TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICOpnpc.ittepic.edu.mx/tesis/Repositorio_programa_2014/2014...1.4...

$: TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICOpnpc.ittepic.edu.mx/tesis/Repositorio_programa_2014/2014...1.4 Compuestos de interés nutricional del fruto de guayaba 14 1.4.1 Fibra dietética y fracción$
TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TEPIC

ESTUDIO DE LA BIOACCESIBILIDAD DE COMPUESTOS FENÓLICOS Y

METABOLITOS DE LA FERMENTACIÓN COLÓNICA EN EL FRUTO DE

GUAYABA (Psidium guajava L.)

TESIS

Por:

MCA. FRANCISCO JAVIER BLANCAS BENITEZ

DOCTORADO EN CIENCIAS

EN ALIMENTOS

Director:

DRA. SONIA G. SÁYAGO AYERDI

Co-Director:

DR. GUSTAVO A. GONZÁLEZ AGUILAR

Tepic, Nayarit 2018

1

RESUMEN Blancas-Benitez, Francisco Javier. DCA. Tecnológico Nacional de México, Instituto Tecnológico de Tepic. Abril de 2018. Estudio de la bioaccesibilidad de compuestos fenólicos y metabolitos de la fermentación colonica en el fruto de guayaba (Psidium guajava L.). Directora: Sáyago-Ayerdi Sonia G. Co-director: González-Aguilar Gustavo A.

La cáscara y la pulpa del fruto de guayaba son una excelente fuente de vitaminas (A, C, tiamina, niacina y riboflavina), minerales (fósforo, calcio y hierro), fibra dietética y compuestos fenólicos (CF). La mayoría de los CF identificados en la pulpa de guayaba también se han detectado en hojas de guayaba; tales compuestos incluyen taninos hidrolizables y compuestos como guavin A, guavin B y quercetina. Por su parte, la fibra dietética es parte de la fracción indigestible del alimento; cabe recordar que la microbiota humana para estar saludable necesita interactuar diariamente con 45-60 g de sustratos no digeribles. La guayaba se consume fresca y es común eliminar sus semillas, que pueden constituir hasta 10% del peso total. Esto puede afectar a la cantidad y el tipo de CF ingeridos, mientras que los CF no absorbidos podrían ejercer efectos beneficos en el colon sirviendo de sutrato fermentable para la microbiota colonica. El objetivo de este estudio fue evaluar la bioaccesibilidad de compuestos fenólicos asociados a la fracción indigestible en fruto de guayaba (Psidium guajava L.) así como los metabolitos producto de la fermentación colónica de la fracción indigestible. Se observaron porcentajes similares de bioaccesibilidad en la guayaba entera (GC) (64.79%) y la guayaba sin semillas (GSS) (67.69%), y las tasas de liberación de CF fueron de 10.55 y 8.70 mg/min, respectivamente. La galocatequina fue el compuesto principal identificado en la fracción bioaccesible, y el guavina B fue el componente principal en la fracción no bioaccesible. La procianidina B y la guajaverina se detectaron por primera vez en GC y GSS. Estos datos muestran que los PC se liberan significativamente de la matriz de alimentos en ambas muestras, lo que les permite ser absorbidos en el intestino delgado. Se observó una mayor proporción de ciertos CF (guavina A o guavina B) en la fracción no bioaccesible de GC, lo que podría relacionarse con diferentes efectos biológicos.En la fracción indigestible soluble (SIF) el perfil de azúcares neutros fue arabinosa (46.11%), galactosa (20.09%), glucosa (14.74%) y xilosa (7.67%). En la fracción indigestible insoluble (IIF) se encontró xilosa (65.89%), arabinosa (16.65%), galactosa (7.26%) y glucosa (6.03%). Se identificaron a la procianidina B, la guajaverina, la quercetina y la geranina como los principales CF presentes en la FI. Los extractos de fermentación colónica muestran una producción significativa de AGCC de ácido acético y ácido propiónico, y en mayor medida de ácido butírico, en las primeras 12 h de fermentación. El mayor efecto antiproliferativo se observó en SG-12h y WG-24h. El consumo de toda la fruta de guayaba puede contribuir no solo a satisfacer los requerimientos diarios de consumo de fibra, sino que también podría contribuir a la salud del colon. Palabras clave: digestión in vitro, bioaccesibilidad, fermentación colonica, compuestos fenólicos.

2

ABSTRACT Blancas-Benitez, Francisco Javier. DCA National Technological Institute of Mexico, Technological Institute of Tepic. April 2018. Study of the bioaccesibility of phenolic compounds and metabolites of colonic fermentation in the guava fruit (Psidium guajava L.). Directora: Sáyago-Ayerdi Sonia G. Co-director: González-Aguilar Gustavo A. The peel and pulp of guava fruit are an excellent source of vitamins (A, C, thiamine, niacin and riboflavin), minerals (phosphorus, calcium and iron), dietary fiber and phenolic compounds (PC). Most PC identified in the guava pulp have also been detected in guava leaves; such compounds include hydrolysable tannins, guavin A, guavin B and quercetin. For its part, dietary fiber is part of the nondigestible fraction of food; it should be remarkerd that, in order to be healthy, the human microbiota needs to interact daily with 45-60 g of non-digestible substrates. Guava is consumed fresh and it is common to eliminate its seeds, which can constitute up to 10% of the total weight. This can affect the amount and type of CF ingested, while the CF not absorbed could have beneficial effects on the colon serving as a fermentable substrate for the colonica microbiota. The objective of this study was to evaluate the bioaccesibility of phenolic compounds associated with the indigestible fraction in guava fruit (Psidium guajava L.), as well as the metabolites produced during the colonic fermentation of the indigestible fraction. Similar percentages of bioaccesibility were observed in whole guava (WG) (64.79%) and seedless guava (SG) (67.69%), and PC release rates were 10.55 and 8.70 mg/min, respectively. Gallocatechin was the main compound identified in the bioaccessible fraction, and guavin B was the main component in the non-bioaccessible fraction. Procyanidin B and guajaverine were detected for the first time in WG and SG. These data show that PC are significantly released from the food matrix in both samples, allowing them to be absorbed in the small intestine. A higher proportion of certain PC (guavin A or guavin B) was observed in the non-bioaccessible fraction of WG, which could be related to different biological effects. In the soluble indigestible fraction (SIF) the profile of neutral sugars was arabinose (46.11%), galactose (20.09%), glucose (14.74%) and xylose (7.67%). In the insoluble indigestible fraction (IIF) was found xylose (65.89%), arabinose (16.65%), galactose (7.26%) and glucose (6.03%). The PC identified procyanidin B, guajaverine, quercetin and geranin as the main PC present in the IF. The extracts of colonic fermentation show a significant production of SCFA of acetic acid and propionic acid, and to a greater extent of butyric acid, in the first 12 h of fermentation. The highest antiproliferative effect was observed in SG-12h and WG-24h. The consumption of all the guava fruit can contribute not only to satisfy the daily requirements of dietary fiber consumption but could also contribute to colon health. Key words: in vitro digestion, bioaccessibility, colonic fermentation, phenolic compounds.

3

CONTENIDO

LISTA DE CUADROS 5

LISTA DE FIGURAS 6

INTRODUCCIÓN 7

CAPÍTULO 1 ANTECEDENTES 10 1.1 Generalidadesdelaguayaba(PsidiumguajavaL.) 10 1.2Produccióndeguayaba. 11

1.2.1 Mundial. 11 1.2.2 Nacional. 12 1.2.3 Estatal. 12

1.3Caracteristicasnutricionalesdelfrutodeguayaba. 12 1.4Compuestosdeinterésnutricionaldelfrutodeguayaba 14

1.4.1 Fibra dietética y fracción indigestible 14 1.4.2 Compuestos bioactivos 16

1.5Compuestosfenólicosasociadosalafracciónindigestible 17 1.6Bioaccesibilidaddecompuestosfenólicos 19

1.6.1 Efecto de la digestión sobre la fracción indigestible (FI) y compuestos fenólicos (CF).21 1.7Fermentacióncolónicadelafracciónindigestible. 24

CAPÍTULO 2 JUSTIFICACIÓN 31

CAPÍTULO 3 HIPÓTESIS 32

CAPÍTULO 4 OBJETIVOS 33 4.1OBJETIVOGENERAL 33

4.1.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS 33

CAPÍTULO 5 METODOLOGÍA 34 5.1Preparacióndelamuestra. 34 5.2MetodologíaEtapa1 34

5.2.1 Contenido de fenoles solubles totales (FST) de guayaba entera y guayaba sin semilla34 5.2.2 Identificación por HPLC-DAD-MS de compuestos fenólicos presentes en guayaba entera y guayaba sin semilla. 35 5.2.2 Aislamiento y cuantificación de fracción indigestible (FI) de guayaba entera (GE) y guayaba sin semilla (GSS). 36

4

5.2.3 Evaluación de azúcares neutros y ácidos urónicos en guayaba entera (GE), guayaba sin semilla (GSS) y en las fracciones indigestibles total (FIT), soluble (FIS) e insoluble (FII), de los frutos de guayaba 36

5.3MetodologíaEtapa2 37 5.3.1 Modelo de digestión in vitro y evalaución de bioaccesibilidad (%) en guayaba entera (GE) y guayaba sin semilla (GSS) 37 5.3.2 Cinética in vitro de la liberación de compuestos fenólicos (CF) en guayaba entera (GE) y guayaba sin semillas (GSS). 39

5.4MetodologíaEtapa3 40 5.4.1 Fermentación colónica in vitro de la fracción indigestible (FI) de guayaba entera (GE) y guayaba sin semilla (GSS). 40 5.4.2 Determinación de ácidos grasos de cadena corte (AGCC) en sobrenadantes de la fermentación de la fracción indigestible de frutos de guaba complete (GC) y sin semilla (GSS) 41 5.4.3 Identificación de compuestos fenólicos (CF) en sobrenadantes de la fermentación de la fracción indigestible de frutos de guaba complete (GC) y sin semilla (GSS) 43 5.4.4 Ensayo con lineas celulares 44

5.5Análisisestadístico 45

CAPITULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 47 6.1Evaluacióninvitrodelabioaccesibilidadylacinéticadelaliberacióndecompuestosfenólicosdelfrutodeguayaba(PsidiumguajavaL.). 47

6.1.1 Introducción al tema. 47 6.2Composicióndelamatrizdelfrutodeguayaba(PsidiumguajavaL.),efectosenlaproduccióndemetabolitosmicrobianosyefectosantiproliferativosencélulasHT-29,despuésdeunprocesodefermentacióninvitro 56

6.2.1 Introducción al tema. 56

CAPÍTULO 7 CONCLUSIONES 88

CAPITULO 8 BIBLIOGRAFÍA 89

5

LISTA DE CUADROS

Cuadro 1.1 Principales componentes de interés nutricional en guayaba. 11

Tabla 6.1.1 Bioaccesible, non-bioaccesible, and bioaccesibility percentage (%)

of phenolics compounds (PC) in whole guava and seedless guava, during in vitro

digestion

50

Tabla 6.1.2 Phenolic compounds released at each stage of in vitro digestion of

whole guava and seedless guava fruit

51

Tabla 6.1.3 Phenolic compounds profile in each time of phenolic compounds

release kinetics of whole guava and seedless guava fruit

52

Tabla 6.2.1 Total, soluble and insoluble indigestible fraction content of whole and

seedless guava

81

Tabla 6.2.2 Content of total sugars, uronic acid, neutral sugars profile and phenolic

compounds profile in samples of whole guava and seedless guava as is consumed

and, its indigestible, soluble and insoluble fractions

82

Tabla 6.3.3 Short-chain fatty acids production at 12, 24, 48 h of in vitro

fermentation of raffinose and indigestible fraction (IF) isolated from whole guava

(WG) and seedless guava (SG)

84

Tabla 6.3.4 Phenolic compounds identified in guava colonic fermentation

supernatants

85

6

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 Guayaba (Psidium guajava L.) 8

Figura 1.2 Tipos de interacciones entre compuestos fenólicos y fibra dietética 16

Figura 1.3 Mecanismos propuestos de escisión y reducción ocurridos durante

la bioconversión de compuestos fenólicos presentes en el fruto de guayaba 26

Figura 1.4 Mecanismos propuestos de hidrólisis y reducción ocurridos

durante la bioconversión de compuestos fenólicos presentes en el fruto de

guayaba

27

Figura 1.5 Mecanismos propuestos de hidrólisis, escisión y reducción

ocurridos durante la bioconversión de compuestos fenólicos presentes en el

fruto de guayaba.

28

Figura 6.1.1 In vitro digestion scheme to determine the bioaccessibility of PC 50

Figura 6.1.2 HPLC-DAD Chromatogram of phenolic compounds release

kinetics of whole guava and seedless guava 51

Figura 6.1.3 In vitro kinetics of total soluble pholyphenolsrelease of whole

guava and seedless guava

52

Figura 6.2.1 Changes in pH during the colonic fermentation 83

Figura 6.2.2 Antiproliferative effect of supernatants from fermentation of

whole guava and seedless guava at different fermentation times on HT-29 cell

lines

86

INTRODUCCIÓN

7

INTRODUCCIÓN

Una dieta adecuada y saludable, así como un estilo de vida activo son dos de los factores

que en los últimos años han sido asociados con la disminución de riesgo de padecer

enfermedades crónico degenerativas (Araújo, Gonçalves, & Martel, 2011). Son bien

conocidos los efectos benéficos que tiene el consumo de fibra dietaria (FD) proveniente de

frutas y vegetales en la salud digestiva. Aunque los mecanismos por los cuales se llevan a

cabo estos efectos no están completamente esclarecidos; se considera que los principales

compuestos de interés nutricional que conforman los frutos son la FD, vitaminas,

minerales, compuestos bioactivos como los compuestos fenólicos (CF), fitoesteroles y

carotenos; una combinación de estos componentes pueden tener un efecto aditivo y/o

sinérgico en las propiedades saludables que se atribuyen a los vegetales (Ajila & Prasada

Rao, 2013; Liu, 2003; Quirós-Sauceda et al., 2014).

La mayoría de los estudios realizados en frutos se centran únicamente en la cuantificación

de FD y CF. Otros trabajos destacan el efecto de la adición de FD en diversos alimentos o

los efectos saludables de éstos. Sin embargo, tanto FD como CF generalmente son

estudiados de manera separada y la abundante literatura en esta área no ha establecido una

relación entre estos dos compuestos, probablemente debido a sus diferencias estructurales,

fisicoquímicas y biológicas (Quirós-Sauceda et al., 2014; F Saura-Calixto, 2011). Por lo

cual no se ha establecido una relación directa entre ambos componentes, a pesar de que

ambos son consumidos de manera conjunta en la matriz del fruto.

INTRODUCCIÓN

8

Por su parte, la FD es un concepto nutricional en el que se mezclan consideraciones

botánicas, químicas y fisiológicas. La FD no se considera como entidad sino como un

término colectivo de una compleja mezcla de sustancias con diferentes propiedades

químicas y físicas que ejercen distintos tipos de efectos fisiológicos (Lunn & Buttriss,

2007). Desde el punto de vista fisiológico el concepto de FD es limitado por ello existe un

concepto complementario conocido como fracción indigestible (FI), el cual fue definido

por Saura-Calixto y cols. (2000). En este concepto se consideran además de los

polisacáridos no amiláceos que no son digeridos por las enzimas del intestino delgado, los

compuestos asociados a la FD como son proteína resistente y compuestos bioáctivos que

sirven de sustrato a la microbiota colónica y tienen una relevancia fisiológica por los

metabolitos que pueden sintetizarse.

Asimismo, hoy en día el estudio de los frutos tropicales como la guayaba, como fuente de

CF y FD ha cobrado mayor interés (De Souza, Pereira, Queiroz, Borges, & De Deus

Souza Carneiro, 2012; Dembitsky et al., 2011; Moo-Huchin et al., 2014), debido a que el

perfil de CF que presentan estos mejoran el estado antioxidante y producen diversos

metabolitos con posibles efectos beneficos, (Garcia et al,.2017)

La guayaba (Psidium guajava L) es una fruta tropical, la cual es consumida sobretodo en

fresco. Se ha observado que este fruto tiene alto contenido de algunos compuestos

importantes desde el punto de vista nutricional como son la FD y los PF (Jiménez-Escrig,

Rincón, Pulido, & Saura-Calixto, 2001).

INTRODUCCIÓN

9

A nivel mundial se producen 1.2 millones de Ton del fruto de guayaba (Psidium guajava

L), India y Pakístan aportan el 50%, y México aporta el 25% de la producción mundial

(SIAP, 2014). Este fruto es considerado nativo de México (Rios y cols., 1977), y destaca

por su alto valor nutritivo, excelente fuente de Vitaminas A, C, tiamina, niacina y

riboflavina; así como de minerales como fósforo, calcio y hierro (Medina y Pagano, 2003)

y específicamente en FD se ha reportado que contiene hasta un 61.9 % (Martínez y cols.,

2012) de la composición del fruto, así como CF en un 5.5 g Equivalentes de Ácido Gálico

(EAG) /100 g (Mahattanatawee y cols., 2006).

Sin embargo, se conoce poco acerca de la bioaccesibilidad que presentan los CF del fruto,

el tipo de CF que están asociados a la fracción no digestible y los posibles metabolitos

producidos durante la fermentación colónica de las fracciones indigestibles los cuales

podrían tener efectos saludables a nivel digestivo en especial en el colon.

CAPÍTULO 1 ANTECEDENTES

10


1.1 Generalidades de la guayaba (Psidium guajava L.)

El fruto de guayaba (Psidium guajava L.), es considerado nativo de México (Rios y cols.,

1977) se extiende y cultiva por toda la región de América del Sur, Europa, África y Asia.

Crece en todas las zonas tropicales y subtropicales, se adapta a diferentes condiciones

climáticas, pero se desarrolla preferentemente en climas secos (Stone, 1970). Pertenece a

la familia Myrtaceae, es un árbol que tiene una altura aproximada de 10 m, es delgado,

liso y de corteza irregular. Las hojas son cortas, pecioladas, el óvalo de la cuchilla con

prominentes venas pinnadas de 5-15 cm de largo. Las flores son poco vistosas, pétalos

blanquecinos de hasta 2 cm de longitud y numerosos estambres (Stone, 1970). Los frutos

son redondos a ovoides, carnosos de color amarillo de unos 5 cm de diámetro con un

mesocarpio comestible de color rosa o blanco que contiene pequeñas semillas (Figura

2.1). El sabor va desde ácido hasta muy dulce y el olor fuerte y penetrante hasta el débil y

agradable (Adsule & Kadam, 1995).

En México las tres principales variedades del fruto son: ‘Media China’, ‘China’ y criolla.

La variedad ‘Media China’ es de forma ovoide, de pulpa color crema, sabor agradable y

tamaño regular (de 5 a 6 cm de diámetro y peso de 100 a 140 g de los frutos clasificados

como calidad extra) (Figura 1.1). La variedad “Media China”, tiene bastante aceptación en

el mercado, por lo que ha llegado a establecerse en el 90 % de las huertas.


11

La variedad ‘China’ es un fruto pequeño, de forma redonda y generalmente de mucha

consistencia; la pulpa es de color crema y tiene abundante semilla. Este tipo se destina

para la industria, pero su tendencia es a desaparecer por su poca aceptación. La variedad

criolla se clasifica por tamaño y forma encontrándose frutos con pulpa de color blanca,

rosada y salmón (Martínez-De Lara et al., 2004). La guayaba se consume fresca y es

común eliminar sus semillas, que pueden constituir hasta 10% del peso total. Esto podría

afectar la cantidad y el tipo de compuestos ingeridos en el fruto

Figura 1.1 Guayaba (Psidium guajava L.) variedad media china

1.2 Producción de guayaba.

1.2.1 Mundial.

México, según el Consejo Mexicano de la Guayaba participa en la producción mundial

con el 25.0%. Los principales productores son la India y Pakistán, con el 50 % de la

producción (SIAP, 2017).


12

1.2.2 Nacional.

En nuestro país el estado de Michoacán, junto con los estados de Aguascalientes,

Zacatecas, Jalisco, México y Guerrero son los principales productores de Guayaba,

alentados por la proximidad a los grandes mercados como Estados Unidos, Ciudad de

México y Guadalajara en el Occidente del país, el estado de Nayarit ocupa el séptimo

lugar en producción de este fruto (SIAP, 2017).

1.2.3 Estatal.

En el 2017 según datos del SIAP en el cual el municipio de Santa María del Oro ocupa el

primer lugar de producción estatal, seguido por los municipios de Ixtlán del rio y Jala

(SIAP, 2017).

1.3 Caracteristicas nutricionales del fruto de guayaba.

La importancia del fruto de guayaba, no solo radica en su agradable olor y sabor, sino en

que es una fuente importante de distintos nutrientes; en el Cuadro 1.1 se muestra el

contenido de componentes nutricionales en promedio por 100 g de fruto de guayaba. La

composición nutricional de la guayaba varía entre cultivares; dentro de su composición

destaca el contenido de carbohidratos los cuales representan poco mas del 14 % en peso de

la fruta.


13

Además de presentar cantidades importantes de vitaminas, principalmente vitamina C

(ácido ascórbico), una sola fruta de guayaba común puede contener alrededor de cuatro

veces la cantidad de vitamina C que contiene una naranja (Lim, Lim, & Tee, 2007;

Medina & Pagano, 2003).

Cuadro 1.1 Principales componentes de interés nutricional en el fruto de guayaba.

Determinación Contenido (%)

Humedad 73.5

Carbohidratos 14.8

Fibra dietética 7.0

Proteína 1.0

Lípidos 0.7

Minerales (mg)

Hierro 0.4

Potasio 352.7

Vitaminas

Vitamina A (µg ER) 39.7

Ácido ascórbico 227.3

(Muñoz de Chávez et al., 2002)


14

1.4 Compuestos de interés nutricional del fruto de guayaba

1.4.1 Fibra dietética y fracción indigestible

Además de ser fuente de distintos nutrientes, la guayaba también es fuente importante de

FD. La FD es un componente importante de los alimentos vegetales, y el interés por su

estudio en la nutrición y la salud es ampliamente reconocido. Se define como los

“Polímeros de carbohidratos con diez o más unidades monoméricas que no son

hidrolizados por las enzimas endógenas en el intestino delgado humano” (McCleary et al.,

2010).

Estos componentes no son ni degradadados ni absorbidos durante su paso a través de la

parte superior del tracto gastrointestinal, y pueden ejercer efectos nutricionales

importantes además de retardar el vaciado gástrico y disminuir o retardar la absorción de

nutrientes en el intestino delgado ejerciendo un efecto de atrapamiento, lo que impide la

acción de las enzimas digestivas sobre los mismos (Brownlee, Dettmar, Strugala, &

Pearson, 2006).

Si bien la fibra es uno de los compuestos mayoritarios en el fruto de guayaba, lo cual

puede tener efectos benéficos en los consumidores de dicho fruto, existen otros

componentes minoritarios los cuales pueden contribuir y/o incrementar dichos efectos

benéficos (González-Aguilar, Blancas-Benitez, & Sáyago-Ayerdi, 2017).


15

Desde el punto de vista fisiológico el concepto de FD es limitado ya que solo considera en

su definición a los polisacáridos no amiláceos (PNA) y lignina, sin tomar en cuenta todos

aquellos componentes de los alimentos que, al no ser digeridos en el intestino delgado

(ID) pueden alcanzar el colon.

El concepto de fracción indigestible (FI) considera, además de los PNA y lignina que se

incluyen en la definición de FD, aquellos compuestos asociados a la FD como son

proteína resistente y CF (Fulgencio Saura-Calixto, García-Alonso, et al., 2000), los cuales

como se explicó previamente, pueden encontrarse unidos mediante diversos enlaces a la

fracción de FD, por lo que pueden alcanzar el colon y servir de sustrato a la microbiota.

Este concepto por tanto cobra relevancia fisiológica debido a los metabolitos que llegan a

sintetizarse producto de la fermentación colónica, así como por el estatus antioxidante que

proporcionan al medio al estar disponibles en el colon (Mosele, Macià, Romero, Motilva,

& Rubió, 2015; C. Renard, Watrelot, & Le Bourvellec, 2017).

Para el fruto de guayaba, Jiménez-Escrig y cols., (2001) reportaron valores de fracción

indigestible total para piel y pulpa de 61.6 y 57.4 % respectivamente. Sin embargo, hasta

ahora no se conoce cuáles son los carbohidratos que componen la FI en guayaba ni las

posibles interacciones que pudiesen existir entre estos componentes de la FI y los CF,

presentes en el fruto, lo cual podría afectar la bioaccesibilidad de los CF del fruto de

guayaba.


16

1.4.2 Compuestos bioactivos

Los frutos como la guayaba, contienen compuestos fitoquímicos minoritarios, los cuales

no son nutrientes, denominados compuestos bioáctivos, y se definen por tener las

siguientes características: estar presentes en bajas concentraciones, no se consideran hasta

ahora nutrientes y tienen un probado efecto positivo en la salud (Hervert-Hernández,

García, Rosado, & Goñi, 2011; Wang, Li, & Bi, 2017). Dentro de este grupo de

compuestos se encuentran los compuestos fenólicos (CF), los cuales, son metabolitos

secundarios naturales de las frutas y los vegetales (Tokusoglu & Hall, 2011).

1.4.2.1 Compuestos fenólios (CF).

Los CF han sido ampliamente estudiados, esto debido a que son los compuestos bioactivos

más abundantes en alimentos vegetales, sus estructuras son diversas y pueden ser

clasificadas en diferentes grupos en función de sus componentes fenólicos, ya sean ácidos

fenólicos, flavonoides, lignanos y estilbenos, proantocianidinas, entre otros (Tokusoglu &

Hall, 2011).

Por su solubilidad en solventes acuosos u orgánicos, pueden clasificarse como CF solubles

o extraíbles y CF no extraíbles (Bravo, 1998). Además de esta diversidad de estructuras,

pueden estar asociados con carbohidratos (simples o complejos), o estar unidos a los

componentes de la pared celular (celulosa, hemicelulosa o lignina) (Quirós-Sauceda et al.,

2014).


17

El árbol de guayabo, incluido sus hojas, tallos y fruto, ha sido objeto de estudio en función

del contenido de CF y actividad antioxidante que presentan (Jiménez-Escrig et al., 2001).

Se han identificado en las hojas del árbol de guayaba compuestos como guavina A y

guavina B, guajaverina y algunos derivados de la quercetina, los cuales están relacionados

con efectos saludables (Cerdá, Tomás-Barberán, & Espín, 2005; Díaz-de-Cerio, Gómez-

Caravaca, Verardo, Fernández-Gutiérrez, & Segura-Carretero, 2016; Holt, Heiss, Kelm, &

Keen, 2012). El fruto de guayaba contiene ácido gálico, elágico y quercertina

(Mahattanatawee et al., 2006); sin embargo, poco se conoce sobre la cantidad y tipo de

compuestos que pueden estar bioaccesibles para ser utilizados por el organismo, después

de ingerido el fruto.

1.5 Compuestos fenólicos asociados a la fracción indigestible

Los frutos son matrices muy complejas dentro de las cuales pueden existir distintas

interacciones entre sus componentes, tanto la FD como los CF son dos constituyentes de

los frutos que se han estudiado por separado y que presentan diferentes propiedades

funcionales (Quirós-Sauceda et al., 2014). Los CF presentes en vegetales pueden estar

unidos a la matriz de FD ya sea a las fracciones soluble o insoluble mediante enlaces

covalentes o interacciones hidrofóbicas (Saura-Calixto, 2011). Los CF poseen tanto

anillos hidrofóbicos como hidrofílicos con grupos hidroxilos que presentan la habilidad de

ligarse a polisacáridos, proteínas o diversos sitios en la pared celular (Saura-Calixto,

2011).


18

Los CF pueden unirse a la FD mediante enlaces de puente hidrógeno, fuerzas

electrostáticas o de Van der Waals o a través de enlaces éster entre los ácidos fenólicos y

los polisacáridos (Parada & Aguilera, 2007).

Esto es importante desde el punto de vista nutricional, ya que los componentes asociados a

la FD pueden ser responsables de algunos beneficios que tradicionalmente se han

atribuido únicamente a FD (Sáyago-Ayerdi & Goñi, 2010).

La presencia de CF asociados a la FD es una característica común en los alimentos

vegetales ricos en CF, como las frutas (Pérez-Jiménez et al., 2008). El complejo grupo de

polisacáridos que forman a la FD puede actuar atrapando los CF o bien formando

interacciones químicas con ellos produciendo un efecto de acarreamiento de los CF a lo

largo de tracto gastrointestinal (Saura-Calixto, 2011).

Los compuestos fenólicos más abundantes vinculados a la fibra dietética pertenecen a la

clase química de los ácidos hidroxicinámicos. En los frutos, estos tipos de compuestos son

principalmente taninos poliméricos, y después de la hidrólisis los compuestos fenólicos

más comunes son los ácidos gálico y elágico (Arranz, Saura-Calixto, Shaha, & Kroon,

2009).

A través de esta relación, se estima que alrededor de 2.5% del contenido de fibra dietética

presente en las frutas se asocia con compuestos fenólicos (Saura-Calixto, 2011). Los CF

asociados a la FD pueden constituir una parte sustancial del total de CF en alimentos y

bebidas. Estos CF no son bioaccesibles y por lo tanto tampoco son biodisponibles en la


19

parte superior del intestino delgado humano, sin embargo, estos compuestos asociados a la

FD pueden llegar al colon, donde se convierten en sustratos fermentables para la

microbiota, junto con la FD (Blancas-Benitez et al., 2015; Velderrain-Rodríguez et al.,

2014). La fermentación de los CF en el colon mejora el estado antioxidante y produce

diversos metabolitos con posibles efectos sistémicos (Mosele et al., 2015).

1.6 Bioaccesibilidad de compuestos fenólicos

Las posibles interacciones que pueden ocurrir entre FI y CF durante el proceso digestivo,

pueden afectar principalmente la bioaccesibilidad y por ende la biodisponibilidad de los

CF de los frutos (Blancas-Benitez et al., 2015). Para ejercer su actividad biológica de

absorción y metabolismo de los CF, debe tomarse en cuenta la acción de las enzimas

digestivas que afectan su biodisponibilidad (Crozier, Jaganath, & Clifford, 2009). La

mayoría de los CF son poco absorbidos en el ID, ya que son altamente metabolizados o

rápidamente eliminados (Manach, Williamson, Morand, Scalbert, & Rémésy, 2005).

La bioaccesibilidad se define como la cantidad de un componente del alimento que está

presente en el intestino humano, como consecuencia de su liberación de la matriz del

alimento, y que puede ser capaz de atravesar la barrera intestinal (Shim, Ferruzzi, Kim,

Janle, & Santerre, 2009), mientras que la biodisponibilidad se define como la cantidad de

un compuesto que se absorbe y puede ejercer los efectos beneficiosos que se le atribuyen

(Holst & Williamson, 2008). Al respecto, el rendimiento exacto y la proporción de CF que

serán absorbidos dependerán no únicamente del perfil genético del individuo, sino

también de la composición y competencia de la microbiota del individuo.


20

Cuando los CF de la dieta son absorbidos en el ID, son modificados y conjugados para ser

sulfatados, glucosilados o metilados (Espín, González-Sarrías, & Tomás-Barberán, 2017).

Las agliconas y algunos glucósidos pueden ser transportados al interior del enterocito por

el transportador de glucosa Na-dependiente (SGLT1) donde son hidrolizados por las β-

glucosidasas o las lactasas floricidin hidrolasas (Crozier et al., 2009).

Algunos informes han puesto de manifiesto la mala biodisponibilidad de varios grupos de

CF, que se refleja, por ejemplo, en una baja concentración en plasma (Espín et al., 2017;

Manach & Donovan, 2004). La biodisponibilidad de los CF depende de varios factores,

incluyendo la liberación desde la matriz durante la digestión gastrointestinal, es decir, la

bioaccesibilidad, la absorción celular, el metabolismo y el transporte adicional en el

sistema circulatorio (Blancas-Benitez et al., 2015; González-Aguilar et al., 2017).

Las sustancias que se encuentran principalmente en el intestino delgado y que son

extraíbles (Hinsberger & Sandhu, 2004), constituyen la fracción bioaccesible soluble en el

medio del tracto gastrointestinal, mientras que los compuestos no liberados (fracción no

bioaccesible) llegan al colon (Cilla, González-Sarrías, Tomás-Barberán, Espín, & Barberá,

2009; Tagliazucchi, Verzelloni, Bertolini, & Conte, 2010).

La bioaccesibilidad y biodisponibilidad difieren sustancialmente de un CF a otro, por lo

tanto, el CF más abundante en la dieta no necesariamente podría ser el mayormente

absorbido, y por ende el que ejerza un efecto benéfico en el organismo. Los CF asociados

a la FI, no están biodisponibles en el ID humano (Blancas-Benitez et al., 2015; Mercado-

Mercado et al., 2015). Por lo cual llegan al colon en asociación con la FI, donde se


21

convierten en sustratos fermentables para la microbiota, junto con los hidratos de carbono

no digeribles y proteínas resistentes, mientras que los CF no fermentados permanecen en

el lumen del colon, donde pueden contribuir a un medio ambiente antioxidante al eliminar

los radicales libres y contrarrestar los efectos de los compuestos pro-oxidantes de la dieta

(Espín et al., 2017).

Tanto la bioaccesibilidad como la biodisponibilidad de los CF presentes en la matriz

alimentaria dependen mayormente de los cambios que ocurren en la matriz alimentaria

durante el proceso de digestión.

1.6.1 Efecto de la digestión sobre la fracción indigestible (FI) y compuestos fenólicos

(CF).

El tracto gastrointestinal humano puede considerarse como un extractor, en donde la

masticación y la acción química durante la fase de digestión, contribuyen a la extracción

de CF de las matrices sólidas como las frutas (Lafay & Gil-Izquierdo, 2008). Dentro de la

matriz alimentaria, los CF se encuentran principalmente ligados a los carbohidratos

pertenecientes a la FI. En el caso de los CF mas simples, como los ácidos fenólicos, se

encuentran usualmente unidos mediante enlaces covalentes con los carbohidratos de la

pared celular de las plantas, formando principalmente, enlaces éster con la arabinosa que

forma parte de la hemicelulosa (Quirós-Sauceda et al., 2014; Velderrain-Rodríguez et al.,

2014).


22

Por su parte, otros CF complejos como las antocianinas, tienden a acumularse en las

vacuolas, mientras que los flavonoides permanecen en el citoplasma, principalmente en

forma libre (Jiang et al., 2013). Por lo cual para que se lleve a cabo la posterior absorción

de los CF presentes en la matriz alimentaria, se requiere la ruptura total de la pared celular

y la liberación de los CF asociados a los polisacáridos de la FI (Pineda-Vadillo et al.,

2017).

La digestión comienza en la cavidad oral, donde la amilasa es la enzima predominante,

aunque debido al corto tiempo de interacción entre ésta y la matriz alimentaria, su efecto

sobre la liberación de CF es muy bajo (Laurent, Besançon, & Caporiccio, 2007), sin

embargo, es aquí donde se lleva a cabo un proceso importante de reducción del tamaño de

partícula, lo cual garantiza una mejor acción de las enzimas que participan en las etapas

posteriores de la digestión (Lemmens, Van Buggenhout, Van Loey, & Hendrickx, 2010).

En particular, la acción mecánica de la masticación influye en la degradación de las

células de las frutas con la liberación de los CF contenidos en las vacuolas y los asociados

a la pared celular (Crozier et al., 2009).

La mayor parte de los CF presentes en la matriz del alimento, son liberados durante la fase

gástrica de la digestión (Saura-Calixto, 2011). En esta etapa, la digestión con pepsina en

conjunto con el pH bajo en el estómago y los movimientos peristálticos, dan como

resultado una reducción aun mayor en el tamaño de partícula de la matriz del alimento

(Meyer, 1980).


23

La liberación de los CF presentes en la matriz alimentaria, ocurre por solubilización

directa o por acción de las enzimas digestivas que hidrolizan los enlaces no covalentes

entre los grupos hidroxilo de los CF y los grupos polares de las moléculas de los

polisacáridos (Palafox-Carlos, Ayala-Zavala, & González-Aguilar, 2011). Esto depende

del tipo de CF, p.e. la quercertina, daidzeína, genisteína, ácidos fenólicos o ácidos

clorogénicos, pueden ser absorbidos directamente en el estómago, pero no así sus

glucósidos (Espín et al., 2017; Manach & Donovan, 2004).

El paso a la siguiente etapa de la digestión, desde el estómago hacia el intestino delgado,

incluye un incremento en el pH, desde aproximadamente un pH de 2 hasta un pH de

aproximadamente 7, este cambio de pH induce la secreción de diversas enzimas desde el

páncreas, las cuales incluyen amilasas y lipasas (Alminger et al., 2014). Después de la

liberación de los CF, por acción de las enzimas intestinales, en sus respectivas agliconas,

estos compuestos pueden ser absorbidos por los enterocitos, mediante dos mecanismos. El

primero de ellos es mediante difusión pasiva, el cual es el mecanismo de absorción mas

común para compuestos de menor peso como los ácidos fenólicos y algunas agliconas de

flavonoides (Terao, 2017), mientras que el segundo es la difusión facilitada o transporte

activo, en el cual intervienen algunas proteínas transportadoras especialmente el

transportador de glucosa dependiente de sodio (SGLT1) (Walle & Walle, 2003; Wolffram,

Blöck, & Ader, 2002), y es el mecanismo por el cual son absorbidos varios flavonoides y

sus glucósidos.

Los compuestos que no son absorbidos en el ID, principalmente los CF asociados a la

FDI, llegarían al intestino grueso donde puede ocurrir un rompimiento de algunos CF


24

conjugados, liberando los correspondientes ácidos fenólicos o bien ser transformados por

la microbiota colónica liberando catabolitos no fenólicos, los cuales dependerán del tipo

de la estructura de los CF (Espín et al., 2017). Por su parte la FI resiste todo el proceso

digestivo antes descrito, y se ha observado que tiene un efecto en diferentes aspectos

gastrointestinales (movilidad y el tiempo de tránsito, estreñimiento, etc.), caracteristicos

del consumo de FD (Van der Kamp, 2010). Además, uno de los principales papeles de la

FI es proporcionar sustratos para la fermentación por las bacterias en el intestino grueso,

lo que da lugar a la producción de diversos compuestos finales (acetato, propionato, y

butirato, amoníaco, gases, H2, CO2, aminas, fenoles), energía y biomasa (Mosele et al.,

2015; Sáyago-Ayerdi, Zamora-Gasga, & Venema, 2017; Victor Manuel Zamora-Gasga et

al., 2017).

Este proceso también hace posible una función que es esencial para el ecosistema

intestinal: el mantenimiento de la microbiota del colon y el mejoramiento del sistema

inmunológico (Sáyago-Ayerdi et al., 2017).

1.7 Fermentación colónica de la fracción indigestible.

Es ampliamente conocido que para que la microbiota humana tenga un optimo desarrollo,

debe de interaccionar diariamente con 45 - 60 g de substratos no digestibles procedentes

en su mayor parte de la dieta (Jonathan et al., 2012). Sin embargo, la ingesta de sustratos

no digeribles puede ser menor entre las personas que siguen una dieta occidental, lo que

implica un posible déficit en la cantidad de substratos disponibles para la microbiota, con


25

graves consecuencias sobre el mantenimiento de un óptimo crecimiento y equilibrio de las

especies bacterianas (Bingham et al., 2003).

Uno de los efectos fisiológicos que más se atribuye a la FD que forma parte de la FI,

especialmente a la fracción soluble es el papel quimioprotector que pueden ejercer los

compuestos producto de la fermentación colónica, como son los ácidos grasos de cadena

corta (AGCC) tales como acético, propiónico y butírico, los cuales actúan disminuyendo

el pH del colon, inhibiendo el desarrollo de patógenos potenciales y disminuyendo la

solubilidad de ácidos biliares en el colon, lo que trae como consecuencia una disminución

en la probabilidad de desarrollar cáncer de colon (Koh, De Vadder, Kovatcheva-Datchary,

& Bäckhed, 2016; Ríos-Covián et al., 2016).

Particularmente, el ácido acetico se absorbe rápidamente y se transporta al hígado, donde

puede ejercer efectos beneficiosos tales como la inducción de la síntesis de glutation-S-

transferasa y otros genes de respuesta al estrés (Pool-Zobel, Veeriah y Böhmer, 2005).

El ácido butírico es el sustrato preferido por los colonocitos y regula la proliferación y

diferenciación celular y puede servir como fuente de energía para el crecimiento de las

células epiteliales colónicas (Sengupta, Muir y Gibson, 2006).

Además, el ácido butírico induce la apoptosis y previene la proliferación de células

tumorales, reduciendo o previniendo la formación de tumores malignos (Fåk et al., 2015).

Por su parte al ácido propiónico se le han atribuido propiedades beneficiosas como fuente

de energía para el crecimiento de las células epiteliales del colon y estimulan la apoptosis

de las células del carcinoma colorrectal (Geier, Butler, y Howarth, 2006).


26

El grado de fermentabilidad depende en mucho del tipo de alimento vegetal y su

composición en FD, ya que no todas las fibras producen la misma cantidad de AGCC

(Zamora-Gasga et al., 2015). En experimentos in vitro, la mayoría de los sustratos

fermentables producen acetato, como producto final, pero las cantidades de propionato y

butirato son variables de unos a otros (Aguirre et al., 2016). Asimismo, no se puede dejar

de lado que estos compuestos pueden interactuar con otros componentes presentes en la

mucosa colónica. Por lo que los efectos benéficos no son sólo consecuencia de la cantidad

de FI presente, sino más bien de la composición que presentan la FI en cuestión (Ferguson

y cols., 2005) y de las interacciones entre la FI y otros compuestos como los CF los cuales

puedan llegar al colon y servir de sustrato fermentable (Espín et al., 2017).

Por su parte, otros CF complejos de alto peso molecular presentes en los alimentos

vegetales conocidos como polifenoles hidrolizables (PH) y proantocianidinas o taninos

condensados (TC), al igual que los CF asociados a la FD, no son absorbidos en el ID y

pasan directamente al colon donde pueden estar presentes en concentraciones de cientos

de micromoles/L junto con algunso carotenoides, lo que tieneimportancia biológica

(Renard, Watrelot, & Le Bourvellec, 2017).

Los CF no fermentados permanecen en el lumen del colon, donde pueden contribuir a un

medio ambiente antioxidante al eliminar los radicales libres y contrarrestar los efectos de

los compuestos pro-oxidantes de la dieta (Espín et al., 2017; Manach et al., 2005). Si bien

la fermentación colónica puede disminuir la biodisponibilidad de los CF en su forma

nativa, durante esta se generan distintos metabolitos los cuales pueden tener mayor

actividad biológica que los CF en su forma nativa (Monagas et al., 2010). En general,


27

estos metabolitos dependen de la estructura de los CF fermentables, como en el caso de la

fermentación del compuestos giajaverina, puede sufrir procesos de hidrólisis, escisión y

reducción, para producir ácido hidroxifenilpropionico, o para la quercetina, la cual puede

sufrir procesos de escisión y reducción hasta obtener compuestos como el ácido

hidroxifenilácetico (Figura 1.3) (Espín et al., 2017).

Figura 1.3 Mecanismos de bioconversión propuestos para guajaverina y quercetina,

presentes en la fracción indigestible del fruto de guayaba.


28

Este tipo de procesos de bioconversión pueden llevarse a cabo en distintos compuestos

complejos identificados en el fruto de guayaba, como la geranina, compuesto que puede

sufrir hidrólisis o escisiones para obtener compuestos como, eñ ácido gálico o

protocateico (Figura 1.4) (Espín et al., 2017).

Figura 1.4 Mecanismos de bioconversión propuestos para geranina presente en la fracción

indigestible del fruto de guayaba.


29

Otro de los CF identificados en el fruto de guayaba es la procianidina B, el cual podría

sufrir algunos procesos de bioconversión como hidrólisis, escisión y reducción, hasta

obtener compuestos como los ácidos hidroxibenzoico y protocateico (Figura 1.5) (Espín et

al., 2017).

Figura 1.5 Mecanismos de bioconversión propuestos para procianidina B, presente en la

fracción indigestible del fruto de guayaba.


30

A pesar de que existen trabajos en los cuales se ha caracterizado el contenido de CF y de

FI en la guayaba, no existen estudios realizados sobre los posibles productos que se

pueden generar durante la fermentación colónica de ambos componentes, al consumir las

matrices del fruto completas, incluyendo la fracción indigestible y los CF asociados a la

misma.

CAPÍTULO 2 JUSTIFICACIÓN

31

CAPÍTULO 2 JUSTIFICACIÓN

Estudios epidemiológicos indican que el consumo frecuente de frutas está asociado con un

menor riesgo de algunas enfermedades como el cáncer, entre otras. Sin embargo, los

constituyentes específicos responsables de este efecto siguen siendo difícilmente

identificables. La fracción indigestible (FI), y los compuestos antioxidantes de alimentos

de origen vegetal, podrían ser los responsables de estos efectos, típicamente atribuidos a el

consumo de frutas. La guayaba (Psidium guajava L.) es una importante fruta tropical, que

es principalmente consumida en fresco. Este fruto es fuente importante de FD y CF, por lo

cual surge el interés de analizar la bioaccesibilidad de los CF que se encuentran asociados

a la FI de la guayaba, así como el efecto que el consumo de esta fruta tiene sobre la

producción de metabolitos durante la fermentación colónica los cuales pueden tener

efectos beneficiosos sobre la salud.

CAPÍTULO 3 HIPOTESIS

32

CAPÍTULO 3 HIPÓTESIS

La fracción indigestible y los compuestos fenólicos asociados a la misma de fruto de

guayaba entera y sin semilla, producirán distintos metabolitos durante la fermentación

colónica con potenciales efectos beneficiosos para la salud del colon.

CAPÍTULO 4 OBJETIVOS

33

CAPÍTULO 4 OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la bioaccesibilidad de compuestos fenólicos asociados a la fracción indigestible en

fruto de guayaba (Psidium guajava L.) entera y sin semilla, así como los metabolitos

producto de la fermentación colónica de la fracción indigestible de ambas muestras.

4.1.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Caracterizar y cuantificar los compuestos fenólicos, polisacáridos no amiláceos

(PNA) y la fracción indigestible, en muestras de guayaba entera y sin semilla.

2. Evaluar la bioaccesibilidad de compuestos fenólicos asociados a la fracción

indigestible (soluble e insoluble) en muestras de guayaba entera y sin semilla.

3. Identificar y cuantificar los productos de la fermentación colónica de la fracción

indigestible (soluble, insoluble y total) de muestras de guayaba entera y sin semilla

y evaluar sus efectos sobre líneas celulares de cáncer de colon HT-29.

CAPÍTULO 5 METODOLOGÍA

34


5.1 Preparación de la muestra.

Los frutos de guayaba se obtuvieron de un mercado local en Tepic, Nayarit, México y se

dividieron en dos lotes de 30 frutas. El primer lote correspondió a guayaba entera (GE)

(pulpa, cáscara y semillas), y el segundo a guayaba sin semillas (SG) (pulpa y cáscara).

Para garantizar la homogeneidad de la muestra, ambos grupos de muestras se liofilizaron

(LABCONCO, Freezone, EE. UU.), Molido (Nutribullet, NBR-0804B, EE. UU.), Se

tamizaron (0.5 μm) y se almacenaron en bolsas selladas a -20°C hasta el análisis. Por lo

tanto, las muestras liofilizadas de guayaba entera contienen todas las partes de la fruta,

incluyendo pulpa, cáscara y semilla, mientras que las muestras liofilizadas de guayaba sin

semillas contienen solamente pulpa y cáscara de guayaba.

5.2 Metodología Etapa 1

5.2.1 Contenido de fenoles solubles totales (FST) de guayaba entera y guayaba sin

semilla

Para la cuantificación de FST, se realizó una extracción acuosa orgánica en las muestras

con una solución de metanol-agua acidificada (0.8% de HCl 2 N) (50: 50 v / v) y una

solución de agua con acetona (80: 20 v / v) (Pérez-Jiménez et al., 2008). Los contenidos

de FST se determinaron de acuerdo al método propuesto por Montreau (1972) con algunas


35

modificaciones, A continuación, se mezclaron 250 μL de muestra con 1000 μL de

carbonato de sodio (7.5% p / v) y 1250 μL de reactivo de Folin-Ciocalteu. Posteriormente,

se midió la absorbancia de cada muestra a 750 nm usando un lector de microplacas de 96

pocillos (Bio-Tek®, Synergy HT, Winooski, VT, EE. UU.) Con el software Gen5. Se usó

ácido gálico como estándar (Sigma-Aldrich), y los resultados se expresan en mg de

equivalentes de ácido gálico (g GAE / 100 g DW).

5.2.2 Identificación por HPLC-DAD-MS de compuestos fenólicos presentes en guayaba

entera y guayaba sin semilla.

La identificación de los CF presentes en el fruto de guayaba se llevó a cabo utilizando un

HPLC Agilent serie 1260 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) acoplado a

un detector de arreglo de diodos (UV-Vis) (DAD). Las muestras se inyectaron (10 μL,

velocidad de flujo 0.4 mL/min) en una columna Poroshell 120 EC-C18 (4.6 mm x 150

mm, tamaño de partícula 2.7 μm) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). La

elución en gradiente se llevó a cabo usando agua que contenía ácido trifluoroacético al 1%

(Sigma Aldrich) como disolvente A, acetonitrilo (Sigma Aldrich) como disolvente B, y se

aplicó como sigue: 0 min, 5% de B; 10 min, 23% de B; 15 minutos, 50% de B; 20 min,

50% de B; 23 min, 100% B; 25 min, 100% B; 27 minutos, 5% de B, 30 minutos, 5% B. La

detección en el DAD se realizó a 280-320 nm. Para el ensayo de MS, se utilizó un sistema

HPLC Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) acoplado a un detector

de masas simple cuadrupolo Agilent 6120 , (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.

UU.), equipado con una interfaz de ionización por electrospray, en modo de ionización

negativa con las siguientes condiciones: flujo de gas de secado (N2), 13.0 L/min; presión


36

del nebulizador, 40 psi; temperatura de secado del gas, 350°C; tensión capilar, 3500 V; y

rango de exploración, m/z 100-1000. El análisis de datos se realizó con el software

OpenLab CDS, ChemStation Edition (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.).

5.2.2 Aislamiento y cuantificación de fracción indigestible (FI) de guayaba entera (GE) y

guayaba sin semilla (GSS).

La cuantificación de la fracción indigerible total (FIT), soluble (FIS) e insoluble (FII) se

realizó por el método propuesto por Saura-Calixto (2000) el cual considera una digestión

gastrointestinal in vitro. El aislamiento de FIT a partir de muestras GC y GSS se llevó a

cabo de acuerdo a lo propuesto por Saura-Calixto (2000), el cuan se ejecutó a escala

preparativa, de acuerdo con las modificaciones propuestas por Tabernero (2011). La FII

se consideró como los residuos de digestión peletizados por centrifugación, mientras que

los retenidos por diálisis representaron la FIS; y la FIT como la suma de FIS + FII. La

FIT, fue colectada, se liofilizó, se molió (IKA M20, EE. UU.), Se tamizó (500 μm) y se

almacenó en bolsas de sellado a -20ºC.

5.2.3 Evaluación de azúcares neutros y ácidos urónicos en guayaba entera (GE), guayaba

sin semilla (GSS) y en las fracciones indigestibles total (FIT), soluble (FIS) e insoluble

(FII), de los frutos de guayaba

El contenido total de azúcar en GC y GSS, y de cada una de las fracciones indigestibles

(FIT, FIS y FII), se determinó mediante el método de la antrona (Southgate, 1991). Los

ácidos urónicos se determinaron con el método simplificado de Ahmed y Labavitch


37

(1978), utilizando ácido galacturónico (Sigma-Aldrich) como patrón de calibración para la

cuantificación. El contenido de azúcares neutros se determinó por el método de

derivatización de sacáridos a acetatos de alditol utilizando el método propuesto por

Blakeney, Harris, Henry y Stone (1983), que consta de tres etapas: hidrólisis, reducción y

acetilación. El producto derivado se resuspendió en 150 μL de acetona y se inyectó en un

cromatógrafo de gases (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) Provisto de

detector de ionización de llama (DIF) que alcanzaba una temperatura de 250 ° C. Se

utilizó una columna capilar DB-23 de 30 mx 0,25 mm (210°C) y helio de flujo constante

(3 ml min-1) como gas portador. Se usó mioinositol (Sigma-Aldrich) como patrón interno

y se calculó la concentración de azúcares neutros a partir de las curvas de calibración

ramnosa, fucosa, arabinosa, xilosa, manosa, galactosa y glucosa (Sigma-Aldrich).


5.3.1 Modelo de digestión in vitro y evalaución de bioaccesibilidad (%) en guayaba entera

(GE) y guayaba sin semilla (GSS)

Las muestras liofilizadas (GC y GSS) se sometieron a un proceso de digestión in vitro,

adaptado de la metodología propuesta por Saura-Calixto, García-Alonso, Goñi y Bravo

(2000). Primero, las muestras se sometieron a un proceso de hidrólisis enzimática con

pepsina (300 mg / ml, P-7000, Sigma Aldrich) a una temperatura de 37°C durante 1 h; los

CF liberados en esta etapa se consideran como los CF presente en la fracción gástrica

(FGas). Posteriormente, las muestras se sometieron a hidrolisis con pancreatina (5 mg /

ml, P-1750, Sigma Aldrich) durante 6 h y α-amilasa (120 mg / ml, A-6255, Sigma


38

Aldrich) durante 16 h, ambas a 37°C. Los CF liberados en esta etapa de la digestión se

considera como los CF presente en la fracción intestinal (FInt). Después de la triple

hidrólisis, las muestras se centrifugaron, para separar las fracciones indigestibles solubles

e insolubles. El sobrenadante se dializó (D9652, 12-14 KDa, Sigma Aldrich) durante 48 h

para simular la absorción pasiva. Después de la diálisis, se determinó el contenido de CF

asociados a la fracción indigestible soluble (FIS). El residuo formado durante la

centrifugación, que contenía los CF que no eran bioaccesibles en el intestino delgado, se

usó para determinar los CF asociados con la fracción indigestible insoluble (FII) después

de una extracción orgánica (Pérez-Jiménez et al., 2008). Tanto los CF asociados con la

FIS como los asociados a la FII correspondían a la fracción de CF que no eran

bioaccesibles en el intestino delgado.

Se determinaron los contenidos de fenoles solubles totales (FST) de las diferentes

fracciones FGas, IFnt, FIS y FII, y las muestras se analizaron por HPLC/MS como se

describio anteriormente. El porcentaje de bioaccesibilidad in vitro (% BA) de CF se

determinó usando la Eq. (1):

(1)

Donde CF-FInt = CF liberados en la fracción intestinal, CF-FIS = CF asociados a la

fracción indigestible soluble, y CF-FII = CF asociados a la fracción indigestible insoluble.


39

5.3.2 Cinética in vitro de la liberación de compuestos fenólicos (CF) en guayaba entera

(GE) y guayaba sin semillas (GSS).

La cinética in vitro de la liberación de CF de GC y GSS se determinó de acuerdo con un

método de digestión in vitro (Blancas-Benitez et al., 2015). Brevemente, se pesaron 300

mg de muestra seca y se combinaron con 10 ml de tampón de fosfato (0.05 M, pH 1,5) y

0.2 ml de solución de pepsina (300 mg / ml, P-7000, ≥ 250 unidades/mg, Sigma Aldrich),

y la solución se incubó a 37°C durante 1 h. Después, se añadió tampón de fosfato (4.5 ml,

0.05 M, pH 6.9) y las muestras se transfirieron a bolsas de diálisis de celulosa (D9652, 12-

14 KDa, Sigma Aldrich). Se añadió un mililitro de α-amilasa pancreática (120 mg / ml, A-

6255, 110 unidades / mg, A6255, Sigma) a cada bolsa de diálisis, las muestras se ajustaron

a un volumen de 30 ml y las bolsas de diálisis se sellaron. Las bolsas se colocaron en un

recipiente de vidrio con 200 ml de tampón de fosfato (0.05 M, pH 6.9) que se había

estabilizado previamente a 37°C. Las muestras se incubaron durante 3 h con agitación

continua. A intervalos de 30 minutos, se tomaron extractos de 1 ml del líquido que

contenía los compuestos dializados y se usaron para el análisis del FST usando HPLC /

MS, tal como se describe en las secciones anteriores. Para calcular los parámetros

cinéticos de la liberación de CF durante la digestión in vitro. La velocidad final (Vf) de la

liberación de CF se determinó de acuerdo con la Ec. (2):

(2)


40

Donde ΔC es la diferencia de concentración entre la concentración de CF inicial y final, Δt

es la diferencia de tiempo entre un tiempo específico y el tiempo inicial, y Vf es la tasa

final de liberación de CF durante la digestión in vitro (mg GAE / min).


5.4.1 Fermentación colónica in vitro de la fracción indigestible (FI) de guayaba entera

(GE) y guayaba sin semilla (GSS).

La FIT de las muestras de guayaba entera y sin semilla se sometieron a un proceso de

fermentación colónica en condiciones anaeróbicas, de acuerdo con el método propuesto

por Campos-Vega (2009) con algunas modificaciones, las condiciones anaeróbicas se

mantuvieron utilizando una mezcla de gases (10:10:80 H2: CO2: N2) en medio nutritivo

basal estéril ajustado a pH 7.0, que contiene: agua de peptona (2 g / L), (2 g / L), extracto

de levadura, (0.1 g / L) NaCl, (0.04 g / L) K2HPO4, (0.04 g / L) KH2PO4, (0.01 g / L)

MgSO4 - 7H2O, (0.01 g / L) CaCl2 -2H2O, (0.01 g / L) NaHCO3, (0.5 g / L) cisteína HCl y

(0.5 g / L) sales biliares, (2 mL / L) tween 80 y 0.2 g hematina (diluida en 5 ml de NaOH).

Se tomaron muestras de heces frescas de cuatro donantes sanos que siguieron una dieta

normal, no tenían enfermedad intestinal previa y no recibieron tratamiento con

antibióticos al menos durante los tres meses anteriores.


41

La muestra fecal se almacenó inmediatamente en un recipiente anaeróbico antes de su uso,

luego se diluyó con tampón de fosfato (0.1 mol / l, pH 7) y se homogeneizó para obtener

una solución final de 10 g / 100 ml como inóculo de fermentación. Los tubos que

contenían medio de cultivo basal se inocularon con 1 ml de solución fecal. Las

fermentaciones se realizaron en 100 mg de FIT de muestras de GC y GSS, a 37 0C. Se usó

rafinosa (50 mg, R0514, Sigma Aldrich, St Louis MO, EE. UU.) como referencia de

azúcar fermentable, así como un blanco negativo que corresponde al medio de cultivo y al

inóculo fecal. Durante la fermentación, el pH de la muestra, la producción de ácidos

grasos de cadena corta (AGCC) y el contenido de CF se determinaron a las 12, 24 y 48 h,

de fermentación. La fermentación se detuvo colocando los tubos en un congelador a -

70°C. La relación molar se calculó a partir de (concentración individual de AGCC) /

(concentración total de AGCC). La fermentabilidad (%) se calculó a partir de (AGCC

(muestra) / AGCC (rafinosa)) x100.

5.4.2 Determinación de ácidos grasos de cadena corte (AGCC) en sobrenadantes de la

fermentación de la fracción indigestible de frutos de guaba complete (GC) y sin semilla

(GSS)

Las muestras se sometieron a microextracción líquido-líquido (MELL): brevemente, se

añadieron alícuotas de 1 ml del sobrenadante de la fermentación a 500 μl de acetato de

etilo y se agitaron en vórtex durante 1 minuto. Las muestras se centrifugaron (10.000 rpm

durante 5 minutos), se recuperó el sobrenadante y se repitió la extracción, mezclándose el

sobrenadante con el procedente de la extracción previa.


42

Los extractos obtenidos se utilizaron para la determinación de AGCC, por el método

propuesto por Han et al., (2014). Brevemente, se tomaron 20 μL de extracto en un tubo,

luego 10 μL de 3-nitrofenilhidrazina (3-NPH-HCl) 40 mM y 10 μL de 1-etil-3- (3-

dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC-HCl) 37.5 mM con 1.5% de piridina; La mezcla

de reacción se incubó en un baño de agua a 40ºC durante 30 minutos, luego se colocó en

un baño de hielo durante un minuto y luego se añadieron 960 μl de acetonitrilo: agua

(10:90).

La mezcla se filtró en acrodiscos de 0.45 μm de diámetro de poro y se colocó un inserto

para su estudio. El análisis de la muestra se realizó con un sistema Acquity UPLC (Waters

Corp. Milford, MA, EE. UU.) Acoplado a un espectrómetro de masas en tándem Xevo

TQ-S de triple cuadrupolo (Waters Corp.). Se utilizó una columna Acquity UPLC BEH

C18 de 100 mm x 2.1 x 1.7 μm (Waters Corp.) para la separación de AGCC, usando agua:

ácido fórmico (100: 0.01, v / v; disolvente A) y acetonitrilo: ácido fórmico (100: 0.01, v /

v; disolvente B) como fase móvil para la elución en gradiente. La velocidad de flujo fue de

0.35 ml/min; la temperatura de la columna fue de 40°C, y el automuestreador se mantuvo

a 5°C. El gradiente de elución del disolvente binario se optimizó a 15% de B durante 2

minutos, 15% a 55% de B en 9 minutos, y luego se mantuvo a 100% de B durante 1

minuto.

La columna se equilibró durante 3 min a 15% B entre inyecciones. La determinación se

realizó en modo de ionización negativa para los ensayos de MS. Los parámetros de ESI-

MS optimizados típicos se determinaron de esta manera: el voltaje capilar de ESI, -4200

V; gas nebulizador (N2), 35 (unidades arbitrarias); gas de cortina (N2), 20 (unidades

arbitrarias); gas de colisión (N2), 3 (unidades arbitrarias); potencial de entrada, -10 V;


43

potencial de salida de celda de colisión, -20 V. El flujo y la temperatura del gas de secado

(N2) fueron 35 (unidades arbitrarias) y 450C, respectivamente. Los escaneos Q1 de masa

total se realizaron en el rango de masa de m / z 100 a 300 en el modo de perfil, usando un

tiempo de exploración de 0.5 s.

El control y el procedimiento de datos del espectrofotómetro UPLC y el tándem de masa

Xevo TQ-S de triple cuadrupolo, se realizó con el software MassLinx (Waters Corp.).

5.4.3 Identificación de compuestos fenólicos (CF) en sobrenadantes de la fermentación de

la fracción indigestible de frutos de guaba complete (GC) y sin semilla (GSS)

Los sobrenadantes de la fermentación de la fracción indigestible de GC y GSS se

centrifugaron 10 min a 15,000 rpm. Tras completar la centrifugación, se tomaron 90 μL

del sobrenadante.

El análisis de la muestra se realizó con un sistema Acquity UPLC (Waters Corp. Milford,

MA, EE. UU.) Acoplado a un espectrómetro de masas en tándem Xevo TQ-S de triple

cuadrupolo (Waters Corp.). Se utilizó una columna Acquity UPLC BEH C18 de 100 mm

x 2,1 x 1,7 μm (Waters Corp.) para la determinación de CF. La determinación se realizó

en modo de ionización negativa para los ensayos de MS. Las condiciones de ESI se

establecieron en voltaje capilar 2.85 kV, temperatura de desolvatación 500°C, temperatura

de la fuente 150°C, desolvatación y flujo de gas en cono 794 L / hy 151 L / h,

respectivamente, y gas de colisión 0.14 ml / min. El perfil de elución incluyó dos

solventes, agua acidificada con ácido fórmico 7.5 mM y acetonitrilo LC-MS.


44

La determinación se realizó en modo de ionización negativa para los ensayos MS2. Las

condiciones de ESI se establecieron en voltaje capilar 2.85 kV, temperatura de

desolvatación 500°C, temperatura de la fuente 150°C, desolvatación y flujo de gas en

cono 794 L / hy 151 L / h, respectivamente, y gas de colisión 0.14 ml / min.

El control y el procedimiento de datos del espectrofotómetro UPLC y el tándem de masa

Xevo TQ-S de triple cuadrupolo, se realizó con el software MassLinx (Waters Corp.).

5.4.4 Ensayo con lineas celulares

La línea celular utilizada fue un modelo para el cáncer de colon HT-29 (HTB-38; ATCC),

el desarrollo de las células se llevó a cabo en placas de Petri de 100 mm. El medio de

crecimiento que se empleó fue RPMI-1640 con un 10% de suero bovino fetal (FSB) y un

1% de penicilina-estreptomicina. La incubación se realizó a 37°C en una atmósfera

humidificada con 5% de CO2. Durante el crecimiento de las células, se realizó un cambio

de medio cada dos días. Las células se subcultivaron cada 4-5 días hasta una

concentración adecuada para el ensayo de MTT (9600 células por pocillo).

5.4.4.1 Determinación de la actividad antiproliferativa de los sobrenadantes de la

fermentación de la fracción indigestible de frutos de guaba complete (GC) y sin semilla

(GSS), mediante el ensayo MTT


45

La actividad antiproliferativa se evaluó mediante el ensayo MTT (Hajiaghaalipour,

Kanthimathi, Sanusi, & Rajarajeswaran, 2015; Rai et al., 2018).

La actividad enzimática mitocondrial de las células se estimó mediante el ensayo MTT

(bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltiazol). Que es una medida indirecta de

la viabilidad celular. Para esto, las células se sembraron en placas de 96 pocillos con una

densidad de 9.6 x 103 células / pocillo en medio RPMI. Los tratamientos se colocaron en

los pocillos con las células en crecimiento y se incubaron durante 24 h. Previamente, las

muestras se disolvieron en medio RPMI. Después del tiempo de contacto, los medios de

cultivo se recuperaron con tratamientos y los pocillos se lavaron dos veces con PBS (1X)

para eliminar el residuo de los extractos.

Se añadió la solución de MTT y las placas se incubaron durante 4 h. Los cristales de

formazan generados se resuspendieron en 200 μl de DMSO.

Las lecturas de absorbancia se realizaron a 570 y 690 nm usando un lector de microplacas.

El porcentaje (%) de inhibición se calculó usando la Ec. (3):

(3)

5.5 Análisis estadístico

Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado para comparar las muestras

de fruta WG y SG. Todos los análisis se realizaron por triplicado, y se calcularon la media


46

y la desviación estándar de cada determinación. Los datos se analizaron utilizando la

prueba T de Student para la comparaciones entre las muestras de guayaba entera y sin

semilla, mientras que para la comparación de los distintas etapas digestivas, así como los

distintos tiempos de liberación en la cinetica, se utilizó un analisis de varianza (ANOVA),

y una prueba LSD de fisher, todo esto utilizando el software Statistical 8.0 Release para

Windows (Stat Soft. Inc., Tulsa, OK, EE. UU.) Con un nivel de significancia de α = 0.05.

CAPITULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

47

CAPITULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

6.1 Evaluación in vitro de la bioaccesibilidad y la cinética de la liberación de compuestos

fenólicos del fruto de guayaba (Psidium guajava L.).

6.1.1 Introducción al tema.

Actualmente, el consumo de frutas tropicales está aumentando debido a sus atributos

sensoriales deseables y cualidades nutricionales. De hecho, son una fuente importante de

FD y varios compuestos bioactivos que se han asociado con diferentes propiedades

relacionadas con la salud. Tal es el caso de la guayaba (Psidium guajava L).

La cáscara y la pulpa de esta fruta son una excelente fuente de vitaminas (A, C, tiamina,

niacina y riboflavina), minerales (fósforo, calcio y hierro), fibra dietética y compuestos

fenólicos (CF).

La mayoría de las CF identificados en la pulpa de guayaba también se han detectado en

hojas de guayaba; tales compuestos incluyen taninos hidrolizables, guavina A, guavina B

y quercetina. La guayaba se consume fresca y es común eliminar sus semillas, que pueden

constituir hasta 10% del peso total. Esto puede afectar la cantidad y el tipo de CF

ingeridos.


48

El objetivo de este estudio fue evaluar la bioacesibilidad y la cinética de la liberación de

CF a partir de guayaba mediante el uso de un modelo de digestión in vitro. Se observaron

porcentajes similares de bioaccesibilidad en la guayaba entera (GE) (64.79%) y la guayaba

sin semillas (GSS) (67.69%), y las tasas de liberación de CF fueron de 10.55 y 8.70 mg /

min, respectivamente.

La galocatequina fue el compuesto principal identificado en la fracción bioaccesible, y la

guavina B fue el componente principal en la fracción no bioaccesible. La procianidina B y

la guajaverina se detectaron por primera vez en GC y GSS. Estos datos muestran que los

CF se liberan significativamente de la matriz de alimentos en ambas muestras, lo que les

permite ser absorbidos en el intestino delgado. Se observó una mayor proporción de

ciertos CF (guavina A o guavina B) en la fracción no bioaccesible de GC, lo que podría

relacionarse con diferentes efectos biológicos.


49

Contents lists available at ScienceDirect

Journal of Functional Foods

journal homepage: www.elsevier.com/locate/jff

In vitro evaluation of the kinetics of the release of phenolic compounds fromguava (Psidium guajava L.) fruitFrancisco J. Blancas-Beniteza, Jara Pérez-Jiménezb, Efigenia Montalvo-Gonzáleza,Gustavo A. González-Aguilarc, Sonia G. Sáyago-Ayerdia,⁎

a Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Tepic, Laboratorio Integral de Investigación en Alimentos, Av. Tecnológico 2595, CP 63175, Tepic, Nayarit,Mexicob Institute of Food Science, Technology and Nutrition (ICTAN-CSIC), José Antonio Novais 10, 28040 Madrid, Spainc Coordinación de Tecnología de Alimentos de Origen Vegetal, Laboratorio de Antioxidantes y Alimentos Funcionales, Centro de Investigación en Alimentación y DesarrolloA.C., Carretera a La Victoria km 0.6, CP 83304, Hermosillo, Sonora, Mexico

A R T I C L E I N F O

Keywords:Phenolic compoundsBioaccessibilityIn vitrodigestionRelease kineticsPsidium guajava L

A B S T R A C T

Psidium guajava L. is a source of phenolic compounds (PC). The aim of this study was to evaluate the bioac-cessibility and kinetics of the release of PC from guava fruit by using an in vitro digestion model. Similar per-centages of bioaccessibility were observed in whole guava (WG) (64.79%) and seedless guava (SG) (67.69%),and the release rates of PC were 10.55 and 8.70mg/min, respectively. Gallocatechin was the major compoundidentified in the bioaccessible fraction, and guavinoside B was the major component in the non-bioaccessiblefraction. Procyanidin B and guajaverin were detected for the first time in WG and SG. These data show that PCare significantly released from the food-matrix in both samples, allowing them to be absorbed in the smallintestine. Higher proportion of certain PC (guavinoside A or guavinoside B) was observed in the non-bioac-cessible fraction of WG, which could be related with different biological effects.

1. Introduction

Currently, the consumption of tropical fruits is increasing due totheir desirable sensorial attributes and nutritional qualities. Indeed,they are an important source of both dietary fiber and several bioactivecompounds that have been associated with different health-relatedproperties (Maria do Socorro, 2010). Such is the case of guava (Psidiumguajava L). The peel and pulp of this fruit are an excellent source ofvitamins (A, C, thiamine, niacin, and riboflavin), minerals (phosphorus,calcium, and iron) (Medina & Pagano, 2003), dietary fiber (Martínezet al., 2012) and phenolic compounds (PC) (Mahattanatawee et al.,2006), including gallic acid, ellagic acid, and quercetin (Jiménez-Escrig, Rincón, Pulido, & Saura-Calixto, 2001). Most of the PC identi-fied in guava pulp have also been detected in guava leaves; suchcompounds include the hydrolyzable tannins, guavin A, guavin B andquercetin (Díaz-de-Cerio, Gómez-Caravaca, Verardo, Fernández-Gutiérrez, & Segura-Carretero, 2016). Guava is consumed fresh and it iscommon to remove its seeds, which may constitute up to 10% of totalweight. This may affect the amount and type of PC ingested.

Moreover, to show in vivo health effects, the PC present in guavafirst need to be bioaccessible. Bioaccessibility is defined as the amount

of a food component that can cross the intestinal barrier as a result of itsrelease from the food matrix (Shim, Ferruzzi, Kim, Janle, & Santerre,2009). The interactions of PC with the food matrix are one of the factorsthat can delay or decrease their release during digestion, affecting theirpotential bioavailability (Sengul, Surek, & Nilufer-Erdil, 2014). Itshould be remarked that discarding seeds from guava also implies theremoval of a fraction of the connective tissue around the seeds, mainlycomposed of soluble polysaccharides such as galactomannans(Soukoulis, Gaiani & Hoffman, 2018). Since there are evidences of theinteractions between carbohydrates present in the food matrix and PC,affecting the metabolic fate of the latter (Bouayed, Deuβer, Hoffmann,& Bohn, 2012; Chandrasekara & Shahidi, 2012), the consumption ofguava with or without seeds may affect not only the amount and type ofPC but also their bioaccesibility during the different digestion steps.

Several in vitro digestion models have been suggested for emulatingthe physiological conditions of digestion; they provide a useful alter-native to animal and human models by rapidly screening food in-gredients (Alminger et al., 2014). Although they are a previous step forin vivo assays, there are good correlations between results for PC releaseobtained by in vitro digestion models or by in vivo assays (Bohn et al., inpress). The use of these systems has revealed different molecular

https://doi.org/10.1016/j.jff.2018.02.011Received 11 November 2017; Received in revised form 10 February 2018; Accepted 10 February 2018

⁎ Corresponding author.E-mail address: [email protected] (S.G. Sáyago-Ayerdi).

-RXUQDO�RI�)XQFWLRQDO�)RRGV��²��

��(OVHYLHU�/WG��$OO�ULJKWV�UHVHUYHG�

7


50

interactions affecting the bioaccessibility of PC in different matrices,such as complete and residues of decoction of Hibiscus calyces, redgrapes, mango byproducts, strawberry or juçara fruit (Euterpe edulisMartius) (Tagliazucchi, Verzelloni, Bertolini, & Conte, 2010; Blancas-Benitez et al., 2015; Mercado-Mercado et al., 2015; Ariza et al., 2016;Schulz, Biluca, Gonzaga, Borges, Vitali, Micke, Fett, 2017). However,the bioaccessibility of the PC present in guava fruit has not been ex-plored in detail.

Hence, the aim of this study was to use an in vitro digestion proce-dure to determine the bioaccessibility and kinetics release of PC fromwhole and seedless guava fruit, including the identification of in-dividual PC, in order to elucidate whether the mode of consuming thisfruit could affect the profile or the bioaccessibility of PC.

2. Materials and methods

2.1. Sample preparation

Guava fruits (Psidium guajava L.) were obtained from a local marketin Tepic, Nayarit, Mexico and were divided into two batches of 30fruits. The first batch corresponded to whole guava (WG) (pulp, peeland seeds), and the second one to seedless guava (SG) (pulp and peel).In order to ensure sample homogeneity, both samples groups werefreeze-dried (LABCONCO, Freezone, USA), ground (Nutribullet, NBR-0804B, USA), sieved (0.5 µm), and then stored in sealed bags at −20 °Cuntil analysis. Therefore, the freeze-dried samples of whole guavacontain all parts of the fruit, including, pulp, peel, and seed whilefreeze-dried samples of seedless guava contain only pulp and peel ofguava.

2.2. In vitro digestion model and bioaccessibility percentage (%) in wholeguava and seedless guava

Lyophilized samples (WG and SG) were submitted to an in vitrodigestion model adapted from the methodology proposed by Saura-Calixto, Garcia-Alonso, Goñi, and Bravo (2000) (Fig. 1). First, thesamples were subjected to an enzymatic hydrolysis process with pepsin(300mg/ml, P-7000, Sigma Aldrich) at a temperature of 37 °C for 1 h(step 1); the PC released to the supernatant at this stage were con-sidered as the PC present in the gastric fraction (GasF). Subsequently,the samples were hydrolyzed with pancreatin (5 mg/mL, P-1750, SigmaAldrich) for 6 h and α-amylase (120mg/mL, A-6255, Sigma Aldrich) for16 h, both at 37 °C (step 2). The PC released at this stage of digestion areconsidered as the PC present in the intestinal fraction (IntF). After thetriple hydrolysis, samples were centrifuged (step 3) to separate thesoluble and insoluble indigestible fractions. The supernatant was dia-lyzed (D9652, 12–14 KDa, Sigma Aldrich) for 48 h to simulate passiveabsorption (step 4). After dialysis, the PC associated with the solubleindigestible fraction (SIF) was determined (step 5). The pellet formedduring centrifugation, which contained the PC that was non-bioacces-sible in the small intestine, was used to determine the PC associatedwith insoluble indigestible fraction (IIF) after an organic extraction(Pérez-Jiménez et al., 2008) (step 6). Both the PC associated with theSIF and IIF corresponded to the fraction of PC that was not bioaccessiblein the small intestine. In this study, we focused on PC released duringthe gastric and small intestine stages, and due to the lower release ofthese compounds at mouth stage, it was not considered (Williamson &Clifford, 2017).

The total soluble polyphenol (TSP) contents of the different frac-tions GasF, IntF, SIF, and IIF were determined, and the samples wereanalyzed by HPLC/MS as described below. The in vitro bioaccessibilitypercentage (%BA) of PC was determined using Eq. (1):

= − − − ×− + −% BA (PC IntF) (PC SIF) 100(PC IntF) (PC IIF) (1)

where PC-IntF= the PC released on the intestinal fraction, PC-

SIF= the PC associated with the soluble indigestible fraction, and PC-IIF= the PC associated with the insoluble indigestible fraction.

2.3. In vitro kinetics of the release of phenolic compounds (PC) in wholeguava (WG) and seedless guava (SG)

The in vitro kinetics of PC release from WG and SG were determinedaccording to an in vitro digestion method (Blancas-Benitez et al., 2015).Briefly, 300mg of dried sample was weighed and combined with 10mLof phosphate buffer (0.05M, pH 1.5) and 0.2mL of pepsin solution(300mg/mL, P-7000, ≥250 units/mg, Sigma Aldrich), and the solutionwas incubated at 37 °C for 1 h. Afterwards, phosphate buffer (4.5 mL,0.05M, pH 6.9) was added, and the samples were transferred to cel-lulose dialysis bags (D9652, 12–14 KDa, Sigma Aldrich). One milliliterof pancreatic α-amylase (120mg/mL, A-6255, 110 units/mg, A6255,Sigma) was added to each dialysis bag, the samples were adjusted to avolume of 30mL, and the dialysis tubes were sealed. The tubes wereplaced in a glass vessel with 200mL of phosphate buffer (0.05M, pH6.9) that had previously been stabilized at 37 °C. The samples wereincubated for 3 h with continuous stirring. At 30min intervals, 1 mLextracts of the liquid containing the dialyzed compounds were takenand used for the analysis of the TSP using HPLC/MS, as described in thefollowing section. To calculate the kinetic parameters of PC releaseduring the in vitro digestion, the final rate (Vf) of PC release was de-termined according to Eq. (2):

= ⎛⎝ ⎞⎠Vf Ct

Σ ∆∆ (2)

where ΔC is the difference in concentration between the final andthe initial PC concentration, Δt is the time difference between a specifictime and the initial time, and Vf is the final rate of PC release during thein vitro digestion (mg GAE/min).

2.3.1. Total soluble polyphenols (TSP) content in the digested guavafractions

TSP contents were quantified in all digested fractions of WG and SGfrom the in vitro digestion assay and at each point in the release kineticsassay; this analysis was conducted according to the method describedby Montreau (1972) with slight modifications. Next, 250 μL aliquots ofeach fraction (in vitro digestion or kinetics assay) were mixed with1000 μL of sodium carbonate (7.5% w/v) and 1250 μL of Folin-Cio-calteu’s reagent. Afterward, the absorbance of each sample was mea-sured at 750 nm using a 96-well microplate reader (Bio-Tek®, SynergyHT, Winooski, VT, USA) with Gen5 software. Gallic acid was used as thestandard (0.0125–0.2mg/mL, R2≥ 0.9997), and the results are ex-pressed as mg of gallic acid equivalents (g GAE/100 g DW).

2.3.2. Identification of phenolic compounds (PC) by HPLC-DAD-MSanalysis in digested guava fractions

The identification of the PC was carried out using an HPLC Agilent1260 series system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)equipped with a UV–Vis diode array detector (DAD). Samples wereinjected (10 μL, flow rate 0.4mL/min) into a Poroshell 120 EC-C18column (4.6mm× 150mm, particle size 2.7 μm) (AgilentTechnologies). The gradient elution was carried out using water con-taining 0.1% trifluoracetic acid (Sigma Aldrich) as solvent A andacetonitrile (Sigma Aldrich) as solvent B and was applied as follows:0 min, 5% B; 10min, 23% B; 15min, 50% B; 20min, 50% B; 23min,100% B; 25min, 100% B; 27min, 5% B, 30min, 5% B. Detection wasperformed at 280–320 nm. For the MS analysis, a 6120 AgilentQuadrupole LC/MS equipped with an electrospray ionization interfacewas used in negative ionization mode with the following conditions:drying gas flow (N2), 13.0 L/min; nebulizer pressure, 40 psi; gas dryingtemperature, 350 °C; and capillary voltage, 3500 V. The data analysiswas performed using OpenLab CDS ChemStation Edition software(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Characterization of the

F.J. Blancas-Benitez et al. -RXUQDO�RI�)XQFWLRQDO�)RRGV��²��

��


51

PC was based on retention time and mass spectrometric data. Thecompounds were first detected using a single MS scan in the100–1100m/z range followed by a targeted search based on the peaksshowing major signals in the UV–Vis chromatograms.

2.4. Statistical analysis

A completely randomized experimental design was used, in order tocompare WG and SG fruit samples. All analyses were performed intriplicate, and the mean and standard deviation from each determina-tion were calculated. Data were analyzed using the Student’s T-test andthe Statistic 8.0 Release software for Windows (Stat Soft. Inc., Tulsa,OK, USA) with a significance level of α=0.05.

3. Results and discussion

3.1. In vitro digestion and bioaccessibility percentage (%) in WG and SG

PC released from food matrices is a key aspect of the biologicalrelevance of polyphenols. In this study, PC in vitro release of PC wasevaluated followed by the determination of TSP and PC profile at eachdigestion stage. Previous studies reported a general agreement betweenresults obtained by such approaches and those from in vivo studies(Bohn et al., in press). The PC released during the digestion of the WGand SG samples in the present study are shown in Table 1. No sig-nificant differences (p > 0.05) were observed between the samplesduring gastric digestion. During the in vitro digestion process, a sig-nificant release of PC in the GasF was observed, and values up to 15 gGAE/100 g DW were seen. This result could be due to the partial releaseof PC bound to the cell walls of the fruit matrix (Bouayed, Hoffmann, &Bohn, 2011). At this stage, pepsin digestion in conjunction with the lowpH in the stomach and the peristaltic movements, significantly favorreducing the particle size of the food matrix and enhancing the releaseand solubilization of the PC (Chen et al., 2014).

In contrast, in the IntF, significant differences (p < 0.05) in theamount of TSP released from the food matrix were observed betweenWG and SG, and the highest values were observed for SG (Table 1). Therelease of PC in this stage, which mimics the small intestine are affectedby changes in pH and the action of the pancreatine and α-amylaseenzymes. Both factors are known to enhance breakdown of macro-molecules weakening the interactions between carbohydrate and PC,increasing its bioaccessibility (Pekkinen et al., 2014). The in vitro di-gestion model used on this study does not consider the interaction ofthe food matrix with the microbiota present in the upper digestive tube.This was considered as a valid approach since PC is known to betransformed mostly by the colonic microbiota. Indeed, although in vitro

Fig. 1. Phenolic compounds bioaccesibility in whole and seedless guava fruit samples (Psidium guajava L.): Step 1 Gastric fraction (Pepsine), Step 2 Intestinal fraction (Pancreatine andamylase) Step 3 Centrifugation to separate supernatants and residues, Step 4 Dialysis 24–48 h, Step 5, Non-bioaccesible PC, associated to soluble indigestible fraction (SIF), Step 6 Non-bioaccesible PC, associated to insoluble indigestible fraction (IIF).

Table 1Bioaccesible, non-bioaccesible, and biocessibility percentage (%) of phenolic compounds(PC) in whole guava (WG) and seedless guava (SG) during in vitro digestion.1

Total soluble polyphenols (g GAE/100 g DW) WG SG

Bioaccessible PCGastric fraction 15.12 ± 0.06a 16.63 ± 0.15a

Intestinal fraction 17.67 ± 0.25a 20.93 ± 0.28b

Non-bioaccessible PCSoluble indigestible fraction 5.10 ± 0.29a 5.74 ± 0.10a

Insoluble indigestible fraction 1.73 ± 0.67a 1.51 ± 0.34a

Bioaccesibility PC (%) 64.79a 67.69a

1 Values represent mean ± standard deviation (n= 3). Different lowercase letters inthe same row indicate significant difference between guava samples (p < 0.05).Percentage of bioaccesibility (%BA), calculated as: = − − − ×− + −%BA (PC IntF) (PC SIF) 100

(PC IntF) (PC IIF) ,

where PC-IntF= the PC released on the intestinal fraction, PC-SIF= the PC associatedwith the soluble indigestible fraction, and PC-IIF= the PC associated with the insolubleindigestible fraction.


��


52

studies using ileostomy fluid suggested some biotransformations byenteric bacteria (Schantz, Erk & Richling, 2010), they may be con-sidered as marginal as compared with colonic transformations(Williamson & Clifford, 2017).

The non-bioaccessible fraction comprises the SIF and IIF. After thedialysis process, the contents of PC in the SIF were not significantly

different between the WG and SG samples (p > 0.05); the differencewas approximately 5%. SIF corresponds to the PC that was not able tocross the dialysis membrane; these compounds can be associated withdietary fiber from the food matrix or are PC with high molecularweights (González-Aguilar, Blancas-Benítez, & Sáyago-Ayerdi, 2017).These values were higher than those observed in the IIF, which was

Table 2Phenolic compounds released at each stage of in vitro digestion of whole guava (WG) and seedless guava (SG) fruit.1

Compound Gastric fraction Intestinal fraction Non-bioaccesible fraction

MS area2 MS area2 MS area2

WG SG WG SG WG SG

Phenolic acidsGallic acid 169.5 ± 2.3b 1070.5 ± 112.4c n.d.a n.d.a n.d.a n.d.a

Quercetin derivativesQuercetin 2287.4 ± 124.2c 2120.1 ± 101.2c 542.3 ± 75.3b 517.2 ± 23.3b n.d.a n.d.a

Guavinoside A 6427 ± 112.6d 4407.5 ± 110.9c n.d.a n.d.a 382.7 ± 10.4b n.d.a

Guavinoside B 17660.9 ± 287.5c 20334.1 ± 368.9c n.d.a n.d.a 177.1 ± 26.6b n.d.a

Guavinoside C 2400 ± 223.1c 2778.4 ± 674.1c 680 ± 87.9b 873.6 ± 121.7b n.d.a n.d.a

Guajaverin 2454.7 ± 212.4a 5904.3 ± 323.2b 2126.7 ± 111.2a 2663.1 ± 191.2a 5242.7 ± 126.7b 4842.9 ± 201.2b

FlavonoidsNaringenin n.d.a 441.7 ± 34.6b 372.9 ± 67.6b 577.4 ± 43.2b n.d.a n.d.a

Gallocatechin 7149.6 ± 98.2c 13966.9 ± 134.5d 2429.5 ± 129.3b 3316.3 ± 232.2b n.d.a n.d.a

(epi)gallocatechin n.d.a n.d.a 202.2 ± 23.5b n.d.a n.d.a n.d.a

TanninsPedunculagin 1773.5 ± 67.9d 430.8 ± 122.2b 2367 ± 104.2d 2536.6 ± 90.4a n.d.a 633.1 ± 12.4c

Geraniin n.d.a 389.2 ± 49.5b 699.8 ± 20.2c 931.5 ± 76.5d n.d.a n.d.a

Prodelphinidin dimer 2308.1 ± 24.9d 942.5 ± 69.8c 179.3 ± 45.3b 1852.3 ± 87.9d n.d.a n.d.a

Procyanidin B 37527.4 ± 462.7b 7624.3 ± 76.8a 7579.3 ± 279.3a 8139.1 ± 225.1a 7386.8 ± 98.7a 6736.4 ± 108.9a

1 Values are the mean ± standard deviation (n= 3).2 Arbitrary units. Different lowercase letters in the same row indicate significant difference between whole and seedless guava samples on each digestion stages (p < 0.05) n.d., not

detected.

Fig. 2. Phenolic compounds profile (HPLC-DAD) of guava fruit digestion fractions. (a) Gastric fraction, (b) Intestinal fraction, (c) soluble indigestible fraction, after dialysis process Peakannotations; 1: Gallic acid, 2: Naringenin, 3: Quercetin, 4: (epi)gallocatechin, 5: Geraniin, 6: Gallocatechin, 7: Pedunculagin, 8: Guavinoside B, 9: Prodelphinidin Dimer, 10: Guajaverin,11: Guavinoside C, 12: Guavinoside A, 13: Procyanidin B.


��


53

1.73% for WG and 1.51% for SG. The IIF corresponds to the residue ofthe food matrix and contains insoluble dietary fiber, hydrolyzablepolyphenols and other insoluble compounds (Saura-Calixto, 2011)(Table 1). Nevertheless, this fraction of PC, which are non-bioaccessiblein the small intestine in the system tested here, could become morebioaccessible in two different ways: through release due to the action ofthe intestinal enzymes on glycosides that releases the corresponding

aglycones that can be taken up by passive diffusion into the enterocytes(Chandrasekara & Shahidi, 2012) or through further transformation bycolonic microbiota or the release of absorbable metabolites (Williamson& Clifford, 2017).

The lowest PC values were detected in the IIFs in both samples.These polyphenols were not bioaccessible at all in the small intestine.However, they could become bioaccessible in the large intestine afterfermentation by the microbiota, which is a key step in the metabolicfate of polyphenols (Williamson & Clifford, 2017). The study of each ofthe indigestible fractions, both soluble and insoluble, is of great im-portance because the compounds associated with these indigestiblefractions are not absorbed in the small intestine, reaching the colonwhere is fermented by the microbiota producing short chain fatty acidssuch as acetic, propionic and butyric acids and other that may exertdifferent beneficial effects (Saura-Calixto, 2011, Sáyago-Ayerdi,Zamora-Gasga & Venema, in press). Based on the release of PC in thedifferent stages of in vitro gastrointestinal digestion and considering thePC associated with SIF and IIF, the bioaccessibility was calculated be-tween 64% and 68% in both samples (Table 1). This result seems toindicate that the presence of seeds in guava does not affect PC bioac-cessibility. Similarly, food matrix differences in mango peel and pulpdid not affect the bioaccessibility of PC (Blancas-Benitez et al., 2015).While in other products, such as Hibiscus, the bioaccessibility of PC indecoction residues was 2.7-fold higher than that in complete calyces(Mercado-Mercado et al., 2015). Interestingly, of these examples, thebioaccessibility values of the PC were similar to those found in thisstudy for guava only in the decoction residue; in the other examples, thebioaccessibilities were much lower.

Fig. 3. In vitro Kinetics of total soluble polyphenols release kinetics of whole guava andseedless guava.

Table 3Phenolic compounds profile in each time of phenolic compounds release kinetics of whole guava (WG) and seedless guava (SG) fruit.1

Time (min) Compound MS area2 m/z [–] Molecular formula

WG SG

30 Pedunculagin n.d.Aa 173.9 ± 11.2 Bb 783.07 C34H24O22

Geraniin 2030.5 ± 18.3 Db 1120.7 ± 121.1 Da 951.08 C41H28O27

Procyanidin B 24949.3 ± 348.6 Db 165 ± 14.7 Ba 577.14 C30H26O12

Guavinoside B 647.2 ± 27.9 Aa 697.6 ± 6.89 Aa 571.15 C28H28O13

Guavin B n.d.Aa 356.5 ± 3.67 Bb 693.11 C33H26O17

60 Pedunculagin n.d.Aa 168.4 ± 10.9Bb 783.07 C34H24O22

Geraniin 775.2 ± 65.4 Bb n.d.Aa 951.08 C41H28O27

Procyanidin B 844 ± 87.3 Cb n.d.Aa 577.14 C30H26O12

Guavinoside B 744.6 ± 23.4 Aa 1668.4 ± 27.7 Bb 571.15 C28H28O13

Guavin B n.d.Aa n.d.Aa 693.11 C33H26O17

90 Pedunculagin 190.3 ± 10.5 Ba 203.4 ± 18.8 Ca 783.07 C34H24O22

Geraniin 1311 ± 27.8 Cb 168.3 ± 15.4 Ba 951.08 C41H28O27

Procyanidin B 185.8 ± 25.1 Ba 793.8 ± 17.5 Cb 577.14 C30H26O12

Guavinoside B 1040.8 ± 86.3 Bb 521.5 ± 5.42 Aa 571.15 C28H28O13

Guavin B n.d.Aa 685.5 ± 61.3 Cb 693.11 C33H26O17

120 Pedunculagin n.d.Aa n.d.Aa 783.07 C34H24O22

Geraniin n.d.Aa 1500.1 ± 100.3Db 951.08 C41H28O27

Procyanidin B n.d.Aa n.d.Aa 577.14 C30H26O12

Guavinoside B 886.8 ± 18.9 Ba 1273.9 ± 29.8 Bb 571.15 C28H28O13

Guavin B 374 ± 21.4 Ca 746.7 ± 7.78 Db 693.11 C33H26O17


Geraniin 1914.5 ± 10.9 Db n.d.Aa 951.08 C41H28O27

Procyanidin B n.d.Aa n.d.Aa 577.14 C30H26O12

Guavinoside B 1154.7 ± 28.7 Ba 1490.2 ± 10.4 Ba 571.15 C28H28O13

Guavin B 203.4 ± 18.3Bb n.d.Aa 693.11 C33H26O17


Geraniin 190 ± 10.7 Ba 550 ± 5.6 Cb 951.08 C41H28O27

Procyanidin B 649.5 ± 64.2Cb n.d.Aa 577.14 C30H26O12

Guavinoside B 740.2 ± 15.7 Aa 1102.1 ± 10.67 Bb 571.15 C28H28O13

Guavin B 481.1 ± 41.2 Da 645.1 ± 6.3 Cb 693.11 C33H26O17

Different uppercase letters indicate significant difference between times of kinetics on each sample, different lowercase letters in the same row indicate significant difference betweensamples on each kinetic time (p < 0.05); n.d., not detected.

1 Values represent mean ± standard deviation (n= 3).2 Arbitrary units.


��


54

3.2. Evaluation of the bioaccessibility of individual PC in WG and SG

A fundamental part of the study of the bioaccessibility of bioactivecompounds involves not only quantifying the total amounts of thecompounds but also determining the types of PC that are bioaccessible.Table 2 shows the PC profiles determined at each stage of the in vitrodigestion process for whole and seedless guava fruit. The major PCidentified in all stages of the in vitro digestion were flavonoids andtannins. In particular, the following PC were identified in the GasF andIntF both in WG and SG (Fig. 2a,b): quercetin, guavinoside C andguajaverin (quercetin derivatives), gallocatechin, the ellagitanninpedunculagin, prodelphinidin dimer and procyanidin B. These com-pounds have been related with several health-related properties, suchas gallocatechin or ellagitannins (Cerdá, Tomás-Barberán, & Espín,2005; Holt, Heiss, Kelm, & Keen, 2012) reported in guava fruits. In thisstudy, procyanidin B and guajaverin were identified by the first time inguava fruit. Procyanidins are one of the classes of PC with the highestevidences of cardiometabolic beneficial effects, including clinical trials(González-Abuín et al., 2015). Interestingly, procyanidin B was recentlyidentified in sour guava (Psidium friedrichsthalianum) by the first time(Cuadrado-Silva, Pozo-Bayón & Osorio, 2017) and guajaverin (quer-cetin 3-arabinoside) previously identified in leaves and stems of theguava tree (Díaz-de-Cerio et al., 2016), which was reported to be anantiplaque agent (Prabu, Gnamani & Sadulla, 2006).

Regarding the differences between the PC profile in GasF and IntF, itwas found that gallic acid, guavinoside A and guavinoside B were onlyfound in the GasF, while naringenin appeared mostly in the IntF. Thisindicates that, while gallic acid could be completely released from thefood matrix at the gastric step. Other PC needs the action of intestinalenzymes in order to be released. Recent studies employing in vitro di-gestions in samples such as strawberry or the tropical juçara fruit,showed that PC profile varies during the different digestion steps (Arizaet al., 2016; Schulz et al., 2017). Also, it has been reported that some PCsuch as anthocyanins and other flavonoids are unstable in intestinalconditions, and their contents may decline by up to 43% during di-gestion (Bermúdez-Soto et al., 2007). Interestingly, the hydrolyzabletannin guavinoside A, here released in the intestinal step, has beenreported to show hypoglycemic and hepatoprotective activity(Eidenberger, Selg, & Krennhuber, 2013). This property attributed tothis compound can be added to the list of health benefits that haveanother PC present in guava fruit.

Overall, all these PC were present in both WG and SG, althoughthere were also some compounds specific of one of the samples. Forinstance, naringenin and geraniin were not detected in the GasF of WG,but they were present in the other samples. Geranin is a dehy-droellagitannin that may be involved in the induction of apoptosis inhuman melanoma cells (Lee et al., 2008). While naringenin is a flava-none that can promote moderate cytostatic activity against cancer celllines (Kang, Youn, Hong, & Kim, 2011).

Regarding the non-bioaccesible fraction (Fig. 2c), guajaverin andprocyandin B, both at thigh concentrations were detected in WG andSG, indicating that a major fraction of these compounds would reachthe colon. Additionally, guavinoside A and B were detected in WG,while pedunculagin was identified in SG. The non-bioaccessible PCreach the colon where they may exert additional health effects either byincreasing the antioxidant content of the intestinal lumen or by servingas a fermentable substrate for the colonic microbiota and subsequentlyreleasing absorbable and beneficial metabolites (Dall'Asta et al., 2012).

Overall, the differences observed among the samples analyzed in-dicate that the potential effects of guava consumption with or withoutseeds can depended more on the PC that can be released in each stage ofdigestion and on the type of non-bioaccessible compounds potentiallybiotransformed by the microbiota. Than on the different types of PCpresent on the sample. WG samples exhibited a relevant content of PCin the GasF and the IntF, but a higher proportion of certain PC (gua-vinoside A or guavinoside B) in the non-bioaccessible fraction, which

could indicate potentially higher health-related effects.

3.3. In vitro kinetics of the release of PC in WG and SG

To get more information on the metabolic fate of PC present inguava, their kinetics release was assessed. This evaluation, com-plementary to bioaccesibility assessment, provides information on howlong PC are expected to be released from food matrix after intake, beingpotentially absorbed and circulating in the bloodstream. Previous invitro studies have obtained relevant information regarding this para-meter (Blancas-Benitez et al., 2015) that may be used to evaluate po-tential absorption peaks in further in vivo assays.

No significant differences (p > 0.05) in the release of PC from ei-ther WG or SG were observed (Fig. 3). In both cases, a constant releaseof PC during the digestion process was observed. The total release ratesof PC in WG and SG were 10.55mg/min and 8.70mg/min, respectively(Fig. 3). PC present in the fruit and released from the food matrix couldpotentially be absorbed throughout the gastrointestinal digestion pro-cesses.

The PC identified during the release kinetics assay were peduncu-lagin, an isomer of geranin, procyanidin B, guavinoside B, and guavin B(Table 3). Only guavinoside B was detected at each step of digestion inboth samples. These results agree with the detection of these com-pounds during the in vitro evaluation of bioaccessibility, which confirmsthe release of these compounds from food matrices during digestion andsubsequent intestinal absorption. The same types of PC were observedin each of the aliquots analyzed during the release kinetics studies;however, as the digestion process progresses and the kinetics change,the profiles of the identified PC change between each of the analyzedaliquots, which would indicate a release and potential gradual ab-sorption of the compounds identified in the kinetics studies.

4. Conclusions

In this study, guava samples with or without seeds showed, by invitro digestion experiments had a gradual kinetic release of PC and asimilar bioaccesibility in the small intestine (about 70%). Nevertheless,there was a higher proportion of certain PC (guavinoside A or guavi-noside B) in the non-bioaccessible fraction of WG that could indicatedifferential biological effects. Finally, the compounds procyanidin Band guajaverine, previously identified in leaves and stems of the guavatree, were detected in guava fruit by the first time indicating an addi-tional benefit for the consumption of this fruit. The results obtained inthis research indicate that the consumption of the guava fruit, both withseed and without seed, can contribute to increase the consumption andassimilation of PC in the diet, and represents a basis for further studieson the effects of non-bioaccesible PC, and their potential health benefitson the colon.

Acknowledgements

SGSA acknowledge the financial support from Tecnológico Nacionalde México the project 5614.15-P. FJBB thanks the financial supportfrom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México (CONACyT) forthe scholarship 378371 granted.

References

Alminger, M., Aura, A. M., Bohn, T., Dufour, C., El, S. N., Gomes, A., & Santos, C. N.(2014). In vitro models for studying secondary plant metabolite digestion andbioaccessibility. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 13(4),413–436.

Ariza, M. T., Reboredo-Rodríguez, P., Mazzoni, L., Forbes-Hernández, T. Y., Giampieri, F.,Afrin, S., & Mezzetti, B. (2016). Strawberry achenes are an important source ofbioactive compounds for human health. International Journal of Molecular Sciences,17(7), 1103.

Bermúdez-Soto, M. J., Larrosa, M., Garcia-Cantalejo, J. M., Espín, J. C., Tomás-Barberan,F. A., & García-Conesa, M. T. (2007). Up-regulation of tumor suppressor


��


55

carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 in human colon cancerCaco-2 cells following repetitive exposure to dietary levels of a polyphenol-richchokeberry juice. The Journal of Nutritional Biochemistry, 18(4), 259–271.

Blancas-Benitez, F. J., Mercado-Mercado, G., Quirós-Sauceda, A. E., Montalvo-González,E., Gonzalez-Aguilar, G., & Sayago-Ayerdi, S. G. (2015). Bioaccesibility of poly-phenols associated with dietary fiber and in vitro kinetics release of polyphenols inMexican ‘Ataulfo’mango (Mangifera indica L.) by-products. Food & Function, 6,859–868.

Bohn, T., Carriere, F., Day, L., Deglaire, A., Egger, L., Freitas, D., Menard, O. (in press).Correlation between in vitro and in vivo data on food digestion. What can we predictwith static in vitro digestion models? Critical Reviews in Food Science and Nutrition,doi:10.1080/10408398.2017.

Bouayed, J., Deußer, H., Hoffmann, L., & Bohn, T. (2012). Bioaccessible and dialysablepolyphenols in selected apple varieties following in vitro digestion vs. their nativepatterns. Food Chemistry, 131(4), 1466–1472.

Bouayed, J., Hoffmann, L., & Bohn, T. (2011). Total phenolics, flavonoids, anthocyaninsand antioxidant activity following simulated gastro-intestinal digestion and dialysisof apple varieties: Bioaccessibility and potential uptake. Food Chemistry, 128(1),14–21.

Cerdá, B., Tomás-Barberán, F. A., & Espín, J. C. (2005). Metabolism of antioxidant andchemopreventive ellagitannins from strawberries, raspberries, walnuts, and oak-agedwine in humans: Identification of biomarkers and individual variability. Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 53(2), 227–235.

Chandrasekara, A., & Shahidi, F. (2012). Bioaccessibility and antioxidant potential ofmillet grain phenolics as affected by simulated in vitro digestion and microbial fer-mentation. Journal of Functional Foods, 4(1), 226–237.

Chen, G.-L., Chen, S.-G., Zhao, Y.-Y., Luo, C.-X., Li, J., & Gao, Y.-Q. (2014). Total phenoliccontents of 33 fruits and their antioxidant capacities before and after in vitro diges-tion. Industrial Crops and Products, 57, 150–157.

Cuadrado-Silva, C. T., Pozo-Bayón, M. A., & Osorio, C. (2017) Targeted metabolomicanalysis of polyphenols with antioxidant activity in sour guava (Psidium frie-drichsthalianum Nied.) fruit. Molecules, 22, Article number 11.

Dall'Asta, M., Calani, L., Tedeschi, M., Jechiu, L., Brighenti, F., & Del Rio, D. (2012).Identification of microbial metabolites derived from in vitro fecal fermentation ofdifferent polyphenolic food sources. Nutrition, 28(2), 197–203.

Díaz-de-Cerio, E., Gómez-Caravaca, A. M., Verardo, V., Fernández-Gutiérrez, A., &Segura-Carretero, A. (2016). Determination of guava (Psidium guajava L.) leaf phe-nolic compounds using HPLC-DAD-QTOF-MS. Journal of Functional Foods, 22,376–388.

Eidenberger, T., Selg, M., & Krennhuber, K. (2013). Inhibition of dipeptidyl peptidaseactivity by flavonol glycosides of guava (Psidium guajava L.): A key to the beneficialeffects of guava in type II diabetes mellitus. Fitoterapia, 89, 74–79.

González-Abuín, N., Pinent, M., Casanova-Martí, À., Arola, L., Blay, M., & Ardévol, A.(2015). Procyanidins and their healthy protective effects against type 2 diabetes.Current Medicinal Chemistry, 22(1), 39–50.

González-Aguilar, G. A., Blancas-Benítez, F. J., & Sáyago-Ayerdi, S. G. (2017).Polyphenols associated with dietary fibers in plant foods: Molecular interactions andbioaccessibility. Current Opinion in Food Science, 13(Supplement C), 84–88.

Holt, R. R., Heiss, C., Kelm, M., & Keen, C. L. (2012). The potential of flavanol andprocyanidin intake to influence age-related vascular disease. Journal of Nutrition inGerontology and Geriatrics, 31(3), 290–323.

Jiménez-Escrig, A., Rincón, M., Pulido, R., & Saura-Calixto, F. (2001). Guava fruit(Psidium guajava L.) as a new source of antioxidant dietary fiber. Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 49(11), 5489–5493.

Kang, H. J., Youn, Y.-K., Hong, M.-K., & Kim, L. S. (2011). Antiproliferation and re-differentiation in thyroid cancer cell lines by polyphenol phytochemicals. Journal ofKorean Medical Science, 26(7), 893–899.

Lee, J. C., Tsai, C. Y., Kao, J. Y., Kao, M. C., Tsai, S. C., Chang, C. S., ... Way, T. D. (2008).Geraniin-mediated apoptosis by cleavage of focal adhesion kinase through up-reg-ulation of Fas ligand expression in human melanoma cells. Molecular Nutrition & Food

Research, 52(6), 655–663.Mahattanatawee, K., Manthey, J. A., Luzio, G., Talcott, S. T., Goodner, K., & Baldwin, E.

A. (2006). Total antioxidant activity and fiber content of select Florida-grown tro-pical fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(19), 7355–7363.

Maria do Socorro, M. R., Alves, R. E., de Brito, E. S., Pérez-Jiménez, J., Saura-Calixto, F.,& Mancini-Filho, J. (2010). Bioactive compounds and antioxidant capacities of 18non-traditional tropical fruits from Brazil. Food Chemistry, 121(4), 996–1002.

Martínez, R., Torres, P., Meneses, M. A., Figueroa, J. G., Pérez-Álvarez, J. A., & Viuda-Martos, M. (2012). Chemical, technological and in vitro antioxidant properties ofmango, guava, pineapple and passion fruit dietary fibre concentrate. Food Chemistry,135(3), 1520–1526.

Medina, M. L., & Pagano, F. (2003). Caracterización de la pulpa de guayaba (Psidiumguajava L.) tipo ‘Criolla Roja’. Revista de la Facultad de Agronomía, 20(1).

Mercado-Mercado, G., Blancas-Benitez, F. J., Velderrain-Rodríguez, G. R., Montalvo-González, E., González-Aguilar, G. A., Alvarez-Parrilla, E., & Sáyago-Ayerdi, S. G.(2015). Bioaccessibility of polyphenols released and associated to dietary fibre incalyces and decoction residues of Roselle (Hibiscus sabdariffa L.). Journal of FunctionalFoods, 18, 171–181.

Montreau, F. (1972). Sur le dosage des composés phénoliques totaux dans les vins par lamethode Folin-Ciocalteau. Connaiss Vigne Vin, 24, 397–404.

Pekkinen, J., Rosa, N. N., Savolainen, O.-I., Keski-Rahkonen, P., Mykkänen, H., Poutanen,K., & Hanhineva, K. (2014). Disintegration of wheat aleurone structure has an impacton the bioavailability of phenolic compounds and other phytochemicals as evidencedby altered urinary metabolite profile of diet-induced obese mice. Nutrition &Metabolism, 11(1), 1.

Pérez-Jiménez, J., Arranz, S., Tabernero, M., Díaz-Rubio, M. E., Serrano, J., Goñi, I., &Saura-Calixto, F. (2008). Updated methodology to determine antioxidant capacity inplant foods, oils and beverages: Extraction, measurement and expression of results.Food Research International, 41(3), 274–285.

Prabu, G. R., Gnamani, A., & Sadulla, S. (2006). Guaijaverin - A plant flavonoid as po-tential antiplaque agent against Streptococcus mutans. Journal of Applied Microbiology,101, 487–495.

Saura-Calixto, F. (2011). Dietary fiber as a carrier of dietary antioxidants: An essentialphysiological function. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(1), 43–49.

Saura-Calixto, F., Garcia-Alonso, A., Goni, I., & Bravo, L. (2000). In vitro determination ofthe indigestible fraction in foods: An alternative to dietary fiber analysis. Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 48(8), 3342–3347.

Sáyago-Ayerdi, S. G., Zamora-Gasga, V. M., & Venema, K. (in press). Prebiotic effect ofpredigested mango peel on gut microbiota assessed in a dynamic in vitro model of thehuman colon (TIM-2). Food Research International, doi:10.1016/j.foodres.2017.12.024.

Schantz, M., Erk, T., & Richling, E. (2010). Metabolism of green tea catechins by thehuman small intestine. Biotechnology Journal, 5(10), 1050–1059.

Schulz, M., Biluca, F. C., Gonzaga, L. V., da Borges, G. S. C., Vitali, L., Micke, G. A., & Fett,R. (2017). Bioaccessibility of bioactive compounds and antioxidant potential ofjuçara fruits (Euterpe edulis Martius) subjected to in vitro gastrointestinal digestion.Food Chemistry, 228, 447–454.

Sengul, H., Surek, E., & Nilufer-Erdil, D. (2014). Investigating the effects of food matrixand food components on bioaccessibility of pomegranate (Punica granatum) phenolicsand anthocyanins using an in-vitro gastrointestinal digestion model. Food ResearchInternational, 62, 1069–1079.

Shim, S.-M., Ferruzzi, M. G., Kim, Y.-C., Janle, E. M., & Santerre, C. R. (2009). Impact ofphytochemical-rich foods on bioaccessibility of mercury from fish. Food Chemistry,112(1), 46–50.

Soukoulis, C., Gaiani, C., & Hoffmann, L. (2018). Plant seed mucilage as emerging bio-polymer in food industry applications. Current Opinion in Food Science, 22, 28–42.

Tagliazucchi, D., Verzelloni, E., Bertolini, D., & Conte, A. (2010). In vitro bio-accessibilityand antioxidant activity of grape polyphenols. Food Chemistry, 120(2), 599–606.

Williamson, G., & Clifford, M. N. (2017). Role of the small intestine, colon and microbiotain determining the metabolic fate of polyphenols. Biochemical Pharmacology.


��


56

6.2 Composición de la matriz del fruto de guayaba (Psidium guajava L.), efectos en la

producción de metabolitos microbianos y efectos antiproliferativos en células HT-29,

después de un proceso de fermentación in vitro

6.2.1 Introducción al tema.

La microbiota humana para estar saludable necesita interactuar diariamente con 45-60 g

de sustratos no digeribles. Las frutas tropicales como la guayaba (Psidium guajava L.) son

una fuente importante de fibra dietética (FD) y compuestos fenólicos (CF). El objetivo de

este trabajo fue identificar y cuantificar el tipo de carbohidratos y CF en guayaba ingerida

e identificar los metabolitos producidos durante la fermentación colónica in vitro de la FI

de guayaba, así como los efectos de los extractos de fermentación sobre lineas celulares de

cáncer de colon (HT-29). En la fracción indigestible soluble (FIS) el perfil de azúcares

neutros fue arabinosa (46.11%), galactosa (20.09%), glucosa (14.74%) y xilosa (7.67%).

En la fracción indigestible insoluble (FII) se encontró xilosa (65.89%), arabinosa

(16.65%), galactosa (7.26%) y glucosa (6.03%). Los principales compuestos identificados

en las fracciones indigestibles fueron la procianidina B, la guajaverina, la quercetina y la

geranina. Los extractos de fermentación colónica muestran una producción significativa

de AGCC, principalmente, ácido acético y ácido propiónico, y en mayor medida de ácido

butírico, en las primeras 12 h de fermentación. El mayor efecto antiproliferativo se

observó en GSS-12h y GC-24h.

El consumo de toda la fruta de guayaba puede contribuir no solo a satisfacer los

requerimientos diarios de consumo de fibra, sino que también podría contribuir a la salud

del colon


57

Gut metabolites from in vitro colonic fermentation of the guava (Psidium guajava L.)

fruit indigestible fraction

ABSTRACT

To be healthy, human microbiota must interact with 45-60 g of non-digestible substrates

daily. Tropical fruits, such as guava (Psidium guajava L.), are an important source of

indigestible fractions (IFs), including dietary fiber (DF) and phenolic compounds (PC).

The aims of this study were to identify and quantify the types of carbohydrates and PC

present in guava fruit (whole guava; WG and seedless guava; SG) as eaten; to identify the

gut metabolites produced during in vitro colonic fermentation of WG and SG in the IF;

and to elucidate the anti-proliferative activity of fermentation extracts in HT-29 cancer

cell lines. In the soluble IFs of WG and SG, the neutral sugar profile comprised arabinose

(46.11%), galactose (20.09%), glucose (14.74%) and xylose (7.67%). The insoluble IF

comprised xylose (65.89%), arabinose (16.65%), galactose (7.26%), and glucose (6.03%).

The major PC identified in the IF were procyanidin B, guajaverin, quercetin, and geraniin

in both samples. The colonic fermentation extracts showed significant (p<0.05) production

of short chain fatty acids, including acetic acid, propionic acid, and butyric acid, during

the first 12 h of fermentation. A greater antiproliferative effect was observed in the SG-12


58

h and WG-24 h groups. Consumption of WG or SG may contribute to the daily

requirements of DF consumption and enhance colon health.

KEYWORDS: Food matrix, phenolic compounds, indigestible fraction, carbohydrates,

colonic fermentation, antiproliferative, Psidium guajava L.

INTRODUCTION

The human microbiota needs at least 45-60 g of non-digestible compounds to be healthy

(Flint & Juge, 2015). The intake of dietary fiber (DF) in western countries is between 15-

20 g/day (Bingham et al., 2003), which is too low to satisfy the amount of substrates

required to maintain optimal growth and equilibrium of microbiota species (Sekirov,

Russell, Antunes, & Finlay, 2010). Guava fruit (Psidium guajava L.) is an important

source of DF and phenolic compounds (PC) (Medina & Pagano, 2003). In recent years,

the study of plant foods has focused on these two components. However, little is known

about the composition of carbohydrates in the complete fruit or the indigestible fraction

(IF), nor do we know much about its possible relationship with human health.


59

The relevance of the study of PC and DF is focused on the possible chemo-preventive role

that can be exerted by metabolites produced during the colonic fermentation of

indigestible carbohydrates, including short chain fatty acids (SCFA; acetic, propionic and

butyric acid) (Chandrasekara & Shahidi, 2012).

Therefore, the fermentability of non-digestible compounds is a consequence of the amount

of IF present, the composition and possible molecular interactions that can take place with

the PC and indigestible carbohydrates present in the fruit, and the effects that they can

exert on colonic health (Aguirre et al., 2016; Flint, Duncan, Scott, & Louis, 2015). The

contents of PC and IFs in guava were characterized (Blancas-Benitez, Pérez-Jiménez,

Montalvo-González, González-Aguilar, & Sáyago-Ayerdi, 2018) previously, but studies

on the possible products that can be generated during the colonic fermentation of both

components have not been reported. Even the antioxidant capacity of guava fruit was

previously reported (Yahia et al., 2007). Its antiproliferative capacity against cancer cells

is poor. The consumption of guava fruit may have beneficial health effects, but few

studies have focused on the characterization and identification of which PC types are

present in WG and SG and the type of carbohydrates in the IF. Therefore, elucidating the

possible beneficial effects that guava consumption exerts on the production of metabolites

during colonic fermentation of the IF is important. Therefore, the aim of this work was to


60

identify and quantify the type of carbohydrates and PC in WG and SG as eaten, to identify

gut metabolites from the in vitro colonic fermentation of guava IF, and to test the

antiproliferative activity of fermentation extracts on HT-29 cancer cell lines.

MATERIALS AND METHODS

Raw materials

White guava (Psidium guajava L.) fruits were purchased from a local market in Tepic

Nayarit, Mexico. Fruits were sanitized (300 ppm chloride sodium), and the peduncules

were removed. The fruits were divided into two batches: 1) whole guava (WG) to emulate

the fruit as eaten, and 2) seedless guava (SG) to evaluate the possible effect of seeds as

eaten. The samples were freeze-dried (Labconco Freezone 4.0, USA), ground (Nutribullet,

NBR-0804B, USA) and sieved (0.5 µm). The samples were sealed in a hermetic container

and stored at -20 °C until analysis.

Quantification and analysis of PC in WG and SG by HPLC-DAD-MS

For PC quantification, organic aqueous extraction was performed on samples with an

acidified methanol (0.8% of 2N HCl) water solution (50:50 v/v) and an acetone–water


61

solution (80:20 v/v) (Pérez-Jiménez et al., 2008). PC contents were determined in the

extracts, previously obtained according to Montreau (1972) with some modifications,

using a microplate reader (BioTek® Synergy HT, USA). Absorbance was read at 750 nm

against a blank, and total soluble polyphenols (TSP) were measured using a gallic acid

calibration curve. The results are expressed as gallic acid equivalents (GAE)/100 g of

sample dry weight (DW).

The identification of PC present in guava fruit was carried out using the methodology

proposed by Blancas-Benitez et al. (2018). The previously obtained samples were injected

(10 μL, flow rate 0.4 mL/min) into a Poroshell column (120 EC-C18, 4.6 mm × 150 mm,

particle size 2.7 μm, Agilent Technologies) in an HPLC Agilent 1260 series (Agilent

Technologies, Santa Clara, CA, USA) equipped with a UV–Vis diode array detector

(DAD). Gradient elution was carried out using water containing 1% trifluoracetic acid

(Sigma Aldrich, St Louis MO, USA) as solvent A and acetonitrile (Sigma Aldrich, St

Louis MO, USA) as solvent B and applied as follows: 0 min, 5% B; 10 min, 23% B; 15

min, 50% B; 20 min, 50% B; 23 min, 100% B; 25 min, 100% B; 27 min, 5% B, 30 min,

5% B. DAD detection was performed from 280-320 nm. For the MS assay, a 6120 Agilent

Quadrupole LC/MS was coupled to the HPLC, equipped with an electrospray ionization

interface in negative ionization mode under the following conditions: drying gas flow


62

(N2), 13.0 L/min; nebulizer pressure, 40 psi; gas drying temperature, 350 °C; capillary

voltage, 3500 V; and scan range, M/Z 100–1000. Data analysis was performed using

OpenLab CDS ChemStation Edition software (Agilent Technologies, Santa Clara, CA,

USA).

Quantification and isolation of IFs

The quantification of total indigestible fractions (TIFs), soluble indigestible fractions

(SIFs) and insoluble indigestible fractions (IIFs) was performed using the method

proposed by Saura-Calixto et al. (2000) following in vitro gastrointestinal digestion. This

method simulates the physiological conditions in the upper gastrointestinal tract. The

method was run on a preparative scale according to the modifications proposed by

Tabernero et al. (2011). IIF was considered to be the digestion residues pelleted by

centrifugation, while those retained by dialysis represented the SIF, and the TIF was

represented by the sum of SIF and IIF. TIF was collected, freeze-dried, milled (Universal

Mill, M20, IKA, USA), sieved (500-μm mesh), and stored in sealed bags at −20 °C.

Total and neutral sugars and uronic acid contents in WG and SG and the TIFs, SIFs,

and IIFs of WG and SG


63

The total sugar contents in WG and SG and each IF (TIF, SIF and IIF) was determined

using the anthrone method (Southgate, 1991). Uronic acids were determined with the

simplified method provided by Ahmed and Labavitch (1978). Galacturonic acid (Sigma

Aldrich, St Louis MO, USA) was used as a calibration standard for quantification. Neutral

sugar content was determined by derivatizing saccharides to alditol acetates using the

method proposed by Blakeney et al., (1983), which consists of three stages: hydrolysis,

reduction, and acetylation. The derivatized products were resuspended in 150 μL of

acetone and injected into a gas chromatograph (Agilent Technologies, Santa Clara, CA,

USA) with a flame ionization detector (FID), reaching a temperature of 250 °C. A DB-23

capillary column (30 m x 0.25 mm, 210 °C) was used with a constant helium flow (3

mL/min) as the carrier gas. Myo-inositol was used as the internal standard, and the

concentration of neutral sugars was calculated with calibration curves from rhamnose,

fucose, arabinose, xylose, mannose, galactose, and glucose (Sigma Aldrich, St Louis MO,

USA).

In vitro colonic fermentation in the IFs of WG and SG

The TIFs of WG and SG samples were submitted to an in vitro colonic fermentation

process under anaerobic conditions according to the method proposed by Campos-Vega et

al. (2009) with some modifications. Anaerobic conditions were maintained using a gas


64

mixture (10:10:80 H2:CO2:N2) in sterile basal nutrient medium adjusted to pH 7.0

containing (2 g/L) peptone water, (2 g/L) yeast extract, (0.1 g/L) NaCl, (0.04 g/L)

K2HPO4, (0.04 g/L) KH2PO4, (0.01 g/ L) MgSO4 -7H2O, (0.01 g/L) CaCl2 -2H2O, (0.01

g/L) NaHCO3, (0.5 g/L) cysteine HCl, (0.5 g/L) bile salts, (2 mL/L) Tween 80, and 0.2 g

of hematin (diluted in 5 mL of NaOH).

Fresh fecal samples were collected from four healthy donors (25-35 years old), two males

and two females (nutritional status based on body mass index: normal-weight) who were

obviously free of gastrointestinal diseases and had no declared antibiotic treatments during

the previous 3 months. The fecal sample was immediately stored in an anaerobic jar

before use, diluted with phosphate buffer (0.1 mol/L, pH 7) and homogenized to obtain a

10 g/100 mL final solution as a fermentation inoculum.

The tubes containing basal culture medium were inoculated with 1 mL of fecal solution.

Fermentations were performed on 100 mg of TIFs of WG and SG at 37 °C. Raffinose (50

mg, R0514, Sigma Aldrich, St Louis MO, USA) was used as a fermentable sugar

reference. A negative blank from the culture medium and fecal inoculum was used.

During the fermentation, the pH of the sample, SCFA production and PC were monitored

at 12, 24 and 48 h. Fermentation was stopped by placing the tubes in a freezer at -70 °C.

The molar ratio was calculated as (individual SCFA concentration)/(total SCFA


65

concentration). Fermentability (%) was calculated as (SCFA sample)/ (SCFA raffinose))

x100.

SCFA determination in the IFs fermented from WG and SG

The samples were subjected to liquid-liquid microextraction (LLME). Briefly, 1 mL

aliquots of the fermentation supernatant were added to 500 μL of ethyl acetate and

vortexed for 1 min. The samples were centrifuged (4400 xg, for 5 min), the supernatants

were recovered, and the extraction was repeated. The supernatant was mixed with the

previous extract. The extracts obtained were used for the determination of SCFA using the

method proposed by Han et al. (2015); 20 μL of extract was reacted with 10 μL of 3-

nitrophenylhydrazine (3-NPH-HCl, 40 mM) and 10 μL of 1-ethyl-3- (3-

dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC- HCl, 37.5 mM with 1.5% of pyridine). The

reaction mixture was incubated in a water bath at 40 °C for 30 min and placed in an ice

bath for one min, and 960 μl of acetonitrile: water (10:90 v/v) was then added. The

mixture was filtered with 0.45 μm pore diameter acrodiscs, and an insert was placed for

study. Sample analysis was performed with an Acquity UPLC system (Waters Corp.

Milford, MA, USA) coupled to a triple quadrupole Xevo TQ-S tandem mass spectrometer

(Waters Corp. Corp., Milford, MA, USA). A 100 mm x 2.1 x 1.7 μm Acquity UPLC BEH

C18 column (Waters Corp. Corp., Milford, MA, USA) was used for the SCFA separation.


66

A UPLC column used water: formic acid (100:0.01, v/v; solvent A) and acetonitrile:

formic acid (100:0.01, v/v; solvent B) as the mobile phase for gradient elution. The

column flow rate was 0.35 mL/min. The column temperature was 40 °C, and the

autosampler was kept at 5 °C. The binary solvent elution gradient was optimized at 15% B

for 2 min, 15%–55% B for 9 min, and held at 100% B for 1 min. The column was

equilibrated for 3 min at 15% B between injections. The analysis was performed in

negative ionization mode for the MS assays. Typical optimized ESI-MS parameters were

determined in this manner: ESI capillary voltage, -4200 V; nebulizer gas (N2), 35

(arbitrary units); curtain gas (N2), 20 (arbitrary units); collision gas (N2), 3 (arbitrary

units); entrance potential, -10 V; and collision cell exit potential, -20 V. The drying gas

(N2) flow and temperature were 35 (arbitrary units) and 45 °C, respectively. Full-mass Q1

scans were performed over the mass range from m/z 100 to 300 in profile mode using a

0.5-s scan time. Control and data analyses of the UPLC spectrophotometer and the Xevo

TQ-S Triple Quadrupole mass tandem were performed with MassLinx software (Waters

Corp. Corp., Milford, MA, USA).

PC identification in fermentation supernatants

Supernatants from the IFs of WG and SG fermentation samples were centrifuged for 10

min at 10,000 x g. After centrifugation was complete, 90 μL of the supernatant was taken.


67

Sample analysis was performed with an Acquity UPLC system (Waters Corp. Corp.,

Milford, MA, USA) coupled to a triple quadrupole Xevo TQ-S tandem mass spectrometer

(Waters Corp. Corp., Milford, MA, USA). A 100 mm x 2.1 x 1.7 μm Acquity UPLC BEH

C18 column (Waters Corp. Corp., Milford, MA, USA) was used for the determination of

PC. The determination was performed in negative ionization mode for the MS assays. ESI

conditions were set at a capillary voltage of 2.85 kV, a desolvation temperature of 500 °C,

a source temperature of 150 °C, desolvation and cone gas flows of 794 L / h and 151 L / h,

respectively, and a collision gas flow of 0.14 mL / min. The elution profile included two

solvents: water acidified with 7.5 mM formic acid and LC-MS acetonitrile. Multiple

reaction monitoring data were recorded from 0 to 13.5 min. The routine was used to

control the stability of ionization efficiency of the mass spectrometer, and a mixture of

different phenolic compounds was used to monitor retention time and m/z values. Control

and data analyses of the UPLC spectrophotometer and Xevo TQ-S triple/triple quadrupole

tandem were performed using MassLinx software (Waters Corp. Corp., Milford, MA,

USA).

Cell Line Assay

The HT-29 (HTB-38; ATCC) cell line used was a model for colon cancer. Cell growth

was carried out in 100 mm Petri dishes. The growth medium comprised RPMI-1640 with


68

10% fetal bovine serum (FSB) and 1% penicillin-streptomycin. Incubation was performed

at 37 °C in a humidified atmosphere with 5% CO2. During cell growth, the medium was

changed every two days. Cells were subcultured every 4-5 days to a concentration suitable

for the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylthiazole bromide) assay (9600

cells/well).

Measurement of anti-proliferative activity by the MTT assay

Antiproliferative activity was assessed using the MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-

diphenylthiazole bromide) assay (Hajiaghaalipour, Kanthimathi, Sanusi, &

Rajarajeswaran, 2015; Rai et al., 2018), which indirectly measures cellular viability. Cells

were seeded into 96-well plates at a density of 9.6 x 10 3 cells / well in RPMI medium.

Treatments were placed in wells with the growing cells and incubated for 24 h. The

samples were previously dissolved in RPMI medium. After the time of contact, culture

media were recovered with treatments, and the wells were washed twice with PBS (1X) to

remove residue from the extracts. The MTT solution was added, and the plates were

incubated for 4 h. The generated formazan crystals were resuspended in 200 μl of DMSO.

Absorbance readings were performed at 570 and 690 nm using a microplate reader. The

percentage (%) of inhibition was calculated using Eq (1):


69

(Eq 1)

Statistical analysis

The results are presented as the average values of three determinations ± standard

deviation. They were analyzed by analysis of variance (ANOVA) and a minimum

significant difference Tukey test with a confidence level of 95% using Statistica version

8.0.

RESULTS AND DISCUSSION

Total, soluble and insoluble indigestible fraction contents in WG and SG

Table 1 shows the IF contents. Significant differences (p<0.05) between TIFs in WG

(60.38%) and SG (49.99%) were observed, potentially because of the seed removal, which

is an important source of IF (which contains 85.9% of TIF). The SIF content was higher in

SG (4.03%) than in WG (2.8 %). SG showed higher SIF content but lower TIF content


70

due to the contribution of the seed in the IIF. However, when seeds were removed, the

percentages of SIF and IIF changed, as seeds represent a good proportion of IF

recommended for daily intake in a healthy diet (Saura-Calixto, 2010).

Total and neutral sugars and uronic acids contents in WG and SG as well as the SIFs,

IIFs and TIFs of WG and SG

Table 2 shows the contents of total and neutral sugars and the uronic acid profiles in WG

and SG samples and in the indigestible fractions (SIF, IIF, TIF). Non-significant

differences (p>0.05) in total sugars between WG (21.27 ± 1.45%) and SG (21.86 ± 1.41%)

and uronic acid content in WG (5.320 ± 2.48%) and SG (5.328 ± 3.05%) were observed.

Most previous studies did not consider the content or type of individual carbohydrates that

constitute the complete fruit (Jiménez-Escrig, Rincón, Pulido, & Saura-Calixto, 2001).

The results obtained show the profile of neutral sugars in WG, mainly made up of glucose,

xylose, arabinose, galactose, and mannose, with rhamnose and fucose in minor

proportions. In SG, the major sugars were glucose, xylose, arabinose, galactose and

mannose and, in a lower proportion, rhamnose and fucose. In both samples, the main

compound was glucose, which is a free sugar found in the fruit (Ma, Sun, Chen, Zhang, &

Zhu, 2014). Xylose and arabinose are major compounds in both WG and SG. These

sugars comprise structural polysaccharides, such as xilogalacturonans, and minor


71

compounds identified in guava can also be components of other polysaccharides, such as

hemicelluloses. These polysaccharides are not digested by the organism and are DF

constituents in the fruit (Vincente, Manganaris, Ortiz, Sozzi, & Crisosto, 2014).

The contents of total sugars and uronic acids that comprise the SIF were not significantly

different (p>0.05) between WG and SG. The neutral sugar profile in SIF showed that the

major sugars in WG were arabinose, galactose, glucose, xylose, and rhamnose, and lower

proportions of fucose and mannose were observed. For SG, the major sugars identified

were the same but with slight differences between the samples analyzed, mainly between

the contents of arabinose, xylose and glucose. However, both samples showed similar

profiles. The results found in this study differ from those reported by Jiménez-Escrig et al.

(2001), who analyzed the components of the soluble DFs of guava peel and pulp. They

reported that the major sugars were arabinose and glucose in both samples. Seven

different sugars were identified in guava fruit as the main IF components. This can

elucidate the possible type of polysaccharide that can be in the fiber fractions and the IF.

Sugar profiles show that the main polysaccharides potentially comprising the SIFs in WG

and SG could be arabinose and galactose polysaccharides, including some arabinoxylans

(Huisman, Voragen, & Schols, 2000). Like in the SIF, the content of total sugars and

uronic acids that comprised the IIF were not significantly different (p>0.05) between WG


72

and SG. The results obtained in the neutral sugar profiles that comprise the IIF showed

that the major sugar was xylose (65.89%) for WG. Non-significant differences (p>0.05)

were observed in the IIF sugar profiles of both guava samples. The results for IIF were

similar to those reported by Jiménez-Escrig et al. (2001), who analyzed the components of

the insoluble DFs of guava peel and pulp. Xylose, glucose and arabinose were the

identified sugars in both guava samples. The resulting sugar profiles elucidated the

possible polysaccharides present in IIF fractions. In both WG and SG, the major sugars

identified were xylose, arabinose and galactose, which indicates that the IIF consists

mainly of hemicelluloses and some xylanes (Huisman et al., 2000), which mostly

contributed to the IIF contents of both samples tested.

PC profile in samples of guava fruit and indigestible fractions.

Table 2 shows the PC contents of WG and SG. Non-significant differences (p > 0.05)

between WG (5.17 ± 0.07 g GAE/100 g sample DW) and SG (5.77 ± 0.28 g GAE/100 g

sample DW) were found. Mahattanatawee et al. (2006) reported PC values similar to those

obtained in this study (5.480 g GAE/100 g DW). However, most guava studies focused on

the PC present in different parts of the plant and fruit. Jiménez-Escrig et al. (2001)

reported PC values of 5.87 g GAE/100 g DW and 2.63 g GAE/100 g Dw for guava skin

and guava pulp, respectively. These results were like those found in the present study for


73

guava peel. In WG and SG, gallocatechin, gallic acid, procyanidin isomers and

guavinoside B were the major PC present in WG. These compounds were reported in

leaves (Díaz-de-Cerio, Gómez-Caravaca, Verardo, Fernández-Gutiérrez, & Segura-

Carretero, 2016; Flores, Wu, Negrin, & Kennelly, 2015) and recently in guava fruit

(Blancas-Benitez et al., 2018).

Table 2 shows the identifications and quantifications of PC from SIF and IIF samples.

Non-significant differences (p > 0.05) between PC associated with the SIF of the SG

sample (5.74 ± 0.10 GAE/100 g DW) and PC associated with the SIF of the WG sample

(5.10 ± 0.29 GAE/100 g DW) were observed. The major PC in both WG and SG were

procyanidin isomers and guajaverin. As expected, fewer compounds were identified in

SIF than in the whole fruit. This may be because some compounds, such as gallocatechins,

are stable in gastric conditions and degraded in intestinal conditions (Lamothe, Azimy,

Bazinet, Couillard, & Britten, 2014). It was reported that the degradation of these

compounds during in vitro gastrointestinal digestion ranges from 60 to 100% (Neilson et

al., 2007). During the isolation of SIF, some PC released from the fruit matrix can be

eliminated by passive diffusion, which is the most common mechanism for lower weight

compound absorption, such as phenolic acids and some flavonoids aglycones (Velderrain-

Rodríguez et al., 2014).


74

The results of PC analysis associated with IIF showed non-significant differences (p>0.05)

between the PC associated with the IIF of the WG sample (1.73 ± 0.67 GAE/100 g dw)

and the PC associated with the IIF of the SG sample (1.51 ± 0.34 GAE/100 g dw) (Table

2). The major PC identified in WG and SG were quercetin and geranin isomers, a

dehydroellagitannin previously identified in guava leaves (Díaz-de-Cerio et al., 2016).

This compound has not been previously identified in WG and SG. During the digestion

process, polyphenols undergo oligomerization/oxidation transformations resulting in high-

molecular weight compounds (Neilson et al., 2007). Therefore, it is normal to identify

other transformed PC after the in vitro digestion, which occurs under different pHs and

enzymes.

Changes in pH during the in vitro fermentation of WG and SG IFs

One of the important changes that can occur during fermentation is pH modification of the

fermentation medium. The fermentation medium pH was monitored over 48 h (Figure 1).

The use of different substrates significantly affected (p<0.05) the pH of the medium. In

the case of raffinose, pH decreases were higher than those observed in WG and SG. The

highest pH decrease occurred for WG and SG at 12 h. Afterward, the pH remained

relatively stable for the rest of the fermentation process. The pH can be used as a marker

of the preventive power of colon health. Colonic pH can influence the gut microbiota


75

composition and the ability to prevent overgrowth of pathogenic bacteria, such as

Enterobacteriaceae and Clostridia (Zimmer et al., 2012).

Production of SCFA and the fermentation index

Total SCFA concentrations (Table 3) were higher using raffinose as a substrate at all the

analyzed times. The SG sample showed higher amounts of SCFA at 12 and 48 h than the

WG sample. After 24 hour of sample fermentation, non-significant differences (p<0.05) in

total SCFA content were observed. Acetic acid was the SCFA produced most during the

fermentation of raffinose. In the case of WG and SG samples, the amount of acetic acid

produced was lower than that of raffinose. This behavior was observed in samples after

12, 24 and 48 h. Particularly, acetate is rapidly absorbed and transported to the liver,

where it can exert beneficial effects, such as inducing glutation-S-transferase synthesis

and other stress response genes (Pool-Zobel, Veeriah, & Böhmer, 2005). Butyric acid is

the SCFA that is produced most by the fermentation of WG and SG, and it was present at

all the fermentation times analyzed. Higher concentrations of this SCFA compared to

those of raffinose in the samples at 12 h correlated with the highest concentrations of

butyric acid in the WG and SG samples. Butyric acid is the preferred substrate by

colonocytes. It regulates cell proliferation and differentiation and can serve as an energy

source for the growth of colonic epithelial cells. In addition, butyric acid induces


76

apoptosis and prevents the proliferation of tumor cells, reducing or preventing the

formation of malignant tumors (Sengupta, Muir, & Gibson, 2006). In the case of propionic

acid production, during the fermentation of the WG and SG samples, a profile similar to

that obtained in the fermentation of raffinose was observed at the three fermentation times

analyzed. This SCFA was shown to have beneficial properties, serving as an energy

source for the growth of colon epithelial cells and stimulating the apoptosis of colorectal

carcinoma cells (Geier, Butler, & Howarth, 2006). Isobutyric branched chain fatty acid

(BCFA) at 12 h of fermentation was produced in WG and SG, but not for raffinose. This

BCFA has been related to the increase in interleukin-1β in blood and the induction of cell

apoptosis (Ohara, Yoshino, & Kitajima, 2009).

The fermentability index (%) was calculated as the ratio of total SCFA production from

the substrates to the total SCFA produced from raffinose (data not shown). It was used as

a reference. WG and SG showed a higher fermentability index at 24 h; the value obtained

from fermentability was 78.84% for the WG sample and 84.74% for the SG sample. These

values were higher than those obtained in other studies where foods were analyzed as

eaten (Zamora-Gasga, Bello-Pérez, Ortíz-Basurto, Tovar, & Sáyago-Ayerdi, 2014) and

were even higher than those in the IF of a complete menu (Zamora-Gasga et al., 2017).

This may be because fruits have a high percentage of carbohydrates, which are used as


77

fermentable substrates by colonic microbiota (Hernot et al., 2009). Higher contents of

non-digestible components in a diet of complex foods are correlated with lower capacities

of digestion by microbiota (Hamaker & Tuncil, 2014; Zamora-Gasga et al., 2017). To the

best of our knowledge, no studies on the production of SCFA and the fermentability index

of whole fruits, such as guava, exist. Therefore, it is important to determine the type and

content of metabolites produced during the fermentation of IF from fruits.

Identification of PC present in the fermentation medium

The PC identified in the supernatants of the WG and SG fermentation samples are shown

in Table 4. In total, 15 compounds were identified in the supernatants of the fermentation

samples. However, quantifying these compounds was difficult because they were found in

traces. Although the concentrations of the compounds identified were minimal, the

presence of these bioactive compounds in fermentation extracts can contribute and exert

different health benefits on the colon. Particularly, quercetin derivatives, gallocatechin,

and procyanidin B are related to several health properties. These compounds were

reported to show hypoglycemic and hepatoprotective activity (Eidenberger, Selg, &

Krennhuber, 2013). They may be involved in the induction of apoptosis in human

melanoma cells (Lee et al., 2008), like gallocatechin and ellagitannins (Cerdá, Tomás-

Barberán, & Espín, 2005; Holt, Heiss, Kelm, & Keen, 2012). Procyanidins are the class of


78

PC with the most evidence (including clinical trials) of cardiometabolic beneficial effects

(González-Abuín et al., 2015). Naringenin is a flavanone that can promote moderate

cytostatic activity against cancer cell lines (Kang, Youn, Hong, & Kim, 2011). On the

other hand, the presence of compounds such as 3,4-dihydroxybenzoic and 4-

hydroxybenzoic acids shows that during the fermentation process, some PC, such as

procyanidin B, guajaverine, quercetin and geranin (which were previously identified in the

IF before the fermentation process), could be metabolized by colonic microbiota. Gut

microbiota can catalyze different reduction reactions of PC. These include the

hydrogenation of double bonds, carbonyl reductions and specific dehydroxylations (Espín,

González-Sarrías, & Tomás-Barberán, 2017). Several studies reported some effects of

these microbiota metabolites, such as exerting anti-inflammatory activity on colon cancer

cells by modulating the expression of some pro-inflammatory cytokines, cyclooxygenase-

2 and NF-kB activation (González-Sarrías, Larrosa, Tomás-Barberán, Dolara, & Espín,

2010; Hollebeeck et al., 2012)

Antiproliferative effect of GC and GS fermentation supernatants on HT-29 cancer cell

lines

Each supernatant from guava colonic fermentation samples, positive blank (raffinose)

supernatants and a negative control were used to determine the effect on a colon cancer


79

model (HT-29) to analyze the possible effects that fermentation products have on the

viability of HT-29 cells.

Figure 2 shows the percentage of mitochondrial enzymatic activity, which is directly

related to cell viability. Therefore, lower mitochondrial enzymatic activities are correlated

with lower HT-29 cell proliferation rates. The SG sample at the fermentation time of 12 h

showed a greater antiproliferative effect than the WG sample at this time. This agrees with

the fact that this sample exhibited a higher proportion of butyric acid. This SCFA plays a

main role in the regulation of cell proliferation and differentiation (Corrêa-Oliveira, Fachi,

Vieira, Sato, & Vinolo, 2016). In addition, the contents of acetic and propionic acid exert

beneficial effects on the colon (Al-Lahham, Peppelenbosch, Roelofsen, Vonk, & Venema,

2010). The WG-24 h sample showed a very similar antiproliferative activity to the SG-12

h samples, which agrees with the AGCC profile exhibited by this sample. The

antiproliferative effect of extracts from GC and SG fermentation samples may be due to

the induction of apoptosis and decreased DNA synthesis (Gupta, Siddique, Beg, Ara, &

Afzal, 2008). However, the antiproliferative effects of the WG and SG fermentation

extracts could be due to the presence of SCFA and the combination of different

compounds in the extracts. The results obtained from the analysis of the fermentation

extracts showed the presence of PC. Among these compounds, gallic acid was reported to


80

induce apoptosis in a variety of cancer cells, including stomach, colon, and lung cancer

cells (Lo et al., 2010; Yoon et al., 2013). García-Rivera et al. (2011) reported that gallic

acid inhibited colon cancer cells but was not reactive against normal cells. These

antiproliferative effects can be associated with reactive oxygen species (ROS)-dependent

apoptosis. In addition to gallic acid, a wide variety of PC, such as epicatechin and

gallocatechin, inhibit growth and induce apoptosis in human colon cancer cells, including

HT-29 cells (Dai & Mumper, 2010). Olivas-Aguirre et al. (2017) reported that penta-O-

galloyl-glucoside inhibited the growth of different cancer cells lines. This could indicate

that both glycosylated and free gallic acid may increase the antiproliferative power of WG

and SG fermentation extracts.

Conclusions

This study showed that both WG and SG of guava fruit are excellent fermentable

substrates for colonic bacteria, with fermentability percentages up to 78.84% and 84.74%,

respectively. The antiproliferative effect on the colonic cancer cell line HT-29 is

apparently related to the high fermentability in conjunction with the SCFA profile of

guava fruit and the presence of different PC in these extracts. Therefore, according to the

results obtained, we confirm that the consumption of guava fruit can contribute to colonic


81

health. Further studies are necessary to elucidate the possible mechanisms involved in the

biotransformation of guava fruit PC.

Acknowledgements

FJBB thanks the financial support from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología,

México (CONACyT) for the scholarship 378371 granted.


82

Table 1 Total, soluble and insoluble indigestible fraction content of whole and seedless guava 1

Whole Guava Seedless Guava

Total indigestible fraction 2 60.38 a 49.99 b

Soluble indigestible fraction 2.88 ± 0.41 b 4.03 ± 0.38 a

Insoluble indigestible fraction 57.50 ± 6.81 a 45.96 ± 1.36 b

1 Mean of three replicates ± standard deviation 2Total indigestible fraction as the sum of FIS +

FII


83

Table 2 Content of total sugars, uronic acid, neutral sugars profile and phenolic compounds profile in samples of whole guava and seedless guava as is consumed and, its indigestible, soluble and insoluble fractions.1

Whole Fruit Soluble Indigestible Fraction Insoluble Indigestible

Fraction




Total sugars (%) 21.27 ± 1.45a 21.86 ± 1.41a 14.99 ± 0.74a 13.79 ± 4.05a 14.31 ± 1.26a 13.59 ± 4.05a

Total uronic acids (%) 5.32 ± 2.48a 5.33 ± 3.05a 15.91 ± 0.97a 14.06 ± 3.78a 2.61 ± 1.25a 2.68 ± 1.74a

Neutral sugars (molar %)

Ramnose 0.87 ± 0.06b 1.31 ± 0.27 a 6.31 ± 0.29a 5.68 ± 0.26a 2.18 ± 0.07a 1.95 ± 0.28a

Fucose 0.37 ± 0.04b 0.49 ± 0.04 a 2.75 ± 0.29a 2.16 ± 0.10a 0.93 ± 0.14a 0.81 ± 0.06a

Arabinose 7.92 ± 0.61b 10.74 ± 0.44 a 46.11 ± 0.07b 51.97 ± 1.25a 16.65 ± 2.52a 17.01 ± 1.23a

Xilose 23.98 ± 3.48b 32.42 ± 0.74 a 7.67 ± 2.42a 5.35 ± 0.34b 65.89 ± 4.27a 69.26 ± 1.59a

Mannose 3.23 ± 0.24a 2.54 ± 0.92 a 2.33 ± 0.14a 2.55 ± 0.29a 1.07 ± 0.27a 1.06 ± 0.09a

Galactose 3.36 ± 0.14a 3.35 ± 0.09 a 20.09 ± 0.54a 20.52 ± 0.67a 7.26 ± 1.42a 5.82 ± 0.29a

Glucose 60.27 ± 3.61a 49.16 ± 0.79 b 14.74 ± 0.66a 11.76 ± 0.42b 6.03 ± 1.25a 4.11 ± 0.88a

Phenolic compounds 5.17 ± 0.07 a 5.77 ± 0.28 a 5.10 ± 0.29 a 5.74 ± 0.10 a 1.73 ± 0.67 a 1.51 ± 0.34 a

Phenolic profile (%)

Gallic acid 29.83 b 15.22 a n.d a n.d a n.d a n.d a

Hydroxybenzoic acid 0.06 a 0.04 a n.d a n.d a n.d a n.d a

Catechine 0.10 b 0.05 a n.d a n.d a n.d a n.d a

Chlorogenic acid 0.12 b 0.07 a n.d a n.d a n.d a n.d a

Ellagic acid 0.09 a 0.06 a n.d a n.d a n.d a n.d a

Vanillic acid 0.08 a 0.11 a n.d a n.d a n.d a n.d a

Ferulic acid 0.07 a 0.05 a n.d a n.d a n.d a n.d a

Naringenin 0.11 b 0.04 a n.d a n.d a 5.48 a 5.49 a

Coumaric acid 0.10 b 0.03 a n.d a n.d a n.d a n.d a

Quercetin 0.19 b 0.03 a n.d a n.d a 76.17 b 50.17 a

Gallocatechin 39.30 a 69.25 b n.d a n.d a n.d a n.d a

Guajaverin n.d a n.d a 39.74 a 39.65 a n.d a n.d a

Guavin A n.d a n.d a 2.90 b n.d a n.d a n.d a

Guavin B 13.57 b 10.94 a 1.34 b n.d a n.d a n.d a

Procyanidin B Isomer 16.36 b 4.051 a 56.00 a 55.16 a n.d a n.d a

Geraniin isomer n.d a n.d a n.d a 5.18 b 18.34 a 44.34 b

1Different lowercase letters indicate significant differences in columns among samples (p < 0.05).


84

Figure 1 Changes in pH during the colonic fermentation, different lowercase letters indicate significant differences among substrates for a time (p < 0.05).


85

Table 3 Short-chain fatty acids (SCFA) production at 12, 24, 48 h (mmol/L produced per 100mg) of in vitro fermentation of raffinose

and indigestible fraction (IF) isolated from whole guava (WG) and seedless guava (SG)1.

12 hours 24 hours 48 hours

Rafinose WG SG Rafinose WG SG Rafinose WG SG

Total SCFA 10.78 ± 0.2c 6.07 ± 0.21a 8.01 ± 0.51 b 10.32 ± 0.32 b 8.14 ± 0.12 a 8.75 ± 0.15 a 13.02 ± 0.25 c 6.35 ± 0.21 a 9.74 ± 0.29 b

Acetic acid 5.25 ± 0.3 b 1.32 ± 0.23 a 1.88 ± 0.32 a 5.75 ± 0.42 c 1.90 ± 0.23 a 2.39 ± 0.12 b 5.42 ± 0.22 c 1.58 ± 0.19 a 2.55 ± 0.28 b

Propionic acid 2.18 ± 0.09 b 1.05 ± 0.41 a 1.73 ± 0.12 a 2.32 ± 0.10 b 1.46 ± 0.25 a 1.99 ± 0.11 a 2.17 ± 0.34 b 1.18 ± 0.11 a 2.07 ± 0.19 b

Butyric acid 3.26 ± 0.1 b 2.32 ± 0.22 a 2.86 ± 0.10 a 2.02 ± 0.26 a 2.84 ± 0.10 a 2.99 ± 0.17 a 4.87 ± 0.22 b 2.31± 0.25 a 3.12 ± 0.33 b

1The values are reported mean ± standard deviation (n=3); different lowercase letters indicate significant differences in columns among

substrates over the fermentation time (p < 0.05).

CAPITULO 7

86

Table 4 Phenolic compounds identified in guava colonic fermentation supernatants

No. Compound Rt (min) [M-H]- m/z MS2 ions m/z

1 Gallic acid 1.67 169 125, 79

2 Gallocatechine 2.56 305 164, 125

3 3,4 dihydroxybenzoic acid 3.20 153 109, 81

4 Procianidine B 3.63 577 425, 407, 289

5 Catechine 4.46 289 203, 109

6 Chlorogenic acid 4.47 353 191, 135

7 Procyanidine B2 4.47 577 425, 407, 289

8 4-hydroxybenzoic acid 4.57 137 93, 65

9 Caffeic acid 5.03 179 135, 107, 79

10 Epicatechin 5.18 289 162, 125

11 Gallocatechin gallate 5.32 457 305, 169, 125

12 Coumaric acid 6.38 163 119, 93, 65

13 Ferulic acid 6.75 193 178, 149, 134

14 Naringin 7.65 579 271,151

15 Naringenin 9.33 271 151, 119, 107

CAPITULO 7

87

Figure 2 Antiproliferative effect of supernatants from fermentation of whole guava and seedless

guava at different fermentation times on HT-29 cell lines. Different lowercase letters indicate

significant differences among substrates over the fermentation time (p < 0.05).

CAPÍTULO 7 CONCLUSIONES

88

CAPÍTULO 7 CONCLUSIONES

En este estudio, las muestras de guayaba entera o sin semillas mostraron, una liberación cinética gradual de compuestos fenólicos y una bioaccesibilidad similar en el intestino delgado (aproximadamente 70%). Sin embargo, hubo una mayor proporción de compuestos fenólicos (guavina A o guavina B) en la fracción no bioaccesible de guayaba entera que podría indicar efectos biológicos diferenciales. Los compuestos procianidina B y guajaverina, previamente identificados en hojas y tallos del árbol de guayaba, se detectaron en la parte comestible de la guayaba por primera vez indicando un beneficio adicional para el consumo de esta fruta. Estos resultados indican que el consumo de la guayaba, tanto con semilla como sin semilla, puede contribuir a aumentar el consumo y la asimilación de compuestos fenólicos en la dieta, y representa una base para futuros estudios sobre los efectos de la bioaccesibilidad.

Se demostró que la guayaba tanto completa como sin semilla es una excelente fuente de fracción indigestible y compuestos fenólicos. En concreto, los resultados obtenidos indican que la fracción indigestible de la guayaba es un excelente sustrato fermentable para bacterias colónicas, con porcentajes de fermentación de hasta 84.74% en guayaba sin semilla y hasta 78.84% para guayaba entera. Esta alta fermentabilidad junto con el perfil ácidos grasos de cadena corta durante la fermentación de la fracción indigestible del fruto de guayaba y los compuestos fenólicos presentes en los extractos de la fermentación, mostraron un efecto antiproliferativo en las líneas celulares de cáncer de colon HT-29. Con los resultados obtenidos en esta investigación, podemos proponer que el consumo frecuente de guayaba, entera o sin semilla, podría contribuir mejorar la salud del colon. Sin embargo se necesitan más estudios para dilucidar los mecanismos implicados en la bioatransformación de los compuestos fenólicos presentes en el fruto de guayaba y los posibles efectos beneficiosos de los mismos.

CAPÍTULO 8 BIBLIOGRAFÍA

89

CAPITULO 8 BIBLIOGRAFÍA 1 2Adsule, R. N., & Kadam, S. S. (1995). Guava. FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY-3

NEW YORK-MARCEL DEKKER-, 419. 4Aguirre, M., Eck, A., Koenen, M. E., Savelkoul, P. H. M., Budding, A. E., & Venema, K. 5

(2016). Diet drives quick changes in the metabolic activity and composition of 6human gut microbiota in a validated in vitro gut model. Research in Microbiology, 7167(2), 114–125. 8

Ahmed, A. E., & Labavitch, J. M. (1978). A simplified method for accurate determination 9of cell wall uronide content. Journal of Food Biochemistry, 1(4), 361–365. Retrieved 10from http://dx.doi.org/10.1111/j.1745-4514.1978.tb00193.x 11

Ajila, C. M., & Prasada Rao, U. J. S. (2013). Mango peel dietary fibre: Composition and 12associated bound phenolics. Journal of Functional Foods. 13

Al-Lahham, S. H., Peppelenbosch, M. P., Roelofsen, H., Vonk, R. J., & Venema, K. 14(2010). Biological effects of propionic acid in humans; metabolism, potential 15applications and underlying mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular 16and Cell Biology of Lipids (Vol. 1801). http://doi.org/10.1016/j.bbalip.2010.07.007 17

Alminger, M., Aura, A. M., Bohn, T., Dufour, C., El, S. N., Gomes, A., … Santos, C. N. 18(2014). In vitro models for studying secondary plant metabolite digestion and 19bioaccessibility. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 13(4), 20413–436. http://doi.org/10.1111/1541-4337.12081 21

Araújo, J. R., Gonçalves, P., & Martel, F. (2011). Chemopreventive effect of dietary 22polyphenols in colorectal cancer cell lines. Nutrition Research, 31(2), 77–87. 23

Arranz, S., Saura-Calixto, F., Shaha, S., & Kroon, P. A. (2009). High contents of 24


90

nonextractable polyphenols in fruits suggest that polyphenol contents of plant foods 25have been underestimated. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(16), 267298–7303. 27

Bingham, S. A., Day, N. E., Luben, R., Ferrari, P., Slimani, N., Norat, T., … Boeing, H. 28(2003). Dietary fibre in food and protection against colorectal cancer in the European 29Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC): an observational study. 30The Lancet, 361(9368), 1496–1501. 31

Blakeney, A. B., Harris, P. J., Henry, R. J., & Stone, B. A. (1983). A simple and rapid 32preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis. Carbohydrate Research, 33113(2), 291–299. Retrieved from 34http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0008621583882445 35

Blancas-Benitez, F. J., Mercado-Mercado, G., Quirós-Sauceda, A. E., Montalvo-36González, E., González-Aguilar, G. A., & Sáyago-Ayerdi, S. G. (2015). 37Bioaccessibility of polyphenols associated with dietary fiber and in vitro kinetics 38release of polyphenols in Mexican ‘Ataulfo’ mango (Mangifera indica L.) by-39products. Food Funct., 6(3), 859–868. http://doi.org/10.1039/C4FO00982G 40

Blancas-Benitez, F. J., Pérez-Jiménez, J., Montalvo-González, E., González-Aguilar, G. 41A., & Sáyago-Ayerdi, S. G. (2018). In vitro evaluation of the kinetics of the release 42of phenolic compounds from guava ( Psidium guajava L.) fruit. Journal of 43Functional Foods, 43(November 2017), 139–145. 44http://doi.org/10.1016/j.jff.2018.02.011 45

Bravo, L. (1998). Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional 46significance. Nutrition Reviews, 56(11), 317–333. 47

Brownlee, I. A., Dettmar, P. W., Strugala, V., & Pearson, J. P. (2006). The interaction of 48


91

dietary fibres with the colon. Current Nutrition & Food Science, 2(3), 243–264. 49Campos-Vega, R., Reynoso-Camacho, R., Pedraza-Aboytes, G., Acosta-Gallegos, J. A., 50

Guzman-Maldonado, S. H., Paredes-Lopez, O., … Loarca-Piña, G. (2009). Chemical 51composition and in vitro polysaccharide fermentation of different beans (Phaseolus 52vulgaris L.). Journal of Food Science, 74(7), T59–T65. 53

Cerdá, B., Tomás-Barberán, F. A., & Espín, J. C. (2005). Metabolism of antioxidant and 54chemopreventive ellagitannins from strawberries, raspberries, walnuts, and oak-aged 55wine in humans: identification of biomarkers and individual variability. Journal of 56Agricultural and Food Chemistry, 53(2), 227–235. 57

Chandrasekara, A., & Shahidi, F. (2012). Bioaccessibility and antioxidant potential of 58millet grain phenolics as affected by simulated in vitro digestion and microbial 59fermentation. Journal of Functional Foods, 4(1), 226–237. 60http://doi.org/10.1016/j.jff.2011.11.001 61

Cilla, A., González-Sarrías, A., Tomás-Barberán, F. A., Espín, J. C., & Barberá, R. 62(2009). Availability of polyphenols in fruit beverages subjected to< i> in vitro</i> 63gastrointestinal digestion and their effects on proliferation, cell-cycle and apoptosis 64in human colon cancer Caco-2 cells. Food Chemistry, 114(3), 813–820. 65

Corrêa-Oliveira, R., Fachi, J. L., Vieira, A., Sato, F. T., & Vinolo, M. A. R. (2016). 66Regulation of immune cell function by short-chain fatty acids. Clinical & 67Translational Immunology, 5(4). 68

Crozier, A., Jaganath, I. B., & Clifford, M. N. (2009). Dietary phenolics: chemistry, 69bioavailability and effects on health. Natural Product Reports, 26(8), 1001–1043. 70

Dai, J., & Mumper, R. J. (2010). Plant phenolics: extraction, analysis and their antioxidant 71and anticancer properties. Molecules, 15(10), 7313–7352. 72


92

De Souza, V. R., Pereira, P. A. P., Queiroz, F., Borges, S. V., & De Deus Souza Carneiro, 73J. (2012). Determination of bioactive compounds, antioxidant activity and chemical 74composition of Cerrado Brazilian fruits. Food Chemistry, 134(1), 381–386. 75http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.02.191 76

Dembitsky, V. M., Poovarodom, S., Leontowicz, H., Leontowicz, M., Vearasilp, S., 77Trakhtenberg, S., & Gorinstein, S. (2011). The multiple nutrition properties of some 78exotic fruits: Biological activity and active metabolites. Food Research International, 7944(7), 1671–1701. http://doi.org/10.1016/j.foodres.2011.03.003 80

Díaz-de-Cerio, E., Gómez-Caravaca, A. M., Verardo, V., Fernández-Gutiérrez, A., & 81Segura-Carretero, A. (2016). Determination of guava (Psidium guajava L.) leaf 82phenolic compounds using HPLC-DAD-QTOF-MS. Journal of Functional Foods, 8322, 376–388. 84

Espín, J. C., González-Sarrías, A., & Tomás-Barberán, F. A. (2017). The gut microbiota: 85A key factor in the therapeutic effects of (poly)phenols. Biochemical Pharmacology, 86139, 82–93. http://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.04.033 87

Fåk, F., Jakobsdottir, G., Kulcinskaja, E., Marungruang, N., Matziouridou, C., Nilsson, 88U., … Nyman, M. (2015). The physico-chemical properties of dietary fibre determine 89metabolic responses, short-chain fatty acid profiles and gut microbiota composition 90in rats fed low- and high-fat diets. PLoS ONE, 10(5), 1–17. 91http://doi.org/10.1371/journal.pone.0127252 92

Flint, H. J., Duncan, S. H., Scott, K. P., & Louis, P. (2015). Links between diet, gut 93microbiota composition and gut metabolism. Proceedings of the Nutrition Society, 9474(1), 13–22. 95

Flint, H. J., & Juge, N. (2015). Role of microbes in carbohydrate digestion. Food Science 96


93

& Technology, 29(1), 24–26. 97Flores, G., Wu, S.-B., Negrin, A., & Kennelly, E. J. (2015). Chemical composition and 98

antioxidant activity of seven cultivars of guava (Psidium guajava) fruits. Food 99Chemistry, 170, 327–335. http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.08.076 100

Garcia, G., Nanni, S., Figueira, I., Ivanov, I., McDougall, G. J., Stewart, D., … Brites, D. 101(2017). Bioaccessible (poly) phenol metabolites from raspberry protect neural cells 102from oxidative stress and attenuate microglia activation. Food Chemistry, 215, 274–103283. 104

Geier, M. S., Butler, R. N., & Howarth, G. S. (2006). Probiotics, prebiotics and synbiotics: 105a role in chemoprevention for colorectal cancer? Cancer Biology & Therapy, 5(10), 1061265–1269. 107

Goñi, S. G. S.-A., & Isabel. (2010). Hibiscus sabdariffa L: Fuente de fibra antioxidante. 108Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 60(1), 79. 109

González-Abuín, N., Pinent, M., Casanova-Martí, À., Arola, L., Blay, M., & Ardévol, A. 110(2015). Procyanidins and their healthy protective effects against type 2 diabetes. 111Current Medicinal Chemistry, 22(1), 39–50. 112

González-Aguilar, G. A., Blancas-Benitez, F. J., & Sáyago-Ayerdi, S. G. (2017). 113Polyphenols associated with dietary fibers in plant foods: molecular interactions and 114bioaccessibility. Current Opinion in Food Science, 13, 84–88. 115http://doi.org/10.1016/j.cofs.2017.03.004 116

González-Sarrías, A., Larrosa, M., Tomás-Barberán, F. A., Dolara, P., & Espín, J. C. 117(2010). NF-κB-dependent anti-inflammatory activity of urolithins, gut microbiota 118ellagic acid-derived metabolites, in human colonic fibroblasts. British Journal of 119Nutrition, 104(4), 503–512. 120


94

Gupta, J., Siddique, Y. H., Beg, T., Ara, G., & Afzal, M. (2008). A review on the 121beneficial effects of tea polyphenols on human health. International Journal of 122Pharmacology, 4(5), 314–338. 123

Hajiaghaalipour, F., Kanthimathi, M. S., Sanusi, J., & Rajarajeswaran, J. (2015). White 124tea (Camellia sinensis) inhibits proliferation of the colon cancer cell line, HT-29, 125activates caspases and protects DNA of normal cells against oxidative damage. Food 126Chemistry, 169, 401–410. http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.07.005 127

Hamaker, B. R., & Tuncil, Y. E. (2014). A perspective on the complexity of dietary fiber 128structures and their potential effect on the gut microbiota. Journal of Molecular 129Biology, 426(23), 3838–3850. 130

Han, J., Lin, K., Sequeira, C., & Borchers, C. H. (2015). An isotope-labeled chemical 131derivatization method for the quantitation of short-chain fatty acids in human feces 132by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 854, 13386–94. http://doi.org/10.1016/j.aca.2014.11.015 134

Hernot, D. C., Boileau, T. W., Bauer, L. L., Middelbos, I. S., Murphy, M. R., Swanson, K. 135S., & Fahey, G. C. (2009). In vitro fermentation profiles, gas production rates, and 136microbiota modulation as affected by certain fructans, galactooligosaccharides, and 137polydextrose. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(4), 1354–1361. 138http://doi.org/10.1021/jf802484j 139

Hervert-Hernández, D., García, O. P., Rosado, J. L., & Goñi, I. (2011). The contribution 140of fruits and vegetables to dietary intake of polyphenols and antioxidant capacity in a 141Mexican rural diet: Importance of fruit and vegetable variety. Food Research 142International, 44(5), 1182–1189. http://doi.org/10.1016/j.foodres.2010.09.021 143

Hinsberger, A., & Sandhu, B. K. (2004). Digestion and absorption. Current Paediatrics, 144


95

14(7), 605–611. 145Hollebeeck, S., Winand, J., Hérent, M.-F., During, A., Leclercq, J., Larondelle, Y., & 146

Schneider, Y.-J. (2012). Anti-inflammatory effects of pomegranate (Punica granatum 147L.) husk ellagitannins in Caco-2 cells, an in vitro model of human intestine. Food & 148Function, 3(8), 875–885. 149

Holst, B., & Williamson, G. (2008). Nutrients and phytochemicals: from bioavailability to 150bioefficacy beyond antioxidants. Current Opinion in Biotechnology, 19(2), 73–82. 151

Holt, R. R., Heiss, C., Kelm, M., & Keen, C. L. (2012). The potential of flavanol and 152procyanidin intake to influence age-related vascular disease. Journal of Nutrition in 153Gerontology and Geriatrics, 31(3), 290–323. 154

Huisman, M. H., Voragen, A. G. J., & Schols, H. A. (2000). Elucidation of the chemical 155fine structure of polysaccharides from soybean and maize kernel cell walls. 156

Jiang, L., Shen, X., Shoji, T., Kanda, T., Zhou, J., & Zhao, L. (2013). Characterization and 157activity of anthocyanins in Zijuan tea (Camellia sinensis var. kitamura). Journal of 158Agricultural and Food Chemistry, 61(13), 3306–3310. 159

Jiménez-Escrig, A., Rincón, M., Pulido, R., & Saura-Calixto, F. (2001). Guava fruit 160(Psidium guajava L.) as a new source of antioxidant dietary fiber. Journal of 161Agricultural and Food Chemistry, 49(11), 5489–5493. 162

Jonathan, M. C., Van Den Borne, J. J. G. C., Van Wiechen, P., Souza Da Silva, C., Schols, 163H. A., & Gruppen, H. (2012). In vitro fermentation of 12 dietary fibres by faecal 164inoculum from pigs and humans. Food Chemistry, 133(3), 889–897. 165http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.01.110 166

Kang, H. J., Youn, Y.-K., Hong, M.-K., & Kim, L. S. (2011). Antiproliferation and 167redifferentiation in thyroid cancer cell lines by polyphenol phytochemicals. Journal 168


96

of Korean Medical Science, 26(7), 893–899. 169Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., & Bäckhed, F. (2016). From dietary 170

fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell, 171165(6), 1332–1345. http://doi.org/10.1016/j.cell.2016.05.041 172

Lafay, S., & Gil-Izquierdo, A. (2008). Bioavailability of phenolic acids. Phytochemistry 173Reviews, 7(2), 301–311. 174

Lamothe, S., Azimy, N., Bazinet, L., Couillard, C., & Britten, M. (2014). Interaction of 175green tea polyphenols with dairy matrices in a simulated gastrointestinal 176environment. Food & Function, 5(10), 2621–2631. 177

Laurent, C., Besançon, P., & Caporiccio, B. (2007). Flavonoids from a grape seed extract 178interact with digestive secretions and intestinal cells as assessed in an in vitro 179digestion/Caco-2 cell culture model. Food Chemistry, 100(4), 1704–1712. 180

Lemmens, L., Van Buggenhout, S., Van Loey, A. M., & Hendrickx, M. E. (2010). Particle 181size reduction leading to cell wall rupture is more important for the β-carotene 182bioaccessibility of raw compared to thermally processed carrots. Journal of 183Agricultural and Food Chemistry, 58(24), 12769–12776. 184

Lim, Y. Y., Lim, T. T., & Tee, J. J. (2007). Antioxidant properties of several tropical 185fruits: A comparative study. Food Chemistry, 103(3), 1003–1008. 186

Liu, R. H. (2003). Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic 187combinations of phytochemicals. The American Journal of Clinical Nutrition, 78(3), 188517S–520S. 189

Lo, C., Lai, T.-Y., Yang, J.-H., Yang, J.-S., Ma, Y.-S., Weng, S.-W., … Chung, J.-G. 190(2010). Gallic acid induces apoptosis in A375. S2 human melanoma cells through 191caspase-dependent and-independent pathways. International Journal of Oncology, 192


97

37(2), 377–385. 193Lunn, J., & Buttriss, J. L. (2007). Carbohydrates and dietary fibre. Nutrition Bulletin, 194

32(1), 21–64. 195Ma, C., Sun, Z., Chen, C., Zhang, L., & Zhu, S. (2014). Simultaneous separation and 196

determination of fructose, sorbitol, glucose and sucrose in fruits by HPLC–ELSD. 197Food Chemistry, 145, 784–788. 198

Mahattanatawee, K., Manthey, J. A., Luzio, G., Talcott, S. T., Goodner, K., & Baldwin, E. 199A. (2006). Total antioxidant activity and fiber content of select Florida-grown 200tropical fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(19), 7355–7363. 201

Manach, C., & Donovan, J. L. (2004). Pharmacokinetics and metabolism of dietary 202flavonoids in humans. Free Radical Research, 38(8), 771–785. 203

Manach, C., Williamson, G., Morand, C., Scalbert, A., & Rémésy, C. (2005). 204Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. I. Review of 97 205bioavailability studies. The American Journal of Clinical Nutrition, 81(1), 230S–206242S. 207

Martínez-De Lara, J., Barrientos-Lara, M. C., Reyes-De Anda, A. C., Hernández-Delgado, 208S., Padilla-Ramírez, J. S., & Pérez, N. M. (2004). Diversidad fenotípica y genética en 209huertas de guayabo de Calvillo, Aguascalientes. Revista Fitotecnia Mexicana, 27, 210243–249. 211

McCleary, B. V, De Vries, J. W., Rader, J. I., Cohen, G., Prosky, L., Mugford, D. C., … 212Okuma, K. (2010). Determination of total dietary fiber (CODEX definition) by 213enzymatic-gravimetric method and liquid chromatography: collaborative study. 214Journal of AOAC International, 93(1), 221–233. 215

Medina, M. L., & Pagano, F. (2003). Caracterización de la pulpa de guayaba (Psidium 216


98

guajava L.) tipo “Criolla Roja.” 217Mercado-Mercado, G., Blancas-Benitez, F. J., Velderrain-Rodríguez, G. R., Montalvo-218

González, E., González-Aguilar, G. A., Alvarez-Parrilla, E., & Sáyago-Ayerdi, S. G. 219(2015). Bioaccessibility of polyphenols released and associated to dietary fibre in 220calyces and decoction residues of Roselle (Hibiscus sabdariffa L.). Journal of 221Functional Foods, 18, 171–181. http://doi.org/10.1016/j.jff.2015.07.001 222

Meyer, J. H. (1980). Gastric emptying of ordinary food: effect of antrum on particle size. 223American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 239(3), 224G133–G135. 225

Monagas, M., Urpi-Sarda, M., Sánchez-Patán, F., Llorach, R., Garrido, I., Gómez-226Cordovés, C., … Bartolomé, B. (2010). Insights into the metabolism and microbial 227biotransformation of dietary flavan-3-ols and the bioactivity of their metabolites. 228Food & Function, 1(3), 233–253. 229

Montreau, F. R. (1972). Sur le dosage des composés phénoliques totaux dans les vins par 230la methode Folin-Ciocalteau. Connaiss Vigne Vin, 24, 397–404. 231

Moo-Huchin, V. M., Estrada-Mota, I., Estrada-León, R., Cuevas-Glory, L., Ortiz-232Vázquez, E., Betancur-Ancona, D., & Sauri-Duch, E. (2014). Determination of some 233physicochemical characteristics, bioactive compounds and antioxidant activity of 234tropical fruits from Yucatan, Mexico. Food Chemistry, 152, 508–515. 235

Mosele, J. I., Macià, A., Romero, M. P., Motilva, M. J., & Rubió, L. (2015). Application 236of in vitro gastrointestinal digestion and colonic fermentation models to pomegranate 237products (juice, pulp and peel extract) to study the stability and catabolism of 238phenolic compounds. Journal of Functional Foods, 14, 529–540. 239http://doi.org/10.1016/j.jff.2015.02.026 240


99

Muñoz de Chávez, M., Ledesma Solano, J. A., Avila Curiel, A., Calvo, C., Castañeda 241López, J., & Castro González, I. (2002). Los alimentos y sus nutrientes. Tablas de 242valor nutritivo de alimentos. Los Alimentos y Sus Nutrientes: Tablas de Valor 243Nutritivo de Los Alimentos. 244

Neilson, A. P., Hopf, A. S., Cooper, B. R., Pereira, M. A., Bomser, J. A., & Ferruzzi, M. 245G. (2007). Catechin degradation with concurrent formation of homo-and 246heterocatechin dimers during in vitro digestion. Journal of Agricultural and Food 247Chemistry, 55(22), 8941–8949. 248

Ohara, T., Yoshino, K., & Kitajima, M. (2009). Pre-and probiotics increase host-cell 249immunological competence, improve bowel movement, and prevent the onset of 250colon cancer--an analysis based on movements of intestinal microbiota. Rinsho 251Byori. The Japanese Journal of Clinical Pathology, 57(6), 533–541. 252

Palafox-Carlos, H., Ayala-Zavala, J. F., & González-Aguilar, G. A. (2011). The role of 253dietary fiber in the bioaccessibility and bioavailability of fruit and vegetable 254antioxidants. Journal of Food Science, 76(1), R6–R15. 255

Parada, J., & Aguilera, J. M. (2007). Food microstructure affects the bioavailability of 256several nutrients. Journal of Food Science, 72(2), R21–R32. 257

Pérez-Jiménez, J., Arranz, S., Tabernero, M., Díaz-Rubio, M. E., Serrano, J., Goñi, I., & 258Saura-Calixto, F. (2008). Updated methodology to determine antioxidant capacity in 259plant foods, oils and beverages: Extraction, measurement and expression of results. 260Food Research International, 41(3), 274–285. 261

Pineda-Vadillo, C., Nau, F., Guerin-Dubiard, C., Jardin, J., Lechevalier, V., Sanz-262Buenhombre, M., … Dupont, D. (2017). The food matrix affects the anthocyanin 263profile of fortified egg and dairy matrices during processing and in vitro digestion. 264


100

Food Chemistry, 214, 486–496. http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.07.049 265Pool-Zobel, B., Veeriah, S., & Böhmer, F. D. (2005). Modulation of xenobiotic 266

metabolising enzymes by anticarcinogens - Focus on glutathione S-transferases and 267their role as targets of dietary chemoprevention in colorectal carcinogenesis. 268Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 269591(1–2), 74–92. http://doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2005.04.020 270

Quirós-Sauceda, A. E., Palafox-Carlos, H., Sáyago-Ayerdi, S. G., Ayala-Zavala, J. F., 271Bello-Perez, L. A., Álvarez-Parrilla, E., … González-Aguilar, G. A. (2014). Dietary 272fiber and phenolic compounds as functional ingredients: interaction and possible 273effect after ingestion. Food & Function, 5(6), 1063. 274http://doi.org/10.1039/c4fo00073k 275

Rai, Y., Pathak, R., Kumari, N., Sah, D. K., Pandey, S., Kalra, N., … Bhatt, A. N. (2018). 276Mitochondrial biogenesis and metabolic hyperactivation limits the application of 277MTT assay in the estimation of radiation induced growth inhibition. Scientific 278Reports, 8(1), 1531. 279

Renard, C. M. G. C., Watrelot, A. A., & Le Bourvellec, C. (2017). Interactions between 280polyphenols and polysaccharides: Mechanisms and consequences in food processing 281and digestion. Trends in Food Science and Technology, 60, 43–51. 282http://doi.org/10.1016/j.tifs.2016.10.022 283

Renard, C., Watrelot, A., & Le Bourvellec, C. (2017). Interactions between polyphenols 284and polysaccharides: Mechanisms and consequences in food processing and 285digestion Interactions between polyphenols and polysaccharides: Mechanisms and 286consequences in food processing and digestion. Trends in Food Science, 28760(November), 43–51. Retrieved from https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-01506642 288


101

Ríos-Covián, D., Ruas-Madiedo, P., Margolles, A., Gueimonde, M., de los Reyes-289Gavilán, C. G., & Salazar, N. (2016). Intestinal short chain fatty acids and their link 290with diet and human health. Frontiers in Microbiology, 7. 291

Saura-Calixto, F. (2011). Dietary fiber as a carrier of dietary antioxidants: an essential 292physiological function. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(1), 43–49. 293

Saura-Calixto, F. (2011). Dietary fiber as a carrier of dietary antioxidants: An essential 294physiological function. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(1), 43–49. 295http://doi.org/10.1021/jf1036596 296

Saura-Calixto, F., Garcia-Alonso, A., Goni, I., & Bravo, L. (2000). In vitro determination 297of the indigestible fraction in foods: an alternative to dietary fiber analysis. Journal of 298Agricultural and Food Chemistry, 48(8), 3342–3347. 299

Saura-Calixto, F., García-Alonso, A., Goni, I., & Bravo, L. (2000). In vitro determination 300of the indigestible fraction in foods: an alternative to dietary fiber analysis. Journal of 301Agricultural and Food Chemistry, 48(8), 3342–3347. 302

Sáyago-Ayerdi, S. G., & Goñi, I. (2010). Hibiscus sabdariffa L: source of antioxidant 303dietary fiber]. Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 60(1), 79. 304

Sáyago-Ayerdi, S. G., Zamora-Gasga, V. M., & Venema, K. (2017). Prebiotic effect of 305predigested mango peel on gut microbiota assessed in a dynamic in vitro model of 306the human colon (TIM-2). Food Research International, (October), 0–1. 307http://doi.org/10.1016/j.foodres.2017.12.024 308

Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., & Finlay, B. B. (2010). Gut microbiota in 309health and disease. Physiological Reviews, 90(3), 859–904. 310

Sengupta, S., Muir, J. G., & Gibson, P. R. (2006). Does butyrate protect from colorectal 311cancer? Journal of Gastroenterology and Hepatology, 21(1), 209–218. 312


102

Shim, S.-M., Ferruzzi, M. G., Kim, Y.-C., Janle, E. M., & Santerre, C. R. (2009). Impact 313of phytochemical-rich foods on bioaccessibility of mercury from fish. Food 314Chemistry, 112(1), 46–50. 315

SIAP. (2017). Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera. Secretaría de 316Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), 317http://infosiap.siap.gob.mx/aagricola_siap_gb/icul. 318

Southgate, D. A. T. (1991). Determination of food carbohydrates. Elsevier. 319Stone, B. C. (1970). The flora of Guam: A manual for the identification of the vascular 320

plants of the island (Vol. 6). University of Guam. 321Tabernero, M., Venema, K., Maathuis, A. J. H., & Saura-Calixto, F. D. (2011). Metabolite 322

production during in vitro colonic fermentation of dietary fiber: analysis and 323comparison of two European diets. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 32459(16), 8968–8975. 325

Tagliazucchi, D., Verzelloni, E., Bertolini, D., & Conte, A. (2010). In vitro bio-326accessibility and antioxidant activity of grape polyphenols. Food Chemistry, 120(2), 327599–606. 328

Terao, J. (2017). Factors modulating bioavailability of quercetin-related flavonoids and 329the consequences of their vascular function. Biochemical Pharmacology, 139, 15–23. 330http://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.03.021 331

Tokusoglu, O., & Hall, C. A. (2011). Fruit and Cereal Bioactives: Sources, Chemistry, 332and Applications. CRC Press. 333

Van der Kamp, J. W. (2010). Dietary Fibre: New Frontiers for Food and Health. 334Wageningen Academic Pub. 335

Velderrain-Rodríguez, G. R., Palafox-Carlos, H., Wall-Medrano, A., Ayala-Zavala, J. F., 336


103

Chen, C.-Y. O., Robles-Sánchez, M., … González-Aguilar, G. A. (2014). Phenolic 337compounds: their journey after intake. Food Funct., 5(2), 189–197. 338http://doi.org/10.1039/C3FO60361J 339

Vincente, A. R., Manganaris, G. A., Ortiz, C. M., Sozzi, G. O., & Crisosto, C. H. (2014). 340Nutritional Quality of fruits and vegetables. In Postharvest Handling (Third Edition) 341(pp. 69–122). Elsevier. 342

Walle, T., & Walle, U. K. (2003). The β-D-glucoside and sodium-dependent glucose 343transporter 1 (SGLT1)-inhibitor phloridzin is transported by both SGLT1 and 344multidrug resistance-associated proteins 1/2. Drug Metabolism and Disposition, 34531(11), 1288–1291. 346

Wang, T. yang, Li, Q., & Bi, K. shun. (2017). Bioactive flavonoids in medicinal plants: 347Structure, activity and biological fate. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 348http://doi.org/10.1016/j.ajps.2017.08.004 349

Wolffram, S., Blöck, M., & Ader, P. (2002). Quercetin-3-glucoside is transported by the 350glucose carrier SGLT1 across the brush border membrane of rat small intestine. The 351Journal of Nutrition, 132(4), 630–635. 352

Yoon, C.-H., Chung, S.-J., Lee, S.-W., Park, Y.-B., Lee, S.-K., & Park, M.-C. (2013). 353Gallic acid, a natural polyphenolic acid, induces apoptosis and inhibits 354proinflammatory gene expressions in rheumatoid arthritis fibroblast-like 355synoviocytes. Joint Bone Spine, 80(3), 274–279. 356

Zamora-Gasga, V. M., Bello-Pérez, L. A., Ortíz-Basurto, R. I., Tovar, J., & Sáyago-357Ayerdi, S. G. (2014). Granola bars prepared with Agave tequilana ingredients: 358Chemical composition and invitro starch hydrolysis. LWT - Food Science and 359Technology, 56(2), 309–314. http://doi.org/10.1016/j.lwt.2013.12.016 360


104

Zamora-Gasga, V. M., Loarca-Piña, G., Vázquez-Landaverde, P. A., Ortiz-Basurto, R. I., 361Tovar, J., & Sáyago-Ayerdi, S. G. (2015). In vitro colonic fermentation of food 362ingredients isolated from Agave tequilana Weber var. azul applied on granola bars. 363LWT-Food Science and Technology, 60(2), 766–772. 364

Zamora-Gasga, V. M., Montalvo-González, E., Loarca-Piña, G., Vázquez-Landaverde, P. 365A., Tovar, J., & Sáyago-Ayerdi, S. G. (2017). Microbial metabolites profile during in 366vitro human colonic fermentation of breakfast menus consumed by Mexican school 367children. Food Research International, 97, 7–14. 368http://doi.org/10.1016/j.foodres.2017.03.038 369

Zimmer, J., Lange, B., Frick, J.-S., Sauer, H., Zimmermann, K., Schwiertz, A., … Enck, 370P. (2012). A vegan or vegetarian diet substantially alters the human colonic faecal 371microbiota. European Journal of Clinical Nutrition, 66(1), 53. 372

373

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICOpnpc.ittepic.edu.mx/tesis/Repositorio_programa_2014/2014...1.4...

Documents

Transcript of TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICOpnpc.ittepic.edu.mx/tesis/Repositorio_programa_2014/2014...1.4...