HONGOS Y LEVADURAS

MARCO TEORICO

A) HONGOS o mohos

Pertenecen al reino Fungí

Son eucarioticos, heterotróficos y se reproducen asexualmente mediante la formación de esporas o yemas.

Se caracterizan por su falta de clorofila y por la presencia de una pared celular rígida que contiene quitina, glucamanosa y a veces celulosa

Son saprofitos, viven en materia orgánica muerta y no necesitan de luz para poder crecer.

Habitan en ambientes húmedos (suelo, plantas muertas)

B) LEVADURAS

Son hongos unicelulares de morfología esférica o elíptica que, salvo ciertas excepciones, se reproducen por gemación o fisión.

Necesitan oxigeno para su crecimiento además de minerales y vitaminas especiales (tiamina, biotina, inositol, acido pantotenico.

No ocasionan toxiinfecciones alimentarias. Las escasas levaduras patógenas existentes causan alteraciones en los alimentos, especialmente en los azucares y en los ácidos, pero no causan problemas sanitarios.

Desde el punto de vista comercial entre la mas importante tenemos a la Saccharomyces cerevisae (industria panadera y cervecera)

Factores de crecimiento

PH optimo 4.5 – 6.5, y las tolerantes de 2.8 -8.5

Temperatura optima: 25ºC aunque algunas se pueden reproducir a 0ºC y pueden vivir entre 5 – 37ºC

Son osmotolerantes

Actividad de agua 0.65

Hongos importantes en alimentos

Quesos famosos, como el Roquefort, Brie o Camembert, El moho Penicillium roquefortii da el sabor característico

En el pan, particularmente las levaduras, juegan un papel muy importante en su elaboración.

La levadura tiene una capacidad única para producir alcoholes como el alcohol etílico (que sirve para elaborar bebidas alcohólicas como el vino o el aguardiente) y dióxido de carbono o CO2 (resultante de la descomposición del carbono) a partir de azúcares como la glucosa, en ausencia de oxígeno.

El Aspergillus tamarii y otras especies de hongos imperfectos se utilizan en Oriente para producir salsa de soya, fermentando el poroto de soya

También hay hongos que atacan los alimentos provocando daños en el producto como en el caso de:

Aspergillus determinan coloraciones amarillentas verdosas u oscuras algunas especies producen aflatoxinas elaboran proteasas

Aspergillus spp. en almacenamiento de alimentos como pescado seco y leche condensada, granos de cereales y compotas, queso y materiales de envasado. Son importantes las especies que producen micotoxinas

Fusarium en los cultivos aparece algodonoso con tonalidades rosa, deterioran muchos frutos y verduras Las pudriciones terminales causadas por Fusarium spp. se introduce en frutas y vegetales por heridas y reventaduras o roturas hechas en el manejo de las frutas y hortalizas

La descomposición de las frutas puede ser causada por varias especies de Fusarium que se encuentra en el suelo y frutas antes de la cosecha, selección y almacenamiento

Además

Aspergilius repens : Mantequilla

Wallemia sebi : Carnes (coloración chocolate en los embutidos)

Botrytis cinerea : legumbres frescas (por almacenamiento prolongado prolifera un moho en forma de tela de araña blanco grisácea (moho gris).

Lecvaduras de interés clinico

Candida albicans vive normalmente en la atmósfera vaginal, por cuanto aquí el ph es ácido (5,0-4,0).

En verdad, la Candida se localiza en la mucosa del intestino delgado

Mientras la localización vaginal puede ser considerada como una localización secundaria

Localización cutánea (presencia de machas hongosas cuando se expone al sol) puede representar la localización secundaria

Toxicidad de Hongos

Los cereales:

El trigo, el maíz, la cebada, la avena pueden contaminarse y podremos encontrar en estos cereales todo tipo de micotoxinas, como las aflatoxinas, las ochratoxinas A y B, el ácido penicilínico, los alcaloides del cornezuelo, la zearalenona.

Las oleaginosas:

En los granos y sus residuos encontramos sobre todo especies de Aspergillus (Aspergillus flavus) Fusarium y Penicillium. Aspergillus flavus aparece principalmente en determinados

Las micotoxinas y sus orígenes fúngicos Micotoxinas Mohos responsables Toxicidad Aflatoxinas B1, B2, G1, G2, M1, M21

Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus

Mutágeno, teratógeno, cancerígeno, hepatotóxico, nefrotóxico, neurotóxico.

Ácido penicilínico Penicillium puberulum Penicillium cyclopium Penicillium suavolens Aspegillus ochraceus Aspergillus sulphureus

Citotóxico

Ocratoxina A y B Aspegillus ochraceus Penicillium viridicatum

Teratógeno, hepatotóxico, nefrotóxico, neurotóxico

Zearalenona Fusarium graminearum Efectos endocrinos Esterigmatocistina Aspergillus versicolor

Aspergillus regulosos

T2 Fusarium tricinctum Citroviridina Penicillium citroviridia Ácido ciclapiazónico Penicillium ciclopium Rubratoxina Penicillium rubrum

Penicillium purpugerum

Luteoskirina Penicillium islandicum Tricotecenos Fusarium divers Citotóxico, irritante de las

mucosas Cladosporina Cladosporium cladosporoides Tremórgenos Penicillium patulans

Aspergillus flavus Neurotóxico

lotes de maní; pero también encontramos los granos de girasol, lino, soya, contaminados con aspergillus, aunque se trata de especies poco tóxicas.

Frutos y verduras.

Los frutos y las verduras pueden recubrirse de una multitud de hongos en fase de espora y si las condiciones de cosecha y almacenamiento son favorables, estas esporas proliferan y originan podreduras diversas.

Las carnes y productos de charcutería

Es posible encontrar la aflatoxina en los huevos y también la ochratoxina en el caso de intoxicaciones.

Leche y productos lácteos.

Las micotoxinas como la aflatoxina pasa a la leche y puede ocurrir que algunos residuos de semillas ricos en aflatoxinas determinen su presencia en la leche de ganado. Productores y colectores deben dedicar especial atención a este problema.

FUNDAMENTO

Se usa para realizar el estudio de si un alimento se encuentra contaminado con estos microorganismos, esto puede ocurrir debido a que la materia prima usada estaba contaminada o a que el producto a estado en malas condiciones de almacenamiento

OBJETIVO

- Conocer el procedimiento e importancia de la determinación de hogos contaminantes en los alimentos.

- Aprender los métodos de aislamiento y determinación de hongos contaminantes.- Diferenciar los métodos de determinación de hongos contaminantes.

AGAR OGY (agar oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura (base))

NOMBRE:AGAR OGY(Agar-Oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura)

Descripción yUso:

Agar selectivo según Mossel y col.(1970) para la demostración y numeración de mohos y levaduras en todo tipo de material de investigación (alimentos, material clínico, etc.).El agar-oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura ha sido recomendado como medio de rutina para la investigación de mantequilla.En la investigación de muestras de heces procedentes de pacientes  tratados con Tetraciclina, las Enterobacteriáceas sólo son inhibidas de manera insuficiente. En tales casos, es preferible el empleo de Gentamicina en vez de la Oxitetraciclina.

Composición: (g/L)

Extracto de levaduraD(+)glucosaAgar-agar

Aditivo:Oxitetraciclina 0,1 o Gentamicina 0,05.

5,010,015,0

Preparación

Disolver 30 g/litro, esterilizar en autoclave (15 min. A 121ºC), dejar enfriar hasta unos 50ºC, incorporar 0,1 g/litro de Oxitetraciclina en forma de solución acuosa o 0,05 g/litro de Gentamicina (1 mL/litro de Gentamicina en solución) y verter en placas.pH: 6.5 + 0,2Las placas con medio de cultivo son claras e incoloras.

Empleo e interpretación

El material objeto de investigación se homogeniza, eventualmente, con solución Ringer (Tabletas de RINGER), se diluye y se extiende sobre las placas mediante espátula.Incubación: hasta 5 días a temperatura ambiente (aprox. 22ºC).Contar el número de colonias de hongos por placa y mediante el factor de dilución, calcular el número de gérmenes del material objeto de

investigación.

MATERIALES

- 2 botellas esteriles- 6 placas petri estériles - 1 pipetas estériles de 10 ml - 3 pipetas estériles de 1ml - mechero- espátula Drigalsky- Agua peptonada - balanza electrónica - Agar Ogy- Una capsula de oxatetraciclina

PROCEDIMIENTO

Previamente preparamos nuestro agar, al cual le agregamos oxitetraciclina para inhibir el crecimiento de bacterias y procedemos a plaquear

Colocamos la mitad de nuestra muestra en agua peptonada y lo mezclamos enérgicamente. Dejamos reposar para que sedimente un poco

Separamos 10ml de la muestra en 90ml de agua peptonada. Realizamos las diluciones 10-2, 10-3

Realizamos la siembra por diseminación en el Agar Ogy , colocando 0.1 ml de cada dilución y diseminamos con ayuda d ela espátula de Drigalsky la cual hemos esterilizado previamente.

Incubamos a 25º C de 3 a 5 dias

PROCEDIMIENTO SEGÚN LA NORMA

Preparación y dilución de las muestras de alimentos:

1- tarar un matraz vacío y pesar en el 10gr de la muestra del alimento.2- Añadir un volumen diluyente igual a 9 veces la muestra ( 90ml). Así se logra la dilución

10-1 ( el diluyente debe ser agua de triptona, solución Tween 80 o solución Ringer).3- Hacer funcionar la licuadora un tiempo suficiente según la velocidad, para conseguir

15000 a 20000 revoluciones, teniendo en cuidado en que la duración de la operación no exceda de 2,5 minutos.

4- Agitar el homogenizado ( dilución 10-1) y pipetear una porción de 10 ml a otro matraz o botella con 90 ml de diluyente, obteniéndose la dilución 10-2.

5- Mezclar el liquido cuidadosamente, aspirando 10 ml con pipeta estéril. Transferir estos 10 ml a otro matraz con 90 ml de diluyente y mezclar, así se obtendrá la dilución 10-3.

6- Repetir los pasos hasta obtener las diluciones buscadas. Al final de las diluciones desechar siempre 10 ml, para homogenizar volúmenes.

Numeración de levaduras y mohos en placa

1. Pipetear por duplicado a las placas Petri estériles alícuotas de 1 ml a partir de la dilución 10-1,10-2 y10-3 si se sospecha alto porcentaje de contaminación.

2. Agregar rápidamente a las placas Petri 15 ml de agar YGC licuado y temperado.3. Mezclar inmediatamente las alícuotas con el agar mediante movimientos de vaivén y

rotación. Para este fin se pueden seguir los siguientes pasos: Mover la placa 5 veces de arriba hacia abajo en una dirección. Rotar la placa 5 veces en el sentido de las agujas del reloj. Mover la placa 5 veces en la dirección que haga ángulo recto a la

usada en el primer tiempo. Rotar la placa 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.

4. Como control d esterilidad, adicionar a una placa Petri agar sin inocular.5. una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas aeróbicamente a 25ºC

durante 5 días.6. Realizar el recuento estándar en placa.

Identificación de levaduras y mohos

1. Verter en placas Petri estériles 15 ml de agar PATATA-DEXTROSA licuado y temperado.2. con un asa de siembra aislar por separado todos los tipos morfológicos de colonias que

hallan crecido, de las placas que hallan presentado mayor desarrollo de colonias.3. Una vez solidificado el agar, sembrar por estrías las muestras de hongos previamente

aisladas.4. Invertir las placas e incubar aeróbicamente a 28ºC durante 7 días.5. los mohos y levaduras se identifican mediante un examen morfológico (microscópica y

microscópicamente), fisiológico y bioquímico(crecimiento en 18 substratos carbonados) , y los resultados se comparan con datos de especies conocidas.

DESCRIPCIÓN DE COLONIAS (EN AGAR PATATA DEXTROSA)

Alternaria: Desarrolla colonias de micelio gris al principio, después se tornan negras con periferias grisáceas. Microscópicamente se observan filamentos tabicados con conidióforos cortos; sus macroconidias son de color pardo oscuro con tabiques longitudinales y transversales que se disponen uno tras otro.

Aspergillus : Desarrolla colonias de color blanco al inicio, luego el color varia de acuerdo a la especie, pudiendo ser amarillo, amarillo naranja, verde azufrado, marrón claro o negro intenso. Microscópicamente presenta hifas tabicadas que originan conidióforos no tabicados que se ensanchan en su extremo distal, dando lugar a la cabeza aspergilar, que a su vez da origen a los esterigmas, de donde parten las conidias en cadena.

Chrysosporium: Desarrolla colonias de aspecto pulvurulento, de un tono crema a amarillo. Microscópicamente se observa una gran cantidad de clamidosporas con unos pequeños tubérculos en su superficie. Sus hifas son tabicadas.

Cephalosporium: Desarrolla colonias de micelio aéreo de color blanco rosado a blanco amarillento. Microscópicamente se observa la presencia de hifas septadas, conidióforos cortos que van a dar origen a conidias con o sin tabique transversal, hialinas, elipsoidales y aglutinadas en cabezuela en el extremo distal del conidióforo.

Fusarium: Desarrolla colonias de micelio aéreo algodonoso de color rosado, violeta o amarillo en la superficie. Microscópicamente presenta filamentos tabicados que dan origen a cortos conidióforos verticilados; macroconidias multiseptadas, alargadas, levemente encurvadas y fusiformes.

Helminthosporium: Desarrolla colonias de color gris al principio y después forma un micelio central deprimido, de color negro mate, con periferia elevado de color gris. Microscópicamente se observan hifas septadas, con macroconidias de septos longitudinales en racimo sobre conidióforos cortos y nudosos.

Penicillium: Desarrolla colonias azul-verdosas, pulvurulentas a causa de la abundante formación de conidias. Microscópicamente presenta hifas tabicadas con conidióforos ramificados en su extremo distal, dando la apariencia de un pincel, cada ramificación (esterigmas) da lugar a la formación de conidias dispuestas en cadenas.

Rhizopus : Desarrolla colonias de micelio aéreo denso, de aspecto algodonoso, de un color que varia entre blanquecino y el gris. Microscópicamente presenta hifas sin septos transversales; destacan hifas vegetativas cortas, agrupadas a manera de finas raicillas, a partir de los cuales se proyectan uno o varios filamentos largos (esporangióforos), que en su extremo distal presentan una estructura globosa, pigmentada de color oscuro (esporangio), que contiene en su interior gran cantidad de endoesporas.

Rhodotula : Desarrolla colonias de aspecto cremoso (característica de los hongos levaduriformes), de color rosado, debido a que forma pigmentos carotenoides. Microscópicamente se observan células ovoides o redondeadas, con o sin yema. A la coloración de Gram se comportan como Gram positivos.

RESULTADOS

Se obtuvo presencia de colonias solo en 1 de las 6 placas sembradas

CONCLUSIONES

Esto nos demuestra que nuestra muestra no se hallaba tan contaminada

DISCUSIONES

BIBLIOGRAFIA

depa.pquim.unam.mx/.../TecnicBasicas-Cuenta-mohos-levaduras_6530.pdf

http://www.digesa.minsa.gob.pe/norma_consulta/proy_microbiologia.htm

PROTOCOLO DE DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS

Muestra Comedor OBUMuestra del CET

Preparamos el agar Ogy y plaqueamos

101 10-2 10-3

Incubar a 25º C / 3 – 5 dias

10ml muestra 1ml1m

1ml

90ml Agua Peptonada

9ml Agua Peptonada

9ml Agua Peptonada

0.1ml a cada placa

0.1ml a cada placa

0.1ml a cada placa