Atlas de Histologı́a Vegetal y Animal

Técnicas histológicas

TINCIÓN

Manuel Meǵıas, Pilar Molist, Manuel A. Pombal

Departamento de Bioloǵıa Funcional y Ciencias de la Salud.Fcacultad de Bioloǵıa. Universidad de Vigo.

(Versión: Julio 2018)

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Contenidos

1 Introducción 1

2 El proceso histológico 2

3 Tinción 4

4 Tinciones generales 5

5 Histoqúımica 11

6 Lectinas 15

7 Inmunocitoqúımica 18

8 Hibridación in situ 24

Técnicas histológicas. Tinción. 1

1 Introducción

En estas páginas dedicadas a las técnicas histológicasvamos a describir los procedimientos experimentalesnecesarios para obtener secciones teñidas y listas paraobservar al microscopio partiendo de tejidos vivos ex-tráıdos de un animal o de una planta. Por tanto, dedi-caremos espacios a la obtención, fijación, inclusión,corte y tinción de los tejidos. Todos estos aparta-dos seguirán el mismo esquema que los caṕıtulos ded-icados a los tejidos o a la célula, partir de un es-quema básico y ampliar la información sucesivamenteen páginas adicionales. No dedicaremos demasiadoespacio a los instrumentos, desde el punto de vistaoperativo, pero śı a la conveniencia de su uso y asus capacidades. Además, se incluye un apartado deprotocolos y recetas donde se incorporan los tiempos,productos y manera de proceder para llevar a cabolas tinciones más comunes y cómo preparar sus reac-tivos.También se han añadido algunos v́ıdeos explica-tivos.

La mayoŕıa de las técnicas histológicas van encam-inadas a preparar el tejido para su observación con elmicroscopio, bien sea éste óptico o electrónico. Ello

es debido a que la composición de los tejidos, salvocontadas ocasiones, no tienen contraste ni colores per-mitan diferenciar sus estructuras de una manera claramediante la observación directa con los microscopios.Por ello hay procesar las muestras, primero para queno se se deterioren y después para resaltar sus estruc-turas y poder estudiarlas en detalle.

Existen procedimientos rápidos y simples para laobservación de tejidos y células vivas que reciben elnombre de vitales. Por ejemplo, la observación delflujo sangúıneo en capilares del sistema circulatorio.Otra forma de observar células o tejidos vivos es medi-ante las técnicas histológicas supravitales, en los quelas células y los tejidos se mantienen o se hacen crecerfuera del organismo, como es el caso de los cultivosde células y de tejidos.

Las técnicas histológicas postvitales son aquellas enlas que las células mueren durante el proceso, pero lascaracteŕısticas morfológicas y moleculares que poséıanen estado vivo se conservan lo mejor posible, lo quedepende del tipo de técnica. Estas páginas estarándedicadas a este tipo de técnicas, puesto que son lasmás comúnmente usadas en los laboratorios de his-toloǵıa.

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2 El proceso histológico

Denominamos proceso histológico a una serie demétodos y técnicas utilizados para poder estudiarlas caracteŕısticas morfológicas y moleculares de lostejidos. Hay diversos caminos para estudiar los teji-dos, es decir, series de técnicas que se utilizarán de-pendiendo de qué caracteŕıstica deseemos observar.En el siguiente esquema se muestran los métodosy técnicas comúnmente empleados durante el proce-samiento de los tejidos para su observación con losmicroscopios óptico o electrónico. Sin embargo, hayque tener en cuenta que existen muchas variantes a es-tos ”caminos” y su elección dependerá del resultadofinal que queramos obtener.

El proceso histológico comienza con la obtencióndel tejido objeto de estudio. En el caso de los tejidosvegetales directamente se toman muestras de los dis-tintos órganos que componen el cuerpo de la planta,mientras que para los tejidos animales podemos op-tar por dos opciones: coger una porción del tejidou órgano y procesarla o procesar primero el animalcompleto y luego extraer la muestra que nos interese.En cualquier caso las muestras son habitualmente fi-jadas con unas soluciones ĺıquidas denominadas fi-jadores, las cuales se usan para mantener las estruc-turas celulares y moleculares inalterables durante elprocesamiento posterior y con una organización lomás parecida posible a como se encontraban en lamuestra viva. También podemos fijar las moléculas delos tejidos por congelación rápida. Fijar un tejido escomo hacer una fotograf́ıa de dicho tejido, su estruc-tura se mantendrá hasta su observación. La fijaciónpor congelación se emplea cuando la fijación qúımicao los procesos histológicos posteriores alteran las car-acteŕısticas de la muestra que queremos estudiar, porejemplo una molécula sensible a dichos tratamientos.

Normalmente, tras la fijación se procede a incluir eltejido para posteriormente obtener secciones. Cuantomás delgada queramos que sea nuestra sección mástenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se con-sigue embebiendo el tejido con sustancias ĺıquidas queposteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán

consistentes (ceras). También se puede conseguirel mismo efecto mediante congelación rápida. Cortesmás gruesos de 40 µm se pueden cortar sin necesi-dad de inclusión usando el vibratomo. Los mediosde inclusión no son normalmente hidrosolubles porlo que tendremos que sustituir el agua de los tejidospor solventes orgánicos liposolubles y posteriormentesustituirlos por el medio de inclusión.

Tras la inclusión o la congelación se procede a cor-tar los tejidos, es decir, obtener secciones. Existendiferentes aparatos de corte que permiten conseguirsecciones ultrafinas (del orden de nanometros), semi-finas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm)y gruesas (mayores a 10 µm). Habitualmente las sec-ciones se procesan para poder observarlas y estudiar-las, aunque ciertos tipos de microscoṕıa, por ejemplocon contraste de fase, permiten observar secciones detejidos sin procesar. Normalmente las secciones setiñen con colorantes que son hidrosolubles, por lo quehay que eliminar el medio de inclusión para que loscolorantes pueden unirse al tejido. Las secciones ul-trafinas (observadas con el microscopio electrónico)o semifinas (observadas con el microscopio óptico)se pueden contrastar con metales pesados o con col-orantes, respectivamente, sin necesidad de eliminar elmedio de inclusión.

Los tejidos procesados se observan con los micro-scopios. Existen dos tipos básicos de microscopios:óptico y electrónico. Los primeros ofrecen una granversatilidad en cuanto a modos de observar los teji-dos: campo claro, fluorescencia, contraste de fase,polarización o contraste de interferencia diferencial,mientras que los segundos permiten un gran poder deresolución, pudiéndose observar caracteŕısticas ultra-estructurales.

Como dijimos al comienzo existen múltiples varia-ciones sobre este esquema general de procesamientohistológico. Por ejemplo, se pueden observar tejidoscon el microscopio electrónico de barrido sin necesi-dad de incluir ni cortar, pero sólo observaremos su-perficies. En las siguientes páginas veremos con ciertodetalle algunas de las técnicas más empleadas para laobservación de los tejidos.

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Figura 1: Esquema del proceso histológico.

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3 Tinción

Los tejidos animales son en su gran mayoŕıa incoloros,excepto aquellos que poseen algún tipo de pigmentocomo la hemoglobina de la sangre o la melanina dela epidermis. En las plantas, sin embargo, existe unamayor variedad de pigmentos naturales que permitensu observación directa con el microscopio óptico, a loque también ayuda la presencia de las paredes celu-lares, las cuales facilitan la delimitación celular y ladiscriminación entre diferentes tejidos. Cuando seinventaron los primeros microscopios hubo que des-cubrir cómo teñir los tejidos para poder desentrañarsus caracteŕısticas morfológicas. Se observó que al-gunos pigmentos como el carmı́n o la eosina, disuel-tos en agua, se uńıan a determinados componentesde los tejidos. La expansión de la industria textilen el siglo XIX y su necesidad de colorear las telasprovocó un rápido desarrollo de los tintes o pigmentos.Muchas de estas sustancias fueron usadas como col-orantes en la histoloǵıa de los animales y de las plantasdesde mediados del siglo XIX hasta la actualidad, al-canzándose un enorme desarrollo y perfeccionamientode nuevas técnicas y moléculas sintéticas que se usansegún las necesidades del investigador. Con la lle-gada de la bioloǵıa molecular se han puesto en marchaotras técnicas mucho más sofisticadas para observarelementos celulares, entre las que se pueden destacaraquellas que usan anticuerpos, inmunocitoqúımicas,las que usan sondas de ADN o ARN, hibridaciones ”insitu”, o más sofisticadas aún como las que mediante eldiseño de animales transgénicos permiten identificary observar a las células que expresan un determinadogen, incluso en el organismos vivo, gracias a la fluo-rescencia de la protéına verde fluorescente (GFP).

No vamos a describir con detalle las técnicas máscomplejas, al menos no en estas páginas básicas, sinolas más comunes, las que se suelen emplear en un lab-oratorio para el estudio general de los tejidos. Dividi-remos el conjunto de técnicas histológicas en cuatrocategoŕıas.

a) Tinciones generales. Aquellas que usan sustan-cias coloreadas que se unen a componentes tisularespor afinidad electro-qúımica.

b) Histoqúımica. Son aquellas técnicas de tinciónque implican la modificación qúımica de algunasmoléculas tisulares para posteriormente ponerlas demanifiesto con colorantes. En este apartado incluire-mos también a los métodos de tinción basados en lacapacidad cataĺıtica de algunas enzimas presentes enlos tejidos que queremos estudiar.

c) Lectinas. Las lectinas son dominios de protéınas,como las selectinas, que son capaces de reconocerglúcidos que forman parte de polisacáridos. Tienenuna gran especificidad y se usan para determinar eltipo de glúcido que aparece en las glicoprotéınas delas células o de la matriz extracelular de los diferentestejidos o como marcadores de estructuras tisulares.

d) Inmunocitoqúımica o inmunohistoqúımica. Sontécnicas histológicas muy potentes basadas en laalta especificidad de la unión de los anticuerpos alos ant́ıgenos contra los que se produjeron. Estosant́ıgenos pueden ser cualquier molécula tisular que,purificada en inyectada en un animal, sea capaz dedesarrollar una respuesta inmune. Estos anticuer-pos añadidos a una sección de tejido reconocerán yse unirán espećıficamente a dicha molécula.

e) Hibridación. Son técnicas basadas en la unióncomplementaria de las bases de ácidos nucleicos(adenina con la timina, o con el uracilo, y de laguanina con al citosina). Esto hace que dos cadenascomplementarias de ácidos nucleicos se unan entre śıde forma muy espećıfica, es decir, hibriden. Sigu-iendo este principio se pueden sintetizar sondas mar-cadas, cadenas de ADN o ARN con una secuenciade bases determinada que llevan una molécula unidapara poder detectarlas. La secuencia de bases de lasonda es complementaria a otra que está presente enla célula, normalmente en forma de ARN mensajero.Aśı, podemos observar qué células expresan un deter-minado gen.

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4 Tinciones generales

La mayoŕıa de los tejidos, sobre todo los de los an-imales, son incoloros y por ello necesitamos teñirlospara observar sus caracteŕısticas morfológicas con elmicroscopio óptico. Ello se consigue con el uso loscolorantes, sustancias coloreadas que son capaces deunirse de manera más o menos espećıfica a estruc-turas del tejido aportándoles color. Se utilizan nor-malmente para teñir a las células y componentes tisu-lares que van a ser observados con el microscopioóptico y por ello se realizan habitualmente sobre sec-ciones de tejido, siendo las más utilizadas las sec-ciones obtenidas a partir de inclusiones en parafinau obtenidas en el criostato. Los colorantes son loselementos principales de las tinciones generales.

La molécula de un colorante tiene normalmente doscomponentes importantes: uno que aporta el color,denominado cromógeno, y otro que posibilita la unióna elementos del tejido denominado auxocromo. Elcromóforo es la organización molecular dentro delcromógeno responsable de la absorción de un espec-tro determinado de longitudes de onda. El auxocromoque se une al cromógeno puede influir en su coloracióny muchos colorantes tienen más de un grupo aux-ocrómico. El auxocromo puede ser un grupo inoniz-able, un grupo que reacciona covalentemente con ionesmetálicos (mordientes) o puede reaccionar covalente-mente con el sustrato, en este caso el tejido. Los col-orantes son normalmente hidrosolubles, aunque haycolorantes que carecen de grupos ionizables y sirvenpara teñir sustancias grasas, como gotas de ĺıpidos.

Según la naturaleza qúımica del cromóforo hay var-ios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, derivados dela antroquinona, derivados de la acridina, derivadosde iminas quinónicas, derivados de diferrilmetano ytriferrilmetano, derivados del xanteno y derivados delas talocianinas.

Según la naturaleza qúımica del radical auxocromolos colorantes se clasifican en:

Básicos: son sales en las que la base, normal-mente una amina, aporta el color, mientras que laparte ácida es incolora. Es decir, con colorantescatiónicos. Tienen apetencia por sustancias ácidas

del tejido como el ADN o ciertos componentes de lamatriz extracelular como los glicosaminoglicanos. Launión es por atracción eléctrica. Aśı, ponen de mani-fiesto el núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr presenteen los ribosomas por ser muy abundante, aśı comociertas matrices extracelulares ricas en componentesácidos. Ejemplos de colorantes básicos son la tionina,safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o lahematoxilina.

Ácidos: son sales con el anión coloreado y la baseincolora. Son derivados de grupos sulfónicos, carbox-ilos o hidroxilos fenólicos. Tienen apetencia por sus-tancias básicas, sobre todo estructuras proteicas lo-calizadas en el citoplasma celular y también por elcolágeno de la matriz extracelular. La unión es poratracción eléctrica. Ejemplos de colorantes ácidos sonla fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la eosina.

Colorantes mordientes: son aquellos que se usanen combinación con sales metálicas, que actúan comomordiente. Estas sales se pueden emplear junto conel colorante, antes o después. En algunos casos el col-orante mordiente puede ser también aniónico o, menosfrecuentemente, catiónico. Normalmente se empleanpara teñir los núcleos. Por ejemplo, la hematoxilinaférrica de Heidenhain

Neutros: poseen una porción ácida y otra básica,ambas con capacidad para aportar color. Por tanto unmismo colorante puede teñir tanto las partes básicascomo las ácidas de los tejidos. Por ejemplo, el eosinatode azul de metileno.

Indiferentes o hidrofóbicos: realmente no se unena elementos de los tejidos por afinidad qúımica sinoporque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorantesudán se disuelve en los ĺıpidos y por tanto teñirá alas gotas de ĺıpidos, especialmente en los adipocitos.

Los colorantes usados en histoloǵıa se emplean amuy altas concentraciones y la cantidad que se uneal tejido es realmente pequeña. Por eso, una soluciónde colorantes se puede usar muchas veces sin que seagote. La manera en cómo se consigue una tinciónadecuada se puede dividir en dos tipos: progresiva yregresiva. La tinción progresiva consiste en obteneruna coloración adecuada controlando el tiempo de lasección en el colorante, de modo que a más tiempo

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más coloración. La tinción regresiva consiste en laeliminación lenta de colorante de una tinción que hasido teñida en exceso. Esta eliminación se consiguenormalmente con soluciones alcohólicas y al procesose le denomina desteñido. La concentración de lasolución y tiempo de diferenciación nos aporta la col-oración adecuada.

Figura 2: Sección de un glomérulo de un riñón de mamı́feroobtenida a partir de una inclusión en parafina y teñidocon hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de colorvioláceo (hematoxilina) y el citoplasma de color rosado(eosina).

En algunas ocasiones necesitamos resaltar elemen-tos tisulares de manera espećıfica y para ello usamoscolorantes que tienen apetencia por dichas estruc-turas. Por ejemplo, la tinción denominada azán con-tiene azocarmı́n y naranja-anilina-ácido acético quetiñen los núcleos de rojo y sobre todo destaca el conec-tivo intensamente teñido de azul. Otra tinción com-binada es el tricrómio de Mallory que tiñe el colágenode verde y las células musculares de rojo.

Cuando un colorante se une al tejido y aporta uncolor diferente al que tiene en solución se dice queha ocurrido un fenómeno de metacromasia. Esto sedebe a que las propiedades de absorción de la luz delcolorante cambian al unirse a componentes celulares.Por ejemplo, el azul de toluidina se vuelve púrpuracuando se une a ciertos gránulos de los mastocitos.Cuando el colorante unido al tejido tiene el mismocolor que en solución se denomina ortocromasia.

Tinción general. Una de las tinciones máscomúnmente usada en histoloǵıa es la hematoxilina-

eosina sobre cortes de parafina. Como vemos seusa un colorante básico (hematoxilina) y otro ácido(eosina) para teñir de diferente color a las estructurasácidas y básicas de la célula. Antes de proceder ala tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemosque llevar a cabo unos tratamientos previos sobre lassecciones como es el desaparafinado y la hidratación,puesto que estos colorantes son hidrosolubles. Si par-timos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.

Tinción de semifinos. Cuando se procesa materialpara microscoṕıa electrónica es necesario a veces hac-erse una idea de qué zona del tejido vamos a cor-tar. Téngase en cuenta que el área de una secciónpara observar con el microscopio electrónico es muypequeña. Además, el proceso de osmificación que hade llevarse a cabo previamente a la inclusión acar-rea el oscurecimiento del tejido, con lo que dificultaaún más la orientación de la muestra. Por ello es fre-cuente hacer secciones de 0,5 a 1 µ;m de grosor, de-nominadas secciones semifinas, con el ultramicrotomopara orientarnos en la muestra y seleccionar la zonaa partir de la cual haremos las secciones ultrafinas.Los semifinos suelen tener áreas más grandes que lasque posteriormente vamos a usar para la obtención delas secciones ultrafinas. El colorante usado para teñirsecciones semifinas es normalmente el azul de toluid-ina, el cual puede infiltrase en la resina calentada enuna plancha y llegar hasta el tejido.

Figura 3: Sección semifina de un glomérulo de un riñónobtenida a partir de una inclusión en resina y teñida conazul de toluidina.

Contraste de ultrafinos. Aunque las seccionespara microscoṕıa electrónica se pueden observar di-rectamente con el microscopio electrónico se suelen

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tratar previamente con metales pesados en un procesodenominado contraste, obteniendo aśı una imagenóptima de la ultraestructura celular. El contraste noes una tinción, puesto que no aporta color a la mues-tra, pero śı es un proceso habitual para poder observarlos componentes ultraestructurales de la célula. Porese motivo lo incluimos en este apartado. Téngase encuenta que en la microscoṕıa electrónica lo importanteno es añadir sustancias coloreadas sino moléculas quepuedan interferir con el camino de los electrones emi-

tidos por el microscopio y que chocan contra la mues-tra. Los metales pesados unidos al tejido impediránque pasen los electrones y por tanto se verá unazona negra en la pantalla fosforescente, mientras queen aquellas zonas de la célula donde no estén es-tos metales dejarán pasar los electrones y provocaránáreas luminosas en dicha pantalla. Por ello todas lasimágenes originales de microscoṕıa electrónica son enblanco y negro, aunque se puedan colorear posterior-mente con un ordenador.

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Figura 4: Pasos que se siguen durante una tinción general de hematoxilina-eosina. Los tiempos son aproximativos porquedependen del grosor de los cortes y de la concentración de los colorantes. El desparafinado elimina el medio de inclusión, laparafina. El paso por agua de grifo es t́ıpico de la hematoxilena y se denomina diferenciación. Las sales del agua permitenobtener una coloración más violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final es necesaria porque el medio de montajeno suele ser hidrosoluble. Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedadesópticas excelentes. Además, conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el montado y secado(evaporación del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio óptico.

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Figura 5: Proceso de tinción de una sección semifina. La porosidad de la resina, el calor y las propiedades del colorante(azul de tolouidina) hacen que se pueda teñir el tejido sin necesidad de eliminar previamente la resina.

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Figura 6: Proceso de contraste de secciones ultrafinas. Los tiempos de incubación en citrato de plomo y acetato de uraniloson aproximativos. Las lentejas de hidróxido sódico eliminan humedad del aire y dificultan la pricipitación del citratode plomo. Los lavados en agua se llevan a cabo sumergiendo repetidas veces (en inglés, ”deeping”) la rejilla en el aguadurante un tiempo de aproximadamente 30 segundos en cada pocillo con agua destilada.

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5 Histoqúımica

Incluiremos dentro de las técnicas histoqúımicas aaquellas que supongan una reacción qúımica en laque intervienen moléculas pertenecientes al propiotejido (trataremos la detección de glúcidos medi-ante lectinas y la inmunohistoqúımica en aparta-dos diferentes a éste, aunque algunos autores lasincluyen como técnicas histoqúımicas). El obje-tivo de la histoqúımica es poner de manifiesto unamolécula o familia de moléculas presentes en unasección histológica y estudiar su distribución tisu-lar ”in situ”. Estas moléculas son dif́ıcilmente dis-cernibles con técnicas generales y por tanto es nece-sario realizar pasos previos para poner de manifiestola molécula que queremos detectar. Vamos a dividirlas técnicas histoqúımicas en dos grupos: reaccionesqúımicas e histoqúımica enzimática.

Las reacciones qúımicas consisten en la modifi-cación qúımica de moléculas del tejido para poste-riormente poder colorearlas. Existen técnicas his-toqúımicas para detectar glúcidos, protéınas y nu-cleótidos. La técnica histoqúımica más empleada esla reacción de PAS (Periodic Acid Schiff). Se utilizapara la detección de hidratos de carbono, libres o con-jugados, cuando están en cantidades relativamente

grandes en los tejidos. La modificación qúımicadel tejido consiste en la oxidación mediante el ácidoperiódico de los enlaces entre los carbonos próximosque contienen grupos hidroxilos. Esto provoca la for-mación de grupos aldeh́ıdos que serán reconocidos porel reactivo de Schiff, el cual se combinará con ellospara dar un color rojizo brillante. Entre los compo-nentes del reactivo de Schiff está la pararosanilina (uncomponente de la fucsina básica) tratada con ácidosulfúrico. Una gran ventaja de la tinción histoqúımicaPAS es su capacidad de discriminación de tipos deglúcidos con pequeñas modificaciones de la técnica.

Figura 7: Tinción con hematoxilina-eosina (imagen de laizquierda) y PAS-hematoxilina (imagen de la derecha) delas vellosidades del intestino de humano cortadas transver-salmente. Se puede apreciar a las células caliciformesteñidas de rosado con la técnica de PAS por su alto con-tenido en mucopolisacáridos, mientras que en una tincióngeneral aparecen transparentes, sin teñir.

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Figura 8: Pasos de la tinción histoqúımica PAS-Hematoxilina sobre cortes de parafina. Los pasos con letras en color verdeson los espećıficos para esta tinción.

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La histoqúımica enzimática o histoenzimoloǵıa sebasa en la capacidad que tienen algunos enzimas deltejido de mantener funcional su centro activo tras elproceso de fijación. Estos enzimas y las células que losposeen se ponen de manifiesto mediante una reacciónenzimática que convierte a unos sustratos solubles eincoloros en productos insolubles y coloreados. Lossustratos son espećıficos para el enzima y los pro-ductos se depositan en el lugar preciso donde se pro-dujo la reacción, es decir, donde se localiza el enz-ima. Las enzimas que se pueden detectar son variadascomo las peroxidasas, fosfatasas, deshidrogenasas, di-aforasas, acetilcolinesterasa, etcétera. Hay que teneren cuenta que cuando queremos detectar una activi-dad enzimática es recomendable no incluir el materialen medios como la parafina puesto que la deshidrat-ación y la temperatura elevada pueden dañar la con-formación de la enzima y por tanto la actividad desu centro activo. Por ello estas técnicas se realizannormalmente en secciones obtenidas por congelacióno con el vibratomo.

La actividad NADPH diaforasa se asocia a las en-zimas sintasas del óxido ńıtrico en sistema nervioso yvascular. A estos enzimas se les ha relacionado con

el control del flujo sangúıneo y con ciertos aspectosde la fisioloǵıa del sistema nervioso. Esta técnica per-mite detectar neuronas que expresan la enzima sintasadel óxido ńıtrico de una forma sencilla y rápida. Lareacción es NADPH + tetrazolio = NADP+ + for-mazán. Es el formazán el producto coloreado e insol-uble que se puede observar con el microscopio óptico,incluso con el microscop̀ıo electrónico de transmisión.

Figura 9: Imagen de un corte de 60 µ;m de grosor decerebro obtenida con un criostato y procesada para his-toqúımica enzimática que pone de manifiesto una actividaddiaforasa perteneciente a la enzima óxido ńıtrico sintasaneuronal que aparece en algunas neuronas (células con uncolor azul intenso)

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Figura 10: Los pasos para la detección histoqúımica de la actividad diaforasa es muy sencilla. Tras una fijación, prefer-entemente por perfusión, hay que permeabilizar el tejido con un disolvente de ĺıpidos como el Triton-X100. El revelado seproduce a 37 ◦C y el final de la reacción se controla mediante observaciones periódicas. Las concentraciones del sustrato(NADPH) y del azul de tetrazolio vaŕıa según el tejido o el proceso de fijación.

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6 Lectinas

Aparte de las técnicas de tinción generales y las his-toqúımicas, no muy espećıficas, existen otras que seusan para detectar moléculas tisulares con una mayorespecificidad. Ello es posible gracias a la capacidadque tienen ciertas moléculas como las lectinas o lasinmunoglobulinas para reconocer y unirse sólo a untipo de molécula presente en el tejido. En esta páginavamos a tratar sobre el uso de las lectinas para ladetección en los tejidos de distintos tipos de glúcidosde manera espećıfica. En muchos textos la técnicade las lectinas se incluye dentro del apartado de lahistoqúımica.

Las lectinas son protéınas que tienen dominios o se-cuencias de aminoácidos que son capaces de recono-cer y unirse a glúcidos terminales que forman partede cadenas de oligosacáridos, bien libres o formandoparte de otras moléculas como las glicoprotéınas. Porello se dice que las lectinas reconocen glicoconjuga-dos. Las lectinas están ampliamente distribuidas enlos tejidos animales y vegetales y sus funciones sonmuy variadas. Por ejemplo, la salida de los linfocitosdesde el torrente sangúıneo hacia los tejidos dañadosse produce gracias a la acción de una familia de lecti-nas denominadas selectinas que expresan las célulasendoteliales próximas al lugar de la lesión. Es decir, ellinfocito puede salir por la pared endotelial gracias ala unión de las selectinas endoteliales a los glúcidos dela membrana del linfocito. En el laboratorio de his-toloǵıa las lectinas se usan, sin embargo, para estudiarla distribución tisular de distintos tipos de azúcares demanera espećıfica. Se pueden usar diferentes tipos delectinas en base a su especificidad de reconocimientode azúcares determinados. Hay al menos cinco gru-pos de lectinas según se unan a manosa (Man), agalactosa/n-acetilgalactosamina (Gal/GalNAc), a N-acetilglucosamina (GllNAc), a fucosa (Fuc) o a ácidosiálico (Neu5Ac), respectivamente.

Para poder observar el lugar de unión espećıfica en-tre la lectina y su glúcido tenemos que unir a la lectinaun marcador que nos produzca una señal visible con elmicroscopio óptico o electrónico de transmisión. Nor-malmente el marcaje consiste en la unión de una en-zima como la peroxidasa de rábano o la fosfatasa al-

-calina. Es el resultado de la reacción enzimática loque se puede observar. También se usa como mar-cador una molécula fluorescente que se puede obser-var directamente en el tejido con un microscopio defluorescencia. Cuando la enzima o la molécula flu-orescente están directamente unidas a la lectina sedenomina método de detección directa y cuando seunen a la lectina mediante una molécula interpuestase denomina detección indirecta. Las moléculas in-terpuestas más comunes son la biotina o anticuerposespećıficos (inmunoglobulinas tipo G) obtenidos con-tra la lectina.

La técnica con lectinas se suele complementar conuna serie de tratamientos que sirven para obtener másinformación acerca de la composición sacaŕıdica delos glicoconjugados. Por ejemplo, la desulfataciónse usa para demostrar las uniones tipo ésteres desulfato de las cadenas terminales y la eliminación tipobeta permite conocer si las cadenas de glúcidos sonuniones con enlaces tipo O (uniones covalentes a gru-pos hidroxilo) o tipo N (enlaces covalentes a gruposamino). En este último caso la alcalinización de loscortes elimina las uniones tipo O.

Figura 11: Detección de lectinas mediante métodos indirec-tos en cortes adyacentes de epitelio del pie de Haliotis tu-berculata (oreja de mar, invertebrado prosobranquio). Laimagen de la izquierda muestra la detección de glucosaminamediante la lectina WGA biotinilada y su posterior reve-lado de la peroxidasa unida a avidina (color marrón). Enla imagen de la derecha se muestra la detección de fucosamediante la lectina AAA unida a digoxigenina. Medianteun anticuerpo contra la digoxigenina unido a fosfatasa al-calina se pone de manifiesto la localización de la fucosa(color azul).

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Figura 12: Tabla con las lectinas más usadas en la que se muestra el carbohidrato o carbohidratos que se detectan, lasespecies de donde se obtienen las lectinas que reconocen a dichos carbohidratos, los acrónimos de las lectinas y los tipos deenlaces que se reconocen espećıficamente por cada lectina. El śımbolo ¿ significa afinidad creciente hacia su izquierda, loque indica que una lectina puede reconocer a un carbohidrato espećıfico enlazado de diferentes formas con otras moléculas,pero con diferente afinidad.

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Figura 13: Pasos para la detección de glúcidos con lectinas. Los tiempos pueden variar según el material o la lectina usada.En este ejemplo se usa un método de detección indirecta puesto que la lectina lleva unida una protéına intermediaria quees la biotina, la cual será reconocida por la avidina del complejo ABC (”avidin-biotin-complex”) que contiene la enzimaperoxidasa. Es el resultado de la reacción de este enzima tras añadir el substrato peróxido de hidrógeno y la moléculadiaminobencidina, lo que produce un precipitado insoluble y visible con el microscopio óptico. El paso de BSA (albúminade suero bovino) sirve para saturar posibles sitios de unión inespećıficos de la lectina. Si en vez de cortes en parafinahubiésemos usado cortes de vibratomo podŕıamos procesar, tras la reacción de la peroxidasa, dichos cortes para observarel producto de reacción con el microscopio óptico y también con el electrónico de transmisión.

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7 Inmunocitoqúımica

La inmunocitoqúımica es una técnica para la local-ización de moléculas en los tejidos mediante el empleode anticuerpos. Es una técnica que gracias a la ofertacomercial de anticuerpos y a la estandarización desu protocolo se ha convertido en un método sencillo,rápido y muy potente. Se basa en la gran especifi-cidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos parareconocer a moléculas y unirse a ellas. Además, laconjugación o combinación de los anticuerpos con en-zimas o con sustancias fluorescentes permite detectarcantidades ı́nfimas de moléculas presentes en el tejido.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan enlas técnicas inmunocitoqúımicas son del tipo G, pro-ducidas por unas células del sistema inmunitario de-nominados linfocitos B durante la respuesta inmune.La producción masiva de anticuerpos se produce enun animal cuando le inyectamos una molécula quereconoce como extraña. Estos anticuerpos pasan alsuero sangúıneo, el cual se extrae del animal inmu-nizado, y del que posteriormente se purifican. Dichosanticuerpos purificados se usarán posteriormente enla técnica inmunocitoqúımica.

Las moléculas complejas como las protéınaspueden tener en su estructura varios determinantesantigénicos, es decir, lugares que son capaces de des-encadenar una respuesta inmune. Ello supone quecada determinante antigénico es capaz de activar unclon de linfocitos B, es decir, un linaje de linfoci-tos B que producirá un mismo tipo de inmunoglob-ulina G contra dicho determinante antigénico. Losanticuerpos de todos los clones de linfocitos B acti-vados por la molécula inyectada irán a parar al suerosangúıneo. Cuando se emplean sueros purificados deeste tipo en inmunocitoqúımica se dice que se estánempleando anticuerpos policlonales. Por otra parte,existe una técnica que permite aislar y cultivar en ellaboratorio (in vitro) de forma invidualizada a cadauno de los clones de linfocitos B activados durantela respuesta inmune. Cada uno de esos cultivos pro-ducirá un solo tipo de inmunoglobulina G que recono-cerá sólo a uno de los determinantes antigénicos dela molécula inyectada. A los anticuerpos obtenidosde cada uno de esos cultivos se les denomina mono-

clonales ya que proceden de linfocitos que produceninmunoglobulinas idénticas. Las moléculas de in-munoglobulinas tipo G pueden dividirse en dos domi-nos: la fracción cristalizable y la variable. El do-minio variable es el que se encarga de reconocer aldeterminante antigénico de nuestra molécula. Haydos sitios de unión en cada molécula, por lo que cadainmunoglubulina podŕıa reconocer y unir a dos de-terminantes antigénicos a la vez (estos determinanteshan de ser idénticos). La fracción cristalizable tieneuna estructura similar para todas las inmunoglubu-linas G producidas por los individuos de una mismaespecie.

Para que un anticuerpo se una a su determi-nante antigénico localizado en una molécula del tejidoprocesado, ésta no debe alterarse. De otro modo esedeterminante antigénico no será reconocido por el an-ticuerpo. Por ello el proceso de fijación del tejido debeelegirse para preservar al máximo a la molécula quequeremos detectar. Aśı, se usan diferentes fijadoressegún el tipo de molécula en la que estemos interesa-dos. También es necesario considerar el método de ob-tención de los cortes. Inclusiones en parafina puedendañar las moléculas, por lo que en la mayoŕıa de loscasos se suele trabajar con cortes de vibratomo o consecciones obtenidas por congelación.

Las inmunoglobulinas, aunque se unan a lamolécula que queramos detectar, no son visibles conel microscopio por lo que las tendremos que conju-gar (unirlas) a otras moléculas que nos den una señalvisible. Estas moléculas que aportan visibilidad a losanticuerpos suelen ser de dos tipos: moléculas fluo-rescentes y enzimas. Las primeras se pueden observarcon el microscopio de fluorescencia mientras que lassegundas pueden convertir determinadas moléculassolubles e incoloras en productos insolubles y colore-ados. La señal aparece alĺı donde está la sustanciafluorescente o el enzima, que es donde se ha unido lainmunoglubulina.

El método del marcado con sustancias fluorescentestiene una serie de ventajas que veremos más adelante,pero tiene la desventaja de que no son marcajes per-manentes puesto que la luz emitida por la moléculafluorescente se desvanece con el tiempo. Sin embargo,las secciones procesadas con anticuerpos unidos a en-

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zimas pueden deshidratarse, montarse y mantenersepermanentemente para su observación. Las enzimashabituales que se unen a las inmunoglobulinas son laperoxidasa y la fosfatasa alcalina.

La conjugación directa de un marcador (enzimao fluorescente) con la inmunoglobulina se denominamétodo de detección directa. Hoy en d́ıa se sueleemplear el método de detección indirecta, que con-siste en colocar una serie de intermediarios entre lainmunoglobulina y la molécula marcadora.

En la detección con enzimas, también llamadainmunocitoqúımica o inmunohistoqúımica , Inicial-mente se usó el método indirecto denominadoperoxidasa-antiperoxidasa (PAP; ver figura anterior),pero actualmente es más frecuente usar el método delcomplejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC; ver figuraanterior). El método indirecto permite una mayorversatilidad de la técnica y mayor intensidad de señalfrente a una misma cantidad de ant́ıgeno.

Figura 14: Detección de la molécula tirosina hidroxilasamediante inmunocitoqúımica usando un anticuerpo pri-mario sin marcar, un anticuerpo secundario conjugado conbiotina y el complejo avidia-biotina-peroxidasa.

La inmunofluorescencia se basa en las propiedadesde los fluorocromos. Son moléculas que emiten luzvisible cuando se les ilumina con una determinadalongitud de onda. Aunque la inmunofluorescencia sepuede usar para detectar a una sola molécula tisular,su verdadero potencial se muestra cuando necesita-mos una múltiple inmunodetección, es decir, dos omás moléculas presentes en una misma célula o ma-triz extracelular de forma simultánea. Esto es posibleporque existe una gran variedad de fluorocromos queson capaces de emitir luz visible tras ser excitados condiferentes longitudes de onda, luego seleccionando elintervalo de longitudes onda con el que iluminamos untejido podemos excitar de modo individual, y secuen-cial, varios fluorocromos que hayamos usado, unidos ainmunoglubulinas diferentes, para detectar moléculasdiferentes. Tomando fotograf́ıas tras cada excitacióny superponiendo dichas imágenes podemos averiguarsi las moléculas se expresan, por ejemplo, en la mismacélula.

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Figura 15: Esquema resumido de las diferencias en la obtención de anticuerpos policlonales (izquierda) y monoclonales(centro y derecha).

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Figura 16: Métodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios unidos espećıficamente a una molécula del tejido.

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Figura 17: Inmunocitoqúımica con detección indirecta y enzimática. La sección se obtiene de tejido previamente fijado.Inmediatamente después se incuban en una solución de bloqueo que satura los posibles sitios de unión inespećıfica, graciasa una alta concentración de protéına como la albúmina de suero bovino. Tras cada paso de unión de anticuerpos o delcomplejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solución tamponada de fosfato (tampón fosfato),en la que también van disueltos los anticuerpos. La reacción de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidinay el peróxido de hidrógeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio óptico.

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Figura 18: Detección con inmunofluorescencia de dos ant́ıgenos en una sección de tejido nervioso: la molécula calbindina(a la izquierda) y parvoalbúmina (a la derecha), usando fluorescéına y Texas red como fluorocromos, respectivamente,mediante un método de marcaje indirecto. Se pueden observar cuerpos celulares y prolongaciones nerviosas. Las flechasblancas indican células que poseen ambas protéınas (calbindina y parvoalbúmina) mientras que la flechas azules indicancuerpos celulares que sólo expresan parvoalbúmina. Obsérvense las zonas oscuras, negativas, en la imagen de la izquierda.

Figura 19: Detección simultánea de dos moléculas situadas en una misma sección mediante inmunofluorescencia. La razónde que los dos anticuerpos primarios procedan de dos animales diferentes es que los anticuerpo secundarios, obtenidos deotro animal, normalmente cabra u oveja, inmunizados con las inmunoglobulinas de ratón y conejo, respectivamente, es loque permite a cada anticuerpo secundario reconocer y unirse a un anticuerpo primario determinado y no al otro.

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8 Hibridación in situ

No se puede considerar a la hibridación in situ comouna técnica de uso general. Sin embargo, aportauna información sobre la fisioloǵıa de las células y lostejidos que no es posible obtener con otras técnicas.La hibridación in situ se usa ampliamente en inves-tigación en desarrollo embrionario, diferenciación decélulas madre, manipulaciones genéticas o cambiosen la fisioloǵıa celular frente a señales externas, en-tre otras. Permite descubrir la expresión de un genmediante la detección de su transcrito procesado, elARN mensajero. Podemos descubrir qué células ex-presan un gen determinado y cuándo lo expresan. Laexpresión génica es un testimonio directo de la fun-cionalidad celular. Existe otra aplicación de la hibri-dación in situ y consiste en la localización f́ısica de ungen sobre un cromosoma.

La hibridación in situ se basa en la complemen-tariedad de bases nucleot́ıdicas (A-T o A-U y G-C).Del mismo modo que en la inmunocitoqúımica se usanlos anticuerpos, en la hibridación in situ se usa unasecuencia de nucleótidos, denominada sonda, que escomplementaria a la secuencia del ARN mensajeroque queremos detectar, y que está conjugada con unamolécula que luego pondremos de manifiesto y quenos sirve de marcador.

Quizá una de las razones por las que la hibridaciónin situ no es común todav́ıa en los laboratorios dehistoloǵıa es porque sintetizar una sonda es compli-cado y generalmente no se puede usar en una especieanimal o vegetal distinta a aquella para la que se haproducido dicha sonda. Ello es porque un mismo gen(y su ARN mensajero) en dos especies distintas tienensecuencias que no son idénticas y por tanto hay quefabricar una sonda para cada especie. Sin embargo,una vez obtenida la sonda el proceso de hibridaciónes sencillo.

Para obtener una sonda lo primero que tenemosque hacer es conocer la secuencia de bases del ARNmcon el que queremos hibridarla. Si esa secuencia estápublicada en las bases de datos en Internet todo elproceso se simplifica enormemente puesto que hoy end́ıa se puede solicitar la śıntesis de forma qúımica desecuencias largas de ADN (hasta 1000 nucleótidos es

común) a empresas especializadas. A partir de eseADN podemos obtener nuestras sondas en el laborato-rio (ver más abajo). Pero incluso, se pueden comprarlas sondas ya marcadas, con lo que nos ahorramos unagran cantidad de tiempo en el laboratorio.

Sin embargo, en muchos casos no conocemos lasecuencia de bases del gen deseado por lo que hayque averiguarlo primero para obtener posteriormentela sonda. Para obtener una sonda hay primero queclonar la secuencia de bases del gen (ARN men-sajero) que queremos detectar. Clonar implica re-alizar una serie de pasos. 1) Una vez purificado elARN de nuestro tejido, los ARN mensajeros se retro-transcriben (transcripción inversa), es decir, se hacencopias complementarias de ADN de todos los frag-mentos de ARN mensajero. Se obtienen hebras deADN denominadas cDNA (ADN clonado). 2) Me-diante la técnica de PCR (”polymerase chain reac-tion”) se consiguen multitud de copias de manera es-pećıfica de la secuencia que queremos estudiar. 3)Dichas copias se integran en un plásmido y posteri-ormente se introduce en bacterias. 4) Se cultivan lasbacterias para que proliferen y aśı también conseguirgran número de copias de los plásmidos, que se du-plican en cada división bacteriana. 5) Los plásmidosse extraen y purifican. 6) Mediante un proceso detranscripción similar al que ocurre en el núcleo de lascélulas, a partir de estos plásmidos se consiguen nu-merosas réplicas de ARN complementarias a nuestrasecuencia inserta, que será también complementaria ala secuencia del ARN mensajero que queremos detec-tar. El resultado de la transcripción realizada repeti-das veces es un gran número de cadenas de ARN de-nominadas sondas. Durante su śıntesis es cuando seañaden los nucleótidos conjugados con las moléculasmarcadoras que nos servirán para detectarla una vezla hibridación se haya producido. Normalmente sonmoléculas pequeñas como la digoxigenina y la biotina,aunque también se pueden utilizar moléculas fluores-centes, que se unen a los nucleótidos que formaránparte de la sonda.

La hibridación in situ se puede combinar con otrastécnicas como la inmunocitoqúımica o tinciones gen-erales.

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Figura 20: Esquema resumido del proceso de hibridación in situ. NBT (nitro blue tetrazolium) y el BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl fosfato, sal de toluidina) son los sustratos de la fosfatasa alcalina.

Figura 21: Imagen que muestra neuronas (de color azul) que expresan el receptor D1 para la dopamina en el cerebroventral de una lamprea.

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Figura 22: Esquema del proceso de hibridación in situ sobre secciones de criostato.

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