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PRÁCTICAS DE INMUNOTECNOLOGÍA

(CURSO 2006/2007)

ÁREA DE INMUNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, GENÉTICA E INMUNOLOGÍA

FACULTAD DE CIENCIAS - UNIVERSIDAD DE VIGO

PROFESORA: DRA. ÁFRICA GONZÁLEZ FERNÁNDEZ

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P R Á C T I C A N º 1

A . P R E P A R A C I Ó N D E I N M U N Ó G E N O S Y U S O D E A D Y U V A N T E S .

P R O T O C O L O S D E I N M U N I Z A C I Ó N .

Un inmunógeno es cualquier sustancia que induce una repuesta inmunitaria. Todo los

inmunógenos son antígenos pero no todos los antígenos son inmunógenos. Aquellos antígenos

que no son capaces por si solos de causar una repuesta inmunitaria se denominan haptenos, son

moléculas de bajo peso molecular y deben conjugarse con una molécula “portadora” o “carrier”

que proporcione epitopes reconocibles por las células de sistema inmunitario.

1. T I P O S D E AD Y U V AN T E S

El antígeno libre suele dispersarse con rapidez desde los tejidos locales que drenan el sitio

de la inyección y una importante función de los adyuvantes es contrarrestar esto al proporcionar

un reservorio antigénico duradero, ya sea en una localización extracelular o dentro de los

macrófagos. Los principales adyuvantes son:

• ADYUVANTE INCOMPLETO DE FREUND : es una emulsión estabilizada de aceite no

metabolizable en agua. Las emulsiones tienden a producir concentraciones más altas

y duraderas de anticuerpos.

• ADYUVANTE COMPLETO DE FREUND : es igual que el incompleto pero contiene

bacterias atenuadas de Mycobacterium tuberculosis. Este produce granulomas y es

muy irritante, por lo que no está indicado para su uso en el ser humano.

• ALUMN : compuesto de aluminio (fosfato o hidróxidos) y es el más utilizado en el

hombre. Para incrementar la estimulación no específica, se asocia en ocasiones a

bacterias muertas de Bordetella pertussis. Si se emplea estas bacterias no se puede

inyectar por vía intravenosa, pero si por el resto de las vías de inmunización.

I. PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DEL ADYUVANTE INCOMPLET O DE FREUND:

1. Resuspender el adyuvante de Freund incompleto por agitación.

2. Preparar 200 µl del BSA en solución salina a una concentración final de 2 mg/ml.

(Concentración del antígeno 200 mg/ml)

3. Añadir en un tubo eppendorf 100 µl del adyuvante incompleto de Freund. Mientras se agita

el adyuvante, ir añadiendo gota a gota la solución antigénica (100 µl) Mezclar bien hasta

que se vea una emulsión pastosa.

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4. La emulsión ahora es espesa. Guardar en nevera a 4ºC.

¿A qué concentración tenemos la emulsión?

Inyección: La concentración habitual para inyectar en una rata o ratón es de 50 a 100 µg.

Para un conejo la concentración varía entre 50 y 1000 µg. Antes de inyectarlo se debe diluir el

precipitado en salino con un volumen final de 250 µL.

Queremos inmunizar a un ratón con 100µg de BSA

¿Qué volumen de emulsión necesitamos? y de salino?

II. PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DEL ADYUVANTE ALUMN:

Se requiere:

• Preparar 10 ml de una solución al 5% de Alluminium potassium sulphate (sulfato de potasio y

aluminio) [KAl (S04)2.12 H20] en agua destilada estéril. Se conoce como ALUMN.

1. Preparar 1 ml de antígeno (BSA) diluido a una concentración de 1 mg/ml en agua

destilada en un tubo Falcon de 15 ml.

2. Añadir 1 ml de la solución 5 % ALUMN. Ajustar el pH a 6.5 añadiendo lentamente 4N

NaOH. Normalmente requiere varias alícuotas de 30 µl, aunque esto varía de acuerdo al

pH del agua. Medir el pH con papel indicador.

3. Centrifugar la muestra 5 minutos a máxima centrifugación en una centrífuga (13.000 r.p.m)

Eliminar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.

4. Resuspender el precipitado en 1 ml de salino estéril (concentración final de 1 mg/ml)

Mantener a 4 ºC. Si se quisiera guardar muchos días (al menos 14), resuspender en

salino/merthiolate 1: 10.000.

Inyección: La cantidad habitual para una rata o ratón es de 50-100 µg. Para un conejo

entre 50 - 1000 µg. Tomar la cantidad de antígeno necesario y añadir 109 unidades de B.

pertussis (el preparado comercial inactivado por calor, contiene 20 x 10 9 unidades en 0.5 ml) e

inyectar al animal en un volumen final de 250 µl en salino.

2. V Í AS D E I N M U N I Z AC I Ó N

La elección de la vía de inmunización va a depender de varios factores: cantidad que ha

de administrarse, solución en la que a resuspenderse o diluirse el inmunógeno y qué otros

componentes se han asociado (por ejemplo la B. pertussis no puede inocularse por vía

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intravenosa) y la rapidez o velocidad a la cual el inmunógeno debe ser liberado a los vasos

linfáticos y a la circulación.

Las principales vías de inmunización son:

• Subcutánea o hipodérmica: es muy fácil de realizar y permite inocular volúmenes

grandes, pueden administrarse en sucesivas veces.

• Intramuscular: el antígeno se libera lentamente, el volumen a inocular varía en función del

tamaño del animal.

• Intradérmica: es más difícil de realizar y permite inyectar volúmenes reducidos.

• Intravenosa: no efectiva para inmunizaciones primarias, permite una liberación rápida del

antígeno en el ratón, la inyección se suele realizar en la vena caudal (vena de la cola)

• Nódulos linfoides: empleada principalmente en el campo de la investigación, se realiza

en raras ocasiones.

• Intraperitoneal: se utiliza frecuentemente en animales pequeños (cobaya, ratón, rata,

hámster, etc.) permite inocular una grandes volúmenes en ratones, no está recomendada

para conejos

3. AN I M AL E S M ÁS U T I L I Z AD O S

La experimentación animal es uno de los pilares más importante de las investigaciones

científicas. El trabajo con animales permite obtener modelos experimentales fidedignos y

económicos, pero éticamente obliga al investigador a evitar la producción de dolor innecesario en

el animal. Las principales especies animales que se utilizan en la experimentación son:

• Conejos: sobre todo para producir anticuerpos policlonales.

• Ratones: son animales de fácil manejo y son muy buenos para producir anticuerpos

monoclonales.

• Ratas: muy buenos para anticuerpos monoclonales.

• Hámster: sobre todo para anticuerpos policlonales cuando tenemos poco antígeno.

• Cobayas ( Guinea pigs ): son animales bastantes pacíficos y sobre todo se utilizan para

producir anticuerpos policlonales.

• Pollos: sobre todo para obtener respuesta frente a antígenos de mamíferos muy

conservados.

• Cabras: sobre todo para obtener grandes cantidades de anticuerpos policlonales.

• Humanos: éticamente discutible, peligroso.

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Dado que la respuesta de los animales va a ser diferente, deben de inmunizarse varios

individuos. En caso de los conejos se debe inmunizar al menos dos, siendo mejor 3 ó 4. En el

caso de los roedores se deben usar entre 3 a 6 animales.

4 . N E C E S I D AD E S D E AN E S T E S I A

Tanto para la seguridad de los animales y de las personas que los manejan, como por

razones éticas, en todos los casos para la administración y la toma de muestras se debe sujetar e

inmovilizar a los animales correctamente y si es necesario, se debe de administrar anestesia

siempre que exista resistencia al manejo o suponga dolor a la administración de un producto o la

toma de muestras. En todos los casos debe de evitarse, en la medida de lo posible, producir

estrés o sufrimiento innecesario a los animales.

Antes de administrar un anestésico a un animal debe de tenerse en cuenta la especie, el

estado fisiológico, la duración de la inmovilización y la vía de administración. La anestesia

pretende producir un estado inconsciencia o hipnosis, acompañada de analgesia, relajación

muscular y equilibrio de las constantes vitales, además de deprimir el centro termorregulador e

induce estado de hipotermia que es muy peligroso en especies de pequeño tamaño. Los

principales anestésicos que se utilizan son: Dióxido de carbono (inhalación 1-2 min.),

Pentobarbitona sódica (inyección), Fluanisona (en caso de cirugía mayor), Droperidol (se usa

en combinación con la fluanisona en caso de cirugía mayor) y Diethyl ether (inhalación)

5 . T I P O S D E I N M U N Ó G E N O S Y V I AS D E I N M U N I Z AC I Ó N

Excepto inmunógenos particulares (tipo virus, hongos, bacterias, etc.) que sólo deben

inyectarse vía subcutánea, intramuscular o intradérmica, el resto (proteína solubles, insolubles,

carbohidratos y ácidos nucleicos) pueden inyectarse de forma intravenosa además de las vías

anteriores.

B . E S T U D I O D E R E S P U E S T A I N M U N E E S P E C Í F I C A ( E L I S A I N D I R E C T O )

1. OBTENCIÓN DE SUERO

Se sangra el ratón por el plexo retrorbital con la ayuda de una pipeta Pasteur o un capilar,

obteniendo unos 500 µL de sangre. Se deja la sangre 1 hora a 37 ºC o toda la noche a 4ºC para

obtener la retracción del coágulo. Finalmente se centrifuga la sangre 5 min. a 13.000 r.p.m. para

separar el suero del coagulo.

2. D E T E R M I N A C I Ó N D E L A C O N C E N T R A C I Ó N D E A N T I C U E R P O S

F R E N T E A B S A : E L I S A I N D I R E C T O .

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El ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) es una técnica cuantitativa, que se

basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que

directa o indirectamente producen una señal o una reacción enzimática cuyo producto, puede ser

medido espectofotométricamente. Hay diversos tipos de ELISAS (directos, competitivos,

indirectos, tipo sandwich, etc..)

El ELISA indirecto consiste en inmovilizar el antígeno (en nuestro caso BSA) en un soporte

físico y los anticuerpos que capturan el antígeno (suero de ratón) se revela con un segundo

anticuerpo (anti-inmunoglobulinas de ratón) acoplado a una enzima. Este tipo de ELISA se utiliza

cuando se dispone de un antígeno puro o razonablemente purificado. Las fases para realizar un

ELISA son:

• Inmovilización del antigenos a un soporte sólido : Incubar a 4ºC durante toda la noche el

fondo de una placa de 96 pocillos con 50 µL de BSA a una concentración de 2µg/mL (5ml de

BSA)

• Bloqueo : Para evitar uniones inespecificas, bloquearemos los huecos libres del fondo del

plastico con proteina leche. Añadir a cada procillo 150 µL de leche al 1% en PBS (15ml por

placa) y dejar incubar a 4ºC durante toda la noche. Lavar la placa tres veces con PBS.

• Recta patrón, muestras, blancos, control positivo : en la placa de ELISA se va a colocar por

triplicado un blanco, un suero del ratón antes de inmunizar, un control positivo y el suero del

ratón despues de inmunizado, según el siguiente esquema:

- En los pocillos A1, A2 y A3 se añaden 50µL de PBS con 1% de leche a cada uno de los

tres pocillos. Será nuestro blanco, nos dará el fondo.

- En los pocillos B1, B2 y B3 se añaden 50 µL de un suero positivo. Será nuestro control

positivo.

- En los pocillos C1, C2 y C3 se añaden 100 µL de la “Solución patrón”. En los restantes

pocillos de las tres columnas y en los pocillos de las columnas 4, 5 y 6 se añaden 50

µL de PBS con 1% de leche. A continuación se transfieren 50 µL de los pocillos C1, C2

y C3 a los pocillos D1, D2 y D3 respectivamente, luego se transfieren 50µL de los

posillos de esta fila a la siguiente y así sucesivamente hasta llegar a los pocillos H4, H5

y H6. Será nuestra recta patrón. Acordarse de descartar 50 µL del los pocillos H4,

H5 y H6

- En los pocillos A7, A8 y A9 se añaden 100 µL del suero del ratón antes de inmunizar, y

se hacen diluciones seriadas a lo largo de las columnas 7, 8 y 9.

- En los pocillos A10, A11 y A12 se añaden 100 µL del suero del ratón despues de

inmunizar, y se hacen diluciones seriadas a lo largo de las columnas 10, 11 y 12.

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Esquema:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

A B l a n c o B l a n c o B l a n c o 1 / 6 4 1 / 6 4 1 / 6 4 P r e I n . P r e I n . P r e I n . P o s I n . P o s I n . P o s I n .

B P o s i t i v o P o s i t i v o P o s i t i v o 1 / 1 2 8 1 / 1 2 8 1 / 1 2 8 1 / 2 1 / 2 1 / 2 1 / 2 1 / 2 1 / 2

C R e c t a R e c t a R e c t a 1 / 2 5 6 1 / 2 5 6 1 / 2 5 6 1 / 4 1 / 4 1 / 4 1 / 4 1 / 4 1 / 4

D 1 / 2 1 / 2 1 / 2 1 / 5 1 2 1 / 5 1 2 1 / 5 1 2 1 / 8 1 / 8 1 / 8 1 / 8 1 / 8 1 / 8

E 1 / 4 1 / 4 1 / 4 1 / 1 0 2 4 1 / 1 0 2 4 1 / 1 0 2 4 1 / 1 6 1 / 1 6 1 / 1 6 1 / 1 6 1 / 1 6 1 / 1 6

F 1 / 8 1 / 8 1 / 8 1 / 2 0 4 8 1 / 2 0 4 8 1 / 2 0 4 8 1 / 3 2 1 / 3 2 1 / 3 2 1 / 3 2 1 / 3 2 1 / 3 2

G 1 / 1 6 1 / 1 6 1 / 1 6 1 / 4 0 9 6 1 / 4 0 9 6 1 / 4 0 9 6 1 / 6 4 1 / 6 4 1 / 6 4 1 / 6 4 1 / 6 4 1 / 6 4

H 1 / 3 2 1 / 3 2 1 / 3 2 1 / 8 1 9 2 1 / 8 1 9 2 1 / 8 1 9 2 1 / 1 2 8 1 / 1 2 8 1 / 1 2 8 1 / 1 2 8 1 / 1 2 8 1 / 1 2 8

• Lavados : Lavar la placa con PBS tres veces. No se debe dejar que la placa se seque.

• Anticuerpo secundario o de detección : Añadir 50 µL por pocillo del anticuerpo secundario de

cabra anti-Igs totales de ratón marcado con peroxidasa a una concentración 1: 2000 diluido en

PBS con 1% de leche, a partir de una dilucción stock de 1/200. Incubar 1 hora a 37 C.

• Lavados : Lavar tres veces la placa con PBS. No se debe dejar que la placa se seque.

• Revelado y lectura de la Absorbancia : Unos minutos antes del lavado se debe disolver 75µL

ABTS al 20X en 1,5 mL de buffer citrato 0.1 M pH 4.3 (0,55 mg/ml) Añadir a esta mezcla 3

gotas de agua oxigenada y mezclar bien. A continuación, añadir 50 µL de esta solución en

cada uno de los pocillos y dejar que la reacción de color ocurra (esperar entre 5-10 min) Parar

la reacción añadiendo 50 µL de acido cítrico 0.1 M con 0,01% de azida sódica y leer en el

lector de ELISA a 450 nm.

Dibuja la recta patrón obtenida, y calcula la conce ntración anticuerpo total anti-BSA

presente en tu suero problema.

¿Por qué no interfiere la albúmina presente en la l eche con la albúmina que pegamos al

fondo del pocillo?

C . C U L T I V O S C E L U L A R E S . D E S C O N G E L A R L A L Í N E A C E L U L A R N S O

La contaminación microbiana es uno de los principales problemas de la tecnología del

cultivo celular. Para garantizar una atmósfera estéril, las manipulaciones han de llevarse a cabo

en la cabina de flujo laminar que es un compartimiento en el que se proyecta un flujo de aire

sobre la superficie de trabajo, el aire pasa previamente por un filtro llamado HEPA (High Efficiency

Particulate Arrestor) para retirar los microorganismos y esporas.

Existen dos tipos: cabinas de flujo vertical el usuario queda protegido por una pantalla de

vidrio o plástico transparente, el personal solo introduce los brazos y todo el material de trabajo

dentro de la cabina; y las cabinas de flujo frontal el aire cargado con aerosoles del cultivo es

proyectado hacia el usuario, no está recomendada para trabajar con material infeccioso, se usa

prácticamente en cultivo de tejidos vegetales. Todo el material que se introduce dentro de la

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cabina: gradillas, recipientes, micropipetas, etc. debe ser esterilizado o limpiarse con etanol al

70% o con una solución antiséptica.

Para el cultivo de células se emplean medios de cultivo líquidos que se componen de

agua, sales minerales, aminoácidos, vitaminas y glucosa; para mantener el pH en valores

fisiológicos se emplean un tampón de bicarbonato que se equilibra con el CO2 gaseoso aportado

externamente al incubador. También suelen tener un indicador de pH, el rojo de fenol, que virará

a amarillo si el medio se acidifica y a violeta si se basifica. Existen distintos medios comerciales,

por ejemplo: DMEM y RPMI.

Estos medios se suplementan con suero descomplementado, generalmente, bovino, que

aporta oligoelementos, hormonas y proteínas de transporte. También suelen llevar antibióticos

para prevenir el crecimiento de bacterias. La mezcla de células y el medio de cultivo se dispensa

en recipientes de poliestireno (botellas, pocillos, flask, placas, etc.) que se mantienen

semicerrados para permitir el intercambio de gases y se colocan en un incubador donde se

mantienen a una temperatura estable, generalmente a 37ºC.

PROTOCOLO PARA DESCONGELAR LA LÍNEA CELULAR NSO

1. Preparar un tubo de 15 ml con 8-10 ml de medio DMEM con 20 % FCS.

2. Coger el vial del congelador y pasarlo directamente al baño con mucho cuidado y

mantenerlo en movimiento (hasta que quede una pequeña bolita de hielo). Limpiar el vial

con etanol. Rápidamente llevar el vial a una caja con hielo y llevarla a la cabina de flujo

laminar.

3. Recoger las células con una pipeta Pasteur y pasar las células al tubo de 15ml preparado

anteriormente. Centrifugar a 1.200 r.p.m. durante 5 min.

4. Volcar el sobrenadante en un vaso de cristal, resuspender el pellet suavemente, dando

golpecitos con los dedos y añadir 1 mL de DMEM con 20 % FCS.

5. Pasar 500 µL al pocillo A1 de la placa de 24, poner 250 µL en los pocillos A2y A3. Rellenar

con medio hasta un volumen final de 2 mL.

6. Poner la placa en el incubador a 37ºC con un flujo de CO2.

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P R A C T I C A N º 2 : G E N E R A C I Ó N , S U B C L O N A C I Ó N Y E X P A N S I O N D E

H I B R I D O M A S : A N T I C U E R P O S M O N O C L O N A L E S .

En 1975 Köler y Milstein desarrollaron la técnica de hibridación de células somáticas que

permitió la obtención de anticuerpos monoclonales. Esta técnica consiste en tres etapas:

I. Inmunización del animal con un antígeno: Se realiza una primera inmunización y luego se

realizan varias inmunizaciones de recuerdo. El número y la frecuencia de las inmunizaciones

es variable. Por último se da una inmunización de refuerzo (booster) tres días antes de

sacrificar al animal. Las vías de inmunización pueden ser subcutánea, intraperitoneal, y en

ocasiones, intravenosa. Si tenemos poco antígeno o es poco inmunogénico se puede

inmunizar directamente en el bazo o en los nódulos linfáticos.

II. Fusión celular: se va a realizar entre los linfocitos del bazo del animal inmunizado (aporta la

especificidad del anticuerpo) y una línea celular tumoral (mieloma) que aporta la inmortalidad.

El mieloma no debe de producir inmunoglobulinas propias, debe de ser capaz de inducir la

fusión con alta eficacia y poseer los marcadores necesarios para seleccionar las células

fusionadas (gen HGPRT deficiente) en el medio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). La

fusión celular se ve favorecida por el polietilenglicol (PEG).

III. Ensayos de especificidad frente al antígeno: la detección de los anticuerpos específicos, en el

medio de cultivo donde crecen los hibridomas, es uno de los puntos más críticos en la

estrategia de producción de anticuerpos monoclonales. Las técnicas empleadas deben ser

sensibles para detectar µg de anticuerpo por ml, deben ser rápidas para evitar el

sobrecrecimiento; simples y lo más automatizadas posibles. Las técnicas más utilizadas son

las enzimoinmunométricas. Los cultivos que den positivo deben ser clonados lo más

rápidamente posible para establecer clones productores de anticuerpos monoclonales. Esto se

realiza principalmente por el método de dilución límite en medio líquido o en agar.

1 0

P R O T O C O L O D E F U S I Ó N Y G E N E R A C I Ó N D E H I B R I D O M A S

A - P R E P A R A C I Ó N D E L A S C E L U L A S D E L B A Z O :

1 . Matar al ratón por dislocación cervical, introducirlo en etanol al 70% y extraer el bazo en

una cabina estéril.

2 . Homogeneizar el bazo en DMEM con un 5% de FCS (hacerlo en hielo), usar un

homogenizador y un tubo de fondo redondo con 2-3 mL de medio de forma que se vaya

aplastando poco a poco el bazo sin machacar. (alternativa: placa de Petri y embolo de una

jeringa de 1ml)

3 . Una vez homogeneizado el tejido, se lleva a un tubo de 15 mL y se deja decantar unos 2

min, hasta que veamos que el tejido conectivo se haya ido al fondo, se recoge el

sobrenadante (SB) y se lleva a otro tubo de 15 mL. En los casos en los que en el SB aún

tengamos tejido conectivo, se puede repetir este último paso.

4 . Centrifugar el SB y resuspender las células en 10 mL de DMEM al 5% de FCS a 4ºC,

quitar una alícuota de 100 µL para contar. Se le añaden 900 µL de Metil Violeta 6B al 0,1%

en 0,21% de ácido cítrico (así se tiñen específicamente las células nucleadas) Recordar el

factor de dilución (10X)

5 . Volver a centrifugar las células y resuspender en DMEM sin FCS.

¿Cuántas células has obtenido? ¿Son todos linfocito s B?

B - P R E P A R A C I Ó N D E L A S C É L U L A S D E L M I E L O M A :

Se deben descongelar unos diez días antes y cuando ya tengamos las monocapas bien

formadas en Flasks grandes, se pasan a los “roller” (se deben poner unos cinco días antes de la

fusión), se deja una noche sin mover para que se forme una monocapa e irles cambiando el

medio todos los días, aumentando el volumen, en caso de que el día anterior a la fusión no

tengamos células suficientes no quitar todo el medio al cambiarlo.

1 . Mantener los mielomas (línea NSO) creciendo en medio al 5-10% de FCS.

2 . Para la fusión se debe utilizar un número adecuado de células de mieloma, que va a

depender de las células de bazo obtenidas en la etapa anterior. La relación a seguir es de

1 célula de NSO por cada 3 células de bazo. Coger las células NSO necesarias,

centrifugar a 1200 r.p.m. durante 5 min. y resuspender el pellet en DMEM sin FCS.

3 . Llevar las células NSO a un tubo Falcon de 50 mL y añadir las células de bazo, completar

con DMEM a 37ºC hasta 50 mL. Centrifugar a 1.200 r.p.m. durante 5 min. a temperatura

ambiente, resuspender el pellet y mantener en un baño a 37ºC.

1 1

4 . Ir añadiendo muy lentamente (gota a gota) y moviendo el pellet con la pipeta de cristal 1

ml de PEG a 37ºC (Merck PEG, MW 1500 en 10 mM Hepes y 0,85% salino)

5 . Seguir moviendo las células con la misma pipeta durante 2 min.

6 . Preparar dos tubos con 10 y 12 mL de DMEM sin FCS a 37ºC.

7 . Añadir 1 mL del tubo de 10 mL en 1 min. (moviendo la pipeta), repetir. Añadir de la misma

forma otro mL en 30 s , repetir. Añadir el resto de los 10 mL en 2 min.

8 . Añadir los 12 mL gota a gota, sin mover la pipeta ni el tubo. Mantener a 37ºC durante 20-

30 min.

9. Centrifugar las células durante 5 min. a 1.200 r.p.m. Resuspender el pellet en 12 mL de

DMEM al 20% FCS/HAT.

10. Se plaquea en una placa de 24 pocillos de la siguiente manera:

• FILA A: 1 mL en cada pocillo de los 12 iniciales (dilución 1/1) Nos sobran 6 mL y

añadimos otros 6 mL de DMEM al 20% FCS/HAT.

• FILA B: repartimos 1 mL en cada pocillo (dilución ½) Nos quedan 6 mL y añadimos

otros 6 ml de medio DMEM al 20% FCS/HAT.

• FILA C: repartimos 1 mL en cada pocillo (dilución 1/4) Nos quedan 6 mL y

añadimos otros 6 ml de medio DMEM al 20% FCS/HAT.

• PILA D: repartimos 1 mL en cada pocillo.

Añadimos en todo los pocillos 1 mL de medio DMEM al 20% FCS/HAT, de forma que el

volumen final de todos los pocillos sea de 2 mL.

MATERIAL QUE HAY QUE MANTENER A 37ºC

- PEG.

- 200 ml de DMEM con 20% FCS, antibióticos y HAT (filtrarlos antes)

- 1 Tubo de 10 mL y otro de 12 mL de DMEM sin FCS con antibióticos.

- 200 mL de DMEM con antibióticos y sin FCS.

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P R Á C T I C A N º 3 : P I C A R C L O N E S

Bajo una lupa y en la cabina de flujo laminar se observa la placa de 24 pocillos resultante

de la fusión celular y se transfieren individualmente cada unos de los clones a un pocillo de la

placa de 24. Picar 48 clones y llevar los pocillos con medio DEMEM al 20% de FCS/HAT hasta un

volumen final de 2 mL.

P R Á C T I C A N º 4 Y N º 5 : C U L T I V O S C E L U L A R E S Y E S T U D I O D E L A

P R O L I F E R A C I Ó N C E L U L A R .

En numerosas aplicaciones de la tecnología del cultivo celular se requiere cuantificar la

proliferación, por ejemplo en respuesta a estímulos fisiológicos y mitógenos o para analizar la

sensibilidad o resistencia de un tumor a un fármaco, por ejemplo. Existen varios ensayos que

permiten realizar estudios de viabilidad celular. Los dos más extendidos son el Cristal Violeta y el

MTT. El violeta cristal es un colorante que se une al DNA. Sin embargo el MTT, 3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, es una sal de tretazolio de color amarillo

que se convierte en un formazán insoluble de color azul-violáceo al ser metabolizado por las

células. Esta reacción está catalizada por las deshidrogenasas mitocondriales de células vivas y

consiste en la ruptura del anillo de tetrazolio. De esta forma la cantidad de formazán dependerá

de la cantidad de células en proliferación (no de la cantidad total de células) Para medir el

formazán se solubiliza primero en un solvente acídico (isopropanol-ácido clorhídrico) y se analiza

con un espectrofotómetro a 570nm.

PROTOCOLO PARA MEDIR LA PROLIFERACIÓN CELULAR MEDIA NTE MTT

• Reactivos, soluciones, material, etc.

A. PBS 1X

B. Filtros: MILLEX

C. GP 33mm 0.22µm Syringe Driven Filter Unit Cat No. SLGP033RS

1 3

D. MTT (Sigma M5655)

E. HCl 5N

F. isopropanol al 0,07n de ClH.

A. PRACTICA Nº 4 : PREPARACIÓN DE LAS CÉLULAS

1 . La línea celular NSO está creciendo en medio DEMEN al 5% de FCS en el incubador.

2. Para la realización el estudio de la proliferación celular se deben colocar 200.000 células por

pocillo en el primer pocillo de las columnas 1, 2 y 3 de una placa de 96, y luego hacer

diluciones seriadas ½ hacia abajo.

2.a� Primero, coger las células necesarias, centrifugar a 1.200 r.p.m. durante 5 min. y

resuspender el pellet en DMEM con 5% de FCS.

2.b� Segundo, en la primera fila se añaden 100µl de medio con las células necesarias, al resto

de los pocillos se añade 50 µl de DMEM con 5% de FCS.

2.c� A continuación se transfieren 50µl de la primera fila a la segunda fila, mezclar bien y se

retiran otros 50 µl que se transfiren a la siguiente fila, y así sucesivamente hasta el final de la

placa.

3 . En las siguientes tres columnas (4, 5 y 6) se añaden 20.000 células en 100 µl por pocillo,

excepto en las dos primeras filas en las que no se añaden células (igual que 2.a)

4 . A todos los pocillos de las las tres primeras columnas (1, 2 y 3) se le añade 50µl de DMEM

con 5% de FCS.

5 . En las columnas 4, 5 y 6 se va a añadir (ver esquema):

- Fila A y B: 200 µl de DMEM con 5% de FCS por pocillo

- Fila C y D: 100 µl de DMEM con 5% de FCS por pocillo

- Fila E y F: 100 µl de DMEM sin FCS por pocillo.

- Fila G y H: 100 µl de DMEM con 5% FCS con Tritón X-100 por pocillo.

7 . Dejar incubando las placas a 37ºC durante toda la noche.

1 4

Esquema:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

A 2 0 0 M I L C É L U L A S

2 0 0 M I L C É L U L A S

2 0 0 M I L C É L U L A S

S O L O M E D I O

S O L O M E D I O

S O L O M E D I O

B 1 / 2 ½ 1 / 2 S O L O

M E D I O S O L O

M E D I O S O L O

M E D I O

C 1 / 4 ¼ 1 / 4 C . + M E D I O

C O N F C S C . + M E D I O

C O N F C S C . + M E D I O

C O N F C S

D 1 / 8 1 / 8 1 / 8 C . + M E D I O

C O N F C S C . + M E D I O

C O N F C S C . + M E D I O

C O N F C S

E 1 / 1 6 1 / 1 6 1 / 1 7 C . + M E D I O

S I N F C S C . + M E D I O

S I N F C S C . + M E D I O

S I N F C S

F 1 / 3 2 1 / 3 2 1 / 3 2 C . + M E D I O

S I N F C S C . + M E D I O

S I N F C S C . + M E D I O

S I N F C S

G 1 / 6 4 1 / 6 4 1 / 6 4 C . + M E D I O C O N T X 1 0 0

C . + M E D I O C O N T X 1 0 0

C . + M E D I O C O N T X 1 0 0

H 1 / 1 2 8 1 / 1 2 8 1 / 1 2 8 C . + M E D I O C O N T X 1 0 0

C . + M E D I O C O N T X 1 0 0

C . + M E D I O C O N T X 1 0 0

B. PRACTICA Nº 5 :

1. MEDICCIÓN DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR MEDIANTE MTT (continuación)

♦ Solución stock de MTT: Solubilizar el MTT en PBS 1X a una concentración de 5mg/ml,

filtrar, hacer alícuotas de 1 ml y conservar a –20ºC. El MTT es muy tóxico sobre todo en

polvo, usar siempre guantes.

1. Añadir 10 µL por pocillo de la solución stock. Incubar de 3 a 4 horas a 37 ºC.

2. Añadir 100 µL por pocillo de isopropanol al 0,07N de HCl

3. Solubilizar por aspiración repetida con la ayuda de la micropipeta hasta conseguir que el

precipitado se disuelva y el medio coja un color azul-violáceo. Medir la absorbancia a

570nm. La absorbancia detectada es proporcional a la proliferación.

2. DILUCCIÓN LIMITE DE LOS HIBRIDOMAS GENERADOS

1. Para la realización la dilución límite se deben colocar 2.000 células en 200µL por pocillo en

la primera columna de una placa de 96.

2. Añadir 100 µL por pocillo de DMEM con un 20% de FCS/HAT al resto de la placa.

3. Hacer diluciones seriadas ½ desde la columna 1 hasta la 12. Para ello, se transfieren

100µl de la primera columna a la columna 2, mezclar bien y se retiran otros 100 µl que se

transfiren a la siguiente columna, y así sucesivamente hasta el final de la placa. Descartar

en la última columna 100 µl.

4. Añadir 100 µl de DMEM con un 20% de FCS/HAT a toda la placa para que el volumen final

de todos los pocillos sea de 200 µl.

5. Dejar en el incubador a 37ºC hasta que empiecen a aparecer clones en el fondo de los

pocillos.