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TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS DE RESIDUOS INHIBIDORES

Mª Teresa Fernández Fernández

Laboratorio de Salud Pública de Lugo

Conselleria de Sanidade

Xornada técnica do leite

12 de Noviembre de 2007

Residuos y

Salud pública



¿Cuál es la justificación del control de residuos en leche?

EFECTOS

TOXICOLÓGICOS

v Resistencias microbianas

v Alergias

v Toxicidad

v Efectos sobre la flora intestinal

Residuos y

Industria Láctea

EFECTOS TECNOLÓGICO ECONÓMICOS

qInhibición bacteriana:Efectos sobre las características organolépticas del productoqEnmascaramiento de los controles microbiológicos: fallan los controlesqTermorresistencia:superan las barreras térmicas (pasteurización,UHT,etc.)

Residuos y

Productor

EFECTOS

ECONÓMICOS

Ø Sanciones

Ø Pago por calidad

Ø Descarte de leche

§ Contaminación cisterna-silo



¿Cuáles son los posibles residuos y contaminantes en la leche?

vResiduos de medicamentos veterinarios

vSustancias anabolizantes

vDetergentes y desinfectantes.

vPesticidas

vMicotoxinas

vPCBs, Dioxinas, metales pesados,etc.

DEFINICIONES

(Codex Alimentarius)

Define los residuos de medicamentos veterinarioscomo los productos originales y sus metabolitos en cualquier porción comestible del producto animal

(P.N.I.R.)Residuo de:

•Sustancias de acción farmacológica

•Sus productos de transformación

•Otras sustancias

que se transmitan a los productos animales y que

puedan resultar nocivos para la salud humana



Residuo

DEFINICIONES



Promotor de crecimiento

Sustancia que en sí misma proporciona el crecimiento del animal

(Clembuterol,Hormonas)

Precursor de crecimiento

Sustancia que favorece las condiciones del entorno del animal para favorecer su

crecimiento

(antibióticos , vitaminas,tranquilizantes,etc.)

LMR = Limite Máximo de Residuo(µg/kg = ppb)

Es el contenido de un determinado producto veterinario que se considera

admisible en un producto alimenticio; este límite se basará en el tipo y en la

cantidad de residuos que se consideren no constituyen ningún riesgo

toxicológico para la salud humana



DEFINICIONES

• Antibiótico: (1942) compuestos químicos de origen microbiano ,con actividadantimicrobiana.

• Quimioterápico:compuestos de síntesis (distinción con los de origen natural)

• Antibacteriano: Para distinguir losantimicrobianos activos frente a bacterias de los activos frente a hongos (Antifúngicos).

• Inhibidor: Se denominan así a los residuos de antibióticos detectados mediante técnicas microbiológicas



DEFINICIONES



Normativa sobre residuos de medicamentos veterinarios

(Reglamento UE 2377/90)

ØAnexo I: Lista de sustancias farmacológicas activas, cuyos LMR se han fijado definitivamente (medicamentos con limitación de uso)

ØAnexo II: Lista de sustancias que no están sujetas a LMR (medicamentos de libre uso)

ØAnexo III: Lista de sustancias para las que se han fijado LMR provisionales (medicamentos con limitación de uso provisional)

ØAnexo IV: Lista de sustancias para las que no se pueden establecer LMR (medicamentos prohibidos)



Grupos antibióticos

Macrólidos y LincosaminasEpiramicina

Kitasamicina

Lincomicinsa

Tilosina

etc.

TetraciclinasClortetraciclina

Oxitetraciclina

Tetraciclina

Doxiciclina

Rolitetraciclina

:

PenicilinasAmoxicilina

Ampicilina

Bencilpenicilina

Cloxacilina

Oxacilina,etc.




CefalosporinasCefalotina

Cefaloxina

Cefoperazona

Cefuroxima

Cefazolina

etc.

NitrofuranosFuraltadona

Furazolidona

AminoglucósidosEspectinomicina

Estreptomicina

Kanamicina

Gentamicina

etc.

:

QuinolonasCirofloxacinoEnrofloxainoAc Nalidíxico

AnfenicolesCloranfenicol

Tianfenicol

Fluorfenicol.




PeptídicosBacitracina

Colistina

Polimixina B

Avoparcina

Virgiamicina

Gramicidina

IonóforosMonensina

Salinomicina Lasalocid

OtrosNovoviocina

A.Fusidico

Trimetroprima

Dimetridazol

Griseofulvina

Nistatina

Carbadox

Ronidazol

Metronidazol

Dapsona

etc.



Propiedades de los métodos de detección

ØSelectividadØLímites de detecciónØSensibilidad para los LMRsØReproducibilidad, Precisión, Exactitud

Falsos Positivos

Falsos Negativos

OBJETIVO DEL MÉTODO DE CONTROL

ELEGIREMOS EL MÉTODO DE DETECCIÓN

¿Cuál sería el método ideal?ü Detecta todos los residuos posibles

üCon sensibilidad alrededor de los LMRs

üPocos resultados falsos negativos(protección del consumidor)

üPocos resultados falsos positivos (protección del productor y del comercio nacional e internacional)

üEconómico y de fácil usoXornada técnica do leite




ESTRATEGÍA ANALÍTICA

Técnicas de

Cribado

o de

Screening

Técnicas

de

Post-Cribado

Técnicas

de

Confirmación



Propiedades de los métodos de detección: Fundamento

Técnicas de

Cribado

o de

Screening

Microbiológicas



Propiedades de los métodos de detección: Fundamento

Técnicas

de

Post-Cribado

Ø Inhibición microbiana: Post-Cribado

Ø HPTLC(Cromatografía de capa fina)

Ø Inmuno-enzimáticos:*Inmunológicos (ELISA, RIA,etc.).*Enzymáticos (Pezym)

Ø De Unión a Receptores:*Receptores microbiológicos(Charm).

*Receptores proteicos (Beta-star,Snap)



Propiedades de los métodos de detección: Fundamento Cromatografía

Técnicas

de

Confirmación

Ø HPLC/UVØ HPLC/DADØ HPLC/FLUOØ HPLC/MS-MSØ GSØ GS/MSØ etc.



TÉCNICAS MICROBIOLÓGICASDE

Screening o Cribado

Todas se basan en el cultivo de un microorganismo enagar que tiene resistencia o sensibilidad frente a un antibiótico o grupos antibióticos determinados que seecuentran como residuos en los tejidos de origen animal o en sus productos .

Para conseguir un amplio espectro de identificación , se juega con la siembra en agares de distinta composición ypH.



TÉCNICAS MICROBIOLÓGICASde Screening o Cribado

qTécnica de Cribado de residuos antibacterianos con 5 placas

qTécnica Stop (“Swab test on premises”)

qTécnica STAR (“screening test for antibiotic residues”)

qTécnica de cribado de residuos antibacterianos en leche por inhibiciónde B. stearotermóphilus:

* En placa.

* Delvotest.

* Eclipse 50



Técnica de Cribado de residuos antibacterianos con 5 placas

Disco control Estreptomicina

0,5 µg/disco

Disco control Estreptomicina

0,5 µg/disco

Disco controlSulfadimidina0,5 µg/disco

Disco controlBencilpenicilina

0,01 UI /disco

Disco controlCiprofloxacino0,003 µg/disco

Ph 830ml de

agar

+

Kocuria rhizophila

37ºC

Ph 6

30ml deagar

+

B. subtilis

30ºC

DST(pH7,4)

30ml de agar+

solución deTrimetoprima

+

B. subtilis

30ºC

Ph 8

30ml deagar

+

B. subtilis

30ºC

DST ó PH 8

30ml deagar

+

E. coli

30ºC



Leche cruda

En baño a 80ºC

durante 10 mit



Medida con calibre de los halos de inhibición

Positivas las muestras conhalos

mayores ó iguales 2mm



Técnica Stop (“Swab test on premises”)

Johnston et al. 1981

Utilizada por su sencillez en mataderos sin necesidad de remitir muestras al laboratorio en EEUU y países de

influencia

Agar nº 5

+

B. subtilis

Disco control de Neomicina

(V. Calderón)

Técnica STAR (“screening test for antibiotic residues”)

Fué una de las propuestas del laboratorio Comunitario de Referencia en atención a las necesidades de los planes de

residuos

Tilosina37ºCM. LuteusMedio pH 8

Ciprofloxacino37ºCE. coli Medio pH 8

Estreptomicina30ºCB. subtilisMedio pH 7,2

Sulfadimidina55ºCB. stearotermóphilus

Medio DSTpH 7,4

+Trimetoprima

Clortetraciclina30ºCB. cereusMedio pH 6

DISCO CONTROL

TªMICROORGANISMOMEDIO



Técnica de Post-cribadode residuos de antibióticos por

bioensayo múltiple

Es una técnica con la que se pretende identificar el grupo de antibióticosal que podría pertenecer el residuo

Se utiliza desde hace tiempo en EEUU y su puesta a punto para el PNIR fué a cargo del Centro Nacional de Referencia de Majadahonda (V. Calderón)

40 mg/ ml200 UI/ml E. coli CECT 4201Nº 7,4K

NO200 UI/ml E. coli CECT 4201Nº 7,4Q

40 mg/ ml200 UI/ml S. epidermidis CECT 231Nº 11?

NO200 UI/ml S. epidermidis CECT 231Nº 11G

NO200 UI/ml Kocuria rhizophila CECT4093Nº11F

NO200 UI/mlKocuria rhizophila CECT 4070Nº 11E

40 mg/ ml200 UI/mlB. subtilis CECT 356Nº 5d

NO200 UI/ml B. subtilis CECT 356Nº 5D

NO200 UI/mlKocuria rhizophila CECT 4070Nº 2C

NONOKocuria rhizophila CECT 4070Nº 2B

NO200 UI/mlB. cereus CECT 5314Nº 8a

NO200 UI/ml B. cereus CECT 193Nº 8A

PLACA MEDIO MICROORGANISMO PENICILASA HEPARINA

PREPARACIÓN DE PLACAS



cilindros de 8 mm de Ø externo y 10

mm de altura

Leche cruda

A 80º C durante 10 mit

para inactivar los posibles inhibidores naturales



Técnica de Post-cribado de residuos de antibióticos por bioensayo múltiple

Lectura de resultadosØPlacas A y a: Detección de Tetraciclinas

ØPlaca B y C: Detección de ß-lactámicos

ØPlaca D: Detección de aminoglucósidos(estreptomicina)

ØPlacas E y F : Detección de macrólidos (eritromicina)

ØPlaca G: Detección de aminoglucósidos (Neomicinay Gentamicina)

ØPlaca Q: Detección de Quinolonas



Técnica de Post-cribado de residuos de antibióticos por bioensayo múltiple

Informe de resultados

Si no se puede interpretar el resultado Inhibidor no identificable

Si no se detecta el halo Negativo

Se detecta una inhibición Actividad antibacteriana concordante con el grupo....



Agar Nº 2 adicionado con 1 g de D(+) Glucosa+Púrpura de Bromocresol

+suspensión de esporas B. stearothermophilus

+solución de Trimetoprima

Técnica de cribado de residuos antibacterianos en leche porinhibiciónde B. stearotermóphilus en placa

( método de Kundrat)

En ausencia de sustancias inhibidorasel germen se desarrolla en el curso de la incubación, fermentando la glucosapresente en el medio, formando ácido, el cual hará virar a amarillo el Púrpura de bromocresol (violeta) de todo el agarde la placa o del tubo.

disco control de 0,01 UI de penicilina GTª de incubación 64ºC durante 3h - 4h



Delvotest y test Eclipse 50Añadir una tableta nutritiva (solo en

el Delvotest)

Añadir 100 µl de muestra en Delvotesty 50 µl en el Eclipse 50

Tapar los viales e incubar a 64ºC± 2ºC

Leer los resultados

aproximadamente

3 h

Eclipse 50 Delvotest



ØSon tests que vienen preparados para su utilización en tubo. Se basa igualmente que el anterior en la inhibición o no del desarrollo de Bacillus stearothermophilus(var.calidolactis) a 64ºC, en un agar compuesto de nutrientes seleccionados y con un indicador de color que hará virar el medio a amarillo en caso de ausencia de sustancias inhibidoras debido a la formación de ácido por parte del germen que se ha desarrollado en el medio, y permanecerácon el color violeta original del medio, en el caso de la presencia de sustancias inhibidoras, que no permitirán el desarrollo del germen.ØNegativo cuando en todo el agar del tubo hay un cambio de color manifiesto de violeta a amarillo.ØPositivo cuando veamos con claridad que se mantienen el color violeta original del medio

Fundamento de la técnica del Delvotest y Test Eclipse 50

ØLa favorable evolución del proceso patológico a curar

ØUn buen diagnóstico:ØNos lleva a la elección del mejor tratamiento

ØLa mejor dosificaciónØElección del mejor producto

ØLa adecuada duración del tratamiento

ØY en consecuencia

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