tema 6 transfección genica germinal

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UNIVERSIDAD JUÁREZ DEL ESTADO DE DURANGO FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOMÉDICAS TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE TRANSFERENCIA GÉNICA GERMINAL Y APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS U J E D E PRESENTA: QFB. JUDIT PULIDO ALONSO MAYO DE 2010

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UNIVERSIDAD JUÁREZ DEL ESTADO DE DURANGO

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOMÉDICAS

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

TRANSFERENCIA GÉNICA GERMINAL Y APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS

U J E D

E

PRESENTA: QFB. JUDIT PULIDO ALONSO

MAYO DE 2010

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Es un animal genéticamente modificado al que le transfieren un gen o grupo de

genes que no le pertenecen (transgén) con el fin de obtener un producto de

interés.

Los embriones que integren este ADN en su genoma, antes de la primera

división, producirán un organismo que pasará el transgen a las siguientes

generaciones a través de la línea germinal (gametos).

Animal Transgénico

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Historia

Los ratones fueron los primeros animales transgénicos y se obtuvieron en la

década de los 1980. El primer ratón transgénico (1982) producía la hormona

de crecimiento de la rata (se veía más grande que un ratón normal). Este

experimento mostró que un gen de una especie podía introducirse en otra

diferente, integrarse al genoma del receptor y expresarse (la proteína se

fabrica y el organismo manifiesta la característica asociada).

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Microinyección de Ovocitos FecundadosUtilización

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Los ratones transgénicos se obtienen por:

Microinyección del DNA en el óvulo fecundado: el DNA se introduce por un medio capilar, bajo el microscopio, en el ovocito fecundado.

Esta técnica se realiza de la siguiente forma:

Primera fase, se aíslan un número grande de óvulos fertilizados, los que se consiguen sometiendo a las hembras a un tratamiento hormonal para provocar una mayor ovulación.

Segunda fase, los ovocitos recién fertilizados se manipulan uno a uno y con una micropipeta a modo de aguja, se introduce una solución que contiene DNA.

Tercera fase, estos óvulos son reimplantados en hembras que actuarán como nodrizas permitiendo el termino de la gestación.

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Microinyección del DNA en Células Embrionarias

El organismo adulto será una quimera ya que no todas las células incorporan el nuevo gen. Entonces se utilizaran solo los animales que tengan el gen en sus gametas y se lo transmitirán a su descendencia (técnica más fácil y eficiente que la anterior).

Esta estrategia implica la introducción de DNA extraño en células embrionarias totipotentes (células ES).

Estas células se extraen del interior de la blástula en desarrollo y se incuban en un medio donde las células no se diferencian, manteniendo su estado embrionario.

El DNA extraño se introduce en las células ES mediante diversas técnicas de transfección, posteriormente las células transfectadas son reintroducidas en una blástula y ésta reimplantada en una hembra.

Con esta técnica los neonatos son quimeras. Cuando la integración del transgén ocurre después de la primera división celular, el animal es quimérico, es decir sus

células tienen diferentes características, según tengan o no el transgén.

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Utilización

Como herramienta de laboratorio para estudiar los genes, su función y como se regula su expresión si se cambia el lugar o el tiempo de expresión de ese gen.

o Como modelos de enfermedades para el desarrollo de tratamiento.

Ingeniería genética de caracteres de interés Rápida generación de líneas puras con idéntica progenie (clones) Sistemas animales como bioreactor es para la producción de compuestos biológicos

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Otros Animales Transgénicos

Obtención de animales transgénicos Se realiza una fertilización in vitro. Se inyecta el gen transgénico en el cigoto. Se implanta el embrión en una madre sustituta. Se produce un transgén. De esta manera se han producido conejos, cabras, ovejas.

En una Cabra En una Vaca Se le incorporó un gen para la hormona del

crecimiento humano.

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Oveja

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Método 1: La Transformación de Células ES Vs

Método 2: La Inyección de Genes en el Óvulo Fertilizado

La transformación de células ES funciona bien sólo en ratones. Otros animales transgénicos son producidos por la inyección de huevos la transformación de células ES ofrece un mayor control del paso de integración (Selección de establemente transfectadas células ES)

 La inyección del gen en el óvulo fertilizado es menos confiable (Viabilidad de los huevos, la frecuencia de la integración), pero ayuda a evitar los animales quiméricos

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Aplicaciones:

Manipular la expresión génica in vivo.

Estudiar la función de genes específicos.

Estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación.

Ratones Transgénicos

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Generación de Ratones Trangénicos

Dos aproximaciones experimentales se han utilizado para la generación de ratones

transgénicos: 1. Microinyección de DNA en ovocitos recién fertilizados para producir ratones

transgénicos conteniendo una o más copias de un vector de expresión insertado al azar en el genoma.

2. Recombinación homóloga en loci definidos para crear knockouts (KO) o reemplazar genes.

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Generación de Ratones TransgénicosInyección de DNA

El DNA purificado es inyectado directamente en el pronúcleo masculino de un cigoto, utilizando un micromanipulador acoplado a una pipeta con presión negativa y otro micromanipulador acoplado a una aguja de inyección.

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El pronúcleo masculino es inyectado con picolitros de DNA purificado(1ug/ml), mientras el cigoto es inmovilizado por la presión negativa dela pipeta. El éxito de la inyección depende del tiempo de la fertilizacióny de la precisión en el proceso.

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Luego de la microinyección, 20-30 cigotos son implantados en el oviducto de una hembra pseudopreñada (recientemente apareada con un macho vasectomizado). Esto resulta, 19 días más tarde, en la generación de 5-8 crías,. Los animales transgénicos son identificados mediante análisis de PCR a partir de DNA extraído de las colas a las tres semanas de vida. Los transgénicos son, posteriormente, verificados mediante Southern blots.

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Los ratones positivos para el ensayo de PCR son cruzados con animales controles para

identificar los fundadores, es decir, aquellos que contienen el DNA integrado en su línea

germinal, lo que da lugar a un patrón Mendeliano de herencia del transgen.

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Regiones enhancer que controlan la expresión tejido-específica de un gen pueden ser utilizadas para dirigir la expresión de un gen foráneo en tejidos de interés. Este esquema ilustra como el promotor de un gen expresado en la próstata puede ser utilizado para generar ratones transgénicos que son modelos del cáncer de próstata.

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Aplicación de Animales Transgénicos

Los ratones transgénicos se generan a menudo para:

1. Caracterizar la capacidad de un promotor de expresión directa de genes tejido

específica por ejemplo un promotor se puede conectar a un gen reportero LacZ o GFP.

2. Examinar los efectos de la sobreexpresión de genes endógenos en momentos y lugares

específicos en los animales.

3. Estudio de la función génica. Muchas enfermedades humanas se puede modelar

mediante la introducción de la misma mutación en el ratón, el animal intacto proporciona

una más completa y relevante función fisiológica de un transgén a dierencia de pruebas

in vitro.

4. Pruebas de drogas.

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Aplicaciones Biotecnológicas de la Transgénesis

Mejoramiento de caracteres productivos

Resistencia a enfermedades.

Modelos animales de enfermedades humanas (por ejemplo, ratones

knockout).

Animales transgénicos como biorreactores para la síntesis de

proteínas de alto valor (proteínas terapéuticas): Las "granjas

farmacéuticas" o "granjas moleculares“.

Donación de órganos: Xenotransplantes.

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Recientemente, la metodología de transferencia nuclear ha revolucionado este

campo, a través de la clonación de animales. Esta técnica se basa en la

habilidad de inyectar o fusionar óvulos carentes de núcleos con núcleos

diploides derivados de células somáticas en cultivo. Estas células pueden ser

transfectadas de manera estable y proporcionar una manera de obtener

cientos de animales idénticos en una generación.

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TRANSFERENCIA NUCLEAR

Esquema de la clonación de la oveja Dolly, utilizando el material genético derivado de células aisladas de la glándula mamaria de una oveja adulta.

(tasa de éxito:1 de 227)

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Transfección estable de células diploides con un vector que contiene el cDNA del Factor IX y un promotor que dirige su expresión específicamente en las glándulas mamarias (pMIX1).

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