Tema 4 Estudios en patología general

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Christel Benoit Vivas

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Presentación de clase de Técnicas de diagnóstico en Patología

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Christel Benoit Vivas

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HistoquímicaInmunohistiquímica

Inmunohistoquímica enzimática.Inmunohistoquímica enzimática.

PCRHibridación in situ

Citometría de flujo.Citometría de flujo.

Electroforesis.Electroforesis.

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HISTOQUÍMICA

Técnica de preparación de los tejidos para poder ser observados al microscopio, el la cual tiñen con sustancias químicas solubles en agua o aceites cada uno de los compuestos celulares.

Es la técnica más utilizada para el diagnóstico de las enfermedades de los tejidos extraídos del cuerpo.

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HISTOQUÍMICA

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HISTOQUÍMICA

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HISTOQUÍMICA

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HISTOQUÍMICA

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HISTOQUÍMICA

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HISTOQUÍMICA

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HISTOQUÍMICA

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H&E

Azul de toluidina

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Negro Sudán

Fontana Masson

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Hematoxilina férrica

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Van Geison

Cajal

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PAS

Mucicarmín

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Papanicolau

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Zeihl Neelsen

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Grocot

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Rojo Congo conluz polarizada

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PCR

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La La Reacción en cadena de la polimerasa, conocida como conocida como PCRPCR por por sus siglas en inglés, es una técnica de sus siglas en inglés, es una técnica de biología molecular (descrita en 1985, biología molecular (descrita en 1985, por Kary Mullis), cuyo objetivo es por Kary Mullis), cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo, en teoría, de partiendo de un mínimo, en teoría, de una única copia de ese fragmento.una única copia de ese fragmento.

PCR

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Esta técnica sirve para amplificar Esta técnica sirve para amplificar ADN. Tras la amplificación, resulta ADN. Tras la amplificación, resulta mucho más sencillo identificar con una mucho más sencillo identificar con una muy alta probabilidad virus y/o muy alta probabilidad virus y/o bacterias causante de una bacterias causante de una enfermedad, identificar personas enfermedad, identificar personas (cadáveres, criminales...) o hacer (cadáveres, criminales...) o hacer investigación científica sobre el ADN investigación científica sobre el ADN amplificado. amplificado.

PCR

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Estos usos derivados de la Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. necesario para llevarla a cabo.

PCR

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Su principio se basa Su principio se basa en el uso de en el uso de oligonucleótidos sintéticos oligonucleótidos sintéticos que son complementarios que son complementarios a secuencias que a secuencias que flanquean una región flanquean una región específica de ADN molde.específica de ADN molde.

PCR

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Por medio de ciclos de Por medio de ciclos de amplificación repetidos, que amplificación repetidos, que comprenden cambios de comprenden cambios de temperatura que permiten el temperatura que permiten el alineamiento de los alineamiento de los oligonucleótidos.oligonucleótidos.

En sí, es un proceso químico En sí, es un proceso químico más que un proceso biológico, que más que un proceso biológico, que permite diagnosticar las permite diagnosticar las enfermedades a nivelenfermedades a nivel

PCR

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El proceso del PCR consta de un número de ciclos para amplificar al secuencia espcífica de ADN; cada ciclo tiene tres pasos sucesivos:

1. Desnaturalización 2. Renaturalización3. Síntesis

PCR

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Los componentes más importantes para el PCR son la ADN polimerasa, los primers (oligonucleótido corto que hibridiza con un blanco), dNTP (trifosfato desoxinucleótido), el amortiguador y el ADN blanco.

PCR

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Las condiciones de los ciclos térmicos son los siguientes:

Desnaturalización95°Cx1minReconocimiento 55°Cx1minExtensión 72°Cx2minNúmero de ciclos 40

PCR

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Sus aplicaciones dentro de la odontología han sido ampliamente desarrolladas, ya que debe conocerse la secuencia de base por amplificar o parte de esta.

Permite implementar un tratamiento adecuado debido a la facultad de los diversos virus para permanecer latentes dentro del organismo.

PCR

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El PCR ha sido utilizado para confirmar la presencia de agentes infecciosos en los tejidos humanos tales como el virus del papiloma humano (VPH), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de hepatitis B, citomegalovirus, virus del Epstein Barr y el virus del herpes simple.

PCR

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Para que la técnica funcione se Para que la técnica funcione se necesita, abundante suministro de de necesita, abundante suministro de de bases de bases de nucleótidos y dos y dos cebadorescebadores, que son secuencias , que son secuencias cortas de unos veinte nucleótidos y cortas de unos veinte nucleótidos y que se usan para iniciar la reacción que se usan para iniciar la reacción (PCR).(PCR).

PCRPCR

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En primer lugar, se calienta la mezcla para separar las hebras de ADN (el ADN se abre) y a continuación se enfría la solución, lo que permite que los cebadores se peguen a las partes adecuadas de la hebra de ADN (chocan unas a otras hasta que encuentran el complemento exacto, y entonces se ensamblan, actuando como límites de la región de la molécula que va a ser duplicada).

PCR

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Para terminar, se aumenta la temperatura hasta el valor en que puede actuar la polimerasa, y sobre la plantilla crece una hebra nueva complementaria

PCR

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PCR

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Huella genética

Test de Paternidad

Diagnóstico de enfermedades hereditarias

Clonación de genes

Mutagénesis

Análisis de ADN fósil

Genotipo de mutaciones específicas

PCR

USOS

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PCR

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La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores.

CMF

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Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula.

CMF

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Los parámetros son:

Relacionados con características intrínsecas de la célula, como su tamaño y la complejidad de su núcleo y citoplasma.

Relacionados con características antigénicas de cada célula (inmunofenotipo).     Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una célula por medio de sus características antigénicas y/o por sus características morfológicas de tamaño y complejidad.

CMF

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Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una célula por medio de sus características antigénicas y/o por sus características morfológicas de tamaño y complejidad.

CMF

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CMF

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   Las señales producidas por la interacción de las células con el haz de luz son de dos tipos:- Señales de dispersión. - Señales de fluorescencia.

LECTURACMF

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a) Señales de dispersión: Resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamental-mente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado com-plejidad.

LECTURACMF

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En los Citómetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersión: -La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión. -La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula. sus características morfológicas de tamaño y complejidad.

LECTURACMF

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CMF

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b) Señales de Fluorescencia: Un fluorocromo es una molécula química que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una longitud superior (menor energía). El espectro de absorción o excitación es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es el rango sobre el que un fluorocromo emite luz.

LECTURACMF

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Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía se utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes shiff.

LECTURACMF

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Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía se utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes shiff.

LECTURACMF

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CMF

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La CMF es una técnica sencilla que se aplica en la rutina diaria de muchos laboratorios clínicos y de investigación, capaz de proporcionar resultados de forma rápida que pueden ser aplicables al diagnostico.

CaracterísticasCMF

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Gracias a su gran especificidad es capaz de distinguir entre varias poblaciones celulares diferentes, y detectar una población celular en una muestra en la que predominan otras poblaciones celulares mayoritarias. Pero la principal característica de la CMF es que puede ofrecer información simultánea de varios parámetros de cada una de las células analizadas y la relación entre los parámetros de una célula y los de otra célula también analizada.

CaracterísticasCMF

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Permite el análisis de dos parámetros de dispersión, SSC/FSC y tres de fluorescencia (en equipos con un solo láser), Fl1, Fl2 y Fl3, y de una cuarta fluorescencia en equipos con dos lásser.

CaracterísticasCMF

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Debido a la necesidad de utilizar una suspensión de partículas (células, núcleos, cromosomas, etc), para ser leídos de una en una hace que se pierda información sobre la arquitectura de los tejidos que componen las células o de las propias células, así como la interacción entre estas y el medio que las rodea (patrones nodulares o difusos de los linfomas).

Ventajas e inconvenientesCMF

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La CMF presenta múltiples ventajas frente al microscópio de fluorescencia y las técnicas citoquímicas, como:

- Posibilidad de empleo de multiples marcajes frente a un solo marcaje de la citoquímica y la microscopia de fluorescencia.

- Posibilidad de analizar un elevado número de partículas en un corto período de tiempo (5000 partículas/segundo).

Ventajas e inconvenientesCMF

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-Posibilidad de cuantificar la intensidad antigénica por medio de los canales medios de fluorescencia.- - Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mínima residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales como los basófilos. -

Ventajas e inconvenientesCMF

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- Posibilidad de analizar poblaciones celulares y epitopos celulares. - Permite almacenar informáticamente la información del análisis para poderla utilizar en cualquier momento y reanalizar análisis hechos con anterioridad. - Posibilidad de cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un grupo celular

Ventajas e inconvenientesCMF

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IHQ

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Técnica utilizada para el diagnóstico de diferentes enfermedades además de permitirnos identificar el origen celular de una manera más precisa de los diferentes tipos de neoplasias, determinando los fenómenos de benignidad o malignidad en las neoplasias y que permite identificar diferentes antígenos específicos de cada uno de los grupos celulares característicos.

Inmunohistoquímica

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Las técnicas de inmunohistoquímica (IHQ), se basan en la reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), y consisten en incubar el Ag que queremos detectar, (en este caso la PrPCJD ), frente a un Ac (anti-PrPCJD); y mediante un sistema de amplificación junto con el empleo de un sistema revelador; esta unión pueda ser visualizada al microscopio óptico

IHQ

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Corresponde a un grupo de técnicas de inmunotinción que permiten demostrar una variedad de antígenos presentes en las células o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas técnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse específicamente a los correspondientes antígenos. Esta reacción es visible sólo si el anticuerpo está marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloración.

IHQ

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Inmunohistoquímica convencional

Inmunofluorecencia

Inmunoperoxidasa

IHQ

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IHQ

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En las técnicas de inmunofluorescencia se utilizan como marcadores compuestos de fluoresceína que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de onda visible, que depende de la naturaleza del compuesto. El isotiocianato de fluoresceína emite luz verde amarillenta intensa. Estas técnicas necesitan muestras en fresco y congeladas, sin fijación convencional, pues los antígenos están presentes en superficies celulares o son muy lábiles a la fijación en formalina. .

IHQ

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La inmunofluorescencia directa, es decir con anticuerpos conjugados con fluoresceína, se aplica corrientemente en el diagnóstico de las enfermedades cutáneas en donde tiene indicación y utilidad muy precisas como en enfermedades ampollares, vasculitis y mesenquimopatías . Esta técnica pese a ser muy sensible, presenta inconvenientes como la falta de permanencia de la fluorescencia, requiere de microscopía especializada y el detalle morfológico es pobre. Para documentar cada caso, es necesario fotografiar la reacción.

IHQ

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IHQIHQ

Anticuerpo Anticuerpo AntígenoAntígeno FuenteFuente

ME7 ME7 Scrapie fibrillas Scrapie fibrillas Dr. J. Hope (Edinburgo)Dr. J. Hope (Edinburgo)

IB4IB4 ""   

IB3IB3 ""   

IA8IA8 ""   

RO73RO73 Hamster prionHamster prion Dr. S. Prusiner(California)Dr. S. Prusiner(California)

611611 ""   

1755 1755 Péptido sintéticoPéptido sintético Dr. H. Diringer(Berlin)Dr. H. Diringer(Berlin)

SP30 SP30 Péptido sintéticoPéptido sintético Prof.B. Anderton(London)Prof.B. Anderton(London)

SP40 SP40 ""   

3F4 3F4 Péptido sintéticoPéptido sintético Dr. Kascsak(New York)Dr. Kascsak(New York)

PrP Nott PrP Nott Péptido sintéticoPéptido sintético Prof. R.J. MayerProf. R.J. Mayer

KG9 KG9 PrP bovina recombinantePrP bovina recombinante Dr. C. Birket(crompton)Dr. C. Birket(crompton)

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EJEMPLOS DE MARCADORES INMUNOHISTOQUIMICOS

Anticuerpo celular Antígenos detectados

CD1a célula de Langerhans CD4 linfocito T de auxilio CD8 linfocito T citotóxico CD30 célula de Reed-Sternberg CD45 leucocitos CD68 macrófagosS100 células de Schwann HMB-45 melanocitos AE1 citoqueratinas de bajo peso molecular AE3 citoqueratinas de alto peso molecular DESMINA células musculares GFAP glía CEA antígeno carcino-embrionario AFP alfa-fetoproteína REN receptores nucleares de estrógenos VIM sarcomas

IHQ

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IHQ

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IHQIHQ

Tipos de pretratamientoTipos de pretratamiento

• 80-11% ácido fórmico durante 5-60 min. 80-11% ácido fórmico durante 5-60 min. • 4M thiocyanato de guanidina (TG) 2h 4M thiocyanato de guanidina (TG) 2h • Proteinasa K 10 ug/ml, 15 min., 37ºC Proteinasa K 10 ug/ml, 15 min., 37ºC • Pepsina 10%, 30 min., 37ºC Pepsina 10%, 30 min., 37ºC • Autoclave hidrolítica, 2. 5mM HCl, 10 min., 121ºC Autoclave hidrolítica, 2. 5mM HCl, 10 min., 121ºC • Autoclave hidratada, agua destilada, 10 min. 120ºC Autoclave hidratada, agua destilada, 10 min. 120ºC • 30% ácido fórmico, 1 mim microondas 30% ácido fórmico, 1 mim microondas • 96% ácido fórmico, 60 min., 4M (TG), 2h 96% ácido fórmico, 60 min., 4M (TG), 2h • Combinaciones entre ellosCombinaciones entre ellos

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En las técnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas más frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio (color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamene al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o proteína A.

IHQ

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Las técnicas inmunohistoquímicas enzimáticas permite una localización más precisa de las reacciones, ya que la tinción es permanente, estable, puede contrastarse y puede ser evaluada con microscopio de luz. El material así estudiado puede archivarse por años sin pérdida de la intensidad de la reacción. Los anticuerpos monoclonales ha permitido aumentar la especificidad, sensibilidad y gama de esta técnica.

IHQ

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Desventajas: presencia de reacción inespecífica, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales, algunos reactivos son potencialmente carcinógenos y su manipulación debe ser cuidadosa, requieren estandarización precisa y estricto control de calidad. Existen diversos tipos de técnicas, cuya indicación dependerá del anticuerpo a utilizar (monoclonal o policlonal), material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y antígenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmáticos o nucleares).

IHQ

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Estas técnicas necesitan de controles internos

o paralelos, usualmente positivos y negativos. El control negativo se obtiene realizando la misma técnica, pero con omisión del paso de incubación con anticuerpo primario. Existen sistemas automatizados que permiten la tinción de un gran número de casos simultáneamente con la ventaja de pasos definidos y estandarización de las variable usuales con costo relativamente bajo y en mucho menor tiempo.

IHQ

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La inmunohistoquímica tiene utilidad

diagnóstica en identificación de diferenciación y de marcadores pronósticos de neoplasias (marcadores tumorales). Por ejemplo, es posible la identificación de los productos de oncogenes y de genes supresores de tumores con anticuerpos monoclonales, especialmente contra c-erbB-2, bcl-2, p21, Rb1 y p53; la identificación de marcadores de diferenciación como HMB-45 para melanocitos (melanoma), AE1 para carcinomas, vimentina para sarcomas y CD45 para leuocitos (linfomas).

IHQ

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Un elemento importante a considerar es

la óptima preservación del tejido y por ende de los antígenos. La mayoría de los antígenos se conservan adecuadamente después de la fijación en formalina e inclusión en parafina. Algunos son más lábiles y sólo se detectan en cortes de congelación.

IHQ

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Uno de los problemas actuales con estas técnicas no es la técnica en sí, manual o automatizada, o la posibilidad de acceder a los numerosos anticuerpos existentes, sino la interpretación de los resultados. Los errores de interpretación disminuyen a nivel aceptable cuando el patólogo y sus colaboradores tiene experiencia en estas técnicas y los resultados se analizan a la luz de los demás hallazgos clínico-patológicos. 

IHQ

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Los cultivos celulares constituyen, desde 1950, el sistema más empleado para el aislamiento y propagación de la mayoría de los virus, hongos y bacterias. Los cultivos de células in vitro consisten en un sistema formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad controladas.

CULTIVOS

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La definición operacional de los cultivos celulares en tres tipos - cultivo primario, cepa celular y línea celular - depende del origen y tiempo de sobrevida de las células in vitro. Los cultivos primarios se preparan a partir de tejidos normales, jóvenes, que tienen un cariotipo normal y una capacidad de crecimiento in vitro limitada a 2 ó 3 subcultivos (Ej: pulmón fetal humano, prepucio de recién nacido, amnios humano, etc.) y son más difíciles de obtener.

CULTIVOS

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En el otro extremo, las líneas celulares provenientes de tejidos tumorales, con cariotipos heteroploides, pueden subcultivarse en forma contínua y son fáciles de mantener in vitro ( Ej: HEp-2, Hela, Vero, RK, etc.).

Las cepas celulares tienen una constitución cromosómica normal y permiten 20 a 50 subcultivos (MCR-5). 

CULTIVOS

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La aplicación de técnicas de microscopia electrónica ha permitido observar la morfología de la mayoría de los virus que se conocen. En ciertos casos dicha morfología es característica (adenovirus, rotavirus, coronavirus) y permite la identificación de la partícula viral, aunque habitualmente la observación de su morfología sólo sugiere una familia o grupo viral.

MET

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El uso de microscopía con tinción negativa mejora la visualización de las partículas virales presentes en una muestra. El empleo de la microscopía electrónica tiene algunas limitaciones, como la necesidad de una alta concentración de partículas virales en la muestra, la disponibilidad de un microscopio electrónico y de un operador experimentado.

MET

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Se puede mejorar este método realizando inmunomicroscopía electrónica, en la cual se agregan anticuerpos específicos a la muestra que aglutinan y concentran los virus, haciendo más fácil de visualizar y permitiendo identificar la partícula viral, pues la reacción antígeno-anticuerpo es específica.

MET

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Se pueden detectar algunos virus con genoma segmentado por electroforesis del ácido nucleico, observando su patrón de migración en geles de agarosa o poliacrilamida. El diagnóstico de rotavirus representa un buen ejemplo del empleo de esta técnica, dado que su genoma es RNA segmentado, lo que ha permitido desarrollar un método simple y rápido para su detección en deposiciones, que se usa rutinariamente en diversos laboratorios.

Electroforésis

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En los virus que no tienen un genoma fragmentado (adenovirus, herpes simplex, citomegalovirus, VRS, etc.) pueden usarse enzimas de restricción (endonucleasas) que cortan el genoma en secuencias específicas, originando varios segmentos que conforman un patrón de movilidad electroforética característico que permite identificar al virus y sus variantes genéticas . Esta técnica se usa extensamente en investigación para estudiar variación antigénica (RFLP: restriction fragment lengh polymorfism)

Electroforésis

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Electroforesis

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Electroforesis

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Electroforesis

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Esta técnica se basa en la capacidad de las moléculas de ácido nucléico de una hebra de reconocer, por apareamiento de bases, a hebras de ácido nucleico que poseen secuencias nucleotídicas complementarias. La detección del híbrido puede realizarse usando sondas de ácidos nucleicos marcadas. Hay sondas radioactivas en que se visualiza la formación del híbrido mediante una autorradiografía; otras sondas son biotiniladas, detectándose la formación del híbrido mediante una reacción inmunoquímica.

HIS

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Otras veces se detectan los híbridos por la diferente velocidad de migración en geles de electroforesis (heteroduplex). Algunos ensayos se pueden realizar por la técnica de hibridación en filtro, que emplea como soporte un filtro de nitrocelulosa sobre el cual se realiza la reacción. La hibridación in situ se realiza en un corte de tejido o sobre una monocapa de cultivo celular. Esta última técnica constituye en la actualidad un buen método de diagnóstico para el virus papiloma.

HIS