TECNICAS PARA ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS

ELECTROFORESIS

La electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa, permite separar fragmentos de DNA de diferente tamaño.

Sin embargo, no se puede saber en cuál de los fragmentos se encuentra el gen o la secuencia de DNA que se busca.

HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS

El DNA puede sufrir un proceso reversible de separación y reasociación de hebras

DNA en estado nativo Denaturado Renaturado

Sonda marcada

Acido nucleico inmovilizado

Paso 1: Separación de fragmentos de RNA por electroforesis.

Paso 2: Transferencia del RNA al filtro o membrana

Sonda marcada

Acido nucleico inmovilizado

Paso 3: Hibridación con la sonda específica complementaria

Paso 4: Lavado y detección de la sonda marcada

La hibridación con sondas específicas permite determinar la identidad de un

fragmento de DNA o RNA

La hibridación en condiciones de mayor estringencia garantiza una mayor especificidad en la interacción.

TIPOS DE HIBRIDACION

1. Tipo de interaccion: DNA – DNA / DNA – RNA/ RNA – RNA

2. Hibridación en filtro: Southern

Northern

Colony Hibridization

Dot-blot

3. Hibridacion en solución : substractiva + columna de hidroxiapatita

4. Hibridacion in situ

Colony hibridization

Por hibridación en colonia, se puede identificar cuáles de las colonias recombinantes obtenidas, tiene clonado un fragmento de DNA en particular.

SECUENCIAMIENTO

• Uso de dideoxinucleótidos (ddNTPs)• 4 reacciones por separado, en paralelo.• Separación de fragmentos producidos por

electroforesis en gel de secuenciamiento

• Animación (Lodish)

Figure 7-29a

Se realizan 4 reacciones por separado

Oligonucleótido o PrimerTemplado