n biofilm o biopelícula es unecosistema microbiano organi-zado, formado por conjuntos decélulas microbianas inmoviliza-

das sobre una superficie viva o inerte yembebidas en una matriz exopoliméricaque sintetizan los propios microorganis-mos. Se forma cuando las células planc-tónicas se adhieren a una superficie osustrato, formando una comunidad quese caracteriza por la secreción de una ma-triz extracelular adhesiva protectora. Enun biofilm maduro entre un 5% y un 25%de su volumen está ocupado por célulasy entre un 75% y un 95% por la matriz ex-tracelular de exopolímeros. Los biofilmssuelen estar formados simultáneamentepor varias especies microbianas, entre lasque se encuentran bacterias, mohos, al-gas, levaduras y protozoos.

Aunque cuando nos referimos a los mi-croorganismos es frecuente pensar en or-ganismos que viven libres en un ecosis-tema y aunque la mayoría de estudiosmicrobiológicos se han basado en elcomportamiento de cultivos bacterianospuros obtenidos a partir de microorga-nismos libres o planctónicos, la realidades que la mayor parte de los microorga-nismos se encuentran en el medio am-biente formando parte de biofilms.

La matriz extracelular de un biofilmestá formada por exopolímeros (EPS) quegeneran los propios microorganismos. Setrata de una mezcla limosa y adhesivaque produce el anclaje de los microorga-nismos a la superficie y está formadaprincipalmente por polisacáridos, glico-proteínas (proteínas unidas a uno o va-rios hidratos de carbono), proteínas li-bres, etc.

Se distinguen las siguientes etapas en laformación de un biofilm (figura 1):� Adhesión reversible de microorganis-

mos a la superficie, producida por ad-sorción por atracciones electrostáticasdel tipo de fuerzas de Van der Waals.

� Adhesión irreversible de los microor-ganismos, en la que se produce el an-claje a la superficie por apéndicesbacterianos, se habla ya de células sé-siles. El tiempo necesario para este tipode adhesión es muy corto: desde unossegundos a unos minutos.

� Multiplicación de las células microbia-nas y formación de microcolonias, cre-cimiento del biofilm y producción deexopolímeros. Esta fase puede produ-cirse en unas horas o en unos días.

� Crecimiento y dispersión del biofilm,que incluye el desarrollo del biofilm, laformación de canales o intersticios conagua, la captura de otros microorga-nismos y de partículas de suciedad ynutrientes, así como el desprendi-miento de células y de partes del bio-film. La formación de un biofilmmaduro es un proceso que necesita dedías a semanas.El mecanismo conocido como quorum

sensing es importante para la formacióndel biofilm, ya que permite a las bacteriasdifundir una señal sobre el medio en elque se encuentran y modificar su com-portamiento en función de la concentra-ción que existe de esta señal. Cuanto ma-yor sea la población de bacterias, mayorserá la concentración de estas señales ycuando se alcanza una concentraciónumbral, la población ha llegado al quo-rum y se empiezan a expresar una seriede genes, lo que desata acciones pobla-cionales concertadas, tales como la ge-neración de exopolímeros.

Para la formación de biofilms es nece-saria la presencia de agua o humedad so-bre las superficies. En las industrias ali-mentarias las películas e incrustacionesde suciedad constituyen un sustrato muyadecuado para la formación de biofilms.Si las superficies son porosas, rugosas oestán rayadas, los microorganismos seadhieren con mayor facilidad a todas lassuperficies que se encuentran en una sala

Ante la necesidad de disponerrenuevas técnicas rápidas,selectivas y sencillas que facilitenel control de la contaminación porbiofilms, Betelgeux ha llevado acabo un proyecto de investigacióny desarrollo, en colaboración conel Departamento de Tecnología delos Alimentos de la UniversidadComplutense de Madrid y elcentro tecnológico Ainia. Esteproyecto, subvencionado por elCDTI, ha estado enfocado aldesarrollo de nuevas herramientaspara la detección y eliminación debiofilms que mejoren lassoluciones disponiblesactualmente para el control de lacontaminación por biofilms

Enrique J. Orihuel Iranzo. ConsejeroDelegado de Betelgeux SL.Ponencia presentada en la Jornada sobreSalas Blancas II, organizada por ANICE ycelebrada en Madrid el 21 de marzo de2012.

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Nuevas herramientas para ladetección y la eliminación debiofilms

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blanca: acero inoxidable, teflón, plásti-cos, cintas transportadoras, etc.

El biofilm les proporciona a los micro-organismos estabilidad, nutrientes y es-pacio, facilitando su supervivencia y pro-liferación y brindándoles un entornoprotegido, húmedo y rico en nutrientes.El biofilm es, por tanto, una forma de de-fensa de los microorganismos frente alentorno: dificulta la acción de los pro-ductos biocidas y proporciona una de-fensa frente a la desecación, contribu-yendo a que sobrevivan en condicionesdesfavorables.

La colonia, en división continua, liberaperiódicamente microorganismos y si lascondiciones lo permiten, el movimientodel agua libera unas pocas células. Conflujo intenso o turbulento se pueden in-cluso desenganchar partes enteras delbiofilm, que colonizarán otras superficies.

Problemáticas asociadas a los biofilmsLa formación de biofilms se ve favore-cida por un diseño higiénico inadecuado,un deficiente programa de limpieza ydesinfección o por un mal manteni-miento de los materiales e instalaciones.

En las salas blancas los biofilms consti-tuyen reservorios de microorganismosque pueden contaminar alimentos e ins-talaciones y pueden ocasionar diversosproblemas:

� Tecnológicos, como obstrucción deconductos, corrosión, disminución dela transferencia energética, etc.

� Calidad del producto alimenticio, ayu-dando a la proliferación de micro-

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Figura 1. Etapas en la formación de un biofilm.

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organismos alterantes que afectan alaspecto, vida útil y a las propiedadesorganolépticas.

� Seguridad alimentaria, por la prolifera-ción y resistencia de microorganismospatógenos, ya que el biofilm actúacomo reservorio de patógenos comoListeria o Salmonella. La presencia de biofilms en una sala

blanca, provoca la disminución de la efi-cacia de los productos desinfectantes. Laresistencia de las bacterias a los desin-fectantes es mayor en los biofilms quecuando se encuentran en suspensión y sedebe a procesos de adaptación o toleran-cia de las células al agente antimicro-biano, pero también a la dificultad de ac-ceso del biocida hasta el interior delbiofilm, que se produce muy lentamentepor el mecanismo de difusión. Como se

observa en la figura 2, el desinfectante,coloreado en amarillo, penetra en las ca-pas superficiales del biofilm, pero no llegahasta las células más profundas o llega aconcentraciones subletales.

Estos fenómenos de adaptación, tole-rancia y exposición a concentraciones su-bletales, unidos a la protección frente acondiciones adversas que proporciona elbiofilm, favorecen el desarrollo de cepaspersistentes de microorganismos pató-genos. Este es un fenómeno ampliamenteobservado en las plantas procesadorasde alimentos, en el que un número limi-tado de células de patógenos pueden es-tablecerse y persistir durante años. En elcuadro I se recogen algunos casos des-critos en la bibliografía, de cepas persis-tentes de Listeria monocytogenes en in-dustrias cárnicas.

Las cepas persistentes, una vez des-arrolladas, se adhieren a las superficies yforman biofilms más fácilmente que lascepas esporádicas, lo que sugiere que laadherencia a superficies es importantepara la supervivencia y la persistencia delas mismas. La recolonización agrava es-tos problemas y puede ocurrir, por ejem-plo, en operaciones de limpieza con pre-siones elevadas, que pueden arrancarpartes de biofilm y enviarlas a otros pun-tos de la instalación, y también en la partesuperior de instalaciones en altura (comotuberías), donde se forman biofilms quepueden desprenderse, caer sobre otra su-perficie y recolonizarla.

Detección de biofilmsLa detección de los biofilms es impres-cindible para poder aplicar estrategiaseficaces para su control, aunque presentavarias dificultades: � a) Los biofilms son de tamaño micros-

cópico, y no pueden detectarse a sim-ple vista.

� b) Su detección exige usualmente mé-todos lentos y complejos.

� c) Las técnicas de detección suelen ca-recer de la especificidad necesaria, yaque detectan células y no el biofilm.Normalmente la detección de biofilms

implica la toma de muestras de las su-perficies y el análisis de las mismas pormedida de bioluminiscencia del ATP, quecuantifica las células presentes indepen-dientemente de que sean viables o no, opor recuento microbiológico que reflejalas células viables presentes. En cualquiercaso se trata de técnicas no específicas, yaque están orientadas a la detección derestos celulares o microorganismos via-bles, independientemente del estado desu asociación, por lo que se hace necesa-rio disponer de nuevas técnicas rápidas,selectivas y sencillas que faciliten el con-trol de la contaminación por biofilms.

Con el objetivo de cubrir estas necesi-dades, Betelgeux ha llevado a cabo unproyecto de investigación y desarrollo, encolaboración con el Departamento deTecnología de los Alimentos de la Uni-versidad Complutense de Madrid y elcentro tecnológico Ainia. Este proyecto,subvencionado por el CDTI, ha estadoenfocado al desarrollo de nuevas herra-mientas para la detección y eliminaciónde biofilms que mejoren las solucionesdisponibles actualmente para el controlde la contaminación por biofilms. El di-seño de una técnica para la detección se-lectiva de biofilms se basó en el empleo

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Figura 2. Difusión de un agente antimicrobiano a través de la matriz de un biofilm.

Figura 3. La aplicación y posterior aclarado del producto TBF 300 en una superficie de acerorevela la presencia de biofilm por medio de una coloración permanente y detectable a simple vista.

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de agentes de tinción capaces de teñir lamatriz extracelular que forma parte de laestructura de los biofilms. Estos coloran-tes se seleccionaron en función de su ca-pacidad para teñir biofilms formados poralgunos de los patógenos más comunesen la industria alimentaria (Pseudomo-nas fluorescens, Bacillus aureus, Staphy-lococcus aureus, Salmonella enteriditis yListeria monocytogenes) y la ausencia decoloración en presencia de residuos ha-bituales en las industrias alimentarias(grasa, proteínas, aceites, etc.). Asimismo,se desarrolló un sistema para la aplica-ción de estos agentes de tinción sobre lassuperficies en forma de espuma, con elobjetivo de facilitar la aplicación en unárea de muestreo determinada y asegurarel tiempo de contacto necesario para latinción del biofilm.

La identificación de la presencia debiofilms se produce tras el aclarado conagua de la superficie analizada, elimi-nando la espuma colorante y revelandozonas de crecimiento de biofilm quemuestran una coloración permanente decolor fucsia (figura 3). Como resultadode este proyecto, ya se encuentra dispo-

nible el test de detección de biofilms TBF300, una novedosa herramienta que per-mite la detección rápida (no más de cincominutos), sencilla y selectiva de biofilmsen superficies como acero, aluminio o te-flón, con un coste inferior a otras técnicascomo la bioluminiscencia de ATP o elcultivo de placas. Este producto se ha en-sayado en diversas industrias alimenta-rias, demostrando ser una herramientamuy útil para la identificación rápida depuntos donde la limpieza y desinfecciónno ha conseguido eliminar los biofilmspresentes y que requieren una higieniza-ción más exhaustiva. TBF 300 se presentaen envases de 150 ml, que permitenmuestrear alrededor de 300 puntos (áreade muestreo recomendada de 10 cm2),

resultando así adecuado para su utiliza-ción rutinaria como parte del plan decontrol de la limpieza y desinfección delas instalaciones.

EliminaciónLas dificultades para la eliminación debiofilms están asociadas con la natura-leza de los mismos. Su velocidad de for-mación (apenas unas horas en condicio-nes favorables), la adaptación y toleranciaa los desinfectantes habituales, el creci-miento en lugares de difícil acceso y sucapacidad de propagación (recoloniza-ción), unidos a su “invisibilidad”, dificul-tan las medidas de control para evitar suformación y eliminarlos una vez forma-dos.

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Cuadro I. Contaminación por L. monocytogenes persistente en industria cárnica (Lundén, 2004).

Industria Duración Referencia

Planta de procesado 4 años Nesbakken et al. 1996

Matadero y sala de despiece 1 año Giovannacci et al. 1999

Planta de procesado 2 años Senczek et al. 2000

Planta de procesado 3 meses Chasseignaux et al. 2001

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El uso de equipos sin rincones inacce-sibles, construidos con materiales lisos yno porosos, las limpiezas mecánicas delas superficies por fregado manual, evi-tando la utilización de estropajos o cepi-llos abrasivos que rayen las superficies, larotación de productos desinfectantes, asícomo los análisis microbiológicos fre-cuentes y sistemáticos de las superficies yla detección de la matriz del biofilms, sonestrategias imprescindibles para evitar laformación de biofilms maduros en salasblancas de procesado de alimentos. Sin

embargo, cuando el biofilm maduro ya seha formado, son necesarias técnicas yproductos específicos para su elimina-ción.

La eliminación de biofilms madurosimplica disgregar la matriz extracelular,venciendo las fuerzas de adherencia quela mantienen unida a las superficies, yeliminar los microorganismos conteni-dos en el biofilm. Para ello se necesitan: � Productos específicos que actúen

sobre las células y sobre la matriz delbiofilm.

� Energía mecánica en forma de fregado(manual o automático), proyección deagua a presión, proyección de CO2 só-lido o pellets de hielo. Entre los productos específicos se en-

cuentran los formulados enzimáticos,que son combinaciones de enzimas ami-lasas, lipasas y proteasas que catalizan ladisociación de las exopolímeros que for-man la matriz de los biofilms, junto contensioactivos, que aumentan el podermojante y de penetración del productosobre las superficies. Como una alterna-tiva más económica a los productos debase enzimática, Betelgeux ha desarro-llado dos nuevas formulaciones quími-cas, que han resultado muy efectivas parala disgregación de la matriz del biofilm yla eliminación de las células bacterianas.

Estos productos deben ser empleadosentre las fases de limpieza y desinfección,con el objetivo de conseguir una degra-dación eficaz de la matriz protectora enausencia de residuos y permitir el accesodel desinfectante a los microorganismos,facilitando su eliminación. En la figura 4se esquematiza la acción de estos pro-ductos (Betelene BF31 y Betelene BF31EC) sobre el biofilm. Los componentesde estos productos son de base química yayudan a desprender la matriz de la su-perficie a la que está adherido, tienen unefecto biocida sobre las células, degra-dan la matriz de exopolímeros y desesta-bilizan e inhiben el crecimiento.

En la figura 5 se comprueba el efectodel producto Betelene BF31 sobre el bio-film. Se ha utilizado una tinción vital, deforma que las células vivas aparecen encolor verde mientras que las célulasmuertas adquieren una coloraciónpardo-rojiza. Después de la inmersión auna dosis del 5% (peso/volumen) se ob-serva que se han eliminado totalmentelas células y se ha conseguido un des-prendimiento del 55% de la biomasa delbiofilm. Tras enjuague con agua a bajapresión, se consigue el desprendimientodel 99% de la biomasa del biofilm.

La utilización periódica en salas blan-cas de productos específicos para la eli-minación de biofilms, unida a la detec-ción frecuente de la presencia de biofilmsen las superficies e instalaciones, son fun-damentales para prevenir el crecimientode los mismos y deben ser implantadascomo mecanismos para la mejora de lascondiciones higiénicas en las instalacio-nes y para la protección de los productoscárnicos frente a patógenos alimenta-rios.�

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Figura 4. Mecanismo de acción de los componentes del producto Betelene BF31 sobre el biofilm.

Figura 5. Acción de Betelene BF31 sobre un biofilm de Pseudomonas.

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