Tecnica de cultivo de microorganismos_7.pdf

1 Laboratorio de Microbiología

“AÑO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD

ALIMENTARIA”

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA - LA MOLINA

INFORME N° 7

TECNICAS DE CULTIVO DE

MICROORGANISMOS

Integrantes:

20111360 Colquehuanca Mejía, Eliana Elsye 20091001 Flores Calderon, Elvis Hedim 20120456 Norabuena Damian, Juan Bernardo 20100472 Tantahuillca Landeo, Pat Teresa

Mesa N°5

Grupo: Miércoles de 3 a 5 pm

2013


I. INTRODUCCIÓN

Muchos de los análisis realizados en los laboratorios de microbiología de alimentos

incluyen en recuento de microorganismos presentes en una muestra. Aunque se puede

usar el microscopio para enumerar los microorganismos, esta técnica tiene tres

limitaciones. Primero, es difícil de diferenciar las células vivas de las células muertas.

Segundo, es casi imposible observar la bacteria a la luz del microscopio con una

densidad celular de menos de 106 por mililitro. Tercero, los materiales sólidos como

partículas de nutrientes no pueden ser vistos sin una ruptura mecánica debajo de la luz

de un microscopio de alta potencia (Swanson, Petran y Hanlin; 2001).

Seguido de la incubación, la población de microorganismos originalmente presente

puede ser estimada por un recuento del número de colonias o el número de tubos que

muestran evidencia del crecimiento y multiplicación a través de la dilución que fue

agregada a las placas o tubos. En el caso de los alimentos, existe un límite para

recuento de bacterias en estos, que ya están establecidos por la norma siendo

permitidos dentro de un rango de 30 a 300 u.f.c./ml.

Generalmente los microorganismos se encuentran mezclados unos con otros en una

muestra, por lo que se realizan aislamientos para estudiar un microorganismo objetivo

a través de un cultivo puro. Esto porque viven de forma sinergística, o sea que existe

cooperación entre ellos.

En este informe se explican las principales técnica usadas para el cultivo del

microorganismo, características del crecimiento en medios de cultivos como en el caldo

nutritivo y agar nutritivo (inclinado y vertical); además del aislamiento y recuento de

microorganismos con dos métodos: a) por estrías en placas con agar Mc Conkey y

agar Manitol-salado, b) diluciones por incorporación (0,1 ml) en agar nutritivo licuado.

OBJETIVOS:

Observar características de crecimiento de los microorganismos al trasplante

en medios de cultivo líquido y sólido.

Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismo

utilizando técnicas de aislamiento.


Figura 1: Pseudomona aeruginosa cultivada en agar

Triptacasa-Soja

II. MARCO TEÓRICO

El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios de

cultivo, recibe el nombre de “siembra”, esta operación la podemos realizar a partir de

muestras biológicas (orina, pus, secreciones, etc.), de análisis de control de calidad

(alimentos, aguas, cosméticos, medicamentos, etc.), procedentes de muestras

ambientales (agua, suelo, aire, etc.) o de un cultivo microbiano a otro. Por otro lado, si

la realizamos de un cultivo a otro se denomina “subcultivo” o “repique” (Rojas, 2011).

Una vez que ha sido preparado un medio de cultivo (Agar Gelatina, Agar Mc Conkey,

etc.), puede ser inoculado e inmediatamente incubado en condiciones que favorezcan

el crecimiento microbiano. En la toma de muestras de un medio (solido, liquido o aire),

mayormente se tiene una población mixta, entonces si se quiere cultivar una especie

de la muestra se debe realizar “técnicas de aislamientos” que permitan obtener cultivo

axénicos o puros.

Un cultivo puro o axénico es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo y que

procede de una sola célula, el crecimiento de esta origina, en medio sólido, una masa

de células fácilmente reconocibles o visibles que recibe el nombre de “colonia”, un

ejemplo figura 1.

La técnica de aislamiento, fue desarrollada durante el siglo XIX. En un principio se

utilizó diluciones seriadas en medio líquido, pero la presencia de contaminantes

(microorganismos no deseados) dificulto el aislamiento. Posteriormente la escuela de

Robert Koch introdujo los medios sólidos, completamente con agar y las placas Petri

para bacterias, permitiendo así la separación de física de las colonias sobre la

superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. Esto permite tener una visión

macroscópica de las colonias y de diferenciar distintas especies microbianas.

Fuente: Madigan, 2009.


2.1 Técnica de siembra en medios contenidos en tubos

Se tiene siembra en medios de cultivo contenido en tubos, ya sea caldo, caldo

nutritivo, agar inclinado, otros. Así se observara en las colonias su intensidad de

enturbiamiento, aparición de película o sedimento en el tubo, también poder

determinar un crecimiento móvil o no.

En esta siembra se debe tener mayor cuidado, puesto que un contaminante del

aire puede superar en crecimiento al microorganismo de estudio, por lo tanto se

deber tomar las siguientes precauciones:

Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de

modo que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del

tubo y no en la bica de este.

Los tapones se deben mantener en la mano contraria a aquella que

contiene el tubo, sosteniéndolos entre el dedo menique, el anular y el dedo

del corazón. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro

lugar.

Flamear la boca de tubo antes de cerrarlo después de la siembra o

inoculación.

Esterilizar el asa adecuadamente (toda porción que entra en contacto con

el medio de cultivo)

Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.

Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo.

Después de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la

boca del tubo.

Al sembrar trabajar en cámara de flujo laminar o en su defecto con

mechero Bunsen.

En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, así

como, utilice asas totalmente rectas.

a) Siembra en tubos por estrías simples

Se realiza en un tubo con medio solido inclinado (en bisel o pico de flauta), y

deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se

marque con movimiento en zigzag o surcos en la superficie. El proceso se

inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el área inclinada. Luego

incubar en estufa durante 28-48 horas a temperatura más adecuada a 37ªC.


b) Siembra en tubos por picadura

Se realiza con asa recta en punta en tubos de medios sólidos y semisólidos

generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el

microorganismo al medio de cultivo por el centro de superficie, llegando con el

extremo del asa al fondo del tubo y retirándolo posteriormente por la misma

trayectoria utilizada al realizar la picadura. Una siembra con asa (de argolla) o

con cierto movimiento de vaivén podría originar un patrón de crecimiento que

se interpretaría erróneamente como movilidad bacteriana. Por ultimo incubar

durante 24-48 horas a temperatura optima de crecimiento.

c) Siembra en tubo en medio líquido (caldo líquido)

Transferir asépticamente con el asa bacteriológica (de argolla), o en algunos

casos, pipetas estériles o hisopos. Si se usa asas bacteriológicas, de una

pequeña muestra de microorganismos, se transfiere desde el tubo que

contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estéril, se inocula el

microorganismo en el medio líquido, sumergiendo el asa en el líquido y rotar el

mango para desprender la muestra.

Figura 2: Siembra en un tubo de agar inclinado

Figura 3: Prueba de movilidad en agar

semisólido.


2.2 Técnicas de aislamiento

Un modo de estudiar un ecosistema microbiano consiste en aislar de él los

microorganismos y estudiar sus propiedades en cultivos de laboratorio. El

aislamiento es importante porque se obtienen cultivos para estudios

experimentales en el laboratorio y para las aplicaciones en los campos de la

biotecnología y la microbiología industrial y ambiental (Madigan, 2009).

Hernández (2003) nos dice que se ha desarrollado una serie de técnicas

microbiológicas para aislar microorganismo y obtener cultivos puros. A

continuación se mencionan tres de ellas:

Siembra en placas de Petri por rayado

Siembra en placa vertida

Diluciones en serie

2.2.1 La siembra en placas de Petri por rayado

Esta técnica se basa en la separación de los microorganismos al dispersar-

por rayado sobre agar- una muestra que los contiene, según se muestra en

la figura 5, a. Para llevar a cabo la disgregación, se recoge una porción de

la muestra con un asa bacteriológica y se raya sobre una sección de una

placa Petri; luego, se repite el rayado en tres secciones más de la placa.

En cada rayado, se toma la muestra de la sección anterior por lo que se

logra una disminución gradual en la cantidad de microorganismos.

Los microorganismos dispersos en la placa se incuban a la temperatura y

el tiempo recomendados; al crecer, formarán colonias separadas unas de

otras en alguna de las secciones del rayado, como se puede observar en

la figura 5, b. En esa figura, cada punto representa una colonia.

Posteriormente, se toma una muestra de una de las colonias separadas y

se repite el procedimiento, con la finalidad de confirmar la presencia de un

solo tipo de microorganismos.

Figura 4: Inoculación de un caldo de cultivo


2.2.2 La siembra en placa vertida

En esta técnica se hacen crecer los microorganismos en tubos, cada uno

con una concentración diferente, y se evalúa el tubo en el que las colonias

crecieron en forma separada.

Como primer paso, se preparan suspensiones de la muestra en diversas

diluciones y se coloca cada una en un tubo con agar fundido, como se

muestra en la figura 6, a. Luego, se mezcla homogéneamente el contenido

(el agar y el inóculo) de cada tubo y se vierte (no se siembra por rayado)

en una placa de Petri, según se muestra en la figura 6, b.

Se incuba cada placa, a la temperatura y el tiempo recomendados, y se

selecciona la dilución en la que se haya obtenido mayor separación de las

colonias.

Por último, de esta dilución, se toma una muestra de las colonias y se

siembra en una placa de Petri, por rayado, para confirmar si el cultivo está

puro. La conformación de pureza se puede realizar por observación a

simple vista (colonias de igual morfología), por observación microscópica o

mediante pruebas bioquímicas.

Figura 5: Siembra en placa Petri por rayado. a) El rayado de placas con asa

microbiológica. b) El crecimiento y la separación de las colonias.

Fuente: Hernández, 2003.

Figura 6: La siembra en placa vertida. a) Las diluciones de la muestra. b)

El vertido del cultivo en una placa de Petri.

Fuente: Hernández, 2003.


2.2.3 Diluciones en serie

Esta técnica se aplica cuando se conoce de antemano que el

microorganismo de interés se encuentra en mayor cantidad que los demás.

Para llevarla a cabo, se preparan varias diluciones de la muestra y se

incuban en el medio de cultivo adecuado para que crezca este

microorganismo; así, se logra que en alguna de las diluciones solo él

aparezca. Es necesario reconfirmar su presencia, utilizando el método de

siembra en placa de Petri por rayado.

2.3 Morfología de la colonia de bacterias

Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivos exhiben diferentes

tipos, formas macroscópicas en su crecimiento, estas diferencias llamadas

“características culturales”, son la base para la separación de ellas en grupos

taxonómicos. Estas son determinadas por el cultivo de microorganismos en agar

Nutritivo inclinado, en placas de Petri, en caldo nutritivo y otros.

La morfología colonial, es una característica indispensable a tener en cuenta en el

aislamiento primario de una bacteria y, en la cual se debe considerar el borde y la

elevación de la misma. Adicionalmente, es importante apreciar la consistencia y

textura de la masa celular, pues también son características distintivas. La

consistencia va desde viscosas que se pegan en el asa y se separan de la colonia

formando un hilo. Así como también la pigmentación de la colonia, las películas

continúas de crecimiento (bacterias móviles), colonias lisas (generalmente

virulentas) o colonias rugosas (generalmente avirulentas).

2.3.1 Caracterización del crecimiento sobre Agar Nutritivo inclinado

Los cultivos en este medio se inoculan en una sola línea recta (sobre la

superficie del bisel), y se evalúan de la siguiente manera:

Abundancia de crecimiento: La cantidad de crecimiento es

designada como ninguna, leve, moderada o abundante.


Pigmentación: Los microorganismos cromogénicos, pueden

producir pigmentos intracelulares que son responsables de la

coloración de las colonias; otros microorganismos, producen

pigmentos solubles extracelulares que son excretados en el medio

y también producen color, sin embargo la mayoría de la los

microorganismos son no cromogénicos y aparecerán en

tonalidades que van desde el blanco al gris.

Las características ópticas: Pueden evaluarse con base en la

cantidad de luz transmitida a través del crecimiento, estas

características son descritas como: opaca (ninguna transmisión de

luz), translucida (transmisión parcial), o transparente (transmisión

total de la luz).

Forma: La apariencia del crecimiento de la siembra en una sola

línea sobre la superficie del agar inclinado se designa de la

siguiente forma (Ver figura 7).

Estas pueden ser:

a. Filiforme.- Crecimiento en forma de hilo con bordes lisos

continuos.

b. Equinulado.- Crecimiento en forma de hilo con bordes

irregulares continuos.

c. Barbado.- Colonias semi-confluentes o no confluentes.

d. Difuso.- Crecimiento difuso y reducido.

e. Arborescente.- Crecimiento en forma de árbol.

f. Rizoide.- Crecimiento en forma de raíz.

Figura 7: Apariencia del crecimiento bacteriano, sembrado en una sola

línea sobre agar Nutritivo inclinado, donde: (A) Crecimiento filiforme, (B)

equinulado, (C) barbado, (D) difuso, (E) arborescente y, (F) rizoide.

Fuente: Rojas, 2011.


2.3.2 Caracterización del crecimiento en caldo nutritivo

Son evaluados según la distribución y apariencia del crecimiento como

sigue (Ver figura 8):

a. Turbidez fina uniforme.- Crecimiento fino y totalmente

disperso

b. Floculante.- Crecimiento en agregados escamosos

totalmente dispersos

c. Película.- Crecimiento en la superficie como plataforma,

grueso

d. Sedimento.- Concentración del crecimiento en el fondo del

caldo; puede ser granular, escamoso o floculante.

2.3.3 Caracterización del crecimiento en placas de Agar Nutritivo

La descripción se realiza sobre las colonias formadas (agrupamiento

bacteriano originado por el crecimiento y observable macroscópicamente),

de forma aislada y se evalúa de la siguiente manera (figura 9).

Figura 8: Apariencia del crecimiento bacteriano, sembrado en caldo

Nutritivo, donde: (A) Crecimiento de turbidez fina uniforme, (B)

floculante, (C) película y, (D) sedimento.

Fuente: Rojas, 2011.


a. Tamaño: Grande (diámetro mayor a 1mm), mediano (diámetro

aproximado a 1 mm), pequeño (diámetro inferior a 1 mm) y puntiforme.

b. Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide y lanceolada.

c. Borde: De borde regular (continuo), de borde irregular (ondulado,

lobulado, espinoso/dentado/lacerado, ondulado y filamentoso).

d. Elevación: Plana o aplastada (no elevación), elevada (convexa baja,

convexa cupuliforme, mamelonada, pulvinada y umbilicada).

e. Superficie: Lisa o rugosa.

f. Consistencia: Blanda, dura o mucoide.

g. Aspecto: Brillante, opaco y mate o translucido.

h. Pigmento: De diferente color. Pueden ser pigmentos solubles en agua y

que decoloran el medio, pigmentos fluorescentes y pigmentos no

difundibles confinados a las colonias.


La morfología de las colonias es un parámetro importante en el proceso de

identificación bacteriana, siendo estas características, comunes entre cada género

bacteriano. Sin embargo, la morfología puede alterarse por tiempo de incubación,

composición del medio de cultivo (excesiva desecación o humedad), etc. Esta

descripción es también aplicable a las levaduras, debido a que esta presenta

crecimientos típicos a bacterias.

III. PARTE EXPERIMENTAL

Ejercicio 1: Técnicas de cultivo de Microorganismos: Características de

crecimiento en medio de cultivo

Materiales:

Cultivo de microorganismos de 18 horas: Staphylococcus sp

Asa de kölle

Mechero

Figura 9: Descripción macroscópica realizada en colonias creciendo sobre

Agar Nutritivo, donde se aprecia la forma, la elevación y el borde.

Fuente: Rojas, 2011


Tubos con agar nutritivo inclinado

Tubos con agar nutritivo vertical

Tubos con caldo nutritivo

Procedimiento:

1. Se esterilizó el asa de kölle por flameo a la llama.

2. Se tomó el tubo con cultivo de 18 horas, se retiró el tapón, se flameó la

boca del tubo al mechero y se obtuvo una pequeña porción del cultivo

con ayuda del asa de kölle. Se flameó nuevamente la boca del tubo

antes de volver a taparlo.

3. Se tomó el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados

anteriores se introdujo el asa en el líquido para dejar el inóculo. Se

homogenizó la mezcla girando el tubo entre las palmas de la mano.

4. Se repitió el procedimiento 1 para obtener más inóculo, pero se usó

esta vez aguja de kölle.

5. Se tomó el tubo de agar inclinado y se realizó la siembra depositando

el inóculo a lo largo de una sola línea descrita desde la base de

inclinación hasta el extremo.

6. Se repitió el procedimiento 1 para obtener más inóculo, se usó

nuevamente aguja de kölle.

7. Se tomó el tubo con agar vertical y se realizó la siembra por picadura

profunda del medio.

8. Se rotularon los tubos sembrados y se colocaron a incubar a 37°C por

24 horas.

9. Cumplido el tiempo de incubación, se evaluó el crecimiento.

Figura 10. 1. Se esterilizó el asa de kölle por flameo.


Ejercicio 2: Técnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y Recuento

en placas

Materiales:

- Tubos de caldo conteniendo una mezcla de microorganismos

(Serratiamarcescens, Bacillus sp., Escherichia coli, Micrococcus sp., Proteus

sp.)

- Asa de kölle, aguja de kölle

- Mechero

- Tubos con 12ml de agar nutritivo licuado y manteniendo a 50°C

- Placas Petri estériles

- Placas con Agar nutritivo

Figura 11. Se introdujo el asa en el líquido para dejar

el inóculo.

Figura 12. Se introdujo el asa en el líquido para dejar el

inóculo.


- Placas con Agar Mc Conkey

- Placas con Agar Manitol Salado

Procedimiento:

A. Aislamiento por estrías

1. Se tomó el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y

con ayuda del asa o aguja de kölle previamente esterilizada a la llama,

se retiró el inóculo. Se consideró todas las recomendaciones antes

dadas para el trabajo con asepsia.

2. Se tomó la placa con agar nutritivo con la mano izquierda y con ayuda

de los dedos pulgar e índice se levantó hacia un lado la tapa,

procurando que la parte expuesta se encuentre bajo la influencia de la

llama del mechero. No se descubrió por completo la placa, así se evitó

mayor contaminación. Con el asa cargada de inóculo, se hizo estrías

sobre toda la superficie del medio, se procuró trazar una última estría

en un espacio libre. Se cerró la placa.

3. Se esterilizó el asa a la llama nuevamente.

4. Se repitió los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mc Conkey.

5. Se colocó las placas en incubación a 37°C por 24 horas.

6. Se observó el desarrollo de colonias individuales y se describieron sus

características de forma, elevación, consistencia, bordes, etc. Se

diferenció las características de las colonias desarrolladas en el medio

selectivo-diferencial.

B. Aislamiento por diluciones

1. Se tomó el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y

con ayuda del asa de kölle se retiró inóculo.

2. Se tomó un primer tubo de agar licuado manteniéndolo a 50°C y

transferir asépticamente el inóculo. Se esterilizó el asa a la llama del

mechero. Con el tubo cerrado se mezcló el inóculo con el medio, se

hizo girar entre las palmas de las manos.

3. Se transferir una asada del agar mezclado con el inóculo hacia un

segundo tubo de agar licuado. Se repitió la operación anterior para

obtener una mezcla homogénea.

4. Se vertió el contenido de cada tubo por separado en dos placas Petri

estériles y se rotó lentamente sobre la mesa para distribuir el medio de

manera uniforme. Se rotularon cada dilución para diferenciarlas.


5. Se incubó las placas a 37°C por 24 horas.

6. Se examinó el crecimiento de las colonias en las placas. Se hizo un

recuento de colonias (el estimado no es inferior a 30 ni superior a 300).

Se describieron las características diferenciales de las colonias

observadas.

IV. OBSERVACIONES

Al día siguiente se observaron los resultados en cada placa, y cada tubo. Obteniendo

los siguientes resultados:

Ejercicio 1: Características de crecimiento en medio de cultivo.


Agar Nutritivo Vertical

Crecimiento Limitado a la línea de inoculación

En profundidad

Agar Nutritivo inclinado

Cantidad Abundante

Distribución en la superficie Irregular

Forma de crecimiento Rizoide

Consistencia de crecimiento Viscoso

Pigmentación Blanco

Caldo Nutritivo

Cantidad Escasa

Figura 13: Agar nutritivo inclinado.

Figura 15: Caldo nutritivo

Figura 14: Agar nutritivo vertical


Ejercicio 2: Técnica de aislamiento.

A) Aislamiento por estrías:

a)

Apariencia o tipo Turbidez, aparición de opacidad en el

medio.

Características de colonias observadas:

Tienen forma redondeada

Presentan elevación

Características de colonias observadas:

No se observó crecimiento de colonias

de Staphylococcus sp, después de

aproximadamente 24 horas.

Figura 16. Crecimiento de Staphylococcus sp

en Agar MacConkey.

Figura 17. Crecimiento de Staphylococcus sp en

agar manitol salado.


B) Aislamieno por diluciones

Características de las colonias presentes con la primera asada del inóculo :

Se obsevó colonias muy juntas y abundantes.

Características de las colonias presentes con la segunda asada del inóculo:

Se observó que las colonias presentes estaban aún juntas pero si se

podían contabilizar.

El número de colonias contabilizadas fue de 92.

Figura 18. Primera asada del agar mezclado con el inóculo.

Figura 19. Segunda asada del agar mezclado con el inóculo.

Colonias formadas


V. DISCUSIONES

Las bacterias Staphylococcus sp son poco exigentes en sus necesidades; crece bien

en cualquier medio ordinario, aunque lo hacen mejor en los medios enriquecidos. Los

medios de cultivo comunes son el agar nutritivo donde crece Staphylococcus sp.,

como se muestra en las figuras 13 y 14, donde se observa un crecimiento de

microorganismos; lo mismo sucede en el medio de caldo nutritivo como se muestra en

la figura 1, donde se observa turbidez (cambio de color) después de aproximadamente

24 horas, siendo esto indicador de que se han crecido microorganismos.

En la figura 16 se muestra el crecimiento de Staphylococcus sp en el medio de cultivo

de agar Mac Conkey, pero según Konemman et al. (2006) este medio de siembra es

diferencial, solo para seleccionar y recuperar Enterobacteriaceae y bacilos

gramnegativos entéricos relacionados, inhibiendo a las gram-negativas como lo es

Staphylococcus sp; por lo tanto en el experimento ocurrió un error, tal vez en la

preparación del medio o al momento de sembrar las bacterias.

Según Pahissa (2009), el medio selectivo más empleado para identificar

Staphylococcus sp es el agar sal manitol (medio Chapman), que por su elevado

contenido en sal inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias gramnegativas.

Sin embargo como se muestra en la figura 17, en la experimentación no crecieron

colonias de Staphylococcus sp, este error pudo deberse a una mala preparación del

medio de cultivo.

Para aislar un microorganismo de la naturaleza, se debe conocer previamente los

requerimientos nutricionales y las condiciones ambientales óptimas para su

crecimiento, en la figura 18 se muestra que en la primera asada se obtuvieron una gran

cantidad de colonias, pero en la segunda asada se obtuvo una cantida menor a 300 y

mayor a 30 , siendo esta contabilizada (92 colonias) como se muestra en la figura 19,

estas crecieron en el centro de la placa petri.

VI. CONCLUSIONES

Se logró observar el crecimiento de las bacterias Staphylococcus sp en

medios de cultivo como agar nutritivo inclinado, agar nutritivo vertical y

caldo nutritivo.


Se logró separar colonias con la técnica de estrías, aunque este

experimento presento un error ya que las bacterias Staphylococcus no

debían crecer en el medio con agar MacConkey pero si en el agar

manitol.

Se logró observar colonias individuales con dos asadas a partir del

inóculo de una mezcla de bacterias.

VII. CUESTIONARIO

Ejercicio 1: Técnicas de cultivo de Microorganismos: Características de

crecimiento en medio de cultivo.

1. ¿Por qué algunos microorganismos desarrollan en caldo un característico

crecimiento tipo película? ¿Qué factores ambientales podrían alterar la formación

de una película superficial?

El crecimiento tipo película es la acumulación de los microorganismos que se están

cultivando en la superficie del medio de cultivo, en este caso del caldo nutritivo. Los

microorganismos se acumulan allí por tener respiración tipo aerobia. Al ser el oxígeno

poco soluble en agua no penetra en la totalidad del tubo, y se concentra en la superficie

del medio donde se agrupan los microorganismos, formando la película.

La concentración del oxígeno ambiental que disiparía la acumulación de

microorganismos en la superficie del medio o factores como el aumento de temperatura

pueden también causar la muerte del microorganismo.

2. Cuando utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las características de

crecimiento es preferible inocular con aguja de kölle y no con asa. ¿Por qué?


La aguja de Kölle, a diferencia del asa, facilita el sembrado del inóculo en el agar

debido a que es necesario hacer la estría sobre éste, la cual debe realizase desde la

base hasta el borde del medio, asegurando de este modo el crecimiento de los

microorganismos. Además la cantidad de inóculo debe ser moderada y el asa tiende a

recoger muestras abundantes.

3. Cuando se utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las características

de crecimiento es preferible inocular con aguja de kölle y no con asa ¿Por qué?

¿Qué factores de influirán en la abundancia del crecimiento en caldo, agar

inclinado y agar vertical?

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado

por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por

completo al propio medio.

a) Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener,

como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos

casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento.

Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o

captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de

carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de

estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los

factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es

utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno

y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente

las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros

compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Consistencia adecuada del medio:

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos

como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido

o sólido.


Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos

microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto

de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad,

pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente

extendido en el laboratorio.

b) Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno

normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero

los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una

atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos

microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias

(tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un

metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

c) Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los

cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas

de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la

humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el

medio.

d) Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en

presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los

microorganismos fotosintéticos.

e) pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH

neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar

que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento

bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos

normales.


f) Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y

43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a

temperaturas superiores (hipertermófilos). En líneas generales, los patógenos humanos

crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los

saprófitos tienen rangos más amplios.

g) Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la

aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el

crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios.

El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza

vapor de agua a presión como agente esterilizante)

Ejercicio 2: Técnica de cultivo de Microorganismos: Aislamiento y recuento en

placas

1. ¿Qué procedimiento seguiría a continuación del desarrollo en estos ejercicios

para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? ¿Cómo

podríamos comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las

colonias aisladas?

Luego de tener las colonias aisladas, éstas deben transferirse con el filamento a un

tubo que contenga agar nutritivo estéril para cultivar esa colonia aislada; este

procedimiento se conoce como trasplante. Para garantizar la pureza del cultivo

obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo de colonia aislada, repetir el proceso de

aislamiento antes descrito. Se considerará que se ha obtenido un cultivo puro, cuando

al realizar este proceso, todas las colonias obtenidas presenten las mismas

características. El medio de cultivo utilizado en el proceso de aislamiento dependerá,

entre otros factores, de los requerimientos nutricionales de los microorganismos que se

espera aislar y de la presencia de microorganismos que, por sus características y/o por

la cantidad en que se encuentren en la muestra, dificulten la obtención del

microorganismo objeto del aislamiento. En este último caso, se deben utilizar medios

de enriquecimiento y medios selectivos que inhiban el desarrollo de gérmenes

contaminantes.


La temperatura y otras condiciones de incubación, variarán según los microorganismos,

usualmente la temperatura óptima de los microorganismos patógenos para el hombre

oscila entre 30 y 40ºC. Cuando el microorganismo que se intenta aislar es anaeróbico,

deben tomarse las precauciones necesarias a fin de eliminar la presencia de oxígeno

en el ambiente donde se desarrollará el mismo. Basándose en el origen y naturaleza de

la muestra se pueden inferir los posibles microorganismos que se encuentran

presentes en la misma, y ese conocimiento ayudará en la selección del medio y las

condiciones de cultivo adecuadas. Para iguales fines, es de gran utilidad el

conocimiento de la procedencia de la muestra analizada.

2. ¿Qué factores limitan el tamaño de las colonias en una placa de cultivo?

Existen diversos factores que limitan el tamaño de las colonias en un placa de cultivo;

una de ellas es el pH, dependiendo del rango de pH del medio; el contenido de agua,

influenciar en la forma y tamaño de la colonia; el potencial de óxido reducción; el

contenido nutricional presente en el medio cultivo; los constituyentes antimicrobiales y

las estructuras bilógicas.

3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el

número total de colonias por gramo. Plantee una metodología cuantitativa

basada en diluciones sucesivas para resolver el problema.

El método de recuento en placa consiste en sembrar por duplicado 1 ml de la muestra

liquida o 1ml de la dilución madre en placas Petri estériles. Se repite esta operación en

cada una de las diluciones decimales preparados. Verter 15 ml de agar VRBL a 45ºC,

mezclar y dejar solidificar, preparar de la misma manera una placa testigo, para

controlar la esterilidad del medio, cubrirla con 4ml del mismo medio a 45ºC. Dejar

solidificar e incubar a 30ºC durante 24 a 48 horas.

Se contabiliza las colonias de diámetro mayor o igual a 0.5mm en las placas que

contengan 150 colonias características o de 30 a 300 colonias. Por medio de la

densidad se podrá hallar el número de colonias por gramo.

4. ¿En qué consiste la técnica del número más probable y qué usos tiene?

La estimación por el método del Número Más Probable (NMP) es muy adecuado para

determinar bacterias anaerobias, porque permite mantener un ambiente anaerobio

dentro de los tubos, sin necesitar de sistemas anaerobios más complejos como

cámaras o jarras anaerobias.


El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente

sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para

estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin

embargo, se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de

microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos

contaminados.

El método consiste en la estimación del número de microorganismos viables a partir de

diluciones sucesivas (1/10) partiendo de 1 g de suelo o sedimento en base húmeda o 1

ml de agua; posteriormente, de tres o más de las diluciones se inoculan tubos con

medio de cultivo con sustratos y aceptores de electrones específicos. En este método

se asume que en las series de diluciones los microorganismos se encuentran

distribuidos al azar y que al menos un microorganismo generará crecimiento,

produciendo una respuesta positiva (turbidez, cambio de color, producción de algún

metabolito específico). Esta técnica se basa en la estimación de la densidad bacteriana

por el método estadístico de máxima probabilidad, utilizando la teoría de diluciones.

Para realizar la estimación microbiana se utiliza un mínimo de tres diluciones y un

intervalo de 3 a 10 réplicas (“n” tubos de medio para crecimiento) por dilución; el

número de diluciones y réplicas utilizadas estará en función de la precisión requerida.

Actualmente, existen tablas estándar como las publicadas por la FDA o NACE para

estimar el número de microorganismos más probable. Estas tablas están limitadas a

tres diluciones y a 3, 5 y 10 réplicas por dilución; sin embargo, también existen

programas de computadora (MPN CalculatorTM, “Chem SW”) para obtener la

estimación microbiana empleando más de tres diluciones y un número mayor de

réplicas.

5. ¿De qué manera se pueden preservar cepas puras por largos períodos?

Existen varios métodos para la conservación de los microorganismos-, todos buscan

que las células sufran el daño mínimo y se preserven por el máximo periodo posible.

Los cuatro procedimientos generales son:

La siembra o el subcultivo: Este método consiste en sembrar el microorganismo en

determinado medio de cultivo y, luego, conservarlo en refrigeración. El procedimiento

se debe repetir cada cierto tiempo. Se lleva a cabo en tubos de ensayo con agar

inclinado, o en botellas especiales que contienen un medio de cultivo sólido y estéril.

Una de las desventajas del método es que los tubos guardados en refrigeración se

deshidratan y, entonces el microorganismo muere, por esta razón, es necesario repetir

el procedimiento periódicamente.


Una variación del método consiste en adicionar aceite mineral estéril al tubo o a la

botella con el microorganismo en crecimiento, de tal forma que cubra al agar hasta una

altura de un centímetro y medio, para reducir el metabolismo del microorganismo y la

deshidratación del medio de cultivo.

La desecación: El método consiste en remover el agua celular e impedir la

rehidratación de las células de los microorganismos. Para llevarlo a cabo se inocula

una muestra de cultivo en tierra húmeda estéril (material de soporte), se separa hasta

que haya crecimiento (vatios días) y, luego se seca con aire a vacío. Después, el

cultivo se guarda en una atmósfera seca o en refrigeración. Otros materiales de soporte

pueden ser sílica gel, discos de gelatina y tiras de papel.

Entre las ventajas del método se puede mencionar que no necesita equipo especial ni

mucho personal para ejecutarlo y, si no sufre daños durante la desecación, el cultivo

puede continuar viable por muchos años.

La congelación: La congelación es, al igual que la liofilización, uno de los métodos de

mantenimiento más utilizados, porque se logran los periodos de conservación más

largos (superiores a veinte años, cuando se utiliza nitrógeno líquido).

En el proceso de congelación lo más importante es controlar la velocidad de

disminución de la temperatura, porque, si es muy lenta, los cristales que se forman a

partir del líquido contenido en las células serán muy grandes y pueden romper la

membrana celular.

El proceso de congelación se puede clasificar, con base en la temperatura en la que se

lleva a cabo, en:

Congelación ordinaria: Se mantienen temperaturas de -5 a -20°C.

Congelación ultrafría: Se efectúa en congeladores mecánicos entre -50 y -80°C.

Congelación con nitrógeno líquido: Se logran temperaturas de -150 a -196°C.

La liofilización: Es la remoción de agua de las células congeladas (sólidas) a presión

reducida (sublimación). Para llevar a cabo este procedimiento, se toma una muestra de

cultivo por conservar y se suspende en algún medio con crioprotectores, como leche,

suero o glutamato de sodio. Se transfieren unas gotas de la muestra a una ampolla, se

congela y se somete a alto vacío hasta que el agua celular se sublima (pasa de estado

sólido al gaseoso). Una vez liofilizada la cepa, la ampolla que la contiene se sella para

impedir que el microorganismo se altere por el contacto con el medio ambiente.

6. ¿Qué técnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos

anaeróbicos?


El aislamiento de bacterias anaeróbicas por método de siembra en placa plantea

problemas especiales. Siempre que los organismos en cuestión no mueran

rápidamente al ser expuestos al oxígeno, las placas pueden preparase de la manera

usual y luego incubarse en recipientes, de los cuales se elimina el oxígeno bien sea por

absorción química o por evacuación. Para los anaeróbicos más sensibles al oxígeno,

es preferible una modificación del método de siembra por vertido, denominado cultivo

por dilución y agitación. Un tubo con agar fundido y enfriado se inocula y se mezcla,

aproximadamente la décima parte de su contenido se transfiere a un segundo tubo el

cual se mezcla a su vez y se utiliza para inocular un tercer tubo de la misma manera.

Después de haber preparado de 6 a 10 disoluciones sucesivas, los tubos se enfrían

rápidamente y se encierran herméticamente una forma es verter un capa de vaselina y

parafina, con el fin de evitar el acceso del aire a la columna de agar. En esto cultivos,

las colonias se desarrollan en profundidad dentro de la columna de agar, y por lo tanto

no son tan fácilmente accesibles. Para hacer una transferencia de colonias se elimina

el cierre de vaselina-parafina con una aguja estéril y la columna de agar se extruye del

tubo soplando suavemente una corriente de gas libre de oxígeno a través de una pipeta

capilar introducida entre la pared del tubo y el agar. La columna extruida se recoge en

una placa Petri estéril y se secciona en discos con una cuchilla estéril, a fin de permitir

el examen y transferencia de las colonias.

Muchas bacterias mueren al ser expuestas aunque sólo sea momentáneamente al aire;

por lo tanto, el cultivo con éxito de estos anaerobios estrictos exige medidas

extraordinarias para excluir, en todo momento, incluso trazas de oxígeno.

Habitualmente se utilizan dos técnicas principales para el cultivo de bacterias en

completa ausencia de oxígeno; son las técnicas de tubo rodante y las de la cámara

anaeróbica con guantes. El procedimiento del tubo rodante, desarrollado por R. E.

Hungate, se usa para obtener cultivos puros de anaerobios estrictos distribuyendo

células en una fina capa de agar depositado en la pared de un tubo de ensayo, en

donde se desarrollan como colonias aisladas. El tubo de ensayo contiene unos pocos

mililitros de medio con agar fundido que ha sido reducido químicamente para eliminar el

oxígeno disuelto; el tubo es cerrado herméticamente con un tampón de goma de butilo.

El agar fundido se inocula con diluciones apropiadas de la fuente de baterías,

introduciéndolas a través de los tapones de goma con una jeringa estéril. Los tubos se

depositan luego tumbados sobre hielo y se los hace rodar hasta que el agar se

solidifique formando una capa fina en la pared del tubo.

Después de un periodo de incubación, cuando las colonias son ya visibles, se quita el

tampón y las colonias aisladas se recogen con una aguja o con un tubo capilar.

Siempre que se destapa un tubo, se impide la entrada de aire pasando continuamente

una corriente libre de O2 (normalmente CO2 ó N2) al interior del tubo. Para asegurarse

de que no ha penetrado algo de aire inadvertidamente, se suele incluir en el medio el


colorante sensible al redox resazurina, que vira de incoloro a rojo cuando el Eh alcanza

un valor de -0.042 V.

También pueden aislarse anaerobios estrictos utilizando técnicas convencionales de

siembra por estría en placa, si se realizan todos los procedimientos dentro de una

cámara anaeróbica, que contiene una atmósfera reductora.

VIII. BIBLIOGRAFÍA

HERNANDEZ, A. 2003. Microbiología industrial. Primera edición.

Editorial EUNED. San José, Costa Rica.

KONEMAN, E., Allen, S., Klajn, D. 2006. Diagnostico Microbiológico.

Sexta edición. Editorial Médica Panamericana. Argentina.

MADIGAN M. et al. 2009. Biología de los microorganismos. Brock.

Pearson-Prentice Hall Editorial. 12a edición. Madrid.

PAHISSA, A. 2009. Infecciones producidas por Staphylococcus aureus.

Primera edición. Barcelona (España).

ROJAS, A. 2011. Conceptos y práctica de microbiología general.

Universidad Nacional de Colombia. Palmira.

SWANSON M. J. Katherine, Ruth L. Petran, y John H. Hanlin. 2001.

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods-

Chapter 6. American Public Health Association. 4th edition. Editado por:

Frances Pouch Downes y Keith Ito. Washington.

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