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Guía de Trabajos Prácticos Microbiología Ambiental y Parasitología

Tecnicatura Superior en

Gestión Ambiental

UNViMe 2017

Guía TP Microbiología- TSGA 2017

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Trabajo Práctico Nº 1 Parte A: LA SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA

Objetivo

- Adquirir conciencia de los riesgos potenciales durante el trabajo en el Laboratorio de Microbiología

- Reconocer las vías de infección más comunes en el laboratorio - Identificar los distintos niveles de bioseguridad en Microbiología y los

requerimientos de protección personal, del medio ambiente y de las muestras en cada uno de ellos.

Introducción

Las personas que trabajan en un laboratorio QUÍMICO están expuestas a una serie

de riesgos potencialmente graves. Comúnmente están en contacto con sustancias y

vapores tóxicos y explosivos, carcinógenos, sustancias cáusticas, altos voltajes,

radiaciones, etc. En un laboratorio de Microbiología hay que agregar otro riesgo: la

INFECCION por microorganismos.

La infección difiere de la mayoría de los otros riesgos en que los efectos no están

limitados a quien trabaja individualmente ni a sus compañeros de trabajo, sino que la

infección también puede ser transmitida fuera del laboratorio, a su familia, contactos

humanos casuales, animales domésticos o de experimentación, etc. No debe olvidarse

que pueden diseminarse agentes no patógenos para los seres humanos, pero capaces de

contaminar medios de cultivo, reactivos o que afectan la vida de las plantas.

Vías de infección más comunes en el laboratorio

- tracto digestivo: ingestión o transferencia de microorganismos desde dedos contaminados.

- mucosas: nasal, conjuntiva, aerosoles y manos contaminadas - piel – vía percutánea: inyección, cortes o escoriaciones. - respiratoria: es la más importante. El 80% de las infecciones contraídas en el

laboratorio son de origen aéreo por inhalación de aerosoles que transportan microorganismos o virus.


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Importancia de la vía respiratoria

Se deben tener en cuenta 3 factores principales.

- La facilidad con que se producen pequeñas gotas y partículas. - Las pequeñas partículas (entre 1-4 µm) no son retenidas en el tracto

respiratorio y llegan a pulmón. - La capacidad de la mayoría de los microorganismos patógenos para invadir

tejido pulmonar.

La infectividad de un microorganismo depende de:

- el tamaño de la dosis

- la susceptibilidad individual - la virulencia del agente (varía con el microorganismo y la cepa) - el sitio de invasión

Situaciones de riesgo más comunes en el Laboratorio

Mecanismo de producción de aerosoles

La producción de aerosoles es generada por 2 mecanismos:

- atomización de suspensiones líquidas - molido muy fino de material sólido infectado

Muchas técnicas de laboratorio producen distintos aerosoles mediante burbujeo,

salpicadura, espuma, quemado del ansa, y dos mecanismos adicionales: vibración de alta

frecuencia y fuerza centrífuga. Los aerosoles también se producen cuando se manipulan

cultivos secos, liofilizados o secados con acetona (ej. cuando se destapan tubos o

ampollas).

Técnicas comunes de laboratorio

Además de la producción de aerosoles hay que tener en cuenta el riesgo que se genera como consecuencia de la deposición de material infectado sobre distintas superficies, como la mesada de trabajo, elementos personales como cuadernos, lapiceras, y las propias manos, a partir de las cuales los microorganismos pueden ser transferidos a la piel, boca y ojos. Es recomendable el uso de guantes descartables, barbijo y gafas.


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Pipetas y pipeteo

Las pipetas se preparan para conservar su esterilidad hasta que son utilizadas. Una

práctica casi universal es colocar un tapón de algodón en la parte superior para prevenir la

entrada de polvo. Sin embargo, el tapón protege relativamente a quien usa la pipeta ya

que es fácilmente penetrado por microorganismos presentes en suspensiones líquidas. Las

pipetas contaminadas se descartan siempre en un frasco con lavandina.

El pipeteo oral debe ser evitado en Microbiología. Se recomienda el uso de propipeta.

El ansa

Mediante el flameado (quemado directo a la llama) del ansa o agujas contaminadas se

puede producir diseminación de organismos, particularmente cuando se trabaja con

inóculos semi-sólidos (ej. suspensiones de esporas, colonias de Mycobacterium o esputo).

También puede ocurrir con pequeños volúmenes de líquido.

El mismo riesgo se corre cuando se introduce el ansa caliente en un líquido, o se hace

contacto con la superficie de agar de un cultivo.

El ansa fría, una vez cargada, puede contaminar cuando se producen vibraciones o rápidos

movimientos de aire que causen desprendimiento de pequeñas gotas. Por esta razón, no

agite ni sacuda el ansa mientras trabaja.

Las placas de agar

La principal fuente de infección resulta cuando cae al suelo y se rompe una placa de Petri

con cultivo. El mismo riesgo se corre cuando se utilizan tubos o botellas con agar. En esos

casos, neutralice la contaminación con lavandina diluida y después de unos minutos

comience el operativo de limpieza usando guantes. Confine los restos de vidrio en un

recipiente que luego será esterilizado.

Tapones y tapas

La remoción de tapones de algodón, tapas a rosca o tapones de goma u otro tipo de tapa

en tubos con caldo de cultivo, tubos de centrífuga, etc., puede crear aerosoles de varias

maneras, sobre todo si los cultivos han sido agitados y hay material particulado. Oriente la

boca del tubo hacia el mechero en el momento de abrir!


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Hay que tener presente que los tapones de medios líquidos (sobre todo si se agitan

previamente) pueden estar humedecidos con material infectivo. Si es necesario agitar el

tubo, hacerlo con suavidad para evitar este inconveniente.

Precauciones Las medidas preventivas a tomar caen en 6 categorías:

- protección física del trabajador (guardapolvo, guantes, barbijo, gafas, uso de

propipeta, etc.) - técnicas cuidadosas: buen manejo de la técnica aséptica - métodos de confinamiento del agente (cámaras de bioseguridad, flujo laminar

vertical, ambientes aislados con presurización positiva o negativa, recipientes con desinfectante para descartar material contaminado, envases bien tapados, sin filtraciones).

- barreras intangibles (desinfección del aire: uso de lámparas UV, áreas estériles) - desinfección en general (empleo de etanol al 70%, alcohol iodado, lavandina

diluida u otros productos según el caso: piel, superficies inertes, instrumentos metálicos, etc).

- medidas inmunológicas (vacunación del personal cuando sea posible)

Nivel Prácticas y técnicas Equipamiento Alcance

1 Prácticas microbiológicas standard

Ninguno Agentes bien caracterizados que presentan riesgo mínimo para el personal y el medio ambiente Ej. Bacillus subtilis

2 Personal con entrenanamiento específico. Acceso restringido absoluto

GBS clase I ó II Agentes de moderada peligrosidad para el personal y el medioambiente. Ej. Salmonella, sangre, fluidos corporales, tejido humano y animal

3 Acceso más restringido. Registro de visitas y accidentes. Barreras de contención física: máscaras, guantes, rotores sellados, filtros HEPA

GBS clase II Agentes con potencial de transmisión aérea que pueden causar infección seria potencialmente letal. Alto riesgo personal, bajo riesgo comunitario Ej. Mycobacterium, Coxiella

4 Barreras de aire con el exterior. Cambio de ropa y ducha. Intercambio de ropa sucia a limpia por tuberías.

GBS tipo III Traje presurizado

Agentes exóticos productores de enfermedades letales para los que no existen vacunas ni terapia. Ej: virus Ebola


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Requerimientos recomendados para distintos niveles de bioseguridad en Microbiología

GBS: gabinete de bioseguridad.

Dirección de aire “limpio” Dirección de aire “contaminado”

REGLAS A TENER A CUENTA EN CADA SESIÓN DE TRABAJOS PRÁCTICOS

1. Reportar los accidentes al docente a cargo del Trabajo Práctico, no importa lo insignificante que puedan parecer. Se debe reportar toda enfermedad o lastimadura tan rápido como sea posible. La pérdida de tiempo en la identificación de una infección de laboratorio puede tener graves consecuencias.

2. Tratar a todos los microorganismos como patógenos potenciales para el ser humano, o contaminantes para los cultivos vecinos. Rotular todo el material infectivo para prevenir confusiones. Los números en código no son adecuados.

3. Usar ropa y elementos de seguridad (ej. guardapolvo, guantes, máscara, etc). 4. Manejar los materiales cuyo potencial patógeno se desconoce (ej. esputo, suero,

material fecal, microorganismos no identificados) como si fueran infectivos, ya que probablemente lo son.

5. El laboratorio debe permanecer siempre limpio. La mesada debe estar libre de todo material que no sea esencial. La superficie debe limpiarse antes y después de cada sesión de laboratorio con una solución germicida. Todo el material contaminado, cultivos, pipetas, tapones, etc., deberá ser esterilizado antes de ser lavado.

6. Antes de dejar el laboratorio, sacarse el guardapolvo, lavarse cuidadosamente las manos con agua y jabón y desinfectarlas.

7. Tener un desinfectante listo para ser usado en suficiente volumen para llevar a cabo una descontaminación de emergencia en el caso de salpicaduras. Asegurarse que el desinfectante sea activo contra el organismo que está siendo manejado.


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8. Nunca comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio, o pipetear con la boca. Usar propipetas o pipetas automáticas. Siempre recordar que las manos o guantes pueden estar contaminados y ser capaces de transferir la infección al cuerpo.

9. Nunca llevar a cabo una acción apresuradamente, en particular aquéllas que pueden producir burbujeo, salpicaduras, volcaduras o contaminar superficies que es necesario mantener limpias (ej. las tapas de las botellas).

Bibliografía

- Ferrari S., Mattana C., Digenaro M.S. y Favier G. 2011. Manual de Seguridad en el Laboratorio de Microbiología. Nueva Editorial Universitaria. ISBN/ISSN 978- 987-1595-68-6, UNSL, San Luis, Argentina.

- Microbiological safety cabinets. Reproducido de Collins C.H. Laboratory Acquired infections (2nd ed). Extraído del curso de posgrado Cultivo celulares y sus aplicaciones biotecnológicas. 1994. Laboratorio de Virología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA. Buenos Aires.


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Trabajo Práctico Nº 1 Parte B: ESTERILIZACION

OBJETIVOS

- Definir y diferenciar los conceptos de esterilización, desinfección y

pasteurización - Conocer diferentes métodos físicos y químicos de esterilización y desinfección

utilizados en el Laboratorio de Microbiología y sus aplicaciones - Adquirir conocimiento en la preparación de materiales y medios de cultivo a

esterilizar y en el manejo de equipos usados en esterilización. - Aplicar controles de esterilización y esterilidad a los procesos

INTRODUCCIÓN

A. CONCEPTOS

ESTERILIZACIÓN: Tratamiento mediante el que el objeto queda libre de todo organismo vivo.

Consigue eliminar a todos los microorganismos patógenos, saprofitos y formas de

resistencia. Éstas técnicas se usan exclusivamente sobre objetos inanimados, nunca en

seres vivos. Procedimiento mediante el cual la probabilidad de que el objeto tratado

contenga un solo superviviente sea infinitamente pequeña, produciendo ausencia absoluta

de toda forma viable de vida (la probabilidad de sobrevivencia de un microorganismo es

de 1 x 10-6, es decir 1 en un millón). El procedimiento físico o químico que se emplee

para la esterilización seguirá una cinética (curva de muerte) exponencial, que dependerá del

método, de el ente sobre el que se aplique y de la carga microbiana presente. Se aportarán

las condiciones necesarias para acabar con las formas de vida más resistentes, para tener

la seguridad de que se han destruido las más sensibles.

Muerte: Pérdida irreversible de cualquier capacidad para reproducirse

DESINFECCIÓN: Eliminación de todos los microorganismos patógenos, pero no

necesariamente de todas las formas microbianas. Uso de agentes químicos para eliminar la

infectividad potencial de un material mediante la destrucción de las formas vegetativas de


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los agentes patógenos. No implica la eliminación total de los microorganismos, ya que las

esporas pueden sobrevivirAplicación sobre objetos inanimados. Proceso o técnica de

destrucción de microorganismos patógenos y saprofitos productores de enfermedades

transmisibles y que pueden ser aplicado sobre seres animados u objetos inanimados, si se actúa

sobre:

Bacterias: bactericida

Hongos: fungicida

Virus: virucida

PASTEURIZACIÓN: es un proceso donde se aplican alternativamente altas y bajas

temperaturas para reducir en un 97-99% la población microbiana presente en leche y

otros alimentos. No es sinónimo de esterilización.

ANTISEPSIS: Se aplica sobre tejidos vivos, para inhibir o destruir microorganismos. Los

antisépticos son sustancias aplicada en la piel u otro tejido vivo que previene o detiene el

crecimiento o la acción de microorganismos por inhibición de su actividad o por su

destrucción. Son sustancias orgánicas o inorgánicas que sirven para la antisepsia cutánea y

para neutralizar la infección inhibiendo la proliferación de gérmenes. Es importante que

reúna las siguientes características:

Determinar características del agente tópico: no absorbible, reducción rápida de la

flora, espectro de actividad

Evaluar seguridad y eficacia en reducir el recuento de microorganismos

Aceptación por el personal que lo va a usar y que sea económico

B. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN

Existen diversos métodos físicos de esterilización y de inhibición del crecimiento

microbiano, como pueden ser el calor, la filtración y la radiación, pero el más

ampliamente usado es el calor, ya sea húmedo ó seco, los cuales tienen diferente

penetrabilidad.


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El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal

bacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y substancias, con el

propósito de matar a las bacterias que ellos contengan. Este proceso se llama

“Esterilización” y al material, cultivo ó medio de cultivo sometido a éste, se le denomina

entonces “Estéril”, es decir, desprovisto de toda forma viviente.

Cuando se efectúa experimentalmente la esterilización de una población

microbiana, contenida en un medio de cultivo ó en todo el material utilizado en

microbiología es de suma importancia conocer los diversos métodos de esterilización los

cuales se dividen en:

I. Esterilización por agentes físicos:

a. Esterilización por calor b. Esterilización por radiación

II. Esterilización por agentes mecánicos: Esterilización por filtración:

a. Fluidos líquidos b. Fluidos gaseosos: aire

III. Esterilización por agentes químicos:

óxido de etileno, glutaraldehido, formaldehido

IV. Esterilización en frío: gas plasma

I.a.- ESTERILIZACION POR CALOR:

Tyndalización: baño María a ebullición - calor húmedo vapor fluente

Autoclave a presión: 121°C durante 15-20 min.

- calor seco Aire caliente (estufa): 160-180°C durante 1.5-1 h respectivamente.


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- calor directo Llama directa: al rojo, flameado.

I.b- ESTERILIZACION POR RADIACION

a. luz ultravioleta b. radiaciones ionizantes

II.a- ESTERILIZACION POR FILTRACION DE FLUIDOS LIQUIDOS

Se aplica a aquellas sustancias que se alteran por contacto con el agua o por acción

del calor.

-membranas filtrantes Filtros standard

(actuales) Filtros especiales Ultrafiltros

II.b- ESTERILIZACION POR FILTRACION DE FLUIDOS GASEOSOS

La elección del método de esterilización depende del tipo de material a esterilizar,

así como la finalidad que se persiga.

MÉTODOS FÍSICOS

I.a.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR

La esterilización por calor es uno de los métodos más comúnmente utilizados en el

laboratorio, es muy útil para la cristalería, los medios de cultivo y para la esterilización de

los medios después de su utilización y este puede ser:

a. Calor Húmedo

b. Calor Seco

c. Calor Directo

a. Calor Húmedo

Se utiliza para esterilizar medios de cultivo, la esterilización se hace por el vapor a

presión en una autoclave u olla de presión.


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Descripción del autoclave.

Es un cilindro de acero inoxidable que consta de los siguientes elementos (Fig. 1):

Descripción de la olla.

Es de forma cilíndrica de acero inoxidable y consta de los siguientes elementos:

1) Un cuerpo cilíndrico con topes herméticos; 2) Una tapa que contiene un indicador de

presión y temperatura, una válvula de seguridad y una espita de escape de vapor (Fig. 2).


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Figura 2. El tipo olla de presión es el más común, es un aparato para agua hirviendo a

presión. Tiene una cámara vertical de metal provista de una tapa metálica fuerte que se

aprieta y cierra herméticamente mediante un aro de goma. Se disponen en la tapa una

espita para la salida del aire y el vapor, un indicador de presión y una válvula de seguridad.

El agua del fondo de la autoclave se calienta mediante mecheros de gas exterior, un

calentador eléctrico de inmersión o un serpentín de vapor.

b. Calor Seco

La esterilización se hace por medio de un horno que permite alcanzar

temperaturas más elevadas (150- 180°C) que no pueden soportar los medios de cultivo y

el material de goma ó plástico, se utiliza más para la esterilización del material de vidrio

(matraces, probetas, etc.) y en los instrumentos.

Descripción del Horno pasteur o estufa punpinel (Fig. 3)

Es de forma rectangular, tiene doble pared que permite circular el calor producido por

unos picos de gas ó una resistencia eléctrica. Se utiliza para esterilizar material de vidrio,

porcelana y también para objetos metálicos. El material deberá introducirse en la estufa

una vez limpio y seco, una vez introducido hay que procurar que estos no toquen las

paredes de la estufa, porque alcanza temperaturas muy altas. Una vez introducido el

material, se cierra la estufa y se enciende, dejándolo calentar hasta 180 º, dejándolo a

estas temperaturas por espacios de tiempo variables, dependiendo del tipo de material

que se ha introducido. Una vez transcurrido el tiempo deseado se apagará y se dejará

enfriar totalmente antes de sacar el material.


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c. Calor Directo

Se utiliza en asas bacteriológicas. La esterilización se efectúa directamente en la

flama del mechero (Fig.4).

Figura 4. La esterilización adecuada del material es importante para obtener los

resultados esperados.

I.b.- ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN

a. Radiación ultravioleta.

Su efectividad como agente letal y mutágeno depende de la longitud de onda. La

longitud de onda más efectiva como bactericida se encuentra en el espectro de 240 a 280

nm, con un óptimo a 260 nm, que corresponde con la máxima absorción del DNA.

La radiación UV conduce a la formación de uniones covalentes entre residuos de

pirimidina adyacentes entre sí ubicados en la misma hebra, dando lugar a la formación de

dímeros de pirimidina. Éstos interfieren en el apareamiento normal de las bases y el

resultado final es la inhibición de la síntesis del DNA. Este tipo de radiación presenta

algunos inconvenientes para ser usada como agente esterilizante. Su energía es baja y su

capacidad de penetración es escasa. Por lo tanto su aplicación principal consiste en el

control de infecciones transmitidas por el aire, donde se la emplea para la desinfección de

áreas cerradas como las salas de hospitales, quirófanos y laboratorios.


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b. Radiaciones ionizantes.

Es tipo de radiación es de alta penetración e incluye rayos x y γ. Su acción letal se

produce en forma indirecta. A medida que las radiaciones ionizantes atraviesan el H2O

provocan la ionización de sus moléculas.

Las radiaciones ionizantes son adecuadas para la esterilización de material

quirúrgico, médico y de laboratorio descartable y en general en procesos de esterilización

en gran escala.

II.a. FILTRACIÓN DE FLUIDOS LIQUIDOS

Es el principal método para esterilizar líquidos que contienen componentes sensibles al

calor, tales como vitaminas, proteínas séricas, antibióticos y soluciones salinas definidas.

Consiste en hacer pasar líquidos por un material que posee poros más pequeños que las

bacterias e incluso más pequeños que los virus, con lo cual aquellos quedan libres de

microorganismos, según el tamaño de dichos poros.

Para cualquier tipo de filtro, hay dos sistemas de filtración: 1) al vacío por succión o 2)

mediante presión positiva.

Fig 5 Equipo de Filtración

II.a. FILTRACIÓN DE FLUIDOS GASEOSOS


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Se aplica en la industria farmacéutica, en cirugía, etc., para disminuir al mínimo la

probabilidad de contaminación del aire. Se usan filtros HEPA y ULPA.

Existen básicamente 2 tipos de áreas estériles:

La segunda corresponde a los ambientes de los GBS.

III.- MÉTODOS QUÍMICOS:

Por sus efectos en los microorganismos los agentes químicos pueden ser de dos

tipos básicos: bactericidas (matan al microorganismo) son esterilizantes y bacteriostáticos

(simplemente impiden el desarrollo del microorganismo).


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AGENTES QUÍMICOS BACTERICIDAS:

Oxido de etileno: Se emplea en forma gaseosa para esterilizar superficies

expuestas, materiales porosos, instrumentos, materiales plásticos, filtros.

Formaldehido: Es un agente alquilante que se combina con grupos –NH2, -

COOH y –SH en los ácidos nucleicos y proteínas.

Glutaraldehído

C. TÉCNICAS DE DESINFECCIÓN

Por lo general los agentes bacteriostáticos tienen un efecto reversible; es decir,

que al eliminar el agente, los microorganismos vuelven a su actividad normal y pueden

crecer si se les coloca en las condiciones que necesitan para su crecimiento.

AGENTES QUÍMICOS BACTERIOSTÁTICOS: MECANISMOS DE ACCIÓN

El cloro (hipoclorito de Na): es un agente altamente corrosivo; su actividad

se neutraliza con materia orgánica.

Acidos: por efecto de pH.

Alcalis: por efecto de pH.

Sales: por vestigios de metales pesados que las acompañan. Ej. sales de Hg,

Cu, Ag (sales de metales pesados) y otros metales suelen utilizarse como antisépticos.

Iones de metales pesados: envenenamiento de enzimas a nivel de grupo –

SH.

Jabones: desnaturalizantes de proteínas y disolución de lípidos.

Alcoholes alifáticos: desnaturalizantes de proteínas Ej. etanol, isopropanol.

Son más activos cuando están diluidos en agua (50-70% de alcohol en agua). Son solventes

de lípidos y desnaturalizan proteínas.


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Eteres: desnaturalizantes de proteínas.

Alcoholes aromáticos: Ej. fenoles y cresoles: disolventes de lípidos y

desnaturalizantes de proteínas.

Halógenos: desnaturalizantes de proteínas (sobre puentes disulfuro).

Colorantes: sensibilización fotodinámica (desnaturalización de proteínas)

Alquilantes: inactivan macromoléculas por puentes alquilantes entre =NH

y –NH2.

Detergentes sintéticos: desnaturalización de proteínas y disolución de

lípidos. Ej. Tensioactivos catiónicos: actúan afectando las membranas celulares mediante

interacciones de carga con los fosfolípidos. Se utilizan para limpieza de material

contaminado y superficies de trabajo.

Tensioactivos aniónicos: su acción se manifiesta a través de una

eliminación mecánica de los m.o., por lo tanto su acción no es desinfectante. Se utilizan

para el lavado del material ya decontaminado.

D. MANIPULACIÓN EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD

La muestra puede ser:

Muestra Contaminada (protección)

Muestra estéril (evitar su contaminación)

En ambos casos los mecanismos son los mismos, se trata de evitar el trasiego de

microorganismos entre el material y el medio ambiente o el manipulador.

Aspectos a tener en cuenta

1. Zona de trabajo limpia y en condiciones extremas estéril (Mecheros, Gabinetes de

seguridad biológica en los laboratorios de manejo de muestras de alta peligrosidad,

Campanas de extracción para drogas volátiles y tóxicas).

2. El material empleado para manipular la muestra debe de mantenerse estéril (flameado) o

desecharse en condiciones de seguridad tras su empleo.

3. El ambiente (aire) será estéril por UV, filtración., antes del manejo.


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4. El manipulador utilizará métodos de barrera (gorros, mascarillas, guantes) para proteger la

muestra de su flora

5. Terminado el proceso, todo el material empleado deberá de ser lavado y esterilizado si se

va a reutilizar o esterilizado y desechado en recipientes especiales.

Todo el proceso va a estar condicionado por el nivel de bioseguridad que queramos

alcanzar, dependiendo del material a emplear y del o de los microorganismos de los que nos

queramos proteger o proteger a la muestra.

ACTIVIDADES A REALIZAR

MATERIALES

Placas de Petri Frascos de vidrio

Tijera Pinza

Caja de metal Aceite

Pipetas de vidrio Gasa

Alcohol Hipoclorito de Sodio (lavandina)

Probeta Agua destilada

Medio de cultivo Ansa

Mechero de bunsen Placas de Petri con medio de cultivo

Cultivo de bacterias/hongos

1) Preparación del material a esterilizar:

Material de vidrio

Placas de petri: se envuelven individualmente con papel (Autoclave).

Tubos con o sin tapón de algodón: se arman grupos de 10 tubos, y se envuelven en

papel. (Autoclave).

Pipetas (de 0,1;0,2;0,25 y Huddleson : se introducen en tambores metálicos

(pipeteros) y se esterilizan en estufa o autoclave.

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Pipetas: (de 1, 2, 5, 10, 25 ml). Se introduce un trozo pequeño de algodón en la

boca de la pipeta, se envuelve en papel blanco o manteca, se indica su capacidad y con

una flecha la boca de la misma. Se preparan en haces de 10-15 pipetas del mismo

volumen envueltas en papel con la punta hacia arriba. (Autoclave).

Frascos vacíos con tapa a rosca de plástico: Se colocan tapados con la tapa semi

enroscada, con un capuchón de papel de aluminio o envueltos en papel madera.

(Autoclave).

Materiales metálicos: tijeras, espátulas, pinzas, etc. Se envuelven individualmente,

se colocan en cajas metálicas que cierren herméticamente. (Estufa/Autoclave)

Tips, tapones de goma, pipetas pasteur de vidrio, hisopos: Se colocan en frascos de

vidrio que en el fondo contengan un trozo de algodón, se cierra el frasco dejando la tapa

media floja. (Autoclave)

Aceites, vaselina, talco: se colocan en frascos individuales con tapón de algodón y

capuchón de papel. (Estufa)

Medios de cultivos: se colocan en frascos individuales con tapón de algodón y

capuchón de papel. (Autoclave)

Soluciones tampones, antibióticos: se filtran

NOTA: todo el material a esterilizar debe estar correctamente rotulado. En el rotulo se

debe indicar el tipo de material y la fecha de esterilización. El material que se ha

esterilizado en autoclave se lleva a estufa de 37ºC hasta que esté completamente seco.

Una vez que ha finalizado el proceso de esterilización, el material deberá ser guardado

correctamente (cajones, armarios, heladeras, etc.) a fin de evitar contaminaciones y

asegurar la duración del proceso de esterilización. El tiempo promedio que dura la

esterilización es de 1 a 3 meses, paso dicho tiempo el material deberá ser re esterilizado

por más que no haya sido utilizado.

2) Preparación de alcohol al 70 % (Cambio de su pH) y lavandina 10% (formación de

hipoclorito de sodio) para su uso como desinfectante.

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3) Análisis de la importancia de la esterilización del ansa: Técnica de esterilización con

calor directo. Estas se deben esterilizar antes y después de llevar a cabo la siembra de

cualquier tipo de bacteria.

a. Poner el ansa directamente en la parte azul de la flama durante algunos segundos.

b. Cuando el metal se torna de color rojo, se retira y se enfría en las paredes superiores

del recipiente de cultivo.

4) Armado de equipo de filtración para esterilizar líquidos.

5) Análizar el siguiente temario:

a. Preparación del autoclave: instrucciones, condiciones operativas y precauciones

con respecto al material a esterilizar.

b. Controles físicos, químicos o biológicos de esterilización en autoclave durante el

proceso.

c. Control de esterilidad sobre los medios de cultivo esterilizados en autoclave: para

ello tomar no menos del 10% de los tubos o recipientes con medio de cultivo y colocar en

estufa de incubación a 37°C durante 24 h.

Funcionamiento de una olla a presión tanto en esterilización como en tyndalización.

BIBLIOGRAFÍA

-Velázquez L. Esterilización y desinfección. 2012. Apunte de Teoría. Microbiología General,

FQBF, Universidad Nacional de San Luis. De lectura obligatoria para este Trabajo Práctico.

-Madigan, Martincko. 2009. Brock, Biología de los microorganismos. 10ª. Edición. Pearson-

Prentice Hall.

-www.google.com (imagen)

http://www.google.com/

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Trabajo Práctico Nº2 Parte A: MEDIOS DE CULTIVO.

OBJETIVOS

- Fundamentar la composición de diferentes medios de cultivo conociendo los requerimientos energéticos, nutricionales y ambientales de los principales grupos de microorganismos. - Preparar medios de cultivo duso cotidiano en Microbiología. - Reconocer la presencia de los gérmenes en todos los hábitats naturales, en los animales

y los seres humanos. - Conocer los distintos instrumentos, materiales y medios de cultivo que se utilizan más

frecuentemente en el Laboratorio de Microbiología durante la siembra y transplante de microorganismos

- Adquirir conocimiento y destreza en el manejo de la técnica aséptica

MEDIOS DE CULTIVO

Cada microorganismo debe contar en su medio ambiente con todas las sustancias

químicas necesarias para generar energía y más material celular, y las condiciones físicas o

ambientales óptimas para crecer: pH adecuado, temperatura óptima y presencia o

ausencia de O2. Fuera de su hábitat, los microorganismos pueden crecer en medios

artificiales.

INTRODUCCIÓN

Definición: un MEDIO DE CULTIVO es una preparación nutritiva, natural o artificial,

sólida, semisólida o líquida, que suministra al microorganismo cada una de las sustancias

fundamentales, una fuente de energía y las condiciones ambientales adecuadas para su

crecimiento y multiplicación, aproximándose lo más posible a las condiciones de su

hábitat natural o nicho ecológico.

MATERIALES Y MÉTODOS

-Medios de cultivo deshidratados: agar nutritivo, agar Mueller Hintlton, agar sangre, caldo

nutritivo y agar sulfuro-indol-movilidad (SIM)

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-Agua destilada

-Cintas indicadoras de pH

-pHmetro

-Placas de Petri, Erlenmeyers, probetas, pipetas de 5, 10 y 25 ml, varillas de vidrio, tubos

de ensayo y de hemólisis.

-Algodón

Medios de cultivo a preparar en este Trabajo Práctico

1. Caldo nutritivo

Extracto de carne.................................................................... 0.15 g

Peptona................................................................................... 0.25 g

NaCl......................................................................................... 0.25 g

Utilizando un erlenmeyer, disolver cada uno de los componentes ya pesados, en 50 ml

de agua destilada. Homogeneizar. Ajustar el pH a 7 (6.8-7.2). Envasar todo el volumen

en un recipiente limpio. Tapar con papel. Rotular. Esterilizar en autoclave 15 min a

121°C.

2. Agar nutritivo

Extracto de carne.................................................................... 0.45 g

Peptona .................................................................................. 0.75 g

NaCl......................................................................................... 0.75 g

Agar.............................................................................................. 3 g

Agua destilada ....................................................................... 150 ml

Esta fórmula nutritiva se proveerá como un polvo con el peso adecuado que se

rehidratará en 150 ml de agua destilada utilizando un erlenmeyer. Tapar con papel.

Rotular. Fundir a ebullición en una olla. Retirar y dejar enfriar a 55-60°C.

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Homogeneizar bien. Ajustar el pH a 7-7.2 empleando cinta indicadora de pH de uso

externo. Neutralizar con ácido o base según corresponda.

Envasar en tubos en cantidades de 15 ml si se desea obtener agar derecho (para volcar

en placa de Petri en prácticos posteriores), o en cantidades de 7 ml si se desea obtener

agar inclinado o en pico de flauta. Luego de tapar con algodón, tapa a rosca o tapón

plástico, esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. Antes de solidificar, los tubos

que contienen 7 ml se inclinan sobre una tabla para que solidifique en pico de flauta.

Los que contienen 15 ml se dejan solidificar en posición vertical.

3. Agar sulfuro-indol-movilidad (SIM)

Peptona de caseína...................................................................... 1 g

Peptona de carne.................................................................... 0.33 g

Citrato de amonio y hierro (III) .............................................. 0.01 g

Tiosulfato de sodio ................................................................. 0.01 g

Agar......................................................................................... 0.15 g

Agua destilada ......................................................................... 50 ml

Esta fórmula nutritiva se proveerá como un polvo deshidratado con el peso adecuado

que se rehidratará en 50 ml de agua destilada utilizando un erlenmeyer. Tapar con

papel. Rotular. Fundir a ebullición en una olla. Retirar y dejar enfriar a 55-60°C.

Homogeneizar bien. Ajustar el pH a 7-7.2.

Envasar en tubos de hemólisis en cantidad de 3 ml por tubo. Luego de tapar con

algodón, esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. Dejar solidificar en posición

vertical.

4. Agar sangre

Material necesario: -1 tubo de agar nutritivo derecho -glóbulos rojos de carnero -1 placa de Petri

Fundir el agar nutritivo en tubo y enfriarlo a 50- 55°C. En cámara de bioseguridad desenvolver una placa de Petri estéril y colocar 0.5 ml de sangre por cada 10 ml de medio

25


de cultivo, de manera que se obtenga una concentración final de 5%. Volcar el agar fundido sobre la sangre. Homogeneizar haciendo movimientos circulares suaves. Secar. Sembrar. Incubar en un recipiente con CO2 (tarro con vela) a 37°C durante 24-48 h. Observar la hemólisis.

Otros medios de cultivo de uso frecuente en Microbiología (ver en ANEXO I)

Ajuste de pH para medios preparados en el laboratorio

Se pueden utilizar ácidos tales como chlorídrico, acético, láctico o tartárico, y álcalis como

hidróxido de sodio 1 N.

El pH debe medirse antes de la esterilización de los medios.

Conservacion de los medios de cultivo

La estabilidad de los medios de cultivo es limitada. De no utilizarlos inmediatamente, se

conservarán a 4-10°C en refrigerador.

EXCEPCION: Los medios con tioglicolato se conservan mejor a temperatura ambiente.

Control de esterilidad

Se realizará para todos los medios recién esterilizados. A tal fin, se colocará un parte de

los tubos conteniendo los medios en estufa de 37°C durante 24 h, y se observará

desarrollo o ausencia de desarrollo de microorganismo sobrevivientes al proceso de

esterilización en autoclave.

BIBLIOGRAFÍA

- Escudero M.E. Medios de cultivo (parte 1). 2012. Explicación de Trabajo Práctico. Microbiología General, FQBF, Universidad Nacional de San Luis. De lectura obligatoria para este Trabajo Práctico. - Madigan, Martincko. 2009. Brock, Biología de los microorganismos. 10ª. Edición. Pearson- Prentice Hall. - Manuales de medios de cultivo, ver: - www.merck.com.ar - www.britanialab.com.ar

http://www.merck.com.ar/

http://www.britanialab.com.ar/

26


Trabajo Práctico Nº2 Parte B: SIEMBRA Y TRANSPLANTE

INTRODUCCIÓN

Siembra: se entiende por siembra al acto de transferir o colocar un microorganismo en un

medio de cultivo adecuado. La transferencia se efectúa desde el hábitat natural (nicho

ecológico) al medio de cultivo.

Por ejemplo, se efectúan siembras desde distintos materiales biológicos (esputo, orina,

materia fecal, etc.) cuando existe sospecha de infección y se quiere aislar el agente causal.

También se pueden efectuar siembras desde los más diversos materiales, por ej. agua,

tierra, aire, etc. Con esto se demuestra la universalidad de los gérmenes.

Transplante o repique: es la transferencia de gérmenes desde un medio de cultivo a otro.

Se efectúan transplantes cuando se desea obtener un cultivo puro a partir de uno mixto,

mantener cepas, o efectuar estudios químicos, bioquímicos o culturales.

Con qué se siembra?

Ansa Recta en anillo

Pipetas Comunes (de 1, 2, 5, 10 y 25 ml) Pasteur rectas Pasteur a bolas

Micropipetas de diferentes volúmenes: 2, 10, 20, 100, 200 y 1000 µl

Espátula de Drigalski y “palo de hockey” para sembrar en superficies grandes (caja de Petri, botellas

de Roux, etc.)

Hisopo ídem anterior.

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En qué se siembra?

Medios líquidos

Medios sólidos 1,5 – 2 % de solidificante Agar inclinado o en pico de flauta

Agar en caja de Petri o botella de Roux

Medios semisólidos agar blando, 0.2-0.3% de solidificante

Cómo se siembra?

Medios sólidos

En placa de Petri Extensión espátula de Drigalski

Estrías ansa en anillo

ansa recta

Placa vertida inóculo más agar fundido y enfriado a 45-50°C

En superficie inclinada En estrías

Por contacto

En medio semisólido (agar derecho) por punción

En medios líquidos con ansa recta (preferentemente)

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- Elementos de siembra: un ansa rectas y un ansa en anillo, hisopos estériles, frascos

con tips estériles, micropipetas. - Material de vidrio preparado y esterilizado: placas de Petri, hisopos, frasco con

tips, pipetas estériles, ansas, tubos de hemólisis estéril. - Frascos de descarte con lavandina al 10% - Medios de cultivo: agar nutritivo derecho, agar nutritivo inclinado, agar SIM

(semisólido o blando), caldo nutritivo, agar sangre. - Botellas con SF: solución fisiólogica estéril (NaCl al 0.9% en agua destilada) - Recipiente para realizar microaerofilia - Alcohol 70% y algodón. Repasador. - Elementos de protección personal: guaradapolvo, guantes, barbijo.

29


Algunos elementos de siembra utilizados en Microbiología

Ansas en anillo y un ansa recta Espátula de Drigalski

Micropipeta con tip estéril Pipeta Pasteur

30

ogía- TSGA 2016

Guía TP Microbiol

Técnica aséptica para siembras y transplantes

Las operaciones que se describen a continuación están dirigidas a personas diestras. Proceder de

modo similar pero con las manos opuestas en caso de personas zurdas. Observar Figura 5.3 para

entender la técnica.

1. Siembras en agar semisólido o blando por punción o picadura:

Esterilizar a la llama (al rojo) el alambre del ansa. Dejarlo enfriar 5 seg. Tomar el tubo del cual se va a extraer el inóculo con la mano izquierda, con el meñique de la mano derecha quitar el tapón del tubo, flamear la boca y mantenerlo oblicuo, casi horizontal, para reducir al mínimo el peligro de contaminación. Retirar con el ansa esterilizado una pequeña cantidad de cultivo (inóculo), flamear nuevamente la boca del tubo, taparlo y dejarlo en la gradilla. Tomar el tubo que se va a sembrar con la mano izquierda, quitarle el tapón con el meñique de la derecha, flamear la boca del tubo y con el ansa cargado de inóculo picar el medio hasta aproximarse al fondo del tubo. Retirar con cuidado el ansa, flamear la boca del tubo, taparlo y esterilizar el ansa


31

antes de dejarla sobre la mesa. El tubo sembrado se marca para identificarlo colocando en el rótulo el medio, lo que se sembró y la fecha. Luego se lleva a incubar a temperatura adecuada durante el tiempo necesario.

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/guia.pdf

2. Siembras sobre medios inclinados (en pico de flauta)

Esterilizar a la llama el alambre del ansa. Dejarlo enfriar 5 seg. Tomar el tubo del cual se va a extraer el inóculo con la mano izquierda, con el meñique de la mano derecha quitar el tapón del tubo, flamear la boca y mantenerlo oblicuo, introducir el ansa estéril, retirar una pequeña cantidad de cultivo, flamear la boca del tubo, taparlo y dejarlo en la gradilla. Tomar el tubo que se va a sembrar con la mano izquierda, quitarle el tapón con el meñique de la derecha, flamear la boca del tubo, mantenerlo inclinado, introducir el ansa cargada al tubo y extender el inóculo sobre la superficie del medio trazando estrías a intervalos de pocos mm empezando por abajo, retirar el ansa, flamear la boca del tubo y taparlo. También esterilizar el ansa antes de dejarla sobre la mesa. Como en la siembra anterior, rotular el tubo y luego llevarlo a incubar.



32

3. Siembra en placa de Petri

Preparación de placa de Petri. Fundir en baño de María hirviente un tubo de agar derecho. Enfriarlo a 45-50°C en un baño. Secarlo. Destaparlo. Flamear la boca del tubo y volcar el contenido en una caja de Petri estéril, rotar la caja sobre la mesa de manera que se forme una capa uniforme. Dejar solidificar. Secar en estufa a 37°C 5 min y luego sembrar.


Siembra por estrías. En estos casos las células son separadas por agotamiento, al realizar estrías sobre la superficie del agar. El inóculo inicial tiende a diluirse progresivamente con cada estría sucesiva.

Procedimiento: 1. Tomar una caja de Petri con el medio de cultivo adecuado ya solidificado y dividir la

base de la caja (con marcador indeleble del lado externo) en 3-4 sectores 2. Sembrar por orden en cada cuadrante en zigzag. 3. Una vez sembradas, las cajas se incuban invertidas



33

4. Siembra en medios líquidos en general: (caldo, leche, agua peptonada, medio mineral de fosfato, etc.) Los medios transparentes se deben sembrar con ansa recta, tratando de transportar poco inóculo. Los demás se pueden sembrar con ansa, o bien con pipetas estériles.

Siembra en medios líquidos con ansa: Una vez que el ansa esterilizada fue cargada con el inóculo, tomar con la mano izquierda el tubo con medio líquido a sembrar, con el meñique de la mano destaparlo, flamear la boca del tubo y mantenerlo inclinado, introducir el ansa y descargar el inóculo. Retirar el ansa, flamear la boca del tubo, taparlo, esterilizar el ansa antes de dejarla sobre la mesa, rotular el tubo y llevarlo a incubar.

Siembras de medios líquidos con pipetas: Tomar la pipeta estéril (puede estar en tambores de aluminio o bien envuelta en papel), pasarla ligeramente por la llama. En la mano izquierda tenemos el tubo del cual vamos a extraer el inóculo, con el meñique de la derecha lo destapamos, flameamos y mantenemos inclinado, introducimos la pipeta, aspiramos el volumen deseado, flameamos el tubo, tapamos y dejamos en la gradilla con la mano izquierda. Tomamos el tubo con el medio de cultivo que vamos a sembrar, con el meñique derecho lo destapamos, flameamos e introduciendo la pipeta sin llegar hasta el líquido sembramos el volumen deseado (gotas, ml, etc.). Flamear la boca del tubo, taparlo y colocar la pipeta en recipientes que contengan mezcla sulfocrómica o solución desinfectante. Una vez hecho esto, el tubo se rotula y se incuba.

Siembras de medios líquidos o sólidos con micropipeta Colocar el volumen deseado en el visor de la micropipeta (siempre dentro del rango de microlitros permitidos en cada una de ellas), y colocar un tip estéril en el extremo de la micropipeta. Ante un roce o toque con elemento extraño, descartar el tip y reemplazarlo por uno estéril. Tomar el tubo con la muestra líquida en la mano izquierda y sostener la micropipeta con la mano derecha. Acercar el tubo a la mano que sostiene la micropipeta y con el dedo meñique quitar y sostener el tapón del tubo y flamear. Con el pulgar de la derecha bajar el pistón de la micropipeta hasta el primer tope e introducir el tip en el líquido donde está la muestra o inóculo. Soltar suavemente el pistón para que el líquido ascienda, retirar la micropipeta, y tapar el tubo acercando al dedo que sostiene el tapón. Llevar la muestra a otro tubo con medio de cultivo, para lo cual, se destapa el tubo con la mano izquierda y se introduce el tip; con el pulgar de la derecha se baja el pistón suavemente hasta el 2do. tope para descargar la muestra. Soltar el pistón suavemente y tapar tubo.


34


1. Encender un mechero sin limpiar previamente la mesada con desinfectante.

2. Proveerse con un frasco de descarte conteniendo lavandina al 10%.

3. Pasar un hisopo sobre la mesada y sembrar una placa de agar nutritivo.

4. Descontaminar área de trabajo utilizando algodón embebido en alcohol iodado o

alcohol al 70%.

5. Pasar nuevamente un hisopo sobre la mesada y sembrar otra placa de agar

nutritivo.

6. Preparar 3 placas de Petri con 15 ml de agar nutritivo derecho cada una.

7. Dejar solidificar sobre la mesada. Llevar a secar en estufa a 37°C por 5-10 min.

8. Sembrar desde las siguientes muestras:

-aire del medio ambiente, en: --placa de Petri (siembra espontánea): se deja abierta durante el TP.

-manos - tierra de jardín, en:

--caldo nutritivo con ansa en anillo, --agar nutritivo inclinado con ansa en anillo, --agar semisólido con ansa recta, --agar en placa de Petri, dividida en cuadrantes en la base, con ansa en anillo. Realizar aislamiento.

-fauces, en: --agar sangre, con hisopo en 1er. cuadrante, descartar hisopo en

contenedor con lavandina, y continuar con ansa en anillo hasta 4to.cuadrante. Incubar en microaerofilia.

9. Incubar todos los medios de cultivo en estufa a 37°C durante 24 h.

10. Al concluir el trabajo, repetir descontaminación de mesada y de manos.

11. Clasificar residuos para desechar (recipiente negro: papel, recipiente rojo: algodón

contaminado, guantes descartables).

BIBLIOGRAFÍA

- Madigan, Martincko. 2009. Brock, Biología de los microorganismos. 10ª. Edición. Pearson- Prentice Hall.

- www.google.com (imágenes)

http://www.google.com/


35

Trabajo práctico N° 3:

IDENTIFICACIÓN MICROBIANA

PARTE A: IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA

OBJETIVOS:

- Caracterizar el desarrollo macroscópico de los microorganismos en medios de cultivo líquidos

y sólidos.

- Adquirir entrenamiento en la realización de exámenes en fresco y coloración de Gram para la

observación microscópica de los microorganismos.

INTRODUCCION TEÓRICA

Qué debe observarse en los cultivos de microorganismos?

1. En medios de cultivo líquidos:

- crecimiento en superficie

- turbidez

- sedimento

-Crecimiento en superficie:

Puede ser:

floculento: contiene masas de formas diversas que flotan en el medio líquido.

en anillo: desarrollo adherido al vidrio en el borde de la superficie del líquido de cultivo.

película: desarrollo de una capa delgada uniforme.

-Turbidez:

-características: ligera, regular, intensa, transitoria, persistente, nula.

-Sedimento:

-caracterísiticas: compacto, granular, grumoso, escamoso, viscoso.


36

-cantidad de sedimento: abundante, escaso, nulo.

2. En medios de cultivo semisólidos:

- desarrollo

- movilidad

3. En medios de cultivo sólidos:

-en agar nutritivo inclinado: desarrollo abundante, moderado o escaso

-en placa de Petri: desarrollo con o sin aislamiento. En este caso se pueden

observar colonias. Toda especie bacteriana en medio de cultivo sólido

forma un tipo característico de agrupación llamada colonia. Una colonia es

la progenie de una sola célula al proliferar en un medio de cultivo sólido.

Importante: No se forman colonias en medios de cultivo liquidos!

Las colonias se diferencian por su tamaño, forma, altura o elevación, color y grado de adherencia al

medio (consistencia).

Forma:

puntiforme: muy pequeñas, pero visibles a simple vista, diámetro menor de 1 mm.

circular: diámetro mayor de 1 mm

rizoide: ramificada en forma de raíces

en forma de huso

Elevación, altura o perfil:

plana

convexa

pulvinada

pitting

Margen, contorno o borde:

entero

ondulado: borde sinuoso

lobulado

mellado: con muescas irregulares


37

filamentosa: forma de largos hilos

festoneado

Olor:

ausente

pronunciado

parecido a .........

Brillo:

vivo

opaco

metálico

Características ópticas:

opaca

traslúcida

opalescente

iridiscente

color

Consistencia: (usar ansa recta)

butírica

viscosa o mucoide

membranosa

quebradiza

-En agar sangre observar:

-alfa hemólisis, hay hemólisis parcial y los productos de la hemólisis son de color verde, viéndose

alrededor de la colonia un halo de hemólisis de color verde.

- beta hemólisis, en este caso hay hemólisis total y alrededor de la colonia se observa un halo

transparente.

- gamma hemólisis, cuando no se observa hemólisis ni en la superficie ni en la profundidad del

medio de cultivo, ejemplo típico: Enterococcus faecalis.


38


Observar los cultivos e informar los resultados obtenidos en:

- caldo nutritivo: membrana superficial, turbidez, sedimento?

- agar SIM: movilidad?

- agar nutritivo en pico de flauta: desarrollo abundante o escaso?


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Examinar el desarrollo en placa de Petri de diferentes muestras.

- Informar si se trata de cultivos axénicos o mixtos

- Tipos coloniales que se observan: en cada placa determinar número de colonias diferentes y

caracterizarlas por sus propiedades macroscópicas.

1.-PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Todas las actividades de la célula bacteriana se realizan a través de enzimas. Realizando una

serie de pruebas, denominadas pruebas bioquímicas, podemos establecer un patrón de actividad,

el cual nos refleja la composición enzimática del microorganismo, y además nos puede ayudar en

la identificación y diferenciación de un microorganismo dado entre otras especies estrechamente

relacionadas.

IMViC: conjunto de pruebas bioquímicas que comprende:

I = Prueba del Indol

M = Prueba de Rojo de Metilo

V = Prueba de Voges-Proskauer

C = Prueba de utilización de Citrato

Prueba del Indol Medio: agua

peptonada

Peptona........................................1 g

NaCl.............................................0,5 g

A.D. c.s.p.....................................100 ml

Sembrar y a las 24 h reconocer la producción de indol añadiendo 1 ml de algunos de los siguientes

reactivos:

a) Reactivo de Kovacs:

Alcohol amílico............................150 ml

p-dimetilaminobenzaldehído.......2 g

HCl (c).........................................40 ml

b) Reactivo de Ehrlich:

Alcohol etílico 95 %.....................190 ml

p-dimetilaminobenzaldehído........2 g

HCl (c).........................................40 ml

Fundamento e interpretación: dentro de los aminoácidos que aportan las peptonas se encuentras

el triptófano, el cual puede ser hidrolizado por ciertas especies de microorganismos liberándose

entre los productos finales de esta reacción el indol, el cual se puede poner de manifiesto con

cualquiera de los reactivos mencionados anteriormente. En caso positivo se observa un anillo de


40

color rojo. En caso de emplear el reactivo de Ehrlich, previamente agregar al cultivo, un volumen

igual de éter para extraer el indol.

Prueba de Voges-Proskauer (VP) y Rojo de Metilo (RM)

Para la realización de estas pruebas se utiliza el medio de Clark y Lubs, que es una solución de

peptona glucosada:

K2HPO4....................................5 g

Peptona....................................5 g

Glucosa....................................5 g

A.D. c.s.p.................................1000 ml

PH 7-7,2. Esterilizar la glucosa por separado. Sembrar. Incubar a 37°C durante 48-96 h.

a) VP: a una alícuota de cultivo adicionar 0,1 a 0,2 ml de KOH al 40 %, agitar y añadir 0,2 ml de solución de alfa naftol. Una reacción positiva se manifiesta por el desarrollo de color violeta-rojizo. Esta reacción depende de la producción a partir de glucosa de acetil-carbinol (acetoína), que es un precursor de 2,2-butilenglicol. En presencia de oxígeno atmosférico y álcali, la acetoína es oxidada en diacetilo, y este reacciona con el reactivo colorante alfa naftol para dar el color violáceo de la reacción.

Reactivos: a) alfa naftol..............................5 g

alcohol 95°...........................1000 ml b) KOH......................................40 g

creatina................................0,3 g A.D......................................100 ml

b) RM: a la otra porción de cultivo agregarle 2-3 gotas de la solución de rojo de metilo. La aparición de color rojo indica reacción positiva, mientras que color amarillo indica reacción negativa. La finalidad es comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. El rojo de metilo es un indicador de pH que vira al rojo cuando el pH del medio es igual a 4,2 o menor.

Reactivo: Rojo de metilo.......................0,1 g Alcohol.................................300 ml A.D......................................200 ml

Prueba de utilización del citrato Medio citratado de Simmons: MgSo4................................0,2 g NaCl....................................5 g NH4H2PO4...........................1 g K2HPO4..............................1 g Citrato de Na.......................2 g Azul de bromotimol.............2 g


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A.D......................................1000 ml Agar....................................15 g

Colocar en tubos de hemólisis 3 ml por tubo. Esterilizar. Inclinar. Inocular con ansa en estrías. Incubar 18 a 24 h a 37°C. El medio es de color verde, si el microorganismo usa el citrato como única fuente de carbono, el medio vira al azul por liberación de NaOH.

En la identificación de una especie microbiana se emplean, en primer lugar o en forma simultánea: la coloración de Gram que permite conocer formas y disposición celular y presencia de estructuras tales como esporas.

2.- COLORACIONES

OBJETIVOS

Conocer y llevar a cabo correctamente los pasos de cada técnica de coloración, desde la

preparación del frotis hasta el agregado de los colorantes.

Manipular adecuadamente el microscopio óptico, diferenciando sus distintas partes y

enfocando correctamente los preparados a visualizar.

Diferenciar bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) de bacterias no BAAR, en la coloración

de Ziehl Neelsen.

Distinguir esporas, cápsulas y flagelos, describiendo el campo visual observado al

microscopio.

INTRODUCCIÓN

La observación de los microorganismos se puede realizar:

Teñidos con colorantes

Vivos sin teñir o en fresco: se evalúa movilidad

Los microorganismos son químicamente muy diferentes del medio que los rodea. Esta

diferencia es la que permite distinguir las bacterias por tinción pues generalmente el colorante

reacciona con la célula bacteriana pero no con el medio externo.

Algunas de las ventajas que presenta la observación de los microorganismos coloreados son:

Proporciona el contraste suficiente entre el microorganismo y el medio que los rodea,

permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos.

Permite el estudio de estructuras de la célula bacteriana.

Se puede obtener mayores amplificaciones con el empleo del objetivo de inmersión del

microscopio.


42

¿Qué es un colorante?

Los colorantes son, generalmente, sales en las que uno de sus iones tiene color. Una sal es

un compuesto formado por un ión cargado positivamente y un ión cargado negativamente. Ej. la

sal cloruro de metileno, donde el color del colorante reside en el ión azul de metileno (AM),

cargado positivamente.

ClAM CL- + AM+

Los colorantes se pueden dividir en 2 grupos: básicos y ácidos. Si el colorante reside en el

ión positivo, se dice que es un colorante básico. Si el color reside en el ión cargado negativamente,

se dice que es un colorante ácido.

PASOS A SEGUIR PARA REALIZAR UNA COLORACIÓN

1.- PREPARACIÓN DEL MATERIAL que se va a colorear se puede llevar a cabo realizando: frotis,

extendido o impronta.

- Frotis: se realiza colocando una ansada de cultivo líquido en le centro de un portaobjeto

bien limpio; si el examen se debe efectuar desde un cultivo sólido, colocar previamente sobre el

portaobjeto una gota de solución fisiológica y sobre ella emulsionar perfectamente el inóculo, de

manera de lograr una película delgada y uniforme.

- Extendido: se realiza en una técnica para colorear la cápsula en microorganismos que la

poseen. Coloca en un extremo del portaobjetos una gota de tinta china* y se emulsiona sobre

dicha gota la suspensión de gérmenes. Con el pulgar y el índice de la mano izquierda se sujeta el

portaobjetos desde un extremo y con el pulgar y el índice de la mano derecha se sujeta por el

extremo un segundo portaobjetos contra la superficie del primero, con un ángulo de 30-40°. La

gota quedará en el ángulo de los 2 portaobjetos. Se empuja lentamente el portaextensor en la

dirección opuesta a lo largo del otro, de manera que la gota fluya por detrás del borde del

primero. Un buen extendido tiene una parte gruesa y una más delgada, con una transición gradual

entre ambas. El aspecto debe ser liso y nivelado.

*Una vez realizado el extendido se deja secar, se fija y se le coloca un contracolorante (cristal

violeta). La bacteria se observa violeta, la cápsula clara y el medio circundante oscuro. El

extendido se puede realzar también en materiales con gran cantidad de células.

- Impronta: con un hisopo se presiona la zona que se desea estudiar (por ej. boca, encías,

garganta, etc.) y luego se presiona suavemente sobre el portaobjetos. Este método se emplea para

diferenciar distintas agrupaciones celulares (por ej. estreptococos de estafilococos) o agrupaciones

en empalizada del bacilo de la difteria.


43

Preparación del frotis para colorear

2.- SECADO: cualquiera sea el método seguido en la preparación, el segundo paso a seguir es el

secado. Este se puede realizar secando el preparado al aire, a temperatura ambiente, o bien

manteniéndolo encima de la llama del mechero.

3.- FIJACIÓN: el calor es el agente fijador mas comúnmente empleado, también se pueden

emplear algunos agentes como el alcohol y varios compuestos químicos. Para fija el preparado

utilizando el calor, se lo toma desde un extremo, y se lo pasa tres veces rápidamente por la llama

del mechero. Dejarlo enfriar antes de proceder a la fijación. La capa de células debe estar siempre

hacia arriba cuando se fija el preparado. El propósito de la fijación es matar a los microorganismos,

coagular el protoplasma de la célula y adherirla al portaobjetos, si no se fijase la capa de células se

lavaría durante el proceso de tinción.

Nota: los portaobjetos utilizados para coloraciones deben estar perfectamente limpios y

desengrasados, para eso se los mantiene en alcohol de 95° hasta el momento de su uso. Deben ser

en lo posible nuevos y no presentar rayaduras que puedan confundir la observación.

MECANISMO DE COLORACIÓN

- Coloración directa: La mayor parte de las proteínas bacterianas tienen un punto

isoeléctrico entre pH 2 y pH 5, esto nos indica que, la célula bacteriana tiene una carga negativa

neta cuando el pH del medio está cercano a la neutralidad (pH 7), que es lo que generalmente

ocurre. La bacteria cargada negativamente se combina con el ión cargado positivamente (por ej. El

ión azul de metileno) con lo cual se tiñe la bacteria. Las diferencias en la carga da lugar a una

afinidad entre el colorante básico y la célula bacteriana. Los colorantes básicos más comúnmente

empleados son: fucsina, azul de metileno, cristal violeta y fucsina fenicada. Estos se diferencian en

la proporción y rapidez en que tiñen a la célula bacteriana.


44

- Coloración indirecta: La eosina es un ejemplo de colorante ácido y se emplea como sal

soluble eosinato sódico que se ioniza en eosinato- + Na+. Como la capacidad colorante reside en el

ión cargado negativamente, este no tendrá afinidad por la célula bacteriana cargada también

negativamente. En lugar de ello, el colorante se deposita alrededor de la célula, quedando ésta

incolora y el medio que la rodea coloreado.

Otros preparados para la observación de microorganismos:

MOVILIDAD

1. Colocar en el centro de un portaobjeto limpio una ansada de cultivo joven (18 a 24 h) en

caldo nutritivo.

2. Cubrir la gota con un cubre objetos evitando formar burbujas de aire.

3. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio, enfocar con objetivo de 40x

4. Observar si las bacterias presentan verdadero movimiento, diferenciándolo del browniano

por el agregado de una gotita de formol por capilaridad.

COLORACIÓN VITAL

1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución acuosa de cristal violeta 1/5000.

2. Con un ansa tomar una pequeña cantidad de cultivo y emulsionarlo perfectamente con la

gota del colorante.

3. Cubrir suavemente la gota con un cubreobjetos, evitando la formación de burbujas de

aire.

4. Examinar con el objetivo de inmersión. Las bacterias aparecen coloreadas sobre un fondo

claro.

COLORACIÓN SIMPLE O DIRECTA

1. Hacer el frotis. Secar. Fijar a la llama.

2. Cubrir el preparado con una solución diluida de fucsina 1/10 durante 1 min.

3. Lavar con agua corriente. Secar. Observar por inmersión.

COLORACIONES DIFERENCIALES

De acuerdo a la composición de la pared celular de las bacterias, la coloración de Gram permite

agruparlas en dos grandes grupos Gram positivas y Gram negativas. Además existen coloraciones

especiales para poner en evidencia:

la pared celular compleja de los bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR)

estructuras facultativas especiales que presentan algunos géneros bacterianos: capsula y flagelos

estructuras de resistencia que forman algunos géneros bacterianos: esporas


45

Estudiar cada una de estas estructuras de la teoría y explicación de trabajos prácticos

correspondiente.

Los microorganismos difieren químicamente y físicamente entre sí y por eso reaccionan de

una manera distinta frente a un determinado proceso de tinción. Este es el fundamento de las

coloraciones diferenciales. Así se puede definir la tinción diferencial como un método para

distinguir tipos de bacterias. Ejemplos: coloración de Gram y de Ziehl-Neelsen.

COLORACIÓN DE GRAM.

Reactivos

a) Cristal Violeta o Violeta de Genciana

Cristal violeta....................... 10 g

Fenol al 50% en alcohol ......50 ml

Alcohol puro......................... 75 ml

Dejar madura en estufa a 37°C durante una semana y agregar luego:

Agua destilada......................1000 ml

Filtrar antes de usar. b) Lugol

Yodo...................................5 g

KI........................................10 g

Agua destilada...................1000 ml

c) Fucsina de Ziehl

Fucsina básica....................10 g

Fenol 50% en alcohol..........100 ml

Alcohol.................................50 ml

Dejar de madurar en estufa a 37°C durante una semana y luego agregar:

Agua destilada.....................1000 ml

Filtrar antes de usar.

Fucsina de Ziehl diluída 1/10: de la fórmula anterior, hacer una dilución 1/10 en agua destilada.


46

Técnica

1. Hacer el frotis. Secar a la llama. Fijarlo.

2. Cubrir la preparación con cristal violeta y dejar actuar 2 minutos.

3. Escurrir el colorante y tratar con lugol dos veces consecutivas durante 30 seg o una vez

durante un min. Volcar.

4. Decolorar con alcohol o alcohol-acetona.

5. Lavar con agua corriente y efectuar la coloración de fondo con la fucsina 1/10. dejar actuar 1

min.

6. Lavar. Secar. Observar por inmersión.

7. Las bacterias Gram positivas se observan violetas y las Gran negativas rojas.

Las 4 soluciones empleadas son:

a) Colorante básico: cristal violeta: el color reside en el ión cargado positivamente.

b) Mordiente: lugol: es una sustancia que aumenta la afinidad o atracción entre la célula y el

colorante, ayudando a que se fije el colorante a la célula.

c) Agente decolorante: alcohol o alcohol-acetona. Sustancia que retira el colorante de la célula

teñida.

d) Contraste: fucsina 1/10: es un colorante de color distinto al colorante utilizado en primer

lugar. La misión del contraste es dar a las células decolaradas un color diferente al de las

células que no se han decolorado.

Etapa de coloración Resultados

Tinción inicial (cristal violeta)

Gram + Gram -

Se tiñen violeta Se tiñen violeta

Mordiente (lugol) Permanecen violeta Permanecen violeta

Decoloración ( ol o ol-acetona) Permanecen violeta Se decoloran

Contraste (fucsina 1/10) Permanecen violeta Se tiñen de rojo

COLORACION DE ZIEHL NEELSEN Para bacilos ácido-alcohol resistentes: BAAR

Reactivos:

Alcohol-ácido:

Solución al 5% de HCl o H2SO4 en alcohol de 96°.

Azul de metileno diluido:

Azul de metileno 0.3 g

Alcohol de 96° 30 ml


47

Disolver.

Agua destilada 10 ml

Se emplea una dilución 1/10.

Fucsina de Ziehl (ver coloración de Gram)

Usar sin diluir.

Técnica:

Hacer el frotis, secarlo y fijarlo a la llama. Cubrir la preparación con fucsina fenicada y calentar,

para lo cual se pasa un hisopo encendido debajo del portaobjetos manteniendo la emisión de

vapores durante 10 minutos, sin ebullición y agregando reactivo si se evapora.

Decolorar con alcohol-ácido unos min. Repetir hasta obtener frotis libre de fucsina,

aproximadamente por 2 minutos.

Lavar con abundante agua y cubrir con azul de metileno diluido durante 5 minutos.

Lavar. Secar. Observar por inmersión.

Los gérmenes ácido-alcohol resistentes se ven rojos, y las demás bacterias, células epiteliales y

otras estructuras se ven azules.

METODO DE MOELLER

Para coloracion de esporas

Reactivos:

Acido crómico: solución acuosa al 5%.

Acido sulfúrico: solución acuosa al 5%.

Fucsina de Ziehl: concentrada

Azul de metileno: el mismo utilizado en Ziehl Neelsen.

Técnica:

Hacer el frotis. Secarlo.

Fijar con alcohol absoluto, escurrir el alcohol y arder el resto.Dejar enfriar.

Lavar. Tratar con ácido crómico 5 minutos. Lavar.

Cubrir con fucsina fenicada de Ziehl y calentar con hisopo encendido manteniendo la emisión de

vapores 10 minutos. Dejar enfriar.

Decolorar con ácido sulfúrico al 5% durante 1 ó 2 minutos. Descartar reactivo. Repetir.

Completar la decoloración con alcohol durante 1 ó 2 minutos.

Lavar y efectuar coloración de fondo con azul de metileno diluido durante 1 min.

Lavar, secar. Observar con mayor aumento usando aceite de inmersión.

Las esporas se ven rojas, y las bacterias y otras estructuras se ven azules.

C.- METODO DE WIRTZ CONKLIN

Para coloración de esporas


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Reactivos:

Verde de malaquita: solución acuosa al 5%

Fucsina de Ziehl: diluida 1:10 (la misma de Gram)

Técnica:

Hacer el frotis. Secarlo.

Cubrir con solución acuosa al 5% de verde malaquita y calentar con hisopo encendido

manteniendo la emisión de vapores durante 10 minutos. Dejar enfriar.

Lavar exhaustivamente para eliminar el colorante en exceso y efectuar coloración de fondo con

fucsina 1:10 durante 1 min.

Lavar, secar. Observar con mayor aumento usando aceite de inmersión.

Las esporas se ven verdes, y las bacterias y otras estructuras se ven rojas.

TECNICA DE BURRI

Para observación de cápsula

Técnica:

Colocar en el extremo de un portaobjetos una gota de tinta china comercial.

Emulsionar sobre esa gota una suspensión de gérmenes capsulados.

Con otro portaobjetos, efectuar un extendido fino. Secar y fijar a la llama cuidadosamente.

Cubrir con solución de cristal violeta durante 2 min.

Lavar cuidadosamente con agua corriente. Secar y observar.

Las cápsulas se verán refringentes sobre el fondo oscuro y el cuerpo bacteriano se tiñe de violeta.

IMPREGNACION ARGENTICA DE FONTANA TRIBONDEAU

Para espiroquetas y espirilos

Reactivos:

Líquido de Rouge

Acido acético 0.1 ml

Formol 40% 2 ml


Mordiente

Acido tánico 5 g


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Agua destilada c.s.p. 100 ml

Solución de Fontana

A.- Nitrato de plata 5 g


B. –Amoníaco 5 ml

Agua destilada c.s.p. 100 ml

En el momento de usar, colocar en un tubo de ensayo la solución A y agregar gota a gota la

solución B hasta opalescencia debida al óxido de plata.

Técnica:

cubrir con líquido de Rouge el frotis, previamente seco pero sin fijar a la llama. Lavar.

Fijar colocando alcohol etílico, dejar escurrir, arder el resto.

Cubrir con el mordiente y calentar hasta emisión de vapores durante 30 seg.

Lavar con abundante agua y luego volver a lavar con agua destilada (para evitar la precipitación de

AgCl).

Impregnar con solución de Fontana en frío, hasta que tome color castaño oscuro. Se remueve el

líquido y se calienta hasta emisión de vapores, volcar a los 30 seg. Se colorea la preparación de

castaño con reflejos metálicos. Lavar con agua destilada. Secar. Observar.

Las espiroquetas y espirilos se ven de color marrón oscuro, sobre fondo pardo claro.

COLORACION ARGENTICA DE FLAGELOS

Reactivos:

Solución I: mordiente

Solución acuosa saturada de

sulfato de potasio y aluminio (14 g/100 ml A.D.) 25 ml

Acido tánico al 10% (p/v) 50 ml

Solución de FeCl3 al 5% (p/v) 5 ml

Mezclar y conservar en frasco oscuro a temperatura ambiente. La solución es estable durante

varios meses.

Solución II: colorante argéntico

Preparar 100 ml de solución de nitrato de plata al 5% (p/v).

Adicionar hidróxido de amonioi concentrado (2-5 ml) gota a gota a 80 ml de solución de nitrato de

plata al 5% hasta que el precipitado marrón formado se redisuelva.

Adicionar algo del remanente de la solución de nitrato de plata al 5%, gota a gota a la solución,

hasta ligera opalescencia persistente.


50

Conservar la solución en frasco oscuro a temperatura ambiente. La solución es estable durante

varios meses.

Técnica:

Limpiar los portaobjetos con alcohol-acetona, rotularlos y flamearlos en la parte azul de la llama

para eliminar los residuos.

Utilizar un cultivo joven (si es caldo: cuando presente turbidez aparente, si es de agar inclinado, un

desarrollo de 18-24 h). Los cultivos obtenidos a 25°C generalmente producen los mejores

resultados.

Tratar el cultivo con 1 ml de formalina al 1% en solución fisiológica durante una noche (12 h). Si se

utiliza un cultivo inclinado, tratar cuidadosamente las células con la solución de formalina y dejar

reposar toda la noche. Conservar en heladera hasta el momento de ser utilizada.

Centrifugar cuidadosamente (1000 x g durante 15 min) para obtener el pellet, lavar con buffer

isotónico, volver a centrifugar y resuspender en buffer.

Colocar una ansada abundante o dejar deslizar una gota con pipeta Pasteur hasta el otro extremo

del portaobjetos. Secar al aire. No fijar por calor.

Cubrir el portaobjetos con la solución I durante 4 min. Lavar con agua destilada.

Cubrir el portaobjetos con la solución II y calentar con hisopo hasta emisión de vapores. Dejar 4

min para que se coloree. Lavar con agua destilada e inclinar para secar al aire.

Observar con objetivo de inmersión.

Los flagelos ven de color marrón claro, sobre fondo marron oscuro (celula vegetativa bacteriana).


Cepas a utilizar desde cultivos frescos: Klebsiella

pneumoniae (para técnica de Burri) Bacillus subtilis

(tinción de Moeller y Wirtz Conklin)

Frotis de Mycobacterium smegmatis (para colorear por Ziehl Neelsen)

Frotis de Clostridium chauvoei teñidos por impregnación argéntica

Portaobjetos y cubreobjetos

Goteros con solución fisiológica.

Microscopios ópticos provistos con objetivos de 4, 10, 40 y 100x.

Aceite de inmersión.

Reactivos de coloración para Ziehl Neelsen (para bacterias ácido alcohol resistentes BAAR):


Cada equipo de alumnos:

- realizará coloración de Gram a partir de los cultivos sembrados en el práctico anterior


51

- observará frotis con coloración de Ziehl Neelsen. Identificará BAAR, células y estructuras no

BAAR

- observará frotis de K. Pneumoniae según el procedimiento detallado en tinción negativa de Burri

y observará la cápsula bacteriana

- observará el aspecto característico de las esporas y de las formas vegetativas de bacterias en

frotis teñidos

- observará el resultado de la coloración argéntica aplicada a células de C. Chauvoei, un anaerobio

flagelado

- realizará dibujos y anotará en el informe todo lo observado

Bibliografía:

Madigan, M.T; Martinko, J.M; Stahl, D. A; Clark, D. P. Brock. Biology of microorganisms. 13th ed.

Ed Pearson Educación, NSA. 2011.

Madigan, M.T; Martinko, J.M; Dunlap, P.V; Clark, D. P. Brock. Biología de los Microorganismos. 12ª

ed. Ed Pearson Educación, NSA. 2009.

Tortora, G, J., Funke, B.R., Case, C. L. Introducción a la Microbiología. 9ª ed. Editorial Médica

Panamericana, Buenos Aires, 2007.

3.- MANEJO DEL MANUAL BERGEY

El primer Manual Bergey de Bacteriología Determinativa fue publicado en 1923, bajo el

auspicio de la Sociedad Americana de Bacteriólogos, siendo su presidente David Bergey.

Actualmente la sociedad encargada de la publicación del manual, es una organización sin fines de

lucro, siendo los ingresos que percibe usados solamente con el propósito de preparar, editar y

publicar sucesivas ediciones del manual y publicaciones suplementarias.

El último manual publicado en el 2000, corresponde a la 2° edición y consta de 5 volúmenes,

a diferencia de los anteriores que presentaban un solo. A grandes rasgos los 5 subvolúmenes se

dividen en:

1. Archaea, Cyanobacteria, Fotótrofos y Géneros ramificados.

2. Proteobacteria.

3. Bajo contenido en G+C. Gram positivas.

4. Alto contenido en G+C. Gram positivas.

5. Plantomicetes, Espiroquetales, Fibrobacter, Bacteroides y Fusobacteria.

El objetivo del Manual dividido en subvolúmenes es que cada parte puede ser actualizada y

publicada mucho más rápidamente que si se tratase del manual completo. Permite además, que el

microbiólogo acceda al subvolumen de su interés exclusivamente.


52

La última edición amplía el objetivo original e incluye más información de importancia para

la bacteriología sistemática, ya que trata la ecología, enriquecimiento, aislamiento y descripción de

especies y sus características determinantes, mantenimiento y preservación.

Uso del Manual

El principal objetivo del manual es asistir a la identificación de las bacterias, pero además el

otro objetivo es indicar las relaciones que existen entre las distintas clases de bacterias. Los

métodos de biología molecular hacen posible intentar una clasificación de las bacterias basadas en

sus relaciones mutuas.

PARTE B: IDENTIFICACIÓN GENOTIPICA

La biología molecular es una disciplina relativamente joven, originada en los años 30s y los

40s, e institucionalizada en los años 50s y los 60s. El período clásico de ésta comenzó en 1953 con

el descubrimiento de la doble hélice del ADN por James Watson y Francis Crick. La relación

científica de Watson y Crick unificó varios acercamientos disciplinarios: Watson, estudiante de

Luria y el grupo fago, reconocieron la necesidad de utilizar la cristalografía para aclarar la

estructura del ADN, por lo que hicieron un uso amplio de datos a partir del trabajo de

cristalografía con rayos X en ADN realizado por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin en el King´s

College, de Londres (Darden y Tabery, 2005).

Con la estructura del ADN a disposición, la biología molecular cambió su enfoque por lo

que la estructura de la doble hélice ayudó a la elucidación de los mecanismos de replicación y

función genética, las claves para entender el papel de los genes en la herencia. Esta investigación

subsecuente fue guiada por la noción de que el gen era una molécula informativa. La secuencia

linear de las bases de los ácidos nucleicos a lo largo de una hebra de ADN proporcionó la

información codificada para dirigir el orden linear de aminoácidos en las proteínas (Darden y

Tabery, 2005).

Técnicas moleculares

Las técnicas moleculares actuales han sido desarrolladas, en solo pocos años de

investigación académica básica en muchos campos de la ciencia, de tal manera que en los últimos

años, éstas técnicas han surgido como los métodos para el análisis y tipificación de los

aislamientos bacterianos.

Ellas son la huella dactilar de plásmidos o PF, el análisis de endonucleasas de restricción

de ADN de plásmidos o REA; el análisis de endonucleasas de restricción de ADN cromosómico

utilizando enzimas de corte y electroforesis convencional; el Polimorfismo de largos fragmentos de

restricción o RFLP utilizando análisis de pruebas de ADN; La electroforesis en gel de campos

pulsantes o PFGE; y el AP-PCR y otras técnicas relacionadas con la tipificación basada en la

amplificación de ácidos nucleicos (Tenover et al., 1997).


53

La caracterización molecular de microorganismos en un ambiente natural puede realizarse

mediante la detección de genes específicos que permitan su identificación y tipificación. La

principal ventaja de estas técnicas es la de no requerir el aislamiento de los microorganismos ni su

identificación por microscopía con tinciones específicas. Las técnicas moleculares permiten evaluar

la biodiversidad de un hábitat amplificando genes específicos.

Algunos métodos de clasificación incluyen las especies genómicas, un grupo de

microorganismos con altos valores de homología ADN-ADN, y las genoespecies, un grupo de

organismos capaces de cambios genéticos.

Actualmente es aceptado por los taxonomistas microbianos que la hibridización de ácidos

nucleicos y los estudios de secuenciación proveen los mejores y más racionales métodos

disponibles para designar especies y determinar la relación entre microorganismos diferentes.

Wayne y col. (1987), definen molecularmente especie indicando que una especie podría

generalmente incluir cepas con 70% o más de homología ADN-ADN y con 5ºC o menos de

diferencia en la temperatura de melting.

La identificación a nivel de especies es el propósito primario de todo esquema de

clasificación microbiano, la separación y reconocimiento exacto de subtipos dentro de una especie

es importante en todas las ramas de la microbiología, y particularmente en la microbiología

médica. Además, en muchos casos, el control de enfermedades no podría ser posible sin el uso de

métodos de tipificación para ayudar a definir las fuentes de infección, mecanismos de transmisión

y velocidad de diseminación de la infección en una población susceptible. Otras áreas en las cuales

la exactitud de la tipificación microbiana es importante incluye estudios ecológicos que involucran

el monitoreo de nuevos microorganismos en nuevos hábitats naturales, y programas industriales

en la búsqueda de nuevos productos microbianos.

La secuencia completa del ADN constituiría el método de referencia fundamental para

reconocer los subtipos dentro de las especies.

La tipificación puede proporcionar información sobre la distribución de tipos microbianos

en poblaciones humanas y animales, lo cual puede ser aplicado en programas de vigilancia a nivel

local, regional, nacional o global. De especial interés pueden ser el monitoreo de marcadores

asociados con la patogenicidad, inmunogenicidad o resistencia a medicamentos, como se

demuestra por ejemplo en la vigilancia del cólera con la emergencia de una nueva cepa epidémica

en Asia.

En síntesis, esta aplicación puede incluir análisis periódicos para la detección de grupos de

patógenos con tipos similares y de origen común en espacio y tiempo, para mejorar las

advertencias anticipadas de brotes potenciales.


54

Asimismo, puede ayudar en la planeación de servicios de salud e intervenciones

preventivas como desarrollo de vacunas y programas de inmunización.

Estas técnicas también pueden ser usadas en estudios clínicos para la delineación de

patrones de colonización y para la identificación de fuentes de transmisión de microorganismos

infecciosos, lo cual puede contribuir a un entendimiento de la epidemiología y patogénesis

ayudando con ello al desarrollo de estrategias de prevención de enfermedades (Struelens y

MESGEM, 1996).

Las tinciones fluorescentes se emplean para la enumeración de microorganismos en

muestras clínicas, del ambiente y de alimentos. La tinción con DAPI (4`,6-diamido-2-fenilindol) no

reacciona con materia inerte y se puede aplicar para muestras de agua y suelo; proporciona una

estimación razonable del número de células presentes. Para muestras acuáticas, las células se

tiñen en la superficie de un filtro después de haber filtrado un volumen determinado de líquido.

Estas técnicas sencillas tienen la ventaja de no ser específicas (tiñen todos los microorganismos de

una muestra), pero el inconveniente que presentan es que no diferencian entre células vivas y

muertas. La tinción con colorantes fluorescentes que diferencian entre células vivas y muertas

como es el caso de Live/Dead BactoLigth Kit) proporcionan información no sólo del número de

microorganismos de una muestra sino también de la viabilidad de la misma. Ver fundamento al

final.

Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)

La Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) es una técnica que se

utiliza comúnmente en los laboratorios de investigación médicos y biológicos para amplificar

(crear copias múltiples de) el ADN, sin utilizar un organismo vivo, tal como la E. coli o una levadura.

Asimismo, se emplea en una variedad de tareas, tales como la detección de enfermedades

hereditarias, la identificación de huellas digitales genéticas, diagnóstico clínico, análisis forense del

ADN, detección de patógenos en el hombre, animales, plantas, y alimentos, e investigación en

biología molecular (Saunders et al., 2001).

La PCR fue inventada a principios de los 80´s por Kary Mullis, al cual le fue otorgado el

premio Nobel en química en octubre de 1993 por este logro, siete años después de haber

publicado sus primeras ideas. La idea de Mullis fue la de desarrollar un proceso a través del cual el

ADN se pudiera multiplicar artificialmente a través de ciclos repetidos duplicados llevados a cabo

por una enzima llamada ADN-Polimerasa.

La ADN-Polimerasa se produce naturalmente en los organismos vivos, donde funciona

para duplicar el ADN cuando las células se dividen. Trabaja uniéndose a una sola hebra de ADN y

creando una hebra complementaria.

El proceso original de PCR actualmente ha sido mejorado mediante el uso de la ADN-

Polimerasa que procede de una bacteria termofílica que vive a temperaturas arriba de 110°C (en


55

aguas termales). La ADN-Polimerasa o Taq polimerasa tomada de estos organismos es

termoestable (estable en las altas temperaturas).

Actualmente la Taq polimerasa se utiliza frecuentemente en la práctica de PCR. Una

desventaja de la Taq es que incurre a veces en equivocaciones al copiar el ADN, conduciendo a

mutaciones (errores) en la secuencia del ADN (Saunders et al., 2001).

La PCR que ha sido utilizada por varios años para la detección directa de muchos tipos de

agentes infecciosos en muestras clínicas, ha sido adaptada para ser usada como una herramienta

de tipificación. La ventaja de la PCR es su habilidad para producir literalmente millones de copias

de un segmento de ADN particular con alta fidelidad en un tiempo de 3 a 4 horas (Tenover et al.,

1997).

El procedimiento requiere un molde de ADN que puede estar presente en la muestra en

pequeñas cantidades; dos oligonucleótidos (primers) que flanquean las secuencias del molde de

ADN que va a ser amplificado; y una DNA-polimerasa estable al calentamiento.

Un ensayo típico de PCR requiere aproximadamente de 2,5-3 horas para completar 30

ciclos, donde cada ciclo consiste de una fase de desnaturalización, en donde la doble hebra de

ADN es fundida en hebras únicas; una fase de alineación, en donde los primers se unen a las

secuencias blanco en las hebras separadas; y una fase de extensión, en donde la síntesis de ADN

procede de los primers a partir de cada hebra de la plantilla de ADN, generando dos nuevas copias

de la doble hebra de la plantilla original. Después de cada 30 ciclos, una sola copia inicial de la

plantilla de ADN teóricamente puede ser amplificado a 1 billón de copias (Tenover et al., 1997;

Saunders et al., 2003).

El uso válido de esta técnica es crítico para mantener la calidad de muchas bases de datos

de ADN producidas. Diversos factores pueden influenciar la validez de los resultados obtenidos por

PCR, incluyendo la presencia de componentes inhibitorios, la calidad del ADN, y la carencia de

optimización con respecto a componentes de la reacción y las condiciones de los ciclos termales.

Todos estos factores pueden comprometer la especificidad y sensibilidad de la reacción,

pudiendo llevar a resultados falsos-negativos, falsos-positivos, o no reproducibles. Pero menos

conocido, sin embargo, es la variación de los resultados en la PCR atribuidos al subóptimo

funcionamiento de los termocicladores, siendo este el aspecto particular de la técnica que

constituye las bases de los estudios interlaboratorios (Saunders et al., 2003).

Esquema:


56

Fusión Hibridización Extensión de

La cadena

Segundo ciclo se repiten las temperaturas: 95ºC, 50-60ºC y 72ºC y así se obtienen

múltiples copias, repitiendo los ciclos según el protocolo estandarizado.

Electroforesis de geles con gradiente denaturante (DDGE)

El uso de las técnicas microbiológicas tradicionales no es eficiente para evaluar

comunidades bacterianas en muestras ambientales ya que la proporción de células bacterianas

cultivables en medios convencionales esta en el orden de 0.1% al 10% de la población total. Por

este motivo, los métodos moleculares están reemplazando a los métodos tradicionales para el

estudio y análisis de comunidades bacterianas.

La electroforesis de geles con gradiente denaturante (DGGE) es una técnica molecular

introducida en la ecología microbiana por Muyzer (1993) y ha sido adaptada como una

herramienta para determinar la diversidad microbiana en muestras ambientales (Schaefer, 2001).

El DGGE se basa en el análisis de la información genética de la bacteria. El DNA es extraído de las

muestras y amplificado por PCR con primers 16S rDNA bacteriano.

OBJETIVOS DEL TRABAJO PRÁCTICO:

- Individualizar las características macroscópicas de cultivos de bacterias y hongos

(miceliares y levaduriformes). Observación de cultivos.

- Estudiar las características microscópicas (morfología) de bacterias y hongos (miceliares

y levaduriformes).

- Identificación de microorganismos a través de pruebas bioquímicas que reflejan su

metabolismo.

- Utilizar técnicas de tinción con colorantes fluorescentes para análisis de poblaciones

(Live/ Dead).


57

1) Observación macroscópica del crecimiento de bacterias y levaduras en un medio de cultivo

líquido

1- A partir de cultivos en caldo tripteína soja (TSB) y un caldo TSB sin inocular.

Observar y comparar las características del desarrollo microbiano en medio líquido: turbidez

uniforme, formación de película, sedimento.

2- A partir de cajas sembradas observe las características macroscópicas de las colonias

desarrolladas en base a forma, tamaño, consistencia, color, etc.

Forma: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa.

Tamaño: grande (más de 3 mm), mediana (2-3 mm), pequeña (1-2 mm)

Color

Borde: entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado

Elevación: plano, elevado, convexo, pulvinado, umbonado

Superficie: suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta

2) Realizar preparaciones en fresco y tinciones simples y diferenciales de bacterias y hongos

levaduriformes

A partir de una muestra líquida se realizarán las siguientes preparaciones para observar la

presencia de microorganismos (bacterias y/o levaduras) en:

1-preparaciones en fresco (40x)

2-extendidos teñidos con Azul de Metileno (100x)

3-extendidos teñidos con colorantes de Gram (100x)

Característica macroscópica de una colonia

3) Manejo del Manual Bergey

4) Análisis de poblaciones por microscopía de fluorescencia.

1. Tomar 1 mL de muestra de un crecimiento bacteriano, centrifugar a 9000g durante 10 min.

2. Lavar el pellet con SF, centrifugar y resuspender en 120-200 microlitros de SF según volumen de

pellet obtenido.


58

3. Se toman 80 microlitros y se colocan en un Eppendorf cubierto con papel de alumnio y se

agrega la mezcla de colorantes fluorescentes: (65 microlitros de SYTO 9 que tiñe las células viables

de verde, y 35 microlitros de Ioduro de Propidium que tiñe las células muertas de color rojo).

4. Se incuba a temperatura ambiente y en oscuridad durante 15-20 min.

5. Se observa en microscopio de fluorescencia.

Esta técnica también permite observar los cambios morfológicos observados durante cultivos

prolongados, es decir se puede realizar un seguimiento de las características de la población. Entre

los cambios morfológicos observados se encuentran las formas cocoides consideradas formas de

resistencia en ambientes adversos y con importancia epidemiológica desde el punto de vista de

transmisión de enfermedades.

Fundamento del Kit:

El kit Live/Dead BactoLigth brinda información acerca de la viabilidad de las células (actividad

metabólica) en un medio determinado. Contiene dos colorantes de ácidos nucleicos: SYTO 9 el

cual penetra las membranas libremente y el ioduro de propidio, el cual se encuentra altamente

cargado y no penetra normalmente células, salvo que las membranas se encuentren dañadas.

Permite observar las células viables de color verde, las muertas de color rojo y las formas de

muerte parcial de color naranja o amarillo.


59

Trabajo Práctico Nº4:

DIVERSIDAD MICROBIANA

La microbiología es el estudio de los microorganismos, grupo grande y diverso de formas de vida

libre que existen como células aisladas o formando grupos. Así pues, las células microbianas son

diferentes de las células de los animales y las plantas que son incapaces de vivir aisladas en la

naturaleza, en vista de que únicamente pueden sobrevivir como parte de organismos

multicelulares. Todas las células contienen proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y polisacáridos.

Debido a que estos componentes químicos son comunes a todo el mundo vivo, se piensa que

todas las células descienden de un ancestro común. A través de millones de años de evolución se

ha originado la extraordinaria diversidad de tipos celulares que existen en la actualidad.

Los microorganismos pueden dividirse para su estudio en cinco grupos principales: algas, hongos,

protozoarios, bacterias y virus. Estos cinco grupos pueden dividirse a su vez según su organización

celular en eucariotas (algas, hongos y protozoarios) y procariotas (bacterias); los virus no

presentan estructura celular.

Características más importantes de los grupos de organismos eucarióticos:

Algas: Conjunto grande y variado de organismos eucarióticos que contienen clorofila y otros

pigmentos fotosintéticos en estructuras membranosas llamados cloroplastos. Llevan a cabo una

fotosíntesis oxigénica. No deben confundirse con las cianobacterias (antiguamente llamadas "algas

verde-azuladas"), nombre que recalca su forma procariótica). Son unicelulares o coloniales.

Cuando las células se acomodan extremo con extremo se las llama filamentosas. Algunas llegan a

medir varios metros de longitud. Dentro de los principales grupos de algas podemos mencionar:

Clorophyta (algas verdes), Euglenophyta (euglénidos), Chrysophyta (algas pardo-doradas,

diatomeas), Phaeophyta (algas pardas), Pyrrophyta (dinoflagelados), Rhodophyta (algas rojas).

Hongos: En contraste con las algas, los hongos carecen de clorofila. Se diferencian de las bacterias

porque las células fúngicas son mucho mayores y contienen un núcleo, vacuolas y mitocondrias,

típicas de las células eucarióticas. Todos los hongos son organotróficos. Los hábitats son muy

diversos: acuáticos, terrestres, patógenos de plantas y animales. Tres grupos de hongos tienen una

importancia práctica: mohos, levaduras y setas. Los mohos son hongos filamentosos (se

desarrollan sobre el pan, queso o fruta). Cada filamento único se llama hifa, y su conjunto se

denomina micelio. Presentan esporas asexuales (conidios) y sexuales. Las levaduras son hongos

unicelulares. Las células son esféricas, ovales o cilíndricas y en general la división celular se lleva a

cabo por gemación. Las levaduras florecen en hábitats donde hay azúcares, por ejemplo, frutas,

flores y la corteza de los árboles. Algunas especies viven en simbiosis con animales, sobre todo

insectos y algunas son patógenas para los animales y el hombre. Las más importantes


60

comercialmente pertenecen al género Saccharomyces. Las setas son hongos filamentosos que

forman estructuras grandes llamadas cuerpos fructificantes, que es la parte comestible de la seta.

Protozoarios: Son microorganismos eucarióticos unicelulares que carecen de paredes celulares.

Por lo general son incoloros y móviles. Los protozoarios se encuentran en una variedad de hábitats

de agua dulce y de agua de mar, gran cantidad de ellos son parásitos de otros animales,

incluyendo al hombre y algunos se encuentran sobre la tierra o en hábitats aéreos, por ejemplo las

superficies de los árboles. Se alimentan ingiriendo partículas o macromoléculas. Los protozoarios

que se mueven con movimientos ameboideos se denominan Sarcodina, los que utilizan flagelos

son los Mastigóforos, y los que utilizan cilios, los Cilióforos. Los Esporozoos, generalmente no son

móviles y son parásitos de otros animales.

Una demostración simple de laboratorio - la columna de Winogradsky- ilustra cómo diferentes

microorganismos interactúan entre sí, de forma tal que la actividad metabólica de un

microorganismo posibilita el crecimiento de otros y viceversa. Estas columnas, que llevan el

nombre del microbiólogo ruso que las utilizó por primera vez, son sistemas completos

autoreciclables, puestos en marcha solamente por energía lumínica.

La Columna de Winogradsky

Bacterias y Archaeas (procariotas), exhiben una diversidad metabólica tan sorprendente que

difícilmente podremos encontrarla en animales, plantas, hongos u otros organismos "superiores"

(eucariotas). Los procariotas, literalmente, mantienen su sistema biológico utilizando y reciclando,

una y otra vez, todos los elementos minerales necesarios para su soporte vital.

Toda la vida sobre la Tierra podría clasificarse en función de las fuentes de carbono y energía de

las que depende cada organismo: la energía puede obtenerse de reacciones luminosas (fotótrofos)

o de oxidaciones químicas (a partir de compuestos orgánicos o inorgánicos); el carbono para la

síntesis celular puede obtenerse del CO2 (autótrofos) o de compuestos orgánicos preformados

(heterótrofos). Combinando estas categorías tendremos las cuatro estrategias básicas de los seres

vivos: fotoautótrofos (plantas), quimioheterótrofos (animales, hongos), fotoheterótrofos y

quimioautótrofos. Sólo entre las bacterias se pueden encontrar estas cuatro estrategias básicas de

la vida.

Dos famosos microbiólogos fueron pioneros en el estudio de estos procesos: Sergei Winogradsky

(1856-1953) y Martinus Willen Beijerinck (1851-1931). En contraste con los estudios sobre cultivos

puros de otros microbiólogos como Louis Pasteur o Robert Koch, estos investigadores se centraron

en estudiar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos en comunidades mixtas.

La columna de Winogradsky es una demostración clásica de cómo los microorganismos ocupan

"microespacios" altamente específicos de acuerdo con sus tolerancias medioambientales y sus

necesidades vitales (requerimientos de carbono y energía) y que, además, ilustra cómo diferentes

microorganismos desarrollan sus ciclos, y la interdependencia que llega a existir entre ellos (las


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actividades de un microorganismo permite crecer a otro y viceversa). Esta columna es un sistema

completo y autónomo de reciclamiento, mantenido sólo por la energía de la luz.

El montaje consta de un cilindro ancho de cristal que se llena con lodos ricos en materia orgánica

hasta 1/3 de su volumen. Se añaden restos orgánicos de diferente origen (tiras de papel de

periódico, aserrín, restos de raices de plantas, carne piada, etc). Se añade a la mezcla un

suplemento compuesto de SO4Ca y CO3Ca (que actúan como fuente de sulfato y tampón

respectivamente). La mezcla, bien apretada para que no queden burbujas de aire, se cubre con

agua procedente de un lago, estanque, acequia (o alguna fuente similar), se cubre con papel de

aluminio y se deja en una ventana donde reciba la luz del sol.

A lo largo de la columna se desarrollan diversos organismos. En la zona inferior de lodos se

desarrollan organismos que desarrollan procesos fermentativos que producen alcohol y ácidos

grasos como subproductos de su metabolismo. Estos productos de "desecho" son a su vez el

sustrato para el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato. Como resultado se liberan sulfuros

que difunden a la zona superior oxigenada creando un gradiente en el que se desarrollan bacterias

fotosintéticas que utilizan el azufre.

Por encima de esta zona pueden desarrollarse las bacterias púrpura que no utilizan el azufre.

Cianobacterias y algas crecen en la parte superior y liberan oxígeno que mantiene aerobia esta

zona.

Microbiología de la columna de Winogradsky

Entre cuatro y seis semanas después de su instalación, la columna debe estabilizarse en tres

ambientes básicos distintos en los que se desarrollarán comunidades bacterianas específicas en

función de sus requisitos medioambientales. Comenzando desde la parte más profunda de la

columna:

Zona anaerobia (sin Oxígeno)

Hay dos tipos de organismos que pueden crecer en condiciones anaerobias: los que fermentan la

materia orgánica o los que realizan la respiración anaerobia. La fermentación es un proceso en el

que los compuestos orgánicos son degradados de forma incompleta (por ejemplo, las levaduras

fermentan los azúcares a alcohol). La respiración anaeróbica es un proceso en el que los sustratos

orgánicos son completamente degradados a CO2, pero usando una substancia distinta del oxígeno

como aceptor terminal de electrones (Algunas bacterias, por ejemplo, utilizan nitratos o iones

sulfato en vez del oxígeno).

En el nivel más bajo de la columna, en un ambiente con alta concentración de SH2, aparecen

varios grupos diferentes de bacterias:

En el fondo de la columna, dependiendo del tipo de barro utilizado, puede aparecer una capa de

color rosado formada por bacterias púrpura del azufre portadoras de vesículas de gas. Una especie


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característica es Amoebobacter En esta misma zona, en condiciones estrictamente anaerobias al

cabo de unas semanas, y utilizando la carga de celulosa aportada por los restos de papel

incorporados en el sedimento como fuente primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias

del género Clostridium.

Todas las especies de este género son anaerobias estrictas porque, aunque sus esporas pueden

sobrevivir en condiciones aerobias, las células vegetativas mueren si están expuestas al oxígeno.

Por eso no empiezan a crecer hasta que éste desaparece del sedimento. Estas bacterias degradan

la celulosa a glucosa y, a continuación, fermenta la glucosa para obtener la energía que necesitan,

produciendo una serie de compuestos orgánicos simples (etanol, ácido acético, ácido succinico,

etc) como productos finales de esa fermentación.

Un poco por encima, las bacterias reductoras del azufre, que se visualizan como una profunda

capa negra y están representadas por Desulfovibrio, pueden utilizar estos subproductos de la

fermentación para su respiración anaerobia, usando sulfato, u otras formas parcialmente oxidadas

de azufre como el tiosulfato, generando grandes cantidades de SH2 en el proceso. Este SH2

reaccionará con cualquier hierro presente en el sedimento, produciendo sulfuro ferroso, que da

color negro. Es por esto que los sedimentos acuáticos son frecuentemente negros.

Sin embargo, no todo el SH2es utilizado. Como veremos un poco más adelante, ciertas cantidades

difunde hacia arriba a lo largo de la columna de agua y son utilizados por otros organismos que

crecen en las zonas superiores.

Este crecimiento se visualiza bajo la forma de dos bandas estrechas, brillantemente coloreadas,

inmediatamente por encima del sedimento: en una primera franja, las bacterias verdes del azufre

(como Chlorobium) procesan los sulfatos a azufre y aparecen en una franja verdosa. En otras zonas

cercanas, bacterias como Gallionella procesan el Hierro formando una capa negra que se forma

justamente por debajo de la anterior. Un poco más arriba, algo más alejadas por tanto de las altas

concentraciones de sulfídrico se desarrolla una zona de bacterias púrpuras del azufre, como

Chromatium, caracterizada por su color rojo-púrpura.

Estas bacterias del azufre, verdes y púrpuras, obtienen energía de las reacciones luminosas y

producen sus materiales celulares a partir de CO2. En gran medida, de manera muy similar a cómo

lo hacen las plantas aunque, sin embargo, hay una diferencia esencial: no producen oxígeno

durante la fotosíntesis porque no utilizan H2O como elemento reductor sino SH2. Las ecuaciones

simplificadas que siguen muestran el paralelismo de ambos procesos:

6 CO2 + 6 H2O C6H12O6 + 6 O2 (fotosíntesis de las plantas)

6 CO2 + 6 SH2 C6H12O6 + 6 S ( fotosíntesis de las bacterias anaerobias)

Un poco por encima de esta zona nos encontramos una franja de bacterias púrpuras no del azufre,

como Rhodospirillum y Rhodopseudomonas, que adquiere un color rojo-anaranjado. Su mayor o

menor abundancia dependerá de la cantidad de sulfhídrico que se haya producido y de la cantidad


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que, no utilizada por otros organismos, difunda hacia arriba, ya que su presencia inhibe a estas

bacterias. Son anaerobios fotoorganotrofos que sólo pueden realizar la fotosíntesis en presencia

de una fuente de carbono orgánico.

Zona aerobia (rica en Oxígeno)

La parte superior de la columna de agua puede contener abundantes poblaciones de bacterias de

diferentes tipos. Son organismos aerobios que se encuentran habitualmente en los hábitats

acuáticos ricos en materia orgánica (estanques poco profundos, arroyos contaminados, etc).

Suelen ser flagelados, lo que les permite moverse y establecerse en nuevas áreas. Puede

desarrollarse también microorganismos fototróficos variados procedentes directamente del agua

o del barro utilizado originalmente en el montaje de la columna. La superficie del barro puede

presentar en esta zona un ligero color castaño. Esta es la parte de la columna más rica en oxígeno

y más pobre en azufre.

Sin embargo, también aquí llegarán por difusión, procedentes del barro de zonas inferiores, ciertas

cantidades de SH2 que será oxidado a sulfato por bacterias que oxidan azufre (como Beggiatoa y

Thiobacillus). Estas bacterias obtienen energía oxidando el SH2 a azufre elemental y sintetizan su

propia materia orgánica a partir de CO2. Por esto se les llama quimoautótrofas.

En las zonas superiores pueden crecer también cianobacterias fotosintéticas, lo que se visualizaría

cómo un tapete de césped de color verde. Éstas bacterias se caracterizan por ser las únicas que

realizan una fotosíntesis similar a la de las plantas. De hecho, hay poderosas evidencias de que los

cloroplastos de las plantas proceden de cianobacterias ancestrales que se establecieron como

simbiontes dentro de células de algún eucariota primitivo. De forma paralela hay también

evidencias igualmente fuertes de que las mitocondrias de los eucariotas actuales se derivaron de

bacterias púrpuras ancestrales por un similar sistema de endosimbiosis.

Procedimiento para el armado de la columna de Winogradsky


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Colectar una cantidad de tierra o barro de un arroyo, lago, pantano o costa de río

(aproximadamente 100 –150 gr de sedimento superficial o subsuperficial) para llenar el recipiente

hasta una altura aproximada de 10 cm. Remover las piedras, ramas o partículas grandes del

material en estudio. Mezclarlo con las sales (5 gr de cada una de las siguientes sales: CaCO3,

CaSO4, CaHPO4) y el papel de filtro o papel de diario finamente cortado.

Colocar la mezcla en un recipiente adecuado (en nuestro caso una probeta de vidrio de 500 ml) y

añadir suficiente agua destilada hasta aproximadamente 3 – 5 cm del borde. Revolver la mezcla

para eliminar burbujas de aire.

Colocar 3 o 4 portaobjetos en una posición vertical sobre el sustrato inclinados contra la pared del

recipiente.

Marcar el nivel de agua y cubrir la boca de la probeta con una envoltura plástica para reducir la

evaporación. Puede ser necesario reponer agua para mantener el nivel original.

Incubar a temperatura ambiente cerca de una ventana para que reciba una adecuada cantidad de

luz, pero no excesiva.


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Bibliografía:

Brock, Biología de los Microorganismos (10a Ed.): Capítulos 20 (20.1 al 20.3 y 20.5), Capítulo 4 (4.8,

4.9 y 4.15).

Russell AD, Hugo WB y Ayliffe GA J. “Principles and practice of disinfection, Preservation and

Sterilization” Ed Blackwell Science (1999)

Ferrari SG, Mattana CM, Di Genaro, MS y Favier, GI. “Manual de Seguridad en el Laboratorio de

Microbiología”, Nueva Editorial Universitaria, UNSL (2011)

La Herencia de Winogradsky. Brock: Biología de los microorganismos. 8ª edición. p. 493. Apuntes

teóricos de la Asignatura.


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Trabajo Práctico Nº 5

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA POTABLE

OBJETIVOS

- Determinar la calidad microbiológica de agua potable por recuento de aerobios mesófilos,

investigación de coliformes totales y fecales, y determinación de la presencia de

Pseudomonasaeruginosa.

- Comparar los resultados obtenidos con los valores admitidos por el Código Alimentario

Argentino (CAA), y establecer la aptitud de la muestra analizada.

INTRODUCCIÓN

Se considera agua potable de suministro público y agua potable de uso domiciliario la que es

apta para la alimentación y uso doméstico: no deberá contener sustancias o cuerpos extraños de

origen biológico, orgánico, inorgánico o radiactivo en tenores tales que la hagan peligrosa para la

salud. Deberá presentar sabor agradable, y ser prácticamente incolora, inodora, límpida y

transparente. El agua potable de uso domiciliario es la que proviene de un suministro público, pozo

u otra fuente, ubicada en los depósitos o reservorios domiciliarios (CAA, Cap. XII, art. 982).

Según el CAA, las características microbiológicas a estudiar son:

- bacterias aerobias mesófilas, cuyo recuento refiere a la calidad general del agua potable,

- bacterias coliformes totales (Enterobacter, Citrobacter, Klebsiellay Escherichiacoli) que

son consideradas indicadores de contaminación fecal. Las tres primeras pueden tener origen

ambiental. Sin embargo,

- E. coli, considerada dentro decoliformes fecales, proviene del hábitat intestinal humano o

animal, y su presencia en agua es inadmisible.

- Pseudomonasaeruginosa es un patógeno sensible a la cloración, que debería estar ausente

si el agua de bebida es adecuadamente clorada.


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Diagrama de flujo para análisis microbiológico de agua potable


1. Recolección de muestras

1.1. Toma de muestra: en botellas o frascos estériles


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1.2. Neutralización de cloro en muestras cloradas: usar tiosulfato de sodio en las siguientes

proporciones:

-agua de bebida: 0.1 ml de Na2S2O3 al 3% en 120 ml de muestra dará una concentración final de 18

mg/L y neutralizará 5 mg/L de cloro residual.

-agua de efluentes cloacales clorados: 0.1 ml de Na2S2O3 al 10% en 120 ml de volumen de

muestra neutralizará 15 mg/L de cloro residual.

La muestra se debe mantener refrigerada y se debe procesar dentro de las 6 h después de la

recolección.

2. Recuento de bacterias aerobias mesófilas

Procedimiento

Preparar varias diluciones de la muestra (1/10, 1/100, etc). Colocar 1 ml de la muestra sin

diluir, y de cada una de las diluciones en placas de Petri vacías y estériles, por duplicado. Verter 10

a 12 ml de agar triptona-glucosa-extracto de levadura (también llamado agar de recuento –PCA),

fundido y enfriado a 50-55°C, en cada placa.Imprimir suaves movimientos de rotación para

mezclar. Dejar solidificar. Incubar a 35°C durante 24 h.

Se consideran para el recuento aquellas cajas que contengan entre 30 y 300 colonias. El

recuento bacteriano resulta del:

promedio del número de colonias en 2 cajaspertenecientes a la misma dilución,multiplicado por

lainversa de la dilución usada, expresadoen ufc/ml.

Incluir en el informe el método usado, temperatura, tiempo de incubación y el medio de

cultivo.


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Medio de cultivo: agar triptona-glucosa-extracto de levadura o agar de recuento (PCA)

Triptona .................................................... 5 g

Extracto de levadura.............................. 2.5 g

Glucosa..................................................... 1 g

Agar........................................................ 15 g

A.D. .................................................. 1000 ml

pH: 7.0 + 0.2

Autoclavar a 121°C durante 15 min.

Valor máximo admitido por el Código Alimentario Argentino: 500 ufc/ ml.

3. Investigación de COLIFORMES TOTALES (géneros:Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella y

Escherichia)

3.1. ANÁLISIS PRESUNTIVO

- Investigación de COLIFORMES TOTALES

Procedimiento

Técnica del número más probable (NMP) por fermentación de tubos múltiples

Agitar la muestra vigorosamente alrededor de 25 veces.

Inocular series de 5 tubos de caldo Mac Conkeycon distintos volúmenes de la muestra [10 ml

para tubos con doble concentración de caldo (D.C.), 1 ml y 0.1 ml para tubos con simple

concentración de caldo (S.C.)].

Incubar a 35 + 0.5°C.

Hacer una primera lectura a las 24 + 2 h para observar producción de gas y producción de

ácidos a partir de lactosa que se visualiza por viraje del indicador de violeta a amarillo. Esto


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constituye una reacción presuntiva positiva. Si fuera negativo, reincubar y reexaminar al final de 48

+ 3 h.

Interpretación: Producción de gas y viraje de color violeta a amarillo en caldo Mac Conkey a

las 48 h + 3 h constituye un test presuntivo positivo. Continuar con fase confirmativa

Medio de cultivo: caldo Mac Conkey

Bilis fresca de buey……………… .......... 5 g

Peptona……………………………….20 g

Lactosa…………….. ........................... ..10 g

Púrpura de bromocresol ...................... 0.01 g

A.D……………………………….1000 ml

pH =7.3 + 0.2

Envasar en tubos con campanita de Durham y esterilizar.

3.2. ANALISIS CONFIRMATIVO

3.2.1.-Confirmación de COLIFORMES TOTALES

Procedimiento

De los tubos de Mac Conkey que presentan gas y viraje de color a las 48 h, sembrar con ansa

en anillo en caldo BRILA. Incubar 24 h a 35-37°C.


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Interpretación: La producción de gas en caldo BRILA confirma la presencia de coliformes

totales.Calcular NMP (número más probable en 100 ml) desde la Tabla de NMP.

Medio de cultivo: Caldo bilis-lactosa-verde brillante (BRILA)

Peptona................................................... 10 g

Lactosa ................................................... 10 g

Oxgall...................................................... 20g

Verde brillante................................. 0.0133 g

A.D................................................... 1000 ml

pH = 7.2 + 0.2

Repartir 10 ml en tubos con campana de Durham y esterilizar.


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El NMP para combinaciones que no aparecen en la Tabla, o para otras combinaciones de

tubos o diluciones, se puede estimar por la fórmula simple de Thomas:

N° de tubos positivos x 100

NMP/100 mL = ------------------------------------------------------------

todos los tubos

mL de muestra en x mL de muestra en

tubos negativos

El Código Alimentario Argentino admite hasta 3 coliformes totales en 100 ml de muestra.


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3.2.2.- Confirmación de COLIFORMES FECALES (Escherichiacoli)

Procedimiento

De cada uno de los tubos positivos de caldo Mac Conkey en la fase presuntiva, transferir

cultivo con ansa estéril de 3-3.5 mm de diámetro a caldo EC.Incubar en baño de agua a 44.5 + 0.2

°C por 24 + 2 h.

Interpretación: La ausencia de gas en caldo EC dentro de las 24 h de incubación indica

AUSENCIA de coliformes fecales. El análisis de coliformes fecales finaliza aquí. La producción

de gas y turbidez en caldo EC dentro de las 24 h o menos indica PRESENCIA de coliformes

fecales (se debe continuar para confirmar E. coli).

Medio de cultivo: caldo EC

Triptosa .................................................. 20 g

Lactosa ..................................................... 5 g

Sales biliares (mezcla) o

salesbiliares N°3.................................... 1.5 g

K2HPO4 .................................................... 4 g

KH2PO4 ................................................. 1.5 g


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NaCl ......................................................... 5 g

A.D. .................................................. 1000 ml

pH = 6.9 + 0.2

Envasar con campanita de Durham y esterilizar.

3.2.2.1.Confirmación de Escherichiacoli

Procedimiento

Desde cada uno de los tubos de caldo EC positivos, sembrar en agar eosina-azul de metileno

(EMB) y observar el desarrollo de colonias características de Escherichiacoli. Hacer Gram y

pruebas bioquímicas principales.

Interpretación: El desarrollo de colonias oscuras con brillo verde-metálico en agar EMB, la

observación de bacilos y cocobacilos Gram negativosal microscopio óptico, y un IMViC ++ - -

confirman la presencia de E. coli.

Computar los tubos EC donde se confirmó la presencia de E. coliy con la nueva combinación

de tubos positivos, calcular el NMP de coliformes fecales desde la Tabla de NMP.

El Código Alimentario Argentino recomienda ausencia de E. colien 100ml de muestra.

Medio de cultivo: Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)


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Peptona……………………..10.0 g

Lactosa……………………….5.0 g

Sacarosa……………………. 5.0 g

Fosfato dipotásico…………. 2.0 g

Agar………………………… 13.5 g

Eosina………………………. 0.4 g

Azul de metileno………….0.065 g

pH final: 7.2 ± 0.2

Disolver. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos.Enfriar a 45°C y distribuir

agitando suavemente.

4. Investigación dePseudomonasaeruginosa

4.1. Test presuntivo

Procedimiento:

Medir 100 ml de muestra en recipiente estéril y sembrar en 100 ml de caldo asparagina doble

concentración. Incubar hasta 5 días a 25°C. Observar bajo luz U.V.

Interpretación: El desarrollo de fluorescencia verdosa por producción de pigmento en caldo

asparagina se considera test presuntivo positivo.


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Medio de cultivo:caldo asparagina (fórmula simple)

Asparagina ............................................... 3 g

K2HPO4 .................................................... 1 g

MgSO4.7H2O......................................... 0.5 g

A.D. .................................................. 1000 ml

pH = 6.9 a 7.2

4.2.Análisisconfirmativos

Desde caldo asparaginapositivo sembrar para las siguientes pruebas:

4.2.1. Digestión de caseína y producción de pigmento verde característico

Hacer una sola estría (de 2 a 4 cm de longitud) desde caldo asparagina sobre agar leche e

incubar a 35 + 1°C por 24-48 h.

Interpretación:

P. aeruginosahidroliza la caseína y produce un pigmento difusible verde oamarillento en agar

leche.

Medio de cultivo: - Agar leche

A- Leche descremada ........................... 100 g

A.D. .................................................... 500 ml


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B- Caldo nutritivo ............................... 12.5 g

NaCl ...................................................... 2.5 g

Agar…………………………….……..15 g

A.D……………………………..…..500 ml

Esterilizar por separado las mezclas a y B, enfriar rápidamente a 55°C, combinar

asépticamente las mezclas y verter en cajas de Petri.

4.2.2. Producción de pigmento verde característico

Sembrar con ansa desde caldo asparagina en agar King Ward Raney A, e incubar como se

explicó para agar leche.

Interpretación: P. aeruginosa produce un pigmento fluorescente en agar King A, que se pone

enevidencia bajo luz UV. El pigmento se puede extraer con cloroformo en medio alcalino

(NH4OH) y se observa de color azul.

Medio de cultivo: Agar King Ward Raney “A”.

Peptona ............................................. 2 g

Agar ............................................... 1.5 g

Glicerol .................................. 1 g o 1 ml

K2SO4 anhidro .................................. 1 g

MgCl2 .......................................... 0.14 g

Agua destilada ............................ 100 ml

pH: 7.2

4.2.3. Otros ensayos


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Realizar Gram y prueba de oxidasa a colonias seleccionadas desde agar leche o King “A”.

- Prueba de la oxidasa

Se basa en que ciertos microorganismos contienen citocromo-oxidasas, estas enzimas

oxidan la dimetilparafenilendiamina en presencia de O2 y citocromo y llevan alfa-naftol a indofenol

de color azul.

Técnica: se emplean discos comerciales impregnados en los reactivos, que se introducen en

una suspensión de la cepa a ensayar.

Interpretación: P. aeruginosa es un bacilo Gram negativo, que da positiva la prueba de la

oxidasa.

El Código Alimentario Argentino recomienda ausencia de P. aeruginosa en 100 ml de

muestra.


1. Se procederá a realizar toma de muestra desde grifo de pileta del Laboratorio y se sembrará

para las 3 determinaciones: recuento de aerobios mesófilos, coliformes totales e investigación de P.

aeruginosa.

2.En medios de cultivo sembrados con una muestra de agua artificialmente contaminada, se

realizará observación del desarrollo, y lectura e interpretación de los resultados obtenidos.Se

informarán los resultados obtenidos.

3. Tomando como referencia los valores máximos admitidos por el CAA, se establecerá la

calidad del agua analizada.

BIBLIOGRAFÍA

- http://www.anmat.gov.ar/alimentos/codigoa/CAPITULO_XII.pdf

- American Public Health Association (APHA). 1994. Standard Methods for the Examination

of Water and Wastewater. USA.

-Producción fotográfica: María Cecilia Villa.

http://www.anmat.gov.ar/alimentos/codigoa/CAPITULO_XII.pdf


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