Tema 6 Senbhnhnhnnsores y Biosensores SCR Anexo

Curso 2015-2016

GRADO EN QUÍMICA METODOLOGÍAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANALÍTICA

Curso 4º

Curso 201-2015

Anexo Tema 6: Ejemplos biosensores electroquímicos

GRADO EN QUÍMICA METODOLOGÍAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANALÍTICA

Curso 4º

Susana Campuzano Ruiz

[email protected]

UCM

Metodologías Avanzadas en Química Analítica

Metodologías

Sensores

integrados

Partículas

magnéticas (MBs)

UCM


Biosensores enzimáticos

Glucosa Fructosa Hipoxantina/Teofilina Lactosa Lactulosa Polifenoles Ác. D-y L-láctico Ác. Málico Glicerol Etanol H2O2

ANALITOS SUSTRATOS ELECTRÓDICOS

MUESTRAS

AuE GCE Au-acero inoxidable

Refrescos Bebidas alcohólicas Leche Miel, etc.

SAMs de alcanotioles

Membrana de diálisis

i, A

t, s

UCM


Determinación de antibióticos -lactámicos

Nueva plataforma para inmovilización de bioreceptores con His-tag

UCM


Método de cribado rápido para sulfonamidas, tetraciclinas y cefalosporinas

UCM


Magnetoinmunosensores para S. aureus

Muestras de leche inoculadas

Nivel de contaminación, cfu mL-1

[S. aureus] encontrada, cfu mL-1 Recuperación , %

10 (11.2 0.9)

(n = 6)

(112 10) (n = 6)

100 (106 8)

(n = 6)

(106 8) (n = 6)

Au/SPE

Imán

LEGISLACIÓN

103 cfu mL-1

S. aureus ProtA-HRP

Anti-ProtA

ProtA-MBs

UCM


Inmunosensores impedimétricos para E. coli

Biosensores impedimétricos:

Determinación de E. coli en muestras de agua inoculadas

MUESTRA [E. coli], cfu mL-1

Agua de grifo (11 2) (n = 6)

Agua del río Eresma (12 2) (n = 6)

Sulfo-LC-SPDP

+ anticuerpos

tiolados

Lectinas

(ConA)

Con A

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/af/3CNA_Concanavalin_A.png

UCM


Magnetogenosensores para E. coli PCR asimétrica directa (DaPCR)

Sensibilidad: capacidad de detectar 1 cfu de E. coli en 100 mL

(Regulación Europea Nº 1441/2007: Agua potable → libre de E. coli en 100 mL)

DISPOSITIVO DE ALARMA PARA CONTROL DE CALIDAD DE LAS AGUAS

No es posible cuantificar!!!

Cultivo

bacteriano

DNA

genómico

Amplicón de cadena

sencilla biotinilado

cfu: unidades formadoras de colonias

1 2 3 4 5 6 7 8

326 bp

1353 bp1078 bp

872 bp603 bp

1 2 3 4 5 6 7 8

326 bp

1353 bp1353 bp1078 bp

872 bp872 bp603 bp603 bp

1/100 1.0104 cfu mL-1

_

0 50 100 150 200

-1.5

-1.0

-0.5

0.0 H2O

2

-i, µ

A

t, s

Amplicons DaPCR:

sterilized H2O

1/100 cfu mL-1

100 cfu mL-1

1.0x104 cfu mL

-1

Magnetogenosensores

UCM


Genosensores integrados para uropatógenos

Identificación y cuantificación Resistencia a antibióticos

http://www.genefluidics.com/

UCM


Identificación de aislados clínicos

EC: Escherichia coli

KP: Klebsiella pneumoniae

PA: Pseudomonas aeruginosa

EA: Enterobacter aerogenes

PM: Proteus mirabilis

SM: Serratia marcescens

EH: Enterobacter hormaechei

AB: Acinetobacter baumannii

El sensor es capaz de detectar los aislados clínicos de E. coli (EC) con 100% de sensibilidad y

selectividad en sólo 45 min.

-i, n

A

Genosensores integrados para uropatógenos

UCM


Comparación entre cepas de E. coli susceptibles (EC103) y resistentes (EC135, EC139, and EC197) a

ciprofloxacino (CIPRO).

Determinación electroquímica de pre-rRNAs Detección rápida de la

resistencia bacteriana a antibióticos

Genosensores integrados

UCM


Magnetogenosensores para S. pneumoniae

S. pneumoniae

UCM


7.55

1.15 blancoicaamperométrSeñal

muestraicaamperométrSeñallaciónRe

Sensibilidad: 91%

Especificidad: 90%

Identificación microbiana

Sp N-Sp Total

Magnetogenosensor Sp 72 3 75

N-Sp 7 25 32

Total 79 28 107

AUC = 0.94

Especificidad

Sen

sib

ilid

ad

1.92

Validación clínica: muestras en placa

Re

laci

ón

se

ñal

/bla

nco

Sp: S. pneumoniae; N-Sp: S. pneumoniae

Magnetogenosensores para S. pneumoniae

UCM


0.0 0.1 0.2 0.3 0.40.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

i, A

[Etanol]sangre

, g L-1

Bioparche electroquímico para etanol en sudor

Estimulación de sudor

Ingesta de alcohol

Medida puntual: 5 min

Medida continua: 6-8 h

I.L. = (0.0005-0.6) g/L

[etanol]sangre 71 % [etanol]sudor

UCM


Magnetoinmunosensores duales para biomarcadores cardiovasculares

Diagnóstico más fiable y objetivo

0 50 100 150 200 -600

-400

-200

0

NT-proBNP

CRP

i, nA

t, s

Parameter CRP NT-proBNP

LOD, ng mL-1 0.47 0.47

Punto de corte 1000 1.0

[Marcador cardiaco]añadido [Marcador cardiaco]encontrada

CRP, 1 µg mL-1 (1.02 ± 0.04) µg mL-1

NT-proBNP, 1 ng mL-1 (1.0 ± 0.1) ng mL-1

(n = 6, = 0.05)

Suero de referencia para CRP contaminado con NT-proBNP

+

Tiempo de ensayo: 60 min

NT-proBNP

CRP

UCM


Chip de microfluídica para determinación de cTnT

Sistema de microfluidica

Parámetro Valor experimental

IL, ng mL-1 0.05 – 1.0

LOD, ng mL-1 0.03

Curva de calibrado y características analíticas

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

[cTnT], ng mL-1

ic, nA

0 50 100 150 200-20.0

-10.0

0.0

10.0

20.0

0

1 ng mL-1

t, s

i, nA

RE: electrodo de referencia

AE: electrodo auxiliar

ImE: electrodo de inmovilización

WE: electrodo de trabajo

1) Modificación de MBs

2) Captura de las MBs modificadas

3) Cronoamperometría (–0.10 V)

Muestras de suero contaminadas

RE

AE WE

ImE

UCM


Magnetoinmunosensor para fibrinógeno basado en nanobodies

Valor de corte [Fib ]plasma : 4.66 mg mL-1

Parámetro Competitivo

directo Competitivo

indirecto

LOD, µg mL-1 0.49 0.044

Estándar internacional ([Fib] = 2.7 mg mL-1)

Competitivo directo [Fib]

Competitivo indirecto [Fib]

(2.8 0.1) mg mL-1

RSDn=9 = 6.9 %

(2.6 0.2) mg mL-1

RSDn=9 = 9.1 %

Tratamiento de muestra mínimo, tiempo ensayo: 90 min

Cáncer de vejiga

His6 tag en C-terminal

Fusionado a MBP en N-terminal

Ab humano Ab camello

Nanobodi

UCM


Magnetoinmunosensor para ErbB2

ErbB2-negativas: MDA-MB-436

ErbB2-bajas: MCF-7

ErbB2-altas: SK-BR-3

Lisado celular

Magnetoinmunosensor* ELISA**

MCF-7 67 14 69 15

MDA-MB-436 64 6 65 12

SK-BR-3 205 23 198 12

*2.5 g de lisado celular; **0.25 g de lisado celular

[ErbB2], pg/g lisado

Células Nº receptores/célula 10-3

MCF-7 22 2

MDA-MB-436 4.7 0.5

SK-BR-3 530 60 *17.500 Células

Determinación en lisados celulares

Determinación en células intactas

Hiperexpresada en el 2025% cánceres de mama invasivos

0 MCF-7 MDA-MB-436 SK-BR-30.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

-i,

A

MCF-7 SK-BR-3

20

UCM


Genosensor integrado para gen TP53

i, nA

t, s

a)

b)

rGO-CMC

a) No target

a) No target

Biotin

Strep-HRP

Sondas de captura tipo horquilla: - Dual modification (5´-Biotin, 3´-NH2)

- spp53 (20 nts)

- lcpp53 (33 nts)

TP53: region of the wtTP53 gene

1-m: missense mutation in codon 175 (G → A)

UCM


Genosensor integrado para gen TP53

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

-i,

A

0 TP53 1-m MCF-10A MCF-7 SK-BR-3

MCF-10A: wtTP53

Células epiteliales no tumorales

Células cancerígenas

MCF-7: wtTP53 SK-BR-3: 1-m TP53

RNAt

RT

DNA Pol

Buffer + dNTPs

Primers específicos

cDNA

RT

La respuesta equivalente a la del SNP ocurre

sólo para las células SK-BR-3

Identificar el estado del gen TP53 en células

5.0 ng L-1 cDNA

UCM


Magnetosensores para miRNAs

i /

A

t / s

Chitin-MBs

Magnet

Medida amperométrica

Strep-HRP

p19

antimiR

Biotin

target miR

Strep-MBs

antiMBP-HRP

p19: bioreceptor de captura

p19: bioreceptor de detección

UCM



Imán

SPCE

Suspensión de MBs

Conector

Célula electroquímica

①

②

③

④

UCM



0 1.0 nM miR-21

RNAt

MCF-7 RNAt

MDA-MB-231 RNAt

MCF-10A RNAt Hela

Determinación de RNAt (0.5 g) de líneas celulares

Células [miR-21] amol/ng RNAt

MCF-7 18 (1.1107 copias)

MDA-MB-231 10 (6.0106 copias)

Detección fiable del miR diana en 100 ng de RNAt

(3.0104 células MCF-7)

UCM



T: Tejidos cancerígenos de mama

NT: Tejidos normales adyacentes de mama

C: Citología mamaria * : Quimioterapia antes de cirugía

Determinación en RNAt (1.0 g) de tejidos y citologías

*

UCM



Identificación inequívoca de subtipos de cáncer de mama (TNBC)

Detección simultánea de miR-21 y miR-205

p19

ca

tho

dic

cu

rren

t

[antibiotic]

miR-205

miR-21

SPdCE

Tiempo, s

i, n

A

WE1

WE2

antimiR-21

miR-21 Biotin

Strep-HRP

Chitin-MBs

antimiR-205

miR-205

UCM



Detección simultánea en 15 min !!

Líneas celulares

Tejidos frescos

Células de cáncer de mama

metastásicas:

-MCF-7: ER+/PR+

-SK-BR-3: ER-/PR-

-MDA-MB-231: células TNBC

Células epiteliales no tumorales:

-MCF-10A

Muestra Tipo miR-21 miR-205

Células/ Tejidos

Tumoral ↑ ↓

Normal ↓ ↑

ER+/PR+ ↑ ↑

ER-/PR- ↑ ↓

NT T1 T2 T3 T4 T50

400

800

1200

1600

2000

-i,

nA

miR-21

miR-205

MCF-10A MDA-MB-231 MCF-7 SK-BR-30

100

200

300

400

500

-i, nA

miR-21

miR-205

UCM


0

300

600

900

1200

-i,

nA

miR-21

miR-205

miR-205

miR-21

NT T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8

ErbB2+ ErbB2-


Tejidos humanos de mama parafinados (PTFE)

miR-21 y miR-205 in todas las muestras T comparadas con las NT

Diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de expresión de miR-21 en tejidos T ErbB2+ y ErbB2-

UCM


Magnetosensores para determinación simultánea de proteína IL-8 y su mRNA asociado

Los cánceres de cabeza y cuello representa el sexto tipo de cáncer más común en el

mundo y son responsables de 560,000 nuevos casos y 300,000 muertes/año.

IL-8: Citocina proinflamatoria que promueve la angiogénesis, la tumorigenicidad y

metástasis de numerosos tumores.

Se ha demostrado que en el cáncer oral existe concordancia entre los niveles salivares

de la proteína IL-8 y su mRNA asociado.

Saliva como fluido diagnóstico

600 pg mL -1 de proteína IL-8:

valor de corte para discriminar

pacientes con cáncer oral de

individuos sanos

Método de colección no invasivo

Fácilmente manipulable

Barato

Conservación y transporte sencillo

Correlación con niveles en sangre

UCM



UCM



0

3000

6000

9000

12000

15000

NC

-i, nA

Blank PM 1-m

Selectividad adecuada para

el análisis de ambos

biomarcadores

0

1000

2000

3000

4000

10 µg mL-1

LPO

44 µg mL-1

lysozyme

2,500 pg mL-1

IL-6

-i,

nA

0 pg mL-1 IL-8 protein

2,500 pg mL-1 IL-8 protein

Buffer

S/N

0.0

3.0

6.0

9.0

SELECTIVIDAD

REACTIVIDAD CRUZADA

Factible la determinación simultánea

de ambos biomarcadores!!

Mezcla [IL-8], pg mL -1 [IL-8 mRNA], nM

1 0 0

2 600 0

3 0 2.5

4 600 2.5

5 2,500 0

6 2,500 2.5

Mezclas: Proteína IL-8 + mRNA IL-8

Buffer 2,500 pg mL-1 IL-6

44 g mL-1 lisozima

10 g mL-1 LPO Blanco Target 1-m NC

0 pg mL-1 proteína IL-8 2,500 pg mL-1 proteína IL-8

UCM



IL-8 proteína mRNA IL-8

LR 241.3 – 5,000 pg mL -1 0.69 – 7.5 nM

r 0.9992 0.9955

Pendiente (1.47 ± 0.02) nA mL pg -1 (361 ± 12) nA nM -1

LOD 72.4 pg mL -1 0.21 nM

LQ 241.3 pg mL -1 0.69 nM

RSDn=5, % 8.3 (600 pg mL-1) 8.4 (2.5 nM)

0 1000 2000 3000 4000 50000

2000

4000

6000

8000

10000

-i,

nA

[IL-8 protein], pg mL-1

0 1 2 3 4 5 6 7 80

1000

2000

3000

-i,

nA

[IL-8 mRNA], nM

CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS EN MUESTRAS DE SALIVA SIN DILUIR CONTAMINADAS

[Proteína IL-8], pg mL-1 [mRNA IL-8], nM

UCM



ANÁLISIS DE MUESTRAS DE SALIVA SIN DILUIR

Parámetro Proteína IL-8 mRNA IL-8

[Media] 600 pg mL -1 2.5 nM

[Biomarcador] (615 ± 28) pg mL -1 (2.3 ± 0.2) nM

Recuperación, % 102 ± 5 94 ± 7

RSDn=7, % 5.0 7.7

Magnetobiosensor ELISA

Voluntario [IL-8], pg mL-1 RSDn=3, % [IL-8], pg mL-1 RSDn=3, %

1 (320 ± 36) 4.5 (306 ± 33) 5.0

2 (328 ± 26) 3.2 (339 ± 55) 6.6

3 (352 ± 45) 5.2 (336 ± 44) 5.2

4 (314 ± 34) 4.3 (330 ± 65) 7.9

5 (363 ± 10) 1.1 (370 ± 33) 3.6

6 (323 ± 28) 3.5 (319 ± 63) 8.0

7 (264 ± 43) 6.6 (245 ± 46) 7.6

-MUESTRAS DE SALIVA DE INDIVIDUOS SANOS-

Resultados por debajo del valor de

corte (600 pg mL -1) y concordantes

con los que se obtienen empleando

la metodología ELISA convencional

No hay diferencias significativas entre

diferentes muestras de saliva Calibrado

universal para todas las muestras de

saliva analizadas

-MUESTRAS DE SALIVA CONTAMINADAS-

Tema 6 Senbhnhnhnnsores y Biosensores SCR Anexo

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