase móvil y que es más fácilmente retenida, desplazando la mezcla por la

columna al mismo tiempo que se separa.

Los componentes a separar, en su desplazamiento a lo largo del sistema cromatográfico se

mueven a diferentes velocidades, dependiendo de la afinidad de cada uno por la fase

estacionaria, respecto a la fase móvil.

Cada uno de ellos se distribuye entre las dos fases según un equilibrio caracterizado por

una constante denominada constante de distribución o coeficiente de distribución.

Para un componente A,

KA=AS

AMdonde [As] es la concentración de A en la fase estacionaria y [AM] la concentración de A en

la fase móvil.

Cuanto mayor sea el valor de K, mayor será la afinidad del componente por la fase

estacionaria y menor será la velocidad a la que se mueve a través del sistema.

Para una muestra que contenga los componentes A, B y C, si KA > KB > KC el componente A

se desplazará a lo largo del sistema más lentamente que el B, y éste más despacio que el C.

Constante de distribución y separaciones

Los parámetros característicos de un sistema cromatográfico y de un cromatograma son:

� Volumen muerto (VM): volumen total de fase móvil utilizado igual al volumen vacío o

intersticial de la columna.

� Volumen de retención (VR ): volumen de fase móvil necesario para transportar la banda

de un componente desde el punto de inyección, a través de la columna, hasta el

detector.

� Tiempo muerto (tm): tiempo necesario para que una especie no retenida pase a través

de la columna y alcance el detector.

� Tiempo de retención (tR): tiempo necesario para que el componente, una vez inyectado

pase a través de la columna y alcance el detector.

Retención y factor de capacidad

� Tiempo de retención corregido

o ajustado (t'R): tiempo real

que la fase estacionaria ha

retrasado el avance del

compuesto, y por tanto que el

componente ha necesitado

para atravesar la columna

(diferencia entre el tiempo de

retención y el tiempo muerto.

Factor de capacidad (k') ,

�′ =�′�

��=�� − ��

��

expresa la retención de un compuesto por la fase estacionaria. En la práctica, valores de k'

comprendidos entre 1 y 15, para no alargar excesivamente los tiempos de separación.

Al ser el volumen proporcional al tiempo,

�′ =�′�

��=�� − ��

��

Es un parámetro independiente de la velocidad de flujo de la fase móvil y de las

dimensiones de la columna, y puede usarse para comparar retenciones en instrumentos

diferentes.

Volumen de retención, de la expresión anterior,

VR = VM (1 + k')

que en cromatografía de adsorción se modifica,

VR = VM + kA As

donde kA es el coeficiente de adsorción y As el área superficial del adsorbente.

Retención y factor de capacidad

Factor de separación o selectividad , α, permite expresar la capacidad de una determinada

fase estacionaria para separar dos componentes A y B :

α=kB'/k'A

que puede determinarse fácilmente de forma directa midiendo los tiempos de retención

de las especies A y B sobre un cromatograma experimental, ya que,

∝=�� − ��

�� � − ��

Retención y factor de capacidad

� Cuando se introduce, en forma de banda muy estrecha, una mezcla de los componentes a separar

en una columna cromatográfica (cabeza de columna), al eluir la mezcla desde un extremo a otro de

la columna, se observa que las bandas de soluto se van ensanchando al mismo tiempo que se

separan.

� Este proceso es debido fundamentalmente a la difusión de las moléculas de la banda, que tienden

a distribuirse uniformemente en todo el volumen disponible.

� El proceso de difusión es dependiente del tiempo, de forma que la dispersión de la banda

aumentará en función del tiempo de elución.

Dispersión y anchura de las bandas

Dispersión y anchura de las bandas

� Dado que los movimientos de las moléculas son al azar, la concentración final de las moléculas

dentro de una banda cromatográfica adoptará, en un caso ideal, un perfil de distribución normal, y

el registro de las concentraciones de la banda en función del volumen eluído o del tiempo, dará

lugar a una forma gaussiana de anchura definida por la desviación standard de la dispersión.

� La anchura de los picos está directamente relacionada con el tiempo de residencia en la columna

(inversamente proporcional a la velocidad de flujo de la fase móvil)

� A mayor tiempo, mayor dispersión, de forma que las especies eluidas al final presentan picos más

anchos que las eluidas al comienzo.

� El ensanchamiento de los picos de los distintos componentes del analito actúa en detrimento de

la separación, de forma que el objetivo en cromatografía es la obtención de picos estrechos y

simétricos.

El tema de la eficacia de un sistema cromatográfico se aborda desde dos puntos de vista:

La teoría de platos: se basa en considerar que la columna está constituida por numerosas,

pero discretas capas estrechas, denominadas platos teóricos, en términos análogos a lo

que ocurre en la teoría de la destilación fraccionada o de la extracción en contracorriente.

Se considera que en cada plato se establece un equilibrio del componente entre la fase

móvil y la fase estacionaria, y el desplazamiento del analito a través de la columna se trata

como una transferencia de la fase móvil desde un plato al siguiente.

La eficacia de la columna aumenta al hacerlo el número de estas transferencias, esto es, al

aumentar el número de platos teóricos.

La teoría cinética: considera que el ensanchamiento de las bandas se produce como

consecuencia de que los distintos procesos de transferencia de masa durante el

desplazamiento de una especie a lo largo de la columna ocurren a velocidad finita.

Según esta teoría, la forma de los picos depende de los siguientes factores:

* Difusión por turbulencia y trayectorias seguidas por la fase móvil

* Difusión longitudinal del soluto a lo largo de la columna

* Equilibrio del soluto entre las fases móvil y estacionaria

Eficacia de la columna

Para expresar la calidad de un pico, se utiliza un parámetro relativo que tenga en cuenta tanto la

retención como la anchura de la banda,��

�tR, tiempo de retención, σ desviación estándar de la banda cromatográfica

El número de platos teóricos se define como el cuadrado del cociente anterior:

N=(tR/σ)2

Así, el número de platos teóricos de una columna puede calcularse utilizando la anchura de uno de

sus picos, normalmente el último (w=4σ o w1/2 =2,35σ) que pueda medirse directamente sobre el

cromatograma,

N=16tRw

2N=5,545

tRw

1/2

2

Eficacia de la columna: Teoría de platos

El número de platos de una columna cromatográfica depende de su longitud, por lo que para

comparar la eficacia de columnas con diferente longitud, L, se introduce el concepto de altura

equivalente de un plato teórico,

H=L

N

Al considerar la eficacia, solamente se han tenido en cuenta los efectos propios de la columna,

aunque existen otros parámetros del sistema (anchura de banda inicial, velocidad de la fase móvil,

etc.) que contribuyen al ensanchamiento de las bandas cromatográficas.

Eficacia de la columna: Teoría de platos

La separación entre dos bandas cromatográficas, puede estudiarse en función de dos parámetros

� La retención relativa o factor de separación,

α=kB'/k'A� La resolución,

Rs= ∆t

w1+w22

Una separación total de dos bandas requerirá valores de α y de Rs lo más elevados posible

Un valor elevado de Rs puede conseguirse aumentando la eficacia de la columna (mayor longitud de

columna, menores dispersiones de banda, etc.)

El valor de α es constante para cada sistema cromatográfico y solamente podrá variarse alterando la

fase estacionaria o la móvil (cambiando de sistema cromatográfico).

La solución de un problema real de separación entre dos bandas deberá darse en función de los

valores de α y Rs que presente

� para valores altos de α y bajos de Rs, la separación podrá conseguirse mediante un aumento de

eficacia

� para valores bajos de α no es practico intentar la separación en base a un aumento de eficacia y

debe procederse a un cambio del sistema.

Eficacia de la columna

Es la representación de la altura equivalente a un plato teórico, frente a la velocidad lineal de la

fase móvil.

Los factores que contribuyen al ensanchamiento de una banda cromatográfica que se mueve a lo

largo de una columna son los siguientes:

1. Difusión molecular.

2. Irregularidades en el relleno (difusión de Eddy).

3. Resistencia a la transferencia de materia en la fase móvil.

4. Resistencia a la transferencia de materia en la fase estacionaria.

La difusión molecular es debida a la dispersión de las moléculas de la banda a lo largo de la columna,

tanto si se mueve como si está en reposo.

La desviación originada por difusión molecular viene dada por,

� =2γDmL

uDm coeficiente de difusión molecular, L longitud de la columna, u velocidad lineal del eluyente y γ

coeficiente de tortuosidad, que tiene en cuenta la perturbación de la difusión molecular debida a

irregularidades de la fase estacionaria.

El ensanchamiento de la banda por la irregularidad de la fase estacionaria, viene dado por,

� =aL��/�

a es un coeficiente que será función del tamaño medio de la partícula y del coeficiente de dispersión

en la fase móvil

Teoría cinética. La curva AETP

La curva AETP

El ensanchamiento de la banda debido a la resistencia a la transferencia de materia, en la fase móvil y

en la fase estacionaria, vendrá dado por,

�� =��L� �

��

�� =��L� �

��d es el diámetro medio de la partícula del lecho estacionario y Cm y Ce coeficientes que dependen

respectivamente de la fase móvil y de la fase estacionaria.

A partir de las ecuaciones anteriores, se puede deducir que la desviación total de la banda vendrá

dada por,

� =2γDmL

u+aL��/�+

��L� �

��+��L� �

��Y en consecuencia, la altura equivalente de plato teórico, vendrá dada por la expresión:

H=�

�=��

L=

2γDm

u+a��/�+

�� ��

!�+�"

��

!�

Expresión matemática de la curva de AEPT o ecuación de Van Deemter

$ =%

&+ ( + )&

La curva AETP

� La altura de plato es función del diámetro de las partículas de la fase estacionaria, mejorándose la

eficacia del sistema cromatográfico a medida que disminuye el tamaño de partícula.

� La eficacia de una columna cromatográfica, será también función de la velocidad lineal de la fase

móvil

Asismetría de picos

Como primera aproximación, se ha considerado que los picos cromatográficos eran

gaussianos (simétricos). En la práctica no es así y la realización de cálculos en base a esta

suposición, puede llevar a errores significativos si se trabaja con picos muy distorsionados.

El modelo de la curva de Gauss sólo es apropiado cuando se trabaja con picos cuya

asimetría es ligera.

Factor de asimetría,

FA=b+f

b+f−∆wΔw=|b-f|

Los factores de asimetría elevados deben ser evitados (por los errores en la cuantificación

y por la pérdida de resolución). Un pico con FA = 1,1 ocasiona una pérdida de eficacia de un

10 %.

La asimetría de los picos puede ser debida a:

• resolución incompleta de dos bandas

• reacciones químicas del compuesto en la

columna

• volúmenes muertos en el sistema

cromatográfico

• técnicas de inyección incorrectas, etc.

Factores extra-columna que distorsionan la banda

� Introducción de la muestra: teóricamente suele considerarse que la muestra se

introduce en el sistema cromatográfico de forma que ocupa una capa de espesor

infinitamente pequeño.

Sin embargo, en la realidad, la muestra ocupa un volumen finito, y a veces

relativamente grande.

Por ejemplo, en cromatografía de gases un micro-litro de una sustancia líquida

inyectada puede ocupar un volumen del orden de 0.5 mL cuando se vaporiza a 250 º, y

ello representa varios centímetros de longitud de columna.

En cromatografía líquida suelen emplearse bucles conteniendo un determinado

volumen de muestra.

En cromatografía en papel y de capa fina la muestra deberá aplicarse en forma de una

gota tan pequeña como sea posible.

� Volúmenes muertos en el sistema de inyección, detector y tubos de conexión: por

volumen muerto se considera el existente entre el punto de inyección de la muestra y el

punto de detección, excepto el volumen ocupado por la fase estacionaria. Cualquier

zona del sistema en la que estén presentes el soluto y la fase móvil, pero no expuesta a

la fase estacionaria contribuye a la difusión del soluto y, en consecuencia, al

ensanchamiento de las bandas cromatográficas.

Deberán usarse tubos estrechos para las conexiones entre el sistema de inyección y la

columna, y entre ésta y el detector.

Separation Process Principles, 3rd Edition; J. D. Seader (University of Utah); Ernest J.

Henley (University of Houston); D. Keith Roper. John Wiley & Sons, Inc., 2010.

Ténicas Analíticas de Separación; M. Valcálcer y A. Gómez. Editorial Reverté S.A., Barcelona

1988.

http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/principios_

de_cromatografia.pdf

Material docente, Universidad Politécnica de Cartagena, www.upct.es.

Introducción al Análisis Instrumental, L. Hernández Hernández y C. Gónzález Pérez, Ed.

Ariel, 2002.