TEMA 3. OPERACIONES DE LOS PROCESOS BIOSINTETICOS OBJETIVOS DEL TEMA.

El alumno conocerá el fundamento de los diferentes métodos para cuantificar el crecimiento microbiano

El alumno utilizará la estequiometría para predecir requerimientos y rendimientos del crecimiento celular, lo cuál le permitirá formular un medio de cultivo

El alumno aplicará los fundamentos de la esterilización para determinar tiempos y temperaturas para reducción de carga microbiana en medios de cultivo, determinado la constante de muerte térmica

El alumno conocerá y aplicará relaciones matemáticas para describir y predecir el crecimiento bacteriano.

El alumno conocerá y discutirá el efecto de los factores ambientales en el crecimiento de un microorganismo.

El alumno conocerá, distinguirá y aplicará los principios de los diferentes sistemas de cultivo.

El alumno diferenciará los distintos métodos para la recuperación de metabolitos 1.- Métodos para evaluar el crecimiento microbiano. Los microorganismos pueden crecer bajo una variedad de condiciones físicas, químicas y nutricionales muy diversas. En un medio nutritivo, los microorganismos extraen nutrientes a partir del medio y convierten estos en compuestos biológicos. Parte de estos nutrientes son usados para biosíntesis y formación de producto. El crecimiento de cualquier sistema biológico se define como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, lo que ocurre es un aumento de la población. En los microorganismos cenocíticos (en los que la duplicación del genoma no se acompaña de divisón celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamaño de la “colonia” cenocítica. Debido a la complejidad de fenómenos e interacciones involucradas en la cinética de poblaciones celulares, se deben manejar diversas suposiciones para obtener modelos que describan aceptablemente el comportamiento de una población celular, ya que un modelo demasiado realista puede contener parámetros los cuales sean difíciles de determinar.

Para un mejor entendimiento de la cinética de crecimiento iniciemos por mencionar los diversos métodos empleados para cuantificar el crecimiento celular. La selección del método

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dependerá del objetivo de la medición, ya que en ocasiones el medio para el crecimiento y la formación de producto pueden ser muy complejos, dificultando el uso de métodos directos, sobre todo en la presencia de sólidos suspendidos. 1.1 Determinación del número de microorganismos. 1.1.1 Métodos directos. 1. Hemacitómetro. También conocido como placa de Petroff-Hausser o cámara de Neubauer. Se utiliza para el conteo celular directo, en medios preferentemente claros y libres de partículas, colorantes (soluciones de azul de metileno, etc) son utilizados para distinguir células vivas de células muertas. No se recomienda para cultivos que forman agregados celulares. Este método se recomienda para organismos de diámetros menores a 3 μm.

Figura 1. Esquema de un hematocitómetro.

2. Contador de partículas. Basado en la relativa alta resistencia eléctrica de las células. Los contadores comerciales usan dos electródos y una solución electrolítica, un electródo se coloca en un tubo conteniendo un orificio; a continuación se aplica vacío al tubo interior, provocando que la solución de electrolito conteniendo células sea absorbida a través del orificio. Un potencial eléctrico se aplica a través del orificio, la resistencia eléctrica aumenta y causa pulsos en el voltaje eléctrico. El número de pulsaciones es una medida del número de partículas; la concentración de partículas se calcula considerando el volumen predeterminado de muestra. 1.1.2 Métodos indirectos. 1. Cuenta viable en placa. El conteo de células viables se realiza en cajas Petri con medio de cultivo adecuado y gelificado con agar, que son inoculadas con la muestra e incubadas. La palabra "viable" describe a un microorganismo capaz de reproducirse. Los resultados se expresan en unidades formadoras de colonias (UFC). Método útil para bacterias y levaduras, pero no en hongos.

2. Recuento sobre filtros. Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con

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un diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

Figura 2. Esquema de un contador de partículas (Fuente: Bioprocess Engineering: Basic Concepts.

Shuler and Kargi, Prentice Hall, 2002). 1.2 Determinación de la concentración de masa celular 1.2.1 Métodos directos. En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas. 1. Peso celular seco. Es un método que solamente se aplica a células creciendo en un medio libre de sólidos. Las muestras con la biomasa son centrífugadas o filtradas, lavadas con solución buffer o agua y secadas a 80°C por 24 horas. 2. Volumen de empaque celular. Permite la estimación de la concentración celular en medios de fermentación rápidamente; el medio es centrífugado en un tubo graduado bajo condiciones estándar (rpm y tiempo) y el volumen de células puede ser medido aproximadamente. 3. Determinación de proteína celular. Método de Biuret, método de Lowry, método de Kjeldahl. 4. Determinación de un componente celular característico. El crecimiento microbiano se estima mediante la determinación de componentes intracelulares tales como ARN, ADN, proteínas, peptidoglucano, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos. Ejemplo, ATP basada en la reacción: luciferina + O2 + ATP → luz (uso de la enzima luciferasa). 1.2.2 Métodos indirectos. 1. Densidad óptica. Se basa en la absorción de luz de células suspendidas en un medio de cultivo;por lo que es necesario considerar los antecedentes de absorción por componentes en el medio de cvultivo; el medio de cultivo debe estar esencialmente libre de partículas. Una curva de calibración es necesaria para relacionar la densidad óptica contra el peso celular seco. Algunas

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curvas de calibración pueden desviarse del comportamiento lineal a valores de OD (densidad óptica) > 0.3 (ley de Lambert y Beer). 2. Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos. 3. Nefelometría. El número de partículas en solución puede determinarse a partir de mediciones de la intensidad de la luz dispersada con la ayuda de un fototubo (nefelometría); la luz pasa a través de una muestra del cultivo y un fototubo mide la luz dispersada por las células en la muestra. La intensidad de la luz dispersada es proporcional a la concentración celular. 4. Determinación de factores fisicoquímicos. Mediciones de viscosidad, evolución del calor, etc. El crecimiento celular se relaciona con algunos componentes como ADN, ARN y proteínas como se muestra en la siguiente figura 3.

Figura 3. Cinética de crecimiento celular y cambio de la composición macromolecular.

Si se considera la curva del número de células por mililitro, que comúnmente se utiliza para establecer una cinética de crecimiento microbiano, en esta curva se distingue tres fases

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importantes: la fase lag, la fase log y la fase estacionaria. La primera de llas, en la cual el número de células permanece prácticamente constante, se observa que la cantidad de ARN por unidad de peso aumenta al igual que el peso por cada célula, lo que indica que la célula de manera individual está aumentando de tamaño y conjuntamente está preparando la maquinaria biosintética para iniciar un crecimiento sostenido. El aumenta de ARN indica un aumento de la sínteis de proteínas y enzimas. En esta etapa sin embargo la cantidad de ADN por unidad de peso disminuye, lo que indica que dentro de cada célula se mantiene constante. Una vez que se inicia la fase log, aumento del número de células, los tres factores mencionados permanecen constantes, lo que indica un crecimiento balanceado. Finalmente, en la etapa final de la fase log, se observa una vez mas cambios en la relación de ARN, ADN y peso celular individual, indicando que las células se preparan para entrar en una etapa de crecimiento lento, posteriromente en la fase estacionaria la células regresan a la condición inicial de la cinética de crecimiento. 2.- Formulación y esterilización de medios de cultivo. 2.1 Formulación de medios de cultivo. Para hacer la formulación de un medio de cultivo cuando no setiene un conocimiento previo de las necesidades del microorganismos o cuando se quiere conocer la cantidad de los nutrientes necesarios para asegurar que se tendra la cantidad de sustratos necesarios para la biosínteisis de metabolitos es conveniente realizar cálculos de las cantidades necesarias en base a la estequiometría del crecimeitno celular, sobretodo considerando la fuente de carbono. 2.1.1 Estequiometría del crecimiento celular. La conversión microbiológica de carbohidratos (fuente comúnmente utilizada como fuente de carbono) para obtener biomasa y productos de interés industrial es tema siempre actual, debido a la creciente dependencia de los recursos renovables. Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la formulación de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de operación de las plantas industriales. El grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala. Desde este punto de vista, resulta de sumo interés poder llegar a determinar, estimar o predecir rendimientos que den cuenta de las transformaciones que se están llevando a cabo en un biorreactor. Los balances de materia y energía resultan útiles para este fin. La producción de biomasa (biomasa = concentración de microorganismos expresada en gramos de células secas / litro de cultivo), consumo de las fuentes de carbono y energía, de nitrógeno y de oxígeno, y la producción de CO2 y desprendimiento de calor son algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de medidas experimentales y utilizadas para plantear y calcular balances de materia y energía. 2.1.1.1 Fórmula mínima. En primer lugar se ha encontrado que la composición elemental de un importante número de microorganismos, cultivados bajo diferentes condiciones, se mantiene prácticamente constante;

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así podemos definir un “microorganismo promedio” (composición estándar) como aquel cuya composición es (% p/p): C = 46,5; H = 6,94; 0 = 31,0 y N = 10,85, donde el aproximadamente 5 % restante está representado por sales. Es importante recalcar que si bien la composición elemental promedio de la biomasa se mantiene prácticamente constante, la concentración intracelular de proteínas, ARN y demás constituyentes celulares puede variar sensiblemente entre diferentes especies e incluso entre diferentes estadios del cultivo de un mismo microorganismo. Teniendo en cuenta esta composición media, podemos escribir lo que sería la “fórmula mínima” de nuestro microorganismo promedio como C H1,79O0,5N0,2 (en la que está representada el 95% p/p de la biomasa) y con fines meramente prácticos definir “1 C-mol de biomasa” como la cantidad de biomasa que contiene 1 átomo gramo de C. Así pues tenemos que:

g 25,8 = 95,0

2,0x145,0x1679,112 = biomasa de mol-C 1 +++

Si “σx” es la fracción de C en la biomasa, para el microorganismo promedio se tiene que σx = 0,465. De forma análoga se puede definir 1 C-mol de sustrato (entiéndase por sustrato la fuente de carbono y energía), 1 C-mol de fuente de N, etc. Como ejemplo, para la glucosa: C6H12O6, 1 C-mol de glucosa estará representado por CH2O y su peso es 30 g. Para el etanol, 1 C-mol de etanol (CH3O0,5) pesa 23 g. En general para un compuesto de la forma CnHpOqNm, 1 C-mol estará representado por CHp/nOq/nNm/n.

Ahora bien, el crecimiento de un microorganismo lo podemos definir como la siguiente “reacción química”, donde se considera que la fuente de nitrógeno es amoníaco o una sal de amonio y es un organismo aerobio:

)calor(qOHwCOyNOCHyNOCHyObNHaOCH 22s/2CO3p2p1ps/p3b2b1bs/x232s1s ++++→++Sustrato Biomasa Producto

Debe notarse que en esta ecuación todos los coeficientes estequiométricos están referidos a 1 C-mol de fuente de carbono y energía (fuente C y E). El valor de yx/s representa los C-moles de biomasa formados por cada C-mol de sustrato consumido, yp/s representa los C-moles de producto formados por cada C-mol de sustrato consumido, yCO2/s representa los moles de bióxido de carbono formados por cada C-mol de sustrato consumido, a es el número de moles de la fuente de nitrógeno consumidos por cada C-mol de sustrato consumido, b es el número de moles de oxígeno (O2) consumidos por cada C-mol de sustrato consumido, w es el número de moles de agua formados por cada C-mol de sustrato consumido.

Los rendimientos (y’s) son importantes en los procesos de fermentación como una medida de la eficiencia con que se produce un compuesto de interés. El rendimiento generalmente se define como g de producto/g de sustrato consumido, y se utiliza la letra Y. Así por ejemplo, para los casos citados previamente se tiene que: Yx/s representa el rendimiento de biomasa en base a sustrato, esto es, la cantidad en gramos de biomasa formada por gramo de sustrato consumido. Yp/s representa el rendimiento de producto en base a sustrato, esto es, la cantidad en gramos de producto formado por gramo de sustrato consumido.

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YCO2/s representa el rendimiento de bióxido de carbono en base a sustrato, esto es, la cantidad en gramos de bióxido de carbono formado por gramo de sustrato consumido. 2.1.1.2 Grado de reducción.

Otro concepto importante es el de “grado de reducción” o “grado de reductancia”, que es de gran utilidad para plantear balances de materia y energía.

El grado de reducción se puede definir como el número de electrones que son transferidos al oxidar un compuesto, y se representan por γ. Para aclarar el concepto de grado de reducción consideremos el caso de la oxidación del etanol con oxígeno hasta CO2 y H2O. La ecuación química que representa la reacción es, donde se utiliza 1 C-mol de etanol:

CH3O0,5 + 1,5 O2 →CO2 + 1,5 H2O Donde el número de electrones que intervienen en la reacción son 1,5X2X2=6; 1,5 es el número de moles de oxígeno (O2) que se consumen para oxidar el compuesto hasta CO2, 2 es el número de electrones que tiene un átomo de oxígeno y 2 es el número de oxígenos en una molécula de oxígeno. Por tanto, el grado de reducción del etanol es 6, γ = 6. En la siguiente tabla se muestra el caso para varios compuestos.

Los distintos valores de γ que figuran en cada ecuación coinciden con el número de “electrones disponibles” que fueron transferidos desde el compuesto a oxidar al oxígeno. En general γ se expresa en términos de número de electrones disponibles / C-mol de compuesto. En general, para calcular el valor de γ de un determinado compuesto se consideran que los grados de reducción son: 4 para el C; 1 para el H; -2 para el O y -3 para el N. En el caso del CO2, H2O y NH3 no se tienen electrones disponibles (estados de referencia), luego γCO2 = γH2O = γNH3 = 0. Se considera además que el estado de oxidación predominante del N en la biomasa es -3. En términos generales para un compuesto de fórmula CHaObNc, su grado de reducción vendrá dado por:

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γ = 4 + a - 2b - 3c Si tenemos un compuesto cuya fórmula es Ch Hi Oj Nk, debemos llevarlo a la forma

hk

hj

hi NOCH

Si tomamos como ejemplo a nuestro microorganismo promedio su γx (donde el subíndice x indica biomasa) será:

mol-Cdisp. e 4,19 =

-

xγ

En el cultivo de microorganismo hay desprendimiento de calor por reacción de oxidación

con el oxígeno, y este calor por mol de electrones transferidos al oxígeno es relativamente constante para la oxidación de una amplia variedad de moléculas orgánicas y corresponde a 27 Kcal/mol electrones disponibles transferidos al oxígeno (O2). Planteando un balance de materia y energía para un microorganismo creciendo en un cultivo que está representado por la reacción química simple.

)calor(qOHwCOyNOCHyNOCHyObNHaOCH 22s/2CO3p2p1ps/p3b2b1bs/x232s1s ++++→++

(1) Balance de carbono:

1y + y + y s/2COp/sx/s = (2)

Balance del grado de reducción:

γs + (-4)b = yx/s . γx + yp/s . γp (3) Reordenando y dividiendo por γs obtenemos

1 . y . yb4

s

pp/s

s

xx/s

s

=++γγ

γγ

γ (4)

o lo que es lo mismo ε + η + ξ = 1 (5)

Donde

ε = 4b

sγ (fracción de e- disponibles del sustrato transferidos al O2)

η = s

x x/s .yγγ

(fracción de e- disp. del s transferidos a la biomasa)

ξ = s

pp/s .yγγ

(fracción de e- disp. del s transferidos al producto)

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Estos dos balances obedecen directamente al principio de conservación de la masa y la energía, en el primero de ellos, no puede haber entre los productos más carbono del que un c-mol de sustrato puede aportar y el en el caso del segundo, los electrones disponibles del sustrato deben ir obligadamente a los distintos productos. Si asumimos, como ya se mencionó, que el calor de reacción por mol de electrones disponibles transferidos al oxígeno es constante para un importante número de moléculas orgánicas (qo = 27 Kcal/mol electrones disponibles transferidos al O2), el calor generado en la ecuación está dado por: q = 4 qo b kcal/C-mol de sustrato (6) Si se conoce la velocidad de consumo de O2 del cultivo, se puede calcular la velocidad de producción de calor y por lo tanto, los requerimientos de H2O de enfriamiento para mantener constante la temperatura del biorreactor. El concepto de electrones disponibles brinda un método simple de cálculo para verificar los resultados obtenidos experimentalmente en lo que se da en llamar “análisis de consistencia interna”. Empleando las ecuaciones (2) y (4) o (5) con datos obtenidos en el laboratorio, se pueden estimar parámetros no medidos y tener idea de cuán confiables fueron las determinaciones. Medidas realizadas en el laboratorio deben encontrarse dentro de los intervalos:

0,94 ≤ yx/s + yp/s + yCO2/s ≤ 1,06 0,93 ≤ η + ε + ξ ≤ 1,07

Valores inferiores o superiores a estos límites de aceptabilidad determinados estadísticamente ponen en evidencia errores en las determinaciones experimentales. En el trabajo habitual de laboratorio la cuantificación de la biomasa producida se efectúa gravimétricamente, es decir, se determina el incremento en biomasa expresado en g/L (Δx) correspondiente a la utilización de una determinada cantidad de sustrato (Δs) (igualmente

expresada en g/L) con lo cual se define el rendimiento en base a sustrato como sxYx/s Δ

Δ−= al que

tomamos como “rendimiento global” en el que sólo se tienen en cuenta los valores finales e iniciales de biomasa y sustrato.

Para calcular los valores de yx/s, yp/s, y yCO2/s conociendo los respectivos rendimientos globales y los valores de σx, σs, σp y σCO2 se utilizan las relaciones:

S

COs/COs/CO

S

ps/Pp/s

S

xx/s x/s

2

22Yy ; Yy ; Yy

σσ

σσ

σσ

=== (7)

Resulta de gran interés conocer los destinos que toma la fuente de C y energía durante el crecimiento microbiano y la fracción de la misma empleada por el microorganismo para obtener la energía necesaria para llevar adelante sus funciones metabólicas. Para lo cual, por el balance de sustrato:

ΔS = ΔSx + ΔSp + ΔSE (8) donde ΔS = Sustrato total consumido ΔSx = Fracción de sustrato utilizado en la formación de biomasa ΔSp = Fracción de sustrato utilizado en la formación de producto ΔSE = Fracción de sustrato utilizado para obtener energía Por otro lado, se debe cumplir que: - ΔSx σs = ΔX σx (9)

9

ΔSp σs = ΔP σp (10) por consiguiente: ΔSE = ΔS - ΔSx - ΔSp

ΔSE = ΔS + ΔX ..σσ

σσ

x

s

P. P s

+ Δ

fE = sp Y

s xY1

SS

p/sx/sE

σσ

σσ

−−=ΔΔ

fE : Fracción de fuente de carbono y energía (FCE)

destinada a la obtención de energía.

fE = 1 - yx/s - yp/s = (11) s/CO2y

Experimentalmente lo que se hace es determinar la producción global de CO2, conociendo la masa de CO2 y sustrato consumido, se calcula ΔSE por estequiometría. Este método presenta dos inconvenientes: en primer lugar existen reacciones enzimáticas que incorporan O2 a determinados componentes celulares (O2 que no es empleado para obtener energía) no obstante este consumo puede ser despreciado frente al global para oxidar la fuente de carbono y de energía; y el más importante es que debemos suponer que γx ≅ γs, caso contrario se introduce un gran error en el cálculo. Hasta aquí los balances planteados por el método de electrones disponibles consideran el caso particular de formación de biomasa y producto cuando la fuente de N es NH3. Ahora bien, ¿qué sucede cuando ésta no es NH3? Lo que se hace en este caso es modificar los estados de referencia para que en los balances: γ = γ = γCO2 H O2

fte.de N = 0 con lo cual estamos estableciendo un "grado de reducción generalizado". Tomemos: Biomasa = C H O Na b c1 1 1

2

3

4

Sustrato = C H O Na b c2 2

Producto = C H O Na b c3 3

Fuente de N = C H O Nd a b c4 4 4

Se definen los γi generalizados como:

γx = 4 + a1 - - 2b1( )C

Cd a b1

44 4 4

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟ + −4 2

10

γs = 4 + a2 -2 - b2( )C

Cd a b2

44 4 4

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟ + −4 2

γp = 4 + a3 - 2 -b3( )C

Cd a b3

44 4 4

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟ + −4 2

γ N4

4

4

4

4

4

4

4 4

4

4

ad

bd

CC

dd

ad

bd

= + − −⎛⎝⎜

⎞⎠⎟ + −⎛⎝⎜

⎞⎠⎟4 2 4 24

2.2 Esterilización de medios de cultivo.

Muchas fermentaciones industriales se desarrollan con cultivos puros con cepas seleccionadas. Si se tiene la presencia de microorganismos ajenos en el medio de cultivo, así como en algunas partes del equipo, estos microorganismos pueden competir por los nutrientes limitantes. Los microorganismos extraños pueden generar productos que limiten el crecimiento de los organismos productores. Por lo tanto, antes de arrancar una fermentación, el medio y todo el equipo relacionado debe ser liberado de organismos vivos, en otras palabras, debe ser esterilizado y posteriormente se debe cuidar el entorno aséptico durante el desarrollo del proceso.

Por esterilización se entiende la eliminación de toda forma de vida de un medio o material. Generalmente se realiza por medios físicos (filtración, calor), por medios químicos u otra vía. Esta definición excluye cualquier técnica que resulte solamente en un daño a los microorganismos o atenuación de la actividad de cualquier tipo.

Para una operación económica, en virtualmente todos los procesos de fermentación es obligatorio tener en todas las etapas del proceso a los cultivos libres de contaminantes, desde el cultivo preliminar (matraz de propagación) hasta el fermentador de producción. Un biorreactor puede ser esterilizado, destruyendo los microorganismos con algún agente letal como calor, radiación o un producto químico o separando los organismos viables mediante un procedimiento físico como la filtración. 2.2.1 Métodos de esterilización. La esterilización se puede llevar a cabo por tres diferentes métodos: químicos, y físicos. 2.2.1.1 Métodos Químicos. Es el uso de un compuesto químico letal para los microorganismos. Por ejemplo, el oxido de etileno y el glutaraldehído son agentes esterilizantes. Oxido de etileno: es un líquido que hierve a 10.7°C, que actúa inactivando enzimas y otras proteínas que contienen grupos sulfhídrilos (R-SH) mediante una reacción llamada alquilación (R-S-CH2CH2O-H). Se usa en la industria para la esterilización para objetos de plástico (cajas Petri, jeringas) que se funden a temperaturas menores a 100° C. Debido a su alto poder de penetración, estos objetos se empaquetan primero y después se esterilizan. Glutaraldehído: Una solución acuosa al 2% presenta una amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, células vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urológicos y ópticos.

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2.2.1.2 Métodos Físicos. Son aquellos que involucran a radiación ionizante, filtración y calor. a) Radiación ionizante. La radiación ionizante es altamente letal, al destruir moléculas vitales de los microorganismos, lo que se consigue sin producir calor. La mayoría de los daños son a nivel ADN. Las bacterias Gram-negativas son generalmente más sensibles a la irradiación que las Gram-positivas y las esporas aún más resistente. En general la resistencia a la radiación de los hongos es del mismo orden que la de las formas vegetativas bacterianas. Los virus son aún más resistentes que las bacterias a la radiación. a.1 Radiación UV. Luz ultravioleta produce una disminución exponencial en el número de células vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiación. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que sólo los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la acción de la luz UV son susceptibles de ser destruidos. Se utiliza para sanear el aire, esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos. a.2 Rayos gamma. Las radiaciones gamma tienen mucha energía y son emitidas por ciertos isótopos radiactivos (Co60), pero son difíciles de controlar ya que este isótopo emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y después esterilizar. a.3 Rayos catódicos (Radiación con haz de electrones). Se usan para esterilizar material quirúrgico, medicamentos y otros materiales. Una ventaja es que el material se puede esterilizar después de empaquetado (ya que éstas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambiente. b) Separación mecánica de los organismos. Son posibles alternativas como la centrifugación, adsorción a intercambiadores iónicos, adsorción sobre carbón activado o filtración. La filtración es el único método en uso práctico. La esterilización por filtración se utiliza frecuentemente para componentes, en solución, sensibles al calor, que serían desnaturalizados durante el proceso de esterilización por vapor. Las vitaminas, los antibióticos o los componentes de la sangre son ejemplos de compuestos lábiles al calor que deben ser esterilizados por filtración con membranas de 22 μm que impiden el paso de microorganismos e incluso virus. Dos desventajas de la filtración son: 1) ciertos componentes de la soluciones de nutrientes pueden ser adsorbidos sobre el material del filtro, y 2) debe ser utilizada una presión fuerte (de hasta 5 bar) que es indeseable en la práctica industrial. Una manera de economizar es la filtración solamente del agua utilizada en la preparación del medio de cultivo. Por ejemplo, en el proceso de bioconversión de esteroides se esteriliza una solución concentrada de nutrientes mediante calor en el fermentador y luego se diluye con agua que ha sido esterilizada por filtración. c) Tratamiento térmico. Los microorganismos mueren rápidamente cuando son sometidos a temperaturas superiores a su óptima de crecimiento. Esto permite utilizar altas temperaturas para eliminar microorganismos por termodestrucción. Los métodos basados en el calor son quizá los más utilizados para controlar el crecimiento microbiano en los sistemas de fermentación. Por este motivo, a continuación se describen ecuaciones que permiten calcular tiempos y condiciones para lograr la esterilidad de un medio de cultivo.

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2.2.2 Cinética de muerte microbiana. El proceso térmico de la destrucción de una población microbiana, generalmente, sigue

una cinética de primer orden. 2.2.2.1 La velocidad de muerte logarítmica puede expresarse por:

(1) Nk = dtdN

−

donde: N - concentración de microorganismos viables k - constante de velocidad específica de muerte (min-1) t – tiempo (min) Integrando la ecuación (1), con la condición N = No a t = to

(3) e N = N

o

(2) k t - = N

Nln

k t -o

o

Donde No es la concentración de organismos viables al tiempo to La ecuación (3) es más representativa para células vegetativas. El valor absoluto de k es una medida de la resistencia térmica del microorganismo, es decir conforme k tiende a cero, la resistencia térmica es mayor. Gráficamente la cinética de velocidad de muerte logarítmica se puede representar por:

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Figura 1. Datos típicos de velocidad de muerte para células vegetativas (E. coli)

Cuando un medio de fermentación es esterilizado, la concentración y el tipo de contaminación microbiana no puede conocerse con precisión absoluta, sin embargo la resistencia relativa de diferentes tipos de microorganismos puede servir como referencia para el diseño de ciclos de esterilización. La resistencia relativa de algunos microorganismos es presentada en el cuadro 1.

Cuadro 1. Resistencia relativa de varios microorganismos al calor Resistencia relativa Bacterias vegetativas y levaduras Esporas bacterianas Esporas de hongos Virus y bacteriófagos

1.0 3 x 106 2 - 10 1 - 5

2.2.2.2 Efecto de la temperatura sobre la cinética de la muerte Por analogía con reacciones químicas se puede establecer que la constante de cinética de muerte, muestran una dependencia de la temperatura del tipo Arrhenius:

(8) eA =k RT / E Δ− donde: k - constante específica de velocidad de muerte (min-1) A - factor pre-exponencial (min-1) ΔE - energía de activación de muerte (cal / mol) R - constante de los gases (cal / mol -°K) T - temperatura absoluta (° K)

Figura 2. Dependencia de la muerte microbiana de la temperatura

Donde la pendiente es una medida de la susceptibilidad del microorganismo al calor. Energía de activación ( ΔE):

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Normalmente los valores de la energía de activación (ΔE) asociados con la destrucción o muerte microbiana son bastantes altos comparados con los de inactivación térmica de compuestos químicos constituyentes de medios de fermentación tales como vitaminas, etc. (Cuadro 2).

Cuadro 2. Valores típicos para energías de activación y parámetro pre exponencial ΔE (cal / mol) A (min-1) Acido fólico Alcohol d - pantotenilico Cianocobalamina Tiamina HCl B. stearothermophilus (esporas) B. subtilis (esporas) Cl. botulinum (esporas) Anaerobio putrefactivo NCA 3679Cl. sporogenes Células vegetativas

16,800 21,000 23,100 22,000 67,700 76,000 82,000 72,400 68,700

20000 (máximo)

--- --- --- ---

4.93 × 1037 9.50 × 1037

--- ---

1.66 × 1038 1.20 × 1021

Como ejemplo, al analizar el efecto de la temperatura al pretender alcanzar un nivel deseado de esterilidad para un medio de fermentación y el análisis del efecto de la temperatura en la destrucción de una vitamina en el medio. Los valores de energía de activación sugieren que un incremento en la temperatura drástico tiene un efecto significativo en la destrucción de algunos compuestos químicos en el medio. La figura 3 muestra que lo mas deseable es un uso de temperatura alta y tiempo corto para esterilizar medios conteniendo tiamina y de Bacillus stearothermophilus. Tiamina: Temperatura = 102°C Constante de velocidad específica de descomposición (k) = 0.014 min-1 Energía de activación (ΔE) = 22,000 cal/mol Bacillus stearothermophilus: Temperatura = 125°C Constante de velocidad específica de descomposición (k) = 0.07 min-1 Energía de activación (ΔE) = 67,700 cal/mol

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Figura 3. Gráfica tipo Arrhenius para esporas de Bacillus stearothermophilus y tiamina.

Así para un nivel de esterilidad de N / No = 10-16.

Temperatura de esterilización

(°C)

Tiempo requerido para mantener N / No = 10-16

(min)

Pérdida de tiamina (%)

100 110 120 130 140 150

843 75 7.6

0.851 0.107 0.015

99.99 89 27 10 3 1

Cuando el log del número de sobrevivientes es menor a cero se habla de probabilidad de sobrevivencia. Por lo tanto, para un valor de probabilidad igual a -1, indica que hay 0.1 microorganismos viables por unidad, o correctamente expresado una unidad contaminada por cada 10 unidades idénticas procesadas. Un producto se considera estéril cuando la probabilidad de encontrar unidades contaminadas es menor o igual a 10-6, esto es una unidad contaminada cada millón de unidades idénticas procesadas.

La relación de Arrhenius ha sido observada solamente para cultivos puros. Las poblaciones que existen normalmente en soluciones no estériles son generalmente cultivos mixtos no homogéneos que contienen organismos de resistencia variable al calor. La velocidad de destrucción por consiguiente no es una línea recta sino una curva como se muestra en la figura 4 para un cultivo que consta de dos cepas.

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Figura 4. Curva de muerte de un cultivo mixto. Las líneas rectas A y B indican las velocidades de

muerte de ambos cultivos puros. Durante la fermentación deben ser observados tres puntos para asegurar la esterilidad: - Esterilidad en el medio de cultivo - Esterilidad del aire que entra y que sale - Construcción apropiada del biorreactor para su esterilización y para la prevención de la contaminación durante la fermentación. 2.2.2.3 Tiempo de reducción decimal (D).

El tiempo de reducción decimal o valor D, es el tiempo requerido para reducir un 90% la población de un microorganismo determinado a una temperatura específica (o, bien, para que el logaritmo del número de supervivientes se reduzca en una unidad). Matemáticamente

NN

= 110

; ln 110

= - k D

D = 2.303k

o

∴

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Las unidades del D son minutos. El tiempo de termodestrucción (Dt) varía para cada

temperatura (de ahí el subíndice t), es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas.

El medio en el que se encuentra un microorganismo influye en su sensibilidad al calor. Por lo general, los microorganismos son más sensibles a las altas temperaturas cuando se encuentran a pHs ácidos, mientras que las concentraciones altas de proteínas o azúcares en el medio disminuyen la efectividad del calor y protegen a las bacterias. Las altas concentraciones de sal tienen efectos variables según el tipo de microorganismo. 2.2.2.4 Valor z o constante de resistencia térmica.

Se define como la diferencia en temperaturas necesaria para causar una reducción de un 90% en el valor D. Observe que el valor z es un valor característico de cada microorganismo. El valor z describe además la resistencia térmica de las esporas de las bacterias. Para calcular el valor Z, se grafican los valores D a diferentes temperaturas para un cultivo específico de un microorganismo. Como se ilustra en la figura a continuación, el valor z es la diferencia de las temperaturas que definen un cambio en el ciclo logarítmico.

2.2.2.5 Valor F o Tiempo de muerte por tratamiento térmico.

El tiempo de muerte por tratamiento térmico, mejor conocido como valor F, es el tiempo que se requiere para causar una reducción específica de una población de un microorganismo a una temperatura dada. Este tiempo se puede expresar en minutos o como un múltiplo del valor D. Por ejemplo, para una reducción del 90% de la población, el valor F será igual al valor D. Para una reducción del 99% de la población microbiana, el valor F será igual a 2D. Por ejemplo

Para una reducción en la población microbiana de

El valor F será igual a

90 % D 99 % 2D

99.9 % 3D El valor de F se puede expresar en función de D, de acuerdo a la información anterior, por

lo que: F = n D

donde n es el número de reducciones decimales en la población microbiana. En ocasiones, el valor F se escribe con un subíndice y un superíndice que representan la

temperatura y el valor z, tal como se ilustra a continuación: FT

z F110 18

18

F tiene el subíndice "T", que indica la temperatura de tratamiento, 110ºC, y el superíndice "z", identifica el valor de z, 18ºC.

Cuando F es igual a 4D, indica que en el tiempo de tratamiento F, la población microbiana se reducirá en un 99.99%. Por ejemplo, si para un microorganismo el valor de D fuera de 5 minutos y la población microbiana un millón de células por mL, entonces se requieren 20 minutos para reducir la población al orden de 100 células por mL.

En los procesos de pasteurización y esterilización, la determinación del valor D y los cálculos del valor F se hacen asumiendo que se reduce la población del microorganismo contaminante más resistente, por lo que para un tratamiento particular se reducirá también en igual o mayor grado la población de otros microorganismos menos resistentes.

El símbolo F0 se utiliza para indicar que el tiempo de tratamiento térmico a 121ºC. Y es útil para comparar tiempos de exposición equivalente a 121ºC, pero realizados a temperaturas diferentes, para su cálculo se considera un microorganismo ideal con un valor z igual a 10.

zT

tF)121(

0 10−

ΣΔ= Donde Δt es el intervalo de tiempo entre las mediciones de la temperatura T T es la temperatura de esterilización al tiempo T z es igual a 10 Por ejemplo, un tratamiento térmico a 111ºC durante 15 minutos,

min.)()(

511015 10121111

0 ==−

F equivaldría a un tratamiento de 1.5 minutos a 121ºC. Si ahora se considera un tratamiento a 124ºC durante 15 minutos, se tiene

min)()(

291015 10121124

0 ==−

F que indica un tratamiento similar al obtenido a 121ºC durante 29 minutos.

2.2.2.6 Razón de Letalidad.

La razón de letalidad se define como el cociente entre dos tiempos de muerte por tratamiento térmico a diferentes temperaturas. El valor numérico de dicho cociente está dado por la siguiente expresión:

Utilizando esta fórmula, se puede aproximar cuanto tiempo se requiere (FT1) para procesar

un medio a una temperatura (T1) y reducir la población microbiana de la misma forma que se hace con un proceso de tiempo conocido (FT2) a una temperatura específica (T2). Es necesario conocer el valor de z para el microorganismo particular en que se hace la reducción de población.

El concepto de tiempo de muerte por tratamiento térmico (valor F) está basado en la premisa que el tratamiento térmico se efectuará a una temperatura fija. El proceso que se asume en esta premisa está ilustrado en la gráfica que sigue a continuación:

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Sin embargo, en la realidad, los procesos de tratamiento térmico no alcanzan una

temperatura de procesamiento de forma instantánea. El incremento de temperatura es algo más paulatino, tal como se ilustra en la figura a continuación.

Para hacer cómputos de un valor F equivalente (con una temperatura fija) que asemeje a

los procesos reales, se suele subdividir la gráfica del proceso (temperatura vs tiempo) en intervalos de tiempo reducidos en los cuales se asume una fija temperatura, tal como se ilustra a continuación. Entonces se proyectan los tiempos de procesamiento de cada rectángulo a la temperatura característica del proceso utilizando la fórmula de la razón de letalidad.

2.2.3 Esterilización del medio de cultivo. El medio nutritivo que se prepara inicialmente contiene una variedad de células

vegetativas diferentes y de esporas, derivadas de los constituyentes del medio, del agua y del recipiente. Estos deben ser eliminados por un procedimiento adecuado antes de la inoculación. Existen un conjunto de procedimientos para la esterilización, pero en la práctica para instalaciones a gran escala, el calor es el principal mecanismo utilizado.

Un conjunto de factores influyen en el éxito de la esterilización por calor: el número y tipo de microorganismos presentes, la composición del medio de cultivo, el valor del pH y el tamaño de las partículas en suspensión. Las células vegetativas son eliminadas rápidamente a temperaturas relativamente bajas, como se muestra en la Figura 1, pero para la destrucción de las esporas se necesitan temperaturas de 121°C.

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Las esporas de Bacillus stearothermophilus son las más resistentes al calor. Por consiguiente son utilizadas como organismos de ensayo para probar los distintos procedimientos utilizados para esterilizar el equipo. El cuadro 3 proporciona datos sobre la relación entre temperatura y el valor k. En el cuadro 4 se da una lista de tiempos de esterilización y temperaturas para varios organismos.

Cuadro 3. Relación entre temperatura y valores k en Bacillus stearothermophilus.

T(ºC) 100 115 118 131 130 140 150 k (min-1) 0.019 0.666 1.307 2.538 17.524 135.9 956.1

Cuadro 4. Tiempo de esterilización y temperatura de esterilización de microorganismos.

Células Tiempo de esterilización (min)

Temperatura de esterilización (°C)

Células vegetativas 5-10 60 Esporas de Hongos/levaduras 15 80 Esporas de Streptomyces 5-10 60-80 Esporas bacterianas En general 5 121 Esporas de B. stearothermophilus 15 121

3.- Cinética de crecimiento microbiano.

Una población de bacterias que se encuentre en un medio adecuado, donde se mantienen constantes todos sus parámetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, número de células, ADN, ARN, proteínas, etc., es un valor constante y similar en cada caso (ver figura 3, fase log).

ΔM/M = ΔN/N = Δ[ADN]/[ADN] = Δ[proteínas]/[proteínas] = ... = K

Así pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logarítmico, el cultivo se comporta como una reacción autocatalítica de primer orden:

velocidad de aumento del componente = K·{cantidad del componente}

También se puede decir que el número de células, la masa celular u otros componentes se duplican cada determinado lapso de tiempo. Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza, porque todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es la velocidad específica de crecimiento (μ), que es característica para cada cepa bacteriana creciendo en un medio determinado y condiciones ambientales específicas. La curva típica de crecimiento se presenta en la siguiente figura.

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Figura 4. Curva típica de crecimiento para una población bacteriana.

Como se puede apreciar, la curva de crecimiento presenta diferentes fases perfectamente definidas, las cuales se explican a continuación : Fase lag: También conocida como "fase de retardo", es una consecuencia del "choque" que sufren las células al encontrarse en ambiente nuevo. Los microorganismos reorganizan sus constituyentes moleculares y dependiendo de la composición de los nutrientes, sintetizan nuevas enzimas; la síntesis de algunas otras enzimas es reprimida, etc. Múltiples fases lag pueden observarse cuando el medio contiene más de una fuente de carbono. Fase log o de crecimiento exponencial: En esta fase, las células se multiplican rápidamente, y la masa celular y el número de microorganismos se incrementa exponencialmente con el tiempo. Este es un período de "crecimiento balanceado", esto es, todos los componentes de la célula crecen con la misma velocidad, esto es la composición promedio de la célula permanece aproximadamente constante. La velocidad de crecimiento bacteriano durante la fase exponencial es de primer orden, y se puede representar por:

0XdtdX

0 === taXXμ (1)

la cual al integrarse origina

teXot μμ 00

XXXln == (2)

donde: X = concentración celular a tiempo t (g/L)

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Xo = concentración celular a tiempo t (g/L) μ = velocidad específica de crecimiento (t-1) Fase de desaceleración: En esta fase, el crecimiento desacelera debido a la disminución de uno o más nutrientes esenciales o a la acumulación de productos tóxicos al crecimiento. El rápido cambio del ambiente se traduce en un "crecimiento no balanceado" . Fase Estacionaria: En esta fase, la velocidad neta de crecimiento es cero (no existe división celular) o cuando la velocidad de crecimiento es igual a la velocidad de muerte. La producción de ciertos metabolitos es realizada durante la fase estacionaria, por ejemplo; antibióticos, hormonas, vitaminas, etc. Durante el desarrollo de la fase estacionaria uno o más de los siguientes fenómenos tiene lugar: i) La concentración total de masa celular permanece constante, pero el número de células viables puede decrecer ii) Lisis celular puede ocurrir y la masa celular viable descender. Una segunda fase de crecimiento puede presentarse y las células crecer sobre los productos de la lisis (crecimiento típico) iii) Las células pueden no estar creciendo pero pueden tener un metabolismo activo para producir metabolitos secundarios Durante la fase estacionaria, la célula cataboliza reservas celulares para generar nuevos bloques de construcción y monómeros para producir energía, a este fenómeno se denomina "metabolismo endógeno". La célula también puede gastar energía para mantener una membrana energizada y transportar nutrientes y para funciones metabólicas esenciales tales como su movilidad y reparación del daño a estructuras celulares, este gasto es llamado "energía de mantenimiento". Fase Declinación o Muerte: También conocida como "fase muerte", se da debido al agotamiento del medio o presencia de un veneno, la velocidad de muerte sigue una cinética de primer orden:

) 3 ( e N = N o X k' - = dtdN tk' -

sdd

donde: Ns = concentración de células al final de la fase estacionaria k'd = constante de velocidad de muerte 3.1 Tiempo de duplicación (td). Es el tiempo que se requiere para que el microorganismo incremente su población al doble,esto es, el tiempo necesario para que se duplique una bacteria. A partir de la ecuación (1):

dXdt

= X μ

al integrar la ecuación:

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dt = dtdX 2

1

dX

X

t

0∫ ∫ μ

Si X2 = 2 X1, td= tiempo de duplicación Así :

) 4 ( 0.693 = 2ln = t d μμ

3.2 Tiempo de generación (tg). Para muchos propósitos en microbiología es útil conocer el tiempo de generación de una población durante el crecimiento exponencial, durante esta etapa de la curva de crecimiento, se deduce que el aumento de bacterias es una progresión geométrica, existiendo una relación directa entre el número de células presente en el momento inical y el habido en un momento determinado del crecimiento exponencial, de donde: N =N0 2n (5) siendo: n = número de generaciones que ha ocurido durante el período de la fase exponencial. N = número de células al tiempo t. N0 = número de células al inicio de la fase exponencial. Para calcular el tiempo de generación se emplea la ecuación tg = t/n (6) donde: tg = tiempo de generación t = tiempo de crecimiento transcurrido hasta el momento de la toma de muestra durante la fase exponencial. Para calcular el número de generaciones se puede emplear la expresión que se muestra a continuación: log N = log N0 + n log 2 (7) n =(log N – log N0)/log2 (8) n=(log N – log N0)/0.301 (9)

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