Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 1 MICROSCOPIO ELECTRNICO, PRINCIPIO FSICO DE FUNCIONAMIENTO COMPARACIONDELMICROSCOPIOPTICOCONELMICROSCOPIO ELECTRNICODETRANSMISIN,DESCRIPCINYANALOGADESUS COMPONENTES Elmicroscopioelectrnico(ME)utilizaunflujodeelectrones(Candeelectrones) propagadosenelvacoqueconcentradosyrefractadosporcamposmagnticosse proyectan sobre la preparacin y se proyectan en un foco donde proyectan una imagen novisible,peroquepuedefotografiarseorevelarseenunapantalla.Selogran aumentosde30.000a100.000dimetros.Puederesolverpartculasa0.001m, ultrapequequeosde1y2,alcanzanstacapacidaddeaumentodebidoaquela longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles. On line, http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_electrnico, 12 abril 2009Elprincipiosfsicodefuncionamientodeunmicroscopioelectrnico,sebasaenla accindeunhazdeelectronesincidentequeesgeneradosporuncanelectrnico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnticas (todo ello al altovacoyaqueloselectronessonabsorbidosporelaire).Online, http://www.enciclonet.com/documento/microscopio/, 12 abril 2009 ElMEemiteunhazdeelectronesquechocanoatraviesanlamuestraquesedesea aumentar,estoselectronesseproducengeneralmenteenunfilamento,porlogeneral detungsteno,parecidoaldeunabombilla,medianteunprocesoconocidocomo emisintermoinicaobienmedianteemisindecampo,dondeunapartedelos electrones rebotan o son absorbidos por la muestra y otros lo atraviesan formando una imagenaumentada.ElMEposeeunapotenciaamplificadoramayorqueladeun microscopio ptico, ya que la de ste ltimo es limitada por la longitud de onda de la luz visible. TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRNICOS Elmicroscopioelectrnicodetransmisin(MET).Utilizaunhazdeelectrones acelerados por un alto voltaje (cien mil voltios). Este haz ilumina una seccin muy fina de la muestra, sean tejidos, clulas u otro material. Elmicroscopioelectrnicodebarrido(MEB)seutilizaparaelestudiodela morfologaylatopografadeloselementos.Estosinstrumentosutilizanvoltajes cercanosalos20.000voltios.Laslentesmagnticasutilizanunhazmuyfinode electrones para penetrar repetidamente la muestra, y se produce una imagen ampliada de la superficie observada en la pantalla de un monitor. Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 2 El microscopio electrnico mixto tiene propiedades comunes con el de transmisin y con el de barrido y resulta muy til para ciertas investigaciones. Hay otros microscopios analticosquedetectansealescaractersticasdeloselementosqueconstituyenla muestra. COMPARACION ENTRE MICROSCOPIO OPTICO Y MICROSCOPIO ELECTRONICOUnmicroscopiopticoesunmicroscopiobasadoenlentespticas.Tambinsele conocecomomicroscopiodeluz,fotnico(queutilizaluz,o"fotones",odecampo claro),utilizaunhazdeluzenelrangodelaslongitudesdeondadelvisible,Tanto microscopiodeLuz,comoelelectrniconospermitenamplificaraquellosobjetosque son indistinguibles al ojo humano(Puedediscriminardosobjetossiestnsituadosnomscercade0,lmm.,mirandodesdeunadistancianormalde25cm).La diferenciafundamentalentrelosdoseslafuentedeiluminacin. (ArenasJ,2005) Vase tabla 1. Figura 1. Fuente: Tcnicas de Microscopia. CIP, Training manual. Figura1.EsquemadesemejanzasentreMicroscopiodeluzyMicroscopioElectrnico (SEM Y TEM) Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 3 Tabla1.ComparacindelMicroscopiopticoconelmicroscopioelectrnicode transmisin MICROSCOPIO DE LUZMICROSCOPIO ELECTRONICO IluminacinHaz de luzHaz de electrones Longitud de Onda2000 - 7500 0.037 - 0.086 LentesVidrioElectromagnticas MedioAtmsferaVaco Resolucin2000 3 Magnificacin10 x-2000 x100 x-450000 x FocalizacinMecnicaElctrica ContrasteAbsorcin - ReflexinScattering Fuente:http://www.criba.edu.ar/cribabb/servicios/secegrin/microscopia/apunte_col.htm, 2009 Las diferencias entre microscopio de luz y el microscopio electrnico se basan en: Las lentes magnticas no tienen distancias focales fijas como las lentes pticas. La distanciafocalesdependientedelaintensidaddecampo,cambiandolacorriente que pasa a travs de la bobina. Enelmicroscopioelectrnico,noesnecesariocambiarlalentedeObjetivoolas proyectorascuandosedeseandistintasmagnificaciones.Estoselogravariandola distanciafocaldelaproyectora,entantoquelamagnificacindelobjetivoes siempre fija. El modo de formar la imagen es diferente en los 2 microscopios. En el Microscopio pticoseformaporabsorcindiferentedelaluz,entantoqueenelMicroscopio Electrnicolaprdidadeelectronespordispersinenpuntosindividualesdel espcimen resulta en variaciones de la intensidad de la imagen (contraste). On line,http://www.mdp.edu.ar/exactas/biologia/grupos/ersion%2011/Practicos/archivos/056073_TP_Microscopia.pdf,14abril 2009. Referencias. ArenasJ,2005.Contribucionesdelafsicaenlahistoriadelamicroscopa.Revista Digital Universitaria UNAM Mxico. Vol. 6 (7) 10 pginas. GranadaM.YHoracioTroiani.2007.Paracaptarelmundomuypequeo:Los microscopios electrnicos. Desde la Patagonia difundiendo saberes Vol. 6 (5) 5pginas. Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 4 FORMACION DE LA IMAGEN EN UN MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO Y TIPO DE IMGENES QUE SE OBSERVA

ElprincipiodelsistemaSEMconsisteenhacerincidirsobre la muestra unhaz deelectronesfinamenteenfocado,laenergaquepierdenloselectronesalcolisionar contralamuestrapuedehacerqueotroselectronessalgandespedidos,losqueson llamadoselectronessecundarios,yproducirrayosX,electronesAuger,etc.Los electronessecundarios(debajaenerga)serecogensobreunaplacacargada positivamentequeproduceunasealelctricaproporcionalalnmerodeelectrones. Estasintensidadeselctricasdependendelaformaycomposicinqumicadelobjeto irradiado;lassealesseregistranenunmonitor.Enunospuntoselhazdeelectrones esdesviado 1, 2, 3, nvecesporloscampos magnticos controladosporelgeneradordebarrido.Comoconsecuenciaelhazesmovidosobrelasuperficie de la muestraylaseal es detectada porel colectordeelectrones(W, C. Nixon1969).Sepuedeajustarelcolectorparadetectarcualquieremisincomorayos X,luzinfrarroja, ultravioleta.El barrido del haz est sincronizado con el barrido del tubo de rayos catdicos (CRT) y produceunarelacinunoaunoentrepuntosdelamuestraypuntosenelCRT.Elsistemade amplificacinrecogelasseales yprocesala informacinprocedente delamuestra,almismotiempoqueelhazdeelectronesbarrelamuestra,el generador de barrido est conectado CRT para que elhaz de electrones en este tuboseabarridoenlamismaformaqueelhazprincipal.Sinembargo,lapotenciadela corrientesuministradaalacolumnaprincipalparaelbarridopuedeseratenuada mientrasqueeltubodelapantallaesbarridosobreunreaconstante.Como consecuencia de ello, cualquier reduccin en el rea de la muestra barrida da lugar a un aumento de la imagen. Este aumento viene determinadoporlarelacindelreadelapantalladeltubo(constante)respecto al rea dela muestra barrida (variable). Elpoderderesolucinenelmicroscopioelectrnicodebarrido(SEM)dependede variosfactores,talescomoladimensindelhazdeelectrones,ladifusindel mismoenlamuestraantesdelamisindeloselectronessecundarios,yla corrienteestabilizadadelalente.Loselectronesnosetransmitendesdeabajocomo en el TEM, si no que inciden desde arriba sobre la muestra, por lo que no hay limitacin en el grosor de esta. (A, Naik) ElSEM,permiteobservarycaracterizarlasuperficiedematerialesinorgnicosy orgnicos,proporcionandoinformacinmorfolgica,presentandoimgenes tridimensionalesdelassuperficiesdelosobjetosobservados,elobjetoesrecubierto inicialmenteconunadelgadapelculadeunmetalpesadoyacontinuacines explorado por el haz de electrones, los electrones dispersados por el metal pesado son reunidos y enfocados para formar la imagen final. Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 5 Referencias A.Naik.Fundamentosdelmicroscopioelectrnicoysuaplicacinenlainvestigacin textil W.C.Nixon1969.IntroductiontoScanningElectronMicroscopy,Proceedingsofand AnnualScanningElectronMicroscopySymposium,PatrocinadoporIITResearch Institute. FORMACION DE LA IMAGEN EN UN MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN Y TIPO DE IMGENES QUE SE OBSERVA Elmicroscopioelectrnico mssencilloes muysimilar al microscopio ptico, ambostienenlentesycondensadoresparaconcentrarlailuminacinsobrela muestra.El modo de operar de este tipo de microscopio es similar al del microscopio ptico, ya que estbasadoenelhechodequelamaneradeactuardeuncampoelectromagntico sobre un haz de electrones es anloga a la accin de la lente de cristal sobre el haz de fotones. La imagen, sin embargo, se forma sobre una pantalla fluorescente. EnelMET,elhazdeelectronespasaatravsdelamuestraestudiaday posteriormente, a travs de unas lentes electromagnticas que dan lugar a una imagen amplificada. Esta imagen pasa a su vez por una lente proyectora hasta una pantalla de materialfluorescente,quebrillaalrecibirelimpactodeloselectrones.Debajodela pantallase sita la cmara para fotografiar la imagen. Noobstante,aligualqueenelmicroscopioptico,elmicroscopioelectrnicode transmisintienelalimitacindesertilsloparaungrosordeterminadodelobjeto. Laspelculasdemuestra,ademsdeserdelgadas,nodebenposeermaterialesque puedandispersaroabsorberelectrones,debenserlosuficientementefuertescomo para poderlas manipular, y lo bastante estables, como para no volatilizarse, a causa del bombardeoenelvaco.Elinteriordelmicroscopiodebehallarseenvaco,yaqueel aireimpidelamovilidaddeloselectrones.Estoseefectamediantelasbombasde vaco.Estascondicionesimposibilitanlaobservacindemicroorganismosvivos,yde susprocesosfisiolgicos.Lastcnicasquemsseutilizanparaestetipode microscopio electrnico son: tincin negativa, microtoma y congelacin. Losrayosdeiluminacinatraviesanlamuestraysonenfocadasporlaslentesdel objetivoydeproyeccinparaformaunaimagenaumentadasobreunapantalla fluorescente.Sinembargoelmicroscopioelectrnicoesmuchomscomplejo.Paraqueloselectronespuedanseraceleradoshastalavelocidadprefijada,debe trabajarseencondicionesdealtovaco (10-4 10-6 torr, torr = 1mmde mercurioa0C).Elsistemacentraldelmicroscopioelectrnicoincluyendolapantallafluorescenteyelequipofotogrfico,loconstituyeuntubohueco.Elequipo elctricoquesuministralacorrientenecesariasehallageneralmentesituadoauna cierta distancia para evitas la interferencia de los campos magnticos dispersados.La Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 6 mayoradelos microscopiosestnequipadoscon dispositivos deseguridadquenopermitenconectarelfilamentodealtovoltajehastaquenoseha conseguido dvacoapropiado (9). Las lentes magnticas del microscopio electrnico estn formadas por imanes en forma de herradura.El imn puedeser permanente odetipo dectromagn6tico Variandola potenciadelacorrientealalenteseconsigueelefectode variarla distanciafoca1delalentecontinuamente,locualesmuysimilaralsistemade "zoom".Sin embargo, normalmente se preselecciona la corriente deseada.Se puedenajustarlosvoltajesdeaceleracinenunagamaqueincluye40,60,80 y100 Kv,etc. AjustandoKvaunnivelinferior,seconsigueaumentarelcontraste. Estasseccionesultradelgadasdelmaterialbiolgicosonnecesarias,debidoala limitadapenetracindelhazdeelectronesa75-100kV.Paraunaadecuada penetracinyresolucinelespcimennodeberasermsgruesode100nm, preferiblemente ms delgado (70-90 nm). Slo unas pocas muestras, tales como virus y organelossub-celularessonsuficientementedelgadoscomoparaobservarlos directamente,ysinembargo,requierendetcnicasdeprocesamientoadecuadasy diferentes. El TEM puede analizar la seal de los electrones incidentes, los electrones dispersados yloselectronesdifractadospermitiendotrabajarendiversastcnicasyobtener informacin en imagen. Mtodos de preparacin de muestras tanto para microscopia de barrido como de transmisin (para plantas)? La metodologa escogida para preparar las muestras, va a depender del tipo de material y del tipo de informacin que busquemos obtener, per las mas comunes en MET para el anlisis ultraestructural son: Tcnicas para MET 1.Tcnica de rutina Fijacin: Se realiza con paraformaldehdo, glutaraldehdo, tetrxido de osmio o Acido tnico.Inclusin: Resinas de distinta naturaleza (araldita, epon, LR White, Spurr)Secciones Ultrafinas: 40 70 nm.Contraste con sales metlicas pesadas: Acetato de uranilo, Citrato de plomo.Aplicacin: visualizacin de estructuras biolgicas subcelulares. 2.Tcnica de inmunomarcacin Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 7 Empleaanticuerposunidosapartculasdeorocoloidal(de2a150nm)como mtodo de localizacin al MET. Este procedimiento puede realizarse previo a la inclusindelmaterial enunaresina(generalmentehidroflicascomo elLRW), luegoderealizarlasseccionesultrafinas(post-inclusin),dependiendodel protocolo a seguir.Aplicacin: localizacin de molculas.

3.Tcnica de tincin negativa Esparcido de partculas (fijadas o no) sobre un film de soporte.Sombreado con sales metlicas pesadas: acetato de uranilo, citrato de plomo, cido fosfotngstico.Aplicacin:visualizacindemicroorganismos(bacteriasyvirus),de macromolculas,decomplejosmacromolecularesodenanopartculasde materiales inertes. 4.Tcnica de sombreado rotativo con metales Sembrado de micro partculas sobre un film de soporte. Sombreado con oro, oro-paladio y otras aleaciones evaporadas sobre la preparacin.Aplicacin:visualizacindemacromolculasaisladas(ADNoprotenas)y microorganismos. 5.Tcnica de criofractura Fijacin del material (en fro o no). Fractura de la muestra en un ambiente con alto vaco y en fro.Evaporacindeplatino-carbnotungsteno-tntaloparaconstruccindela rplica. Digestin de la muestra biolgica con cido (crmico o sulfrico).Aplicacin: visualizacin de rplicas de superficies de materiales biolgicos. 6.Tcnica de criograbado profundo Fijacin del material (en fro o no). Fractura de la muestra en un ambiente con alto vaco y en fro.Sublimacindelhielo.Evaporacindeplatino-carbnotungsteno-tntalo para construccin de la rplica.Digestin de la muestra biolgica con cido (crmico o sulfrico).Aplicacin: visualizacin de elementos intracelulares no solubles. Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 8 Tcnica de visualizacin con sem Fijacin:paraformaldehdo,glutaraldehdo,tetrxidodeosmio,cidotnico. DeshidratacinysecadodepuntocrticoconCO2.Evaporacindemetales sobre la superficie de la muestra (oro, oro-paladio, platino o tungsteno).Aplicacin:Anlisisdelasuperficiedemuestrasbiolgicascompletaso porcionesdelasmismas.Estetipodemicroscopiopermiteadems,la visualizacin de determinados materiales sin necesidad de procesamiento previo. MTODOS MORFOLGICOS EMPLEADOS EN EL ESTUDIO DE LAS CPSIDES VIRALES. Elconocimientodelaestructuradetalladadelaspartculasviralesesunprerrequisito esencial para conocer muchos aspectos de virologa El trmino cpside se utiliza para denominar a la cubierta cerrada o tubo de un virus y el trmino subunidades morfolgicas se refiere a los grupos de subunidades de protenas reveladosporelmicroscopioelectrnicoylacristalografaderayosX.LaMETesla msutilizadaparadeterminarmorfologadecapsidesviralesporsucapacidadde resolucin.Losvirussonclasificadossegnlamorfologadesucapsideen: isomtricos, con morfologa de varillas, con estructura binal y con aspecto pleomrfico. Paravisualizarultraestructurasmsfinasdentrodelacapsidesedebeusartcnicas ms finas como la Difraccin de Rayos X.

Lasprotenasqueformanlacpside,suelenserprotenassimples,fosfoprotenasy normalmentesueleestarconstituidaporunsolotipodeprotena,oenalgunoscasos por 2, 3 o hasta 9. Lacpsidesueleserregular,enformaytamaoenlosdistintosvirus,ysuelenestar constituidaspormonmerosproteicos,deigualnaturalezaodedistintotipo.Los monmeros proteicos, se les denomina Unidades estructurales de las Cpsides. Esta naturaleza permite predecir dos caractersticas: Si existen muchas subunidades proteicas, indican la formacin de muchos enlaces para formar la estructura, dicha estructura es fsicamente estable. Estables genticamente, mientras ms pequeas sean las protenas, ms pequeo el gen y por tanto menos probabilidad de mutaciones. Horneen1985descubrilaaplicabilidaddelmicroscopioelectrnico(ME)enel estudio de la estructura de los virus de plantas. Preparaciones de sombreado con metal. En estudios tempranos de partculas virales conME,elsombreadoconmetalespesadosfueusadopararealzarelcontraste., Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 9 estetipodesombreadooscurecilosdetallesdelasuperficie,dandoinformacin del tamao y forma de la partcula. Se obtuvo ms informacin cuando la era secado al fro y sombreado en alto vaco. Congeladoconvapordeagua.Estatcnicadainformacintilacercadela superficieyestructuradeviruslargos,particularmentelosdemembranas lipoprotenicas de doble capa. TincinNegativayPositiva.Elusodetincioneselectrn-densahaprovistode informacin mucho ms valiosa que el sombreado con metal para revelar detalles de lamorfologadelaspartculasvirales.Talestincionespuedenserpositivasy negativas.Latincinpositivareaccionaqumicamenteconelvirus(ej.Osmiode vario,plomoycompuestosuranilosycidosfosfotungstenicobajocondiciones apropiadas).Lacombinacinqumicapuedellevaralaalteracinodesintegracin delaestructuradelosvirus.Enlatincinnegativaelmaterialelectrn-densono reacciona con el virus pero penetra los espacios disponibles en la superficie o dentro de la partcula del virus. Esta es la tcnica preferida en la actualidad para examinar la estructura del virus por microscopa electrnica. La tincin negativa ms comn es la del fosfotungstato de potasio (KPT) a pH 7 y acetato de uranilo o formato usado cerca del pH 5. La estructura del virusLos detalles ms finos de la estructura del virus tienden a ser oscurecidos, primero, porruidodebidoalasirregularidadesmenoresenlaestructuraactualdelvirusy otros factores tales como irregularidades en la tincin, segundo, por el hecho de que elcontrastedebidoalatincinesamenudodesarrolladoenambosladosdela partcula a grados variables. Parasuperaresasdificultadesyextraermayorinformacinpuntualydetalladade lasimgenesdelaspartculasviralesindividualesteidasnegativamente,sehan desarrolladovariosmtodoscomo:superposicinfotogrfica,sombreadoy transformacin ptica. Algunosaspectosdelaestructuradelaenvolturadelosvirus,particularmentelas membranasdedoblecapa,puedenserestudiadasusandoseccionesdelgadasde clulas infectadas a de pellets que contienen el virus. Microscopa de Crio-electrn. Jeng y col (1989) usaron una prueba con el TMV para desarrollarunprocedimientobasadomicroscopadeCrio-electrn,quenoesms que el congelamiento extremadamente rpido en un medio acuoso, para determinar los detalles estructurales en el objeto con simetra helical. Ellos obtuvieron datos del TMVcondiferenciade10AdelaimagendelelectrndelTMVhidratadoy congeladoenhielovtreo.Butlerycol(1990)usaronesteprocedimientopara demostrar la presencia de doble disco de TMV bajo condiciones de ensamblaje. Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 10 EMPLEO DE LA CRIOMICROSCOPIA COMBINADA CON LA RECONSTRUCCIN 3D (TRIDIMENSIONAL) PARA EL ESTUDIO DE CAPSIDES VIRALES. Elmtododereconstruccindeimagenicosadricoproduceunaestructura3D, interpretando imgenes separadas de diferente vistas de la misma partcula Unavezobtenidaslasimgenes,ladeterminacindelaestructuraserealizaentres pasos:Determinandolaorientacinycentro delapartcula,refinarlosparmetrospor comparacindelosdatoscomunesentrelasdiferentesvistasycombinacindelos datos en un diagrama esquemtico y la construccin de una imagen 3d. EldesarrollodelaCrio-ME,comomtodoalternoalprocesamientoqumicodelas muestrasbiolgicas,introdujolaposibilidaddelestudioestructuraldelaspartculas viralesenestadohidratado-vitrificado(Adrianycol,1984),sinlautilizacinde fijacionesqumicasyencondicionesquepreservaransusimetra,latcnicaconsiste en un congelamiento extremadamente rpido en un medio acuoso, para determinar los detalles estructurales en objetos con simetra helical. El conocimiento de la arquitectura delosvirushaincrementadoenormementeenlosltimosaos,debidoaquehay mayorcantidaddeinformacinqumicaymorfolgicadetallada.Lacombinacindela Crio-MEconlatcnica3Dpermitilareconstruccintridimensionaldeestructurasde variosvirusicosaedricosamayorresolucin,incluyendoalgunosviruscondoble envoltura:SemilikiForestvirus(SFV)(Vogelycol.,1986)ysindbis(Fuller,1987);no envueltos SV40 (Baker y col, 1988), Rotavirus(Prasad y col., 1988), las nucleocapsides delherpessimple(Schragycol.,1989),Adenovirus(Stewartycol.,1991),las subunidadesproteicasdeRotavirus(Yeagerycol.,1994),yelvirushelicoidalTMV (Jengycol.,1989).Lareconstruccintridimensionaldeimgenes,abrilaposibilidad para la observacin de las partculas virales, a una resolucin de 10-20 sin el empleo de soluciones contratantes ni sombreado metlico (Sanchez y col., 2000). PROTOCOLOS A SEGUIR SEGNMUESTRA DE INTERS MaterialVegetalaestudiar:Tallosyhojasdearrozde60a70das,inoculadoscon Rhizoctoniasolani,endosmateriales,unosusceptible(FONAIAP1)yotrotolerante (LEMON). El material vegetal se sembr en el invernadero del INIA Maracay, al cual despus de 60dasseinoculancontroladamenteconelhongopatognico,transcurridoundiase tomaran muestras de tejidos, cada 12 horas. Elprotocolosegnelintersylanecesidaddeestablecerlainteraccinplanta patgenoesunprocedimientoparamicroscopioelectrnicodebarrido,segnel siguiente esquema.Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 11 MECANISMO DE TINCIN NEGATIVA Y MUESTRAS A LAS QUE SE LES APLICA. Latincinnegativaesunmtodosimpleyrpido,paraestudiarlamorfologay estructuradeespecmenestalescomovirus,componentescelulares(ribosomas, Mitocondrias,etc.),fragmentoscelulares(membranas)ymacromolculasaisladas (Protenas),estatincinpreservalaestructuramacromolecular.Elmecanismode tincinnegativaincrementaelcontraste,comounresultadodelapenetracinde tomos de metalespesados en las regiones hidrfilas de las muestras, producindose diferentes interacciones entre el tinte y la muestra, resultando en imgenes oscuras las zonasdecubrimientodelatincin.Latincinformadepsitosespesosenregiones hidroflicas,remplazandoelaguaysecandorpidamente,formndoseunacubierta alrededordeestasregiones,incluyendoregioneslipdicas.Elporcentajedetincinen las cavidades de una protena se debe bsicamente a las cargas inicas y al tamao de losreactivosusadosparatincin,comolosionesdeUranilacetatoyPTA(Acido fosfotungstnico),loscualestienenundimetrode0.4a0.5nmy0.8-1.5nm Tallos de Arroz Prefijado Glutaraldehido al 4% en BufferdefosfatoapH de 6.5, por 2 horas Lavados Fijado Lavados Deshidratacion Secador Punto Crtico 2 lavados de 10 minutos cadauno,conBufferde fosfato0.1MapHde 6.5. ConOsO4,al1%,en buffer, durante 24 horas2 lavados de 10 minutos cadauno,conBufferde fosfato0.1MapHde 6.5. 3vecesconEtanol,al50, 75y100%,encada concentracindejar10min sumergido el material Cubrimiento con Oro SEM Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa Agrcola. Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010 12 respectivamente.Laspropiedadessuperficialesdelamuestra,determinalaadhesin de la solucin de tincin afectando la imagen final. Latincinnegativaesunatcnicafundamentalparacontrastarmuestrasparticuladas. Elcontrasteseobtieneembebiendolapartculaaobservarenunasaldeunmetal pesado,cidofosfotngsticoal2%,acetatodeuraniloal4%,queperfilamnimos detalles ultraestructurales sobre un fondo oscuro; de ah su denominacin como tcnica de contraste negativo, o de tincin negativa.Siempre que se aplique esta tcnica, es necesario trabajar con grillas cubiertas por un soporte o membrana plstica (formvar o colodin), para evitar que la muestra lquida se escurra entre los agujeros de la grilla. La tincinnegativaseaplicaalestudiodemicroorganismos(virus,bacterias(pilisy flagelos),protozoarios),fragmentoscelulares(membranas)ymacromolculasaisladas (protenas).Estatcnicapermiterealizarunaidentificacinmorfolgicarpidayun diagnstico diferencial de los distintos virus contenidos en la una muestra. Referencia M.A, Hayat. Principles and Techniques of electron microscopy EL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO, QU INTERESA OBSERVAR EN LA MUESTRA ElSEMpermiteobservarycaracterizarlasuperficieotopografa,proporcionando informacinmorfolgicaconimgenestridimensionalesdelmaterialobservado,de muestrasorgnicasoinorgnicas,esespecialmentetilparaconocerelaspecto superficialdelasclulasy/oladisposicinydistribucindestasenlostejidos. Solamentehastaelmomento,puedenserobservadosorganismosmuertos,ynose puedeexplorarmsalldelamorfologaexternadelamuestra.Losmicroscopios electrnicos slo pueden ofrecer imgenes en blanco y negro puesto que no utilizan la luz. En mi caso, en el estudio de interaccin planta patgeno, me interesa observar, como estainterrelacionndoselasestructurasdelpatgeno(hifas,micelio,etc.)conlas estructurasvegetalesycomoelhongoestpenetrandolasestructurascelularesdel vegetal, para posterior mente por un anlisisprotemico de esa interaccin, establecer lapreferenciayrelacinporuntejidoespecificoenlaplanta,porejemplo(Porque atacasolohojasynotallosuotraestructuradelaplanta,enestecasocualserla deficiencia de la hoja (morfolgica o bioqumica) para que el hongo ataque por all)