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GENERALIDADES DE LAS TÉCNICAS UTILIZADAS EN HISTOLOGÍA El objetivo de un curso de histología es conducir al estudiante a comprender la microanatomía de las células, los tejidos y los órganos y a correlacionar la estructura con la función Las técnicas utilizadas por los histólogos son diver- sas en extremo. La mayor parte de los contenidos de un curso de histología se puede formular en los términos de la microscopia óptica, que los estudiantes manejan en las prácticas de laboratorio, pero la interpretación más detallada de la microanatomía se fundamenta en la microscopia electrónica (ME), tanto con el microscopio electrónico de transmisión (MET) como con el micros- copio electrónico de barrido (MEB). La ME, dado su aumento más útil y su resolución mayor, suele ser el último paso en la adquisición de datos al que se recu- rre entre las muchas técnicas auxiliares de la biología celular y molecular. Estas técnicas auxiliares incluyen: 1 1 1 Técnica histológica y microscopia GENERALIDADES DE LAS TÉCNICAS UTILIZADAS EN HISTOLOGÍA | 1 PREPARACIÓN DEL TEJIDO | 2 Tinción con hematoxilina y eosina de muestras fijadas en formalina | 2 Otros fijadores | 3 Otras técnicas de tinción | 5 HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA | 5 Composición química de las muestras histológicas | 5 Fundamentos químicos de la coloración | 6 Colorantes ácidos y básicos | 6 Metacromasia | 7 Grupos aldehído y el reactivo de Schiff | 7 Digestión enzimática | 8 Histoquímica enzimática | 9 Inmunocitoquímica | 9 Técnicas de hibridación | 12 Radioautografía | 13 MICROSCOPIA | 13 Microscopia óptica | 13 Examen de un preparado histológico con el microscopio óptico | 15 Otros sistemas ópticos | 19 Microscopia electrónica | 21 Microscopia de fuerza atómica | 24 R e c u a d r o 1 . 1 Correlación clínica: biopsias por congelación | 4 R e c u a d r o 1 . 2 Consideraciones funcionales: microespectrofotometría de Feulgen | 8 R e c u a d r o 1 . 3 Correlación clínica: anticuerpos monoclonales en medicina | 10 R e c u a d r o 1 . 4 Uso correcto del microscopio óptico | 16 R e c u a d r o 1 . 5 Consideraciones funcionales: desarrollo de la microscopia electrónica | 23 Histología ©2012. Editorial Médica Panamericana

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� GENERALIDADES DE LASTÉCNICAS UTILIZADAS ENHISTOLOGÍA

El objetivo de un curso de histología es conduciral estudiante a comprender la microanatomía delas células, los tejidos y los órganos y a correlacionar la estructura con la función

Las técnicas utilizadas por los histólogos son diver-sas en extremo. La mayor parte de los contenidos de un

curso de histología se puede formular en los términosde la microscopia óptica, que los estudiantes manejanen las prácticas de laboratorio, pero la interpretaciónmás detallada de la microanatomía se fundamenta en lamicroscopia electrónica (ME), tanto con el microscopioelectrónico de transmisión (MET) como con el micros-copio electrónico de barrido (MEB). La ME, dado suaumento más útil y su resolución mayor, suele ser elúltimo paso en la adquisición de datos al que se recu-rre entre las muchas técnicas auxiliares de la biologíacelular y molecular. Estas técnicas auxiliares incluyen: 1

11Técnica histológica y microscopia

� GENERALIDADES DE LAS TÉCNICAS UTILIZADAS EN HISTOLOGÍA | 1� PREPARACIÓN DEL TEJIDO | 2

Tinción con hematoxilina y eosina de muestras fijadas en formalina | 2Otros fijadores | 3Otras técnicas de tinción | 5

� HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA | 5Composición química de las muestras histológicas | 5Fundamentos químicos de la coloración | 6Colorantes ácidos y básicos | 6Metacromasia | 7Grupos aldehído y el reactivo de Schiff | 7Digestión enzimática | 8Histoquímica enzimática | 9Inmunocitoquímica | 9Técnicas de hibridación | 12Radioautografía | 13

� MICROSCOPIA | 13Microscopia óptica | 13Examen de un preparado histológico con el microscopio óptico | 15Otros sistemas ópticos | 19Microscopia electrónica | 21Microscopia de fuerza atómica | 24

Recuadro 1.1 Correlación clínica: biopsias por congelación | 4Recuadro 1.2 Consideraciones funcionales: microespectrofotometría de Feulgen | 8Recuadro 1.3 Correlación clínica: anticuerpos monoclonales en medicina | 10Recuadro 1.4 Uso correcto del microscopio óptico | 16Recuadro 1.5 Consideraciones funcionales: desarrollo de la microscopia electrónica | 23

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• Histoquímica y citoquímica.• Inmunocitoquímica y técnicas de hibridación.• Radioautografía.• Cultivo de tejidos y órganos.• Separación de células y orgánulos por centrifugación

diferencial.• Microscopios y técnicas microscópicas especializadas.

Es posible que los estudiantes se sientan distantes deestas técnicas y procedimientos experimentales porquelos programas actuales de la asignatura no suelen con-templar una experiencia directa con ellos. Sin embargo,es importante saber algo acerca de los procedimientosespecializados y los datos que proporcionan. En este capí-tulo se presenta un panorama general de estas técnicas y unaexplicación de la forma en que los datos aportados por ellaspueden ayudar al estudiante a comprender mejor la estruc-tura y la función de las células, los tejidos y los órganos.

Uno de los problemas que enfrentan los estudiantesen histología es comprender la naturaleza de la imagenbidimensional de un preparado histológico o unamicrofotografía electrónica y la forma en que esta serelaciona con la estructura tridimensional de la cualproviene. Para salvar esta brecha conceptual primerotenemos que presentar una breve descripción de lastécnicas utilizadas para preparar los cortes histológicostanto de la microscopia óptica como de la microscopiaelectrónica.

� PREPARACIÓN DEL TEJIDO

Tinción con hematoxilina y eosinade muestras fijadas en formalina

El corte de rutina teñido con hematoxilina y eosinaes la muestra que más frecuentemente se estudia

La caja de preparados que se entrega a cada estu-diante para que examine bajo el microscopio ópticocontiene principalmente especímenes fijados en forma-lina, incluidos en parafina y coloreados con hematoxi-lina y eosina (H-E). Casi todas las microfotografías ópti-cas que se presentan en las secciones del atlas de estelibro son de preparados de estas mismas cajas. Además,la mayoría de las microfotografías utilizadas para ilus-trar tejidos y órganos en las clases teóricas de histolo-gía y en conferencias se obtienen de estos preparados.A veces se usan otras técnicas para demostrar compo-nentes específicos de las células y los tejidos; varias deestas técnicas se describen más adelante.

El primer paso en la preparación de una muestrade tejido u órgano es la fijación para conservar laestructura

La fijación, en general obtenida mediante el empleode sustancias químicas individuales o mezclas de estas

sustancias, conserva la estructura del tejido en formapermanente para permitir el tratamiento ulterior. Lasmuestras tienen que sumergirse en el fijador inmedia-tamente después de extraerse del organismo. La fijaciónse utiliza para:

• Abolir el metabolismo celular.• Impedir la degradación enzimática de las células y

los tejidos por autólisis (autodigestión).• Destruir los microorganismos patógenos como las

bacterias, los hongos o los virus.• Endurecer el tejido como consecuencia de la forma-

ción de enlaces cruzados o la desnaturalización delas moléculas proteicas.

El fijador de uso más común es la formalina, unasolución acuosa de formaldehído al 37%, en dilucionesvariadas y en combinación con otras sustancias quími-cas y amortiguadores (buffers). El formaldehído preser-va la estructura general de la célula y de los componen-tes extracelulares al reaccionar con los grupos amino delas proteínas (con mucha frecuencia forma enlaces cru-zados entre residuos de lisina). Dado que el formaldehí-do no altera en forma significativa su estructura tridi-mensional, las proteínas mantienen su capacidad dereaccionar con anticuerpos específicos. Esta propiedades importante en los métodos de tinción inmunocitoquí-mica (véase p. 9). La solución comercial estándar de for-maldehído amortiguado con fosfatos (pH 7) actúa conbastante lentitud pero penetra bien en el tejido. Sinembargo, el formaldehído no reacciona con los lípidosy, por lo tanto, es un mal fijador de las membranas.

En el segundo paso la muestra se dispone para suinclusión en parafina con el fin de permitir su corte

Para poder examinar la muestra hay que infiltrarlacon un medio de inclusión que permita realizar cortesmuy delgados, típicamente de 5 a 15 μm (1 micróme-tro [μm] equivale a la milésima parte de un milímetro;véase cuadro 1.1). Luego de la fijación la muestra se lavay se deshidrata en una serie de soluciones alcohólicasde concentración creciente hasta alcanzar alcohol al100%. En el paso siguiente, el aclarado, se utilizan sol-ventes orgánicos como xileno o tolueno, que son mis-cibles tanto en alcohol como en parafina, para extraer

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Equivalencias en las medidas de longitud

CUADRO 1.1

1 picómetro = 0,01 angstroms (Å)

1 angstrom = 0,1 nanómetro (nm)

10 angstroms = 1,0 nanómetro

1 nanómetro = 1 000 picómetros

1 000 nanómetros = 1,0 micrómetro (μm)

1 000 micrómetros = 1,0 milímetro (mm)

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el alcohol al 100% antes de la infiltración de la mues-tra con parafina fundida.

Cuando la parafina fundida se ha enfriado y endu-recido se empareja para formar un bloque de tamañoadecuado. Este bloque, llamado taco, se coloca enton-ces en una máquina cortadora especial, el micrótomo,que lo corta en rebanadas finas con una cuchilla deacero. Luego los cortes obtenidos se montan sobre por-taobjetos de vidrio a los que antes se les habrá añadi-do una pequeña cantidad de albúmina para que sirvade adhesivo.

En el tercer paso, la muestra se tiñe para permitirsu examen

Dado que los cortes en parafina son incoloros, lamuestra todavía no está lista para su examen bajo elmicroscopio óptico. Para colorear o teñir los cortes his-tológicos la parafina debe disolverse y extraerse, denuevo con xileno o tolueno, y los tejidos deben rehi-dratarse mediante el uso de una serie de alcoholes deconcentración decreciente. Luego el tejido colocadosobre los portaobjetos se tiñe con hematoxilina en agua.Como el colorante de contraste, eosina, es más solubleen alcohol que en agua, se vuelve a deshidratar lamuestra en soluciones alcohólicas de concentracióncreciente y después se tiñe con eosina en alcohol. Losresultados de la tinción con hematoxilina sola, con eosi-na sola y con ambos colorantes se muestran en la figu-ra 1.1. Luego de la coloración la muestra se hace pasarpor xileno o tolueno y se le coloca un medio de mon-

taje no acuoso antes de cubrirla con un cubreobjetospara lograr un preparado permanente.

Otros fijadores

La formalina no preserva todos los componentesde las células y los tejidos

Aunque los cortes de muestras fijadas en formalinateñidos con H-E son convenientes porque permiten verbien las características estructurales generales, no sonespecíficos para dilucidar la composición química delos elementos constitutivos de las células. Además,muchos componentes se pierden durante la prepara-ción de la muestra. Para conservar estos componentesy estructuras hay que utilizar otros métodos de fijación.Estos métodos se fundamentan en un conocimientosólido de la química. Por ejemplo, los alcoholes y lossolventes orgánicos que se usan en los preparados derutina diluyen los lípidos neutros.

Para conservar los lípidos neutros, como los de lascélulas adiposas, deben utilizarse cortes por congelaciónde tejido fijado en formalina y colorantes que se disuel-van en las grasas; para conservar estructuras de la mem-brana hay que usar fijadores especiales con metalespesados, como permanganato y osmio, que se unan alos fosfolípidos. El empleo de rutina de tetróxido deosmio como fijador en la microscopia electrónica es larazón principal del excelente estado de conservación delas membranas en las microfotografías electrónicas.

� Preparación del tejido�

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FIGURA 1.1. Coloración con hematoxilina y eosina (H-E). Las tres imágenes que se presentan aquí correspon-den a cortes de páncreas seriados (adyacentes) para demostrar el efecto de la hematoxilina y la eosina utilizadas solas ocombinadas. a. En esta microfotografía se ve una coloración con hematoxilina sola. Si bien hay una tinción general de lamuestra, los componentes y estructuras con gran afinidad por el colorante se tiñen con una intensidad mucho mayor, porejemplo, DNA nuclear y RNA citoplasmático. b. De manera similar la eosina (colorante de contraste), cuando se usa sola,consigue una tinción general de los tejidos, como puede verse en esta microfotografía. Sin embargo, obsérvese que losnúcleos son menos conspicuos que en la muestra teñida sólo con hematoxilina. Después de colorear la muestra con hema-toxilina y de prepararla para su tinción con eosina en solución alcohólica, la hematoxilina que no estaba unida con firme-za se lava y entonces la eosina tiñe los componentes con los que tiene gran afinidad. c. En esta microfotografía puedenverse los efectos tintoriales combinados de ambos colorantes (H-E). 480 ×.

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A veces el patólogo necesita evaluar de inmediato eltejido obtenido durante el acto quirúrgico, en especialcuando el diagnóstico anatomopatológico instantáneopuede determinar el paso siguiente en la cirugía. Hayvarias indicaciones para realizar este tipo de evaluación,que se conoce como biopsia por congelación. Es muyfrecuente que un cirujano solicite una biopsia por conge-lación en el quirófano cuando no cuenta con un diagnós-tico preoperatorio o debe identificar hallazgos intraopera-torios inesperados. Además, es posible que el cirujanoquiera saber si se ha extirpado toda la masa patológicadentro del limite del tejido sano y si el borde de la resec-ción quirúrgica está libre de tejido enfermo. Las biopsiaspor congelación también se realizan en combinación conotros procedimientos, como la endoscopia o la biopsia conaguja fina, para confirmar si el material biópsico obtenidoserá útil en estudios anatomopatológicos adicionales.

Para realizar una biopsia por congelación se siguen trespasos principales:

• Congelación de la muestra de tejido. Se congelanmuestras de tejido de tamaño pequeño mediante eluso de anhídrido carbónico comprimido o la inmersiónen un líquido frío (isopentano) a una temperatura de

−50 °C. El congelamiento, que puede lograrse en unacámara refrigeradora muy eficiente, endurece el tejidoy permite el corte con un micrótomo.

• Corte del tejido congelado. El corte suele realizarsedentro de un crióstato, una cámara refrigerada quecontiene un micrótomo. Dado que el tejido está con-gelado y duro, puede cortarse en rebanadas muy finas(5 a 10 μm). Luego los cortes se montan sobre un por-taobjetos de vidrio.

• Tinción de los cortes. La tinción se realiza para dife-renciar los núcleos celulares del resto de las estructurasdel tejido. Los tinciones de uso más frecuente para lasbiopsias por congelación son H-E, azul de metileno(fig. 1.2) y PAS.

Todo el proceso de preparación y evaluación de lasbiopsias por congelación puede tardar unos 10 minutosen completarse. El tiempo total que transcurre hasta laobtención de resultados depende sobre todo del tiempode transporte del tejido desde el quirófano hasta el labo-ratorio de anatomopatología, de la técnica histopatológi-ca utilizada y de la experiencia del patólogo. Los hallazgosse comunican directamente al cirujano que está esperan-do en el quirófano.

Recuadro 1.1 Correlación clínica: biopsias por congelación

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FIGURA 1.2. Evaluación de una muestra obtenida durante el acto quirúrgico y preparada median-te la técnica de congelación. a. En esta microfotografía se ve una muestra obtenida del intestino grueso que sepreparó mediante la técnica de congelación y se tiñó con azul de metileno (biopsia por congelación). 160 ×. b. Parte dela muestra se fijó en formalina y se procesó con una técnica de rutina que comprende la coloración con H-E (biopsia dife-rida). El examen de la biopsia por congelación permitió comprobar que el tejido era normal. El diagnóstico se confirmódespués mediante el examen del preparado de rutina teñido con H-E. 180 ×. (Gentileza del Dr. Daniel W. Visscher.)

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Otras técnicas de tinción

La hematoxilina y la eosina se utilizan en histología principalmente para poner en evidencialas características estructurales

A pesar de los méritos de la tinción con H-E, esteprocedimiento no permite ver en forma adecuada cier-tos componentes estructurales de los cortes histológi-cos, a saber, elastina, fibras reticulares, membranasbasales y lípidos. Cuando se desea estudiar estos com-ponentes pueden utilizarse otros métodos de tinción,en su mayoría selectivos, que incluyen la coloración conorceína y fucsina-resorcina para el material elástico y laimpregnación argéntica para las fibras reticulares y lasmembranas basales. Pese a que el fundamento químicode muchos no siempre se comprende, estos procedi-mientos sirven. En cualquier caso, es más importantesaber lo que el método permite observar que conocersu mecanismo íntimo de acción.

� HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA

Los procedimientos químicos específicos puedenproveer información detallada acerca de la funciónde las células y los componentes extracelulares delos tejidos

Los métodos histoquímicos y citoquímicos puedentener su fundamento en la unión específica de un colo-rante, el uso de anticuerpos marcados con un coloran-te fluorescente dirigidos contra un componente celularen particular o la actividad enzimática inherente de unelemento constitutivo de las células. Además, muchasmacromoléculas presentes en las células pueden detec-tarse por medio de la radioautografía, en la cual precur-sores moleculares marcados radiactivamente se incor-poran a las células y los tejidos antes de la fijación.Muchos de estos procedimientos pueden usarse en pre-parados tanto para la microscopia óptica como para lamicroscopia electrónica.

Antes de comentar la química de las tinciones derutina y de las técnicas histoquímicas y citoquímicasconviene describir brevemente la índole de un cortehistológico común.

Composición química de las muestras histológicas

La composición química de un tejido listo parauna coloración de rutina es muy diferente de ladel tejido vivo

Los componentes que perduran luego de la fijaciónson principalmente moléculas grandes que no se disuel-

ven con facilidad, en especial después de aplicar el fija-dor. Estas moléculas grandes, en particular las que reac-cionan con otras moléculas semejantes para formarcomplejos macromoleculares, son las que suelen conser-varse en un corte histológico. Los siguientes son ejem-plos de estos complejos macromoleculares grandes:

• Nucleoproteínas, formadas por ácidos nucleicos uni-dos a proteínas.

• Proteínas intracelulares del citoesqueleto en comple-jo con otras proteínas.

• Proteínas extracelulares en grandes aglomeracionesinsolubles, en las que moléculas vecinas semejantesse unen a través de enlaces cruzados, como ocurreen la formación de las fibras colágenas.

• Complejos de fosfolípidos y proteínas (o carbohidra-tos) en las membranas.

En su mayor parte estas moléculas constituyen laestructura de las células y los tejidos, dado que son loselementos morfogénicos hísticos. Constituyen la base dela organización de los tejidos visible con el microscopio.

En muchos casos un elemento estructural es almismo tiempo una unidad funcional. Por ejemplo, en elcaso de las proteínas que forman los filamentos con-tráctiles de las células musculares, estos filamentos sonlos componentes estructurales visibles y además parti-cipan en el proceso de contracción. El RNA del cito-plasma aparece como parte de un componente estruc-tural (ergastoplasma de las células glandulares,sustancia de Nissl de las neuronas) y al mismo tiempoes un participante activo en la síntesis de proteínas.

Muchos componentes de los tejidos desaparecendurante la preparación de los cortes teñidos con H-E

A pesar de que la mayor parte de los ácidos nuclei-cos, las proteínas y los fosfolípidos se conservan en loscortes histológicos, muchos también se pierden. Las pro-teínas pequeñas y los ácidos nucleicos pequeños, comolos RNA de transferencia, en general se pierden durantela preparación del tejido. Como se mencionó antes, lossolventes orgánicos utilizados durante la técnica histoló-gica suelen disolver los lípidos neutros. También puedenperderse otras moléculas grandes, por ejemplo al serhidrolizadas como consecuencia del pH desfavorable delas soluciones fijadoras. Los que siguen son ejemplos demacromoléculas que se pierden durante la fijación derutina en fijadores acuosos:

• Glucógeno (carbohidrato de almacenamiento intrace-lular común en el hígado y las células musculares).

• Proteoglucanos y glucosaminoglucanos (carbohidra-tos complejos extracelulares hallados en el tejidoconjuntivo).Sin embargo, estas moléculas pueden conservarse si

se utilizan fijadores no acuosos para el glucógeno o si

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a la solución fijadora se le añaden agentes ligadoresespeciales que preserven las moléculas extracelularescon carbohidratos abundantes. Además, como ya secomentó, durante la preparación de rutina también sue-len perderse los lípidos neutros porque los solventesorgánicos los disuelven.

Los componentes solubles, los iones y las molécu-las pequeñas también desaparecen durante la pre-paración de las muestras incluidas en parafina

Durante la preparación de las muestras de rutinaque se incluyen en parafina y luego se tiñen con H-Ese pierden metabolitos intermedios, glucosa, sodio,cloro y sustancias similares. Muchas de estas sustanciaspueden estudiarse en preparados especiales, en ocasio-nes con una pérdida considerable de la integridadestructural. Estos iones y pequeñas moléculas solublesno constituyen elementos morfogénicos hísticos sinoque participan en los procesos de síntesis o en las reac-ciones celulares. Cuando se conservan y pueden detec-tarse por métodos específicos aportan informaciónvaliosísima sobre el metabolismo, el transporte activo yotros procesos vitales de las células. El agua, una molé-cula muy versátil, participa en estas reacciones y pro-cesos y contribuye a la estabilización de la estructuramacromolecular a través de enlaces de hidrógeno.

Fundamentos químicos de la coloraciónColorantes ácidos y básicos

La hematoxilina y la eosina son los colorantes deuso más frecuente en la histología

Un colorante ácido, como la eosina, tiene una carganeta negativa en su parte coloreada y se describe con lafórmula general (Na+ anilina−).

Un colorante básico tiene una carga neta positiva ensu parte coloreada y se describe con la fórmula general(anilina+Cl−).

Desde el punto de vista estructural la hematoxilinano es un colorante básico, pero tiene propiedades tin-toriales muy semejantes a las de las anilinas básicas. Elcolor de una anilina no se relaciona con el hecho deque sea ácida o básica, como lo demuestran los ejem-plos que se presentan en el cuadro 1.2.

Los colorantes básicos reaccionan con los compo-nentes aniónicos de las células y los tejidos (com-ponentes que tienen una carga neta negativa)

Entre los componentes aniónicos se encuentran losgrupos fosfato de los ácidos nucleicos, los grupos sul-fato de los glucosaminoglucanos y los grupos carboxilode las proteínas. La capacidad de estos grupos anióni-cos de reaccionar con una anilina o colorante básico se

denomina basofilia (gr. basis + philein, amar, es decirque tiene afinidad por lo básico). Los componentes deltejido que se tiñen con la hematoxilina también exhi-ben basofilia.

La reacción de los grupos aniónicos varía según elpH. Así:

• Con un pH alto (de cerca de 10) los tres grupos seionizan y quedan disponibles para la reacción con elcolorante básico por medio de uniones electrostáticas.

• Con un pH ligeramente ácido a neutro (de 5 a 7) seionizan los grupos fosfato y sulfato y quedan dispo-nibles para reaccionar con la anilina básica a travésde uniones electrostáticas.

• Con un pH bajo (inferior a 4) sólo se mantienenionizados los grupos sulfato para reaccionar con loscolorantes básicos.

En consecuencia, la tinción con colorantes básicosen un pH determinado puede utilizarse para centrar elestudio en grupos aniónicos específicos y como estosaniones específicos predominan en ciertas macromolé-culas, la tinción sirve como indicador de estas macro-moléculas.

Como ya se mencionó, la hematoxilina no es uncolorante básico en sentido estricto. Se usa con un mor-diente (es decir un intermediario entre el componentedel tejido y la anilina) y es por la acción del mordien-te que la coloración con hematoxilina se parece a la tin-ción que produce un colorante básico. La unión en elcomplejo tejido-mordiente-hematoxilina no consiste enun simple enlace electrostático y cuando la hematoxili-na se coloca en agua no se disocia del tejido. Por eso lahematoxilina se presta para aquellos procedimientostintoriales en los que es seguida por soluciones acuosasde colorantes ácidos. Los colorantes básicos verdade-ros, a diferencia de la hematoxilina, no suelen usarse ensecuencias en las que la anilina básica es seguida poruna anilina ácida. Entonces la anilina básica tiende adisociarse del tejido durante los lavados en solucionesacuosas que se realizan entre la aplicación de ambassoluciones colorantes.

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Algunos colorantes básicos y ácidosCUADRO 1.2

Colorante

Colorantes básicos

Verde de metilo

Azul de metileno

Pironina G

Azul de toluidina

Colorantes ácidos

Fucsina ácida

Azul de anilina

Eosina

Naranja G

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Los colorantes ácidos reaccionan con los gruposcatiónicos de las células y los tejidos, en particularcon los grupos amino ionizados de las proteínas

La reacción de los grupos catiónicos con un coloran-te ácido recibe el nombre de acidofilia (lat. acidus + gr.philein, amar, o sea que tiene afinidad por lo ácido). Lasreacciones de los componentes celulares e hísticos conlos colorantes ácidos no son tan específicas ni tan pre-cisas como las reacciones con los colorantes básicos.

Aunque el enlace electrostático es el factor principalen la unión primaria de un colorante ácido con el teji-do, no es el único; debido a ello, los colorantes ácidosa veces se utilizan combinados para teñir en formaselectiva distintos componentes de los tejidos. Por ejem-plo, en la técnica tricrómica de Mallory se usan trescolorantes ácidos: azul de anilina, fucsina ácida y naran-ja G. Estos colorantes tiñen con selectividad el colágeno,el citoplasma en general y los eritrocitos, respectivamen-te. La fucsina ácida también tiñe los núcleos.

En otras técnicas con anilinas ácidas múltiples seemplea la hematoxilina para teñir primero los núcleos yluego se aplican los colorantes ácidos con el fin de teñirselectivamente el citoplasma y las fibras extracelulares. Latinción selectiva de los componentes de los tejidos por loscolorantes ácidos se debe a factores relativos, como eltamaño y el grado de acumulación de las moléculas delcolorante y la permeabilidad y densidad del tejido.

Los colorantes básicos también pueden utilizarsecombinados o secuencialmente (p. ej., verde de metiloy pironina para estudiar la síntesis y la secreción deproteínas), pero estas combinaciones no son de uso tandifundido como las de los colorantes ácidos.

Una cantidad limitada de sustancias dentro de lascélulas y en la matriz extracelular presenta basofilia

Entre estas sustancias figuran:

• Heterocromatina y nucléolos del núcleo (principal-mente por los grupos fosfato ionizados en los ácidosnucleicos de ambos).

• Componentes citoplasmáticos como el ergastoplasma(también por los grupos fosfato ionizados en el RNAribosómico).

• Material extracelular como los carbohidratos com-plejos de la matriz cartilaginosa (por los grupos sul-fato ionizados).

La tinción con colorantes ácidos es menos especí-fica pero más sustancias dentro de las células yen la matriz extracelular presentan acidofilia

Estas sustancias incluyen:

• La mayoría de los filamentos citoplasmáticos, enespecial los de las células musculares.

• La mayoría de los componentes membranosos intra-celulares y gran parte del citoplasma no especializa-do de otro modo.

• La mayoría de las fibras extracelulares (principal-mente por los grupos amino ionizados).

Metacromasia

Ciertos colorantes básicos reaccionan con compo-nentes hísticos que hacen cambiar su color nor-mal del azul al rojo o al púrpura; esta modifica-ción de la absorbancia se denomina metacromasia

El mecanismo básico de la metacromasia es la pre-sencia de polianiones en el tejido. Cuando estos teji-dos se tiñen con una solución colorante básica con-centrada, como la de azul de toluidina, las moléculasde la anilina están lo suficientemente cerca como paraformar aglomeraciones diméricas y poliméricas. Laspropiedades de absorción de estas aglomeraciones sondiferentes de las de las moléculas de colorante indivi-duales no aglomeradas.

Las estructuras de las células y los tejidos con unaalta concentración de grupos sulfato y fosfato ioniza-dos, como la sustancia fundamental del cartílago, losgránulos de heparina de los mastocitos y el retículoendoplasmático rugoso de los plasmocitos, muestranmetacromasia. En consecuencia, el azul de toluidinase verá púrpura o rojo cuando tiña estos componen-tes.

Grupos aldehído y el reactivo de Schiff

La capacidad de la fucsina básica decolorada(reactivo de Schiff) de reaccionar con los gruposaldehído da como resultado la aparición de uncolor rojo distintivo y es la base de las reaccionesdel PAS (ácido peryódico-reactivo de Schiff) y deFeulgen

La reacción del PAS (ácido peryódico-reactivo deSchiff ) tiñe carbohidratos y macromoléculas conabundancia de carbohidratos. Se usa para detectarglucógeno en las células, moco en varios tipos decélulas y tejidos, la membrana basal que se encuentradebajo de los epitelios y las fibras reticulares del teji-do conjuntivo. La reacción de Feulgen, que incluyeuna hidrólisis ácida débil con HCl, se utiliza parateñir DNA.

Los fundamentos de la reacción del PAS son lossiguientes:

• Los anillos de las hexosas (carbohidratos) poseencarbonos adyacentes, cada uno de ellos con ungrupo hidroxilo (−OH).

• Las hexosaminas de los glucosaminoglucanos tam-

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bién poseen carbonos adyacentes, pero con alternan-cia de grupos hidroxilo (−OH) y grupos amino (−NH2).

• El ácido peryódico rompe la unión entre estos áto-mos de carbono adyacentes y forma grupos alde-hído.

• Estos grupos aldehído reaccionan con el reactivo deSchiff para dar un color púrpura intenso distintivo.

La tinción con PAS de la membrana basal (fig. 1.3)y las fibras reticulares tiene su fundamento en el con-tenido o la asociación de proteoglucanos (carbohidra-tos complejos asociados con un centro de proteína).Esta tinción es una alternativa de las técnicas deimpregnación argéntica, que también tienen como basela reacción con las moléculas de sacáridos de los pro-teoglucanos.

La reacción de Feulgen separa las purinas de lasdesoxirribosas del DNA por medio de una hidrólisisácida débil; entonces se abren los anillos de monosa-cárido y se forman grupos aldehído. De nuevo, sonlos grupos aldehído de formación reciente los quereaccionan con el reactivo de Schiff para dar el colorrojo púrpura característico. La reacción del reactivode Schiff con el DNA es estequiométrica y por lotanto, puede usarse en métodos espectrofotométricospara cuantificar el DNA en el núcleo de una célula. ElRNA no se tiñe con el reactivo de Schiff porque notiene desoxirribosa.

Digestión enzimática

La digestión enzimática de un corte adyacente aotro teñido para identificar un componente especí-fico, como glucógeno, DNA o RNA, puede ser útilpara confirmar la identidad del material que se tiñe

El material intracelular que se tiñe con la reaccióndel PAS puede identificarse como glucógeno mediante

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FIGURA 1.3. Microfotografía de tejido renalteñido con la técnica del PAS. Esta técnica histoquí-mica sirve para demostrar y localizar carbohidratos ymacromoléculas con carbohidratos abundantes. Las mem-branas basales son PAS positivas, como es obvio por sucoloración rojo púrpura intensa. Los túbulos renales (T) seencuentran bien delineados por la membrana basal teñidaque los rodea. Los capilares glomerulares (C) y el epitelio dela cápsula de Bowman (BC) también poseen membranasbasales PAS positivas. 360 ×.

La microespectrofotometría de Feulgen es una téc-nica que fue ideada para el estudio de los aumentosdel DNA en las células en desarrollo y para analizar laploidía, es decir la cantidad de veces que está multi-plicado el contenido normal de DNA en una célula (sedice que una célula somática normal que no se estádividiendo es diploide; en cambio, los espermatozoi-des y los óvulos son haploides). Para cuantificar elDNA nuclear se utilizan dos técnicas, la citometríaestática para cortes de tejido y la citometría de flujopara células aisladas. La técnica de la citometría está-tica de cortes de tumores teñidos con el método deFeulgen se vale de la microespectrofotometría acopla-da con un sistema de visualización digital para cuanti-ficar la absorción de luz con una longitud de onda de560 nm por parte de las células y las aglomeracionescelulares. En cambio, la técnica de la citometría deflujo se basa en el empleo de instrumentos capaces derastrear sólo células individuales que fluyen ante undetector en un medio líquido. Esta técnica permite elanálisis cuantitativo rápido de una célula individualsobre la base de la medición de la luz fluorescente emi-tida. En la actualidad la microespectrofotometría deFeulgen se utiliza para estudiar los cambios del conte-nido de DNA de las células en división que se estándiferenciando. Además, se la emplea en la práctica clí-nica para analizar la cantidad anormal de cromosomas(es decir los patrones de ploidía) en las células malig-nas. Se dice que las células malignas con un patrónmayoritariamente diploide están bien diferenciadas yque los tumores con estos tipos de células tienen unpronóstico más favorable que los mismos tumores concélulas aneuploides (con múltiplos no enteros de lacantidad haploide de DNA) o tetraploides. La microes-pectrofotometría de Feulgen ha sido de particular uti-lidad en estudios de adenocarcinomas específicos(tumores del epitelio glandular), cáncer de mama, cán-cer de riñón, cánceres de colon y de otras partes deltubo digestivo, cáncer del endometrio (mucosa delútero) y cáncer ovárico. Es una de las herramientasmás valiosas que los patólogos utilizan para evaluar lapotencialidad metastásica de estos tumores y paratomar decisiones pronósticas o terapéuticas.

Recuadro 1.2 Consideraciones funcionales:microespectrofotometría de Feulgen

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el tratamiento previo de los cortes con diastasa o ami-lasa. La falta de tinción después de este tratamientoidentifica con positividad que el material teñido es glu-cógeno.

De modo similar, el pretratamiento de los cortes his-tológicos con desoxirribonucleasa (DNAsa) evitará latinción con la reacción de Feulgen en esos cortes y eltratamiento de muestras de epitelios secretores de pro-teínas con ribonucleasa (RNAsa) impedirá la tinción del ergastoplasma con los colorantes básicos.

Histoquímica enzimática

Las técnicas histoquímicas también se utilizanpara identificar y localizar enzimas en células y tejidos

Para localizar enzimas en los cortes histológicos debetenerse especial cuidado durante la fijación para que sepreserve la actividad enzimática. La fijación aldehídicadébil suele ser el método preferido.

En estos procedimientos se detecta el producto de lareacción de la actividad enzimática y no la enzima pro-piamente dicha. En general se usa un reactivo de cap-tura, que puede ser un colorante o un metal pesado,para atrapar o fijar el producto de la reacción de laenzima mediante precipitación en el sitio de la reac-ción. En una reacción típica para detectar una enzimahidrolítica, el corte histológico se coloca en una solu-ción que contiene un sustrato (AB) y un agente de atra-pamiento (T) que precipitará uno de los productoscomo sigue:

enzimaAB + T ⎯⎯⎯⎯⎯⎯→ AT + B

en donde AT es el producto final atrapado y B es el sus-trato hidrolizado.

Mediante el uso de este tipo de técnicas se pudoequiparar el lisosoma, identificado por primera vez enestudios celulares de centrifugación diferencial, con uncomponente vacuolar visible en las microfotografíaselectrónicas. En los tejidos sometidos a una fijacióndébil las hidrolasas ácidas y las esterasas contenidas enlos lisosomas reaccionan con un sustrato adecuado. Lamezcla reactiva también contiene iones de plomo paraprecipitar, por ejemplo, fosfato de plomo derivado de laacción de la fosfatasa ácida. Luego el producto de reac-ción precipitado puede verse tanto con microscopiaóptica como con microscopia electrónica.

Se han desarrollado procedimientos histoquímicossimilares para microscopia óptica y electrónica con elfin de demostrar fosfatasa alcalina, adenosina trifosfa-tasas (ATPasas) de varios tipos (incluida la NA+/K+-ATPasa que es el fundamento enzimático de la bombade sodio en células y tejidos), diversas esterasas ymuchas enzimas respiratorias (fig. 1.4).

Inmunocitoquímica

El fundamento de la inmunocitoquímica es laespecificidad de la reacción entre un antígeno y un anticuerpo

Los anticuerpos, también llamados inmunoglobuli-nas, son glucoproteínas producidas por células especí-ficas del sistema inmunitario en respuesta a una prote-ína extraña o antígeno. En el laboratorio los anticuerpospueden purificarse de la sangre y conjugarse (asociar-se) con un colorante fluorescente. En general los colo-rantes fluorescentes (fluorocromos) son sustancias quí-micas que absorben luz de longitudes de ondadiferentes (p. ej., luz ultravioleta) y luego emiten luzvisible de una longitud de onda específica (p. ej., verde,amarillo, rojo). La fluoresceína, el colorante de uso másfrecuente, absorbe la luz ultravioleta y emite luz verde.Los anticuerpos conjugados con fluoresceína puedenaplicarse a cortes de tejido (tanto obtenidos por conge-lación como provenientes de muestras sometidas a unafijación leve) sobre portaobjetos de vidrio para localizar

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FIGURA 1.4. Procedimiento histoquímico parala localización de ATPasa en la membrana decélulas epiteliales de vesícula biliar de conejoen la microscopia electrónica. Las regiones oscu-ras que se ven en la microfotografía electrónica señalanla localización de la enzima ATPasa. Esta enzima se detec-ta en la membrana plasmática de las regiones laterales delas células epiteliales, lo cual concuerda con la ubicaciónde las bombas de sodio. Estas células epiteliales realizanun transporte activo de moléculas a través de la membra-na plasmática. 26 000 ×.

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un antígeno en las células y los tejidos. Luego la reac-ción del anticuerpo con el antígeno puede examinarsey fotografiarse con un microscopio de fluorescencia oun microscopio confocal que produce una reconstruc-ción tridimensional del tejido examinado (fig. 1.5).

En la inmunocitoquímica se utilizan dos tipos deanticuerpos: anticuerpos policlonales producidospor animales inmunizados y anticuerpos monoclonales producidos por líneas celulares productoras de anticuerpos inmortalizadas (de duplicación continua)

En un procedimiento típico una proteína específica,como por ejemplo la actina, se aísla de las células mus-culares de una especie (p. ej., rata) y se inyecta en lacirculación de otra especie (p. ej., conejo). En el cone-jo inmunizado el sistema inmunitario reconoce como

antígenos extraños las moléculas de actina de la rata.Este reconocimiento desencadena una cascada de reac-ciones inmunológicas que comprende muchos grupos(clones) de células inmunitarias llamadas linfocitos B.La clonación de los linfocitos B conduce finalmente a laproducción de anticuerpos antiactina. En conjunto,estos anticuerpos policlonales son mezclas de anticuer-pos diferentes producidos por muchos clones de linfo-citos B en las que cada clon reconoce una región dife-rente de la molécula de actina. Luego estos anticuerposse extraen de la sangre, se purifican y se conjugan conun colorante fluorescente, después de lo cual puedenusarse para la detección de moléculas de actina en lostejidos o las células de rata. Si hay actina en una célu-la o en un tejido, por ejemplo en un fibroblasto del teji-do conjuntivo, el anticuerpo marcado con fluoresceínase le une y la reacción puede verse con el microscopiode fluorescencia.

Los anticuerpos monoclonales son los sintetizadospor una línea celular productora de anticuerpos com-puesta por un solo grupo (clon) de linfocitos B idénti-cos. El clon individual que se convierte en una líneacelular se obtiene de un sujeto con mieloma múltiple,un tumor derivado de un solo plasmocito productor deanticuerpos. Los sujetos con mieloma múltiple produ-cen una población grande de anticuerpos homogéneosidénticos con una especificidad idéntica contra un antí-geno. Para producir anticuerpos monoclonales contraun antígeno específico se inmuniza con ese antígeno aun ratón o a una rata. Luego se aíslan del tejido linfáti-co (bazo o ganglios linfáticos) del animal los linfocitosB activados y se fusionan con la línea celular de mielo-ma. Esta fusión produce un hibridoma, una línea celu-lar secretora de un anticuerpo individual inmortalizada.

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FIGURA 1.5. Imagen de microscopia confocal deuna célula muscular cardíaca de rata. Esta imagense obtuvo con el microscopio confocal mediante el uso dela técnica de inmunofluorescencia indirecta. Se utilizarondos anticuerpos primarios. El primer anticuerpo primarioreconoce un transportador de lactato específico (MCT1) yse detecta con un anticuerpo secundario conjugado conrodamina (rojo). El segundo anticuerpo primario está dirigi-do contra la proteína transmembrana CD147, que tieneuna asociación estrecha con el MCT1. Este anticuerpo sedetectó mediante un anticuerpo secundario marcado confluoresceína (verde). El color amarillo aparece en los sitiosen los que los dos anticuerpos secundarios marcados tienenexactamente la misma localización (es decir, se colocalizan)dentro de la célula muscular cardíaca. Esta imagen tridi-mensional muestra que ambas proteínas están distribuidasen la superficie de la célula muscular, mientras que el trans-portador de lactato solo (color rojo) aparece en una ubica-ción profunda con respecto a la membrana plasmática.(Gentileza de los doctores Andrew P. Halestrap y CatherineHeddle.)

En la actualidad los anticuerpos monoclonalesse utilizan mucho en las técnicas de inmunocitoquími-ca y también tienen muchas aplicaciones clínicas. Losanticuerpos monoclonales conjugados con compues-tos radiactivos se utilizan para detectar y diagnosticarmetástasis tumorales en patología, para diferenciarsubtipos de tumores y sus etapas de diferenciación y,en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas,para identificar los microorganismos en la sangre y enlos líquidos hísticos. En estudios clínicos recientes, sehan usado anticuerpos monoclonales conjugados coninmunotoxinas, agentes quimioterápicos y radioisóto-pos para hacer llegar agentes terapéuticos a célulastumorales específicas del organismo.

Recuadro 1.3 Correlación clínica: anticuerposmonoclonales en medicina

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Para obtener anticuerpos monoclonales contra molécu-las de actina de rata, por ejemplo los linfocitos B de losórganos linfáticos de conejos inmunizados tienen quefusionarse con células de mieloma.

Para localizar un antígeno diana en células y tejidos se utilizan métodos inmunocitoquímicostanto directos como indirectos

La técnica de inmunocitoquímica más antigua que seutiliza para identificar la distribución de un antígenodentro de las células y los tejidos se conoce comoinmunofluorescencia directa. Esta técnica se vale de unanticuerpo primario (policlonal o monoclonal) marca-do con fluorocromo que reacciona con el antígeno den-tro de la muestra (fig. 1.6a). Es un procedimiento de unsolo paso y comprende un solo anticuerpo marcado. Lavisualización de las estructuras no es ideal a causa dela poca intensidad de la emisión de la señal. Dada lasensibilidad subóptima, los métodos de inmunofluores-cencia directa están siendo reemplazados cada vez máspor los métodos indirectos.

La inmunofluorescencia indirecta tiene una sensibili-dad mucho mayor que los métodos directos y con fre-cuencia recibe el nombre de “técnica del emparedado”o “de la capa doble”. En vez de conjugar un fluorocro-mo con un anticuerpo (primario) específico dirigidocontra el antígeno de interés (p. ej., una molécula deactina de rata), el fluorocromo se conjuga con un anti-

cuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo prima-rio (p. ej., anticuerpo de cabra antirrata; fig. 1.6b). Porlo tanto, cuando la fluoresceína se conjuga directamen-te con el anticuerpo primario específico el método esdirecto y cuando la fluoresceína se conjuga con un anti-cuerpo secundario el método es indirecto. El métodoindirecto aumenta en forma considerable la señal fluo-rescente emitida por el tejido. Una ventaja adicional delmétodo de marcación indirecta es que un solo anticuer-po secundario puede usarse para localizar la unión his-toespecífica de varios anticuerpos primarios diferentes(fig. 1.7). Para los estudios microscópicos el anticuerposecundario puede conjugarse con colorantes fluorescen-tes distintos de modo que en el mismo corte de tejidoaparezcan marcas múltiples (véase fig. 1.5). Las desven-tajas de la inmunofluorescencia indirecta son que escara, que requiere mucho trabajo y que no se adaptacon facilidad a los procedimientos automatizados.

También es posible conjugar anticuerpos policlona-les o monoclonales con otras sustancias, como enzimas(p. ej., peroxidasa de rábano), que convierten sustratosincoloros en un producto insoluble de un color especí-fico que se precipita en el sitio de la reacción enzimá-tica. La tinción resultante de este método de inmunope-roxidasa puede verse en el microscopio óptico contécnicas inmunocitoquímicas directas o indirectas. Enotra variante, con la molécula de anticuerpo puede con-jugarse oro coloidal o ferritina (una molécula que con-

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INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

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bFIGURA 1.6. Inmunofluorescencia directa e indirecta. a. En la inmunofluorescencia directa un anticuerpo pri-mario marcado con un fluorocromo reacciona con un antígeno específico dentro de la muestra de tejido. Luego las estruc-turas marcadas se examinan con el microscopio de fluorescencia, en el cual una longitud de onda excitadora (por lo gene-ral, luz ultravioleta) desencadena la emisión de otra longitud de onda. Esta longitud de onda depende de la índole delfluorocromo utilizado para marcar el anticuerpo. b. El método indirecto comprende dos procesos. Primero, los anticuerposprimarios específicos reaccionan con el antígeno de interés. Segundo, los anticuerpos secundarios, que están marcados confluorocromo, reaccionan con los anticuerpos primarios. La apariencia de las estructuras marcadas dentro del tejido es lamisma en ambos métodos y para verlas se necesita un microscopio de fluorescencia.

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tiene hierro). Estos marcadores pueden verse directa-mente con el microscopio electrónico.

Técnicas de hibridación

La hibridación es un método para localizar mRNAo DNA mediante la hibridación de la secuencia deinterés con una sonda de nucleótidos de secuenciacomplementaria

En general el término hibridación describe la capa-cidad de las moléculas monocatenarias de DNA o RNAde interaccionar (hibridarse) con secuencias comple-mentarias. En el laboratorio la hibridación requiere elaislamiento del DNA o del RNA, que luego se mezclacon una secuencia de nucleótidos complementaria (lla-mada sonda de nucleótidos). Con mucha frecuencia loshíbridos se detectan mediante el uso de una marcaradiactiva adherida a uno de los componentes delhíbrido.

La unión de la sonda y la secuencia puede ocurrir enuna solución o en una membrana de nitrocelulosa. En lahibridación in situ la unión de la sonda de nucleótidoscon la secuencia de DNA o RNA de interés se producedentro de las células o los tejidos, como células de cul-tivo o embriones enteros. Esta técnica permite la loca-lización de secuencias de nucleótidos específicas tanpequeñas como 10 o 20 copias de mRNA o DNA porcélula.

En la hibridación in situ se utilizan varias sondas denucleótidos. Las sondas de oligonucleótidos puedentener entre 20 y 40 nucleótidos como mínimo. Las son-das de DNA monocatenario o bicatenario son muchomás largas y pueden contener hasta 1 000 nucleótidos.Para la localización específica de mRNA se utilizan son-das de RNA complementarias. Estas sondas se marcancon isótopos radiactivos (p. ej., 32P, 35S, 3H), un nucle-ótido modificado en forma específica (digoxigenina) obiotina (un marcador multipropósito covalente usadocon mucha frecuencia). Las sondas radiactivas puedendetectarse y visualizarse mediante la radioautografía. Ladigoxigenina y la biotina se detectan con métodosinmunocitoquímicos y citoquímicos, respectivamente.

La fuerza de los enlaces entre la sonda y la secuen-cia complementaria depende del tipo de ácido nucleicoen las dos cadenas. El enlace más fuerte se forma entreuna sonda de DNA y una cadena de DNA complemen-taria y el más débil entre una sonda de RNA y unacadena de RNA complementaria. Si se espera que unamuestra de tejido contenga una cantidad muy pequeñade mRNA o un transcrito viral, puede usarse la ampli-ficación de la reacción en cadena de la polimerasa(PCR) para el DNA o la PCR con transcriptasa inversa(RT-PCR) para el RNA. Los transcritos amplificados quese obtienen durante estos procedimientos suelen detec-tarse mediante el uso de sondas de nucleótidos com-plementarias marcadas en técnicas de hibridación insitu estándares.

Recientemente se han combinado colorantes fluores-centes con sondas de nucleótidos, lo que posibilitó lavisualización de muchas sondas al mismo tiempo (fig.1.8). Esta técnica, llamada técnica FISH (hibridación insitu con fluorescencia), tiene un uso muy difundido enclínica para las pruebas genéticas. Por ejemplo, la hibri-dación de una sonda con cromosomas en metafasepuede usarse para identificar la posición cromosómicade un gen. La técnica FISH se utiliza para examinarsimultáneamente los cromosomas, la expresión génica yla distribución de los productos génicos, como proteí-nas anormales o patológicas. En la actualidad están dis-ponibles en el mercado muchas sondas fluorescentesespecíficas que se utilizan en la práctica clínica para losprocedimientos de detección del cáncer de cuello ute-rino y para la detección de células infectadas por HIV.La técnica FISH también puede usarse para examinarlos cromosomas de los linfocitos de los astronautas con

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FIGURA 1.7. Microtúbulos vistos con técnicasinmunocitoquímicas. El comportamiento de los micro-túbulos (elementos del citoesqueleto) obtenidos de célulasde tumores mamarios humanos puede estudiarse in vitromediante la cuantificación de su actividad de nucleación,que es iniciada por el centrosoma. Esta imagen se obtuvocon el microscopio de fluorescencia. Mediante el uso detécnicas de inmunofluorescencia indirecta se marcaron losmicrotúbulos con una mezcla de anticuerpos monoclonalesanti-α-tubulina y anti-β-tubulina (anticuerpos primarios) yse hicieron visibles por la acción de anticuerpos secundariosconjugados con el colorante fluoresceína (inmunoglobulinaG de cabra antirratón unida a isotiocianato de fluoresceí-na). La reacción antígeno-anticuerpo realizada directamen-te sobre el cubreobjetos de vidrio permitió ver las molécu-las de tubulina responsables de la formación de los más de120 microtúbulos que aparecen en esta imagen. Estosmicrotúbulos se originan en el centríolo y se extiendenhacia fuera de él unos 20 a 25 μm para adquirir una distri-bución radial uniforme. 1 400 ×. (La microfotografía es gen-tileza de la Dra. Wilma L. Lingle y la Sra. Vivian A. Negron.)

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el fin de calcular la dosis de radiación absorbida porellos durante su estadía en el espacio. La frecuencia delas translocaciones cromosómicas en los linfocitos esproporcional a la dosis de radiación absorbida.

Radioautografía

En la radioautografía se utiliza una emulsión fotográfica colocada sobre un corte histológicopara localizar material radiactivo en los tejidos

Muchos precursores moleculares pequeños de molé-culas más grandes, como los aminoácidos que integranlas proteínas y los nucleótidos que forman los ácidosnucleicos, pueden marcarse mediante la incorporaciónde uno o varios átomos radiactivos a su estructuramolecular. Luego se investiga la radiactividad paradetectar las moléculas más grandes en las células y lostejidos. Las moléculas precursoras marcadas puedeninyectarse en animales vivos o introducirse en células uórganos de cultivo. De este modo se han estudiado lasíntesis del DNA y la ulterior división celular, la sínte-sis y secreción de las proteínas por las células y la ubi-cación de los productos de síntesis dentro de las célu-las y en la matriz extracelular.

Los cortes de las muestras que han incorporado elmaterial radiactivo se montan en portaobjetos. En la

oscuridad el portaobjetos suele sumergirse brevemen-te en una emulsión fotográfica fundida de manera quese forme una delgada película fotográfica sobre susuperficie. Luego de la exposición adecuada en unacámara oscura, en general durante un período de díasa semanas, la emulsión expuesta se revela con las téc-nicas fotográficas comunes y el portaobjetos con lamuestra se preserva siempre sellándolo con un cubre-objetos. Los preparados se pueden teñir antes de laexposición y el revelado o después. Mediante este pro-cedimiento se exponen y revelan los gránulos de plataen la emulsión sobre las moléculas marcadas conmaterial radiactivo; los gránulos aparecen como pun-tos oscuros en el sitio de emisión radiactiva cuando lamuestra se examina con el microscopio óptico (fig.1.9a).

Estos gránulos pueden usarse sencillamente comoindicadores de la localización de una sustancia perotambién pueden contarse para obtener informaciónsemicuantitativa acerca de la cantidad de una sustanciadada en un sitio específico. Por ejemplo, después deinyectarle timidina tritiada a un animal las células quehayan incorporado este nucleótido en su DNA antes dedividirse pero que todavía no hayan sufrido la mitosistendrán alrededor del doble de gránulos de plata sobresus núcleos que las células que se hayan dividido des-pués de incorporar el nucleótido marcado.

La radioautografía también puede practicarse sobrecortes finos de material incluido en plástico para suobservación con el microscopio electrónico. En esenciase usan las mismas técnicas pero, como ocurre contodos los métodos de preparación para el MET, los pro-cedimientos son mucho más delicados y difíciles; noobstante, también permiten lograr una resoluciónmucho mayor y una detección más precisa (fig. 1.9b).

� MICROSCOPIA

Microscopia óptica

Un microscopio, sea simple (una sola lente) o com-puesto (lentes múltiples), es un instrumento queaumenta el tamaño de una imagen y permite ver másdetalles que los que sería posible visualizar a simplevista. El microscopio más sencillo es una lupa o un parde gafas o anteojos para leer.

El poder de resolución del ojo humano, o sea la dis-tancia que debe haber entre dos objetos para que sevean separados y no parezcan uno solo (0,2 mm), estádeterminado por el espacio que hay entre las célulasfotorreceptoras contiguas de la retina. La función de unmicroscopio es ampliar una imagen hasta un grado enel cual la retina pueda resolver la información que deotro modo estaría por debajo de su límite de resolu-ción. En el cuadro 1.3 se compara la resolución del ojohumano con la de microscopios diversos.

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FIGURA 1.8. Ejemplo de la técnica de hibrida-ción in situ con fluorescencia (FISH) utilizada enuna prueba de detección prenatal. Se hibridaronnúcleos en interfase de células obtenidas de muestras delíquido amniótico con dos sondas de DNA específicas. Lasonda de color naranja (LSI 21) es específica de locus parael cromosoma 21 y la sonda de color verde (LSI 13) es espe-cífica de locus para el cromosoma 13. El núcleo de la dere-cha proviene de una muestra de líquido amniótico normaly exhibe dos señales verdes y dos naranjas, lo que indicaque hay dos copias de los cromosomas 13 y 21, respectiva-mente. El núcleo de la izquierda posee tres señales de colornaranja, lo que indica una trisomía del cromosoma 21 (sín-drome de Down). El DNA se ha teñido de azul con un colo-rante de contraste inespecífico (DAPI) para tornar visible elnúcleo. 1 250 ×. (Gentileza del Dr. Robert B. Jenkins.)

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El poder de resolución es la capacidad de unalente o sistema óptico del microscopio de producirimágenes separadas de objetos que están muycerca uno de otro

La resolución no depende sólo del sistema óptico sinotambién de la longitud de onda de la luz y de otros fac-tores, como por ejemplo el espesor de la muestra, la cali-dad de su fijación y la intensidad con la que está teñida.Con una luz cuya longitud de onda fuera de 540 nm(véase cuadro 1.1), una luz proveniente de un filtro verdea la cual el ojo es muy sensible, y con lentes objetivo ycondensadora adecuadas, la máxima resolución alcanza-ble sería de 0,2 μm (en la página 17 se describe el méto-do para calcularla). Esta es la resolución teórica y, como

ya se mencionó, depende de que todas las condicionessean óptimas. La lente ocular aumenta la imagen producidapor la lente objetivo, pero no puede aumentar la resolución.

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FIGURA 1.9. Ejemplos de radioautografía en microscopia óptica y electrónica. a. Microfotografía de uncorte de ganglio linfático de un animal al que se le administró timidina tritiada (3H). En algunas de las células se ven aglo-meraciones de gránulos de plata metálica con el aspecto de pequeñas partículas negras (flechas). Estas células han sinteti-zado DNA en preparación para la división celular y han incorporado la [3H]timidina en el DNA recién formado. Con el tiem-po las partículas radiactivas de baja energía emitidas por la [3H]timidina chocan contra los cristales de haluro de plata deuna emulsión fotográfica que cubre la muestra (exposición) y crean una imagen latente (como hace la luz al incidir sobrela película de una cámara fotográfica). Durante el revelado del portaobjetos cubierto con la emulsión la imagen latente,que no es otra cosa que el haluro de plata activado, se torna visible porque la sal se reduce a plata metálica, la que apare-ce como gránulos negros en el examen microscópico. 1 200 ×. (El preparado original es gentileza del Dr. Ernst Kallenbach.)b. Radioautografía microscópica electrónica de la región apical de una célula absortiva intestinal. Para realizar este estudiose le inyectó a un animal 125I unido a factor de crecimiento nervioso (NGF) y 1 hora después se extrajo la muestra de teji-do, que luego se preparó de manera semejante a la que se utiliza para la microscopia óptica. El tamaño relativamentepequeño de los gránulos de plata contribuye a la localización precisa de los complejos 125I-NGF. Obsérvese que los gránu-los de plata se concentran en las invaginaciones apicales (inv) y en las siluetas tubulares endosómicas tempranas (tub). 32 000 ×. (La microfotografía electrónica es gentileza de la Dra. Marian R. Neutra.)

Resolución del ojo en comparacióncon la de los microscopios

CUADRO 1.3

Distancia entre los puntos que se resuelven

Ojo humano

Microscopio óptico de campo claro

MEB

METEn la teoríaEn la práctica

Microscopio de fuerza atómica

0,2 mm

0,2 μm

2,5 nm

0,05 nm1,0 nm

50 pm

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En la investigación biológica moderna se dispone dediversos microscopios ópticos para el uso general oespecializado. Sus diferencias radican principalmente enfactores como la longitud de onda con que se iluminala muestra, la alteración física de la luz que llega a lamuestra o que emana de ella y los procesos analíticosespecíficos que puedan aplicarse a la imagen final. Acontinuación se presenta una breve descripción deestos instrumentos y sus aplicaciones.

El microscopio utilizado por la mayoría de losestudiantes e investigadores es el microscopio decampo claro

El microscopio de campo claro es el descendientedirecto de los microscopios que se usaban en el siglo XIXy que inauguraron la primera gran era de investigaciónhistológica. En esencia, los componentes del microsco-pio de campo claro (fig. 1.10) son los siguientes:

• Fuente luminosa para la iluminación de la muestra,por ejemplo, una lámpara en la subplatina.

• Lente condensadora para enfocar el haz de luz a laaltura de la muestra.

• Platina sobre la que se coloca el portaobjetos.• Lente objetivo para recoger la luz que ha atravesado

la muestra.

• Lente ocular (o un par de lentes oculares en losmicroscopios binoculares, que son de uso máscomún) a través de la cual se puede examinar direc-tamente la imagen formada por la lente objetivo.

Para que la muestra pueda verse con el microscopioóptico de campo claro tiene que ser lo suficientementefina para que la luz pase a través de ella. Aunque cier-ta cantidad de luz es absorbida al atravesar la muestra,el sistema óptico del microscopio de campo claro noproduce un grado de contraste útil en los cortes noteñidos. Por este motivo se utilizan las diversas técnicasde coloración ya comentadas.

Examen de un preparado histológicocon el microscopio óptico

Los órganos son tridimensionales, mientras que loscortes histológicos tienen sólo dos dimensiones

Como se comentó en la sección sobre “Preparacióndel tejido”, toda muestra tisular preparada para su exa-men con el microscopio óptico tiene que ser cortada enláminas muy finas. En consecuencia, de una muestra detejido originalmente tridimensional se obtienen cortesbidimensionales. Uno de los mayores desafíos que

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Fuenteluminosa

Lenteconden-sadora

Muestra

Lenteobjetivo

Lente deproyección

Lenteocular

Imagen enla retinadel ojo

MICROSCOPIO ÓPTICO MICROSCOPIO ELECTRÓNICODE TRANSMISIÓN

MICROSCOPIO ELECTRÓNICODE BARRIDO

Cátodo

Ánodo

Lenteconden-

sadora

Solenoidede barrido

Haz debarrido

Detector de electrones

Imagen enla pantallade visión

Muestra

Amplificadoelectrónico

Pantalla detelevisión

FIGURA 1.10. Diagramas comparativos de la formación de la imagen en diferentes tipos de micros-copios. El microscopio óptico (a la izquierda) se presenta como si estuviera invertido; el microscopio electrónico de trans-misión (MET) aparece en el medio y el microscopio electrónico de barrido (MEB) se ilustra a la derecha. Las flechas rojasrepresentan la muestra y sus imágenes aumentadas.

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Esta breve introducción al uso correcto del microsco-pio óptico está dirigida a los estudiantes que usarán elmicroscopio para el examen de rutina de preparados his-tológicos. Si el comentario siguiente parece elementalsólo se debe a que con mucha frecuencia las personasque usan el microscopio no aprovechan todas sus venta-jas. A pesar del equipo sofisticado disponible en la actua-lidad y de su uso muy difundido, en muchos casos secarece de la instrucción formal necesaria sobre cómodebe emplearse el microscopio óptico.

Los sistemas ópticos costosos y muy corregidos sólopueden funcionar en forma óptima cuando los trayectosde los haces de iluminación y de observación están cen-trados y tienen un ajuste correcto. El uso de ajustes y ali-neamientos adecuados contribuirá sustancialmente alreconocimiento de detalles muy diminutos de la muestray a la manifestación fidedigna de los colores para lavisión directa o la microfotografía.

La iluminación Köhler es una de las claves de labuena microscopia y está incorporada al diseño de casitodos los microscopios modernos que se usan en labora-torios o para la investigación. En la figura adjunta se ilus-tran los dos trayectos de los rayos luminosos y todos loscontroles de ajuste de un microscopio moderno y estadeberá emplearse como guía al seguir las instruccionesque se dan a continuación para obtener una iluminaciónadecuada en el microscopio.

Los ajustes necesarios para conseguir una buena ilu-minación Köhler son pocos y sencillos:

• Se enfoca la muestra. • Se cierra el diafragma de campo.• Se enfoca el condensador moviéndolo hacia arriba o

hacia abajo hasta que el contorno de su diafragma decampo aparezca bien nítido (en foco).

• Se centra el diafragma de campo con los controles decentrado de la subplatina (donde está el condensa-dor). Luego se abre el diafragma de campo hasta queel haz luminoso cubra todo el campo observado.

• Se retira el ocular (o se usa un telescopio de centra-do o un accesorio telescópico de fase, si se disponede ellos) y se observa la pupila de salida del objeti-vo. Así se verá un campo circular iluminado cuyoradio será directamente proporcional a la aperturanumérica del objetivo. A medida que se cierre el dia-fragma del condensador su contorno aparecerádentro de este campo circular. Para la mayor partede los preparados teñidos el diafragma del conden-sador deberá cerrarse hasta cubrir aproximadamen-te dos tercios de la apertura del objetivo. El resulta-do de este ajuste es la avenencia máxima entreresolución y contraste (que no es más que la diferen-cia de intensidades entres las regiones claras y oscu-ras de la muestra).

Recuadro 1.4 Uso correcto del microscopio óptico

Diagrama de un microscopio óptico típico. Este dibujo muestra un corte transversal del microscopio, sus com-ponentes funcionales y el trayecto de la luz. (Gentileza de Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY, EE.UU.)

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enfrentan los estudiantes que utilizan el microscopiopara estudiar la histología es la posibilidad de recons-truir mentalmente la tercera dimensión “faltante”.

Por ejemplo, en la figura 1.11a se ilustran cortes enplanos diferentes a través de una naranja. Obsérveseque cada superficie de corte (indicada por una línea depuntos) de la naranja entera exhibe tamaños y mode-

los estructurales diferentes según la orientación delcorte. Por lo tanto, al examinar un corte dado a travésde la naranja es importante ser capaz de reconstruirmentalmente la organización de la estructura y de suspartes constitutivas. En la figura 1.11b se muestra unejemplo de una estructura histológica, en este caso uncorpúsculo renal, según aparece en planos de cortes

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Si se ponen en práctica estos cinco consejos simplesla imagen obtenida será la mejor que permita la ópticadel microscopio. Ahora veamos por qué.

Primero, ¿por qué ajustamos el diafragma de campopara cubrir sólo el campo observado? Iluminar un campomás grande que el que el sistema óptico puede “ver”sólo conduce a reflexiones internas o a una pérdida deluz, lo cual da como resultado más “ruido” o una dismi-nución del contraste de la imagen.

Segundo, ¿por qué se pone énfasis en el ajuste deldiafragma del condensador o, en otras palabras, la aper-tura de iluminación? Este diafragma ejerce gran influen-cia sobre la resolución y el contraste con los que se pue-den observar ciertos detalles de la muestra.

Para la mayoría de las aplicaciones prácticas la resolu-ción está determinada por la ecuación

d = λANobjetivo + ANcondensador

en donded = distancia entre los puntos del detalle resuelto (en

nm),λ = longitud de onda de la luz utilizada (verde = 540

nm),AN = apertura numérica o seno de la mitad del ángulo

limitado por los rayos más periféricos que, partien-do de un punto cualquiera del objeto, penetran enel objetivo (o condensador) y contribuyen a la for-mación de la imagen, multiplicado por el índice derefracción del medio interpuesto entre el objetivo(o condensador) y la muestra.

¿De qué manera la longitud de onda y la aperturanumérica ejercen influencia directa sobre la resolución?Las estructuras de la muestra refractan la luz. El ángulode refracción es directamente proporcional a la longitudde onda e inversamente proporcional al espaciado entrelas estructuras. Según Ernst Abbé, un espaciado estruc-tural dado sólo puede resolverse cuando el sistema ópti-co de observación (objetivo) puede ver cierta cantidad dela luz refractada producida por el espaciado. Cuantomayor es la apertura del objetivo mayor es la cantidad deluz refractada que participa en la formación de la ima-

gen, con lo que se resuelven detalles menores y las imá-genes son más nítidas.

Sin embargo, nuestra fórmula sencilla, demuestraque la apertura del condensador es tan importante comola apertura del objetivo. Y esto es lógico si se considerael ángulo de refracción de un haz oblicuo o uno de aper-tura mayor. Este ángulo se mantiene esencialmenteconstante pero se le presenta al objetivo de manera talque puede ser captado con facilidad.

¿Cómo afecta el contraste el ajuste de la apertura? Enteoría lo más cercano a la transferencia real de contrasteentre la muestra y la imagen se obtendría por la interac-ción (interferencia) entre los rayos no refractados y todoslos refractados.

Para la transferencia de contraste entre transmisióntotal y absorción completa en una muestra la relaciónde intensidad entre la luz refractada y la no refractadatendría que ser de 1:1 para obtener una interferenciadestructiva total (negro) o una interferencia constructivatotal (blanco). Cuando la apertura del condensador esigual a la apertura del objetivo, la luz no refractadapenetra en el objetivo con intensidad completa, pero laluz refractada sólo puede hacerlo parcialmente, lo queproduce una disminución del contraste. En otras pala-bras, si se cierra la apertura del condensador hasta losdos tercios de la apertura del objetivo se consigue unarelación de intensidad entre la luz refractada y la norefractada que se acerca a 1:1 y, en consecuencia, opti-miza el contraste. Si se cierra la apertura del condensa-dor (o se baja el condensador) y se pierde este equilibriose producirán fenómenos de interferencia o artefactosde la imagen, como anillos de refracción o líneas alrede-dor de las distintas estructuras de la muestra. La mayorparte de las técnicas microscópicas empleadas paraaumentar el contraste (p. ej., campo oscuro, iluminaciónoblicua, contraste de fase, modulación del contraste)tienen su fundamento en el mismo principio, es decirque suprimen o reducen la intensidad de la luz norefractada para mejorar un contraste intrínsecamentebajo de la muestra.

Si se siguen los pasos descritos y se mantienen limpiaslas lentes, la calidad y la fidelidad de las imágenes obser-vadas sólo variarán de acuerdo con la capacidad de fun-cionamiento del sistema óptico.

Uso correcto del microscopio óptico

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FIGURA 1.11. Ejemplo de cortes de una naranja y de un corpúsculo renal. Las líneas de puntos dibujadassobre la naranja entera indican el plano del corte que está en relación con cada una de las superficies seccionadas. De modosimilar, los cortes diferentes a través de un corpúsculo renal, que también es una estructura esferoidal, muestran diferen-cias en cuanto a su aspecto. El tamaño y el aspecto de la estructura interna son un reflejo del plano del corte.

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diferentes. Obsérvense las grandes diferencias en cadacorte del corpúsculo renal. Mediante el examen devarios de estos cortes bidimensionales es posible ima-ginar la configuración tridimensional de la estructuraexaminada.

En todas las etapas de la preparación de los tejidos pueden generarse artefactos en los preparados histológicos

Para la realización de un preparado histológico esnecesario seguir una serie de pasos que comienza conla recolección de la muestra y termina con la coloca-ción del cubreobjetos. En cada paso puede introducir-se un artefacto (un error en el proceso de preparación).Por lo general los artefactos que aparecen en el prepa-rado terminado están vinculados con la metodología, elequipo o los reactivos usados durante la preparación.La poca pureza de las sustancias químicas y los reacti-vos utilizados en el proceso (fijadores, reactivos y colo-rantes), las imperfecciones en la ejecución de la meto-dología (intervalos de fijación, deshidratación, inclusióny coloración demasiado cortos o demasiado largos odescuidos en el montaje o la colocación del cubreobje-tos) o el equipo inadecuado (un micrótomo con unacuchilla desafilada) pueden producir artefactos en elpreparado final. Es importante que los estudiantesadviertan que no todos los preparados de su colecciónson perfectos y que estén familiarizados con los artefac-tos más frecuentes.

Otros sistemas ópticosAdemás del microscopio de campo claro, que se usa

habitualmente para el examen de rutina de los prepa-rados histológicos, en los laboratorios clínicos y deinvestigación se aplican otros sistemas ópticos que sedescribirán a continuación. Algunos se utilizan paraaumentar el contraste sin necesidad de teñir (como elmicroscopio de contraste de fase); otros están diseña-dos para ver las estructuras mediante el uso de técni-cas especiales como la inmunofluorescencia (microsco-pios de fluorescencia y confocal).

El microscopio de contraste de fase permite elexamen de células y tejidos no teñidos y es deespecial utilidad para estudiar células vivas

El microscopio de contraste de fase aprovecha laspequeñas diferencias en el índice de refracción que hayen diferentes partes de una muestra de células o teji-dos. La luz que atraviesa regiones de índice de refrac-ción mayor (regiones más densas) se refracta y quedafuera de fase con respecto al haz luminoso principal. Elmicroscopio de contraste de fase añade otras longitudesde onda cuya salida de fase se ha inducido medianteuna serie de anillos ópticos en las lentes condensadoray objetivo, con lo que en esencia se cancela la amplitud

de la porción del haz refractada inicialmente y se pro-duce contraste en la imagen. Las partes oscuras de laimagen corresponden a las regiones densas de la mues-tra mientras que las partes claras corresponden a regio-nes menos densas. Por lo tanto, el microscopio de con-traste de fase sirve para examinar células y tejidosvivos, como los de cultivo, y también se usa muchopara estudiar cortes semifinos no teñidos (de alrededorde 0,5 μm) de material incluido en plástico.

Dos modificaciones del microscopio de contraste defase son el microscopio de interferencia, que tambiénpermite cuantificar masa hística, y el microscopio deinterferencia diferencial (con óptica de Nomarski), quees de especial utilidad para evaluar las propiedades dela superficie de las células y otras muestras biológicas.

En la microscopia de campo oscuro la lente objetivo no capta luz directa proveniente de la fuente luminosa

En el microscopio de campo oscuro sólo los rayos deluz refractados por las estructuras de la muestra pene-tran en el objetivo. Para lograr esto el microscopio estáprovisto de un condensador especial que ilumina elpreparado con mucha intensidad y en forma muy obli-cua. Así, el campo se ve oscuro y sobre él se destacanpequeñas partículas de la muestra que reflejan parte dela luz y aparecen brillantes.

El efecto es similar al que producen las partículas depolvo en el haz luminoso de un proyector de diaposi-tivas cuando la habitación está oscura. La luz reflejadapor las partículas de polvo alcanza la retina del ojo yeso permite verlas como puntos brillantes.

La resolución del microscopio de campo oscuro nopuede ser mejor que la del microscopio de campoclaro, dado que ambos usan luz de la misma longitudde onda. No obstante, como consecuencia del mayorcontraste obtenido, en las imágenes de campo oscuropueden detectarse partículas más pequeñas.

En la investigación este microscopio se utiliza paraexaminar preparados radioautográficos, en los cualeslos gránulos de plata revelados aparecen blancos sobreun fondo oscuro. En cambio, en la práctica clínica esútil para la detección de cristales (p. ej., de oxalato oácido úrico) en la orina, y para la identificación de espi-roquetas, en particular Treponema pallidum, el microor-ganismo causante de la sífilis, una enfermedad de trans-misión sexual.

El microscopio de fluorescencia aprovecha la capacidad de ciertas moléculas de fluorescer bajo la luz ultravioleta

Una molécula que fluorece emite luz de longitudesde onda dentro del espectro visible cuando es expues-ta a una fuente de luz ultravioleta (UV). El microscopiode fluorescencia se utiliza para la detección de molécu-las con fluorescencia natural (autofluorescencia), como

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la vitamina A y algunos neurotransmisores. Sin embar-go, dado que las moléculas autofluorescentes no sonmuchas, la aplicación principal de este microscopioconsiste en estudiar la fluorescencia secundaria, comocuando se quieren detectar antígenos o anticuerpos enlas técnicas de inmunocitoquímica (véase fig. 1.7). Lasmoléculas fluorescentes específicas también puedeninyectarse en un animal o directamente en las células yluego usarse como marcadores. Estos métodos hanresultado útiles en el estudio de las uniones intercelu-lares (del tipo de los nexos), en la investigación del tra-yecto de las fibras nerviosas en neurobiología y en ladetección de marcadores fluorescentes del crecimientode los tejidos mineralizados.

Entre la fuente luminosa UV y la muestra se colocanvarios filtros para producir luz monocromática (de unasola longitud de onda) o casi monocromática (longitudde onda de banda estrecha). Un segundo conjunto defiltros colocados entre la muestra y el objetivo permiteque sólo la estrecha banda de longitud de onda de lafluorescencia llegue al ojo, a una emulsión fotográfica oa otro procesador analítico.

El microscopio confocal de barrido combina componentes de un microcopio óptico de campoclaro con un sistema de barrido para disecar ópticamente una muestra

El microscopio confocal de barrido permite la

visualización de una muestra biológica en tres dimen-siones. Las dos lentes del microscopio confocal (obje-tivo y fototubo) están alineadas en forma perfecta paraenfocar la luz proveniente del punto focal de una lenteen el punto focal de la otra lente. La diferencia prin-cipal entre un microscopio convencional y uno confo-cal es la adición de una apertura de detector (orificiopuntiforme) que está en conjunción con el punto focalde la lente; por lo tanto es confocal. Este orificio deposición precisa sólo permite que pase la luz “en foco”hacia el interior del dispositivo fotomultiplicador(detector), mientras que la luz “fuera de foco” tienebloqueado el paso hacia el detector (fig. 1.12). Este sis-tema tiene la capacidad de obtener una resolución(0,2 a 0,5 μm) y una claridad excepcionales de uncorte fino de una muestra biológica simplemente porel rechazo de la luz fuera de foco. El sistema de ilu-minación láser que utiliza es fuertemente convergentey en consecuencia produce una luz excitadora de granintensidad en la forma de un punto de barrido muysuperficial. Un sistema de espejos mueve el haz lásersobre la muestra de manera que se ilumine un solopunto a la vez (fig. 1.13). Se exploran muchos puntosindividuales en el mismo plano focal y un programainformático reconstruye la imagen a partir de los datosregistrados durante la exploración. En este aspecto, lamicroscopia confocal se parece a la tomografía com-putarizada (TC).

Por otra parte, al usar sólo la profundidad escasa de

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a

DetectorAperturadel detector(orificio puntiforme)

Orificiopuntiforme

Lenteobjetivo

Lente delfototubo

FuenteluminosaEspejo

separadorde haces

b

Plano del foco

Muestra

EN FOCO FUERA DE FOCO

FIGURA 1.12. Diagrama de la luz emitida “en foco” y “fuera de foco” en el microscopio confocal. a.Este diagrama muestra el trayecto del haz láser y de la luz emitida cuando la estructura formadora de imágenes está direc-tamente en el foco de la lente. La pantalla con un orificio puntiforme al otro lado del sistema óptico del microscopio con-focal permite que la luz de la estructura en foco atraviese el orificio. Luego programas informáticos traducen la luz en unaimagen. Dado que el punto focal de la lente objetivo del microscopio forma una imagen nítida a la altura en la que está elorificio puntiforme, estos dos puntos reciben el nombre de puntos confocales. b. Este diagrama muestra el trayecto del hazláser y de la luz emitida, que está fuera de foco en relación con el orificio puntiforme. En consecuencia, la luz de la mues-tra bloqueada por el orificio nunca se detecta.

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la imagen en foco es posible crear imágenes múltiplesde distintas profundidades de la muestra. Por ejemplo,literalmente se puede así disecar capa por capa todo elespesor de la muestra. También es posible utilizar elordenador para realizar reconstrucciones tridimensio-nales de una serie de estas imágenes. Dado que cadaimagen individual de profundidades específicas dentrode la muestra es muy nítida, la imagen tridimensionalresultante tiene iguales características de nitidez.Además, una vez que el ordenador ha armado cada unade las imágenes de los cortes, la reconstrucción tridi-mensional puede rotarse y verse desde cualquier ángu-lo que se desee (véase fig. 1.5).

El microcopio de luz ultravioleta utiliza lentes decuarzo con una fuente de luz ultravioleta

En el microscopio de luz ultravioleta (UV) la ima-gen depende de la absorción de la luz UV por lasmoléculas de la muestra. La fuente UV tiene una lon-

gitud de onda aproximada de 200 nm, por lo que estemicroscopio puede alcanzar una resolución de 0,1 μm.En principio la microscopia UV tiene un funciona-miento semejante al de un espectrofotómetro, pero losresultados se registran en una placa fotográfica. Lamuestra no puede inspeccionarse en forma directa através del ocular porque la luz UV no es visible y lesio-na el ojo.

La microscopia de luz UV es útil para detectar áci-dos nucleicos, en especial las purinas y las pirimidi-nas que son las bases nitrogenadas de los nucleóti-dos. También es útil para detectar las proteínas quecontienen ciertos aminoácidos. Con una iluminacióncon longitudes de onda específicas habitualmente serealizan procedimientos espectrofotométricos a travésdel microscopio UV para determinar la cantidad deDNA y RNA en células individuales. Como se descri-bió en la página 8, este método se utiliza en la prác-tica clínica para evaluar el grado de ploidía (múltiplosde la cantidad normal de DNA) en cortes de tumo-res.

El microscopio de polarización tiene su fundamento en el hecho de que las moléculas olos conjuntos de moléculas muy bien ordenadaspueden rotar el ángulo del plano en que vibra laluz polarizada

El microscopio de polarización o de luz polariza-da es una simple modificación del microscopio ópti-co de campo claro en la que se coloca un filtro depolarización llamado polarizador, entre la fuenteluminosa y la muestra y se instala un segundo filtro,llamado el analizador, entre la lente objetivo y elobservador.

Tanto el polarizador como el analizador puedenrotarse; la diferencia entre sus ángulos de rotación seutiliza para determinar el grado en el que una estructu-ra afecta el haz de luz polarizada. La capacidad de loscristales o las sustancias paracristalinas de rotar elplano de la luz polarizada recibe el nombre de birre-fringencia (refracción doble). El músculo estriado y lasinclusiones cristaloides en las células intersticiales (deLeydig) del testículo, entre otras estructuras comunes,exhiben birrefringencia.

Microscopia electrónicaHay dos tipos de microscopios electrónicos que pro-

porcionan datos morfológicos y analíticos de células ytejidos: el microscopio electrónico de transmisión (MET)y el microscopio electrónico de barrido (MEB). El ade-lanto principal de la microscopia electrónica respectode la microscopia óptica es que la longitud de onda delhaz de electrones es unas 2 000 veces menor que la delhaz de luz, con lo que aumenta la resolución por unfactor de 103.

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Hazláser

Apertura deldetector(orificio puntiforme)

Fotomultiplicador

Separador dehaces dicroico

Fototubo

Ocular Deslizador de reflexión

Microscopio

Objetivo

Muestra

Espejosde barrido

FIGURA 1.13. Estructura del microscopio confo-cal y diagrama del trayecto de los rayos. La fuen-te luminosa del microscopio confocal es un generador láser.El haz láser (línea roja) que se dirige hacia la muestra detejido atraviesa un separador de haces dicroico y luegopasa por dos espejos de barrido móviles; estos espejosbarren el haz láser por la muestra en las coordenadas x e y.Por último, el haz láser entra en el microscopio y atraviesasu sistema óptico para iluminar la muestra de tejido que sedesea examinar. La luz emitida por la muestra de tejido ilu-minada (línea azul) retorna por el sistema óptico del micros-copio, pasa por ambos espejos de barrido, atraviesa elseparador de haces y se enfoca en el orificio puntiforme. Laluz que atraviesa este orificio es captada y registrada por eldispositivo detector conectado a un ordenador que formala imagen, un pixel a la vez.

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El MET utiliza la interacción de un haz de electro-nes con la muestra para producir una imagen

En principio la “óptica” del MET es similar a la delmicroscopio óptico (véase fig. 1.10), excepto que elMET utiliza un haz de electrones en lugar de un haz deluz. El principio del microscopio es el siguiente:

• Una fuente, como es un filamento de tungstenocalentado, emite electrones (cátodo).

• Los electrones son atraídos hacia un ánodo.• Una diferencia eléctrica entre el cátodo y el ánodo

imparte un voltaje de aceleración de entre 20 000 y200 000 voltios a los electrones, con lo que se gene-ra un haz.

• Este haz de electrones atraviesa luego una serie delentes electromagnéticas que cumplen la misma fun-ción que las lentes de cristal de un microscopioóptico.

La lente condensadora da forma al haz de electronesque alcanza el plano de la muestra y cambia su diáme-tro. Entonces el haz que ha atravesado la muestra esenfocado y aumentado por una lente objetivo para des-pués volver a ser aumentado por una lente proyectorao más de ellas. La imagen final se mira en una panta-lla fosforescente. Las partes de la muestra que han sidoatravesadas por los electrones aparecen claras; las par-tes que han absorbido y dispersado los electrones acausa de su densidad inherente o de la adición demetales pesados durante la preparación aparecen oscu-ras. Por arriba o por debajo de la pantalla visora sepuede colocar una placa fotográfica o un detector devídeo para registrar la imagen de la pantalla de modopermanente.

La preparación de las muestras para la microscopia electrónica de transmisión es similar a la de la microscopia óptica excepto por la necesidad de métodos más refinados

Los principios utilizados en la preparación de loscortes para su examen con el MET son esencialmentelos mismos que los que se emplean para la microsco-pia óptica con la restricción de que en cada paso sedebe trabajar con muestras 3 a 4 veces más pequeñaso más delgadas que las habituales para la microscopiaóptica. El MET, cuyo haz de electrones tiene una longi-tud de onda de alrededor de 0,1 nm, posee una reso-lución teórica de 0,05 nm.

Dada la excepcional resolución del MET, la calidadde la fijación, es decir el grado de conservación de laestructura subcelular, tiene que ser la mejor que sepueda conseguir.

La preparación de rutina de las muestras para lamicroscopia electrónica de transmisión comienzacon la fijación en glutaraldehído seguida por unenjuague en una solución amortiguadora (buffer) yla fijación con tetróxido de osmio

El glutaraldehído, un dialdehído, preserva las prote-ínas al establecer enlaces cruzados entre ellas; el tetró-xido de osmio reacciona con los lípidos, en particularlos fosfolípidos. El osmio también imparte densidadelectrónica a las estructuras celulares e hísticas porquees un metal pesado, lo cual mejora la formación ulte-rior de la imagen en el MET.

Lo ideal sería que los tejidos se perfundieran conglutaraldehído amortiguado antes de extirparse del ani-mal. Pero lo más común es que para el MET se fijenpiezas de no más de 1 mm3 (muy pequeñas si se lascompara con las piezas para el microscopio óptico, quepueden medirse en centímetros). El proceso de deshi-dratación es el mismo que para la microscopia óptica yel tejido se infiltra con una resina monomérica, engeneral una resina epoxi, que luego se polimeriza.

El tejido incluido en plástico se corta en micrótomos de diseño especial que poseen cuchillas de diamante

Dado el poder de penetración limitado de los elec-trones, el espesor de los cortes para la MET de rutinaoscila entre 50 nm y no más de 150 nm. Además,como los abrasivos utilizados para afilar las cuchillas deacero dejan rayas inaceptables en los cortes para elMET, en lugar de estas se usan cuchillas de diamantecon un afilado casi perfecto. Los cortes obtenidos conla cuchilla de diamante son demasiado finos como paramanipularlos; se los hace flotar desde el borde de lacuchilla hacia la superficie de una cubeta llena de líqui-do y se los recoge sobre rejillas de cobre revestido enplástico. Las rejillas o grillas poseen 50 a 400 orificiospor pulgada o ranuras especiales para ver cortes seria-dos. El haz de electrones atraviesa primero los orificiosde la rejilla de cobre y después la muestra y luego laimagen se enfoca en la pantalla visora o en películafotográfica.

La tinción de rutina de los cortes para la micros-copia electrónica de transmisión es necesaria paraaumentar el contraste inherente de manera que losdetalles de la estructura celular sean fáciles de very fotografiar

En general los cortes para la MET se tiñen median-te la adición a la muestra de materiales de gran densi-dad, como los iones de metales pesados. Los iones demetales pesados pueden unirse a los tejidos durante lafijación o la deshidratación o por la inmersión de loscortes, una vez realizados, en soluciones de estosiones. El tetróxido de osmio, usado de rutina como

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fijador, se une a los componentes fosfolipídicos de lasmembranas, con lo que estas adquieren una densidadadicional.

Con frecuencia se añade nitrato de uranilo a lassoluciones alcohólicas usadas en la deshidratación paraaumentar la densidad de los componentes de las unio-nes intercelulares y de otros sitios. La inmersiónsecuencial en soluciones de acetato de uranilo y citratode plomo se usa de rutina para teñir los cortes antes deverlos con el MET y para obtener microfotografías elec-trónicas de mayor contraste y mejor resolución.

A veces se necesitan tinciones especiales para visua-lizar los resultados de las reacciones histoquímicas oinmunocitoquímicas con el MET. Los procedimientospara fosfatasas y esterasas se usan con este propósito(véase fig. 1.4). La sustitución del colorante fluorescenteque ha sido conjugado con un anticuerpo por un com-puesto con un metal pesado ha permitido la adaptaciónde las técnicas inmunocitoquímicas a la MET. De unmodo similar, las técnicas de radioautografía de rutina sehan ajustado para su uso con el MET (véase fig. 1.9b).Estos métodos han sido particularmente útiles paradeterminar las fuentes celulares y las vías intracelularesde ciertos productos de secreción, la distribución sobrela superficie celular de receptores específicos y la ubica-ción intracelular de sustratos y fármacos ingeridos.

La criofractura es una técnica especial de prepara-ción de las muestras para microscopia electrónicade transmisión, de importancia especial en elestudio de las membranas

El tejido que se va a examinar puede ser fijado o no;si lo ha fijado se elimina el fijador de la muestra antesde proseguir. Se deja que un crioprotector (p. ej., glice-rol) infiltre el tejido y luego se lo congela rápidamente

a unos –160° C. La formación de cristales de hielo seevita mediante el uso de los crioprotectores, la conge-lación rápida y el empleo de muestras diminutas. Eltejido congelado se coloca en el aparato de criofractu-ra, que posee una cámara de vacío, y se percute con elborde de una cuchilla o navaja.

El plano de fractura pasa preferencialmente a tra-vés de la parte hidrófoba de la membrana plasmá-tica, de manera que queda expuesto su interior

La fractura resultante de la membrana plasmáticaproduce dos superficies nuevas. La superficie de lamembrana que atrás tiene el espacio extracelular sellama cara E; la cara que tiene atrás el protoplasma(citoplasma) se llama cara P. Luego la muestra se cubretípicamente con una capa de platino evaporado paracrear una réplica de la superficie de fractura. El tejidose elimina y la réplica de la superficie, no el tejidomismo, se coloca sobre la rejilla para su estudio con elMET. En estas réplicas pueden verse detalles de la orga-nización molecular (véase fig. 2.5, p. 34).

En la microscopia electrónica de barrido el haz deelectrones no atraviesa la muestra sino que explora (“barre”) su superficie

En muchos aspectos el MEB se parece más a un tubode televisor que al MET. Para el examen de la mayoríade los tejidos la muestra se fija, se deshidrata por dese-cación de punto crítico, se cubre con una película deoro-carbono evaporados, se monta en un soporte dealuminio y se coloca en la cámara para muestras delMEB. En el caso de los tejidos mineralizados es posibleeliminar todas las partes blandas con un removedor yestudiar los detalles estructurales del mineral.

El barrido se consigue con el mismo tipo de explo-ración que hace recorrer el haz electrónico sobre lasuperficie de un tubo de televisión. Los electrones refle-jados por la superficie (electrones retrodispersados) ylos electrones que son expulsados desde la superficie(electrones secundarios) son recogidos por un detectoro más y reprocesados para formar una imagen de tipotridimensional en un TRC (tubo de rayos catódicos) dealta resolución.

Luego se pueden tomar fotografías del TRC pararegistrar los datos o la imagen puede grabarse en cintade vídeo. Se pueden usar otros detectores para medirlos rayos X emitidos desde la superficie, la catodolumi-niscencia de moléculas en el tejido debajo de la super-ficie y los electrones Auger emitidos en la superficie.

El microscopio electrónico de transmisión-barridocombina características del MET y del MEB parapermitir el microanálisis de rayos X por sondaelectrónica

La configuración del MEB puede usarse para pro-ducir una imagen de transmisión si se inserta un por-

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Los principios electrónicos tanto del MET como delMEB son semejantes a los de un tubo de rayos catódi-cos (TRC), como por ejemplo el que se usa en los tele-visores y en los monitores las computadoras. En efec-to, los primeros microscopios electrónicos, construidosa principios de la década de 1930, fueron creados enforma independiente en varios países por científicos eingenieros que trabajaban en el desarrollo de la televi-sión. Aunque en la década de 1930 el microscopioelectrónico permitió estudiar algunos virus y otrosmateriales paracristalinos desecados, recién en la déca-da de 1950, se desarrollaron métodos de fijación,inclusión y corte adecuados que permitieron aplicar elMET como elemento de rutina en la investigación bio-lógica.

Recuadro 1.5 Consideraciones funcionales: desarrollo de la microscopia electrónica

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tarrejillas a la altura de la muestra, se recogen loselectrones transmitidos con un detector y se recons-truye la imagen en un TRC. Esta última configuraciónde un MEB o un microscopio electrónico de transmi-sión-barrido (METB) facilita el uso del instrumentopara el microanálisis de rayos X por sonda electró-nica.

El microscopio se puede equipar con detectorespara recoger los rayos X emitidos cuando el haz deelectrones bombardea el corte y, mediante el uso deanalizadores adecuados, se puede confeccionar unmapa que muestre la distribución en los cortes de loselementos con un número atómico superior a 12 y unaconcentración suficiente para producir bastante canti-dad de rayos X para analizar. También pueden dedu-cirse datos semicuantitativos para los elementos quehaya en concentración suficiente. Por ende, además deser usados como instrumentos “ópticos” tanto el METcomo el MEB pueden convertirse en herramientas ana-líticas sofisticadas.

Microscopia de fuerza atómica

El microscopio de fuerza atómica se ha convertidoen uno de los instrumentos más poderosos para elestudio de la topografía superficial con resoluciónmolecular y atómica

Uno de los microscopios más nuevos que ha demos-trado ser muy útil para los estudios biológicos es elmicroscopio de fuerza atómica (MFA). Se trata de unmicroscopio no óptico que funciona en la misma formaque los pulpejos de los dedos, que tocan y sienten lapiel de nuestra cara que no podemos ver. La sensacióncaptada por los pulpejos de los dedos es procesada pornuestro cerebro, que tiene la capacidad de deducir latopografía superficial de la cara mientras los dedos latocan.

En el MFA una sonda puntiaguda muy fina (púa),que en su extremo se aproxima al tamaño de un soloátomo, explora la muestra mientras sigue líneas parale-

TÉCNICA HISTOLÓGICA Y MICROSCOPIA1�

Mic

rosc

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Fotodiodo

Láser

SoportePúa

Explorador piezoeléctrico

X

Y

Z

Ordenador

Muestra

MODO DE CONTACTO MODO DE PERCUSIÓN

FIGURA 1.14. Diagrama del microscopio de fuerza atómica (MFA). Una púa muy fina en un soporte móvil sedesplaza sobre la superficie de una muestra biológica. El mecanismo de retrocontrol provisto por los exploradores piezo-eléctricos permite que la púa se mantenga con una fuerza constante sobre la superficie de la muestra. La púa se extiendehacia abajo desde el extremo de un soporte reflector de láser. Sobre el soporte hay un haz láser enfocado. A medida quela púa explora la superficie de la muestra, subiendo y bajando por su contorno, el haz láser se desvía desde el soporte haciaun fotodiodo. El fotodiodo mide los cambios de las intensidades del haz láser y luego convierte esta información en unacorriente eléctrica. Un ordenador o computadora procesa la información recuperada desde el fotodiodo para formar unaimagen de la superficie y también para regular el explorador piezoeléctrico. En el modo de contacto (detalle de la izquier-da), las fuerzas electrostáticas o de tensión superficial arrastran la púa exploradora sobre la superficie de la muestra. En elmodo de percusión (detalle de la derecha), la púa del soporte oscila. Este último modo permite el estudio de muestras blan-das y frágiles al mismo tiempo que consigue una resolución alta.

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las a lo largo del eje x y repite la exploración con inter-valos breves a lo largo del eje y. La púa fina está mon-tada en el extremo de un soporte muy flexible para quedesvíe el soporte conforme encuentra la “fuerza atómi-ca” en la superficie de la muestra (fig. 1.14). La super-ficie superior del soporte es reflectora y un haz láser sedirige desde allí hacia un diodo. Esta distribución actúacomo una “palanca óptica” porque las desviacionesmuy pequeñas del soporte se magnifican mucho en eldiodo. El MFA puede funcionar con la púa del soportetocando la muestra (modo de contacto) o la púa puededar golpecitos a través de la superficie (modo de per-cusión) como el bastón de un ciego (fig. 1.14, detalles).

Conforme la púa sube o baja en el eje z mientrasatraviesa la muestra, los movimientos se registran en eldiodo como movimientos del haz láser reflejado. Undispositivo piezoeléctrico situado debajo de la muestrase activa en un circuito de retrocontrol sensible con eldiodo para subir o bajar la muestra de modo que el hazláser se centre en el diodo. Conforme la púa se hundeen una depresión el dispositivo piezoeléctrico eleva lamuestra para compensar y cuando la púa se eleva sobreuna eminencia el dispositivo compensa bajando lamuestra. La corriente hacia el dispositivo piezoeléctricose interpreta como el eje z, que junto con los ejes x ey presenta la topografía de la muestra con una resolu-ción molecular y, a veces, atómica (fig. 1.15).

Una ventaja importante del MFA para el examen delas muestras biológicas es que a diferencia de lo quesucede con los instrumentos ópticos de alta resolución(p. ej., MET o MEB), la muestra no tiene que estar enel vacío, incluso puede estar en el agua. Por lo tanto, esposible obtener imágenes de células vivas y de sumedio circundante.

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FIGURA 1.15. Imagen de microscopio de fuerzaatómica de una molécula de DNA individual. Estaimagen se obtuvo en el modo de contacto, en el cual la púaexploradora sube y baja desplazada por las anfractuosida-des del “terreno” conforme se mueve hacia adelante yhacia atrás sobre la superficie de la muestra. La muestraestá colocada sobre una superficie de mica ultralisa. Unamolécula individual de DNA produce una eminencia sufi-ciente para ser detectada con facilidad. Los engrosamientosa lo largo de la molécula de DNA son causados por las pro-teínas unidas a ella y estos engrosamientos producen unmovimiento aun mayor de la púa exploradora. El campo deexploración mide 540 nm por 540 nm. La longitud de lamolécula de DNA oscila entre 0 y 40 nm. 185 000 ×.(Gentileza de la Dra. Gabriela Bagordo, JPK Instruments AGBerlín, Alemania.)

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